Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск путей транспорта D-глюкозы в клетки Escherichia coli, альтернативных фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системе

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Поиск путей транспорта D-глюкозы в клетки Escherichia coli, альтернативных фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системе"

На правах рукописи

СЛИВИНСКАЯ ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ПОИСК ПУТЕЙ ТРАНСПОРТА D-ГЛЮКОЗЫ В КЛЕТКИ ESCHERICHIA COLI, АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ФОСФОЕНОЛПИРУВАТ-ЗАВИСИМОЙ ФОСФОТРАНСФЕРАЗНОЙ СИСТЕМЕ

03.01.03 -Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О MAP 2011

Москва 2011

4840278

Работа выполнена в лаборатории №2 Закрытого Акционерного Общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Рыбак Константин Вячеславович

ЗАО «АГРИ»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Миронов Александр Сергеевич

профессор ФГУП «ГосНИИгенетика»

доктор биологических наук, Патрушев Лев Иванович

ГУ РАН Институт биоорганической химии им.ак. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Ведущая организация:

Государственное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи»

Защита диссертации состоится марта 2011 года в ' ' на заседании Диссертационного Совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат диссертации разослан февраля 2011 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук ^ Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Культуры Escherichia coli широко используются в производстве ряда биологически активных веществ, в том числе аминокислот, применяемых в различных отраслях - пищевой, кормовой, фармацевтической промышленности. Для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов методами метаболической инженерии требуется понимание основных метаболических процессов, к которым относится и перенос веществ через цитоплазматическую мембрану.

D-глюкоза применяется в микробиологическом производстве в качестве источника углерода для накопления бактериальной биомассы и биосинтеза биологически активных соединений. Показано, что у ряда продуцентов недостаточная эффективность транспорта глюкозы в клетку является фактором, ограничивающим продуктивность.

Известно, что в клетках Е. coli основной путь утилизации D-глюкозы начинается с ее транслокации через цитоплазматическую мембрану и фосфорилирования (с образованием D-глюкозо-б-фосфата), осуществляемых фосфоенолпируват:углевод фосфотрансферазной системой (PTS) с использованием фосфоенолпирувата (PEP) в качестве донора фосфатной группы. При этом на долю PTS приходится 50% пула фосфоенолпирувата, в то время как на долю основных биосинтетических ферментов, использующих PEP как субстрат, фосфоенолпируваткарбоксилазы, пируваткиназы, уридиндифосфат-N-ацетилглюкозамин-енолпирувил-трансферазы и З-деокси-О-арабино-гептулозонат-7-фосфатсинтазы - 16, 15, 16, 3%, соответственно (Kim, Lees et al. 1996).

К настоящему времени большинство работ, посвященных увеличению эффективности транспорта глюкозы в клетку, было связано именно с модификацией активности PTS. Однако, транспорт через эту систему не выгоден в тех случаях, когда расходующийся на перенос и фосфорилирование глюкозы фосфоенолпируват одновременно является прямым метаболическим предшественником целевого продукта (к примеру, аминокислот аспарагинового семейства). Таким образом, экономия PEP вследствие использования клетками альтернативных PTS-независимых систем транспорта глюкозы, имеет очевидные преимущества для подобных процессов.

На момент начала работы были известны две PTS-независимые системы транспорта моносахаров Е. coli, способные к переносу глюкозы. Это GalP - низкоафинный Н+-симпортер (пермеаза) D-галактозы (Hernandez-Montalvo et al., 2003), который из-за схожести пространственной структуры, субстратной специфичности и способности к ингибированию некоторыми

антибиотиками часто рассматривают в качестве бактериального аналога пассивного транспортера глюкозы млекопитающих - GLUTI, и АТФ-зависимый транспортер (АВС-транспортер) ß-метилгалактозидов MglABC -высокоаффинный переносчик, активный на завершающих стадиях культивирования при малых концентрациях глюкозы (Franchini and Egli, 2006). Было показано, что использование этих транспортных систем в дополнение к активной PTS позволяет увеличить выход целевого продукта при культивировании ряда штаммов-продуцентов Е. coli на средах с глюкозой.

Цель и задачи исследования

Основной целью настоящей работы являлся поиск PTS-независимых транспортеров Сахаров E.coli, способных к переносу глюкозы внутрь клетки Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- Разработка методического подхода к изучению процесса PTS-независимого транспорта глюкозы (на примере пермеазы галактозы GalP)

- Поиск и исследование транспортных систем E.coli, потенциально способных к транспорту глюкозы

- Исследование влияния этапа внутриклеточного фосфорилирования глюкозы на эффективность ее утилизации клеткой

- Использование систем PTS-независимого транспорта глюкозы при создании штаммов-продуцентов аминокислот.

Научная новизна и практическая ценность работы

На основании разработанного методического подхода впервые продемонстирована способность ряда PTS-независимых транспортных систем (XylE, FucP, AraFGH и AlsABC) переносить D-глюкозу в клетки E.coli. Показано, что увеличение активности глюкокиназы улучшает эффективность утилизации D-глюкозы при использования PTS-независимого пути ее транспорта; однако чрезмерное увеличение экспрессии генов, кодирующих PTS-независимый транспортер GalP и глюкокиназу Glk, приводит к ингибированию роста клеток штамма E.coli с неактивной PTS. Наблюдаемый эффект, по-видимому, связан с накоплением токсического для клетки количества фосфорилированных производных D-глюкозы вследствие дисбаланса между стадиями их синтеза и продуктивного вовлечения в клеточный метаболизм. Использование новых PTS-независимых транспортеров D-глюкозы, дополнительно к нативной фосфотрансферазной системе, увеличивает накопление и скорость синтеза ряда аминокислот соответствующими штаммами-продуцентами E.coli.

Результаты работы могут быть полезны при дальнейшем изучении систем транспорта углеводов, исследованных в данной работе, и процессов

утилизации О-глюкозы клетками Е.соП, а также найти практическое приложение в биотехнологии.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены на V Съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (ВОГиС) (Москва, 2127 июня 2009г.) и на смотре-конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» (Москва, 16-17 июня 2010г.).

Диссертационная работа была апробирована на семинаре совместного заседания секций «Молекулярная биология» и «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» и Научно-Технического совета НИИ «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ») 20 декабря 2010 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано шесть печатных работ; из них одна статья в журнале, входящем в список, рекомендованный ВАК, четыре патента и одно сообщение в материалах научной конференции.

Структура работы

Диссертация изложена на /^страницах печатного текста, включая & рисунков и Ар таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитируемой литературы (И^каименований).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка методического подхода для оценки способности РТ8-иезависимых транспортных систем к переносу глюкозы на примере пермеазы галактозы Са1Р.

1.1. Обеспечение конститутивной экспрессии гена galP.

В Е.соП экспрессия гена galP происходит с индуцируемого галактозой С11Р-зависимого промотора, а, значит, при росте клеток дикого штамма на среде с глюкозой синтез транспортера подавлен. Для выявления способности ва1Р к транспорту глюкозы необходимо было обеспечить конститутивную экспрессию соответствующего гена в клетках. При этом следовало учитывать следующие факторы:

- сверхпродукция мембранного белка может быть губительна для клетки;

- недостаточно сильная экспрессия гена транспортера может затруднить оценку способности ва1Р к транспорту глюкозы.

В связи с этим осуществляли замену природного промотора гена galP в штамме MG1655 несколькими tac-подобными промоторами различной «силы» из библиотеки, полученной ранее путем рандомизации области «-35» сильного промотора Р,ас (Каташкина и др., 2005). Были выбраны три промотора:

1) высокоэффективный Р,ос с канонической структурой областей «-35» и «-10»

2) Pftrcj- более «слабый» вариант ?,ас с измененной областью «-35».

3) РL-toc - более «сильный» гибридный промотор, полученный добавлением «upstream» области промотора Pl (UP-elements) к Рюс по схеме, использованной ранее при конструировании гибридного промотора Рыф •

Эффективность toc-подобных промоторов, определенная с использованием гена lacZ в качестве репортера (Каташкина и др., 2005), соотносится как:

{Ры«}:{РМс}:{Р«асз}~4.5:3.0:1.0

Ptac

"-35" "-10" "+1"

ggtaccagatctctccccatccccctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcg

Ptac3

"-35" "-10" "+1"

ggtaccagatctccccatccccctgtttgcaattaatcatcggctcgtataatgtgteeaattgtgagcg

PL-tac

agatctctcacctaccaaacaatgcccccctgcaaaaaataaattcataaaaaacatacagataaccatctgcggtg

"-35" "-10" "+Г

ataaattatctctggcggtgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcg

PgalP

galP

18 n H

156 n H T

cat

N,

Bgl 11 V. Px Y\

x = tac, tac3, L-tac

attR

attL

Рис. 1. Схема замены промоторной области гена galP конститутивным промотором и структура 1ас-подобных промоторов.

Эксперименты по замене промотора в составе бактериальной хромосомы проводились с помощью метода, основанного на Red-зависимой системы рекомбинации бактериофага X по методу, изложенному в работе (Datsenko, Wanner, 2000) с модификациями, разработанными в нашем Институте (Каташкина и др., 2005).

Отметим, что эти замены не затрагивали участок перед структурной частью гена, содержащий сайт связывания рибосомы (SD-последовательность). Схема замены природного промотора galP кассетой, содержащей один из выбранных синтетических промоторов, и структура промоторов tac-семейства изображены на Рис. 1.

1.2. Оценка способности пермеазы галактозы Са1Р к транспорту Б-глюкозы внутрь клетки.

Для исследования способности РТБ-независимых транспортных систем к переносу глюкозы нами был сконструирован штамм МС1655 с неактивной РТБ (делеция оперона р1.чН1сгг, кодирующего общие компоненты РТБ, а также глюкозоспецифический компонент ЕПА), названный Мвс1е1 и далее используемый в качестве реципиентного штамма.

Регуляторная область гена galP в этом штамме была заменена тремя кассетами, содержащими промоторы ¡ас-семейства. Полученные штаммы были исследованы на способность к росту в жидкой минимальной среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода.

Как можно видеть на Рис. 2, замена нативного промотора гена £а1Р любой из модификаций промотора Р(ас приводило к восстановлению роста клеток 1УЮс1е1 на среде с глюкозой; при этом наблюдаемый эффект существенно не зависел от эффективности используемого промотора. Так, скорость роста штамма, содержащего перед геном galP самый «слабый» из промоторов Р,ас3, была примерно равна скорости роста штамма, содержащего

наиболее «сильный» промотор Р|

L-tac.

