Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование путей транспорта и катаболизма глюкозы в клетках Pantoea ananatis

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование путей транспорта и катаболизма глюкозы в клетках Pantoea ananatis"

005055273

на правах рукописи

АНДРЕЕВА ИРИНА ГЕОРГИЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ПУТЕЙ ТРАНСПОРТА И КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ КЛЕТКАМИ РЛШОЕЛ АЫАШТЮ

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 НОЯ 2012

Москва 2012

005055273

Работа выполнена в лаборатории №3 Закрытого Акционерного Общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика»

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Каташкина Жанна Иосифовна.

Официальные оппоненты: Котова Ирина Борисовна

кандидат биологических наук, доцент Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Голденкова-Павлова Ирина Васильевна доктор биологических наук, профессор РГАУ-МСХА имени М.К. Тимирязева.

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН

Защита диссертации состоится 27 ноября 2012 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1. Тел: 8 (495) 939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан ЛС октября 2012 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета: ^^ к.б.н. Пискункова Нина Фёдоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

РаШоеа апапайз - один из представителей семейства энтеробактерий, различные штаммы которого известны как растительные патогены либо эпифиты. В последние десять лет данный вид привлекает к себе всё большее внимание исследователей поскольку, с одной стороны, он оказался распространённым и опасным патогеном растений, а с другой его природные штаммы способны продуцировать целый ряд полезных веществ (например, каротиноиды, 2,3-бутандиол и т.д.). Учитывая способность Р. апапаНя быстро расти на простых минимальных средах, содержащих глюкозу, сахарозу и другие углеводы и углеводороды (Мопуа еГ я/., 1999), данный вид можно рассматривать как перспективный объект биотехнологии.

На момент окончания экспериментов данной работы были секвсннрованы и аннотированы геномы только четырёх штаммов рода РаШоеа, два из которых относятся к виду Р. апапайз. При этом два генома {РаШоеа зр. А1-9Ь и Р. апапайз ЬМ020103) принадлежат патогенным штаммам, и одни геном принадлежит штамму РаШоеа \agans С9-1, используемому в сельском хозяйстве в качестве биопротектора. За период подготовки работы к публикации геномы ещё двух штаммов Р. апапайз были секвенированы и аннотированы.

Объект настоящего исследования - штамм Р. апапаШ АЛ3355, относящийся к первому уровню биобезопасности (непатогенный штамм), на базе которого в настоящее время создаётся ряд штаммов-продуцентов, часть из которых уже находится на стадии промышленного внедрения. Составление подробной аннотации генома данного штамма и реконструкция его центрального метаболизма, несомненно, является актуальной и практически значимой задачей. С другой стороны, сравнение геномов Р. апапаНз АЛ 3355 и ЬМС20103 могло бы пролить свет на генетическую природу патогенности последнего штамма.

Современные методы секвенирования, доступные программные средства и обширные базы данных, содержащие последовательности ДНК и белков позволяют быстро определять полные нуклеотидные последовательности бактериальных геномов, составлять их аннотации и реконструировать метаболические пути.

Ч/ ~

Однако экспериментальная проверка предсказанных моделей зачастую не проводится или существенно задерживается, что определяется отсутствием эффективных генноинженерных методов для конкретного исследуемого организма. Поэтому экспериментальная проверка функционирования предсказанных метаболических путей, поиск новых ферментов, специфических для данного вида или рода, представляет большой научный и практический интерес.

Цели и задачи работы

Диссертационная работа посвящена реконструкции путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками Pantoea ananatis и экспериментальной проверке их функционирования.

В процессе работы решались следующие задачи:

• аннотация генома и теоретическая реконструкция путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками Р. ananatis;

• экспериментальное подтверждение функционирования и оценка относительного вклада и взаимозаменяемости предсказанных путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками Р. ananatis;

• изучение генов Р. ananatis, представляющих потенциальный интерес с точки зрения их использования в метаболической инженерии штаммов-продуцентов на базе Е. coli и других энтеробактерий.

Научная новизна и практическая значимость работы

В диссертационной работе составлена подробная аннотация генома Р. ananatis AJ13355 и проведена теоретическая реконструкция центрального углеродного метаболизма для данной бактерии.

Ранее в нашей лаборатории были успешно адаптированы для использования в Р. ananatis все наиболее эффективные методы прецизионной модификации хромосомы Е. coli, основанные на использовании системы гомологичной рекомбинации фага X и систем сайт-специфической рекомбинации. Это позволило нам в данной работе не только теоретически реконструировать центральный метаболизм углерода, но и, впервые для Pantoea, провести полную экспериментальную проверку построенной теоретической схемы. Было экспериментально подтверждено существование

4

предсказанных путей транспорта и катаболизма глюкозы (фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы (PTS), Н+-симпортёров (GalP, XylE, FucP), глюкозодегидрогеназного пути (mGDH), пути Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса и пентозофосфатного пути) в клетках Р. ananatis, показаны их одновременное функционирование и взаимная заменяемость, обнаружены интересные особенности регуляции.

В ходе работы были обнаружены специфические для Pantoea гены транспорта и катаболизма глюкозы (xylE, fucP, pqq, pzwf, pgnd) определяющие интересные особенности метаболизма. Использование найденных генов может быть полезным для повышения эффективности штаммов-продуцентов как на базе Р. ananatis, так и на базе Е. coli.

Публикации и апробация работы

По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в журналах рекомендованных ВАК. Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ сотрудников «АГРИ» (июнь 2009).

Диссертационная работы была апробирована на заседании Научно-технического совета Закрытого Акционерного Общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика», протокол №32 от «22» июня 2012г.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждения», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на /М. страницах, включая -Г9 рисунков и таблиц. Список цитируемой литературы содержит

?ЪЪ источника, в том числе Л на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Структура генома Р. апапаИБ АЛ3355

Объект исследования данной работы Р. апапаНя был обнаружен в середине 1990-ых в почве чайных плантаций Японии. Согласно стандартным микробиологическим тестам и секвенированию 168 рРНК {Км/оп е/ а1., 1997) штамм был идентифицирован как РаШоеа апапайэ {ТакаИазМ е/ а!., 2008). Однако только в 2010-2011 годах силами нашей лаборатории геном Р. апапайь был секвенирован и аннотирован. Основные результаты секвенирования и аннотации приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Основные параметры генома P. ananatis AJ13355

Хромосома рЕА320

Размер 4555536 п.н. 321744 п.н.

G+C состав 53,76% 53,4%

Кодирующие рамки (CDS) 3789 281

CDS, кодирующие аннотированные белки 3753 272

CDS, кодирующие гипотетические белки 523 110

Плотность кодирования 84,60 84,64

Рибосомальные РНК 22 0

Транспортные РНК 78 0

В результате секвенирования было показано, что геном состоит из двух кольцевых молекул ДНК: 4555536 п.н. хромосомы рБВ1: АР012032] и 321744 п.н. плазмиды рЕА320 рБВ1:АР012033]. Ранее экспериментально было показано, что Р. апапаНз АЛ3355 действительно содержит в геноме автономно реплицирующуюся плазмиду рЕА320 {Нага е/ а/., 2007). Как видно из таблицы 1 по в+С составу хромосома и плазмида Р. апапаИя АЛ3355 похожи (53,8% и 53,4% соответственно), что позволяет предполагать либо недавнее вьнцепление плазмиды из генома либо её горизонтальный перенос от организма со схожим О+С составом.

С помощью ОС-экегу анализа, обычно используемого для идентификации лидирующей и отстающей цепей в репликации (<Згщопеч, 1998), было установлено, что репликация хромосомы Р. апапаИх АЛ3355 идёт в двух направлениях и начинается в районе опС (3803243 - 3803475 п.н.), терминатор репликации определён приблизительно в районе 1500 т.п.н. Для плазмиды

б

рЕА320 точка начала репликации была предсказана в районе 107 т.п.н., содержащем ген герА, кодирующий гомолог (64,7%) белка инициации репликации RepFIB, характерного для плазмид группы несовместимости FI. Также в «upstream» области герА гена был идентифицирован предположительный ген рагАВ, белковый продукт которого необходим для стабильного наследования плазмид (Velmurugan et al., 2003).

