Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот"

На правах рукописи

□03165230

Сычева Елена Викторовна

Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот.

03 00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 Map

щ

Москва, 2008 г

003165230

Работа выполнена в лаборатории №3 Научно-исследовательского института «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Н.В. Стойнова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор A.C. Миронов

ФГУП "ГосНИИгенетика"

кандидат биологических наук С.В. Беневоленский

Институт биохимии им А Н. Баха РАН

Ведущая организация: Институт общей генетики им Н И Вавилова РАН

Защита диссертации состоится «2£у> МОртй 2008 года в 14— на заседании Диссертационного совета Д 217 013 01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу 117545, г Москва, 1-й Дорожный проезд, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика»

Автореферат разослан «22_» 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук , Г Г Заиграева

/

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Всем ферментам в той или иной степени присуще наличие альтернативных субстратов Именно это свойство определяет гибкость метаболических путей и обеспечивает замечательную приспособляемость микроорганизмов к изменяющимся условиям роста Зачастую в новых условиях могут возникать целые альтернативные метаболические пути, так называемые пути "скрытого" метаболизма, которые обусловливают способность клеток к утилизации новых источников питания ичи к катаболизму токсичных агентов экзогенного или эндогенного происхождения [D'An & Casadesus, 1998] Изучение таких путей становится особенно актуальным при создании на основе микроорганизмов штаммов-продуцентов различных метаболитов, в частности, аминокислот Стандартным подходом в такой работе является уситение метаболических потоков, приводящих к синтезу целевого продукта, и блокирование "ненужных" п>тей Это достигается путем увеличения или уменьшения экспрессии соответствующих генов, что может приводить к внутриклеточному накоплению интермедиатов биосинтеза В результате чего могут включаться "скрытые" метаболические пути, катаболизирующие эти интермедиаты, причем соответствующие метаболические потоки могут быть весьма значительными, что может огрицательно сказаться на выходе целевого продукта и приводить к накоплению примесей

Мы столкнулись с явлением "скрытого" метаболизма при конструировании на основе Е coli штамма-продуцента изолейцина Известно, что изолейцин образуется из треонина (Рис 1), поэтому при создании штамма-продуцента изолейцина необходимо в первую очередь усилить биосинтез треонина и блокировать его деградацию Кроме того, для эффективной конверсии треонина в изолейцин очень важно подобрать оптимальный уровень экспрессии ключевых ферментов биосинтеза изолейцина - биосинтетической треониндезаминазы (IlvA), осуществляющей превращение треонина в 2-кетобутират, и синтаз ацетогидроксикислот (AHAS), которые катализируют конденсацию 2-кетобутирата с пируватом с образованием 2-ацето-2-гидроксибутирата - предшественника изолейцина

При создании штамма-продуцента изолейцина мы обнаружили, что уси пение синтеза треонина в ряде случаев приводило к резкому снижению уровня синтеза изолейцина и накоплению в среде значительного количества пропионата Мы предположили, что это явление связано главным образом с деградацией треонина, поэтому основной задачей работы стало изучение ранее неизвестных путей аэробной деградации треонина

К настоящему времени в клетках Е coli охарактеризованы два пути катаболизма треонина - превращение треонина в глицин, в котором участвуют треониндегидрогеназа (Tdh) и 2-амино-З-кетобутират-КоА-лигаза (КЫ) [Aronson et al, 1989], и анаэробная деградация до пропионата [Heßlinger et al, 1998] (Рис 1) Показано, что на первом этапе анаэробного пути деградации треонин превращается в 2-кетобутират под действием биодеградативной треониндезаминазы (TdcB) Затем 2-кетобутират неокислительно декарбоксилируется с образованием пропионил-КоА фомиатлиазами кетокислот PflB и

TdcE, которые чувствительны к кислороду и не активны в аэробных условиях В дальнейшем превращении пропионил-КоА в пропионат через пропионилфосфат принимают участие фосфотрансацетилаза (Pta) и пропионаткиназы - TdcD и АскА Другие пути деградации треонина в клетках Е coli к настоящему времени не охарактеризованы

транспорт из клетки

включение в белки

2-амино-

Tdh

¿aunnu • м» т

—s. L-треонин 3-кетобутират г ^

^ КоА НАДН 11АД+ _

кы

IlvA

' ацетил-КоА L-глицин

TdcB

NH,

2-кетобутират

* пируват

AHAS

2-ацето-2-гидрокси-бутират

I I

L-изолейцин

9

2-кетобутират

NH3 PflB V К0А TdcE|xHCOOH

пропионил-КоА

анаэробные условия

КоА

СО,

Pta

s Рн

ч,

■■КоА

пропионилфосфат АскА у АДФ

TdcD ^ АТФ пропионат

Рис 1. Метаболизм L-треонина в Е. coli

Tdh - треониндегидрогеназа, КЫ - 2-амино-З-кетобутират-КоА-лигаза, IlvA - треониндезаминаза (биосинтетическая), AHAS - синтазы ацетогидроксикислот, TdcB - треониндезаминаза (катаболитная), PflB - пируватформиатлиаза, TdcE - 2-кетобутиратформиатлиаза, Pta -фосфотрансацетилаза, AckA, TdcD - пропионаткиназы

Цели и задачи работы Данная работа является продолжением исследований, проводимых в ЗАО "АГРИ" и направленных на конструирование высокоэффективных штаммов-продуцентов треонина и изолейцина Основной целью настоящей работы являлось изучение путей аэробного метаболизма треонина в клетках Е coli, связанных с образованием 2-кетобутирата

В процессе работы решались следующие задачи

- изучение путей аэробной деградации треонина в клетках Е coli,

- идентификация ферментов, участвующих в аэробной деградации треонина в Е coli,

- создание коллекции экспрессионных кассет, несущих гены, кодирующие изоферменты синтаз ацетогидроксикислот (AHAS) из Е coli и Methylophilis methylotrophus для дальнейшего применения при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот,

- исследование роли ферментов биосинтеза лейцина в образовании неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из 2-кетобутирата,

- изучение возможности сверхсинтеза норвалина и норлейцина в клетках

Е coli

Научная новизна и практическая значимость работы В настоящей работе изучена аэробная деградация L-треонина, однородно меченного изотопами 14С и 13С, в модельном штамме Е coli ITP290-3 Этот штамм накапливает треонин в отсутствие экспрессии гена dvA,,eR, кодирующего биосинтетическую треониндезаминазу, устойчивую к ретроингибированию, и изолейцин в условиях экспрессии гена ilvA,!eR Показано, что в клетках Е coli в аэробных условиях происходит деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират в случае, когда треонин эффективно дезаминируется треониндезаминазой, устойчивой к ретроингибированию, с образованием 2-кетобутирата Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата является незначительным

Создана коллекция экспрессионных кассет, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот Е coli и М methylotrophus Получены варианты оперона ilvG603M и ilvBN Е coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией Полученные конструкции в дальнейшем могут применяться при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот

Получен штамм Е coli с делециями всех генов, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы с выходом 8% На примере данного штамма подтвержден предполагаемый механизм образования норвалина и норлейцина в клетках Е coli из 2-кетобутирата или пирувата ферментами пути биосинтеза лейцина

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной школе-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология", посвященной 100-летию со дня рождения С И Алиханяна (Москва-Пущино, ноябрь-декабрь 2006 г) и на смотрах-конкурсах работ сотрудников ЗАО "АГРИ" (Москва, июнь 2004 т , июнь 2007 г)

Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре ЗАО "АГРИ" и Секции Ученого Совета ФГУП "ГосНИИГенетика" 30 октября 2007 года

Публикации По теме диссертации опубликовано семь печатных работ, из них две в отечественном журнале, четыре тезисных сообщения в материалах научной конференции и одна патентная заявка

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на листах машинописного текста, включая 3? рисунков и 22. таблиц Работа состоит из введения, списка испочьзуемых сокращений, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы Список литературы содержит источников, в том числе 9 на русском языке

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение деградации треонина в модельном штамме ITP290-3 в условиях контролируемой экспрессии треониндезаминазы, устойчивой к ретроингибированию 1.1. Конструирование модельного штамма ITP290-3 и изучение конверсии треонина в изолейцин в условиях контролируемой экспрессии гена ilvA,le"

Для изучения возможных путей деградации треонина нами был сконструирован модельный штамм ITP290-3 В качестве родительского штамма был использован треониновый продуцент TDH7KmS/pPRT614, который содержал на плазмиде pPRT614 структурные гены треонинового оперона thrA442BC под контролем PR промотора фага À, а также ген температурочувствительного репрессора фага X - с1857, и имел хромосомную мутацию в гене tdh, предотвращающую деградацию треонина по пути дегидрирования

Для создания условий регулируемой экспрессии треониндезамииазы в штамм TDH7KmS/pPRT614 была интегрирована экспрессионная кассета mmi-Mu ?\x-lacI-ilvA,,eF\ которая содержала под контролем Plac промотора ген лактозного репрессора (1асГ) и ген ilvA!teR, кодирующий биосинтетическую треониндезаминазу, устойчивую к ретроингибированию Это позволяло путем изменения концентрации индуктора лактозного оперона изопропилтиогалактозида (IPTG) плавно регулировать или полностью блокировать активность треониндезаминазы в ходе культивирования клеток Для интеграции данной кассеты испочьзовалась плазмида pMDv4ilvA (Рис 2) (любезно предоставлена к б н Бирюковой И В , ЗАО "АГРИ")

Sspl (0)

BamHI (5222 HindIII

BamHI (3959)

Рис. 2. Структура плазмиды pMDv4ilvA

Измерение удельной активности треониндезаминазы в клетках штамма НВ101, несущего плазмиду рМБу411уА, подтвердило, что в условиях репрессии гена йуАПеК активность треониндезаминазы была достаточно низкой (на уровне штамма НВ101) При

добавлении индуктора активность фермента значительно увеличивалась (более чем на три порядка) и не ингибировалась изолейцином (Табч 1)

Таблица 1 Удельная активность треониндезаминазы (ТД) в клетках штаммов

НВ101 и НВ101/рМЛу411 уА

Уд. акт ТД, нмоль/мин мг*

Штамм Генотип без 1РТС 1РТв

без Не Не, 2мМ без Не Не, 2мМ

НВ101 ¡Ш 20 1 3 НО НО

Н В101 /р МО у4 11VА ¡ш, Ры-1ас1-1Ш"е* 1 0 06 3000 3117

* Удельную активность ТД измеряли в грубых экстрактах клеток, выращенных в условиях индукции 1РТС (1мМ) и без индукции Так как штамм НВ101 содержит ген гЫА дикого типа, кодирующий ТД, чувствительную к изолейцину, а плазмида р\-ГОу41К'А содержит ген ¡к'Л11'11, кодирующий ТД, устойчивую к изолейцину, измерение проводили как в отсутствие, так и в присутствии изолейцина (2мМ) в пробах, НО - не определяли