OD540 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 О

Табл. 1. Скорость роста РТ5' штаммов с различным уровнем экспрессии гена galP на среде с глюкозой.

время, чао

-MG1655 - MGdel-Ptac3galP -MGdel-PtacgalP

-MGdel

-MGdel-PI-tacgalP

Рис. 2. Рост РТБ' штаммов Е.соИ с различным уровнем экспрессии гена %а1Р на среде с глюкозой.

Штамм Скорость роста ft, час"1

MG1655 0,44 ±0,1

MGdel 0,03

MGdel- PL,acgalP 0,22 ± 0,05

MGdel- P,acgalP 0,23 ± 0,06

MGdel- P.acsgalP 0,26 ± 0,05

Вероятно, отсутствие зависимости скорости роста клеток от уровня экспрессии гена %а\Р связано с тем, что промоторные модификации по тем или иным причинам (нестабильность мРНК, низкая эффективность трансляции, ограничения на встраивание белка в мембрану) не влияли на количество синтезируемого белка-транспортера и, как следствие, на перенос глюкозы через цитоплазматическую мембрану. Возможно также, при использовании сильных промоторов для экспрессии «узким местом» является уже не транспорт глюкозы в клетку, а одна из последующих стадий ее утилизации, в частности, фосфорилирование субстрата. Следующий этап работы был посвящен выяснению этого вопроса.

1.3. Изучение транспорта Б-глюкозы в клетках дефектного по РТБ штамма Е.соИ с разным уровнем экспрессии гена %а1Р.

Исследование транспорта глюкозы внутрь клетки проводили с помощью флуоресцентного аналога глюкозы 2-МВБО (2-(М-(7-нитробензо-2-оксо-1,3-диазол-4-ил)амино)-2-деоксиглюкоза) (УозЬюка а!., 1996). Об эффективности переноса судили по интенсивности тушения флуоресценции в реакционной среде, содержащей культуру живых клеток исследуемого штамма.

Табл. 2. Скорость поглощения 2-

КВБС штаммами с конститутивной экспрессией гена galP.

10 15 20 25 время,час

-МЮ<1е1ИасЗ-да1Р -*-КЮс1е1РЦас-да1Р -»-МС<1е1 -и-М51655(РТЗ+)

Штамм Скорость поглощения г^вов, нмоль/мнн.

М01655 0,65 ± 0,05

моае1 0,02 ±0,01

МОс1е1- Ршсз%а1Р 0,09 ±0,01

МвсЫ- Рь-^а/Р 0,16 ±0,02

Рис. 3. Снижение интенсивности флуоресценции 2-КВОО в реакционной смеси, содержащей клетки с различным уровнем экспрессии гена %а1Р.

Как можно видеть на Рис. 3, конститутивная экспрессии гена galP привело к увеличению скорости поглощения 2-КВОО клетками штамма МОс1е1. При этом скорость транспорта аналога была тем выше, чем более эффективный промотор использовался (Табл.2). Полученные результаты согласуются с данными об относительной «силе» 1ас-подобных промоторов и позволяют говорить о том, что отсутствие разницы в скорости роста штаммов с различным уровнем экспрессии galP связано с одним из этапов

последующего метаболизма глюкозы, в частности, с недостаточной активностью её фосфорилирования.

Заметим, что даже штамм с наиболее «сильным» промотором Рцас в скорости транспорта 2-NBDG заметно уступал штамму дикого типа с нативной фосфотрансферазной системой.

1.4. Влияние увеличения активности глюкокиназы на рост PTS штамма E.coli с конститутивной экспрессией гена galP.

Известно, что в процессе PTS-независимого транспорта глюкоза поступает в клетки в нефосфорилированной форме и для дальнейшего метаболизма должна быть фосфорилирована. Давно известно (Asenio and Sols, 1958), что такое фосфорилирование у Е. coli осуществляет глюкокиназа, кодируемая геном glk. Вероятно, усиление активности глюкокиназы в клетках, транспортирующих глюкозу через PTS-независимые системы, сможет ускорить рост таких клеток на среде с этим субстратом.

По схеме, ранее использованной для замены промоторной области гена galP, мы заменили природную регуляторную область glk в хромосоме Е. coli MG 1655 тремя toe-подобными промоторами разной силы. Активность глюкокиназы была определена в экстрактах полученных штаммов. Как можно видеть на Рис.4, для наиболее «сильного» промотора РЫос активность глюкокиназы была более чем в 20 раз выше активности фермента в клетках штамма дикого типа; в случае наиболее «слабого» искусственного промотора Рмсз уровень активности Glk примерно в 2,5 раза превышал исходный.

Рис. 4. Удельная активность глюкокиназы в клетках:

1 - MG1655

2 - MG1655 Ptac3glk

3-MG 165 5 Ptacglk

4-MG 1655 Pnacglk

Все три промоторные модификации гена glk были перенесены транедукцией в дефектные по РТ8 штаммы с различным уровнем экспрессии гена galP, после чего был проверен рост полученных клеток на среде с глюкозой.

Положительный эффект увеличения активности глюкокиназы был отмечен лишь в случае штамма, в котором транскрипция гена galP находилась под контролем наиболее «слабого» из /ас-подобных промоторов ?1ас3 (Рис.5). Скорость роста клеток возрастала с увеличением активности глюкокиназы, и при использовании наиболее «сильного» промотора ?1.шс для экспрессии гена

glk штамм имел скорость, приближающуюся к характерной для клеток дикого типа.

OD54Q

время, час

-»—MG1655 -в-MGdel

-A- MGdelPtac3-galP -♦- Pl-tac-glk

-ж- Ptac3-glk -*- Ptac-glk

Рис. 5. Влияние увеличения активности глюкокиназы на рост РТБ" штамма Е.соН, в котором экспрессия гена galP находится под контролем «слабого» промотора Р1асз

В то же время те штаммы, в которых galP выражался с более «сильных» промоторов Р,ос и РЫос, при увеличении активности глюкокиназы теряли способность к росту на среде с глюкозой (данные не приведены). Это явление может быть связано с токсичностью D-глюкозо-б-фосфата, который избыточно накапливается в клетках этих штаммов при росте их на глюкозе из-за несоответствия чрезмерно высокой эффективности синтеза этого соединения и его продуктивного вовлечения в клеточный метаболизм.

1.5. Влияние амплификации гена ybiV на рост штамма MGdel с сильной экспрессией генов galP и glk в минимальной среде с глюкозой.

Хромосома E.coli содержит в своем составе ген ybiV, кодирующий белок, аннотированный как специфичная к фосфорилированным производным Сахаров фосфатаза (Roberts et al., 2005). Мы предположили, что амплификация этого белка в штамме с сильной экспрессией генов galP и glk может привести к восстановлению роста клеток на среде с глюкозой вследствие гидролиза избыточного количества сахарофосфатов.

Ген ybiV был клонирован в составе мультикопийного вектора pTZ57 под контролем индуцибельного промотора Piac (Рис.6). Полученная гибридная плазмида была введена в клетки дефектного по PTS штамма, с высоким уровнем экспрессии генов galP и glk. После этого проверяли способность полученного плазмидного штамма к росту в жидкой минимальной среде с глюкозой.

Как можно видеть на Рис. 7, амплификация гена ybiV восстанавливала роста клеток штамма MGdelPLtabgtf/PPLtacg/& в этих условиях. Полученный результат косвенно свидетельствует о том, что одновременная сильная экспрессия генов транспорта глюкозы и глюкокиназы подавляет рост клеток вследствие накопления в них токсичной концентрации фосфорилированных производных глюкозы. Этот факт, в свою очередь, показывает, что при использовании PTS-независимых путей транспорта необходимо соблюдать

строгий баланс между скоростью поступления глюкозы внутрь клетки и её последующим метаболизмом.

Амшшфицированный фрагмент хромосомы

Рис. 6. Клонирование генаybiV в составе мультикопийного вектора pTZ57.

500

1000 1500 время, мин.

2000

MGdelPI-tac(galP-glk) - MGdelPI-tac(galP-gtk)pYbiV

Рис. 7. Восстановление роста штамма МСс1е1РцаС§а1РРиа1£1к на глюкозе при амплификации генауЫУ.

Таким образом, из данных, полученных при исследовании пермеазы галактозы Оа1Р, следует, что оценка способности той или иной транспортной системы к переносу глюкозы должна включать следующие этапы:

1. Обеспечение конститутивной транскрипции соответствующего гена;

2. Количественная оценка транспорта глюкозы внутрь клетки;

3. Изучение влияния конститутивной экспрессии гена-транспортера, а также усиленного фосфорилирования сахара на рост РТБ" штамма на среде с глюкозой.

2. Идентификация новых PTS-независнмых систем транспорта углеводов, способных к переносу D-глюкозы внутрь клетки.

2.1. Выбор PTS-независимых транспортеров, потенциально способных к переносу D-глюкозы.

Для поиска новых PTS-независимых систем, способных к переносу глюкозы внутрь клетки, исследовались известные транспортеры моносахаров E.coli, и при этом были использованы следующие два критерия отбора:

- структурное сходство белка-транспортера с уже известными транспортерами GalP и MglABC

- сходство конформаций специфического и потенциального (D-глюкоза) субстратов.

В результате поиска были отобраны восемь потенциально способных к переносу глюкозы транспортных систем, четыре из которых принадлежат к Н+-симпортерам MFS-семейства транспортеров, а четыре - к семейству АВС-транспортеров. Выбранные системы представлены в Табл. 3.

Табл. 3. Некоторые транспортеры моносахаров Е.соИ и конформация их природных субстратов.

Транспортный белок (система) Семейство транспортеров/ переносимый сахар Тип конформации углеводов

'с, 'с4

Ху1Е Н+ сим портер/ Б-ксилоза -

ГисР Н+ симпортер/ Ь-фукоза он 1 сн. он ' -

АгаЕ Н+/ симпортер/ Ь-арабиноза - но

ЛИаТ Н+ симпортер/ Ь-рамноза -

\ylFGH АВС-транспортер/ Б-ксилоза нГН0 -

АкАВС АВС-транспортер/ О-алллоза он -

АгаРвН АВС-транспортер/ Б-арабиноза но но -

Г^АВСО АВС-транспортер/ Б-рибоза -

РТЭ/ Э-глюкоза он НО <эн -

2.2. Обоснование выбора Ху1Е как потенциального транспортера глюкозы.