В результате аннотации в хромосоме были идентифицированы 22 гена рРНК, сгруппированные в 7 оперонов, расположенные в противоположных репликативных половинах, так, что направление их транскрипции совпадал с направлением репликации, такое расположение ранее было показано для хромосом и других бактерий (Blattner et al., 1997; Kunst et al., 1997; Veith et al., 2004). В хромосоме были определены 3789 кодирующие рамки, из которых 3753 кодировали уже описанные белки, а 523 кодировали гипотетические белки. На плазмиде были идентифицированы 281 кодирующая рамка, 272 из которых кодировали уже описанные белки, а 110 кодировали гипотетические белки.

Исходя из анализа полученной аннотации была предложена возможная схема метаболизма D-глюкозы в клетках P. ananatis AJ13355 (см. Рис.1). При реконструкции были учтены известные схемы метаболизма для Escherichia coli и Klebsiella pneumonia, как наиболее изученных на данный момент представителей семейство энтеробактерий.

Glucose

perimplasm ^^

pr

GL-* Gluconate

2-KDPG

Рисунок 1 - Предполагаемая схема метаболизма D-глюкозы в клетках Р. ananatis. *Предполагаемые сходство и различие в метаболических картах Р. ananatis и Е. coli. Голубые ячейки - гомологичные кодирующие рамки; жёлтые ячейки- кодирующие рамки Р. ananatis, не имеющие гомологов Е. coli; оранжевые ячейки - кодирующие рамки, чьи продукты активны по причине наличия пути биосинтеза соответствующего кофактора в Р. ananatis; белые ячейки - гены Е. coli, отсутствующие в геноме Р. ananatis. Сокращения согласно (Feist et ed., 2007).

2 Экспериментальная проверка предположительной схемы транспорта н

катаболизма глюкозы клетками P. ananatis

2.1 Основные пути поступления глюкозы в клетки P. ananatis

В результате реконструкции центрального метаболизма в клетках P. ananatis. было предсказано наличие трёх независимых путей поступления D-глюкозы внутрь: 1) фосфоенолпируват-зависимый транспорт и фосфорилирование с образованием глюкозо-6-фосфата (PTS); 2) глюкозодегидрогеназный путь: PQQ-mGDH-зависимое окисление в периплазме до 6-фосфоглюконата с его специфическим транспортом и последующим фосфорилированием глюконаткиназой в цитоплазме; 3) транспорт D-глюкозы низко-аффинными Н+-симпортёрами и её последующее фосфорилирование глюкокиназой (glk).

Для проверки поставленной гипотезы были сконструированы штаммы с делециями Д (ptsHI-crr), Aged, A glk. Первая делеция инактивировала гены, кодирующие белки HPr, EI и НА01с PTS, вторая - mGDH P. ananatis, A glk -делеция гена глгококиназы, предполагающая инактивацию всех путей вторичного транспорта D-глюкозы.

Таблица 2 - Скорости роста различных штаммов P. ananatis SCI7(0) при росте на минимальной среде М9 с глюкозой (5г/л)

Штамм Среднее значение скорости роста

Абсолютное, час"' Относительное

SC17(0) 0,97±0,02 1,00

SC1 l(G)h(ptsHl-crr) 0,82±0,012 0,85

SC1l(0)A(ptsiII-crr)Agcd 0,37±0,02 0,38

SC 17 (0) Д (ptsHI-crr) Aged Agí к 0,11±0,01 0,11

Как видно из таблицы 2 инактивация генов РТБ (р1$Ш-сгг) в клетках Р. апапаИ5 не приводит к таким драматическим событиям как полное отсутствие роста. Штамм 8С17(0)Д(р/.уЯ/-с/г) сохраняет рост на минимальной среде с глюкозой, а замедление скорости роста составляет лишь 15%. Отсутствие остановки роста штамма Б С17 (0) Д (р Ду///- с г г) было ожидаемо в связи с теоретическим предсказанием активной твОН в клетках Р. апапаНя, однако даже совместная инактивация генов (р£у#/-стг) и gcd также не привела к полной остановке роста, хотя скорость роста в результате упала на 60%.

9

Поскольку даже тройной мутант с инактивированными компонентами PTS, mGDH и Glk сохраняет способность потреблять глюкозу, можно предполагать существование в P. ananatis дополнительных путей транспорта этого сахара.

2.2 Участие предполагаемых Н+- симпортеров GalP, XylE и FucP в транспорте глюкозы в клетки Р. ananatis

Как было показано в предыдущей главе, клетки Р. ananatis обладают разнообразным набором путей транспорта глюкозы. При этом подтверждён весомый вклад вторичного транспорта.

В результате секвенирования, компьютерного анализа и аннотирования генома Р. ananatis AJ13355 в геноме Р. ananatis были идентифицированы открытые рамки считывания (ORFs), кодирующие белки, ортологичные белкам Н+-симпортёров GalP и XylE и FucP Е. coli MG1655. Для которых ранее была экспериментально показана возможность осуществления Н+-симпорта не только своих специфических субстратов D-галактозы, D-ксилозы и L-фукозы, соответственно, но и транспорта D-глюкозы при условии обеспечения конститутивной экспрессии соответствующих генов (Flores et al., 2005; Сливинская и др., 2007).

Для оценки вклада каждого из симпортеров в транспорт D-глюкозы, были сконструированы штаммы SC 1l(Q)A{ptsIII-crr)AgcdAgalP и SC17(0)A(p/stf/-crr)AgcdAxylE. Из таблицы 3 видно, что инактивация предполагаемого гена xylE в штамме SC17(0)A(ptsHI-crr)Agcd привела лишь к незначительному снижению скорости роста на глюкозе, в то время как инактивация galP в том же штамме уменьшила скорость роста в 3 раза (Таблица 3). Таким образом, GalP действительно вносит заметный вклад в транспорт глюкозы Р. ananatis.

Таблица 3 - Скорости роста различных штаммов Р. апапаШ 8С17(0) при росте на минимальной среде М9 с глюкозой (5г/л)

Штамм Среднее значение скорости роста

Абсолютное, час"1 Относительное

SCn(0)&(ptsHI-crr)Agcd 0,37±0,02 0,38

SC 17(0) Д (ptsH-crr)ágcdAgalP 0,132±0,021 0,14

SC17(0 )A(ptsH-crr)AgcdbxylE 0,37±0,013 0,38

Для прямой проверки способности предполагаемых низко-аффинных Н+-симпортёров GalP, XylE и FucP из Р. ananatis транспортировать D-глюкозу, были сконструированы экспрессионные кассеты, несущие соответствующие гены под контролем конститутивного промотора. Далее полученные экспрессионные кассеты были интегрированы в хромосому РТЭ'-штамма Е. coli, MG1655A(ptsHI-crr), неспособного к росту на D-глюкозе (Simoni et al., 1976). Способность полученных штаммов - MGI 655A(ptsHI-crr)galP, MG1655&(ptsHI-crr)xylE и MG1655&(ptsHI-crr)fucP потреблять глюкозу проверялась измерением роста в жидкой среде, содержащей данный сахар в качестве единственного источника углерода.

Рисунок 2 - Комплементация роста PTS" штамма Е. coli MG 1655A(plsHI-crr) (—) в результате конститутивной экспрессии генов galP(m), xylE(k) и fucP{•) из Р. ananatis при росте на минимальной среде М9 с глюкозой (5г/л). MG1655 (-).

Из представленных на Рис. 2 кривых роста на глюкозе видно, что низкоаффинные Н+-симпортёры GalP, XylE и FucP из Р. ananatis действительно способны обеспечивать транспорт D-глюкозы в клетки Е. coli.

