Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метаболическая инженерия штаммов Escherichia coli - биосенсоров, продуцентов цитокинов, факторов роста и низкомолекулярных веществ
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Метаболическая инженерия штаммов Escherichia coli - биосенсоров, продуцентов цитокинов, факторов роста и низкомолекулярных веществ"
На правах рукописи
итицын
Леонид Романович
Метаболическая инженерия штаммов Escherichia coli — биосенсоров, продуцентов цитокинов, факторов роста и низкомолекулярных веществ.
03.01.03 - молекулярная биология
ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2013
005537230
Работа выполнена во ВНИИ биотехнологии (АО «Биотехнология»), ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, ЗАО «НИИ Аджиномото-Генетика»
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, Вейко Владимир Петрович
профессор, главный научный сотрудник
лаборатории молекулярной инженерии,
ФГБУН «Институт биохимии им. А.Н. Баха» РАН
доктор химических наук, Вартапетян Андрей Борисович
профессор, заведующий отделом химии и биохимии нуклеопротеидов,
НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В Ломоносова
доктор биологических наук, Абилев Серикбай Каримович
профессор, заместитель директора по научной работе, ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН)
Защита диссертации состоится « » декабря 2013 года
в_14_часов на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП
«Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545 Россия, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.
С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИГенетика»
Автореферат разослан ¿¿¿¿'^ ^г ^ 2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета, ^
кандидат химических наук, доцент Воюшина Татьяна Львовна
ОГЛАВЛЕНИЕ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ....................................................... 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................ 7
ВВЕДЕНИЕ............................................................................................. 10
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.............................. 11
Глава 1. Конструирование рекомбннантных клеток Е. coli - бпосенсеров для анализа генотоксичпости химических соединений и физических факторов........... 11
1.1. Клонирование фрагмента ДНК, кодирующего оперон биолюминесценции
P. leiognathi....................................................................................................... 12
1.2. Биолюминесцентный анализ SOS-отвста клеток Е. coli..................................... 15
1.3. Индукция SOS-ответа под действием веществ - мутагенов (SOS lux тест)............. 17
1.4. Индукция SOS-ответа под действием UV или у-излучений................................ 20
1.5. Анализ генотоксического действия комплексных соединений платины и сравнительная оценка их генотоксичности в эукариотической тест-системе............... 20
1.6. Возможности проведения SOS lux теста в полуавтоматическом варианте в
микропланшетах или использования иммобилизованных клеток в тест системе........... 25
Заключение................................................................................................. 26
Глава 2. Экспрессия синтетических генов в клетках Е. coli.................................27
2.1. Цитоплазматическая экспрессия синтетических генов в клетках Е. coli.................28
2.1.1. Модификации пгтаммов-продуцентов интерлейкина-3 и интерлейкина-4 человека. 28
2.1.2. Делецжншая форма интерлейкина-4 человека -IL4-82................................... 32
2.1.3. Интерлейкии-10 человека-hIL-10........................................................... 38
2.1.4. Нейротрофин глиального происхождения человека - GDNF............................ 41
2.1.5. Фактор роста кератиноцитов человека - hKGF............................................. 45
2 1.6. Рецепторный антагонист интерлейкина-1 человека -hlL-lra............................ 47
2.1.7. у-интерферон быка-bIFN-y................................................................................. 48
2.2. Экстраклеточная продукция эпидермалыюго фактора роста человека - hEGF........ 50
Заключение................................................................................................ 53
Глава 3. Оптимизация ряда биоеинтетических путей в клетках Е. coli с целью
повышения продукции аминокислот............................................................. 54
3.1 Модификация путей транспорта источников углерода с целью увеличения продукции аминокислот Е. coli штаммами-продуцентами....................................... 55
3.2. Модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина.................................................................................................... 63
3.3. Идентификация генов, кодирующих ферменты пути I деградации путресцина
(pathway: putrescine degradation I)..................................................................... 73
Заключение................................................................................................ 86
Глава 4. Поиск новых ннзкомолекулярпых биологически активных веществ растительного происхождения и возможность их микробиологического синтеза... 87
4.1. Методы и тест-системы, использованные для скрининга этанольных экстрактов сухих растительных препаратов....................................................................... 88
4.2. Результаты скрининга этанольных экстрактов растительных препаратов.............. 90
4.3. Идентификация новых соединений из экстрактов, активных в in vitro тестах......... 93
4.4. Заключение. Потенциальная возможность микробиологического синтеза идентифицированных соединений................................................................... 99
ВЫВОДЫ........................................................................ ........................ 100
Список публикаций по теме диссертации...................................................... 102
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы.
Современная биотехнология, разрабатывающая и использующая генно-инженерные и клеточные методы создания генетически модифицированных биологических объектов для получения новых видов биологических и химических продуктов различного назначения и повышения эффективности их производства, возникла в 70-х гг. прошлого века. Развитие данных технологий на первых этапах было основано на манипуляциях in vitro с фрагментами ДНК из различных источников и/или синтетическими фрагментами ДНК, с последующим введением их в составе плазмид в живую клетку, где «искусственная» ДНК была способна реплицироваться, а кодируемая ею информация - экспрессироваться. В дальнейшем для повышения уровня продукции целевых соединений были разработаны методы целенаправленного и прецизионного внесения модификаций в бактериальный геном путем замены структурных и/нли регуляторных областей биосинтетических генов, их внутрихромосомной амплификации и модуляции уровня экспрессии; делеции генов, контролирующих синтез нежелательных метаболических интермедиатов и побочных продуктов целевого биосинтеза; оптимизации клеточных систем потребления источников питания и систем секреции целевых продуктов и т.д.
Наглядными примерами успехов современной биотехнологии являются крупнотоннажное производство природных протеиногенных L-аминокислот, основанное на микробных продуцентах, создание новых эффективных лекарственных средств на основе низкомолекулярных биологически активных веществ и БАВ белковой природы -рекомбинантных гормонов и цитокинов.
Клетки Escherichia coli до сих пор являются одним из наиболее генетически и биохимически изученных микроорганизмов, что обусловливает их широкое применение как в биотехнологических исследованиях, так и в промышленности.
Настоящая диссертационная работа, представляемая в виде научного доклада, обобщает результаты исследований, посвященных: разработке биологических тест-систем (биосенсоров) на основе SOS-ответа клеток Е. coli для оценки генотоксичности химических соединений и физических факторов; конструированию штаммов-продуцентов ряда цитокинов и факторов роста человека и других белков на основе бактерии Е. coli; оптимизации ряда биосинтетических путей в клетках Е. coli с целью повышения продукции аминокислот; поиску новых биологически активных низкомолекулярных веществ растительного происхождения, синтез которых может быть в будущем реализован микробиологическим путем.
Цели и задачи исследования.
Основная цель работы состояла в создании рекомбинантных штаммов Е. coli, выполняющих функции биосенсоров для оценки генотоксичности, штаммов-продуцентов ряда белков (цитокинов и факторов роста) и низкомолекулярных соединений (аминокислот), и в поиске новых биологически активных низкомолекулярных веществ растительного происхождения, потенциальных объектов для микробиологического синтеза.
В соответствии с этим решались следующие задачи:
1. Конструирование рекомбинантных штаммов Е. coli, несущих оперон биолюминесценции Photobacterium ieiognathi под контролем индуцируемого SOS-системой Е. coli промотора гена cda плазмиды СоЮ
2. Разработка условий проведения теста на генотоксичность химических веществ и физических факторов с использованием рекомбинантных штаммов Е. coli (SOS /ыхтест).
3. Анализ генотоксического действия комплексных соединений платины, потенциальных противораковых препаратов, с помощью SOS lux теста и сравнительная оценка их генотоксичности в эукариотической тест-системе.
4. Синтез генов некоторых цитокинов и факторов роста [интерлейкин-З, интерлейкин-4, делеционная форма интерлейкина-4 - IL4-52, интерлейкин-10, нейротрофин глиалыюго происхождения (GDNF), фактор роста кератшюцкгов (K.GF), рецепторный антагонист интерлейкина-1 (hlL-lra), эпидермальный фактора роста (EGF) человека; у-шггерферон быка (bIFN-y)] и разработка систем их экспрессии в клетках Е. coli.
5. Разработка методов выделения ряда цитокинов и факторов роста и оценка их биологической активности.
6. Оптимизация систем транспорта глюкозы в клетках Е. coli путем модификации пермеазы PtsG и усиления экспрессии пермеазы EIINa8 с целью увеличения продукции аминокислот штаммами-продуцентами.
7. Получение штаммов Е. coli, способных использовать этанол в качестве источника углерода, и поиск необходимых модификаций путей основного метаболизма Е, coli, приводящих к повышешпо выхода аминокислот при совместном использовании глюкозы и этанола в качестве источников углерода
8. Модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина (N-ацетилглутамат сингетазы и карбамоилфосфат сшгтетазы) для конструирования высокопродуктивных штаммов-продуцентов аминокислоты.
9. Исследование путей возможной деградации шггермедиатов синтеза аргинина.
10. Поиск новых биологически активных низкомолекулярных веществ растительного происхождения, синтез которых может быть в будущем реализован микробиологическим путем.
Научная новизна и практическая значимость результатов исследования.
Впервые сконструирована тест-система (SOS-lux test) для оценки генотоксичности химических веществ и физических факторов (у- и UV- излучение), основанная на измерении SOS-ответа клеток Е. coli на действие ДНК-повреждающих факторов, в которой в качестве гена-"репортера" использован оперон биолюминесценции P. leiognathi под контролем промотора гена eda плазмиды CoID. Тест применялся при оценке генотоксичности и общей токсичности ряда соединений платины, проявляющих противоопухолевую активность, в частности цис-ДДП и циклоплатама. Сконструированная тест-система нашла широкое применение при исследованиях общетоксических и мутантных свойств поллютантов (см. например, Масленникова (ИЭГМ, УроРАН), 2007, Кхатаб З.С. (Южный федеральный университет, г. Ростов-на-Дону), автореф. дисс., 2013; Е. П. Гуськов, и др., (НИИ биологии при ЮФУ, г. Ростов-на-Дону), 2009); при разработке следующего поколения биосенсоров для оценки генотоксичности (SOS-LUX-LAC-FLUORO test (Rabbow Е. et al, 2003, Horneck G et al., 2010 (DLR, Institute of Aerospace Medicine, Cologne, Germany)). Данная часп. работы частично финансировалась в 1995-1997 г.г. гра1ггами INTAS (93-2850) и COPERNICUS (CIPA СТ-94 0122, European Commission).
Сконструирован ряд Е. coli штаммов-продуцентов цитокинов и факторов роста (IL-3, IL-4, IL4-52, IL-10, GDNF, KGF, hlL-lra, EGF человека; у-интерферона быка (bIFN-y)) с использованием синтетических или полусинтетических генов данных белков.
Высокоэффективная продукция белков достигалась с использованием следующих генно-инженерных подходов: а) оптимизация силы промоторов и использование высокоэффективных рибосом-связывающих последовательностей, б) строгая регуляция транскрипции, в) модификация первичной структуры mRNA белков для оптимизации трансляции, г) предотвращение протеолиза целевых продуктов путем использования штаммов Е. coli дефектных по некоторым протеазам, д) цнтоплазматическая продукция белков в виде телец включения, продукция белков в виде их гибридных вариантов, или, в случае EGF, экстраклеточная продукция целевого белка. Разработаны методы выделения и очистки некоторых субстанций белков
Субстанции белков hIL-4 и hIL-452 использовались в Институте инженерной иммунологии для структурно-функциональных исследований рекомбинаигного делеционного варианта интерлейкина-4; hIL-452 передан в Институт Цитологии Новосибирского отделения РАМН для изучения роли этого цитокина в ткане-спецнфической регуляции иммунных реакций на разных этапах онтогенетического развития. Штамм-продуцент рекомбинанпюго hGDNF передан в НПЦ «Фосфосорб» для дальнейших исследований по изучению возможности создання на его основе эффективных лекарственных биопрепаратов. Биологически активные субстанции hEGF и hKGF применялись при выращивании аллогенных эпидермальных пластов (Институт биологии развития РАН) с последующей их трансплантацией больным при глубоких ожогах и незаживающих трофических язвах. Высокоэффективные штаммы продуценты рекомбинангного hIL-lra были переданы в ГНЦ РФ ГосНИИОЧБ (СанктПетербург), где впоследствии были разработаны методы выделения и очистки целевого белка в препаративных количествах, показана биологическая активность hIL-1 га и начаты доклинические испытания препарата. Штамм Е. coli BL21(DE3) (pET-22-blFN-y) был передан s АО «МосАгроГет> для разработки промышленного регламента выделения и очистки рекомбинантного у-интерферона быка с целью последующего создания комбинированных препаратов ветеринарного назначения на основе природных и рекомбинантных интерферонов и щтгокинов.
Показана возможность усиления потребления глюкозы штаммами Е. coli при экспрессии в них мутакгной пермеазы PtsG или при усиленной экспрессии пермеазы gjjNag возможность интенсивного усвоения глюкозы клетками Е. coli посредством пермеазы EIIN>S была показана впервые.
Получены новые мутантные варианты алкоголь дегидрогеназы-альдегид дегидрогеназы Е. coli (AdhE), обеспечивающие рост клеток на средах с этанолом в качестве единственного источника углерода в аэробных условиях культивирования.