Наиболее полно обоим критериям отбора соответствовал транспортер О-ксилозы. Данное заключение основано, в первую очередь, на сходстве этого белка со структурой Н+-пермеазы галактозы Са1Р. Действительно, оба этих транспортера наряду с высокой гомологией аминокислотных последовательностей (которая составляет 34% идентичных аминокислотных остатков), имеют схожую мембранную топологию, включающую локализацию Ы- и С-концевых участков в цитоплазме, и состоят из 12 гидрофобных трансмембранных а-спиралей с гидрофильным цитоплазматическим доменом из 50-60 аминокислот между 6 — и 7— трансмембранными сегментами (ТМС). При этом наибольшая степень гомологии характерна именно для последовательностей ТМС (Рис. 8).

Ху1Е Са1Р Сопзепзиэ

Ху1Е Са1Р Сопэепзиз

Ху1Е Са1Р Сопзепзиэ

Ху1Е Са1Р Сопзепэиз

Ху1Е Са1Р Сопгепзиз

Ху1Е Са1Р Сопзепэиз

Ху1Е Са1Р СопБепзиз

Ху1Е Са1Р Сопзепэиз

Ху1Е Оа1Р СопБепзиз

1 (1) (1) (1)

(56) (60) (61)

(116) (105) (121)

(176) (155) (181)

(236) (207) (241)

60

-МЫТОУНББ^ЬБГТЬУаТГОПЬГГОУпТАУ^З'^ТУЕЗЬМТУГтаРОЫЬЗЕЗААМЗ

мроАкковкветанЦг ЕУСЕЪААХАЗ

N

61

N А Г I

ЬА ЬАОЬЬЕС Р АУ1АС Ь I Е Е

_ _ 120

|ЬЬСГСУА;-АЬ1УС11АСАЬОА^СЗЫКГСУКР31,№А^У ¡. Г186У6^НРЕШГГВ1ЫРР

-------[:;ШF■лAAVfiAVGSGWLf-;F|KL^;PKK^^E'мTG.^IГ.FVAGSLF^^ЛAAP^^|--------

3 Ь й ЮА йВ Э К бИК ЭЬ 1АА1ЬЕ Ь БА

121

МТУРУУШЗУУРЕЕУГО'

180

УМЪЭ УМ'-' 1А" I У У АН. КОКЬУУ|£Ж ГА 1Р--01

УЬЬРЬАУ"У' ЗУТАУЬУЬЗУ! угек: 1|:;ЗМ1ЙМУЧ ьм ТI 'А 11

V

II ЯП С1АУИАЗ АР1Л1АЕ1АР ПУЗ ЫЭ 0 I

181

'АЫ.,П,МЫ.УТУ Е

|!,ЬУУСУЫУГТШ35ГА31<ЬЫТРС'.'<1|УУ.ЕАЗЕС_

|'ьСАУЬЗ|--------Ь &КЛфМЬ6УШРА1.;..Ы КУГЕЬф;

Ь У ЙАЕ Т А 1РА1Ь Ы ЬЕ ЬРБЭРКИ

241

в 240

ЬМЭКСКОЕС) ЕААК1ШЕУР АК К

_ 300

АЕ6Х£Ж1М6НТ1АТСаУ0Е1Ш8ЬРН6ККТ36ВЬШЕ,6--У6-У1У1 М 1ЕООГУ;-1

АЕКУЬЬКЬКРТЗАЕАКРЕЬРЕ1КЕЗЬОУКОЗ^;;МА1ГКЕЫЗЫЕКР|АУЕЬ Ь ЦУНРОУТА] АЕ 1Ь К1 Э Р К Эв Ь I 1СУЬЬ I ООЕ в

3 01 __360

Рп'УЬУУАь'ЕУГКТЬОАЗ-ТМАЬШТ! 1 УУУ1НЬТЕ.ГУЬА 1МТУРКЕ: |Ъ0 I ТПАьС! Н^У1М|/ У А Р к IГЕ1А5 УТ ИТ Т ЕеНМСТУ1УуЬТЬУ№хТ1А1еЬУ|у Р»'. IЬИЬУПУ! 1ЫУ1ЬУУАР 1Е в Э Т Ь ТИУСЬ ЫЬ Т 1А1 УРКЕЫЖР Ю Ь

361____4 20

[ХА1У:МЕ31.0ТАЕУ^Г----ОАР511УАЬЬЗМ!._ГУУААКА'-<УИ."У У1СаУ1,Ь5Е1ЕЕМА1КОКА

МА СМ ЮТ Н А А1 ЬЬ Е1 АЕАМЭ СРЬ ИУЬ ЗЕ1 Р Я А

421___ 4 80

(408) |1^1АУААОУ'11А1-|'УЕУЗМТУPM["!PKNSWLVAHFHЫG^FSУv'I':'GCMG'^■^'т АА!. ^МДОКЁ^УЕТК

(387) |1ТСЗТАТЫУ1АЯМ1УОА'П-'ЬТНЬЫ------ТЬСКАИ^СУ^ААЬЫУ' ЕТТ.ЬТЬЯЬУГ|-УГК

(421) I А А Ш1АЫ V ТЕ М ЫА гГЩУА Ь УЬ Ь УРЕТК

481 504

(468) бКТЬЕЕШОИЕРЕТККТООТАТЬ (441) НУЗЬЕН1ЕРЫЬМКОР1ХЯЕ1С;5НР (481) ЭЬЕ 1Е К А

(293) (267) (301)

(352) (327) (361)

Рис. 8. Выравнивание аминокислотных последовательностей генов ху1Е и galP Е.соИ. Рамками обозначены последовательности ТМС (pdbtm.enzim.hu).

Помимо структурного сходства белков-транспортеров, о сходстве функций может говорить и конформационное подобие специфических (Б-галактоза, Б-ксилоза) и потенциального (Б-глюкоза) субстратов (Табл.3). Наиболее энергетические выгодные конформации Б-глюкозы, Б-галактозы, Б-ксилозы принадлежат к 4С1 конформации типа «кресло» пиранозного цикла, поскольку именно в этом случае минимальна энергия невалентных взаимодействий между отдельными заместителями. Отметим, что и в случае Б-ксилозы, и в Б-глюкозе все объемные группы (гидроксилы и оксиметильная группировка в Б-глюкозе) находятся в экваториальном положении, что делает эти два сахара похожими друг на друга.

Совокупность этих данных указывает на Ху1Е, как на наиболее вероятный транспортер глюкозы, поэтому на его изучении мы остановились более подробно.

2.3. Изучение роста PTS" штамма E.coli с различным уровнем экспрессии гена xylE на среде с глюкозой

Для обеспечения конститутивной транскрипции гена xylE была использована та же схема, что применялась ранее для гена galP. Регуляторная область xylE в штамме MGdel была заменена набором промоторов tac-семейства (tac3, tac, L-tac). Полученные штаммы были исследованы на способность к росту в жидкой минимальной среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода.

-MG1655 -м-MGdel -e-MGdelPtac3-xylE -MGdelPtac-xylE -ж-MGdelPI-lac-xylE_

Табл. 4. Скорость роста штаммов MGdel с различной экспрессией гена ху!Е на среде с глюкозой.

Рис. 9. Рост РТБ" штаммов MGdel с различным уровнем экспрессии гена ху1Е на минимальной среде с глюкозой.

Штамм Скорость роста ц, час"1

MG1655 0,44 ±0,1

MGdel 0,03

MGdel- P,ac3galP 0,26 ± 0,05

MGdel- P,„сзху1Е 0,16 ±0,05

MGdel- Pu¿xylE 0,22 ± 0,05

MGdel- PL-taoXylE 0,25 ±0,05

Как можно видеть на Рис. 9, присутствие любой из использованных промоторных модификаций гена ху1Е приводило к восстановлению роста РТБ-дефектного штамма на глюкозе, причем наблюдаемый эффект был тем более выражен, чем более эффективный промотор использовался для

транскрипции ху1Е. Так, величина скорости роста ц для клеток, содержащих наиболее «сильный» из используемых промоторов составляла 0.25 (час"1) и была в полтора раза выше величины ц, измеренной для клеток штамма с наиболее «слабым» промотором ?,ас3 (0.16 час"1). Однако, во всех случаях скорость роста штамма дикого типа (0.44 час"1) достигнута не была. Тем не менее, полученный результат означает принципиальную способность транспортера ксилозы Ху1Е к переносу глюкозы внутрь клетки.

Заметим, что скорость роста штамма с наиболее сильной экспрессией гена ху1Е была примерно равна скорости роста, рассчитанной ранее для клеток с наименьшей экспрессией %а1Р (Табл.4), что может говорить о различии в специфичности двух исследуемых транспортных белков. Ху1Е и Са1Р, к О-глюкозе.

2.4. Исследование транспорта глюкозы клетками РТ8 штамма с конститутивной экспрессией гена ху1Е.

О том, что Ху1Е обеспечивает транспорт 2-КВОв, а значит и глюкозы, свидетельствует следующий, обнаруженный нами, факт: присутствие в реакционной среде нефлуоресцирующего субстрата - О-глюкозы, приводит к снижению транспорта аналога в клетку и, как следствие, к заметному ослаблению эффекта тушения флуоресценции. Это возможно только в случае конкуренции двух этих соединений за связывание с белком-транспортером (Рис. 10). Кроме того, в обоих случаях имело место стереоспецифическое ингибирование транспорта 2-ЫВЭС - Э-форма глюкозы подавляла поглощение аналога, в то время как присутствие Ь-формы в реакционной смеси никак не сказывалось на транспорте 2-ЫВОС.

К аналогичному результату приводит и внесение в реакционную среду специфического для Ху1Е сахара - Б-ксилозы, что также подтверждает факт переноса аналога через транспортную систему Ху1Е.

Рис. 10. Подавление транспорта 2-МВЭО в клетках Е.соП с конститутивной экспрессией гена ху1Е в присутствии различных Сахаров

1-О-глюкоза, 2-Ь-глюкоза, 3- О-ксилоза, 4- О-галактоза, 5-Ь-арабиноза, 6- Ь-рамноза, 7- О-фукоза, 8- Ь-фукоза. ^

Рис. 11. Влияние ионофора СССР на скорость поглощения 2-NBDG клетками PTS" штамма Е.соП с конститутивной экспрессией xylE 1 - MG 1655, 2 - MGdel-Pi.taoxy/£

С другой стороны, некоторые другие сахара, будучи добавленными в реакционную смесь, также оказывали влияние на перенос аналога внутрь клетки. Транспорт 2-NBDG через XylE в разной степени был снижен в присутствии D-гапактозы и L-арабинозы (Рис. 10), что может говорить о потенциальной способности XylE к транспорту и этих соединений.