Клетки штамма 1ТР290-3 в отсутствие экспрессии гена йчА,к!< накапливали в культуральной жидкости только треонин, а в условиях экспрессии гена ¡1уА!1еК - изолейцин, 2-аминобутират и не накапливали треонин (Табл 2, опыт 1) Таким образом, штамм 1ТР290-3 являлся удобной моделью для изучения путей деградации треонина в условиях экспрессии биосинтетической треониндезаминазы, устойчивой к ретроингибированшо

Анализ накопления изолейцина клетками штамма 1ТР290-3 в условиях экспрессии гена ¡¡уА"6" показал отсутствие полного превращения треонина в изолейцин, причем деградация треонина была существенной (Табл 2, опыт 1) Можно было бы предположить, что подобный результат связан не с деградацией треонина, а со снижением его синтеза в условиях сверхэкспрессии гена ¡Ш"''" Для проверки этого предположения мы индуцировали экспрессию гена г/уЛ/,еЛ уже после того как в клетке синтезировалось значительное количество треонина (Табл 2, опыт 2), но и в этом случае не наблюдали полной конверсии накопленного треонина в изолейцин Сходные резучьтаты были получены и в случае добавления в среду экзогенного треонина (Табл 2, опыт 3)

Таким образом, анализ продуктов, накапливаемых штаммом 1ТР290-3 в условиях экспрессии гена 1ЫА11еЯ, показал отсутствие полной конверсии как вновь синтезируемого, так и экзогенного треонина в изолейцин Мы предположили, что неполное превращение треонина в изолейцин связано с деградацией 2-кетобутират, который образуется из треонина под действием биосинтетической треониндезаминазы, в путях, отличных от биосинтеза изолейцина

Для проверки этого предположения мы определили некоторые продукты, которые штамм 1ТР290-3 накапливает в отсутствие экспрессии гена 11уА!1еК и в условиях экспрессии гена ¡ЫЛПеК при добавлении экзогенного треонина, т е в условиях избытка 2-кетобутирата (Табт 3)

Таблица 2. Продукты ферментации, накапливаемые штаммом 1ТР290-3 в условиях регулируемой экспрессии треониндезаминазы

N Добавки* Время культиви- ОП, Продукты ферментации**, мМ

опыта рования, ч 540 нм Thr Не 2-АБ

1 - 24 13 7 151 1 <1 0 <1 0

IPTG 24 36 <1 15 2 48

2 - 7 47 42 8 (5 1 г/л) <1 0 <1 0

IPTG через 7 ч 24 52 <1 0 13 0 78

3 IPTG, Thr (47 8 мМ) 24 82 <1 0 21 3 58

* Культивирование проводили в пробирках со средой, содержащей глюкозу (4%), 1РТв добавляли до конечной концентрации 1мМ, ** 2-АБ - 2-аминобутират

Оказалось, что в условиях репрессии гена ilvAllsK кроме треонина штамм накапливал небольшое количество пропионата, который обычно токсичен для клеток £ coli (Табл 3) При индукции гена dvAIkR в условиях добавления экзогенного треонина уровень синтеза пропионата существенно увеличивался и происходило накопление 2-кето-З-метилвалерата (КМВ) - предшественника изолейцина, и 2-аминобутирата (2-АБ) - продукта аминирования 2-кетобутирата изолейцин-валиновыми аминотрансферазами

Таблица 3 Некоторые продукты ферментации, накапливаемые штаммом ITP290-3 в отсутствие экспрессии гена ilvAn'R (опыт 1) и в условиях экспрессии гена ilvA!,eR (опыт 2)

N Продукты ферментации, мМ

опыта Добавки* Thr Не Пропионат КМВ 2-АБ

1 - 151 1 <1 0 45 <1 0 <1 0

2 Thr, IPTG <1 0 21 3 32 4 46 58

* Культивирование проводили в пробирках со средой, содержащей глюкозу (4%), с

добавками треонина (47 8 мМ) и IPTG (1мМ), либо без добавок

Мы предположили, что пропионат мог быть как продуктом деградации 2-кетобутирата, который образуется из треонина под действием треониндезаминазы, так и изолейцина (Рис 3) Деградация 2-кетобутирата представлялась нам наиболее вероятным путем синтеза пропионата, так как клетки Е coli не способны катаболизировать углеродный скелет изолейцина, в частности, использовать его в качестве единственного

источника углерода для роста. Для экспериментальной проверки данных схем мы изучили утилизацию треонина, равномерно меченого изотопом иС, в штамме 1ТР290-3.

2-Аминобутират

" 1МЕ, Ау1А

Треонин -► 2-КетобуТИрат -►-►-►-► Изолейцин

I

1 !

!

I

Проиионат

Рис. 3. Возможные пути синтеза пропионата в штамме 1ТР290-3

1.2. Анализ продуктов деградации треонина, однородно меченного изотопом 14С, в штамме 1ТР290-3

Деградация треонина изучалась нами путем анализа меченых продуктов утилизации Ь-[и-,4С]треонина. С

этой целью штамм 1ТР290-3 культивировали в среде с немеченой глюкозой в качестве источника углерода в присутствии 1,-[и-14С]треонина и немеченого треонина (5.7 г/л) в условиях репрессии и дерепрессии гена П\>А'"К. Определение суммарной радиоактивности культуралыгой жидкости штамма ГГР290-3, проведенное на разных этапах ферментации, показало, что в процессе ферментации происходило уменьшение суммарной радиоактивности культуральной жидкости, по-видимому, за счет выведения |4С-мстки с летучими соединениями, главным образом, с ''СО? (Рис. 4). Можно видеть, что в условиях индукции треониндезаминазы количество метки, выводимой с летучими соединениями, было на 24% больше, чем в отсутствие индукции.

Рис. 4. Изменение концентрации |4С-меченных атомов в культуральной жидкости штамма 1ТР290-3 в ходе ферментации в отсутствие экспрессии гена ¡ЫА!к1< и в условиях экспрессии гена /Ш"е"

О 4 8 12 16 20 24

Время культивировании, ч

Мы провели количественный анализ распределения ,4С-метки в продуктах ферментации штамма 1ТР290-3 в условиях экспрессии гена ИуАПеК. Оказалось, что только 38% |4С-метки, введенной с Ь-[и-14С]треонином, включалось в изолейцин, 5% метки включалось в 2-аминобутират, 34% составила потеря метки с летучими соединениями (Рис. 5). Таким образом, в условиях данного эксперимента нам удалось идентифицировать 43% меченых продуктов утилизации Ь-[Ц-14С]треонина. Для идентификации остальных продуктов деградации треонина мы изучили утилизацию треонина, равномерно меченого изотопом ,3С, в штамме 1ТР290-3 с помощью ЯМР-спектроскопии, Все ЯМР-спектры были накоплены, обработаны и проанализированы в лаборатории спектрального анализа ИБХ РАН.

2-аминобутират

изолейцин 38%

Рис. 5. Распределение 14С-меченных атомов в продуктах ферментации штамма 1ТР290-3 в условиях экспрессии гена ИуА""х

1.3. Анализ продуктов деградации Ь-13С-треонина методом ЯМР-спектроскопии

Треонин, однородно меченный изотопом ЬС, был получен путем культивирования треонинового продуцента ТОН7Кга5/рРЯТ614 в среде, содержащей 0-[1!-ьС]глюкозу в качестве единственного источника углерода. В 'Н-ЯМР-спектре Ь-|3С-треонина были обнаружены характерные сигналы протонов а-СН группы при 4.28 м.д., (3-СН группы при 3.1 м.д. и у-СНз группы при 1.35 м.д. (рис. не приводится). Интересно отметить, что Су атом полученного Ь-13С-1реонина был в меньшей степени обогащен изотопом ЬС по сравнению с Са и С(3 атомами. Так, для Са и Ср атомов соотношение изотопов |2С/ЬС составило 0.11, а для Су атома - 0.20. Такая неоднородность мечения треонина, полученного микробиологическим способом из 0-[и-'3С]глюкозы, вероятно, связана с тем, что при образовании Су атома оксалоацетата (и соответственно треонина) в фосфоенол-пируваткарбоксилазной реакции происходит ассимиляция не только меченого ьСО?, выделяемого в реакциях декарбоксилирования, но и 12С02 из окружающей среды (Рис. 6).

Для изучения деградации Ь-13С-треонина мы проводили ферментацию штамма 1ТР290-3 в среде с немеченой глюкозой в присутствии Ь-ьС-треонина (2 г/л) и немеченого треонина (8 г/л) в отсутствие экспрессии гена ЦуАИеК и в условиях экспрессии ИуА"'й.

13СрН2 II

13Са —ОРО3Н7

I

"COO-PEP

СО,

Ррс

н2о

Pi

12 Су ОО" i3CpH2 |3Са = 0

н 1

|3СОО"

Оксалоацегат

,2СуН3 «СрН-ОН

13 CctH-NH3+ » 1

13СОО_ Треонин

Рис. 6. Образование треонина из С-фосфоенолпирувата (PEP) и |2С02

Ррс - фосфоенолпирувагкарбоксилаза (ЕС 4.1.1.31)

Продукты ферментации анализировали методами одномерной гомоядерной и двумерной (2D) гомо- и гетероядерной ЯМР-спектроскопии, которые в настоящее время широко применяются в исследованиях метаболических потоков, так позволяют проследить за метаболизмом 1ЭС-меченных соединений [Szyperski etai, 1992, London etai, 1999].

На Рис. 7 приведены 'Н-ЯМР-спектры культуральной жидкости штамма ITP290-3 в условиях репрессии гена ilvj"eR (спектр I) и в условиях экспресии гена ilvA"eR (спектр II). В отсутствие экспрессии гена HvA,leR в 'Н-ЯМР спектре культуральной жидкости были обнаружены сигналы от протонов треонина и пропионата. В случае экспрессии гена HvA,leR в 'Н-ЯМР спектре наблюдали сигналы, соответствующие протонам пропионата, 2-кетобутирата, 2-аминобутирата. пирувата, треонина и ацетата.

Ь, 21,6

.5 4.0 3.5

Рис. 7. Н-ЯМР-спектры культуральной жидкости штамма 1ТР290-3, выращенного в условиях репрессии гена ¡ЬА,кк (спектр I) и в условиях дерепрессии гена ¡ЫА1Ш (спектр II). Указаны сигналы, соответствующие протонам пропионата (1а, 1Ь), 2-кетобутирата (2а, 2Ь), треонина (За, ЗЬ, Зс), пирувата (4), ацетата (5), 2- аминобутирата (2-АБ) (6).