Введение мутантных генов adhE под контролем сильного промотора в хромосому штаммов-продуцентов (например, треонина или глутаминовой кислоты) позволяет получить аминокислоту при росте клеток на средах с этанолом в качестве единственного источника углерода. Теоретически показаны необходимые модификации пути гликолиза для эффективной продукции аминокислоты при использовании в ростовых средах смесей глюкоза/этанол (на примере штамма-продуцента треонина).
Получены новые варианты мутангтых N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат сингетазы Е. coli, ключевых ферме1ггов пути биосинтеза аргинина, резистентных к ретроингибированию. Гены мутантных ферментов использованы при конструировании высокопродуктивных штаммов-продуцентов аминокислоты.
Впервые идентифицированы гены (и охарактеризованы соответствующие белки) одного из путей деградации путресцина в GABA в Е. coli. Данный путь в базе данных
ЕсоСус получил наименование пути I деградации путресцина (pathway: putrescinc degradation I).
Скрининг более ста препаратов этанольных экстрактов растений, произрастающих на территории России, проведенный с использованием in vitro тестов: 1) ингибирование ангиотензинпревращающего фермента ACE I; 2) ингибирование продукции TNF-a и PGEi клетками моноцнтов человека ТНР-1; 3) оценка антиоксидантной активности (рРРНтест); 4) ингибирование панкреатической липазы (HPL) человека; 5) активация фосфоршшрования 5'-АМФ-активируемой протеинкиназы (АМРК) - выявил препараты с высокой специфической активностью в данных тестах.
Несколько экстрактов показали высокую активность в более чем одном тесте: экстракт соплодий ольхи - в DPPH и ACE I тестах, экстракт из корневищ бадана - в HPL and ACE I тестах, экстракт грушанки круглолистной - в АМРК и PGEj тестах.
Иде1гтифицированы индивидуальные вещества, высокоактивные в указанных выше тестах: а) из экстракта соплодий ольхи выделены глутиноин (соединение обнаружено и структура идентифицирована впервые), педункулагин и праекоксин Д. показавшие антиоксидантную активность в DPPH тесте сравнимую с активностью таких известных анпшкеидантов, как галловая и аскорбиновая кислоты; б) in корневищ бадана выделены (+)-катехин 3,5-ди-О-галлат (обнаружен и структура идентифицирована впервые) и (+)-катсхин З-О-галлат, показавшие высокую антиоксидантную и HPL ингибирующую активности, сравнимые с известными препаратами антиоксидантов и липазных ингибиторов растительного происхождения; в) в экстракте грушанки круглолистной обнаружен 2-метил-7-гидроксиметил-1,4-нафтохиион, для которого впервые была показана способность индуцировать фосфорилирование АМРК в дифференцированных клетках миобластов мыши С2С12. Этот активатор АМРК сравним по активности с ресвератролом гаи гинзенозидом и может быть перспективен в качестве компонента функционального питания.
Возможность микробиологического синтеза идентифицированных соединений обсуждается с учетом достигнутых в последние годы успехов в метаболической инженерии путей биосинтеза метаболитов - предшественников флавононов, биосинтеза флаванонов и флавонолов, в клетках Е. coli.
Основные положения днссертацин, выносимые на защиту.
1. Разработка новой биолюминесцентной тест-системы (SOS-lux тест) оценки генотоксичиости химических веществ и физических факторов;
2. Применение ряда генно-инженерных стратегий для конструирования высоко продуктивных н стабильных при культивировании цггаммов-продуценгов цитокинов и факторов роста (IL-3, IL-4, IL4-S2, IL-10, GDNF, KGF, hlL-lra, EGF человека, у-интерферона быка (bIFN-y)) на основе клеток Escherichia coli',
3. Показана возможность потребления глюкозы штаммами Е. coli посредством пермеазы EIlNas;
4. Получение новых мутантных вариантов алкоголь дегидрогеназы - альдегид дегидрогеназы Е. coli (AdhE) для обеспечения роста клеток на средах с этанолом в качестве единственного источника углерода в аэробных условиях культивирования. Анализ возможных модификаций путей основного метаболизма Е. coli, приводящих к повышению синтеза аминокислот при совместном использовании глюкозы и этанола в качестве источников углерода;
5. Получение новых высокоактивных аллостерически не ингибируемых мутантных варишгтов N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Е. coli, ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина;
6. Идентификация генов (и характеристика белков, YgjG и YdcW) одного из путей деградации путресцина (putrescine degradation I pathway) в E. coli;
7. Поиск и идентификация новых биологически активных низкомолекулярных веществ растительного происхождения. Возможные схемы их микробиологического синтеза.
Часть исследований, описанных в Главе 1, проведены совместно с сотрудником лаборатории автора во ВНИИ биотехнологии к б.и. Рязановой Л.А., а также в соавторстве с В.И. Гуревичем (Институт Биофизики СО РАН, г. Красноярск), О.В. Комовой (ОИЯИ, Дубна), д-р G. Horneck (DLR, Cologne, Germany) и д б.н. В.К. Ивановым (Институт общей и неорганической химии, РАН). Основные результаты, изложенные в Главах 2 и 3, получены в соавторстве с к.б.н. И.Б. Альтман, к.б.н. С В. Смирновым, к.б.н. Н.Н. Самсоновой, к.б.н. В.А Котляровой (ГосНИИгенетика, ЗАО «АГРИ»); кроме того, часть работ выполнялась при участии к.х.н. М.В. Гурова и к.х.н. А.Н. Куркина (Глава 2, синтез олигонуклеотидов), сотрудников Института биологии развития РАН к.б.н. А.В. Васильева и Е.А Воротеляк (оценка биологической активности hKGF и hEGF), сотрудников ОАО Инсппут инженерной иммунологии, Любучаны Р.Н Василенко, A.M. Васильева и В.М. Абрамова (изучение свойств рекомбинангного hIL-452), сотрудников лаборатории к.б.н. ММ. Гусятинера ЗАО «АГРИ» (оценка продукции аминокислот модельными штаммами-продуцентами). Результаты, изложенные в Главе 4, получены автором в соавторстве с сотрудниками его лаборатории к.х.н. С.А. Ивановым, к.х.н. И.Л. Мальфановым, к.б.н. В.Е. Карандашовым и К. Калинкевич, а также при участии К. Nomura, Ajinomoto HF, (ЯМР, КД и масс-спектр алыгый анализ высокого разрешения). Всем им автор выражает искреннюю благодарность за проведение совместных исследований.
Апробация работы.
Основные результаты работы были доложены на совместном заседании Научно-технического совета НИИ «Аджиномогго-Генетика» (ЗАО «АГРИ») и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 8 апреля 2013 г.
Результаты работы были представлены на: Всесоюзной научной конференции «Генетические последствия действия биологических и химических факторов окружающей среды по проблеме «Человек и Биосфера»» (Киев, 1988), V Конференции РФ «Новые направления биотехнологию) (Пущино, 1992), VI Конференции РФ «Новые направления биотехнологии» (Пущино, 1994), Baev International Conference of Biotechnology (Moscow, Russia, 1996), 7-th Imternaiional Conference on Environmental Mutagens. SOS Chromotest Workshop at the 7th 1CEM Meeting (Toulouse, France, 1997), NATO Advanced Research Workshop on Fundamentals for the Assessment of Risk from Environmental Radiation (Brno, Czcch Republic, 1997), 2^ Joint Meeting of the ICS and the ISICR (Jerusalem, Israel, 1998), VI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1999), 2nd International Conference on Tumor Microenvironment: Progression, Therapy and Prevention (Baden, Austria, 2002), Eighteenth UICC International Cancer Conference (Oslo, Norway, 2002), Eleventh International Cytokine Society Conference (Dublin, Ireland, 2003), Is1 FEMS congress of European Microbiologists (Ljubljana, Slovenia, 2003), 30th FEBS Congress "The Protein World", (Budapest, Hungary, 2005), 3rd Moscow International Congress "Biotechnology: state of art and prospects of development" (Moscow, Russia, 2005).
Публикации
111 работ (37 статей в научных журналах, 35 патентов, 5 статей в иностранных сборниках научных трудов; материалы конференций, конгрессов и симпозиумов - 34) были опубликованы после защиты кандидатской диссертации. По теме диссертации опубликовано 87 печатных работ (28 статей в научных журналах; часть результатов защищена 32 российскими и зарубежными патентами; 5 статей в иностранных сборниках научных трудов; 22 материала российских и международных конференций).
МАТЕРИАЛЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы. Генотип и происхождение исходных штаммов бактерий, использованных в работе.
Штамм Photobactermm leiognathi 54D10 (из коллекции Красноярского университета); Штаммы Escherichia coli:
С600 (F2, thi-l, thr-l, leul36. lacYl, tonA2l, supE44) (Bachmann BJ, 1972);
HB101 [F, hsdS (rb-, mb-), recA, ara-14, proA, leu, thi, lacY, ga!K2, str, xyl-5, mtl-1, supE44]
(Sambrook etal., 1989);
JM109 [recAl, endAI, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relAl, A(lac-pro) [F', traD36, proA*B lacf, lacZAM5]\ (Sambrook et al., 1989);
AB1157 (F-, thr-l, leuB6,proA2, hisG4, argE3, lacYl, thi-l, galK2, ara-14, xyl-5, mtl-1, tsx-33,
supE44, rpsL31, A-s); JC9239 (производный от AB1157, recF143) (штаммы предоставлены
В.А.Тарасовым, Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова, РАН, Москва).
TG1 (supE, hsdAS, thi, A(lac-proAB) [F,'traD36, proAB+, lacf, lacZAM15]) (Sambrook et al.,
1989)
BL21 (F, ompT, Ion, hsdS, gal, n, mb~) (Studier FW et al., 1986);
BL21(DE3) (BL21:: lambda D69-plac uv5-T7 gene 1) (Studier FW et al., 1990);
MG1655 -иггамм E. coli дикого типа с полностью установленной первичной структурой
хромосомной ДНК (htpp://www.genetics.wisc.edu) из Всероссийской коллекции
промышленных микроорганизмов (ВКПМ).
В3083 (argA, metB) и B6969(carß::TnlO) из коллекции ВКПМ;
237: штамм-продуцент аргинина В-7925(/Ы::Тп5, argR) (ВКПМ).
В3996: штамм-продуцент треонина TDH-6/pVIC40 (US Патенты 5,175,107 и 5,705,371) (ВКПМ)
Исходные плазмиды. В работе использованы следующие плазмидные векторы: pBR322, pUC18, pUC19, pUC4K (Pharmacia), ColD (Frey J et al., 1986), рЛСУС177 (ВКПМ), pET22b(+) и pET15b(+) (Novagene). pMW118 и pMW119 (малокопийные векторы, Nippon Gene).
Олигонуклеотиды синтезировали на автоматическом синтезаторе ДНК фирмы Milligen/Biosearch, модель 8700, с использованием фосфоамидитного метода и очищали с помощью HPLC, или получали id фирмы «Синтол», Москва.
Манипуляции с ДНК осуществляли, используя стандартные методы (Sambrook et al., 1989) и следуя инструкциям фирм - производителей ферментов дня молекулярной биологии (Pharmacia, Fermentas, New England Biolabs, Так ara Shuzo и др.). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборах фирмы «Applied Biosystems». Нуклеотидные последовательности ДНК определяли по методу Сэнджера (Sanger et al., 1977) или на автоматическом секвенаторе.
Процедура получения синтетических генов включала следующие этапы: 1) синтез набора олигонуклеотидов (длиной от 30 до 70 оснований), соответствующих последовательностям двух цепей ДНК гена; 2) фосфорилирование олигонуклеотидов с помощью Т4-полинуклеотидкиназы; 3) олигонуклеотиды (как правило, 5'-концевой олигонуклеотид обратной цепи гена был нефосфорилирован) смешивали в эквимолярных количествах (по 20 pmol каждого) в 100 мкл лигазного буфера, смесь отжигали, понижая температуру от 85°С до 20°С в течение 2 час, лигировали, затем синтезированную ДНК расщепляли по сайту рестрикции, введенному в З'-концевую последовательность гена; 4) ДНК гена выделяли с помощью электрофореза в агарозном геле, клонировали в соответствующем векторе и последовательность гена анализировали секвенированием.
Гены: интерлейкина 3 (/¡¡7-3) человека и Y-интерферона быка синтезированы в лаборатории проф. Е.Д. Свердлова (ИБХ им. Шемякина и Овчинникова РАН Москва), рецепторного антагониста интерлейкина-1 человека (hIL-lra) предоставлен проф. Ю.А. Берлиным (ИБХ им. Шемякина и Овчинникова РАН), интерлейкина 4 человека (hil-4) и эпидермального фактора роста человека (hegf) синтезированы в лаборатории A.B. Ажаева (ВНИИ биотехнологии). Список генов, полученных нами путем химико-ферментативного синтеза, представлен в таблице 1. Последовательности синтетических генов определялись на основании литературных данных по структуре соответствующих ДНК или аминокислотных последовательностей белков. При этом учитывалась частота встречаемости кодонов в клетках Е. coli, а также необходимость наличия сайтов узнавания рестриктаз для процедуры химико-ферментативного синтеза и клонирования гена.
Таблица 1.
N Целевой белок Ген Оптимизация состава кодонов для Е. coli Источник информации
1 Природная делеционная изоформа интерлейкина-4 человека - hIL-482 hil-4 S2 да Птицын JI.P. и др., 1999.