2.3 P. ananatis способна к внеклеточному окислению D-глюкозы до D-глюконовой кислоты

При культивировании P. ananatis SCI7(0) на минимальной среде с избыточным количеством D-глюкозы (от 5 г/л) в качестве единственного источника углерода происходит накопление глюконовой кислоты в культуральной жидкости (Таблица 4). Продукция глюконовой кислоты наблюдается и для многих других представителей рода Pantoea, и имеет экологические причины. Так, образование глюконовой кислоты клетками Pantoea agglomérons, связывают с необходимостью растворения минеральных фосфатов, необходимых для роста клетки (Sulbarân et al., 2009), а для клеток

Pantoea citrea продукция глюконовой кислоты является необходимым этапом инфицирования плодов ананасов.(С/га et al., 1997; Pujol and Kado, 2000).

Многие микроорганизмы, включая ряд энтеробактерий, осуществляют окисление глюкозы с промежуточным образованием Б-глюконо-1,5-лактона и его последующим превращением в глюконовую кислоту. Как правило, образование глюконовой кислоты происходит в периплазме и катализируется пирролохинолинхинон-зависимой мембранной глюкозодегидрогеназой (PQQ-mGDH).

В геноме P. ananatis AJ13355 были обнаружены как близкий гомолог гена глюкозодегидрогеназы (gcd) из Е. coli (идентичность кодируемых аминокислотных последовательностей 74%), так и pqqABCDEF оперон, гомологичный ранее описанному оперону биосинтеза PQQ из Klebsiella pneumonia. Кроме того, была найдена ORF, предположительно кодирующая глюконолактоназу (аннотирована как gnl).

2.3.1 Глюкозодегидрогеназная активность в мембранных фракциях P. ananatis

Для экспериментального подтверждения функционирования реконструированного на основании аннотации генома P. ananatis PQQ-зависимого пути окисления глюкозы, с помощью адаптированного для P. ananatis метода ¡^Red-зависимой интеграции (Katashkina et al., 2009) были сконструированы делеции гена gcd и pqqABCDEF оперона.

Таблица 4 - Накопление глюконовой кислоты в культуральной среде разных штаммов SC17(0), SC17(0)Agcd, SCn(0)Apqq

Штамм SC17(0) SC17(0)Ag«/ SC17(0)Ap??

Концентрация глюконовой кислоты, г/л 1,4 нд нд

нд- недетекгируемый уровень (<0,06 г/л).

Измерение глюкозодегидрогеназной активности в мембранной фракции клеток Р. апапай5 дикого типа подтвердило присутствие в клетках активного холофермента (Таблица 5). Инактивация гена gcd привела к отсутствию накопления глюконовой кислоты при росте на минимальной среде с Э-глюкозой (5 г/л) в качестве единственного источника углерода (Таблица 4) и к падению глюкозодегидрогеназной активности до недетектируемого уровня

(Таблица 5). Таким образом, было показано, что gcd действительно кодирует Р(}С)-зависимую мембраносвязанную глюкозодегидрогеназу шОБН.

Таблица 5 - Глюкозодегндрогеназная активность в мембранной фракции клеток штаммов SC17(0), SCI 7(0) Ag«/, SC17(0)Apw

PQQ SC 17(0) SC 1 l(())t±gcd SC 17(0 )Apqq

mGDH активность, нМ/(мин*мг) ЮмкМ (1,18 ± 0,04)*103 нд* (1,88 ± 0.12)*103

ЗмкМ (1,2 ± 0,2)*103 нд (1,6 ± 0.2)* 10J

0 (1,47 ± 0,01)*102 нд нд

нд - недетектируемый уровень (<7 нМ/(мин*мг)).

Отсутствие глюкозодегидрогеназной активности в мембранной фракции штамма SC 17(0)-Apqq в случае, когда измерение проводилось без добавления PQQ, подтвердило участие генов pqq оперона в биосинтезе данного кофермента, необходимого для образования активного холофермента глюкозодегидрогеназы. К сожалению, химические реакции, приводящие к образованию PQQ, в настоящее время не известны. Поэтому нельзя было исключать участие каких-то дополнительных, не входящих в состав pqq оперона, генов в данном процессе. Для того чтобы исключить участие в биосинтезе PQQ каких-либо специфических генов P. ananatis, не входящих в состав pqq оперона, решено было клонировать данный оперон и проверить способность клеток Р. ananatis и Е. coli синтезировать PQQ в условиях экспрессии клонированного оперона.

2.3.2 Клонированиердд оперона и влияние его экспрессии на продукцию РОО клетками Р. ananatis и Е. coli

Для клонирования pqqABCDEF оперона из Р. ananatis был выбран интегративный вектор pAH162-TcR на базе R6K репликона, содержащий в своём составе attP сайт фага ф80, позволяющий осуществлять сайт-специфическую интеграцию данной плазмиды в attB сайт фага ф80, расположенный в бактериальной хромосоме (Minaeva et al., 2008). В связи с тем, что клонируемый фрагмент имел достаточно большую длину (6,7 т.п.н.), необходимо было избежать использования ПЦР и провести клонирование in vivo. Клонированный фрагмент содержал в своём составе нативную регуляторную область.

Для интеграции клонированного pqqABCDEF оперона в хромосому P. ananatis был специально сконструирован реципиентный штамм SC17(0)-<¡>80attB, в котором ген атрС был замещён сайтом attB фага ф80. После проведения интеграции полученный штамм был излечен от векторной части интегративной плазмиды за счёт Mnt/Xis-зависимой рекомбинации (интегративный вектор рАН162-Тск содержит в своём составе attL и attR сайты фага X, что позволяет легко удалять из хромосомы векторную часть интегративной плазмиды). Полученный в результате штамм был обозначен SC1 7(0)-§80attB-pqq.

Проведенные измерения накопления PQQ в среде культивирования полученных штаммов ?>C\7{(.))Apqq и SC 17(0)-§80attB-pqq показали, что накопление PQQ штаммом SC17(0)Ap^ не детектируется, а штамм SC17(0)-<¡>80attB-pqq продуцирует в два раз больше PQQ, чем исходный штамм SC17(0) (Таблица 6). Таким образом, продукция PQQ клетками P. ananatis действительно определяется уровнем экспрессии pqqABCDEF оперона.

Таблица б - Накопление PQQ в культуральной среде разных штаммов P. ananatis

Штамм SC 17(0) SCl7(0)-/¡pqq SC 17(Q)-$$0attB-pqq

PQQ концентрация, мкМ 28,2 ± 6 <3,02 54,4 ± 9

Для проверки достаточности наличия pqqABCDEF оперона для обеспечения биосинтеза PQQ данный оперон был интегрирован в нативный сайт ф80а«5 штамма Е. coli MG 1655A(ptsHI-crr). Штамм MG 1655A(ptsHI-crr) неспособен к росту на минимальной среде с глюкозой в результате инактивации в нём PTS. В Е. coli mGDH существует только в апоформе, поскольку путь биосинтеза PQQ отсутствует, однако глюкозодегидрогеназная активность может быть восстановлена добавлением экзогенного PQQ. Мы надеялись добиться аналогичного эффекта благодаря экспрессии в клетках Е. colipqq оперона из Р. ananatis.

Мы предположили, что экспрессия pqq оперона из Р. ananatis обеспечит комплементацию А(ptsHI-crr) мутации благодаря восстановлению активности глюкозодегидрогеназы и образованию дополнительного пути потребления глюкозы через её окисление до глюконовой кислоты. Полученные для штаммов MG1655A (ptsHI-crr) и MG1655A(ptsHI-crr)pqq кривые роста наглядно подтверждают наше предположение (Рис. 3). Тем не менее, нам не удалось

14

детектировать продукцию РС?С> клетками Е. соИ МС\ 655А(р1зН1-сгг)рдд. Возможно, это объясняется худшей, по сравнению с Р. апапайу, экспрессией оперона, расположенного под контролем природной регуляторной области.