Общее содержание изотопа ,3С в продуктах ферментации было определено из одномерных 13С-спектров. Суммарная потеря '3С-меченых атомов в ходе ферментации в условиях экспрессии гена ИуА"еК была на 21% больше, чем в отсутствие экспрессии гена ЦуА,кК. Эти результаты хорошо согласуются с данными по убыли метки в процессе утилизации Ь- [и-14С]треонина (Рис. 4).

Мы провели анализ количественного распределения ьС-метки в основных веществах-метаболитах в условиях индукции треониндезаминазы (Табл. 4). Большая часть изотопа ,3С обнаруживалась в пропионате (41% от суммарного количества 13С-меткн в идентифицированных соединениях). Можно видеть, что в условиях данного опыта Ь-,3С-треонин метаболизировался не полностью. Кроме того, среди меченых продуктов деградации Ь-13С-треонина был идентифицирован норвалин (количество метки в нем не определялось), возможный путь его синтеза будет рассмотрен в Разделе 4 автореферата.

Таблица 4. Относительное содержание изотопа 13С в продуктах ферментации штамма 1ТР290-3 в условиях индукции гена ¡ЫА,к,<

Вещество

Изолейцин 1.00

Пропионат 4.16

Треонин 2.10

2-Кетобутират 2.00

2-Аминобутират 0.62

2-Кето-З-метилвалерат 0.26

Пируват 0

* суммарное содержание изотопа С в изолейцине принято за 1.

На данном этапе работы по характеру включения изотопа 13С в молекулу пропионата мы проверяли два возможных пути его образования, приведенные на Рис. 8.

ТЬг

Л^гД

Пропионат , а

ДСШ

Пропионат

Р

Пируват

Рис. 8. Возможные пути образования пропионата и 2-аминобутирата: путь 1 - пропионат образуется из 2-кетобутирата (2-КБ), путь 2 - пропионат образуется и:

изолейцина; Д - 'эС-атомы, □ - ,2С-ато.мы

В том случае, если пропионат образуется из Ь-13С-треонина, однородно меченого пс всем четырем атомам углерода, то включение изотопа ,3С произойдет во все атомь! углерода пропионата (Рис. 8, схема 2). Если же пропионат образуется из изолейцина

селективно меченного изотопом 13С, то Са и Ср атомы пропионата будут немечеными, так как в мочекуле изолейцина они происходят из немеченого пирувата (Рис 8, схема 2)

Для экспериментальной проверки данных схем был накоплен и проанализирован 2П 'Н-,3С-С08У спектр культуральной жидкости штамма 1ТР290-3, выращенного в условиях экспрессии гена ¡Ш"1* Фрагмент 'Н-13С-С08У спектра и срезы для кросс-пиков изолейцина и треонина по 13С-направлению представлены на Рис 9

Низкая интенсивность и отсутствие расщеплении сигналов Ср и Су2 атомов изолейцина свидетельствовали о природном содержании изотопа 13С (около 1%) в ядрах данных атомов, что подтверждало их образование из немеченого пирувата То, что сигнал Са атома изолейцина имел форму дублета, указывало на включение изотопа 13С в ядро данного атома и на его взаимодействие только с одним атомом 13С, а именно, со связанным с ним атомом углерода карбоксильной группы Характер расщепления сигналов С5 и Су1 атомов изолейцина свидетельствовал о включении изотопа 13С в ядра данных атомов и указывал на взаимодействие между ними Таким образом, анализ спектра подтвердил селективность мечения изолейцина изотопом 13С

3 5-

"я 3 4£

ТЬг ММ [1Н,13С]-С08У

Не

а"сн ш а-АВ

I а-СН 1 1СН | а-СН

60

"С, Ю, (мд)

58

МН,

Т1

13СН2 „ '

13 / ч|) /

Н3С СН

я I 0 у2СН3

•СН

1зСОО

Изолейцин

Ш3

„СИ р I он

Треонин

зСОО"

Рис 9. Фрагмент 'Н-^С-СОБУ спектра, срезы по оси о>1 для кросс-пиков треонина и изолейцина

Характер расщепления сигналов Са, Ср и Су атомов треонина подтверждал включение изотопа 13С во все атомы углерода треонина (Рис 9) То, что сигнал Са атома треонина имел форму дублета дублетов, указывало на неэквивалентность связанных с ним СР атома углерода и атома углерода карбоксильной группы То, что Ср атом треонина давал в спектре триплет, а не дублет дублетов, свидетельствовало об эквивалентности связанных с ним Са и Су атомов углерода

Сигнал Ср атома пропионата в 'Н-ПС-С08У спектре имел форму дублета, что указывало на включение изотопа |3С в ядро данного атома и на его взаимодействие со связанным с ним Са атомом углерода (Рис 10) То, что Са атом пропионата давал в спектре дублет дублетов, свидетельствовало о неэквивалентности связанных с ним Ср атома углерода и атома углерода карбоксильной группы Таким образом, характер расщепления сигналов Са и Ср атомов пропионата указывал на включение изотопа ,3С во все атомы углерода пропионата Это означает, что пропионат был продуктом аэробной деградации однородно меченного треонина, а не изолейцина, селективно меченного изотопом 13С

Характер включения углерода 13С в молекулу 2-аминобутирата свидетельствовал о том, что 2-аминобутират также являлся продуктом деградации Ь-13С-треонина (Рис 10)

а

э >ч

,3СН3 '5 соон

Пропионат

ын2 * »1 СНзчр "си

13сп2 13 соон

2-Аминобутират

Рис 10 Срезы 'Н^'С-СОвУ спектра по оси о>1 для кросс-пиков пропионата и аминобутирата (а-АВ)

Таким образом, на данном эгапе работы мы показали, что в аэробных условиях в клетках Е сок может происходить деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират, и первым этапом этого пути является превращение треонина в 2-кетобутират, которое осуществляет биосинтетическая треониндезаминаза

2 Изучение ферментов аэробного пути метаболизма треонина в пропионат

На втором этапе работы мы попытались идентифицировать ферменты, которые отвечают за дальнейшее превращение 2-кетобутирата в пропионат Из литературных источников известно, что в анаэробно растущих клетках Е coli 2-кетобутират декарбоксилируется с образованием пропионил-КоА пируватформиатлиазой (PflB) и формиатлиазой кетокислот (TdcE), которые чувствительны к кислороду и не активны в аэробных условиях Мы предположили, что в аэробном метаболизме 2-кетобутирата в пропионат в Е coli принимают участие пируватоксидаза и пируватдегидрогеназный комплекс, так как известно, что 2-кетобутират может служить их альтернативным субстратом in vitro [Chang et al, 2000, Bisswanger et al, 1981]

2.1. Влияние амплификации и инактивации гена рохВ на синтез пропионата в штамме ITP290-3

Для проверки предположения о том, что пируватоксидаза может принимать участие в деградации 2-кетобугирата, мы изучили влияние амплификации гена рохВ на уровень накопления пропионата в штамме ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvAUeR С этой целью данный штамм трансформировали плазмидой pBR322-poxB, несущей ген рохВ под собственной регуляцией Как следует из Таблицы 5, амплификация гена рохВ привела к снижению уровня накопления изолейцина (в 2 раза), а также значительно увеличила уровень накопления пропионата (в 3 раза) и препятствовала накоплению 2-кетобутирата Таким образом, амплификация пируватоксидазы усилила деградацию 2-кетобутирата в пропионат

Таблица 5. Влияние амплификации гена рохВ на уровень накопления изолейцина,

пропионата и 2-кетобутирата в штамме ITP290-3

Штамм ОП540 Продукты ферментации, г/л*

2-Кетобутират Изолейцин Пропионат

ITP290-3 8 1 29 23 24

ITP290-3/pBR322 65 53 1 5 2 1

ITP290-3/pBR322-poxB 53 <0 1 07 6 8

♦Среда содержала глюкозу (.4%), треонин (5 7 г/л), IPTG (1мМ)

Далее мы изучили влияние инактивации гена рохВ на синтез пропионата в штамме 1ТР290-3 в условиях экспрессии гена ¡ЬА,кк Для этого хромосомную делецию гена рохВ переносили в штамм 1ТР290-3 Видно, что инактивация гена рохВ не оказала заметного влияния на уровень накопления пропионата и изолейцина в штамме 1ТР290-3 (Табл 6)

Следовательно, несмотря на то, что амплификация пируватоксидазы усиливает деградацию 2-кетобутирата в пропионат, очевидно, что этот путь деградации 2-кетобутирата не является единственным и ключевым

Таблица б Влияние инактивации гена рохВ на уровень накопления

пропионата и изолейцина в штамме ITP290-3

Штамм ОП540 Продукты ферментации, г/л*

Пропионат Изолейцин

ITP290-3 63 26 1 2

1ТР290-ЗДрохВ 68 26 1 3

*Среда содержала глюкозу (4%), треонин (5 7 г/л), IPTG (1мМ)

2.2. Влияние инактивации гена асеЕ на синтез пропионата в штамме ITP290-3

Для проверки предположения о том, что пируватдегидрогеназный комплекс (PDHC) может принимать участие в деградации 2-кетобутирата, мы изучили влияние инактивации гена асеЕ, кодирующего Elp субъединицу PDHC, на уровень синтеза пропионата в штамме ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA,kR Для этого в штамм ITP290-3 трансдукцией фагом PI вводили хромосомную делецию гена асеЕ Полученный в результате штамм 1ТР290-ЗДасеЕ для роста на минимальной среде нуждался в добавлении ацетата

Как следует из Таблицы 7, штамм 1ТР290-ЗДасеЕ в условиях экспрессии гена ilvAHeR не накапливал пропионат и ацетат, а уровень накопления 2-кетобутирата увеличился на 30% по сравнению с исходным штаммом Это означает, что инактивация Elp субъединицы пируватдегидрогеназного комплекса блокировала превращение 2-кетобутирата в пропионат

Таблица 7. Влияние инактивации гена асеЕ на накопление пропионата в штамме ITP290-3

Штамм Ацетат ОП540 Продукты ферментации, г/л*

2-Кетобутират Ацетат Пропионат

ITP290-3 - 63 44 08 26

ITP290-3 + 60 43 1 1 20

1ТР290-ЗДасеЕ + 48 58 <01 <0 1

* Культивирование проводили в пробирках со средой, содержащей глюкозу (4%), с

добавками треонина (5 7 г/л), 1РТС (1мМ) и (если указано) ацетата натрия (0 4%)

Таким образом, полученные данные позволяют нам сделать вывод о том, что основную роль в аэробной деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс Очевидно, что он осуществляет превращение 2-кетобутирата в пропионил-КоА, который, по-видимому, метаболизируется в пропионат фосфотрансацетилазой (Рш) и пропионаткиназой (АскА) (Рис 11)

Пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, однако в отсутствие сверхэкспрессии ее вклад в деградацию 2-кетобутирата является незначительным