2 Интерлейкин-10 человека (hIL-10) hil-10 да Птицын JI.P. и др., 1998.
3 Фактор роста кератиноцигов человека (hKGF) hkgf да Птицын JI.P. и др., 1998.
4 Нейротрофин глиального происхождения (glial-cell-line-derived neurotrophic factor, hGDNF) человека hgdnf да Ptitsyn L.R. et al., 1998.
Расчет потенциальных вторичных структур mRNA проводили в соответствии с кинетическим алгоритмом, реализованным в пакете компьютерных программ DNA-SUN А.А.Мироновым (ГосНИИгенетика, Москва), а также с помощью Wcb-pecypca GeneBee -Molecular Biology Server (http://www.genebee.msu.ru/genebee.htlm).
Электрофорез олигонуклеотидов, ДНК и белков в ПААГ проводили по стандартным методикам (Laemmli et al., 1970; Sambrook et al., 1989).
Концентрацию суммарных клеточных белков определяли по методу Бредфорда с использованием реактива фирмы Bio-Rad (Bradford et al., 1976). Количественное определение содержания в клетке целевых белков проводили путем сканирования прокрашешюго в растворе Coomassie-blue R-250 электрофорезного геля на денситометре CSD-200 (Beckman, США).
Среды. Клетки Е. coli выращивали при 30°С или 37°С на среде LB или на минимальной среде М9 (Миллер, 1976), в которую вносили глюкозу (и/или этанол), необходимые добавки и антибиотики.
На основе исходных штаммов бактерий и плазмид были получены десятки новых шгаммов и гибридных плазмид, часть да которых приведена в таблице 7. Подробные процедуры их получения содержатся в публикациях, список которых приведен в конце диссертации.
SOS lux тест. Штамм С600 (pPLS-1) выращивали на среде LB до оптической плотности культуры равной 0,3 - 0,4 (550 км). Аликвоты культуры (по 300 мкл) переносили в стерильные полипропиленовые пробирки (из комплекта к люминометру LKB) и добавляли в них по 10 мкл тестируемого соединения требуемой концентрации. В контрольную пробирку добавляли 10 мкл дистиллированной воды. Продолжали инкубацию в течение 1,5 часа, затем охлаждали культуры до комнатной температуры (10 мин) при их непрерывном перемешивании. Измерение интенсивности биолюминесценции культур, содержащих анализируемые вещества, и контрольных культур проводили на люмннометре 1250 (LKB, Швеция) или мультифункционалыюм люминометре Lucyl (Anthos Mikrosystem GmbH, Krefeld, Германия); время измерения свечения одного образца - 1сек.
Эксперименты по анализу экспрессии генов с помощью ДНК-чипов (DNA array метод) проводили с использованием Panorama E.coli OligoArray чипов (Sigma Genosys) и набора Е.соН OligoArray cDNA праймеров. Для выделения mRNA применяли метод экстракции горячим фенолом, реакцию обратной транскрипции проводили с использованием HotScribe First-Strand cDNA Labeling Kit (Amersham Biosciences), процедуры гибридизации проводили в соответствии с рекомендациями фирмы -производителя чипов, чипы экспонировали в кассете Molecular Dynamics с экраном Low Energy Screen ("Kodak") в течение 24-72 часов. Визуализацию и количественную оценку радиоактивных сигналов проводили с использованием мультифункциоиального сканера Typhoon 9210 (Amersham) при разрешении 50 мкм и программы ImageQuant (V 5.0).
HPLC стадии выделения и очистки веществ проводили на оборудовании фирм Amersham Biosciences и Waters.
Оптические плотности растворов и клеточных культур, а также спектры соединений в UV и видимом диапазоне определяли с помощью спектрофотометров фирм Phillips и Amersham Biosciences. При проведении реакций в микропланшетах, результаты учитывали с использованием планшетного ридера Multiscan Ascent (Thermo Electron) или планшетного флуориметра Genios FL fluorimeter (Tecan).
Масс-спектрометрический анализ образцов белков проводили в Протеомном центре института биомедицинской химии РАМН, Москва.
Масс-спектры высокого разрешения образцов химических соединений получали с использованием масс-спектрометра Synapt MS (Waters). ^ |з
Bruker Avance-400 спектрометр использовали для получения H (400 MHz), С (100 MHz), HSQC и НМВС спектров ЯМР химических соединений (внутренний стандарт -TMS).
Методы культивирования эукариотических клеток и тестирования противовоспалительного и АМРК активирующего потенциала растительных экстрактов детально описаны в соответствующих публикациях (Kalinkevich К et al, 2013; Ptitsyn LR et al., 2011).
ВВЕДЕНИЕ
Метаболическая инженерия на практике подразумевает оптимизацию генетических и регуляторных процессов внутри клетки с целью увеличения продукции определенных соединений. Эти процессы представляют собой комплекс осуществляемых ферментами биохимических реакций, который позволяет клеткам конвертировать вещества -источники питания в соединения, необходимые для их жизнедеятельности, и целевые продукты.
Методология метаболической инженерии, зародившаяся в начале 1990-х годов, включает в качестве составных частей: анализ метаболических путей микроорганизмов для поиска узких мест и узловых точек метаболизма, препятствующих высокоэффективной продукции целевых веществ микроорганизмами; поиск математических моделей превращений метаболитов; расчет выхода целевых продуктов.
В 1996 г. было предложено следующее рабочее определение метаболической инженерии: "Метаболическая инженерия - целенаправленное изменение метаболических путей организма с целью лучшего понимания и использования их для химической трансформации, передачи энергии и сборки надмолекулярных комплексов. Метаболическая инженерия включает перераспределение клеточных активностей путем перестройки энзиматических, транспортных и регуляторных функций клетки через использование рекомбинантных ДНК и других технологий" (F. Heineken, 1996). С практической точки зрения были выделены восемь важнейших направлений исследований для развития метаболической инженерии: 1) обнаружение и оценка контролирующих механизмов и потоков субстратов (флаксов) плохо изученных путей биосинтеза, 2) разработка аналшического инструментария для изучения ферментативных и регуляторных процессов in vivo, 3) разработка и применение новых генетических инструментов, как то: селективные маркеры, гены-репортеры, векторы, регуляторные молекулы, для манипулирования с клетками, 4) расширение набора микроорганизмов, с которыми возможны генетическое и метаболические манипуляции, 5) развитие технологий для повышения выживаемости и генетической стабильности генетически шмененных клеток, 6) создание баз данных и компьютерных программ для анализа путей метаболизма и их моделирования, 7) исследование механизмов транспорта низкомолекулярных веществ через мембраны, 8) разработка и применение систем, обеспечивающих возможность использования новых путей метаболизма (в т.ч., из растений и разнообразных микробов) для синтеза новых целевых соединений ("Metabolie engineering, NIH Guide", 1996). Таким образом, эта мультидисциплинарная область включает в себя как биохимические, так и геномные, транскриптомные, протеомные, метаболомные исследования, анализ потоков метаболитов (flux analysis) и другие методологии системной биологии (Herrman Т., 2004; Alper Н. & Stephanopoulos G, 2004), необходимые для достижения практических целей биотехнологических производств.
Хотя такого рода комплексные исследования дают явные преимущества при создании штаммов-продуцентов низкомолекулярных соединений или рекомбинантных белков, при реализации каждого отдельно взятого процесса могут возникать существенные проблемы, вследствие чего на практике стратегия улучшения процесса и набор применяемых для этого методов, как правило, определяются эмпирически (Wendisch VF et al., 2006; Jana S and Deb JK, 2005).
Принципы метаболической инженерии клеток Е. coli частично были применены на ранних стадиях данной работы (конструирование SOS lux теста, штаммов-продуцентов цитокинов и факторов роста) и, в большей степени, использованы при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Конструирование рекомбннантных клеток Е. соН - биосеисеров для анализа
генотокснчиости химических соединений и физических факторов.
Химические соединения — загрязнители окружающей среды, также как и ионизирующая радиация, представляют реальную генетическую опасность для человека Классификация химических соединений по степени их потенциальной генетической опасности для человека, а также разработка способов тестирования большого числа химических соединений являются основными задачами генетической токсикологии. Краткосрочные скрининговые тесты на канцерогенность применяются, в частности, в системе доклинического изучения безопасности оригинальных фармакологических средств и вспомогательных веществ. С точки зрения прогноза канцерогенности, существенное значение имеют результаты, полученные в системе мутагенной оценки при учете генных мутаций (на бактериях и дрозофиле) и/или хромосомных аберраций (в клетках костного мозга мышей). С другой стороны, увеличение уровня загрязнения окружающей среды требует разработки чувствительных и специфичных методов обнаружения и оценки опасности этих загрязнений. Для определения влияния такого типа генотоксических воздействий на здоровье человека и баланс экосистем наряду с химическими и физическими методами анализа был разработан ряд биологических тест-систем (см. напр. "Biosensors for Environmental Diagnostics" В.Hock et al. (eds.), 1998, B.G.Teubner Stuttgart.Leipzig и сборник материалов рабочего совещания NATO: "Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation", C.Baumstark-Khan et al. (eels.), 1999, Khmer Academic Publishers, Netherlands). Разработка и внедрение дешевых и быстрых биологических тест-систем для обнаружения и оценки потенциальных канцерогенов и до настоящего времени остается актуальной задачей.
Функционирование подобных систем основано на предположении, что главной причиной канцерогенеза являются индуцируемые генотоксинами повреждения хромосомной ДНК. В настоящее время в практике наиболее распространен бактериальный тест Эймса, основанный на использовании ряда штаммов Salmonella typhimurium, ауксотрофов по гистидину, которые способны ревертировать к прототрофности под действием мутагенов с разными механизмами повреждений ДНК. Этот тест был применен для оценки сотен химических соединений, и было показано, что 90% веществ-мутагенов являются также канцерогенами.
В конце двадцатого столетия широкое развитие получили бактериальные тесты, основанные на изменении некоторых функций клеточного метаболизма под действием генотоксинов, в том числе, на оценке индукции SOS-ответа клеток - комплексной реакции клеток микроорганизмов на действие ДНК-повреждающих агентов и ряда других неблагоприятных воздействий. При этом имеет место активация экспрессии ряда ферментов (около сорока по современным представлениям), обеспечивающих репарационные функции и приостанавливающих нормальное деление клеток. Ключевым механизмом, контролирующим экспрессию этих генов, является протеолитическое расщепление белка LexA - репрессора SOS-зависимых промоторов - активированной формой RecA белка. На определения уровня SOS-ответа Е. coli и £ typhimurium основан ряд тест-систем анализа мутагенного эффекта химических веществ, в частности, Хромотест (Quillardet Р et al., 1985) и ити-тест (Nakamura S et al., 1987). Регистрация эффекта в этих методах осуществляется путем измерения уровня фермента р-галактозидазы, ген которого под контролем определенного SOS-промотора (Р,/,л или Р„„и)
локализован либо в хромосоме Е. coli, либо на плазмиде. Используемые штаммы в обоих случаях несут мутации в хромосомном гене ß-галактозндазы.
Нами была предложена модификация вышеописанных тестов, в которой оперон биолюминесценции Phoíobacierium leiognathi был использован в качестве гена-"репортера" для анализа уровня SOS-ответа клеток Е. coli.
Люминесценция морских фотобактерий обусловлена ферментативной реакцией, катализируемой a-, ß- гетеродимерным ферментом - люциферазой, субстратами которой являются алифатический альдегид, молекулярный кислород и восстановленный флавинмононуклеотид:
FMNHz + 02 + RCHO — FMN + Н20 + RC02H + hv
Организация оперонов биолюминесценции некоторых микроорганизмов ко времени начала данных исследований была достаточно хорошо изучена, и было показано, что, в общем виде, гены оперона располагаются в последовательности: C,D,A,B,E (Meighen ЕА, 1991). luxгА и luxB кодируют субъединицы люциферазы, /ш:С, luxD и luxE - ферменты биосинтеза алифатического альдегида. Для Vibrio fisheri (Engebrecht J et al., 1984) было установлено, что эта система представлена 2-я оперонами, один из которых содержал ген регуляторного белкового фактора (luxR), а второй - гены luxl (белка, синтезирующего аутоиндуктор биолюминесценции) и lux C,D,A,B,E. Опероны ряда фотобактерий (и, в частности, Р. leiognathi) включали дополнительный ген luxF, локализованный между luxB и luxE, функция кодируемого им полипептида оставалась не выясненной (Illarionov ВА et al., 1990).
1.1. Клонирование фрагмепта ДНК, кодирующего оперон биолюминесценции Р.
leiognathi.
Оперон биолюминесценции Р. leiognathi был клонирован нами из штамма 54D10 коллекции Красноярского университета. Высокомолекулярную ДИК, выделенную из этого штамма, частично гидролизовали рестриктазой SauЗА, фрагменты ДНК размером 10-15 т.п.0. клонировали в векторе pBR322/ßamHI и трансформировали лигазной смесью клетки Е. coli TGI. Среди просмотренных визуально 10 ООО клонов было обнаружено 2 люминесцирующих. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид (pPLl и pPL2) показал, что они имеют разные размеры и противоположную относительно вектора ориентацию ДНК вставки. По интенсивности биолюминесценции клоны оказались достаточно близкими, следовательно, в общем для обеих плазмид фрагменте ДНК Р. leiognathi присутствовали гены всех белков, обеспечивающих биолюминесценцию.