Как упоминалось ранее, XylE относится к семейству Н^-симпортеров, а значит, использует для транспорта субстрата электрохимическую энергию протонного потенциала, присутствующего на цитоплазматической мембране. При добавлении протонного разобщителя, к примеру, карбонилцианид-ш-хлорфенилгидразона (СССР), функция этого белка должна подавляться (Landgraf et al, 1996). Действительно, как можно видеть на Рис. 11, транспорт глюкозы в присутствии СССР сильно снижен в клетках PTS" штамма с конститутивной экспрессией xylE, тогда как уровень транспорта в клетках контрольного штамма MG1655 остался неизменным. Этот факт служит ещё одним доказательством переноса глюкозы именно с помощью протон-зависимымой транспортной системой XylE.

Заметим, что, как и в опыте, описанном ранее для пермеазы галактозы GalP, обеспечение конститутивной экспрессии гена xylE не только привело к увеличению скорости поглощения 2-NBDG клетками штамма MGdel, но и обнаружило зависимость ее от эффективности промотора, используемого для экспрессии гена транспортера. (Рис. 12). Однако при этом скорость транспорта 2-NBDG в клетках с сильной экспрессией xylE совпадает со скоростью поглощения его клетками с наименьшей экспрессией GalP (Табл. 5), что также может свидетельствовать о меньшем сродстве XylE к глюкозе.

убыль флуоресценции,% —ГО СО -С». СЛ CT) —J Со CD о ооооооосэооо Табл. 5. Скорость поглощения 2-NBDG штаммами с конститутивной экспрессией xylE.

Х-----—_____ 0

Штамм Скорость поглощения 2-NBDG, пмоль/мип.

MG1655 0,65 ± 0,05

5 10 15 20 25 3

время, мин. MGdel 0,02 ±0,01

-x-MGdelPI-tac-xylE -e-MGdelPtac3-xylE -»-MGdel -*-MG1655(PTS+) MGde\-Plac3galP 0,09 ±0,01

Рис. 12. Снижение интенсивности флуоресценции 2-ЫВБС в реакционной смеси, содержащей клетки с различным уровнем экспрессии гена ху!Е. MGdel-P L.lacgalP 0,16 ±0,02

MGdel-P(ÍK¿<>>/£ 0,06 ±0,01

MGde\-?L.taoxylE 0,1 ±0,01

2.5. Влияние увеличения активности глюкокиназы на рост PTS" штамма с конститутивной экспрессией гена xylE.

О меньшей, по сравнению с GalP, специфичности XylE к глюкозе свидетельствуют и результаты эксперимента по увеличению активности глюкокиназы в штаммах MGdel с различным уровнем экспрессии xylE. Было показано, что в этом случае увеличение активности глюкокиназы даже в штамме с сильной экспрессией гена транспортера не приводило к ингибированию роста на глюкозе и гибели клеток; более того, с увеличением активности фосфорилирования было отмечено последовательное увеличение скорости роста штаммов на среде с глюкозой (Рис. 13). Так, наилучший рост наблюдался для штамма с максимальным уровнем экспрессии обоих генов -xylE, и g/k: в этом случае расчетный параметр скорости ц = 0,40 час'1 составлял около 90% от скорости роста штамма дикого типа в тех же условиях.

Рис. 13. Влияние увеличения активности глюкокиназы на рост PTS" штамма с экспрессией гена xylE под контролем «сильного» ПрОМОТОра Рыас-

OD54Q

время, час MG1655 -ш- MGdel

-±-Ptac3-glk -*- MGdelPI-tac-xyiE

Pl-tac-g Ik -е- Ptac-g Ik"

2.6. Оценка способности других PTS-независимых транспортеров Сахаров к переносу D-глюкозы внутрь клетки.

Аналогичный, но более простой, подход использовался нами для исследования транспорта глюкозы другими выбранными нами PTS-независимыми системами (Табл. 3).

Для оценки способности выбранных нами транспортеров к переносу глюкозы была проведена Red-зависимая замена регуляторных областей соответствующих генов на синтетический промотор Рцас на хромосоме штамма MGdel по схеме, аналогичной схеме замены регуляторной области гена gal?. Штаммы с конститутивной экспрессией генов fucP, alsABC, araFGH показали эффективный рост на глюкозе, уступая, однако, аналогичным вариантам с конститутивной транскрипцией galP или xylE (Рис. 14, 15). Поскольку в этой работе был использован только один конститутивный промотор Рыас» уровень экспрессии этих генов мог быть не оптимален, поэтому полученный результат означает лишь принципиальную способность соответствующих белковых продуктов обеспечивать транспорт глюкозы, достаточный для роста клеток Е. coli.

0 2 4 6 время, час

-»-МС1655 -ж-МСс!е1-Р1-1ас^сР

-А- MGdel-PI-tacrhaT

— И/К3йе1

-•- И/^е1-РиасагаЕ

время,час

-МС1655

-МСйе1-РИаса1зАВС

-MGdel

-MGdel-PI-tacaraFGH

Рис. 14. Рост РТ8" штамма Е.соН с Рис. 15. Рост РТБ' штамма Е.соИ

конститутивной экспрессией генов с конститутивной экспрессией (исР, агаЕ и гИаТ. генов агаРСН и аЬАВС.

В свою очередь, штаммы с конститутивной экспрессией агаЕ, гИаТ, гЬзАВС, хуШСН, как и контрольный РТБ -штамм МСс1е1, не были способны к выраженному росту на среде с глюкозой. Нельзя было исключать, однако, что при конститутивном синтезе этих генов с сильного промотора Рыас поток глюкозы в клетку уже настолько велик, что даже природный уровень активности глюкокиназы обеспечивает токсичные для клетки количества Б-глюкозо-6-фосфата. Для проверки этого предположения на основе названых штаммов были созданы их Рисгварианты с пониженной экспрессией гена-транспортера, после чего клетки были проверены на способность к росту на минимальной среде с глюкозой. Заметный рост таких штаммов обнаружен не был, что говорит, по-видимому, о неспособности транспортеров АгаЕ, ШгаТ, ШЬАВСЭ и ХуШвН к переносу Э-глюкозы, поэтому в дальнейшем эти транспортеры нами не исследовались.

2.7. Исследование транспорта глюкозы клетками РТБ штамма с конститутивной экспрессией генов акАВС, агаГСН,/исР.

При изучении транспорта 2-МВОО в клетках с конститутивной экспрессией акАВС, агаГСН, /исР применялись подходы, аналогичные тем, что были использованы при исследовании Ху1Е . Добавление в реакционную среду специфического для данного транспортера субстрата, а также О-глюкозы приводило к ингибированию транспорта аналога внутрь клеток с конститутивной экспрессией генов РТБ-независимых транспортеров. Причем, этот эффект носил стереоспецифический характер (Рис.16). Подобный же эффект вызывало присутствие в реакционной среде некоторых других Сахаров, что, вероятно, говорит о способности АЬАВС, АгаРвН, РисР к их транспорту. В частности, Б-ксилоза может служить субстратом для АгаРОН.

J* ■ FucP □ AraFGH gAlsABC —

-

_ ■ . .......... . .

1 1

I 1

.OLI %жь\ %-я^.г Ш Щ, sJ

— ■ I 1 ""I.......... .."Т "I1

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 16. Подавление транспорта 2-NBDG в клетках E.coli с конститутивной экспрессией генов fucP, als А ВС, araFGH в присутствии различных Сахаров:

1-D-ксилоза, 2-О-глюкоза, З-Б-галактоза, 4-Ь-арабиноза, 5-Ь-рамноза, 6-Ь-глюкоза, 7-О-фукоза, 8-Ь-фукоза.

Следует отметить интересный факт - скорость поглощения аналога глюкозы через БисР была сравнима со скоростью, рассчитанной для Ху1Е, что согласуется с данными о скорости роста соответствующих штаммов. (Рис. 17, Табл. 6). В это же время скорость транспорта 2-ЫВОО АВС-зависимыми транспортерами АЬАВС и АгаБОН была гораздо более высока и сравнима со скоростью, рассчитанной для штамма дикого типа с нативной фосфотрансферазной системой. Этот факт не согласуется с данными о скоростях роста соответствующих штаммов и мы не имеем пока объяснения этому феномену. Возможно, дело в структуре транспортных систем и использовании различных источников энергии для процесса транспорта. Изучение этого вопроса является предметом наших дальнейших исследований.

О 10 20 30

время, мин

-е- MGdelPI-tac-alsABC -л- MGdelPI-tac-araFGH

-*- MGdelPI-tac-fucP -*-MGdel

-4— MG1 655(PTSl+)_

Рис. 17. Снижение интенсивности флуоресценции 2-МВОО в клетках с конститутивной экспрессией генов РТБ-независимого транспорта- /.исР, аЬАВС и агаРСН

Табл. 6. Скорость поглощения 2-МВОО штаммами с конститутивной экспрессией генов /исР, аЬАВС и агаРСН

Штамм Скорость поглощения 2-NBDG, нмоль/мин.

MG1655 0,65 ± 0,05

MGdel-GalP 0,16 ±0,03

MGdel-XylE 0,10 ±0,01

MGdel-FucP 0,08 ±0,01

MGdel-AraFGH 0,30 ± 0,03

MGdel-AlsABC 0,40 ± 0,03

3. Влияние PTS-независимого транспорта глюкозы на синтез некоторых аминокислот штаммами-продуцентами.

Как было отмечено во введении, использование PTS-независимого транспорта для переноса глюкозы в клетку может повысить уровень синтеза ряда аминокислот клетками штаммов-продуцентов в связи с экономией фосфоенолпирувата и, как следствие, увеличением его потока в биосинтетические пути. Очевидно этот эффект может иметь место в тех продуцентах, где PEP является непосредственным предшественником целевой аминокислоты, а именно, при синтезе аминокислот ароматического ряда и членов семейства аспарагиновой кислоты и L-аспарагина.

В нашей работе мы исследовали влияние конститутивного PTS-независимого транспорта глюкозы на синтез L-фенилаланина и L-треонина соответствующими штаммами-продуцентами. В клетках штаммов AJ12739 (продуцент L-фенилаланина) и В3996 (продуцент L-треонина) конститутивным промотором PL.tac были заменены регуляторные области одного из четырех транспортеров моносахаров, показавших способность к переносу глюкозы: FucP, XylE, AraFGH и AlsABC. Полученные штаммы культивировали на соответствующих ферментационных средах в течение 4872 часов и измеряли накопление целевой аминокислоты в культуральной жидкости. Результаты экспериментов представлены в Табл. 7 и Табл. 8.