Деградацию 2-кетобутирата в пропионат можно считагь примером "скрытого метаболизма", который обусловлен повышением уровня 2-кетобутирата в клетке в результате сверхэкспрессии гена ilvAlkR, что приводит к его утилизации пируватдегидрогеназным комплексом

Ile t

Треонин t

2-Аминобутират

норвалин

IlvA

2-Кетобутират

РохВ

FDHC

(аэробные условия)

РП, TdcE (анаэробные условия)

OA КоА V_^Prp_C Prpü

Пируват

t ¿r Сукцннат

PrpB

AcnB

Пропионил-КоА

I Pta Пропионилфосфат

I АсКА Пропионат

Acs

Рис. 11. Возможные пути метаболизма 2-кетобутирата в клетках Е coli PDHC - пируватдегидрогеназный комплекс, PflB, TdcE - пируватформиатлиазы, AHAS I, III - синтазы ацетогидроксикисчот I и III, IlvE - трансаминаза В, AvtA - трансаминаза С, РохВ - пируватоксидаза, Acs - ацетил-КоА-синтаза, РгрС - метилцитратсинтаза, PrpD -2-метилцитратдегидратаза, АспВ - аконитаза В, РгрВ - 2-метилизоцитратлиаза, OA -оксалоацетат Реакции метилцитратного цикла обозначены пунктирными стрелками

2 3 Изучение возможного метаболизма пропионил-КоА в метилнитратном цикле

Известно, что у Е coli и S typhimurium существует еще одна ферментная система, способная осуществлять метаболизм пропионил-КоА - метилцитратный цикл, в котором пропионил-КоА окисляется до пирувата (Рис 11) [Textor et al, 1997, London et al, 1999, Brock et al, 2002] Однако у E coli данный цикл функционирует только после длительной адаптации клеток к росту на пропионате, поэтому клетки Е coli дикого типа не используют пропионат в качестве источника угтерода [Horswill et al, 1999]

Для того чтобы выяснить, может ли в клетках штамма ITP290-3 происходить утилизация пропионил-КоА в пируват ферментами метилцитратного цикла одновременно с его превращением в пропионат под действием Pta и АскА, мы проанализировали рост

этого штамма на пропионате как единственном источнике углерода Однако нам не удалось отобрать клоны, растущие на пропионате

Полученный результат находится в хорошем соответствии с данными по анализу распределения изотопа ,3С в продуктах деградации Ь-13С-треонина в штамме ITP290-3, согласно которым |3С-атомы отсутствовали как в пирувате (Табл 3), так и в Cß и Су2 атомах изолейцина (Рис 9) Следовательно, метилцитратный цикл, преобразующий пропионил-КоА в легко утилизируемый пируват, по-видимому, не активен в условиях проведенного эксперимента

3 Модификация экспрессии AHAS - ключевых ферментов биосинтеза разветвленных аминокислот

В первой части нашей работы было показано, что в клетках Е coli может происходить деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират, если отсутствует эффективная утилизация 2-кетобутирата синтазами ацетогидроксикислот (AHAS) Поэтому при создании промышленно значимого продуцента изолейцина для предотвращения возможной деградации 2-кетобугарата необходимо было согласовать экспрессию ключевых ферментов биосинтеза изолейцина - биосинтетической треониндезаминазы и синтаз ацетогидроксикислот С этой целью нами был получен набор экспрессионных кассет, содержащих гены AHAS из Е coli и М methylotrophus (Табл 8)

Таблица 8. Сконструированные экспрессионные единицы, содержащие гены синтаз ацетогидроксикислот из Е coli и М methylotrophus

Сконструированные экспрессионные единицы Цель Интеграция в хромосому

Р „hb-ilvG603M Увеличение экспрессии АНАБ II в стационарной фазе роста +

?^A-Aatt-thrA442B-ilvBN Координация экспрессии АНАЭ I и треониновых генов +

Р tWm-iMHM™ Исследование ^охарактеризованной АНА8 из М теЛуЬ^орИт +

Рц-ilvIH Mme -

В Е coli охарактеризованы три изофермента синтаз ацетогидроксикислот (AHAS I -продукт генов ilvBN, AHAS II - продукт генов ilvGM, и AHAS III - продукт генов ilvIH), которые отличаются по ферментативным свойствам - субстратной специфичности и ингибированию валином Известно, что в клетках Е coli дикого типа функционируют только два изофермента - AHAS I и AHAS III, которые подвержены ингибированию валином Для экспрессии устойчивой к валину AHAS И, которая обладает наибольшим

сродством к 2-кетобутирату, необходимо наличие мутации в гене ilvG, восстанавливающей трансляционную рамку этого гена [Lawther et al, 1982]

Для удобства клонирования генов AHAS на основе штамма Е coli К-12 ВКПМ-7 (или В7) нами были получены штаммы B7AilvIH - с делецией ilvIH оперона, B7AilvBNAilvIH - с делецией ilvBN и ilvIH оперонов, и B7AilvBNAilvGMAilvlH - с делениями всех генов, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот

3.1. Клонирование генов AHAS II под контролем регуляторной области ilvBN оперона В нашей лаборатории ранее был получен штамм-продуцент изолейцина 44-3-15, который содержит в хромосоме несколько копий кассеты mmi-Mu Pk-iIvG'""*7' MEDA7434, обеспечивающей эффективную экспрессию ферментов, необходимых для биосинтеза изолейцина и валина Определение удельной ацетолактатсинтазной (АЛС) активности в штамме 44-3-15AiIvBNAilvIH с делениями генов, кодирующих AHAS I и AHAS III, на разных этапах культивирования показало, что суммарная и особенно валин-устойчивая AJIC активность значительно снижалась на поздней логарифмической стадии роста Мы предположили, что это связано главным образом с низкой стабильностью AIIAS II

Для проверки данного предположения мы определили время полужизни AHAS II для штамма 44-3-15, которое оказалось очень низким и составило 50 минут, тогда как время жизни треониндезаминазы составило 105 минут Такое различие в стабильности этих ключевых ферментов биосинтеза изолейцина может привести к активации альтернативных путей утилизации 2-кетобутирата в ранней стационарной фазе роста клеток и накоплению продуктов его деградации

С целью уветнчения экспрессии AUAS II в стационарной фазе роста клеток оперон dvG603M был клонирован в составе мнтегративного вектора pMIV-5JS под контропем регуляторной области ilvBN оперона, поскольку по данным DNA-array анализа выполненного для штамма-продуцента изотеицина, уровень транскрипции этого оперона увеличивается в стационарной фазе роста (к б н Птицын J1 Р , ЗАО "АГРИ") Полученная в резучьтате плазмида pMIV-PlvbL-ilvGM была использована для введения кассеты mmi-Mu attRx-car-attLrP,vbi-^vG603A/ в хромосому штамма 44-3-15, что привело к увеличению уровня удетьной валин-устойчивой активности ацетолактатсинтазы в стационарной фазе роста на 60% Однако возможности дальнейшего увеличения активности AIIAS II в кзегках ограничены, так как было показано, что фермент в высоких концентрациях способен агрегировать В связи с эгим, для увеличения активности AUAS нам представлялось целесообразным амп шфицировать AHAS I и AHAS III

3 2. Клонирование генов AHAS I в составе оперона PlkTx-Aatt-ilirA442B

Для того чтобы можно было усилить в клетке одновременно и синтез треонина, и утилизацию 2-кетобутирата, гены AHAS I были клонированы в составе интеграгивной плазмиды рМТ17, несущей гены синтеза треонина thrA442BC под контролем промотора треонинового оперона с удаленным аттенуатором, фланкированные attL- и attR-сайтами фага Ми В ходе конструирования фрагмент гена thrC плазмиды был заменен фрагментом

ДНК, содержащим структурные гены ilvBN оперона Полученная в результате экспрессионная кассета mini-Mu Puu-a-Лatt-thrA442B-ilvBN была интегрирована в хромосому штамма B7AilvBNAilvIH

Оказалось, что уровень удельной ацетолактатсинтазной активности в клетках штамма B7AilvBNAilvIH Aatt-thrA442B-ilvBN, содержащего в хромосоме кассету mini-Mu PthrA-Aatt-thrA442B-ilvBN, был в четыре раза выше, чем в клетках штамма B7AilvIH, содержащего в хромосоме ilvBN оперон под собственной регуляцией (Табл 9) Таким образом, нами была получена кассета, которая обеспечивала эффективную экспрессию ilvBN генов с промотора треонинового оперона совместно с генами thrA442B

Таблица 9 Результаты измерения удельной АЛС активности в штаммах Е coll

Штамм AHAS в хромосоме Уд акт. АЛС, нмоль/мг мин

B7AiIvBNAiIvIH нет <0 1

B7AiIvIH Р M-ilvBN 40

B7AilvBNAilvIH Aatt-thrA442B-ilvBN mim-Mu PthrA-Дatt-thrA442B-ilvBN 16 1

3.3 Клонирование генов AHAS из М methylotrophus

Известно, что клетки М methylotrophus устойчивы к валину Кроме того, в геноме этих бактерий обнаружена только одна открытая рамка считывания, гомологичная большой субъединице AHAS III Е coli Поэтому с целью поиска гомологов устойчивых к валину AHAS из других организмов оперон ilvIH, кодирующий синтазу ацетогидроксикислот М methylotrophus, был клонирован в составе интегративных векторов pMIV-5JS (под собственной регуляцией) и рМ17 (под контролем Pr промотора фага А.) Полученные в результате плазмиды pMIV5JS-ilvIHMme и pM17-PR-ilvIHMme обеспечивали рост штамма B7AilvBNAilvGMAilvIH на минимальной среде в присутствии 1 г/л валина Таким образом, мы показали, что экспрессия генов AHAS из М methylotrophus в Е coli может осуществляться не только с PR промотора, но и с нативного промотора

Определение АЛС активности в штамме B7AilvBNAilvGMAilvIH, несущем плазмиду pMIV5JS-i!vIHMme, показало, что AHAS М methylotrophus подвержена ингибированию валином, но профиль ингибирования отличен от AHAS III Е coli (Рис 12) Можно видеть, что для AHAS М methylotrophus снижение относительной АЛС активности на 50% наблюдалось при добавлении 20 мМ валина, тогда как для AHAS III Е coli - при добавлении 0 05 мМ валина

Впоследствии было установлено, что устойчивость клеток М methylotrophus к валину связана не с валин-устойчивостью AHAS, а с отсутствием у этих бактерий систем транспорта разветвленных аминокислот в клетку (к б н Йомантас Ю В , ЗАО "АГРИ")

Некоторые из полученных на данном этапе работы конструкций использовались при создании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот

А. Ингибнрование AHAS Мше валимом

í 1

я 08 я

5 0.6

¡ 0.4 <■>

2 0.2 н

О о

10 Val, мМ

В. Иигибирование AHAS III Е. coli валином*

i 1 ; os

i °'5 I 0.4

3 02 I о о

Val, мМ

Рис. 12. Иигибирование AHAS М. melhylotrophus (А) и AHAS III Е. coli (В) валином.