С помощью инсерционного мутагенеза с использованием гена устойчивости к канамицину из плазмиды pUC4K было картировано положение существенных для люминесценции функций. Все полученные инсерционные мутанты плазмиды pPLl разделились на три класса: темновые, с альдегидеависимой и неизменившейся люминесценцией. Было установлено, что темновой фенотип определяется мутациями во фрагменте ДНК размером от 3,5 до 5,1 т.п.о.; альдегидзависимый - от 1,3 до 2,5 т.п.о.; у светящихся инсерционных мутантов вставки картировались либо в векторной ДНК, либо в отсутствующем в плазмиде pPL2 фрагменте. Темновой фенотип мог быть обусловлен мутациями в генах двух субъединиц люциферазы; биосинтеза альдегидного субстрата и регуляторных генах, если все они расположены перед генами люциферазы и транскрибируются под контролем общего промотора. Вставка Km^-гена в район промотора гена устойчивости к тетрациклину в векторе не нарушала люминесценции мугагга. Следовательно, транскрипция генов люминесценции в плазмиде pPLl осуществлялась в рекомбинантных клетках Е. coli с их собственного промотора
(промоторов). Размер фрагмента ДНК, кодирующий альдегидзависимую люминесценцию, был явно недостаточен для кодирования 3 ферментов биосинтеза альдегидного субстрата. С другой стороны, мутации, определяющие темновой фенотип, были локализованы на фрагменте ДНК значительно большем, чем размер двух генов люциферазы. Поэтому мы предположили, что, как и в опероне биолюминесценции V. fisheri, гены двух субъединиц люциферазы расположены между генами биосинтеза альдегида, находятся под контролем общего промотора, и размер существенной для люминесценции области ДНК составляет около 6,5-7 т.п.о.
Затем, с целью более детальной локализации генов биосинтеза альдегида и люциферазы, был проведен делеционный мутагенез фрагмента ДНК Р. leiognathi из плазмиды pPL2. Плазмиды pUPL32 и pUPL22 были получены путем клонирования, соответственно, HináUl-Sphl фрагмента (7,3 т.п.о.) pPL2 по сайтам //iwdlll и Spill плазмиды pUC19 и Sph\-Sph\ фрагмента (6,7 т.п.о.) по сайту Sph\ плазмиды pUC18. Остальные рекомбинантные плазмиды были получены как делециснные производные pUPL22. Препарат ДНК плазмиды расщепляли рестриктазой ßamIII и частично &шЗА, лигировали полученные фрагменты линейной ДНК и трансформировали ими клетки Е. coli HB 101. Клоны HB101(pUPL32) и HB101(pUPL22) люминесцировали in vivo. Клетки, несущие плазмиды pUPL-22 -2, -21, -33, -17, 15 проявляли альдегидзависимую люминесценцию; несущие плазмиду pUPL22-27 - имели темновой фенотип (рис. 1).
О 2 « 6 8 т.п.н.
■ > '_!_1__1-1—I
RH PHSP PvXRhHM S
& ян iMiii L р^
Н SR gj I ) liilt Ii H pl/PLS2
П S S H
-.gl Ш1 tili YU PUPL22
P. B/Sa S H
!§_Li¡iLiUi_pOPi 22-2
R B/Sa S H
-gf lim »IL pUPL 22-21
RS/Sa S H
-ЙТИ» mt ^ PUPL22-33 R B/Sa s H iggLLiiAL-^s pUPL 22-17 R B/Sa S H
pUPL 22-27
r se/x psh ~~gfUt.:ü)iá¡ pUPLJS
CB ЙВ £
Рис. 1. Рекомбинантаые плазмиды серии рЦРЬ, содержащие фрагмент ДНК люминесцентной системы Р. 1ею^па(Ы. В верхней части рис. - плазмида рРЬ2. В нижней части - предполагаемая локализация генов. Сайты рестриктаз: Я - £соЫ, Н -Нтс!\\\, Р - Рз1\, 5 -Г\ - РуиП, X - ХНо\, йа - 5аиЗА, 81 -Заштриховано, косыми линиями -фрагменты рВЮ22, крестиками -фрагменты р1!С19 или р11С18.
Из сравнения клонов НВЮ1(риРЬ22) и HB101(pUPL22-2) следовало, что делеция примерно 400 п.о. в 5'-концевой области фрагмента ДНК Р. ШодшйА плазмиды р!!РЬ22 приводила к альдегидзависимому фенотипу клонов, т.е. к инактивации одного из генов биосинтеза альдегидного субстрата. Из сравнения плазмид рЦРЬ22, р11РЬ22-2 и р11Р1.22-17 видно, что гены белков биосинтеза альдегидного субстрата локализованы слева от генов люциферазы на фрагменте ДНК размером от 2,2 до 2,6 т.п.о. Как было показано ранее для V. /¡.Феги и V. Иагуеу! (ЕгщеЬгесМ 3 е1 а1., 1984), гены С и О, расположенные слева от генов А и В, кодируют полипегтгиды, соответственно, 53 и 33 кДа, а ген £,
находящийся справа от генов люциферазы, - 42 кДа. Поэтому размеры участков ДНК, на которых они локализованы, должны составлять не менее 2,5 т.п.о. слева и не менее 1,2 т.п.о. справа от генов люциферазы. Следовательно, информационная емкость Sphl-Xhol фрагмента ДНК в плазмидс pUPL22 (~2,5 т.п.о.) достаточно близка к необходимой для кодирования двух генов белков биостггеза альдегидного субстрата, а в З'-концевой области фрагмента (1,3-2,5 т.п.о.) расположен третий ген, ответственный за синтез альдегида.
Таким образом, мы сделали заключение, что гены оперона биолюминесценции Р. leiognathi структурно организованы аналогично оперонам V. ftsheri и V .harveyi, т.е. в последовательности С, D, А, В, Е. Позднее в составе оперона биолюминесценции Р. leiognathi был обнаружен дополнительный ген luxF, гомолог гена luxB, локализованный мевду luxB и luxE (Lee CY et al., 1991; штамм P. leiognathi, ATCC-25521). Также, полученные нами данные позднее были полностью подтверждены результатами секвенирования оперона биолюминесценции P. leiognathi (В.И.Гуревич, И-т Биофизики СО РАН, г. Красноярск, неопубликованные данные).
Как отмечалось выше, клоны HB101(pUPL32) и HB101(pUPL22) люминесцировали при росте клеток in vivo. Однако характер свечения этих клонов и клона HBI01(pPL2) в зависимости от плотности культуры резко различался, а именно, значительно увеличивалась интенсивность свечения и практически исчезал эффект аутоиндукции при увеличении плотности культуры, обусловленный участием ретуляторных генов, которые могут быть локализованы вне оперона биолюминесценции. Следовательно, транскрипция генов оперона в плазмидах pUPL32 и pUPL22 контролировалась /ас-промотором. Дополнительным подтверждением этого вывода являлось изменение характера свечения клеток JM109(pUPL22) при индукции культуры IPTG. После добавления индуктора наблюдалось резкое увеличение интенсивности люминесценции клеток JM109(pUPL22), причем в полностью индуцированном состоянии (примерно через 1 ч после добавления IPTG) свечение этих клеток было выше, чем HB101(pUPL22). Этот эффект был обусловлен незначительной репрессией /ас-прмотора в HB101(pUPL22), т.к. содержание lacJ репрессора в клетках НВ101 недостаточно для существенного снижения транскрипции с /ас-промотора, находящегося в составе мультикопийной плазмцды.
Для проверки предположения, что Sphl- Sph\ фрагмент ДНК P. leiognathi плазмиды pUPL22, включающий все функции, необходимые для люминесценции, не содержит собственного промотора, была сконструирована плазмида pBRPL-1, в которой промоторы вектора не контролируют транскрипцию фрагмента ДНК P. leiognathi (рис. 2). В качестве вектора использовали плазмиду pBR322. £coRJ-5¡pAI фрагме1гг (560 и.о.) pBR322, несущий /е/-промотор, был заменен на EcoUl-Sphl участок полилинкера плазмиды pUC18. Затем по сайгу Sphl полученной плазмиды pBRP был встроен Sphl- Sphl фрагмент ДНК Р. leiognathi плазмиды pUPL22. Клоны HB101(pBRPL-l) не люминесцировали in vivo, что свидетельствовало об отсутствии промотора в Sphl- Sphl фрагменте ДНК P. leiognathi.
Встраивание по сайтам полилинкера каких-либо промоторов приводило к появлению люминесценции в соответствующих рекомбшшггаых клонах при их выращивании in vivo. Так, по сайтам £coR] и ВатШ были встроены фрагменты ДНК, несущие промотор tac (EcoRl-ВатШ фрагмент плазмиды pDR540) и промотор tet (EcoRI-ВатШ фрагмент pBR322). Клетки НВ101, трансформированные плазмидами pBRPL-tac и pBRPL-/e/, люминесцировали in vivo, причем степень свечения зависела от силы встроенного промотора, и эти данные хорошо коррелировали с известными данными по силе встроенных промоторов. Добавление миристилового альдегида в культуральную среду не приводило к существенному росту биолюминесценции культур, m чего можно
заключить, что уровень биосиитеза алифатического альдегида посредством белков клонированного оперопа достаточен для обеспечения реакции биолюминесценции в рекомбинантных штаммах, и, следовательно, нет необходимости в дополнительном усилении пути биосинтеза этого субстрата.
1.2. Биолюминесцентный анализ SOS-ответа клеток Е. coli.
Плазмида pPLS-1, в которой геном-"рспортером" служил лишенный собственного промотора оперон биолюминесценции P. leiognalhi, а сенсорным компонентом - промотор гена eda плазмиды CoID (SOS-регулируемый промотор) (рис. 2Л), была сконструирована для создания системы анализа уровня SOS-ответа клеток Е. coli. Srna 1 -Sma 1 фрагмент плазмиды CoID (1,7 т.п.н.) (Ghersa Р et al., 1988), содержащий SOS-промотор и фрагмент гена eda, был клонирован по сайту Smal плазмиды pBRPL-1.
Для точной локализации положения гена luxC относительно сайта Sph\, 5'-концевой участок ДНК оперона в плазмиде pPLS-1 секвенировали по методу Сецджера. Последовательность, полученная в результате сиквенса, представлена на рис. 2В. Сравнение ее с соответствующим фрагментом S'-концевой последовательности гена luxC оперона биолюминесценции P. leiognathi, АТСС25521, позволило локализовать положение стартового кодона ATG гена С относительно сайта Sphl. Как видно из рис. 2В, расстояние от стартового кодона до данного сайта составляет 56 п.н. Следует отметить, что последовательности ДНК 5'-нетранслируемой области данных оперонов существенно различаются, хотя структура 5'-ко1щевого фрагмента гена luxC достаточно консервативна. Кроме того, 5'-концсвой нетранслируемый участок ДНК исследуемого оперона не содержит последовательностей, характерных для прокариотических промоторов или регуляторных элементов типа сайтов связывания белка LexA - репрессора SOS-системы Е. coli (Ihara М et al., 1987). Хотя гексамер, локализованный между 33 и 39 основаниями, достаточно похож на каноническую -10 область промотора Е. coli (5 из 6 оснований -канонические), структура, соотетствующая -35 области промотора, отсутствует, и он расположен слишком близко к RBS гена luxC. Таким образом, эти результаты подтвердили представленные выше данные об отсутствии в клонированном опероне биолюминесценции собственного промотора и о возможности его использования в качестве гена-"репортера" при изучении механизмов регуляции экспрессии генов в Е. coli и, в частности, SOS-регулируемой экспрессии.
Плазмидой pPLS-1 трансформировали штамм С600 Е. coli и полученный рекомбинантный штамм использовали для биолюминесцентного определения уровня SOS-ответа клеток в присутствии ДНК-повреждающих веществ.
Кинетика SOS-зависимой люминесценции штамма Е. coli C600(pPLS-l) определяется биодостутюстыо и дозой генотоксина, а также условиями роста штамма, температурой инкубации, степенью насыщения кислородом и т.д. Пример кинетики индукции свечения при инкубации штамма в присутствии митомицина С при 37°С с последующей инкубацией клеток при комнатной температуре представлен на рис. 3. Двухступенчатый температурный режим инкубации был выбран с целью оптимизации уровня эмиссии света и времени проведения теста. Как известно, 37°С - оптимальная температура для экспрессии SOS-зависимых функций в клетках Е. coli. С другой стороны, температурный оптимум реакции биолюминесценции как в Р. leiognathi, так ив Е. coli блгоок к комнатной температуре и составляет около 25°С (Chatterjee J and Meighen EA, 1995). В течение первых 90 мин инкубации происходил постоянный и значительный рост интенсивности свечения клеток в связи с активацией функций SOS-ответа, затем нарастание сигнала (на единицу оптической плотности культуры) существенно
P .MogfltiMDN
рВЙ 322 \ J pöft 322
Wil 44U,P j wQ 44
W
Рис. 2. (A) Конструирование плазмиды pPLS-1. Полилинкер из плазмиды pUC18 показан как треуголышк(и), стрелка -SOS промотор гена cda плазмиды ColD; указаны сайты рестриктаз, использованных при клонировании. (В) Последовательность 5'-кондевого фрагмента lux оперона P. leiognathi 54D10 в pBRPL-1, и сравнение ее с соответствующей последовательностью из Р. leiognathi АТСС 25521.