Рисунок 3 - Интеграция pqq оперона (■) восстанавливает рост штамма МО1655Л(,0йЯ/-сгг)(п) на минимальной среде с глюкозой до уровня дикого типа МС1655(—).

2.4. Транспорт О-глюконовой кислоты в клетки Р. апапайъ

В геноме Р. ana.na.tis с высокой степенью гомологии были идентифицированы все компоненты Опй системы Е. соИ (Таблица 7).

Таблица 7 - Сравнение аминокислотных последовательностей компонентов впИ систем в Е. соИ и Р. апапайь

Е. coli ген Белок Р. ananatis ген % Гомологии

gntT Высоко-аффинная глюконат пермеаза PAJ_0432 87

gntR Репрессор генов gntT, gntK-gntU PAJ_2930 77

gntK Термостабильная глюконат киназа PAJ_2929 77

gntU Низко-аффинная глюконат пермеаза PAJ_2928 80

Известно, что GntI система — основная система транспорта и фосфорилирования глюконовой кислоты в Е. coli (Tsunedomi et al., 2003). Эта система состоит из gntT гена, кодирующего высоко-аффинную глюконат пермеазу, и gntKU оперона, кодирующего глюконаткиназу GntK и низкоаффинную глюконат пермеазу GntU. Экспрессия этих генов, с одной стороны, регулируется репрессором GntR, действие которого снимается глюконовой кислотой, и, с другой стороны, активируется комплексом CRP-cAMP (Porco et al., 1997; Izu et al., 1997). Таким образом, GntI система работает, когда глюкоза отсутствует, а глюконовая кислота присутствует в достаточной концентрации в среде культивирования.

При культивировании штаммов-продуцентов на базе P. ananatis зачастую наблюдается накопление глюконовой кислоты в количествах токсичных для клеток. При этом инактивация глюкозодегидрогеназы с целью предотвращения накопления глюконовой кислоты в ряде случаев приводило к существенному замедлению роста культуры и соответствующему падению продуктивности. Было решено исследовать регуляцию экспрессии gntKU оперона в P. ananatis с целью последующей оптимизации экспрессии этих генов для улучшения потребления глюконовой кислоты и снижения её накопления штаммами-продуцентами.

Сравнение регуляторных областей gntK генов Е. coli и Р. ananatis показало (Рис. 4), что в "upstream" области гена gntK P. ananatis можно выделить предполагаемые области «-10», «-35», единственный операторный участок для взаимодействия с репрессором GntR, расположенный также, как сайт GntR2 в Е. coli и сайт связывания с комплексом CRP-cAMP, аналогичным образом расположенный, но ещё менее симметричный, чем сайт, ранее идентифицированный в промоторе gntKU оперона Е. coli.

_CRP_

E.coli CGAATCTGg^^ACCGAAAATGTTftGbTTTÄGSrrTCACCTTGTCACCGGGCGGATCTATTTÄÄGCCCACAAATTTGAi^GTAGCTCACACTTÄTACACTT

gntR stop gnfcR stop

P. ananatis---------------------------------------------------AGTATCTi^rTAACGCG-TTT-TATGA-■ТСАГА-.ТТТААГ.ЕГТТ

___GntRl__CRP

E.CCll AAGGCATGGATGGr:TATTGCTT'-CTGATATTGTCCFGr.T~GACAAl4.T?ACr GATAACAGTTACCCGTAACATTTTTA.' T^—CTTGTATTGTGGGGGCA

-35 -10 GntR2

-35 "10 _GntR_

P.ananatis T-GGGA'''GTAAaAAGGTTGCCASCA!,GGAA,.'G-'JCACCA«3ACAATGTGCT 'CACCATTGTTATCGGTAACATGGCAÜACVGACT GAACTTGCCGGAGTA

E.coli CCACTTTGAGCACGACTAACCATGälCAC—CACÄTVTÄCGTCTTta&TGfeGCGl'A

start gntK

P. ananatis AAAAAT-GACCACGC.—AATCTTCGCCACATCACGT':' ¡"ГТАТТС rrjüIGGCTGTT

Рисунок 4 - Сравнение регуляторных областей gntK генов Е. coli и. P. ananatis

Для исследования регуляции данного промотора был сконструирован штамм SC17(0)-PGZ, в котором промоторный участок gntKU оперона с помощью А, Red-зависимой рекомбинации был интегрирован перед lacZ геном в штамме SC 17(0) lacZ Tlh,A!acYтак что в результате интеграции старт кодон lacZ гена был заменён на старт кодон gntK гена. Поскольку только правая половина обнаруженного в промоторной области gntKU оперона Р. ananatis сайта связывания CRP имела гомологию с консенсусной последовательностью, было решено проверить, влияет ли левая половина предполагаемого сайта на связывание CRP-cAMP. Для этого были сконструированы аналогичные транскрипционные слияния lacZ с укороченными вариантами промотора, в

16

первом из которых предполагаемый сайт связывания CRP был полностью удалён, а во втором содержал лишь правую половину (Рис. 4). Полученные штаммы были обозначены SC17(0)-PGZ-Short и SC17(0)-PGZ -1/2, соответственно.

Естественно было предположить, что Р^лгу промотор должен индуцироваться глюконовой кислотой и репрессироваться в присутствии глюкозы в среде культивирования. Поскольку Р. ananatis преобразует часть глюкозы в глюконовую кислоту, для дикого штамма невозможна ситуация роста на чистой глюкозе. Поэтому для точного определения коэффициента индукции был сконструирован штамм SC17(0)-PGZ-Ag«/, в котором образование глюконовой кислоты из глюкозы невозможно, а затем была получена его производная с инактивированным геном репрессора (штамм SC17(0)-PGZ-AgcdAgntR). Аналогично, для корректного определения уровня активации промотора комплексом CRP-cAMP были сконструированы штаммы SC17(0)-PGZ-Acy<x4 и SC17(0)-PGZ-Acrp, в которых были инактивированны предполагаемые гены аденилатциклазы и сгр, соответственно.

Таблица 8 - Активность промотора Рг„,ки

Источник углерода Штамм Активность, ед.М

D-глюкоза D-глюконовая кислота D-глюкоза + D-глюконовая кислота

SC17(0)-PGZ 140±20 480±90 150±20

SC17(0)-PGZ-Agcd 12±3 387±25 116±15

SCn(0)-PGZ-AgcdAgntR 150±1 378±30 нд

SC17(0)-PGZ-Acya/f 45±3 64±5 нд

SC 17(0)-PGZ-Acrp 48±3 68±7 нд

SC 17(0)-PGZ-Short 28±3 35±3 25±3

SC17(0)-PGZ-l/2 150±20 430±10 150±30

Измерение удельной активности р-галактозидазы в полученных штаммах, выращенных на разных источниках углерода, показало (Таблица 8), что максимальная активность для каждого штамма наблюдалась при выращивании на среде, где единственным источником углерода служила глюконовая кислота. Остаётся невыясненным, почему статистически значимое, хотя и незначительное, увеличение активности наблюдалось даже для штаммов

17

SCI 7(0)-PGZ-Acya, SC17(0)-PGZ -Acrp и SC17(0)-PGZ-Short. Как видно, различие в уровнях ß-галактозидазной активности при культивировании на глюкозе и смеси глюкозы с глюконовой кислотой наблюдалось только для штамма с инактивированным геном глюкозодегидрогеназы SC 17(0)-PGZ-Ag«/.