Табл.7. Влияние PTS-независимого транспорта глюкозы на накопление L-фенилаланина клетками штамма-продуцента

Штамм OD540 L-фенилалапин

г/л %

AJ12739 14,7 ± 0,3 1,9 ±0,1 100

AJ12739PL.,acfucP 14,1 ±0,3 2,3 ±0,1 121

AJ12739PL.,acxylE 14,2 ± 0,3 2,4 ±0,1 126

Табл. 8. Влияние РТ8-независимого транспорта глюкозы на накопление L-тpeoнинa клетками штамма-продуцента

Штамм OD540 L-треонин

г/л %

В-3996 15,5 ±0,3 16,0 ±0,2 100

В-3996 PL.tocfiicP 17,4 ±0,2 19,4 ±0,2 121

В-3996 Рыасху1Е 19,2 ±0,2 22,4 ± 0,2 140

Использование PTS-независимого транспорта глюкозы, помимо экономии PEP, может быть выгодно для штаммов, у которых непосредственное поступление глюкозы в клетку является «узким местом» всех последующих метаболических процессов. Иллюстрацией тому служит изменение скорости синтеза L-треонина в клетках штамма В-3996 при дополнении активной PTS альтернативным PTS-независимым путем транспорта глюкозы в клетку за счет конститутивной экспрессии генов xylE либо fucP. Как видно на Рис. 18, накопление треонина такого рода штаммами в течение всего процесса ферментации происходит быстрее, чем накопление этой аминокислоты реципиентным штаммом с неактивным PTS-независимым транспортом.

время, час —♦— В3996 -«—133996-xylEE -6- B3996-fucP

Рис.18. Накопление Ь-треонина в ферментационной среде модельным штаммом-продуцентом В-3996 с конститутивной экспрессией генов ху1Е и/,исР.

Конститутивная экспрессия генов РТЗ-нсзависимого транспорта действительно приводит к увеличению накопления ряда аминокислот в ферментационной среде при культивировании соответствующих штаммов-продуцентов, однако, этот эффект имеет избирательный характер. Очевидно, это связано с разной эффективностью работы исследуемых транспортеров, а также с тем, достигнуто или нет в клетке оптимальное соотношение концентраций РЕР/пируват. Для обеспечения максимального эффекта использования РТ8-независимых транспортеров глюкозы, по-видимому, необходимо тонкое регулирование уровня экспрессии соответствующих генов.

Выводы:

• Разработан методический подход, позволяющий оценивать способность различных PTS-независимых транспортеров углеводов переносить в клетки E.coli глюкозу.

• На основании разработанного подхода впервые продемонстрирована способность 4-х транспортных систем (XylE, FucP, AraFGH и AlsABC) переносить D-глюкозу в клетки E.coli при конститутивной экспрессии кодирующих их генов.

• Обнаружено, что чрезмерное увеличение экспрессии генов, кодирующих PTS-независимый транспортер GalP и глюкокиназу Glk, приводит к ингибированию роста штамма Е. coli с неактивной PTS. Это явление, вероятно, связано с накоплением в клетках высоких концентраций фосфорилированных производных D-глюкозы вследствие дисбаланса между стадиями их синтеза и продуктивного вовлечения в клеточный метаболизм.

• Показано, что использование новых PTS-независимых транспортеров D-глюкозы, дополнительно к нативной фосфотрансферазной системе, увеличивает накопление и скорость синтеза ряда аминокислот соответствующими штаммами-продуцентами E.coli.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Рыбак К.В., Сливинская Е.А., и др. Способ получения L-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae (XylE). Патент РФ №2304615. Выдан 20.08.2007.

2. Сливинская Е.А., Рыбак К.В., Каташкина Ж.И., Машко С.В., Козлов Ю.И. «Конститутивный синтез в Escherichia coli низкоафинных Н+-симпортеров D-галактозы (GalP), D-ксилозы (XylE) или L-фукозы (FucP) приводит к возможности эффективного роста PTS'-штаммов на среде с D-глюкозой» Биотехнология, 2007, №5, 24-37 .

3. Рыбак К.В., Сливинская Е.А., и др. Способ получения L-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae (FucPIKUR). Патент РФ № 2318870. Выдан 10.03.2008.

4. Рыбак К.В., Сливинская Е.А., и др. Способ получения L-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae (AraFGH). Патент РФ №2338783. Выдан 20.11.2008.

5. Рыбак К.В., Сливинская Е.А., и др. Способ получения L-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae (AlsABC). Патент РФ №2351646. Выдан 10.04.2009.

6. Сливинская Е.А., Рыбак К.В., Шереметьева М.Е., Машко С.В., Козлов Ю.И. «Влияние конститутивного синтеза Н+-симпортеров некоторых моносахаридов на потребление D-глюкозы клетками Е.соЧ». Материалы 5-го Конгресса Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров, 21-27.06.2009.

Заказ № 127/02/2011 Подписано в печать 18.02.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сливинская, Екатерина Александровна

I. Введение

II. Обзор литературы

1.Бактериальная цитоплазматическая мембрана и мембранные белки б

1.1.Строение и функции цитоплазматической мембраны

1.2. Мембранные белки

1.3. Функции мембранных белков

1.4. Перенос различных веществ через цитоплазматическую мембрану и транспортные белки

2.Активный транспорт углеводов внутрь клетки и фосфоенолпируват- 13 зависимая фосфотрансферазная система

2.1. Белки PTS

2.1.1. El

2.1.2. НРг

2.1.3. Глюкозо-специфические белки

2.2. Хромосомная организация генов PTS

2.3. Регуляторная роль PTS

2.4. Регуляция синтеза белков PTS

3. PTS- независимый транспорт углеводов в клетку E.coli

3.1. MFS-суперсемейство мембранных транспортеров

3.2. GalP - Н+/симпортер D-галактозы

3.3. Суперсемейство АВС-транспортеров

4.Исиользование PTS-независимого транспорта при создании 44 высокоэффективных продуцентов

III. Материалы и методы

IV. Результаты и обсуждение 54 1. Разработка методического подхода для оценки способности PTSнезависимых транспортных систем к переносу глюкозы на примере пермеазы галактозы GalP

1.1. Конструирование штамма Е. coli MG1655 с делецией генов PTS

1.2. Обеспечение конститутивной экспрессии гена galP.

1.3. Оценка способности пермеазы галактозы GalP к транспорту D-глюкозы внутрь клетки.

1.4. Изучение транспорта D-глюкозы в клетках дефектного по PTS штамма 5 В E.coli с разным уровнем экспрессии гена galP.

1.5. Влияние увеличения активности глюкокиназы на рост PTS" штамм, 60 E.coli с конститутивной экспрессией гена galP.

1.6. Влияние амплификации гена ybiV на рост штамма MGdel с сильно! 62 экспрессией генов galP и glk в минимальной среде с глюкозой.

2. Идентификация новых PTS-независимых систем транспорта углеводов, 64 способных к переносу D-глюкозы внутрь клетки.

2.1. Выбор PTS-независимых транспортеров, потенциально способных к 64 переносу D-глюкозы.

2.2. Обоснование выбора XylE как потенциального транспортера глюкозы.

2.3. Изучение роста PTS" штамма E.coli с различным уровнем экспрессии 67 гена xylE на среде с глюкозой

2.4. Исследование транспорта глюкозы клетками PTS" штамма с 68 конститутивной экспрессией гена xylE.

2.5. Влияние увеличения активности глюкокиназы на рост PTS" штамма ( 71 конститутивной экспрессией гена xylE.

2.6. Оценка способности других PTS-независимых транспортеров Сахаров i 72 переносу D-глюкозы внутрь клетки.

2.7. Исследование транспорта глюкозы клетками PTS" штамма с 74 конститутивной экспрессией генов alsABC, araFGH, fucP.

3. Влияние PTS-независимого транспорта глюкозы на синтез некоторьн 76 аминокислот штаммами-продуцентами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск путей транспорта D-глюкозы в клетки Escherichia coli, альтернативных фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системе"

Актуальность темы. Escherichia coli широко используется в производстве ряда биологически активных веществ, в том числе аминокислот, применяемых в различных отраслях - пищевой, кормовой, фармацевтической промышленности. Для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов методами метаболической инженерии требуется детальное изучение основных метаболических процессов, протекающих в микробной клетке, в число которых входит и перенос веществ через цитоплазматическую мембрану.

D-глюкоза применяется в микробиологическом производстве в качестве источника углерода для накопления бактериальной биомассы и биосинтеза биологически активных соединений. Показано, что у ряда продуцентов недостаточная эффективность транспорта глюкозы в клетку является фактором, ограничивающим продуктивность.

Известно, что в клетках Е. coli основной путь утилизации D-глюкозы начинается с ее транслокации через цитоплазматическую мембрану и фосфорилирования (с образованием D-глюкозо-б-фосфата), осуществляемых фосфоенолпируват:углевод фосфотрансферазной системой (PTS) с использованием фосфоенолпирувата (РЕР) в качестве донора фосфатной группы. При этом на долю PTS приходится 50% пула фосфоенолпирувата, в то время как на долю основных биосинтетических ферментов, использующих РЕР как субстрат, - фосфоенолпируваткарбоксилазы, пируваткиназы, уридиндифосфат-Ы-ацетилглюкозамин-енолпирувил-трансферазы и З-деокси-О-арабино-гептулозонат-7-фосфатсинтазы - 16, 15, 16, 3%, соответственно (122).

К настоящему времени большинство работ, посвященных увеличению эффективности транспорта глюкозы в клетку, было связано именно с модификацией активности PTS (24). Однако, транспорт через эту систему не выгоден в тех случаях, когда расходующийся на перенос и фосфорилирование глюкозы, фосфоенолпируват одновременно является прямым метаболическим предшественником целевого продукта (к примеру, аминокислот аспарагинового семейства). Таким образом, экономия РЕР вследствие использования клетками альтернативных PTS-независимых систем транспорта глюкозы, имеет очевидные преимущества для подобных процессов (18,34,47).