Sph 1
SphI
UXSXIiLXS« а»т»н«пт
)i I X 1 I Г N I I •
Верхняя строка P .leiognathi 54D10 Нижняя строка Р. leiognathi ATCC25S21
замедлялось. Последующая инкубация культур при комнатной температуре в течение 1015 мин была достаточной, чтобы стабилизировать уровень люминесценции клеток и, тем самым, исключить влияние частичной обратимой инактивации люциферазы при ЗТС на уровень светового сигнала тестерных культур. Поэтому в дальнейших экспериментах мы использовали следующие периоды инкубации: 90 мин при 37°С и 10 мин при комнатной температуре при проведении тестирования химических веществ. Кривые роста культур в присутствии достаточно низких концентраций генотоксинов, как правило, не отличались существенно от кривой роста контрольной культуры, и значение фактора индукции (Р1=ь;*00к/Ъ|;*001, где Ь -уровень люминесценции культур в относительных единицах, а
ОО - оптические плотности культур) практически определялось из отношения интенсивности свечения клеток в присутствии генотоксина к свечению контрольной культуры. Однако, при больших концентрациях генотоксинов эффект их токсичности для клеток становился существенным, что приводило к значительному замедлению роста культуры. В этом случае коррекция результатов измерений люминесценции на единицу оптической плотности культур была необходимой. Следует отметить, что фоновое свечение клеток С600(рРЬ5-1) было значительно ниже, чем в неиндуцированной культуре ИШОНрВКРЫас), что свидетельствовало о высоком уровне репрессии помотора сс1а в неиндуцированной культуре клеток.
Время инкубации, мин
Рис.3. Кинетика SOS lux индукции митомицином С (ММС). Экспонентно растущая культура Е. coli C600(pPLS-l) in L-бульоне при OD560 ~ 0.2 обрабатывалась 100 (В) или 500 (С) пМ ММС. Фактор индукции, Fi, и концентрацию клеток (OD560) определяли после разных интервалов инкубации при 37°С, с последующей 0 (•), 5 (в), 10 (A), and 15 (▼) минутной инкубацией при комнатной температуре. Для сравнения, представлен рост необработанных клеток (А).
1.3. Индукция вОв-ответа под действием веществ - мутагенов (вОв /их тест).
Шесть веществ, генотоксические свойства которых достаточно изучены, были исследованы в качестве индукторов БОБ-ответа: митомицин С (ММС), Ы-мстил-М'-нитро-М-шггрозогуанидин (М№*ГО), налидиксовая кислота (КА), диметилсульфат (ОМЭ), формальдегид (СН20), перекись водорода (Н202). Эти вещества имеют разные механизмы мутагенного воздействия: ММС преимущественно индуцирует внутрицепочечные ДНК сшивки, Н202 - разрывы в цепях и модификацию оснований ДНК, и ОМ5
индуцирует алымирование осноапий, ЫА ингибирует ДНК-гиразу. Степень индукции (фактор индукции, р|) определяли как отношение интенсивности свечения бактериальной культуры, содержащей тестируемое соединение, к интенсивности свечения контрольной культуры: = Ь/Ьь Результаты измерений представлены на рис. 4. Видно, что пропорционально растет с увеличением концентраций анализируемых веществ (в определенных пределах концентраций) и коррелирует со степенью их генотоксичности. Высокие конце1гтрации веществ-мутагенов оказывают токсическое действие на клетки штамма. При этом наблюдается как падение уровня биолюминесценции, так и уменьшение плотности анализируемых культур (например, в присутствии более чем 5х10"5 МШО; 7,5x10"" М СН20; ЗхЮ"3 М Н202). Принято считать, что вещество является 805-индуктором, и, следовательно, проявляет мутагенные свойства, если в его присутствии уровень ЗОЭ-ответа клеток (то есть БОЗ-зависимой
экспрессии генов) возрастает в два раза по сравнению с фоновым. В таблице 2 представлены величины минимальных концентраций анализируемых веществ, индуцирующие SOS-ответ. Приведены также данные, полученные при использовании других бактериальных тест-систем.
Рис. 4. Кривые «доза-ответ» изменения фактора индукции люминесценции в присутствии разных концентраций - генотоксинов ММС, MNNG, NA, DMS, Н202, и СН20 (В), и относительная оптическая плотность культур, OD^/ODk (А), для штамма Я. coli C600(pPLS-1) после инкубации в присутствии генотоксина в течение 90 мин при 37°С и -I 10 мин при комнатной 1<f' температуре. Прерывистая линия - Fi=2.
Следует отметить, что ММС, МЫЫО, ЫА, ОМ8 и СН20 дают положительные реакции как в ЭОЗ-Хромотесте, так и в тесте Эймса, в то время как Н202 показывает генотоксичный эффект только в 808-хромотестс. В тесте Эймса нижний предел генотоксичности для ММС, М№>Ю и ОМв определен как количество ревертантов в присутствии 1нМ веществ. Для этих соединений тест Эймса является более чувствительным, чем методы анализа БОБ-ответа клеток.
Таблица 2. Чувствительность SOS lux теста к разным генотоксинам.
Генотоксин Нижний предел детектирования"
SOS lux тест SOS-chromotest4 Umu-testc Arnes testrf
ММС 4.3 х10'9М 1.7 х 10"8 1.5 x 10'7 2.3 x 10"'°
MNNG 7.1 х 10"7 М 5.0 x 10"7 2.0 x 10-6 3.6 x 10-9
NA 4.6 х 10"6М
DMS 7.5 х 10_i М 6.7 x 10"' 3.0 x 10"4 1.6x 10-6
Н202 8.3 х 10"5 М
СН20 6.5 х 10"4 М
UV (254 nm) 0.32 J/m2
у-излучение 2.56 Gy <5 ND 3-4
а- (Fi=2); ь-Quillardet, Р., et ai„ 1982 и Quillardet, Р., et al., 1989; Nakamura, S., Y. et al., 1987;d - Quillardet, Р., et al., 1982; Isildar, M„ et al., 1984; Kozubek, S., et al„ 1989.
В таблице 3 представлены данные по сравнению выживаемости клеток в присутствии некоторых концентраций генотоксинов с изменением оптической плотности культур. Как видно, степень выживаемости клеток с повышением концентрации
Вещество, М
мутагенов падает значительно быстрее, чем значення оптической плотности этих культур. Это не удивительно, т.к погибшие и неделящиеся клетки вносят свой вклад в значения оптической плотности, а также, могут вносить определенный вклад в уровень люминесценции культур. Однако, при концентрациях генотоксинов, на один-два порядка превышающих минимальные для развития ЯОЯ-отнета, токсический эффект на рост клеток практически не проявляется (сравнение данных таблиц 2 и 3).
Таблица 3. Сравнение изменения оптической плотности кульур и выживаемости клеток в
присутствии разных концентраций генотоксинов.
Вещество Концентрация, М Относительная оптическая плотность культур (OD/ODu) Выживаемость клеток (Ni/Nt)
н2о 1.0 1.0
ММС 1 х Ю"8 0.98 0.99
1 х 10"7 0.93 0.70
Ix 10"6 0.88 0.31
MNNG 1 хЮ"6 0.98 0.99
1 х 10"5 0.94 0.81
1 х 10"4 0.64 0.01
сн2о 3 х 10"4 0.96 1.10
7.5 х 10ч 0.90 0.69
1 х 10° 0.80 0.35
-^-Ч С**-1 РН£\ \ \ ь V
в
сш ^ " - Г ■ 1МИЦ-«—-. -^»„„.j-- у\га BUA \ №V V 4 ........."^»f ......"-.Two.
Рис 5. Кривые «доза-ответ» в присутствии веществ AC, BUT, САМ, ТЕС, и РНЕ для штамма Е. coli C600(pPLS-l) после инкубации в течение 90 мин при 37°С и 10 мин при комнатной температуре. Прерывистая линия -Fi=2.
10-1 10a 10-' Вещество, М
Вещества, не относящиеся к генотоксинам, например, ацетон (АС), н-бутанол (BUT), фенол (РНЕ), гидрохлорид тетрациклина (ТЕС), и хлорамфеникол (САМ), давали отрицательный результат в тесте (рис. 5). Следует отметить, что AC, BUT и САМ дают негативный ответ как в тесте Эймса, так и в SOS-Хромотесте (Mersch-Sundermann VU, et al., 1994). Для этих соединений значения Fi, как правило, меньше 1 во всем диапазоне тестируемых концентраций. Следовательно, пи одно из данных соединений не соответствует условию наличия генотоксичности (Fi>2), изложенному выше.
Полученные результаты свидетельствуют, что предлагаемый биолюминссцентный метод (БОтест) является высоко чувствительным. Величины мутагенного эффекта анализируемых веществ коррелируют с имеющимися в литературе данными, полученными с помощью теста Эймса, Хромотеста и ити -теста.
Потенциал генотоксичности может быть оценен по углу наклона кривой индукции (р|) при низких дозах генотоксина, где возрастание Р1 пропорционально дозе вещества.
Следует отметить, что биолюминссцентный метод определения уровня ЗОБ-ответа имеет ряд технических преимуществ по сравнению с колориметрическим, а именно: количественные измерения могут быть выполнены достаточно быстро, в течение одной или нескольких секунд, без добавления каких-либо дополнительных реагетов и на любой стадии роста клеток. Это может быть весьма существенным при выполнении работ по экспресс-анализу мутагенной активности большого числа химических соединений или мониторингу действия ДНК-повреждающих физических факторов.
1.4. Индукция вОв-отвста под действием ЦУ или у-нзлучений.
иУ излучение (254 нм) обладает высоким БОЙ-индуцирующим потенциалом для клеток Е. соИ С600(рР1.8-1), при этом нижний предел индуцирующей дозы составляет менее 1 Ут2 (рис. 6А и таблица 2). Область линейного увеличения люминесценции с ростом дозы составляет от 0,3 до 10 .Г/т1. При дозах более 10 Д/т2 плотность тесгерных культур по сравнешпо с контрольной культурой значительно снижается, однако увеличение уровня люминесценции культур наблюдается до доз <20 1/т2. Аналогичный эффект был получен в результате действия у-излучения на штамм С600(рРЬ5-1) (рис. 6В). Нижний предел обнаружения эффекта составил 2,6 йу, что было несколько ниже, чем при использовании других тестов на мутагенность (таблица 2).
Рис.6. Кривые «доза-ответ» для UV (254 нм) (А) и у-излучений (В). Fi и относительная оптическая плотность, OD/ODt, были определены для культур Е. coli C600(pPLS-l) после облучений и инкубации при 30°С в течение 120 мин. Прерывистая линия - Fi =2.
1.5. Анализ генотоксического действия комплексных соединений платины и сравнительная оценка их генотоксичности в эукариотической тест-системе.
Методы экспресс-тестирования на генотоксичносгь широко используются при поиске новых соединений с противоопухолевой активностью, многие из которых являются генотоксинами. Широкое применение комплексных соединений платины в качестве противоопухолевых препаратов в онкологии (РаггеП N е1 а1., 1993; Кс11аш1 ЬК., е1 а!., 1995) вызывает необходимость изучения механизмов их биологического действия и требует разработки систем эффективного скрининга биологической активности вновь
синтезируемых комплексов. Известно, что противоопухолевое действие данных соединений обусловлено их связыванием с клеточной ДНК, что приводит к образованию внутрицепочечных и межцепочечных сшивок между иурнновыми основаниями ДНК (Burnouf D., et al., 1987; Corda Y., et al., 1993). Комплексные соединения платины, вследствие их генотоксичности, являются эффективными индукторами системы SOS-ответа клеток E.coli (Visse R., et al., 1994). Правомерность выбора SOS -lux теста при изучении комплексов платины обоснована также тем, что, как известно, наиболее часто используемый в химиотерапии препарат, г(ыс-днхлордиамминоплатина(11) (цыс-ДДП), обладающая высокой противоопухолевой активностью, является типичным SOS-мутатеном (Fram RJ et al., 1986).
SOS'/шг тест был применен для оценки генотоксичности шести комплексных соединений платины: цыс-диамминодихлорплатины, (умс-диамминодинитроплатины, циклоплатама, транс-диамминодихлорплатины и двух транс- биядерных комплексов, структура которых представлена в таблице 4. Результаты тестирования этих соединений представлены на рис. 7. Из всех анализированных соединений, i/uc-ДЦП вызывала SOS-ответ при наименьшей концентрации и показала наибольшую индукцию интенсивности люминесценции, следовательно, ^г/с-ДДП проявляла наибольшее генотоксическое действие; транс-ДДП проявляла активность при примерно в 70 раз более высоких концентрациях н индуцировала почти на порядок более низкий SOS-ответ. Интересно отметить, что максимальную индукцию оба изомера показывали при одинаковой концентрации (100 мкг/мл). Это свидетельствует о том, что токсический эффект этих соединений на бактериальные клетки при концентрациях выше 100 мкг/мл становится преобладающим. i/uc-ДДНП, которая не связывается с ДНК ковалентно, практически не вызывала изменения уровня SOS-ответа клеток в исследуемом диапазоне концентраций (до 1000 мкг/мл) и не проявляла токсического действия на жщнсспособность бактерий.
Таблица 4. Комплексные соединения платины.
№ Вещество Структура Сокращение
1 i/1/с-диаммшюдихлорплатина ifw<r-[Pt(NH,)jCy цис-ЩЩ.