Сравнение удельной активности ß-галактозидазы в штаммах SC17(0)-PGZ-Agcdu SC\7(OyPGZ-AgcdAgntR при культивировании на среде с глюкозой позволяет определить коэффициент репрессии в условиях отсутствия активации Кр=12. В то же время, при культивировании штамма SC17(0)-PGZ-Agcd на смеси глюкозы и глюконовой кислоты активность оказывается в 10 раз выше, чем при его культивировании на глюкозе. В литературе нет данных о том, что именно (глюконовая кислота или её фосфорилированная форма) является индуктором GntR. Полученные данные говорят о том, что комплекс GntR с индуктором сохраняет частичную способность связываться с ДНК. Поэтому только делеция гена репрессора позволяет оценить истинную силу промотора в нерепрессированном состоянии.

Сравнение активности ß-галактозидазы в штамме SC 17(0)-PGZ-Agc<i и его производных SC\7(0)-PGZ-АсуаА и SC17(0)-PGZ-Acrp позволяют определить коэффициент активации в условиях индукции Ка=6. В тоже время, сравнение результатов измерения активности в штаммах SC17(0)-PGZ и SC 17(0)-PGZ-Agcd на смеси глюкоза+глюконовая кислота и только глюконовой кислоте свидетельствует лишь о троекратной активации промотора Рткц как для -штамма дикого типа так и для штамма SС17(O)-PGZ-Agcrf в условиях присутствия глюконата в среде культивирования. Как и в предыдущем случае, наблюдаемое несовпадение уровней регуляции промотора измеренных при изменении среды культивирования и при полном удалении регуляторного белка может объясняться остаточной активностью регуляторного белка в непермиссивных условиях. В случае с CRP такое несовпадение может быть связано ещё и с тем, что при росте клеток в присутствии глюкозы концентрация сАМР снижается, но не становится нулевой. Для оценки уровня активации в неидуцированном состоянии проводилось измерение удельной активности ß- галактозидазы штамма SC 17(0)-PGZ-Ago/, выращенного на лактозе в качестве единственного источника углерода (Таблица 9). В этом случае коэффициент активации составил Ка=80. Однако, по необъяснимым причинам на смеси лактоза+О-глюконовая кислота, когда ожидается наблюдать и

индукцию и активацию активность промотора Р^¡ки оказалась в 8 раз ниже чем при условиях исключительно активации при росте на лактозе.

Таблица 9 - Активность промотора Р¡„,ки

Штамм Источник углерода Активность, ед.М

D-глюкоза 12±1

D-глюконовая кислота 387±25

SC17(0)-PGZ-Agcá Лактоза 980±120

О-глкжоза+О-глюконовая кислота 116±15

Лактоза+О-глюконовая кислота 120±10

Измерение активности промотора Рр„ки в штамме с полностью удалённым CRP-сайтом показало отсутствие активации (Таблица 10). В то время как штамм SC17(0)-PGZ-l/2, в котором была оставлена правая половина CRP-сайта демонстрировал активность промотора Ррики на уровне штамма дикого типа. Таким образом, можно предполагать, что in vivo только правая половина CRP-сайта действительно необходима для активации промотора комплексом CRP-cAMP.

Таблица 10 - Активность промотора Ре„,ки

Среда Штамм Активность, ед.М

LB М9+0-глюконовая кислота LB+D-глюконовая кислота

SC17(0)-PGZ 90±10 480±90 105±12

SC17(0)-PGZ-Short 12,2±1,2 35±3 12,4±1,

SC17(0)-PGZ-l/2 86±6 430±10 86±12

Полученные данные показывают, что в штамме дикого типа промотор gntKU оперона оказывается полностью индуцированным не только при росте на глюкозе и других сахарах, но даже при росте на глюконеогенных субстратах без экзогенного добавления глюконовой кислоты. Это говорит о том, что глюконеогенез в Р. апапаИя не только доходит до образования глюкозы, но ещё и завершается её конверсией в глюконовую кислоту. После истощения глюкозы в среде культивирования экспрессия gntKU оперона усиливается в три раза, что, по-видимому, и объясняет наблюдаемое обычно быстрое потребление

глюконовой кислоты штаммами-продуцентами на заключительном этапе ферментации.

Чтобы улучшить потребление глюконовой кислоты в присутствии глюкозы в среде культивирования, мы попытались заменить природный промотор %п1Ки оперона сильным конститутивным промотором Р/ас. Для проверки эффективности такой замены был использован штамм S>C\l(fi)/Azwf^pgi, способный потреблять глюкозу только путем её окисления до глюконовой кислоты. Мы сравнили рост на глюкозе и глюконовой кислоте данного штамма и его производного, в котором Р^лгубыл заменен на РШс.

Рисунок 5 - Кинетические кривые роста на глюкозе штамма SC17(0)Azwj,"Арgi (—) и его производного, содержащего gntKU оперон под контролем промотора Рюс (•) на минимальной среде М9 с глюкозой (А) или D-глюконовой кислотой (В) в качестве единственного

источника углерода.

Из рисунка 5 видно, что такая замена промоторной области привела к заметному увеличению скорости роста штамма на глюкозе. Однако, в условиях полной индукции и активации при росте на глюконовой кислоте наблюдается противоположная ситуация: штамм с нативным промотором опережает в росте штамм с искусственной конструкцией.

' Тем не менее, полученная конструкция РlacgntKU, по-видимому, может быть использована для улучшения потребления глюконовой кислоты при росте на глюкозе штаммов на базе P. ananatis, особенно в случае её амплификации за счёт введения дополнительной копии.

2.5 Пути катаболизма глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконовой кислоты в клетках P. ananatis

2.5.1 Основная точка ветвления катаболизма D-глюкозы: (psi, sed, zwf)

Согласно теоретической реконструкции центральной точкой ветвления катаболизма глюкозы в клетках Р. ananatis является глюкозо-6-фосфат,

который может с помощью фермента фосфоглюкозоизомеразы (pgi) быть преобразован во фруктозо-6-фосфат и далее пойти по пути Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса или же с помощью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (zwf) быть окислен до 6-фосфоглюконолактона, тем самым включившись в пентозофосфатный путь (Рис. 1).

Для проверки функционирования и вклада каждого из перечисленных путей в катаболизм глюкозы были сконструированы штаммы несущие одиночные делеции Apgi (фосфоглюкозоизомераза), Azwf (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы), получены различные комбинации этих мутаций и описанной выше делецией Aged (глюкозодегидрогеназа).

Анализ роста полученных мутантов на минимальной среде с D-глюкозой в качестве единственного источника углерода показал (Таблица 11), что инактивация какого-либо из этих генов не приводит к существенным изменениям скорости роста (не более 25%). В главе 2.3 уже было показано, что в клетках P. ananatis при росте на среде с D-глюкозой глюкозодегидрогеназная реакция работает и данный путь функционирует. Однако, было важно показать взаимодействие и вклад каждого из трёх путей в катаболизм глюкозы. Так, выяснилось, что при инактивации гена gcd в клетках P. ananatis скорость роста на минимальной среде с D-глюкозой почти не меняется. Таким образом, можно предполагать, что оставшиеся два пути в данных экспериментальных условиях компенсируют отсутствие gcd. Стоит отметить, что условия эксперимента не в полной мере отражают реальность и вполне возможно, что в природе штамм SC17(0)AgccZ был бы вытеснен в конкурентной борьбе за ресурс.

Инактивация pgi в клетках P. ananatis приводила к замедлению скорости роста на 23%, а инактивация zwf только на 5%. Таким образом, можно заключить, что любые оставшиеся два пути в данных экспериментальных условиях с той или иной степенью успеха компенсируют отсутствие первого.

Из анализа роста двойных мутантов на минимальной среде с D-глюкозой (Таблица 11) ожидалось сделать вывод о работе каждого из путей в одиночку. Все двойные мутанты были способны к росту на минимальной среде с глюкозой, т.е. каждый из путей способен обеспечить катаболизм D-глюкозы. Наибольшее падение скорости роста (50%) наблюдалось в штамме S С17 (0) Aged Azwf, у которого углеродный поток идёт предположительно только через путь Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса, а вход в пентозофосфатный путь

возможен только благодаря транскетолазной реакции. Штамм SC\l(0)AzwfApgi, в котором предположительно работает только глюкозодегидрогеназный путь и SC17(Q)AgcdApgi, в котором работает только пентозофосфатный путь, характеризуются не столь сильным падением скорости роста около 30%. Однако, утверждать, о наименьшем вкладе пути Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса в катаболизм глюкозы в клетках Р. апапаНб неверно, поскольку большое значение для эффективной работы пути Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса имеет уровень аэрации.