Удельная AJIC активность в клетках в отсутствие валина принята за I; * по данным [Mendel et al, 2001] для фермента дикого типа при добавлении 100 мМ пирувата.

4. Изучение образования норвалина и норлейцина в пути биосинтеза лейцина у штамма Е. coli, дефектного по AHAS

4.1. Сверхсинтез норвалина и норлейцина штаммом B7AiIvBNAiIvGMAüvIH

Еще одним примером "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата, с которым мы столкнулись в рамках этой работы, оказался синтез неканонических аминокислот норвалина и норлейцина штаммом B7AilvBNAilvGMAilvIH - производном штамма Е. coli К-12 В7, в котором делетированы все гены, кодирующие изофермснты A1IAS. Данный штамм является ауксотрофом по изолейцину и валину, но не требует добавления лейцина для роста на минимальной среде, поскольку лейцин синтезируется из продукта дезаминирования валина - 2-кстоизовалсрата (Рис. 13).

Мы обнаружили, что штамм B7AiIvBNAilvGMAilvlH при культивировании в среде с изолейцином (100 мг/л) и валином (100 мг/л) в отсугствие лейцина накапливал в культуральной жидкости вещества, которые методом ВЭЖХ-МС были идентифицированы как норвалин и норлейцин [Новикова и др, 2006]. Содержание норлейцина и норвалина в культуральной жидкости было определено методом ОФ-ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием (Табл. 10). Суммарный выход норвалина и норлейцина из глюкозы для штамма B7AilvBNAilvGMAilvIH составил около 5%.

Таблица 10. Накопление норвалина и норлейцина клетками штаммов Е. coli В7 и

B7AilvBNAilvGMAilvIH*

Штамм Добавки** Норвалин, г/л Норлейцин, г/л

В7 - <0.1 <0.1

B7AilvBNAilvGMAilvIH Не, Val 0.9 1.9

* Клетки растили в среде состава: глюкоза (60 г/л), (N111)2804 (18 г/л), К2НР04-ЗН20 (2 г/л), 1^804'7Н20 (1 г/л), СаС03 (25 г/л), тиамин (0.02 г/л);

** Изолейцин добавляли до конечной концентрации 100 мг/л, валин - 100 мг/л.

Механизм образования норвалина и норлейцина впервые был предложен для Serratia marcescens [Kisumi et al, 1976] Полагают, что норвалин и норлейцин синтезируются из 2-кетобутирата и 2-кетовалерата, соответственно, в так называемом "пути удлинения кетокислот" (Рис 13) Ферменты данного пути - изопропилмалатсинтаза (IPMS, продукт гена leuA), изопропилмалатизомераза (IPMI, продукт генов leuCD) и изопропилмалатдегидрогеназа (IPMD, продукт гена leuB) в норме осуществляют удлинение углеродной цепи 2-кетоизовалерата на одну метиленовую группу с образованием 2-кетоизокапроата - предшественника лейцина Известно, что IPMS S marcescens способна использовать в качестве субстрата не только 2-кетоизовалерат, но и с другие кетокислоты, в частности, 2-кетобутират и 2-кетовалерат Продукты реакции метаболизируются IPMI и IPMD, которые также обладают широкой субстратной специфичностью В результате из 2-кетобутирата в первом цикле "пути удлинения кетокислот" образуется 2-кетовалерат, который превращается в 2-кегокапроат во втором цикле этого пути Аминирование 2-кетовалерата и 2-кетокапроата аминотрансферазами IlvE, AvtA или ТугВ приводит к образованию норвалина и норлейцина, соответственно

сн,

сн-он ¿н-соо NH,+ Треонин

сн,

С=0 AUAS IlvC llvD

¿00 ^ * *

LUU Руг СО,

Пируват

Ас КоА~

ilPMS

КоА сн, оос^~он ¿н2 ¿00 Цитрамалат | IPMI | IPMD

2-Кетоизовалерат

СН,

! »MS СН—СНз

k оос—¿-он ¿н2

IPMI IPMD

СН, H¿—сн, ¿н2

INE

соо

Изопропилчялат

С=0 ТугЕ ¿00

2-Кетоизокапроат

Г

НС—сн,

¿н2 н¿-coo

iW

Лейцин

сн, сн2 ¿=0

IPMS IPMI

соо

2-Кетобутират пируват^

Ас КоА КоА

СН,

¿н2 СП2 ¿=0 ¿00

IPMS IPMI IPMD

Ас КоА КоА

¿н2 сн2

СН2 ¿=0 ¿00

сн,

г

сн2

Тряясаминязы

2-Кетовалерат

со2

AHAS

IlvC IlvD Ih-b

сн,

¿Н2

HC-CH, I^-COO

tW

Изолейцин

Трансачнказьгч,

СН, ¿Н2 СН2 H¿-COO

N4,* Норвалин

2-Кетокапроат

СОО Норлейцин

Рис 13. Предполагаемая схема биосинтеза норлейцина и норвалина в S. marcescens и Е. coli

Руг - пируват

Существует ряд экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что у Е coli, так же, как и у S marcescens, синтез норвалина и норлейцина осуществляется в пути

биосинтеза лейцина [Bogosian et al, 1989] Полученные нами данные по накоплению норвалина и норлейцина клетками штамма Е coli с блокированной функцией AHAS также подтверждают предполагаемый механизм По-видимому, в условиях роста клеток в среде с низкой концентрацией валина (100 мг/л) в отсутствие лейцина уровень 2-кетоизовалерата, а значит и лейцина, в клетке снижен, что вызывает дерепрессию leuABCD оперона, а отсутствие AHAS приводит к значительному увеличению уровня 2-кетобутирата в клетке В этих условиях IPMS вместо 2-кетоизовалерата может использовать 2-кетобутират, который находится в избытке, чю приводит к образованию норвалина и норлейцина

Известно, что норвалин и норлейцин относятся к антиметаболитам и ингибируют рост клеток Е coli дикого типа Однако можно видеть, что штамм B7AilvBNAilvGMAilvIII накапливает данные аминокислоты в количествах, превышающих их минимальные ингибирующие концентрации (Табл 11) Мы предположили, что данное яв пение связано с тем, что в процессе ферментации в условиях сверхсинтеза норвалина и норлейцина накапливаются мутации, приводящие к устойчивости клеток к данным аминокислотам

Таблица 11 Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) норвалина и

норлейцина для штаммов Е coli

Штамм МИК норвалина, г/л МИК норлейцина, г/л

В7 0 06 03

B7AilvBNAilvGMAilvIH 0 06 03

B7AilvBNAilvGMAi!v)H* 0 06 03

"Штамм B7AilvBNAilvGMAilvIH, отобранный после ферментации в среде с

изолейпином (100 мг/л) и валином (100 мг/л)

Определение минимальных ингибирующих концентраций норвалина и норлейцина для штамма В7А11\'ВКД]1\'ОМЛ1К11Н, отобранного после ферментации в среде с изо лейцином (100 мг/л) и валином (100 мг/л) показало, чго он не имеет фенотипа устойчивости к норвалину и норлейцину (Табт 11) Следовательно, наше предположение оказалось неверным Столь высокий уровень продукции данных аминокислот штаммом В7Д11уВ^11уОМД11у1Н возможно связан ь тем, что в процессе ферментации активируются системы их транспорта из клетки

4 2. Подтверждение предполагаемого механизма биосинтеза норвалина и норлейцина

Для подтверждения предполагаемою механизма биосинтеза неканонических аминокислот мы изучили влияние различных факторов на накопление норвалина и норлейцина штаммом В 7 А11V В N А11V О М А11VIII (Табл 12) Из представленных данных видно, что добавление лейцина в среду культивирования предотвращало образование неканонических аминокислот вследствие ишибирования активности 1РМ8 и репрессии 1еиАВСО оперона Аналогичный эффект наблюдался при добавлении валина в

концентрации 500 мг/л, что обусловлено увеличением уровня 2-кетоизовалерата в клетке Введение в шгамм В7Д|1уГШЛ1КОМД11уШ плазмиды рМ1У-Р,мн-1МН, несущей гены АНА8 III, восстанавливало утилизацию 2-кетобутирата и также предотвращало образование норвалина и норлейцина Можно видеть, что амплификация лейцинового оперона дикого типа путем введения в штамм В7Д11 уВ NД11VОМД11VIН плазмиды рВК-1еиАВСО (любезно предоставлена Сливинской ЕА, ЗАО "АГРИ") приводила к двукратному увеличению уровня накопления норлейцина Суммарный выход норвалина и норлейцина из глюкозы в данном случае составил около 8%

Таблица 12 Продукция норвалина и норлейцина штаммом В 7 Д11V В N Д11 у О М Д11V1Н

и его производными

Штамм Добавки* Норвалин, Норлейцин,

г/л г/л

B7AilvBNAilvGMAiivIH lie, Val 09 1 9

B7AilvBNAilvGMAilvIH lie, Val, Leu <0 1 <0 1

B7AilvBNAilvGMAi!vIH He, Val** <0 1 <0 1

B7AilvBNAilvGMAilvIH/pMIV-P,ivin-ilvIH - <0 1 <0 1

B7AilvBNAilvGMAilvIH/pBR-leuABCD lie, Val 08 3 9

B7AilvBNAiIvGMAiIvIHAilvA He, Val 05 1 6

* Клетки растите в среде, содержащей 6% глюкозы, изолейцин добавляти до конечной концентрации 100 мг/л, валин - 100 мг/л, лейцин - 100 М1 /л, ** Валин добавляли до конечной концентрации 500 мг/л

Интересно отметить, чго делеция гена tlvA, блокирующая образование 2-кетобутирата из треонина, не оказывала существенного влияния на накопление норвалина и норлейцина Это указывает на то, что, в отсутствие треониндезаминазы, 2-кетобугират синтезируется не из треонина, а из пирувата ферментами биосинтеза лейцина (Рис 13) Такой альтернативный путь образования 2-кетобутирата используется в некоторых организмах для треонин-независимого биосинтеза изолейцина [Howell et al 1999, Xu el al 2004]

Таким образом, полученные результаты согласуются с предложенной Кисуми схемой биосинтеза неканонических аминокислот

4 3 Образование норвалина и норлейцина покоящимися клетками Е toll с разным уровнем экспрессии генов биосинтеза лейцина