На момент начала работы были известны две PTS-независимые системы транспорта моносахаров Е. coli, способные к переносу глюкозы. Это GalP - низкоафинный Н+-симпортер (пермеаза) D-галактозы (46), который из-за схожести пространственной структуры, субстратной специфичности и способности к ингибированию некоторыми антибиотиками часто рассматривают в качестве бактериального аналога пассивного транспортера глюкозы млекопитающих - GLUTI (74), и АТФ-зависимый транспортер (АВС-транспортер) ß-метилгалактозидов MglABC - высокоаффинный переносчик, активный на завершающих стадиях культивирования при малых концентрациях глюкозы (37). Было показано, что использование этих транспортных систем в дополнение к активной PTS позволяет увеличить выход целевого продукта при культивировании ряда штаммов-продуцентов Е. coli на средах с глюкозой (118,121).

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлся поиск PTS-независимых транспортеров Сахаров E.coli, способных к переносу глюкозы внутрь клетки. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- Разработка методического подхода к изучению процесса PTS-независимого транспорта глюкозы (на примере пермеазы галактозы GalP);

- Поиск и исследование транспортных систем E.coli, потенциально способных к транспорту глюкозы;

- Исследование влияния этапа внутриклеточного фосфорилирования глюкозы на эффективность ее утилизации клеткой;

- Использование систем PTS-независимого транспорта глюкозы при создании штаммов-продуцентов аминокислот.

Научная новизна и практическая ценность работы. 1) на основании разработанного методического подхода впервые продемонстрирована способность ряда PTS-независимых транспортных систем (XylE, FucP, AraFGH и AlsABC) к переносу D-глюкозы в клетки E.coli; 2) увеличение уровня экспрессии гена glk, кодирующего глюкокиназу, повышает эффективность утилизации D-глюкозы при использования PTS-независимого пути ее транспорта. Однако, чрезмерное увеличение глюкокиназной активности наряду с сильной конститутивной экспрессией гена galP, кодирующего PTS-независимый переносчик галактозы, приводит к ингибированию роста клеток E.coli с неактивной PTS на минимальной среде с глюкозой. Показано, что наблюдаемый эффект, может быть связан с накоплением токсического для клетки количества фосфорилированных производных D-глюкозы вследствие дисбаланса между стадиями их синтеза и продуктивного вовлечения в клеточный метаболизм; 3) использование новых PTS-независимых транспортеров D-глюкозы, дополнительно к нативной фосфотрансферазной системе, увеличивает накопление и скорость синтеза ряда аминокислот соответствующими штаммами-продуцентами E.coli.

Результаты работы могут быть полезны при дальнейшем изучении систем транспорта углеводов, исследованных в данной работе, и процессов утилизации Б-глюкозы клетками Е.соИ, а также найти практическое приложение в биотехнологии.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на V Съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (ВОГиС) (Москва, 21-27 июня 2009г.) и на смотре-конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» (Москва, 16-17 июня 2010г.).

Диссертационная работа была апробирована на семинаре совместного заседания секций «Молекулярная биология» и «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» и Научно-Технического совета НИИ «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ») 20 декабря 2010 года.

II. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сливинская, Екатерина Александровна

V. Выводы:

• Разработан методический подход, позволяющий оценивать способность различных PTS-независимых транспортеров углеводов переносить в клетки E.coli глюкозу.

• На основании разработанного подхода впервые продемонстрирована способность четырех транспортных систем (XylE, FucP, AraFGH и AlsABC) переносить D-глюкозу в клетки E.coli при конститутивной экспрессии кодирующих их генов.

• Обнаружено, что чрезмерное увеличение экспрессии генов, кодирующих PTS-независимый транспортер GalP и глюкокиназу Glk, приводит к ингибированию роста штамма Е. coli с неактивной PTS. Это явление, вероятно, связано с накоплением в клетках высоких концентраций фосфорилированных производных D-глюкозы вследствие дисбаланса между стадиями их синтеза и продуктивного вовлечения в клеточный метаболизм.

• Показано, что использование новых PTS-независимых транспортеров D-глюкозы, дополнительно к нативной фосфотрансферазной системе, увеличивает накопление и скорость синтеза ряда аминокислот соответствующими штаммами-продуцентами E.coli.

Заключение:

В ходе выполнения данной работы было показано, что в условиях конститутивного синтеза низкоафинные Н^-симпортеры D-ксилозы (XylE) и L-фукозы (FucP) и АТФ-зависимые транспортеры D-аллозы (AlsABC) и D-арабинозы (AraFGH) способны обеспечить транспорт D-глюкозы в клетки Е. coli с эффективностью достаточной для активного роста бактерий. Во всех случаях для обеспечения конститутивной транскрипции генов транспортеров с помощью Red-зависимой рекомбинации проводилась замена их природной регуляторной области на высокоэффективные /ас-подобные промоторы. Замена промоторов во всех случаях приводила к более эффективному росту клеток на тех специфических моносахарах, гены транспорта которых подвергались модификации. Сравнивая между собой различные штаммы, можно было предположить относительное сродство того или иного транспортера к глюкозе внутри каждой из групп: так, среди исследованных Н1-симпортеров наибольшую специфичность, вероятно, имеет уже известный GalP, наименьшую - FucP, а из двух способных к переносу глюкозы АТФ-зависимых транспортеров большим сродством обладает переносчик D-аллозы AlsABC. В то же время, сравнение транспортеров разных групп, видимо, является не вполне корректным ввиду их отличной структуры и использования разных источников энергии. Полученные данные позволяют оценить потенциальную «биотехнологическую» пригодность того или иного PTS-независимого пути утилизации глюкозы клетками Е. coli. На практике, в каждом конкретном случае, оптимизация роста штаммов, по-видимому, может быть достигнута вариацией «силы» промоторов, обеспечивающих транскрипцию как гена транспортера, так и гена глюкокиназы, активность белкового продукта которого обеспечивает внутриклеточное фосфорилирование глюкозы. Эта стратегия оптимизации продемонстрирована нами в случае PTS-независимого транспорта глюкозы с помощью XylE. Здесь наилучший рост модифицированного штамма на глюкозе наблюдался в случае транскрипции генов xylE и glk с наиболее сильного из использованных промоторов - Pl-íoc- Однако для оптимального баланса активности транспортера и глюкокиназы в случае GalP требуется существенно сниженная транскрипция galP (в наших экспериментах - с самого «слабого» промотора Ptacj).

Выбор транспортеров Е. coli для проверки их на способность к переносу глюкозы основывался на следующих соображениях: это были мембранные белки Е. coli, с экспериментально показанной функцией транспорта моносахаров — гексоз (D-галактоза,

D-аллоза и L-рамноза ) и пентоз (D-ксилоза, L-арабиноза, D -арабиноза и L-фукоза), структурно схожих с D-глюкозой.

Принято считать, что известная способность GalP эффективно транспортировать не только D-галактозу, но и D-глюкозу обусловлена высокой структурной и функциональной гомологией этого белка с входящими в SP семейство транспортерами глюкозы млекопитающих (GLUTI, GLUT2, GLUT3 и GLUT4). С этой точки зрения, если и можно было ожидать от исследованных в данной работе транспортеров способности к переносу глюкозы, то наиболее реальным кандидатом мог считаться АгаЕ, гомология которого с GalP - 64% идентичных аминокислотных остатков (в то время как у XylE -34%) (43,44). Кроме того, именно АгаЕ имеет консервативное для GalP и GLUT од 4 расположение остатка Asn в середине ТМ11, и также как и эти транспортеры глюкозы чувствителен к ингибированию цитохалазином Б. Тем не менее, в наших экспериментах увеличенная активность АгаЕ не привела к эффективному росту PTS^-клеток Е. coli на среде с глюкозой, что, по-видимому, можно объяснить не способностью этого белка к транспорту D-глюкозы.

В то же время для XylE ранее не было показано сродство к D-галактозе или к D-глюкозе - основных субстратов для GalP (28). Более того, меньшая, чем у АгаЕ структурная гомология с GalP, наличие остатка Gin (вместо Asn394 в консервативном районе известных транспортеров D-глюкозы) могли вызвать сомнение в потенциальной способности XylE транспортировать глюкозу. Однако интересно, что GalP наряду с транспортом D-галактозы и D-глюкозы обладал хотя и низкоэффективным, но специфическим сродством и к D-ксилозе. Более того, замена Asn394 в GalP на Gin, которая, казалось бы, должна приблизить мутантный белок по специфичности к XylE, не только снизила его сродство к D-галакгозе, но в существенно большей степени уменьшила эффективность транспорта D-ксилозы. Тем самым, не стоит переоценивать возможность предсказания субстратной специфичности этих симпортеров на основе лишь аминокислотных гомологий. Действительно, именно XylE, обладающий «худшей» по сравнению с АгаЕ гомологией с GalP, оказался способен, по данным настоящей работы, к эффективному транспорту D-глюкозы.

Казалось бы, сравнительный конформационный анализ специфических и потенциального (D-глюкоза) субстратов мог заранее предсказать полученный в данной работе результат. Действительно, наиболее энергетические выгодные конформации для D-глюкозы, D-галактозы, D-ксилозы, D-аллозы и D-арабинозы как и для большинства других D-пираноз относятся к 4Ci, в то время как для L-арабинозы и L-рамнозы (а также - L-маннозы и L-ликсозы, также субстратов для RhaT) - к 'С4. Поэтому схожесть субстратов позволяла предполагать, что не только ва1Р (как уже было известно ранее), но и, например, ХуШ может обеспечить эффективный транспорт Б-глюкозы, в то время как АгаЕ и ИЪаТ по этому признаку не являлись потенциальными кандидатами. Несмотря на то, что эти представления о потенциальных транспортерах О-глюкозы, основанные на достаточно простой модели сравнения их специфических субстратов, полностью совпали с полученными экспериментальными данными, мы бы не преувеличивали значение такого поверхностного анализа.

Есть и второе обстоятельство, которое необходимо отметить. К настоящему времени данные о пространственной структуре исследованных в работе специфических транспортеров и их комплексов с субстратами отсутствуют. Однако в рамках рассматриваемой проблемы представляет определенный интерес рентгено-структурный анализ некоторых комплексов периплазматических рецепторов Е. соИ с сахарами (113). Результаты такого анализа, примененного к Б-глюкозо/Е)-галактозному периплазматическому рецептору, показывают, что структурно очень схожие субстраты (Б-галактоза и Б-глюкоза) ориентированы в междоменном центре связывания этого белка различными способами. И именно это обеспечивает возможность реализации специфических контактов лишь отдельных радикалов указанных Сахаров с конкретными аминокислотными остатками рецептора.