Таблица 11 - Скорости роста различных штаммов Р. апапайв БС17(0) при росте на минимальной среде М9 с глюкозой (5г/л)

Штамм Среднее значение скорости

Абсолютное, час 1 Относительное

SC 17(0) 0,79±0,02 1

SC17(0)Azw/ 0,74±0,02 0,94

SC17(0)Apgí 0,6±0,013 0,77

SCI 7(0) Ag«/ 0,82±0,02 1,03

SCI 7(Q)AzwfApgi 0,58±0,025 0,73

SCl7(0)AgcdApgi 0,53±0,012 0,68

SC 11(0) AgedAzwf 0,39±0,012 0,5

SC 17(0).Aged.AzwfApgi 0,101±0,002 0,13

Тройной мутант, SC17(0)AgedAzwfApgi значительно снижает скорость роста (в 10 раз), но продолжает расти на минимальной среде с глюкозой, что согласовывается с данными аннотации, предполагающими наличие дополнительного пути метаболизма глюкозы.

2.5.2 Проверка функциональной активности генов pzwf и pgnd

В ходе компьютерного анализа на плазмиде P. ananatis был найден

оперон гомологичный оперону из Mesorhizobium loti. Этот оперон содержит

гены глюкоамилазы (çga), глюкозо-6-фостфатдегидрогеназы (zwf), 6-

фосфоглкжонатдегидрогеназы (gnd), глюкокиназы (paj_0286) и

предположительно обеспечивает утилизацию крахмала и гликогена. Для

проверки функционирования дополнительных путей утилизации глюкозы на

базе штамма SC17(0)ApgiAgcd, в котором глюкоза метаболизируется через

пентозофосфатный путь, были сконструированы штаммы несущие делеции

Apzwf и Дpgnd. Также оба гена были инактивированны в штамме SC17(0) Aged.

22

Из результатов измерения роста полученных мутантов видно (Таблица 12), на росте штамма SC\^(0)Agcd даже одновременная инактивация р.и>/и р%п(1 не приводит к изменению скорости роста, это ожидаемо, поскольку в 8С17(0)Д£«/ работает и путь Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса и пентозофосфатный путь. А в штамме SCl7(0)AgcdApgi инактивация pgnd приводит к ухудшению роста относительно исходного штамма на 10% (Таблица 12), что указывает на функциональную активность гена pgnd. В то время как введение мутации Apzwf на скорости роста этого штамма не сказывается. Однако, инактивация p:\vf на фоне комбинации мутаций AgcdApgiApgnd приводит к замедлению роста ещё на 15%, что всё же подтверждает участие данного гена в метаболизме глюкозы.

Таблица 12 - Скорости роста различных штаммов Р. апапайв БС 17(0) при росте на минимальной М9 с глюкозой (5г/л)

Среднее значение скорости Абсолютное, час'1 Относительное

SC17(0)A,?ci/ 0,82±0,03 1,03

SC 17(0)AgcdApgi 0,35±0,01 0,57

SC 1 !(0)AgcdApzwf&pgnd 0,78±0,022 1

SCI 7(0) AgcdApgiApgnd 0,29±0,01 0,467

SC 17(0 )AgcdApgiApzwf 0,34±0,01 0,55

SC 17(0) AgcdApgiApzufApgnd 0,23±0,01 0,4

Для подтверждения функциональной активности генов pzwf и pgnd, необходимо было измерить ферментативную активность соответствующих белковых продуктов. Однако, для этого следовало исключить вклад хромосомных zwf и gnd.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназная активность была измерена в штаммах SC17(0), SC17(0)A2w/ и SC\l{Q)AzwfApzwf Как видно из таблицы 13, NAD-зависимая активность ни одном из штаммов не детектировалась. NADP-зависимая активность определялась только для штамма с интактным хромосомным zwf. Таким образом, активность pZwf в данных условиях отсутствовала. Для дальнейшего исследования ген pzwf был клонирован на низкокопийный вектор RSFP/oc -lacl {Katashkina et al„ 2007) под промотор Pfacuvs. Полученная плазмида RSFPkw-p^vf была введена в штамм SC17(0)Azw/Apzw/i Измерение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы было проведено в неочищенных экстрактах клеток, несущих плазмиду. Как

23

видно из таблицы 13, плазмида RSFPhc-pzwf содержит копию плазмидного гена zw/ , кодирующего глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу с двойной NAD / NADP кофакторной специфичностью. Кроме того, уровень NAD-зависимой активности в этих клонах был значительно выше, чем уровень NADP-зависимой активности.

Таблица 13 - Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в неочищенных экстрактах различных штаммов P. ananatis

Штамм NADP-зависимая активность, нмоль/(мин*мг) NAD-зависимая активность, нмоль/(мин*мг)

SC17(0) 160 ±8 <2

SCI 7(0) Az»/ <2 <2

SC17(Q)AzwfApzwf <2 0

SC17(0)/RSFP ¡„с-lad 57±5 0

SC 17(0)AzwfApzwf/ RSFP i^-lacl 0 0

SCI7(0)Azw/Apzwf/ RSFPtoc-pzif/ 3,9 ±0.5 31 ±2

Активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы была измерена для штаммов SC17(0), SC17(0)Ag«i/ и SCl7(0)AgndApgnd. Как видно из таблицы 14, NADP-зависимая активность определялась только для штамма с интактными хромосомным gnd. NAD-зависимая активность в исходном штамме SC17(0) была в 8 раз ниже чем NADP-зависимая. После инактивации gnd NAD-зависимая активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы уменьшилась в 2 раза, а в штамме SC\7(fi)AgndApgnd не детектировалась совсем. Таким образом, можно предполагать, что фермент pGnd активен и требует NAD в качестве кофактора, но в данных условиях эта активность низкая.

Таблица 14 - Активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в неочищенных экстрактах различных штаммов P. ananatis

Штамм NADP-зависимая активность, нмоль/(мин*мг) NAD-зависимая активность, нмоль/(мин*мг)

SCI 7(0) 98 ±2 15 ±4

SCn(0)Agnd 0 8 ± 2

SCn(0)AgndApgnd 0 0

SC 1 l(fi)AgndApgnd / RSFP/oc -pgnd 31 ± 4 1100 ±200

Для дальнейшего исследования ген pgnd был клонирован на низкокопийный вектор RSFP/iIC -lacl (Katashkina et al., 2007) под промотор P/acuv5- Полученная плазмида RSFP ¡ac-pgnd была введена в штамм SC 1 l(())AgndApgnd. Измерение активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы было проведено в неочищенных экстрактах клеток, несущих плазмиду. Как видно из таблицы 14, NAD-зависимая специфическая активность данного фермента приблизительно в 30 раз выше, чем NADP-зависимая активность. Следовательно, клонированный ген кодирует NAD-зависимую б-фосфоглюконатдегидрогеназу.

Физиологическая роль генов pzwf и pgnd

Долгое время считалось, что реакции окислительной ветки пентозофосфатного пути являются исключительно NADP зависимыми. Но данное утверждение верно только для Е. coli, у которой в ходе глюкозного катаболизма синтезируется недостаточное количество NADPH, вследствие чего кишечная палочка нуждается в образовании дополнительного количества NADPH с помощью энергозависимой трансгидрогеназы PntAB (Sauer et al., 2004.). Для большинства других бактерий скорость образования NADPH превосходит скорость его расходования в глюкозном метаболизме. Так, показано, что решающее значение для предотвращения избыточного синтеза NADPH играют ферменты окислительной ветви пентозофосфатного пути: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и б-фосфоглюконатдегидрогеназа (Fuhrer and Sauer, 2009), за счёт двойной специфичности и/или наличия NAD-зависимых изозимов.