И т/кшс-диамминодихлорплатина m/7ahc-rPt(NH,)2Cl2l транс-ЩЦ\
Ш i/иодиамминодинитро платина i,uc-[Pt(NII,)2(N02)Cl2] цис- ДЦНП
IV Циклоплатам (циклопентил-амин)-S(-) малатоплатина (11))* [Pl(NII3)(NH2C1H„)raal] ЦПМ
V транс-6иядерный комплекс** транс-[Р1(ЫН))2СЖН2(СН2),КНг(МН1>С1Р1]СЬ Pt-672
VI m/мнс-биядерный комплекс** mpohc-rPt(NH3)¡ClNHí(CH.)6NH2(NHj)2ClPt]Cl2 Pt-716
* - получен П.А.Чельцовым в ИОНХ, Москва;
** - получены К.И.Яковлевым в СПХФИ, Санкт-Петербург.
ЦПМ вызывал ЗОЗ-ответ при значительно больших концентрациях, чем все другие исследованные соединения, при этом максимальный уровень БОБ-индукции для него был значительно ниже, чем для цис-ДДН. Это соединение показало выраженную токсичность при концентрации > 1000 мкг/мл. Биядерные триаминовые комплексы платины (РЫ572 и Р1-716) индуцировали невысокий ЗОЭ-ответ при концентрациях от 5 до 100 мкг/мл, оказывая при этом заметный токсический эффект на клетки бактерий при концентрациях, превышающих 10 мкг/мл. По уровню генотоксичности в ВОЪ-Шх тесте изученные комплексы можно расположить в следующей последовательности: а) при сравнении минимальных индуцирующих конце!гтраций чис-ДЦП < Р1-672 < транс-ДДП < Р1-716 < ЦПМ; б) по величине максимального генотоксического эффекта: цис-ЩЩ > ЦПМ = Р1-
672 > транс-ЩЩ > Pt-716; с) по уровню токсичности: г/ис-ДДП > Pt-672 = Pt-716> транс-ДДП>ЦПМ.
Рис. 7. Кривые «доза-ответ» (1)и токсическое действие(относительная оптическая плотность, СГО;/СЮк) (2) комплексов платины (средние данные из трех опытов), а - комплекс I, б - комплекс II, в - комплекс III, юно с Г. комплекс IV, д - комплекс V, е - комплекс VI. По оси абсцисс -конце!гграция комплексов, мкг/мл; по оси ординат - и СЮ,/(Жк1 в %.
5 10 100 ¡000 С
Все соединения, способные реагировать с ДНК, попадая в клетки, вызывают хромосомные аберрации, мутации, остановку синтеза ДНК и деления клеток, что позволяет использовать сравнительно простые тесты для скрининга ДНК-тропных соединений. Одним из них является тест на корнях проростков растений (Иванов В.Б., и др., 1988), основанный на способности цитостатиков ингибировать появление и рост боковых корней. Все комплексы платины с противоопухолевой активностью ингибируют рост корней как типичные цитостатики, что и позволило использовать этот тест при анализе описанных выше соединений (работа проводилась в лаборатории дб.н. В.Б.Иванова, Институт общей и неорганической химии, РАН).
При действии на корни наиболее выраженный антимитотический эффект наблюдали в присутствии цис-ДДП. Это выражалось в резком усилении ипгибирования роста корней при малых концентрациях ¡/»с-ДДП (от 1 мкг/мл) на третьи сутки после начала обработки и в полной остановке ветвения корней. Таким образом, цмс-ДДП, обладающая наибольшей противоопухолевой активностью (Lippard SJ, 1987), оказывается также наиболее активным соединением как в SOS lux тесте, так и в данном тесте, транс-ДДП и цис-ДДНП, в отличие от цкс-ДДП не обладающие противоопухолевым действием, практически не оказывали антимитотического действия на рост главного корпя и не останавливали его ветвения вплоть до самых высоких концентраций. ЦПМ, проявляющий высокую противоопухолевую активность при более высоких дозах, чем i/мс-ДДП, оказывал антимитотический эффект на рост корней и тенотоксический - в SOS lux тесте также при существенно более высоких концентрациях. Биядерные триаминовые
комплексы, обладающие в отличие от моноядерных некоторой противоопухолевой активностью, оказывали также слабовыраженнос антимитотическое действие, как и 505-индуцирующий эффект. Причем, удлинение СН2-мостика в соединении 14-716 приводило к заметному снижению его биологической активности по сравнению с Р1-672.
Таблица 5. Ингибирование роста корней кукурузы комплексами платаны (Ь -ннгибнрование роста, 1 день инкубации, 13 - ингибирование роста, 3 дня инкубации). Средние данные 3-5 опытов.__
Вещество Концентрация комплекса, мкг/мл Концентрация комплекса, останавливающаяобразование боковых корней, мкг/мл
1 1 10 1 100
Ингибирование роста корней кукур; /31,1, %
Ii h I. Ь Ii 1з
1 4 94 44 98 82 100 1
II 6 -4 30 13 75 97 не останавливает
III -4 4 0 -6 50 45 не останавливает
IV -12 -8 -13 35 26 96 100
V 1 0 7 58 75 95 100
IV 0 22 7 48 44 94 100
Таким образом, из шести соединений платины пять комплексов индуцировали SOS-ответ в SOS lux тесте. Из них только мранс-ДДП не обладает избирательным антимитотическим и противоопухолевым действием, хотя этот изомер может вызывать хромосомные аберрации у эукариот. Возможно, это определяется тем, что в отличие от цис-ДДП, комплексы ДНК с транс-ДЦП могут репарироваться, так как структуры аддуктов этих соединений с ДНК различны.
Как видно из представленных результатов, SOS lux тест может быть использован для анализа генотоксичности платиновых комплексов при скрининге вновь синтезируемых веществ. Этот анализ проводится за короткое время с использованием малых количеств изучаемых соединений. Проведение испытаний комплексов в про- и эукариотических системах дополняет друг друга и позволяет выявить ряд особенностей ДНК-тропного действия изучаемых веществ.
Следует отметить, что в последующем эффективность циклоплатама была продемонстрирована при химиотерапии мезотелиомы плевры, рака яичников, предстательной железы, множественной миеломы, в результате чего препарат разрешен Фармакокомитетом МЗ РФ для медицинского применения при этих заболеваниях (Горбунова В.А., РОНЦ им. H.H. Блохина, 2004).
1.5.1. Анализ генотоксичностп комплексных соединений платины с применением recF мутантных штаммов Е. coli.
В данной части работы исследована степень выраженности SOS-ответа в клетках Е. coli, несущих recF143 мутации гена, включенного в контроль репарации и рекомбинации, при действ)ш на них некоторых комплексов платины,
В качестве контрольного штамма использовали клетки Е. coli ABl 157 , в качестве мутантного варианта - клетки JC9239 (производные ABl 157, несущие recF 143 мутацию). Мутагенный эффект пяти соединений платины: цис- и транс-ДДП, ЦПМ, Pt-672 и Pt-716 тестировали с применением вышеуказанных рекомбинакгных штаммов, трансформированных плазмидой pPLS-1. цис-ДДП эффективно индуцировала SOS-ответ клеток AB1157(pPLS-l) в диапазоне концентраций от 1 до 200 мкг/мл. Максимальный
уровень SOS-ответа достигался при концентрации 100 мкг/мл, фактор индукции при лом составлял около 70. При концентрациях комплекса, превышающих 100 мкг/мл, токсический эффект i/ис-ДДП становился преобладающим, что сопровождалось резким падением оптической плотности тестсрных культур и, как следствие, значительным уменьшением их биолюминесценции. Мутация в гене recF приводила к увеличению чувствительности штамма JC9239(pPLS-l) к малым концентрациям цмс-ДЦП (фактор индукции Fi>2 при концентрации цис-ЩЩ >0,2 мкг/мл). Однако наличие recF мутации сопровождается усилением токсического эффекта г/ис-ДДП, который проявлялся при концентрациях комплекса >5 мкг/мл и, вследствие этого, максимальная величина Fi уменьшалась более чем в десять раз (Таблица 6).
Эффект уменьшения минимальных концентраций, индуцирующих SOS-ответ, значительно менее выражен для ЦПМ, практически отсутствует для транс-ЩЩ, а для биядерных транс- соединений платины (Pt-672 и Pt-716), наоборот, характерно увеличение минимальных SOS-индуцирующих концентраций.
Соединения платины имеют разные механизмы связывания с ДНК (Burnouf D., et al., 1987; Corda Y., et al., 1993). Так, цкс-ДДП образует внутрицепочечные сшивки с ДНК, преимущественно в виде аддукта [cisDDP{d(GpG)}] и, в меньшей степени, [cisDDP{d(ApG)>] и (cisDDP{d(GpNpG)}], в то время как транс- соединения образуют, в основном, межцепочечные сшивки (Bellon S.F., et al., 1990; Zou Y., et al., 1994). Антимитогенная активность транс- комплексов двухвалентной платины по сравнению с цис-ДДП по отношению к эукариотическим клеткам выражена незначительно или не проявляется вовсе.
Таблица 6.SOS-otbct клеток: АВ1157(pPLS-l) и JC9239(pPLS-l) на действие комплексов
платины.
Вещество ЧИС-ДДП ЦПМ транс- ДДП Pt-672 Pt-716
Штамм ABl 157 JC9239 АВ1157 JC9239 АВ1157 JC9239 ABl 17 JC9239 ABl 157 JC9239
Мин. Б05-индуцирующая концентрация (р1=2), мкг/мл 1 0.2 80 30 20 20 8 30 8 20
Макс, р! 62,5 6,4 6,7 5,5 3,8 2,5 7.2 2,8 2,2 2,3
Концентрация комплекса при макс. р|, мкг/мл 100 5 500 500 too 50 75 50 20 40
00/00к при макс. (в %) 72 88 85 73 63 70 82 69 85 79
Известно, что recF зависимая рекомбинация катализирует общую рекомбинацию в клетках Ecoli, несущих мутации гесВС, sbcß и sbcC (Sandler S.J., et al., 1993). Этот путь осуществляется продуктами экспрессии следующих генов: recA, recF, red, recti, recQ, ruvA и ruvC (Sawitzke J.A., et al., 1992). Показано, что повреждения ДНК, вызываемые UV излучением, репарируются с участием recF зависимой системы репарации и рекомбинации (Hegde S., et al., 1995). При этом recF белок способен связываться с одноцепочечными олигонуклеотидами, причем константа связывания достаточно высока (Griffin T.J., et al., 1990). Как правило, при наличии UV-индуцируемых повреждений ДНК или повреждений, индуцируемых блеомицином, в клетках, несущих recF мутации, наблюдается замедленное развитие SOS-ответа вследствие менее гагтенсивного
расщепления LexA репрессора (Hegde S., et al., 1995). Как видно m таблицы 6, подобный эффект имеет место при действии на мутантные клетки транс- соединений платины Pt-672 и Pt-7!6. В случае i/uc-ДДП и ЦПМ SOS-ответ в recF мутшгтных клетках развивается при гораздо более низких концентрациях этих генотоксшюв. Также, i/нс-ДДП значительно более токсична для recF мугагтных клеток.
Следовательно, тип аддуктов соединение платины - ДНК определяет процесс индукции SOS-ответа и его уровень, а также эффективность процесса репарации этих аддуктов разными клеточными системами репарации и рекомбинации.
Наиболее исследован процесс i/vrABC репарации i/uc-ДДП - ДНК аддуктов. Показано, что C/vrB-ДНК и f/vrAB-ДНК комплексы защищают от расщепления ДНКазоМ примерно 20 оснований нуклеотидов и оба типа аддуктов вырезаются в присутствии UvrC примерно с одинаковой эффективностью (Visse R., et al., 1992). В то же время, эти аддукты являются эффективными индукторами SOS-системы Е. coli (Burnouf D., et al., 1987).
Паши результаты свидетельствовали, что гес¥ система Е. coli также играет значительную роль в процессах утилизации 1<ыс-ДДП-ДНК аддуктов.
Показано, что аддукты ДНК-1/ыс-ДДП взаимодействуют с высокими константами связывания с рядом клеточных белков: HMG1 (Chow C.S., et al., 1995), hUBF (Treiber D.K., et al., 1994), ERCC-1 (Dabholtar M., et al., 1994), и др. (Billings P.C. et al., 1994). Этот вид взаимодействий i/ыс-ДЦП-ДНК аддуктов приводит к запрещению процессов транскрипции на соответствующей цепи ДНК. Следовательно, можно полагать, что данный эффект может в значительной мере определять цитотоксичность цис-ЩЩ Показано также, чш цис-ДДП оказывает цитотоксический эффект на многие, но не все типы опухолевых клеток человека (Farrell N et al., 1993). Поэтому, принимая во внимание, что в разных опухолях активируется разный набор регуляторных белков, можно было полагать, что взаимодействие цис-ДДП-ДНК аддуктов с белками данного типа клеток будет влиять на уровень цитотоксичности цис-ЩЩ для клеток опухоли.
В последние годы было показано, что биохимические механизмы цитотоксичности унс-ДДП включают, наряду со связыванием с ДНК, взаимодействие со многими другими молекулами в гетерогенных популяциях эукариотических клеток, формирующих опухоли, и резистентность к i/ыс-ДЦП рассматривается как мультифакгорный феномен, ведущий к ослаблению путей индукции апотоза (Sancho-Martinez et al., 2012).