Для дополнительного доказательства того, что норвалин и норлейцин синтезируются из 2-кетобутирата ферментами биосинтеза лейцина, мы изучили образование этих аминокислот из 2-кетобутирата покоящимися клетками штаммов с различным уровнем экспрессии leuABCD оперона штамма В7 - с опероном leuABCD дикого типа, штаммов с усиленной экспрессией leuABCD оперона - В7 cat-P! -leuABCD, содержащем лейциновый

оперон под контролем PL промотора фага X, и В7 cat^ -leuAG479CBCD, в котором ген 1еиАатс, кодирующий IPMS, устойчивую к ретроишибированию, а также остальные гены биосинтеза лейцина находились под контролем Pl промотора фага X, и штамма В7А1еиА, в котором ген leitA был делегирован (Табл 13) Об уровне экспрессии leuÄBCD оперона судили по уровню активности IPMS

Таблица 13. Образование норвалина (Nva) и норлейцина (Nie) покоящимися

клетками Е coli с различным уровнем экспрессии генов биосинтеза лейцина

Штамм IPMS уд акт, нмоль/ (мин мг) Субстрат* Nva, мг/л Nie, мг/л

В7 41 2-КБ <1 0 50 <1 0 <1 0

В7 cat-PL-leuABCD 680 2-КБ 1 5 21 2 3 1 24

В7 cat-PL-leuA°479CBCD 534 2-КБ 93 64 5 64 45

В7Д1еиА <1 0 2-КБ <10 <1 0 <1 0 <1 0

* 2-Кетобутират (2-КБ) добавляли к суспензии покоящихся клеток до конечной

концентрации 10 мМ и инкубировали клетки в течение 24 часов

Результаты проведенного опыта показали, что покоящиеся клетки штамма дикого типа накапливали норвалин только в присутствии экзогенного 2-кетобутирата, а деления гена 1еиА блокировала образование норвалина Наибольший уровень синтеза норвалина и норлейцина наблюдался для клеток штаммов с высоким уровнем активности ¡РМБ, в особенности для штамма В7 са1-Р1-1еиАС17!)СВСО с ¡РМБ устойчивой к ретроингибированию Необходимо отметить, что покоящиеся клетки штаммов В7 саг-Рь-ЬиАВСБ и В7 са1-Р1,-1еиА0479сВСО накапливали норвалин и норлейцин даже в отсутствие 2-кетобутирата, что можно объяснить их образованием из внутриклеточного пирувата

Кроме того, как видно из Таблицы 13, покоящиеся клетки штаммов, имеющих функционально активные АНАБы, при добавлении 2-кетобутирата предпочтительнее накапливают норвалин, тогда как в клетках штамма В7Д11уВМД11уОМА1МН с блокированной функцией АНАЯ преимущественно образуется норлейцин (Табл 10) Возможно, это связано с тем, что в клетках, имеющих функционально активные АНАБы, уровень 2-кетоизовалериата выше, чем в клетках штамма, дефектного по АНАБ, при добавлении валина в концентрации 100 мг/л Поэтому 2-кетовалерат преимущественно вступает в реакцию аминирования с образованием норвалина, а не взаимодействует с 1РМБ, что приводит к образованию норлейцина

Таким образом, полученные данные указывают на то, что норвалин и норлейцин у Е coli действительно образуются из 2-кетобутирата в пути биосинтеза лейцина Синтез этих неканонических аминокислот штаммом Е coli с блокированой функциией синтаз ацетогидроксикислот обусловлен увеличением уровня 2-кетобутирата в клетке, что в условиях дерепрессии лейцинового оперона приводит к утилизации 2-кетобутирата ферментами биосинтеза лейцина

4.4. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков семейства изопропилмалатсиназ

К настоящему времени в базе данных Pfam [http //pfam sanger ас uk] имеются сведения об аминокислотных последовательностях 742 ферментов, относящихся к семейству изопропилмалатсинтаз Единственным ферментом этого семейства, для которого был выполнен рентгеноструктурный анализ (РСА) является 1PMS М tuberculosis [Koon et al, 2004] На основании данных РСА для данного фермента была установлена трехмерная структура и определены аминокислотные остатки, которые участвуют в формировании активного центра и сайта связывания лейцина Биохимические свойства IPMS Е coli к настоящему времени не изучены, однако известно, что фермент имеет высокую степень гомологии с IMPS Salmonella thyphimurium (E-value < 3e-I80, идентичность - 92%, программа protem-protem BLAST), которая может использовать в качестве альтернативных субстратов 2-кетобутират и пируват in vitro [Kahlhaw et al, 1969] Сравнение аминокислотных последовательностей IPMS М tuberculosis, Е coli и S thyphimurium показало, что, несмотря на низкую степень гомологии ферментов (E-value < 9е-19, идентичность - 28%, программа PSI-BLAST), аминокислотные остатки, которые, по данным РСА, взаимодействуют с 2-кетоизовалериатом в центре связывания субстрата -Arg-80, Asp-81, Glu-218, Thr-254, His-285, His-287, His-379 и Tyr-410 [Koon et al, 2004], у данных микроорганизмов идентичны (Рис 14) Следует отметить, что, по данным РСА, консервативные аминокислотные остатки, участвующие в образовании активного центра, не взаимодействуют с у2-СН3-группой молекулы 2-кетоизовалерата Эта особенность, очевидно, объясняет широкую субстратную специфичность фермента

Интересно отметить, что консервативные аминокислотные остатки регуляторного домена IPMS М tuberculosis - Tyr-554, А1а-558 и А1а-565 (Рис 14), взаимодействуют с -СН3-группами молекулы лейцина [Koon et al, 2004] Такое строение регуляторного центра IPMS обусловливает специфичность фермента в отношении ингибирования лейцином и неспособность близких по структуре разветвленных аминокислот, а также неканонических аминокислот норвалина и норлейцина, ингибировать его активность

Таким образом, учитывая консервативное строение центра связывания кетокислоты у изопропилмалатсинтаз, можно предположить, что IPMS Е coli, подобно IPMS S thyphimurium, имеет широкую субстратную специфичность и может использовать 2-кетобутират и пируват в качестве акцепторов ацетильной группы

E. coli _____________________________________________________________

S. typhimuriит ------------------------------------------------------------

M. tuberculosis mttsespdaytesfgahtivkpagpprvgqpswnpqrassmpvnryrpfaeevepirlrn (60)

coü -------msqqviifdttlj^geqalqaslsvkeklqialalermgvdvmevgfpvsspg (53)

s. typhimurium -------msqqviifdttAgeqalqaslsakeklqialalermgvdvmevgfpvsspg (53)

M. tuberculosis rtwpdrvidraplwcavdl^gnqalidpmsparkrrmfdllvrmgykeievgfpsasqt (120)

coli dfesvqtiarq—vknsrvcalarcvekdidvaaeslkvaeafrihtfiatspmhiatk (110)

5. typhimurium dfesvqtiart---iknsrvcalarcvekdidvaaqalkvadafrihtfiatspmhiatk (110)

M. tuberculosis DFDFVREIIEQGAIPDDVTIQVLTQCRPELIERTFQACSGAPRAIVHFYHSTSIIjQRRW (180)

E. COli LRSTLDEVIERAIY----MVKRARNYTD---DVEFSCJ5DAGRTPIADLARWEAAINAGA (163)

S. typhimurium LRSTLDEVIERAVY----MVKRARNYTD---DVEFSClSDAGRTPVDDLARVVEAAINAGA (163)

M. tuberculosis franraevqaiatdgarkcveqaak ypgtqwrfeYSp§sYTGTELEYAKQVCDAVGEVIA (24 0)

E. coli TT------INIPE^VGYTMPFEFAGIISGLYERVPNXDKAIISV!§T|ÉDDLGLAVGNSLAA (217)

S. typhimurium RT------INIPD||vGYTMPFEFAGI ISGLYERVPNIDKAIISV^I^DDLGIAVGNSLAA (217)

M. tuberculosis PTPERPIIFNLPASjVEMTTPNVYADSIEWMSRNLANKESVILSL|f PÍ¡|nDRGTAVAAAELG Í300)

E. COli VHAGARQVEGAMNGIGERAGNCSLEEVIMAIKVRKDIIiNVHTAINHQEIWRTSQLVSQIC (277)

S. typhimurium vhagarqvegahmgigeragncaleevi^IKVRKDIMNVHTNINHHEIWRTSQTVSQIC (277)

M. tuberculosis FAAGADRIEGCLFGNGERTGNVCLVTLGLNLFSR----GVDPQIDFSNIDEIRRTVEYCN (356)

E. coli NMPIPANKAIVGSGAFAHSSGI§QDGVLK--------------------NREN|EIMTPE (317)

S. typhimurium NMPIPANKAIVGSGAFAHSSGi|qdGVLK--------------------NREKl|EIMTPE (317)

M. tuberculosis QLPVHERHPYGGDLVYTAFSGsÍQDAINKGLDAMKLDADAADCDVDDMLWQVP^LPIDPR (416)

E.coli SIG-LNQIQLNLTSRSGRAAVKHRMDEMGYKESEYNLDNLYDAFLKLADKKGQVFDYDLE (376)

S.typhimurium SIG-LNQIQLNLTSRSGRAAVKHRMEEMGYKDTDYNMDHLYDAFLKLADKKGQVFDYDLE (3 76)

M.tuberculosis DVGRTYEAVIRVNSQSGKGGVAYIMKTDHGLSLPRRLQIEFSQVIQKIAEGTAGEGGEVS (4 76)

E. coli ALAFIGKQQEE------PEHFRLDYFSVQSGSNDIATAAVKLACGEEVKAEAANGNGPff (430)

5. typhimurium ALAFINKQQEE------PEHFRLDYFSVQSGSSDIATASVKLACGEEIKAEAANGNGP^) (430)

M. tuberculosis PKEMWDAFAEEYIAPVRPLERIRQHVDAADDDGGTTSITATVKINGVETEISGSGNGP§S (536)

e. coli AVYQA1NRITEYNVE^Vk|sLt|kGHGKD|lÍQVDIVANYNGRRF11GVG----LATDIVE (486)

5. typhimurium AIYQAINRITGYDVE|VK|DLN|KGQGKb|LÍQVDIVVNHHGRRFHGVG----LATDIVE (486)

M. tuberculosis AFVHALADVG- FDVJJfuDSYEH|MSAGDD|Q|AAYVEASVTIASPAOPGEAGRHASDPVT (595)

E. Coli SSAXAMVHVLNNIWRAAEVEKELQRKAQHNENNKETV------------(523)

S. typhimuriim SSAXAMVHVLNNIWRAAEVEKELQRKAQNKENNKETV------------(523)

M. tuberculosis IASPAQPGEAGRHASDPVTSKTVWGVGIAPSITTASLRAWSAVíreAAR (644)

Рис. 14. Выравнивание амииокислотных последовательностей IPMS Е. coli, S. thyphimurium и M. tuberculosis (программа CIustalYV), Нумерация остатков дана по последовательности IPMS М. tuberculosis. Аминокислотные остатки, участвующие в образовании активного центра, выделены жирным шрифтом и серым цветом. Аминокислотные остатки, входящие в регуляторный

центр, выделены серым цветом.