Для объекта наших исследований P. ananatis в ходе предыдущих экспериментов было показано, что в штамме SC 17(0)ApgiAgcd, в котором утилизация глюкозы возможна только через пентозофосфатный путь, делеция pzwf и pgnd приводит к снижению скорости роста. Таким образом, эти вторые гены активны и обеспечивают рост штамма SC17(0)ApgiAgcd в отличие от Е. coli, у которой введение мутации Дpgi существенно снижает скорость роста. Измерения активности ферментов pZwf и pGnd показали их предпочтительную NAD-зависимость, что предполагает их участие в предотвращении избыточного образования NADPH в пентозофосфатном пути.

Выводы

• Аннотирован и охарактеризован геном Р. апапайз.

• Проведена теоретическая реконструкция путей транспорта и катаболизма Б-глюкозы клетками Р. апапаИя.

• Показана и исследована работа предсказанных путей транспорта и катаболизма глюкозы: фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы, глюкозодегидрогеназного пути, транспорт глюкозы низкоаффинными Н+-симпортсрами (Оа1Р, Ху1Е, РисР), пути Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса и пентозофосфатного пути в клетках Р. апапаШ. Показаны их одновременное функционирование и взаимная заменяемость.

• Исследована регуляция gntKU оперона системы впИ периферического метаболизма глюконовой кислоты.

• Экспериментально подтверждены функции теоретически идентифицированных генов катаболизма Б-глюкозы клетками Р. апапаИ$\ Есс], рдд, р?м/, и

Основное содержание диссертации отражено в следующих печатных работах:

1. Нага, Y. The complete genome sequence of Pantoea ananatis AJ13355, an organism with great biotechnological potential./ Y. Hara, N. Kadotani, H. Izui, J.I. Katashkina, T.M. Kuvaeva, I.G. Andreeva, L.I. Golubeva, D.B. Malko, V.J. Makeev, S.V. Mashko, Y.I. Kozlov.// Appl. Microbiol. Biotechnol.-2011.-V.93.-N.1.-P. 331-341.

2. Andreeva, I.G. Identification of Pantoea ananatis gene encoding membrane pyrroloquinoline quinone (PQQ) - dependent glucose dehydrogenase and pqqABCDEF operon essential for PQQ biosynthesis./ I.G. Andreeva, L.I. Golubeva, J.I. Katashkina, T.M. Kuvaeva, S.V. Mashko. // FEMS Microbiol. Lett. - 2011. - V. 318. - P. 55-60.

3. Андреева ИТ J Предполагаемые Н+-симпортёры GalP, XylE и FucP из Pantoea ananatis способны транспортировать глюкозу в клетки Escherichia coli. М.Т. Андреева, Л.И. Голубева, Ж.И. Каташкина. // Биотехнология-2012.-2 —с. 21-31.

4. Katashkina, J.I. Use of the X Red - recombineering method for genetic engineering of Pantoea ananatis. / J.I. Katashkina, Y. Hara, L.I. Golubeva, I.G. Andreeva, T.M. Kuvaeva, S.V. Mashko. // BMC Molecular Biology. -2009 - V. 10. - P. 34. rlni- 1(1 11X6/1471 -2199 - 10-34

Chttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nmc/articlcs/PMC2682490/)

Подписано в печать:

23.10.2012

Заказ № 7750 Тираж - 50 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Андреева, Ирина Георгиевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность.

Цели и задачи.

Научная новизна и практическая значимость работы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Реконструкция метаболизма в масштабах генома.

1.1.1 Аннотация генома.

1.1.1.1 Картирование генов.

1.1.1.2 Базы данных аннотированных геномов.

1.1.1.3 Функциональная аннотация.

1.1.2 Метаболическая реконструкция.

1.1.2.1 Анализ пробелов в метаболической реконструкции.

1.1.2.2 Метаболические модели.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование путей транспорта и катаболизма глюкозы в клетках Pantoea ananatis"

Актуальность

РаМоеа стапаШ - один из представителей семейства энтеробактерий, различные штаммы которого известны как растительные патогены либо эпифиты. В последние десять лет данный вид привлекает к себе всё большее внимание исследователей поскольку, с одной стороны, он оказался распространённым и опасным патогеном растений, а с другой его природные штаммы способны продуцировать целый ряд полезных веществ (например, каротиноиды, 2,3-бутандиол и т.д.). Учитывая способность Р. апапаИь быстро расти на простых минимальных средах, содержащих глюкозу, сахарозу и другие углеводы и углеводороды (Мопуа е/ а1., 1999), данный вид можно рассматривать как перспективный объект биотехнологии.

На момент окончания экспериментов данной работы были секвенированы и аннотированы геномы только четырёх штаммов рода РаМоеа, два из которых относятся к виду Р. апапаИБ. При этом два генома (РаШоеа хр. А1-9Ь и Р. апапаШ ЬМС20103) принадлежат патогенным штаммам и один геном принадлежит штамму Рап1оеа уа%ат С9-1, используемому в сельском хозяйстве в качестве биопротектора. За период подготовки работы к публикации геномы ещё двух штаммов Р. апапаШ были секвенированы и аннотированы.

Объект настоящего исследования - штамм Р. апапаШ АЛ3355, относящийся к первому уровню биобезопасности (непатогенный штамм), на базе которого в настоящее время создаётся ряд штаммов-продуцентов, часть из которых уже находится на стадии промышленного внедрения. Составление подробной аннотации генома данного штамма и реконструкция его центрального метаболизма, несомненно, является актуальной и практически значимой задачей. С другой стороны, сравнение геномов Р. апапаШ АД 13355 и Ь]УЮ20103 могло бы пролить свет на генетическую природу патогенности последнего штамма.

Современные методы секвенирования, доступные программные средства и обширные базы данных, содержащие последовательности ДНК и белков позволяют быстро определять полные нуклеотидные последовательности бактериальных геномов, составлять их аннотации и реконструировать метаболические пути.

Однако экспериментальная проверка предсказанных моделей зачастую не проводится или существенно задерживается, что определяется отсутствием эффективных генноинженерных методов для конкретного исследуемого организма. Поэтому экспериментальная проверка функционирования предсказанных метаболических путей, поиск новых ферментов, специфических для данного вида или рода, представляет большой научный и практический интерес.

Цели и задачи

Диссертационная работа посвящена реконструкции путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками Pantoea ananatis и экспериментальной проверке их функционирования.

В процессе работы решались следующие задачи:

• аннотация генома и теоретическая реконструкция путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками Р. ananatis;

• экспериментальное подтверждение функционирования и оценка относительного вклада и взаимозаменяемости предсказанных путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками Р. ananatis;

• изучение генов Р. ananatis, представляющих потенциальный интерес с точки зрения их использования в метаболической инженерии штаммов-продуцентов на базе Е. coli и других энтеробактерий.

Научная новизна и практическая значимость работы

• В диссертационной работе составлена подробная аннотация генома Р. ananatis AJ13355 и проведена теоретическая реконструкция центрального углеродного метаболизма для данной бактерии.

• Ранее в нашей лаборатории были успешно адаптированы для использования в Р. ananatis все наиболее эффективные методы прецизионной модификации хромосомы Е. coli, основанные на использовании системы гомологичной рекомбинации фага X и систем сайт-специфической рекомбинации. Это позволило нам в данной работе не только теоретически реконструировать центральный метаболизм углерода, но и, впервые для Pantoea, провести полную экспериментальную проверку построенной теоретической схемы. Было экспериментально подтверждено существование предсказанных путей транспорта и катаболизма глюкозы (фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы (PTS), Н^-симпортёров (GalP, XylE, FucP), глюкозодегидрогеназного пути, пути Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса и пентозофосфатного пути) в клетках Р. ananatis, показаны их одновременное функционирование и взаимная заменяемость, обнаружены интересные особенности регуляции.