Все вышесказанное указывает на то, что полученные в настоящей работе экспериментальные результаты могут иметь не только практическое значение для биотехнологии, но и быть полезны для фундаментальных структурно-функциональных исследований бактериальных переносчиков Сахаров.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сливинская, Екатерина Александровна, Москва

1. Генис Р. 1997 Биомембраны. Молекулярная структура и функции. Москва. Мир

2. Гершанович В.Н. 1998 Фосфоенолпируват-углеводфосфотрансферазная система и ее роль в физиологии грамотрицательных бактерий. Молекулярная генетика ,микробиология и вирусология, N 3.-С.8-15

3. Гершанович В.Н. 2003 Плейотропная функция фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы у бактерий. Сообщение I Молекулярная генетика .микробиология и вирусология,. -N 1.-С. 14-26

4. Гершанович В.Н. 2003 Плейотропная функция фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы. Сообщение II Молекулярная генетика ,микробиология и вирусология,. -N 3.-C.3-8

5. Каташкина Ж.И. 2003 Разработка и использование методов направленной модификации целевых генетических локусов хромосомы E.coli при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот.дисс. на соиск. уч.ст. канд.биол.наук Москва. 120 стр.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва. Мир.

7. Миллер Д. 1976. Эксперименты в молекулярной генетике. Москва. Мир.

8. Andrade JM, Arraiano СМ. 2008 PNPase is a key player in the regulation of small RNAs that control the expression of outer membrane proteins. RNA. Mar;14(3):543-51

9. Badia J, Gimenez R, Baldoma L, Barnes E, Fessner WD, Aguilar J. 1991 L-lyxose metabolism employs the L-rhamnose pathway in mutant cells of Escherichia coli adapted to grow on L-lyxose. J Bacteriol. Aug; 173(16):5144-50.

10. Baldwin S.A., Henderson P.J.F. 1989. Homologies between sugar transporters from eukaryotes and prokaryotes. Annu. Rev. Physiol. V. 51, p.459-471.

11. Bassilana M., Damiano-Forano E., Leblanc G. 1985. Effect of membrane potential on the kinetic parameters of the Na+ or Hf melibiose symporter in Escherichia coli membrane vesicles. Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 129, p.626-631.

12. Bettenbrock K, Fischer S, Kremling A, Jahreis K, Sauter T, Gilles ED. 2006 A quantitative approach to catabolite repression in Escherichia coli. J Biol Chem. Feb 3;281(5):2578-84. Epub 2005 Nov 1

13. Blake R., Hager L.P., Gennis R.B. 1978. Activation of pyruvate oxidase by monomeric and micellar amphiphiles. 1978. J. Biol. Chem. V. 253, p.1963-1971.

14. Brosius J, Erfle M, Storella J. 1985 Spacing of the -10 and -35 regions in the tac promoter. Effect on its in vivo activity. J Biol Chem. Mar 25;260(6):3539-41.

15. Bongaerts J, Krämer M, Müller U, Raeven L, Wubbolts M. 2001 Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds. Metab Eng. Oct;3(4):289-300. Review

16. Bradbeer C. 1993. The proton motive force drives the outer membrane transport of cobalamin in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 175, p.3146-3150.

17. Brückner, R., and F. Titgemeyer. 2002. Carbon catabolite repression in bacteria: choice of the carbon source and autoregulatory limitation of sugar utilization. FEMS Microbiol. Lett. 209141-148.

18. Büchel D.B., Erni B. 1980. Sequence of the lactose permease gene. Nature. V. 283, p.541-545.

19. Cairns MT, McDonald TP, Home P, Henderson PJ, Baldwin SA. 1991 Cytochalasin B as a probe of protein structure and substrate recognition by the galactose/H+ transporter of Escherichia coli. J Biol Chem. May 5;266(13):8176-8183.

20. Carpousis, A.J. 2002 The Escherichia coli RNA degradosome: Structure, function, and relationship in other ribonucleolytic multienzyme complexes. Biochem. Soc. Trans.-,30:150-155.

21. Chatteijee R, Millard CS, Champion K, Clark DP, Donnelly MI. 2001 Mutation of the ptsG gene results in increased production of succinate in fermentation of glucose by Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. Jan;67(l): 148-54.

22. Curtis S.J., Epstein W. 1975 Phosphorylation of D-glucose in Escherichia coli mutants defective in glucosephosphotransferase, mannosephosphotransferase, and glucokinase. J Bacteriol. Jun; 122(3): 1189-99.

23. Datsenko, K.A., Wanner, B.L. 2000 One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. £c/.;97:6640-6645

24. Davis EO, Jones-Mortimer MC, Henderson PJ. 1984Location of a structural gene for xylose-H+ symport at 91 min on the linkage map of Escherichia coli K12. J Biol Chem. Feb 10;259(3): 1520-5.

25. Death A., Ferenci T. 1993 The importance of the binding-protein-dependent Mgl system to the transport of glucose in Escherichia coli growing on low sugar concentrations. Res Microbiol. Sep;144(7):529-37.

26. Deutscher J, Francke C, Postma PW. 2006; How phosphotransferase system-related protein phosphorylation regulates carbohydrate metabolism in bacteria. Microbiol Mol Biol Rev. 70:9391031

27. Eisele J.-L., Rosenbusch J.P. 1989. Crystallization of porin using short chain phospholipids. J. Molec. Biol. V. 206, p. 209-212.

28. Ferenci, T. 2008. Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment. Adv. Microb. Physiol. 53169-229.

29. Flores N., Xiao J., Berry A., Bolivar F., Valle F. 1996 Pathway engineering for the production of aromatic compounds in Escherichia coli. Nat Biotechnol. May;14(5):620-3.

30. Flores S., Gösset G., Flores N., de Graaf A. A., Bolivar F. 2002, Analysis of carbon metabolism in Escherichia coli strains with an inactive phosphotransferase system by 13C Labeling and NMR Spectroscopy Met. Engineering 4, 124-137

31. Franchini A.G., Egli T. 2006 Global gene expression in Escherichia coli K-12 during short-term and long-term adaptation to glucose-limited continuous culture conditions. Microbiology. Jul;152(Pt 7):2111-27.

32. Geissmann TA, Touati D. 2004 Hfq, a new chaperoning role: binding to messenger RNA determines access for small RNA regulator. EMBO J. Jan 28;23(2):396-405

33. Gösset G. 2005 Improvement of Escherichia coli production strains by modification of the phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system. Microb Cell Fact. May 16;4(1):14.

34. Gösset, G., Z. Zhang, S. Nayyar, W. A. Cuevas, and M. H. Saier, Jr. 2004. Transcriptome analysis of Crp-dependent catabolite control of gene expression in Escherichia coli. J. Bacterid. 1863516-3524

35. Heller K.B., Lin E.C., Wilson T.H. 1980. Substrate specificity and transport properties of the glycerol facilitator of Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 144, p.274-278.

36. Henderson PJ. 1990 Proton-linked sugar transport systems in bacteria J Bioenerg Biomembr. Aug;22(4):525-69.

37. Henderson PJ, Maiden MC 1990 Homologous sugar transport proteins in Escherichia coli and their relatives in both prokaryotes and eukaryotes. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sei. Jan 30;326(1236):391-410

38. Henderson P., Giddens R., Jones-Mortimer M. 1977 Transport of galactose, glucose and their molecular analogues by Escherichia coli K12 Biochem. J., 162,309-320

39. Hernändez-Montalvo V, Valle F, Bolivar F, Gösset G. 2001 Characterization of sugar mixtures utilization by an Escherichia coli mutant devoid of the phosphotransferase system. Appl Microbiol Biotechnol. Oct;57(l-2):186-91

40. Higgins C.F. 2001. ABC transporters: physiology, structure and mechanism: an overview. Res. Microbiol. V. 152, p.205-210.

41. Higgins C.F., Ames G.E. 1981. Two periplasmic transport proteins which interact with a common membrane receptor show extensive homology: complete nucleotide sequences. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 78, p.6038-6042.

42. Higgins C.F., Haag P.D., Nikaido K., Ardeshir G„ Garcia G., Ames G.F.-L. 1982. Complete nucleotide sequence and identification of membrane components of the histidine transport Operon of S. typhimurium. Nature. V. 298, p.723-727.

43. Home P., Henderson P.J. 1983 The association of proton movement with galactose transport into subcellular membrane vesicles of Escherichia coli. Biochem J. Mar 15;210(3):699-705.

44. Kadner RJ. 1990. Vitamin Bi2 transport in Escherichia coli: energy coupling between membranes. Mol. Microbiol. V. 4, p.2027-2033.

45. Kadner R.J., Murphy G.P., Stephens C.M. 1992 Two mechanisms for growth inhibition by elevated transport of sugar phosphates in Escherichia coli. J Gen Microbiol. 0ct;138(10):2007-14

46. Kerppola R.E., Ames G.F.-L. 1992. Topology of the hydrophobic membrane-bound components of the histidine periplasmic permease. Comparison with other members of the family. J. Biol. Chem. V. 267, p.2329-2336.

47. Khankai R, Chin JW, Ghosh D, Cirino PC. 2009 Transcriptional effects of CRP* expression in Escherichia coli. J Biol Eng. Aug 24;3:13.

48. Kimata K, Inada T, Tagami H, Aiba H. 1998 A global repressor (Mlc) is involved in glucose induction of the ptsG gene encoding major glucose transporter in Escherichia coli. Mol Microbiol.',29:1509-1519

49. Kimata K, Tanaka Y, Inada T, Aiba H. 2001 Expression of the glucose transporter gene, ptsG, is regulated at the mRNA degradation step in response to glycolytic flux in Escherichia coli. EMBO J. Jul 2;20(13):3587-95

50. Lee S-J, Boos W, Bouche JP, Plumbridge J. 2000 Signal transduction between a membrane-bound transporter, PtsG, and a soluble transcription factor, Mlc, of Escherichia coli. EMBO J.; 19:5353-5361

51. Lindsay S.E., Bothast R.J., Ingram L.O. 1995 Improved strains of recombinant Escherichia coli for ethanol production from sugar mixtures. Appl Microbiol Biotechnol. Apr;43(l):70-5.

52. Linton KJ, Higgins CF. 1998 The Escherichia coli ATP-binding cassette (ABC) proteins. Mol Microbiol. Apr;28(l):5-13. Review.

53. Maiden MC, Jones-Mortimer MC, Henderson PJ. 1988 The cloning, DNA sequence, and overexpression of the gene araE coding for arabinose-proton symport in Escherichia coli K12. J Biol Chem. Jun 15;263(17):8003-8010.