Для того чтобы выяснить, является ли образование неканонических аминокислот общим свойством других огранизмов, способных к синтезу лейцина, мы провели сравнительный анализ аминокислотных последовательностей 57 бактериальных белков семейства IPMS. Эти белки были выбраны по базе данных Pfam по наличию двух функциональных доменов: С-концевого регуляторного LeuA-домвна и N-концевого HGML-подобного каталитического домена, по принципу максимального удаления друг от друга на филогенетическом дереве. С целью оценки консервативности положения аминокислотных остатков в полипептидной цепи с помощью программы BioEdit был проведен расчет энтропии Шеннона для этих белков. Данный подход широко применяется при поиске каталитически важных остатков активного центра на основе анализа аминокислотных последовательностей ферментов [Sander et al, 1991].

Энтропия Шеннона для ¡-положения в аминокислотной последовательности (Hj) рассчитывается с использованием величины Р,, (вероятность встречи j-аминокислоты в этом положении):

Hi = -ZP,j-lnPjj

j

Для консервативных аминокислотных остатков значение Hj стремится к нулю. Таким образом, аминокислотные остатки в положениях, соответствующих значениям Hj, близким к нулю, являются консервативными для анализируемого семейства белков.

На Рис. 15 в графическом виде представлен расчет значений функции Шеннона для различных остатков в последовательностях 57 ферментов, принадлежащих к семейству изопропилмалатсинтаз. Нумерация аминокислотных остатков дана для IPMS Aspergillus fumigatus. Оказалось, что для 25 аминокислотных остатков энтропия Шеннона стремится к нулю, значит, они являются консервативными для анализируемых белков семейства IPMS. Среди консервативных аминокислот обнаружены остатки, которые, согласно данным РСА, взаимодействуют с кетокислотой в активном центре IPMS М. tuberculosis - Arg-80, Asp-81, Thr-254, His-285, His-287 и His-379. Кроме того, консервативными оказались аминокислотные остатки - Glu-317 и Arg-318, которые, по данным РСА, необходимы для связывания ацетил-КоА с ферментом [Koon et al, 2004]. Остальные консервативные остатки не участвуют в образовании активного центра и, по-видимому, обеспечивают стабильность третичной структуры белка.

Ешшру (Нх) Plot Afignment Р \Sycheva\S57Ecoli gb

Arg80 Asp81 Thr254 H¡s285, Ghi317, His379 (O.OOl) (<0.001) (0.08) His287 Arg318 (0.08) (0.08) (0.08)

Рис. 15. Значения величины энтропии Шеннона для различных аминокислотных остатков в последовательностях 57 белков семейства IPMS (программа BioEdit).

Выделены остатки, входящие, по данным РСА, в активный центр IPMS М. tuberculosis. Для этих остатков указан номер в последовательности IPMS М. tuberculosis и в скобках приведены значения H¡.

Таким образом, сравнение аминокислотных последовательностей 57 ферментов семейства изопропилмалатсинтаз на основе величин энтропии Шеннона свидетельствует об аналогичной организации активного центра IPMS и остальных ферментов из этого семейства В связи с этим, можно предположить, что образование норвалина и норлейцина может происходить не только у Е coli, но и в других организмах, у которых активный центр IPMS устроен подобным образом

ВЫВОДЫ

1 Изучена аэробная деградация треонина, однородно меченного изотопами 14С и 13С, в штамме Е coli ITP290-3 с контролируемой экспрессией устойчивой к ретроингибированию треониндезаминазы Обнаружено, что при сверхэкспрессии данного фермента в аэробных условиях в клетках Е coli происходит превращение 2-кетобутирата, образовавшегося из треонина, в пропионат и 2-аминобутират

2 Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата является незначительным

3 Создана коллекция экспрессионных кассет, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот Е coli и М methylotrophus Получены варианты оперонов ilvG603M и ilvBN Е coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией

4 Показано, что в клетках Е coli с блокированной функцией синтаз ацетогидроксикислот в условиях дерепрессии генов биосинтеза лейцина происходит утилизация 2-кетобутирата ферментами биосинтеза лейцина, что приводит к образованию неканонических аминокислот норвалина и норлейцина

5 Получен штамм Е coli, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы Данный штамм можно рассматривать как потенциальный продуцент норвалина и норлейцина

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях-

1 Сычева Е В , Стойнова Н В , Саврасова Е А , Козлов Ю И , Бочаров Э В , Соболь А Г , Арсеньев А С "Аэробный катаболизм треонина в штамме Escherichia coli с биосинтетической треониндезаминазой, устойчивой к ретроингибированию" // Биотехнология, №4, стр 22, (2003)

2 Сычева Е В , Стойнова Н В , Бочаров Э В , Козлов Ю И "Новый путь аэробной деградации треонина в Е coif' // 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых Тез докл , стр 380, Пущино, (2003)

3 Стойнова Н В , Сычева Е В , Преображенская Е С , Новикова А Е , Матросов Н Г "Способ получения непротеиногенных аминокислот с использованием бактерии семейств Enterobacteriaceae, в которой все синтазы ацетогидроксикислот инактивированы" Патентная заявка РФ №2004127011 от 10 09 2004, дата приоритета 10 09 2004

4 Сычева Е В , Стойнова Н В , Новикова А Е , Матросов Н Г "Биосинтез норвалина и норлейцина в штамме Е coli, дефектном по AHAS" // Международная школа-конференция "Генетика микроорганизмов и биотехнология", посвященная 100-летию со дня рождения С И Алиханяна Тез докл , стр 86, Москва-Пущино, (2006)

5 Сычева Е В , Ямпольская Т А , Преображенская Е С , Новикова А Е , Матросов Н Г , Стойнова Н В "Изучение сверхсинтеза неканонических аминокислот клетками Escherichia colt //Микробиология, №6, стр 1-8,(2007)

6 Сычева Е В , Ямпольская Т А , Новикова А Е , Матросов Н Г , Стойнова Н В "Изучение сверхсинтеза неканонических аминокислот клетками Е coif' // IV Международный конгресс "Биотехнология состояние и перспективы развития", Тез докл, стр 100, Москва, (2007)

7 Сычева Е В , Ямпольская Т А, Новикова А Е, Матросов Н Г, Стойнова Н В "Изучение сверхсинтеза неканонических аминокислот клетками Escherichia coli" 3-я Международная конференция "Фундаментальные науки - медицине", Тез докл, стр 177, Новосибирск, (2007)

Подписано в печать 18 02 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 88 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сычева, Елена Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. "Скрытый" метаболизм.

1.1.1. Примеры реакций "скрытого" метаболизма.

1.1.2. Синтез неканонических аминокислот в пути биосинтеза лейцина.

1.1.3. Механизм токсического действия норлейцина.

1.1.4. Получение аналогов белков, содержащих неканонические аминокислоты.

1.2. Пути метаболизма треонина в клетках Е. coli.

1.2.1. Биосинтетическая треониндезаминаза.

1.2.1. Аэробные пути деградации треонина.

1.2.2. Анаэробный путь деградации треонина.

1.2.3. Регуляция транскрипции tdcABCDEFG оперона.

1.2.4. ТРР-зависимый путь деградации треонина.

1.2.5. Метилцитратный цикл метаболизма пропионил-КоА.

1.3. Синтазы ацетогидроксикислот в синтезе разветвленных аминокислот у Е. coli.

1.3.1. Классификация синтаз ацетогидроксикислот и их метаболическая роль.

1.3.2. Изоферменты AHAS у Е. coli.

1.3.3. Субстратная специфичность и кинетические свойства AHAS.

1.3.4. Регуляция экспрессии AHAS.

1.3.4.1. Регуляция транскрипции ilvBN оперона.

1.3.4.2. Регуляция транскрипции ilvGMEDA оперона.

1.3.4.3. Регуляция транскрипции ilvIHоперона.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Среды, условия культивирования штаммов.

2.2. Трансформация, трансдукция бактерий, интеграция экспрессионных кассет.

2.3. Хромосомные модификации с использованием ARed-зависимой системы интеграции линейных фрагментов ДНК.

2.4. Бактериальные штаммы, использованные в данной работе.

2.5. Эксперименты с рекомбинантной ДНК.

2.6. Конструирование рекомбинантных плазмид.

2.7. Условия измерения методами ТСХ и ГЖХ.

2.8. Анализ деградации Ь-[и-14С]треонина в штамме ITP290-3.

2.9. Получение Ь-13С-треонина.

2.10. Регистрация и обработка ЯМР-спектров.

2.11. Измерение энзиматических активностей.

2.11.1. Определение активности треониндезаминазы.

2.11.2. Определение активности ацетолактатсинтазы.

2.11.3. Определение активности изопропилмалатсинтазы.

2.12. Определение времени полужизни треониндезаминазы и AHAS.

2.13. Идентификация и анализ накопления норвалина и норлейцина.

2.14. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) аминокислот.

2.15. Анализ образования норвалина и норлейцина покоящимися клетками Е. coli.

2.16. Компьютерные программы, использованные в данной работе.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение аэробной деградации треонина в модельном штамме 1ТР290-3 в условиях контролируемой экспрессии треониндезаминазы, устойчивой к ретроингибированию.

3.1.1. Конструирование модельного штамма ITP290-3.

3.1.2. Изучение конверсии треонина в изолейцин в модельном штамме 1ТР290-3 в условиях контролируемой экспрессии гена ilvAlleK.

3.1.3. Анализ продуктов деградации Ь-[и-14С]треонина в штамме ITP290-3.

3.1.4. Анализ продуктов деградации Ь-13С-треонина методом ЯМР-спектроскопии

3.2. Изучение ферментов пути аэробного метаболизма треонина в пропионат.

3.2.1. Влияние амплификации и инактивации генарохВ на синтез пропионата в штамме ITP290

3.2.2. Влияние инактивации гена асеЕ на синтез пропионата в штамме ITP290-3.

3.2.3. Изучение возможного метаболизма пропионил-КоА в метилцитратном цикле.

3.3. Модификация экспрессии AHAS - ключевых ферментов биосинтеза разветвленных аминокислот.

3.3.1. Клонирование генов AHAS II под контролем регуляторной области ilvBN оперона.

3.3.2. Клонирование генов валин-чувствительных AHAS I и AHAS III.

3.3.3. Клонирование генов AHAS I в составе оперона PmrA-Aatt-lhrA442B.

3.3.4. Клонирование генов AHAS из М. methylotrophus.