• В ходе работы были обнаружены специфические для Pantoea гены транспорта и катаболизма глюкозы (pcylE, fucP, pqq, pz\vf, pgnd) определяющие интересные особенности метаболизма. Использование найденных генов может быть полезным для повышения эффективности штаммов-продуцентов как на базе Р. ananatis, так и на базе E.coli.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

За последние 100 лет благодаря технологическому прогрессу стало возможным изучение механизмов жизнедеятельности клетки на уровне молекулекул и генов. Было накоплено потрясающее количество информации о работе самых разных компонентов клетки. В настоящее время благодаря развитию информационных технологий и системному подходу исследования накопленные массивы информации стало возможным анализировать и систематизировать, в результате чего стал возможным переход от изучения отдельных генов, регуляторных механизмов и метаболических путей к исследованию клетки как единой системы. На сегодняшний день получаемая в результате секвенирования целого генома информация в совокупности с накопленными экспериментальными данными позволяет не только предсказывать функции отдельных генов, но и строить метаболические карты, проясняя физиологию организма в целом и имеющиеся экспериментальные данные, обнаруживать необычные метаболические пути и исследовать происхождение и эволюцию как отдельных генов, так и целых ансамблей генов.

Первая часть Обзора литературы посвящена новым методам, позволяющим на основе результатов секвенирования строить метаболические карты и предсказывать физиологию клетки. Одним из важных практических результатов такого предсказания становится значительное повышение эффективности работы при создании промышленных штаммов продуцентов. На сегодняшний день для культивирования штаммов-продуцентов часто используют среду с глюкозой. Глюкоза представляет собой высокоэнергетический субстрат, используемый большинством биотехнологически интересных штаммов. Вторая часть Обзора посвящена генетике, регуляции экспрессии генов и взаимодействию метаболических путей в центральном метаболизме бактерий, в частности

Е. соИ, использующей глюкозу в качестве источника углерода;

11 рассматриваются описанные в литературе успешные направленные изменения в работе путей транспорта и катаболизма глюкозы с целью повышения продукции отдельных веществ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Андреева, Ирина Георгиевна

выводы

Аннотирован и охарактеризован геном Р. апапаНя.

Проведена теоретическая реконструкция путей транспорта и катаболизма О-глюкозы клетками Р. апапаИь.

Показана и исследована работа предсказанных путей транспорта и катаболизма глюкозы: фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы, глкжозодегидрогеназного пути, транспорт глюкозы низкоаффинными Н^-симпортёрами (Оа1Р, Ху1Е, БисР), пути Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса и пентозофосфатного пути в клетках Р. апапаНя. Показаны их одновременное функционирование и взаимная заменяемость. Исследована регуляция ¿»и/К1/ оперона системы ОпИ периферического метаболизма глюконовой кислоты.

Экспериментально подтверждены функции теоретически идентифицированных генов катаболизма Э-глюкозы клетками Р. апапайз'. £0(1, рдд, 2гм>/ ргт/, ^ и р^с1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Андреева, Ирина Георгиевна, Москва

1. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.

2. Ameyama M., Matsushita K., Ohno Y., Shinagawa E., Adachi O. (1981) Existence of a novel prosthetic group, PQQ, in membrane-bound, electron transport chain-linked, primary dehydrogenases of oxidative bacteria. FEBS Lett. 130: 179-183.

3. Anderson A., Cooper R.A. (1969) Gluconeogenesis in Escherichia coli. The role of trióse phosphate isomerase. FEBS Lett. 4: 19-20.

4. Andreesen J.R., Gottschalk G. (1969) The occurrence of the modified Entner-Doudoroff pathway in Clostridium aceticum. Arch. Microbiol. 69: 160-170.

5. Andreeva A., Howorth D., Brenner S.E., Hubbard T.J., Chothia C., Murzin A.G. (2004) SCOP database in 2004: refinements integrate structure and sequence family data. Nucleic Acids Res. 32: 226-229.

6. Arai M., Okumura K., Satake M., Shimizu T. (2004) Proteome-wide functional classification and identification of prokaryotic transmembrane proteins by transmembrane topology similarity comparison. Protein Sei. 13:2170-2183.

7. Arthur L.O., Bulla L.A.Jr., Julian G.S., Nakamura L.A. (1973) Carbohydrate Metabolism in Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol. 116(1): 304—313.

8. Báez J.L., Bolívar F., Gösset G. (2001) Determination of 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate productivity and yield from glucose in Escherichia coli devoid of the glucose phosphotransferase system. Biotechnol. Bioeng. 6: 530-535.

9. Bairoch A. (2000) The ENZYME database in 2000. Nucleic Acids Res. 28: 304-305.

10. Blangy D., Buc H., Monod J. (1968) Kinetics of the allosteric interactions of phosphofructokinase from Escherichia coli. J. Mol. Biol. 31: 13-35.

11. Blank L.M., Lehmbeck F., Sauer U. (2005) Metabolic-flux and network analysis in fourteen hemiascomycetous yeasts. FEMS Yeast. Res. 5: 545558.

12. Boden M. and Hawkins J. (2005) Prediction of subcellular localisation using sequence-biased recurrent networks. Bioinformatics. 21: 2279-2286.

13. Boonstra B., French C.E., Wainwright I., Bruce N.C. (1999) The udhA gene of Escherichia coli encodes a soluble pyridine nucleotide transhydrogenase. J. Bacteriol. 181: 1030-1034.

14. Bork P., Dandekar T., Diaz-Lazcoz Y., Eisenhaber F., Huynen M., Yuan Y. (1998) Predicting function: from genes to genomes and back. J. Mol. Biol. 283: 707-725.

15. Botsford J. L. and Drexler M. (1978) The cAMP receptor protein and regulation of cAMP synthesis in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 165:47-56.

16. Botsford J. L. and Harman J. G. (1992) Cyclic AMP in prokaryotes. Microbiol. Rev. 56:100-122.

17. Brenner S.E. (1999) Errors in genome annotation. Trends Genet. 15: 132-133.

18. Bringhurst R. M. and Gage D. J. (2002) Control of inducer accumulation plays a key role in succinate-mediated catabolite repression in Sinorhizobium meliloti. J. Bacteriol. 184:5385-5392.

19. Budgen N., Danson M.J. (1986) Metabolism of glucose via a modified Entner-Doudoroff pathway in the thermoacidophilic archaebacterium Thermoplasma acidophilum. FEBS Lett. 196: 207-210.

20. Bulyk M.L., McGuire A.M., Masuda N., Church G.M. (2004) A motif co-occurrence approach for genomewide prediction of transcription-factor-binding sites in Escherichia coli. Genome Res. 14: 201-208.

21. Burgard A.P. and Maranas C.D. (2001) Probing the performance limits of the Escherichia coli metabolic network subject to gene additions or deletions. Biotechnol. Bioeng. 74: 364-375.

22. Cha J.S., Pujol C., Kado C.I. (1997) Identification and characterization of a Pantoea citrea gene encoding glucose dehydrogenase that is essential for causing pink disease of pineapple. Appl. Environ. Microbiol. 63: 71-76.

23. Chin A.M., Feldheim D.A., Saier M.H. Jr. (1989) Altered transcriptional patterns affecting several metabolic pathways in strains of Salmonella typhimurium which overexpress the fructose regulon. J. Bacteriol. 171:2424-2434.

24. Chou C.H., Bennett G.N., San K.Y. (1994) Effect of modulated glucose uptake on high-level recombinant protein production in a dense Escherichia coli culture. Biotechnol. Prog. 10: 644-647.

25. Clarke D.M., Loo T.W., Gillam S., Bragg P.D. (1986) Nucleotide sequence of the pntA and pntB genes encoding the pyridine nucleotide transhydrogenase of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 158: 647-653.33