1.6. Возможности проведения SOS lux теста в полуавтоматическом варианте в
микропланшетах или использования иммобилизованных клеток в тест системе.
Проведение SOS-lux теста может быть частично автоматизировано посредством использования микропланшетной техники и приборов, осуществляющих автоматическую регистрацию люминесценции и оптической плотности культур. Так, исследования генотоксичности мигомицина С (ММС), бихромата калия (К2Сг207) и хлорамфинекола (САР) были выполнены с в 96-луночных микроплашпетах, содержащих в каждой лунке 90 мкл культур C600(pPLS-l) и 10 мкл изучаемых растворов. Инкубацию культур проводили при 30°С, регистрацию кинетики роста люминесценции и оптической плотности осуществляли в течение 300 мин с интервалом в 10 мин на мультифункционалыюи люминометре Lucyl (Anthos Mikrosystem GmbH, Krefeld (Germany)). Низший предел генотоксичности для ММС и К2Сг207 в данном методе оценивался как 1,33 нг/мл (4x10 М) и 11 мкг/мл, соответственно. В присутствии САР, не являющегося генотоксином, наблюдался только токсический эффект этого соединения.
Одновременная и многократная автоматическая регистрация свечения и оптической плотности культур способствовала корректной оценке генотоксичности и цитотоксичности исследуемых соединений в большом диапазоне тестируемых канцентраций веществ. Использование микропланшетов делает возможным проведение скрининга большого количества препаратов в течение одного рабочего дня.
Также, возможность in vivo мониторинга SOS-ответа в SOS-fax тесте позволяет использовать иммобилизованные культуры клеток в режиме "on-line". Для получения агарозных гранул (0,1-0,3 мм) с иммобилизованными клетками C600(pPLS-l) I объем клеток смешивали с 1 объемом раствора агарозы (42°С) и медленно добавляли к 5 объемам соевого масла при интенсивном перемешивании. 1 мл колонка с этими гранулами представляла собой регистрационную ячейку, через которую пропускали в качестве элюента раствор М9 среды с 0,5% казаминовых кислот. Для индукции SOS-ответа, 10"6 М ММС добавляли в раствор элюента в течение 30 мин, и в дальнейшем колонка промывалась средой без ММС. Эксперимент проводили при 28°С и скорости протока среды 5 мл/ч; люминесценцию измеряли в течение 8 ч. Добавление ММС в среду вызывало значительную индукцию эмиссии света, излучаемого колонкой, причем через 3 час свечение индуцированного матрикса примерно в 100 раз превышало свечение аналогичной колонки с неиндуцированным матриксом.
Таким образом, тестерная культура в SOS-/ia тесте может быть использована в иммобилизованном виде и тест может быть легко адаптирован к использованию в варианте "on-line" для мониторинга загрязнений окружающей среды.
Заключение.
В ходе данной работы впервые была сконструирована тест-система (SOS-/ux test) оценки генотоксичности химических веществ и физических факторов (у- и UV-излучение), основанная на биолюминесцентном определении уровня SOS-ответа клеток Е. coli. Тест применен для оценки генотоксичности и общей токсичности ряда соединений платины, проявляющих противоопухолевую активность, в частности i/нс-ДДП и циклоплатама.
Следует отметил.: i) дальнейшие исследования подтвердили, что eda промотор является наиболее удачным выбором в тест-системе для скрининга генотоксинов с точки зрения баланса силы промотора и эффективности связывания с LexA белком (Norman A. et al., 2005); ii) использование генетически модифицированных штаммов Е. coli позволяет адаптировать тест для выполнения конкретных задач, что было продемонстрировано в рамках исследования соединений платины в настоящей работе, а также при изучении процессов мутагенеза клеток E.coli с разным репарационным статусом под действием у-излучения и ускоренных тяжелых ионов (Комова OB, автореф. канд. дисс., 2002, ОИЯИ, Дубна). Сконструированная тест-система нашла широкое применение при исследованиях общетоксических и мутангных свойств поялютантов (см. например, Масленникова (ИЭГМ, УроРАН), 2007; Кхатаб З.С. (Южный федеральный университет, г. Ростов-на-Дону), автореф. канд. дисс., 2013; Е. П. Гуськов, и др., (НИИ биологии при ЮФУ, г. Ростов-на-Дону), 2009); при разработке следующего поколения биоссисоров для оценки генотоксичности (SOS-LUX-LAC-FLUORO test (Rabbow Е. et al, 2003, Ношеск G et al., 2010 (DLR, Institute of Aerospace Medicine, Cologne, Germany)). Данная часть работы защищена 2-я патентами в Германии, частично финансировалась в 1995-1997 г.г. грантами 1NTAS (93-2850) и COPERNICUS (CIPA СТ-94 0122, European Commission).
Глава 2. Экспрессия синтетических генов в клетках Е. coli.
Развитие технологий рекомбинантных ДНК в начале 1970-х годов (Cohen SN, et al., 1973) стимулировало работы по экспрессии гетерологичных генов в клетках прокариот. Первый фармацевтический рекомбинантный продукт - инсулин человека - был разрешен к применению в 1982 г., и к 2009 г. более чем 150 рекомбинантных белков были лицензированы US Food and Drug Administration (FDA) и European Medicines Agency (EMEA) к использованию в фармацевтике (Ferrer-Miralles N, et al., 2009). В первых работах гены целевых белков обычно клонировали и экспрессировали в составе экстрахромосомных самореплицирующих ДНК-элемегггов - плазмид, и до настоящего времени большинство рекомбинантных белков сшгтезируется с использованием плазмид-содержащих штаммов-продуцентов.
Е. coli до сих пор остается одним из наиболее широко применяемых микроорганизмов при создании штаммов-продуцентов рекомбинашных белков вследствие: 1) хорошо изученной генетики бактерии, ее способности быстро расти на дешевых субстратах и наличия многих молекулярно-генетических методов ее модификации; 2). возможное™ получения «высоко-штатных» (high cell density cultivation) культур, что повышает выход рекомбинантных белков (Lee SY, 1996); 3) наличия широкого спектра генетически измененных штаммов Е. coli (несущих делеции генов протеаз, гесА мутации; штаммы с пониженной продукцией ацетата, экспрессирующие tRNA для редких кодонов и т.д.), что позволяет оптимизировать процесс с точки зрения метаболической инженерии (Waegeman H and Soetaert W., 2011). Тем не менее, экспрессии белков в Е. coli присущи некоторые крупные недостатки, среди них - отсутствие системы гликозилирования и секреции в кулиуральную среду рекомбинантных белков, недостаточно эффективная система формирования дисульфидных связей в белках (Вапеух F., 1999;. Kamionka M., 2011). Во многих случаях рекомбипантные белки формируют тельца включения (inclusion bodies), последующий рефолдинг которых тоже может представлять собой технологическую проблему (Вапеух F, and Mujacic M., 2004).
Высокий уровень синтеза рекомбинантного белка может инициировать стрессовый ответ или синтез белков теплового шока и усиление протеолиза в клетках штамма (Gill RT et al., 2000; Hoíliman F and Riñas U., 2004), что приводит к метаболическому «перегрузу» клеток и снижению скорости их роста (Bentley WE et al., 1990; Kurland CG., 1996).
В большинстве случаев требуется эмпирический подбор конкретных подходов для достижения высокоэффективной продукции рекомбиншггных белков (Jana S. and Deb JK, 2005). Стратегия оптимизации продукции включает ряд аспектов, таких как: дизайн экспрессионных векторов, подбор дозы генов, силы промоторов (регуляция транскрипции), обеспечение стабильности mRNA, инициации и терминации трансляции (регуляция трансляции), оптимизация состава кодонов генов, выбор клеток для штамма-продуцеша и подбор условий ферментации для регулирования и оптимизации уровня экспрессии белков в процессе культивирования.
Цитокины - это родовое название специализированных растворимых белков и пепггвдов, которые, действуя как гуморальные иммуномодуляторы на отдельные клетки или ткани, принимают участие в регуляции таких важных биологических процессов как гемопоэз, иммунный ответ, тканеспецифическая клеточная пролиферация, апоптоз. Их действие является антиген-неспецифическим, они способны воздействовать на любые клетки, содержащие соответствующие рецепторы и находящиеся в состоянии адекватной физиологической активности. К моменту начала работ по теме диссертации во многих научно-исследовательских центрах мира проводились интенсивные исследования по
изучению возможности использования цитокинов для диагностики и лечения различного рода патологий иммунной системы (Kindler V. et al., 1986; Okabe M., et al., 1992; Егорова и др., 1998; Martino et al., 2000), вирусных инфекций (Tovey et al., 1999), а также в комплексной терапии широкого спектра онкологических заболеваний (Tagawa, 2000; Bukowski, 2001). Также было показано, что экспрессия в клетках Е. coli генов цитокинов (например, интерферона а-2 (Nagata et al., 1980; Goeddel et. al., 1981) или GM-CSF (Burgess et. al., 1987)) позволяет выделить из бактериальных клеток биологически активные рекомбинантные белки.
В процессе настоящей работы был получен ряд плазмид-содержащих штаммов-продуцентов Е. coli, обеспечивающих продукцию некоторых цитокинов и факторов роста. Для этой цели были сконструированы различные варианты экспрессионных плазмид, обеспечивающих как цитоплазматическую локализацию целевых продуктов, так и, в случае hEGF, секрецию продукта (экскрецию) в культуральную среду.
2.1. Цитоплазматическая экспрессия синтетических генов в клетках Е. coli.
Основные структурные характеристики полученных в работе плазмид и уровни продуктивности штаммов представлены в сводной таблице 7.
Как видно из таблицы, в работе было использовано большинство из имеющихся на время выполнения работы методов оптимизации транскрипции и трансляции гетерологичных генов в клетках Е. coli. Так, в частности, транскрипция клонированных генов обеспечивалась с высокоэффективных прокариотических промоторов, узнаваемых как РНК полимеразой Е. coli, так и РНК полимеразой фага Т7. Для оптимизации трансляции использованы как метод организации искусственных сайтов связывания рибосом (RBS) (в ряде случаев с предварительным компьютерным расчетом потешиальной вторичной структуры 5'-концевых участков соответствующих mRNA), так и конструирование генов "гибридных белков" и гибридных оперонов с частично перекрывающимися генами ("TGATG-оверлаппонов"). Повышение уровня продукции целевых белков достигалось также путем изменения копийности рекомбинантных плазмид
Все это позволяло предполагать, что полученные рекомбиншпные плазмиды позволят обеспечить высокоэффективную экспрессию клонированных генов цитокинов и факторов роста, а также накопление значительных количеств целевых белковых продуктов в ходе культивирования соответствующих бактериальных штаммов-продуцентов. Описанию исследований экспрессии полученных рекомбинантных плазмид посвящены следующие разделы данной главы.
2.1.1. Модификации штаммов-продуцентов интерлейкина-З и интерлейкина-4
человека.
Ранее в СМП Химтек (ИБХ им Шемякина и Овчинникова РАН) были получены штаммы Е. coli, продуценты ишерлейкина -3 (hIL-З) (Луценко и др., 1992) - цитокина, обладающего очень широким спектром активностей и играющего важную роль в регуляции иммунного ответа, и продуценты интерлейкина-4, цитокина, стимулирующего пролиферацию активированных B-клеток, Т-клеток-хелперов, индуцирующего секрецию IgE и экспрессию низкоаффинных IgE-рецепторов (Батчикова и др., 1992)
Рекомбинаншая плазмида pTOTE2IL-3, несущая тандем двух промоторов и Ptoc, обеспечивала высокий индуцибельный уровень синтеза hIL-З (около 30% суммарного клеточного белка через 2 часа после индукции) в штамме Е. coli TGI. Однако для этого штамма было характерно накопление рекомбинантного белка в неиндуцированной
Таблица 7. Характеристики экспрессионных плазмид и уровни продуктивности штаммов.