3.4. Изучение сверхсинтеза норвалина и норлейцина в пути биосинтеза лейцина у штамма

Е. coli, дефектного по AHAS.

3.4.1. Сверхсинтез норвалина и норлейцина штаммом B7AilvBNAilvGMAilvIH.

3.4.2. Подтверждение предполагаемого пути биосинтеза норвалина и норлейцина.96 3.4.3 Образование норвалина и норлейцина покоящимися клетками Е. coli с разным уровнем экспрессии генов биосинтеза лейцина.

3.4.4. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей IPMS.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот"

актуальность проблемы

Всем ферментам в той или иной степени присуще наличие альтернативных субстратов. Именно это свойство определяет гибкость метаболических путей и обеспечивает замечательную приспособляемость микроорганизмов к изменяющимся условиям роста. Зачастую в новых условиях могут возникать целые альтернативные метаболические пути, так называемые пути "скрытого" метаболизма, которые обусловливают способность клеток к утилизации новых источников питания или к катаболизму токсичных агентов экзогенного или эндогенного происхождения [1]. Изучение таких путей становится особенно актуальным при создании на основе микроорганизмов штаммов-продуцентов различных метаболитов, в частности, аминокислот. Стандартным подходом в такой работе является усиление метаболических потоков, приводящих к синтезу целевого продукта, и блокирование "ненужных" путей. Это достигается путем увеличения или уменьшения экспрессии соответствующих генов, что может приводить к внутриклеточному накоплению интермедиатов биосинтеза. В результате чего могут включаться "скрытые" метаболические пути, катаболизирующие эти интермедиаты, причем соответствующие метаболические потоки могут быть весьма значительными, что может отрицательно сказаться на выходе целевого продукта и приводить к накоплению примесей.

Мы столкнулись с явлением "скрытого" метаболизма при конструировании на основе Escherichia coli штамма-продуцента изолейцина. Известно, что изолейцин образуется из треонина (Рис. 1.1), поэтому при создании штамма-продуцента изолейцина необходимо в первую очередь усилить биосинтез треонина и блокировать его деградацию. Кроме того, для эффективной конверсии треонина в изолейцин очень важно подобрать оптимальный уровень экспрессии ключевых ферментов биосинтеза изолейцина -биосинтетической треониндезаминазы (IlvA), осуществляющей превращение треонина в 2-кетобутират, и синтаз ацетогидроксикислот (AH AS), которые катализируют конденсацию 2-кетобутирата с пируватом с образованием 2-ацето-2-гидроксибутирата -предшественника изолейцина.

При создании штамма-продуцента изолейцина мы обнаружили, что усиление синтеза треонина в ряде случаев приводило к резкому снижению уровня синтеза изолейцина и накоплению в среде значительного количества пропионата. Мы предположили, что это явление связано главным образом с деградацией треонина, поэтому основной задачей работы стало изучение ранее неизвестных путей аэробной деградации треонина. транспорт из клетки включение в белки

2-амино- Tdh

3-кетобутират f КоА НАДН НАД+ Ч

TdcB

КЫ

IlvA ацетил-КоА

L-глицин у—L-треонин —^ -ч^ f NH3 рпв

Ч NH3 TdcE 9

AHAS Г КоА С02

1*4 со,

2-кетобутират ч

КоА

2-кетобутират пируват

НСООН пропионил-КоА Рн ч анаэробные условия

Pta

2-ацето-2-гидрокси-бутират

I I I

L-изолейцин

КоА пропионилфосфат АДФ АТФ пропионат

АскА TdcD

Рис. 1.1. Метаболизм L-треонина в Е. coli

Tdh - треониндегидрогеназа, КЫ - 2-амино-З-кетобутират-КоА-лигаза, IlvA треониндезаминаза (биосинтетическая), AHAS - сингазы ацетогидроксикислот; TdcB -треониндезаминаза (катаболитная), PflB - пируватформиатлиаза, TdcE - 2-кетобутират-формиатлиаза, Pta - фосфотрансацетилаза, AckA, TdcD - пропионаткиназы

К настоящему времени в клетках Е. coli охарактеризованы два пути катаболизма треонина - превращение треонина в глицин, в котором участвуют треониндегидрогеназа (Tdh) и 2-амино-З-кетобутират-КоА-лигаза (КЫ) [2], и анаэробная деградация до пропионата [3] (Рис. 1.1). Показано, что на первом этапе анаэробного пути деградации треонин превращается в 2-кетобутират под действием биодеградативной треониндезаминазы (TdcB). Затем 2-кетобутират неокислительно декарбоксилируется с образованием пропионил-КоА фомиатлиазами кетокислот PflB и TdcE, которые чувствительны к кислороду и не активны в аэробных условиях. В дальнейшем превращении пропионил-КоА в пропионат через пропионилфосфат принимают участие фосфотрансацетилаза (Pta) и пропионаткиназы - TdcD и АскА. Другие пути деградации треонина в клетках Е. coli к настоящему времени не охарактеризованы. цели и задачи работы

Данная работа является продолжением исследований, проводимых в ЗАО "АГРИ" и направленных на конструирование высокоэффективных штаммов-продуцентов треонина и изолейцина. Основной целью настоящей работы являлось изучение путей аэробного метаболизма треонина в клетках Е. coli, связанных с образованием 2-кетобутирата.

В процессе работы решались следующие задачи:

- изучение путей аэробной деградации треонина в клетках Е. coli\ идентификация ферментов, участвующих в аэробной деградации треонина в клетках Е. coli\ создание коллекции генетических конструкций, несущих гены, кодирующие изоферменты синтаз ацетогидроксикислот (AHAS) из Е. coli и Methylophilis methylotrophus для дальнейшего применения при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот; исследование роли ферментов биосинтеза лейцина в образовании неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из 2-кетобутирата;

- изучение возможности сверхсинтеза норвалина и норлейцина в Е. coli. научная новизна и практическая значимость работы

В настоящей работе изучена аэробная деградация L-треонина, однородно меченного изотопами 14С и 13С, в модельном штамме Е. coli ITP290-3. Этот штамм накапливает треонин в отсутствие экспрессии гена ilvAIleR, кодирующего биосинтетическую треониндезаминазу, устойчивую к ретроингибированию, и изолейцин в условиях экспрессии гена ilvAIleR. Показано, что в клетках Е. coli в аэробных условиях происходит деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират в случае, когда треонин эффективно дезаминируется треониндезаминазой, устойчивой к ретроингибированию, с образованием 2-кетобутирата. Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата является незначительным.

Создана коллекция экспрессионных кассет, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот Е. coli и М. methylotrophus. Получены варианты оперона ilvG603M и ilvBN Е. coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией. Полученные конструкции в дальнейшем могут применяться при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот.

Получен штамм Е. coli с делениями всех генов, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы с выходом 8%. На примере данного штамма подтвержден предполагаемый механизм образования норвалина и норлейцина в клетках Е. coli из 2-кетобутирата или пирувата ферментами пути биосинтеза лейцина.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сычева, Елена Викторовна

выводы

1. Изучена аэробная деградация треонина, однородно меченного изотопами 14С и 13С, в штамме Е. coli ITP290-3 с контролируемой экспрессией устойчивой к ретроингибированию треониндезаминазы. Обнаружено, что при сверхэкспрессии данного фермента в аэробных условиях в клетках Е. coli происходит превращение 2-кетобутирата, образовавшегося из треонина, в пропионат и 2-аминобутират.

2. Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата не является значительным.

3. Создана коллекция генетических конструкций, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот Е. coli и М. methylotrophus. Получены варианты оперонов ilvG603M и ilvBN Е. coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией.

4. Показано, что в клетках Е. coli с блокированной функцией синтаз ацетогидроксикислот в условиях дерепрессии генов биосинтеза лейцина происходит утилизация 2-кетобутирата ферментами биосинтеза лейцина, что приводит к образованию' неканонических аминокислот норвалина и норлейцина.

5. Получен штамм Е. coli, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы. Данный штамм можно рассматривать как потенциальный продуцент норвалина и норлейцина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сычева, Елена Викторовна, Москва

1. D' Ari R., Casadeus J.: Underground metabolism. BioEssays, 1998, 20: 181-186.

2. Aronson B.D., Levinthal M., Sommerville R.L.: Activation of a cryptic pathway for threonine metabolism via specific IS3-mediated alteration of promoter structure in Escherichia coli. J. Bacterid., 1989,171: 5503-5511.

3. Hesslinger C., Fairhurst S.A., Sawers G.: Novel keto acid formate-lyase and propionate kinase enzymes are components of an anaerobic pathway in Escherichia coli that degrades L-threonine to propionate. Mol. Microbiol., 1998, 27: 477-492.

4. Murray M. L., Hartman P.E.: Overproduction of hisH and hisF gene products leads to inhibition of cell division in Salmonella. Can. J. Microbiol., 1972,18: 671-681.

5. Casadesus J., Roth J.R.: Absence of insertions among spontaneous mutants of Salmonella typhimurium. Mol. Gen. Genet., 1989, 216: 210-216.

6. Berg C.M., Wang M.-D., Vartak N.B., et al.: Acquisition of new metabolic capabilities: multicopy suppression by cloned transaminase genes in Escherichia coli K-12. Gene, 1988,65: 195-202.

7. Itikawa H., Vogel H.J.: Enzymic basis for a genetic suppression: accumulation and deacylation of N-acetylglutamic gamma-semialdehyde in enterobacterial muants. Biochim. Biophys. Acta, 1968,159: 547-550.

8. Richaud C., Mengin-Lecreulx D., Pochet S., et al.: Directed evolution of biosynthetic pathways. Recruitment of cysteine thioethers for constructing the cell wall of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1993, 269: 26827-26835.

9. Brutlag D., Kornberg A.: Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. XXXIV. A proofreading function for the 3-5' exonuclease activity in deoxyribonucleic acid polymerases. J. Biol. Chem., 1972, 247: 221-248.

10. Ninio J.: Kinetic devices in protein synthesis, DNA replication, and mismatch repair. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1987, 52: 639-646.

11. Jakubowski H.,Goldman E.: Editing of errors in selection of amino acids for protein synthesis. Microbiol. Rev., 1992, 56: 412-429.

12. Hopfield J,J.: Kinetic proofreading: a new mechanism for reducing errors in biosynthetic processes requiring high specificity. ProcNatl Acad Sci USA, 1974, 71: 4135-4139.

13. Ninio J.: Kinetic amplification of enzyme discriminatioa Biochimie, 1975, 57: 587-595.

14. Bauerle R.H., Freundlich M., Stoermer C.F., et al.: Control of isoleucine, valine and leucine biosynthesis. II. Inhibition by valine of acetohydroxyacid synthase in Salmonella typhimurium Biochim. Biophys. Acta, 1964,92: 142-149.1516,17,18,19,20.