54. Maki K, Morita T, Otaka H, Aiba H. 2010 A minimal base-pairing region of a bacterial small RNA SgrS required for translational repression of ptsG mRNA. Mol Microbiol. May;76(3):782-92

55. McDonald TP, Henderson 2001 Cysteine residues in the D-galactose-H+symport protein of Escherichia coli: effects of mutagenesis on transport, reaction with N-ethylmaleimide and antibiotic binding. PJBiochem J. Feb l;353(Pt 3):709-17.

56. Metzler D.E. 2001 Biochemistry: The chemical reactions of living cells: Sugars, polysaccharides, and glucopeptides V.l Ch.4 -N-Y: Academic Press, USA, 161-198

57. Morita T, El-Kazzaz W, Tanaka Y, Inada T, Aiba H. 2003 Accumulation of glucose 6-phosphate or fructose 6-phosphate is responsible for destabilization of glucose transporter mRNA in Escherichia coli. J Biol Chem. May 2;278(18): 15608-14.

58. Morita, T., Maki, K., Aiba, H. 2005 RNase E-based ribonucleoprotein complexes: Mechanical basis of mRNA destabilization mediated by bacterial noncoding RNAs. Genes & Dev.; 19:2176—2186.

59. Mueckler M, Caruso C, Baldwin SA, Pánico M, Blench I, Morris HR, Allard WJ, Lienhard GE, Lodish HF. 1985 Sequence and structure of a human glucose transporter. Science. Sep 6;229(4717):941-945.

60. Nam TW, Jung HI, An YJ, Park YH, Lee SH, Seok YJ, Cha SS 2008 Analyses of Mlc-IIBGlc interaction and a plausible molecular mechanism of Mlc inactivation by membrane sequestration. Proc Natl Acad Sei USA. Mar 11;105(10):3751-6

61. Nam T-W, et al. 2001 The Escherichia coli glucose transporter enzyme IICBGl0 recruits the global repressor Mlc. EMBO J.;20:491^198.

62. Nanchen A, Schicker A, Revelles O, Sauer U. 2008 Cyclic AMP-dependent catabolite repression is the dominant control mechanism of metabolic fluxes under glucose limitation in Escherichia coli. J Bacteriol. Apr;190(7):2323-30.

63. Notley-McRobb L., FerenciT. 1999 Adaptive mgl-regulatory mutations and genetic diversity evolving in glucose-limited Escherichia coli populations Environmental microbiology 1(1) 33-43

64. Pao S., Paulsen I., Saier M. 1998 Major Facilitator Superfamily Microbiology and Molecular BiologyReviews, Mar. 1-34

65. Paulsen I., Brown M., Skurray R., 1996 Proton-dependent Multidrug Efflux Systems Microbiological Rev., Dec 575-608

66. Peng L, Shimizu K. 2003 Global metabolic regulation analysis for Escherichia coli K12 based on protein expression by 2-dimensional electrophoresis and enzyme activity measurement. Appl Microbiol Biotechnol. Apr;61(2): 163-78.

67. Perrenoud, A., and U. Sauer. 2005. Impact of global transcriptional regulation by ArcA, ArcB, Cra, Crp, Cya, Fnr, and Mlc on glucose catabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1873171-3179

68. Plumbridge J. 1999 Expression of the phosphotransferase system both mediates and is mediated by Mlc regulation in Escherichia coli. Mol Microbiol.; 33:260-273

69. Plumbridge J. 1998 Expression of ptsG, the gene for the major glucose PTS transporter in Escherichia coli, is repressed by Mlc and induced by growth on glucose. Mol Microbiol. b;29:1053-1063

70. Plumbridge J. 2002 Regulation of gene expression in the PTS in Escherichia coli: the role and interactions of Mlc Curr Opin Microbiol. Apr;5(2): 187-93.

71. Ren C, Chen T, Zhang J, Liang L, Lin Z. 2009 An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli. Microb Cell Fact. Dec 15;8:66

72. Russell DR, Bennett GN. 1982 Construction and analysis of in vivo activity of E. coli promoter hybrids and promoter mutants that alter the -35 to -10 spacing. Gene. Dec;20(2):231-43.

73. Saier M.H. Jr., Beatty J.T., Goffeau A., Harley K.T., Heijne W.H., Huang S.C., Jack D.L., Jahn P.S., Lew K., Liu J., Pao S.S., Paulsen I.T., Tseng T.T., Virk P.S. 1999. The major facilitator superfamily. Mol. Microbiol. Biotechnol. V. 1, p.257-279.

74. Saier M.H. Jr., Tam R., Reizer A., Reizer J. 1994. Two novel families of bacterial membrane proteins concerned with nodulation, cell division and transport. Mol Microbiol. V. 11, p. 841-847.

75. Saier M H, Ramseier T M, Reizer J. Regulation of carbon utilization. In: Neidhardt F C, editor; Neidhardt F C, editor. Escherichia coli and Salmonella. Washington, D.C.: American Society for Microbiology; 1996. pp. 1325-1343

76. Schiefner A, et al. 2005 The crystal structure of Mlc, a global regulator of sugar metabolism in Escherichia coli. J Biol Chem. ;280:29073-29079

77. Scripture J.B., Voelker C., Miller S., O'Donnell R.T., Polgar L., Rade J., Horazdovsky B.F., Hogg R.W. 1987. High-affinity L-arabinose transport operon. Nucleotide sequence and analysis of gene products. J. Mol. Biol. V 197, p.37-46.

78. Seitz S, Lee SJ, Pennetier C, Boos W, Plumbridge J. 2003; Analysis of the interaction between the global regulator Mlc and EIIBGIc of the glucose-specific phosphotransferase system in Escherichia coli. J Biol Chem. 278:10744-10751

79. Shin D, Lim S, Seok YJ, Ryu S 2001 Heat shock RNA polymerase (E sigma(32)) is involved in the transcription of mlc and crucial for induction of the Mlc regulon by glucose in Escherichia coli. J Biol Chem. Jul 13;276(28):25871-5.

80. Shin D, Cho N, Heu S, Ryu S. 2003 Selective regulation of ptsG expression by Fis. Formation of either activating or repressing nucleoprotein complex in response to glucose. J Biol Chem. Apr 25;278(17): 14776-81.

81. Silver S., Walderhaug M. 1992. Gene regulation of plasmid- and chromosome-determined inorganic ion transport in bacteria. Microbiol. Rev. V. 56, p. 195-228.

82. Singer S.J., Nicolson G.L. 1972. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. V. 175, p.720-731.

83. Skare J.T., Postle K. 1991. Evidence for a TonB-depended energy transduction complex in Escherichia coli. Mol. Microbiol. V. 5, p.2883-2890.

84. Sparrow C.P., Ganong B.R., Raetz C.R.H. 1984. Escherichia coli membrane vesicles with elevated phosphatide acid levels. Biochim. Biophys. Acta. V. 794, p.373-383.

85. Sullivan K.H., Hegeman G.D., Cordes E.H. 1979. Alteration of fatty acid composition of Escherichia coli by growth in the presence of normal alcohol. J. Bacterid. V. 138, p. 133-138.

86. Tanaka Y, Kimata K, Inada T, Tagami H, Aiba H. 1999 Negative regulation of the pis operon by Mlc: Mechanism underlying glucose induction in Escherichia coli. Genes Cells.-,4:391-399.

87. Tanner M.J.A. 1979. Isolation of integral membrane proteins and criteria for identifying carrier proteins. Curr. Topics Memb. Transp. V. 12, p.1-51.

88. Tsuchiya T., Lopilato J.,Wilson T.H. 1978. Effect of lithium ion on melibiose transport in Escherichia coli. J. Membr. Biol. V. 42, p.45-59.

89. Taverna RD, Langdon RG. 1973 Reversible association of cytochalasin B with the human erythrocyte membrane. Inhibition of glucose transport and the stoichiometry of cytochalasin binding. Biochim Biophys Acta. Oct 11;323(2):207-19

90. Urban C., Gelis. R.T. 1990. Purification and properties of a kinase from Escherichia coli K-12 that phosphory lates two periplasmic transport proteins. J. Biol. Chem. V. 265, p. 17831786.

91. VandenBoom T., Cronan J.E., Jr. 1989. Genetics and regulation of bacterial lipid metabolism. Annu. Rev. Microbiol. V. 43, p.317-343.

92. Vanderpool CK, Gottesman S. 2004 Involvement of a novel transcriptional activator and small RNA in post-transcriptional regulation of the glucose phosphoenolpyruvate phosphotransferase system. Mol Microbiol. Nov;54(4): 1076-89

93. Wang Q, Wu C, Chen T, Chen X, Zhao X. 2006 Expression of galactose permease and pyruvate carboxylase in Escherichia coli ptsG mutant increases the growth rate and succinate yield under anaerobic conditions. Biotechnol Lett. 2006 Jan;28(2):89-93.

94. Wright J.K. 1986. The kinetic mechanism of galactoside/H4 cotransport in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. V. 855, p.391-416

95. Yamada K, Nakata M, Horimoto N, Saito M, Matsuoka H, Inagaki N. 2000 Measurement of glucose uptake and intracellular calcium concentration in single, living pancreatic beta-cells. J Biol Chem. Jul 21;275(29):22278-83.

96. Yoshioka K, Takahashi H, Homma T, Saito M, Oh KB, Nemoto Y, Matsuoka H. 1996 A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. Feb 9;1289(l):5-9.

97. Zhang X, Jantama K, Moore JC, Jarboe LR, Shanmugam KT, Ingram LO. 2009 Metabolic evolution of energy-conserving pathways for succinate production in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA. Dec l;106(48):20180-5.

98. Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

99. Рыбак К.В., Сливинская Е.А., и др. Способ получения L-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae (XylE)

100. Патент РФ №2304615 Выдан 20.08. 2007

101. Рыбак К.В., Сливинская Е.А., и др. Способ получения L-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae (FucPIKUR)

102. Патент РФ № 2318870 Выдан 10.03. 2008

103. Рыбак К.В., Сливинская Е.А., и др. Способ получения L-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae (AraFGH)

104. Патент РФ №2338783 Выдан 20.11.2008

105. Рыбак К.В., Сливинская Е.А., и др. Способ получения L-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae (AlsABC)

106. Патент РФ №2351646 Выдан 10.04.2009

107. Сливинская Е.А., Рыбак К.В., Шереметьева М.Е., Машко С.В., Козлов Ю.И. «Влияние конститутивного синтеза Н+-симпортеров некоторых моносахаридов на потребление D-глюкозы клетками E.coli»

108. Материалы 5-го Конгресса Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров, 21-27 июня 2009