Ген Штамм Плазмида Регуляция транскрипции Оптимизация трансляции Уровень продукции
hiL-3 TGI pIIL-3-tac 01 ¡'.'.-л RBS гена 10 фага Т7 (RBSio) 30% от £ белков
TGI pBTIL-3 m Pto'+Ota: RBS/o-7bp-ATG 40^5%
hIL-4 TGI pKfCTIL-4(2> P/ac RBS/o 10-12 мг/л
TGI pUCTIL-4(3) RBS* (проксим. часть) 20-25 мг/л
TGI pBTIL-4 01 P ¡ac +0/ac RBSW 50 мг/л (5мг/г влажных клеток)
hIL-452 TGI pBTIL-4d2 Рйо +Olac RBSÍO 30%
BL21DE3 (pETIL^4d2) Prr+Ote (Puc/ocI B векторе) RBS* jo 30%
ML-10 TGI pKKIL-10(2) P« RBSw <2%
TGI pBTIL-10<2) PfcK +0/UC RBS/0 <2%
TGI pBTIL-3-Xa-10<2> Р/ас+Ойе RBS/o; ген «гибридного белка» 5-конц. фр-тhIL-3-Xa-hIL-10 25-30% при репрессии Р,ос
TGI pUIL-3-Xa-10<2) P be RBS*ro> ген «гибридного белка» 5'-конц. фр-т hIL-3-Xa-hIL-10 20-25%
TGI pBTVarlL-10® Ptoc+Ota: RBSio с модиф. послед-ю между SD и AUG 15% (при замене Ser на Cys в положении «+2»)
hgdnf TGI pBT-GDNF Ptoc +0/ac RBSyo 17% (11-15% без инду ищи)
TGI pBT-lacI-GDNF Р/аг "НЗ/до (lad в векторе) RBSyo 40% (20% без индукции)
TGI placIQ-GDNF V,ac+Obc (lad4 в векторе) RBS« 44% (1-3% без индукции)
hkgf TGI pBT-kgf RBS;i)-7bp-ATG <0,6%
TGI pl-kgf P« -Ю/« RBSio; Добавочный ко дон Ala- (-1) 1-1,5%
Плазмида на основе вектора рКК223-3 с инактивированным геном гот (~3-х кратное увеличение копийности плазм иды (Atlung Т, 1999);
(2)-на основе рКК233-2;
(3) - на основе риС18;
Ген Штамм Плазмида Регуляция транскрипции Оптимизация трансляции Уровень продукции
hIL-lra BL21 pPR-TGATG-IL-Ira« P* Оверлаппон -(его '-cat'- 'trpE-TGATG-hIL-Ira) 7-10%
BL21DE3 рЕТ-hIL-lra(5) РфЮ RBS/o 37-40% (25% без индукции)
TGI pTacIL-lra(2) Pte+O;«- RBSio 30-35% (8% без индукции)
blFN-y BL21(DE3) pET-bIFN-у<5) фЮ RBS/o 20-25%
BL21(DE3) pET-22-bIFN-y ¡6) фЮ-Ote (lac 1 в векторе) RBSw 30%
BL21(DE3) pLac-bIFN-у<2> Pte RBS/o 17-20%
BL21(DE3) pTac-bIFN-y(2) Р^+О,« RBS;0 30-35%
культуре, что и являлось причиной нестабильности штамма при длительном хранении и многократных пересевах.
Штамм Е. coli TGlfpKKhlL-4-9) обеспечивал сравнительно невысокое накопление белка интерлейкина -4 в виде телец включения в количестве около 20 мг/л бактериальной культуры.
Оптимизация транскрипции и трансляции рекомбинантных генов в экспрессионных векторах позволила существенно увеличить продукцию интерлейкинов и стабильность штаммов продуцентов.
В случае IL-3, рекомбинантный ген был субклонирован в векторах с разным уровнем копийности: рКК223-3 с инактивированным геном гот и рКК233-2, под контроль /ас-промотора (плазмиды pIIL-3tac и pBTIL-З, соответственно). Причем, если первая плазмида содержала последовательность сайта связывания рибосом (RBS) гена белка 10 фага Т7, дистальная часть которого обеспечивала также стабилизацию в клетках соответствующих mRNA посредством связывания с 16S rRNA (е-последовательность) (Olins P.O. et al., 1989), а проксимальная часть имела последовательность AGGAGATATATCCATG. то вторая несла RBSio с укороченной на один нуклеотидный остаток последовательностью (AGGAGATATCATATG). Анализ уровней продукции белка IL-3 показал, что модификация проксимального участка RBS с изменением расстояния от последовательности Шайн-Дальгарно до ATG с 8 до 7 нуклеотидов при одновременном снижении копийности плазмиды в 2-3 раза (штамм TGl(pBTlL-3)) приводит к увеличению биосинтеза IL-3 приблизительно в 1,5 раза (до 45% суммарного клеточного белка) по сравнению с продуктивностью штамма TGl(plIL-3tac) (рис. 8, таблица 7). При этом существенно возросла стабильность штамма при длительном хранении и многократных пересевах. Полученный таким образом штамм-продуцент был использован для разработки лабораторного метода выделения и очистки рекомбинантного hIL-З из фракции нерастворимых бактериальных белков. В качестве базовой методики выделения была
<4) - на основе pPR-TGATG-1 (Mashko et al., 1990);
(5) - на основе pET-3b (Studier et al., 1990); (6,-на основе pET-22b.
выбрана процедура, описанная Луценко и др. (1992). Наиболее существенная модификация состояла во введении дополнительной стадии ВЭЖХ на обращенной фазе для повышения чистоты получаемого препарата интерлейкина (>96%). Определенная в опытах по стимуляции пролиферации активированных Т-лимфоцитов (Юттепа£1е е1 а1., 1988) удельная биологическая активность МЬ-З была не менее 106 ед/мг белка, что хорошо соответствовало известной из литературы активности природного и выделенного другими авторами рекомбинантного ЫЪ-З. Таким образом, за счет обеспечения более строго регулируемой транскрипции гетерологичного гена (удаления дополнительного
Ш. %
%
Рис. 8. Электрофореграмма суммарных клеточных белков штаммов TGI [pTOTE2IL-3] (2), TGI [pl-IL-3tac] (3), TGI [pBTIL-3] (4). 1 - маркерные белки (Pharmacia, Швеция). Бактериальные клетки выращены в присутствии IPTG.
12 3 4
конститутивного промотора) и вариации структуры RBS мы получили стабильные высокоэффективные штаммы-продуценты рекомбинантного hIL-3.
Для получения штаммов-продуцентов IL-4 были сконструированы экспрессионные плазмиды pBTU,-4, pKKTlL-4 и pUCTIL-4 (Таблица 7), несущие RBS гена белка 10 фага Т7, Кроме того, плазмида pBTIL-4 содержала дополнительный сайт связывания Lacl репрессора для снижения фонового конститутивного синтеза hIL-4. Плазмида pUCTIL-4, копийность которой в клетках примерно в три-четыре раза выше копийности остальных сконструированных плазмид, несла гораздо более слабый регулируемый промотор lac, который обеспечивал примерно 5-8-кратное уменьшение уровня транскрипции по сравнению с Ршс (см. например Птицын и др., 1990). Как видно из рис. 9, наибольший уровень синтеза hlL-4 через 4 часа продукции наблюдался в штамме TG1 (pBTIL -4) -
Рис. 9. Сравнение уровней продукции hIL-4.
1- штамм TG 1 (pKKhIL-4-9); 2 -TGl(pBTIL-4); 3 - TGl(pKKTïL-4); 4-TGl(pUCTIL-4).
Время индукции, час
около 5 мг/г влажных клеток. При этом до 90% клеток в культуре сохраняли рекомбинантную плазмиду. Максимум продукции hIL-4 в штамме TGl(pUCTIL-4) имел место через 2 часа после индукции и при дальнейшей инкубации клеток снижался. При этом через 4 часа продукции более 30% клеток теряли рекомбинантную плазмиду. Штамм TGl(pKKTIL-4) в исследованном интервале времени инкубации сохранял невысокий и примерно одинаковый уровень продукции liIL-4, но при этом в культуре наблюдалась быстрая элиминация плазмиды и частичный лизис клеток. Через 4 часа продукции менее 10 % клеток сохраняли резистентность к ампициллину.
Следовательно, наиболее продуктивным штаммом-продуцентом из рассмотренных является штамм TGl(pBTIL-4), обеспечивающий высокий уровень продукции рекомбинантного hIL-4 и стабильно сохраняющий свою продуктивность при длительном культивировании.
По сравнению с описанной (Kimmenade et al., 1988) процедурой выделения hIL-4, включающей разрушение клеток и получение нерастворимой фракции полипептидов, поэтапную солюбилизацию денатурированных белков в растворах хлористого гуанидина, последующую ренатурацию и две стадии хроматографической очистки, предложенная нами методика выделения hIL-4 включала модификацию используемых для денатурации и ренатурации буферных систем, содержащих, в частности, оптимизированные концентрации ß-меркагггоэтанола, что привело к увеличению выхода целевого биологически активного продукта. Чистота полученного по модифицированной методике препарата была не менее 95%, а удельная биологическая активность в тестах по стимуляции пролиферации активированных Т-лимфоцитов (Kimmenade et aJ., 1988) составляла более 10б ед/мг белка. В экспериментах по определению активности в качестве стандарта был использован препарат рекомбинантного hIL-4 ("Sandoz", Швейцария).
2.1.2. Делеционная форма ннтерлеГисина-4 человека - IL4-S2.
Ранее было показано, что в Т-лимфоцитах периферической крови человека и тимоцитах вместе с mRNA hIL-4 в результате альтернативного сплайсинга экспресируется ее делеционный вариант, у которого отсутствует участок нуклеотвдной последовательности, соответствующий экзону 2, а участки, соответствующие экзонам 1, 3 и 4, образуют непрерывную рамку считывания для природной делеционной изоформы hlL-4 - hII,-452 (Sorg RV.et al., 1993; Alms WJ et al., 1996). Содержание mRNA hlL-452 наиболее высоко в тимоцитах и BAL (bronchoalveolar lavage) клетках (Alamas SP et al., 1996), то есть экспрессия двух изоформ hIL-4 тканеспецифична, и, возможно, эти белки обладают разными биологическими функциями. Рекомбинантный hlL-452, полученный при экспрессии гена hil-4S2 в дрожжевых клетках (Atamas SP et al., 1996), ингибировал костимулирующее пролиферативное действие hIL-4 на активированные Т-лимфоциты периферической крови человека in vitro. Следовательно, hIL-462 имеет общие с hIL-4 клеточные рецепторы, являясь, таким образом, его природным антагонистом.
Последовательность гена hil-4 в плазмиде pUCTIL-4 (см. раздел 2.1.1) была использована для клонирования делеционного варианта гена интерлейкина-4 - hit-482. Фрагменты, соответствующие последовательностям экзона 1 и экзонов 3 и 4, были амплифицированы с использованием соответствующих олигонуклеотидных праймеров, дотированы, и полученная ДНК рекомбинантного гена hil-452 была субклонирована в составе векторов pUCTIL-4/ BamHl- Hindill (плазмида pUCTIL-4d2), pBTIL^/AM-tfmiflll (плазмида pBTIL-4d2) и pET22b(+)/Xbal-Hmdlll (Novagen, USA) (плазмида pETIL-4d2).
Рекомбинантный штамм TGl(pUCTIL-4d2) в условиях дерепрессии промотора Piac продуцировал hlL-452 в виде телец включения (рис. 10, дорожка 3) в количестве до 20%
от суммарного клеточного белка. Однако рост культуры существенно замедлялся уже через 2 ч после индукции биосинтеза гетерологичного белка, а через 3-4 ч наблюдался ее заметный лизис, что свидетельствовало о токсичности гетерологичного hIL-452 для клеток Е. coli. Базальный уровень экспрессии в среднем не превышал 2% (рис. 10, дорожка 2), а удельное содержание целевого белка в очищенном препарате телец включения составляло 45-55% (рис. 10, дорожка 4).
По сравнению с pUCTÍL-4d2, в плазмвдах pBTlL-4d2 и pETlL-4d2 ген /г/7-482 локализован под контролем более сильных промоторов Pte и ?т ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7. Регуляция транскрипции в штаммах TGl(pBTIL-4d2) и BL21DE3(pETIL-4d2) была усилена введением тандема операторов 0!ас (pBTIL-4d2) на фоне снижения копийности плазмиды (репликон pBR322) и генотипа lacP штамма TG1, или введением оператора 0/ж непосредственно за промотором Р77 (pETIL-4d2) на фоне увеличения дозы гена /ас/, входящего в состав вектора рЕТ22Ь(+), и Р/ос-зависимой транскрипции гена ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 в штамме BL21(DE3). Максимальная продукция hIL-452 для штаммов TGl(pBTIL-4d2) и BL21DE3(pETIL-4d2) составляла около 30% от общего клеточного белка через 2 ч с момента начала индукции (рис. 10). Таким образом, в обоих случаях удалось поднять продукцию целевого белка в полтора раза. Однако, базальный уровень экспрессии hIL-452 в штамме TGl(pBTIL-4d2) был в среднем в 2-3 раза выше, чем в штамме TGl(pUCTIL-4d2), что приводило к резкому
Рис. 10. Электрофореграммы препаратов суммарных белков штаммов-продуцентов hIL-452 и соответствующих им препаратов частично очищенных телец включения.
Дорожки: 1 -маркер молекулярных весов; 2,5,8 - неиндуцированные штаммы TG 1 (pUCTIL-4d2), BL21DE3 (pETIL-4d2), TGl(pBTIL-4d2) соответственно; 3,6,9 - индукция в течение 2 часов; 4, 7, 10 - тельца включения, частично очищенные неионным детергентом (TRITON X-100) в присутствии 0.5 М мочевины. Пунктирной рамкой выделены белковые зоны, соответствующие базальной продукции hIL-452 .
снижению стабильности штамма при хранении и культивировании. Возможно, это связано с неоптимизированной структурой тандема операторов Oiac (центры двух операторных участков разделяют 15 п.н.), что не позволяет усилить репрессию промотора РСк адекватно его «силе» на фоне эффективного RBS, даже несмотря на снижение копийности векторной плазмиды и генотип lacjñ штамма TG 1.
Напротив, штамм BL21DE3(pETIL-4d2) показывал наименьшую фоновую экспрессию hIL-452 (1-2%), был стабилен и имел наилучшие ростовые показатели. Благодаря особенности экспрессионных систем на основе ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 практически полностью переключать трансляционный аппарат
ШВШЯЖ 1 BL21DO I ТГЛ
1 pETIL-4d2] Щ 1 ipBTUL-Wl} I
67 кДа —► »У
— * V £: 4* - Si ~
30 кДп -►
"" « Ч !Г * .
20 «Да—* a" Ж 14 кЛ"
Щж " ^ . ^ ^^у
клетки на синтез целевого белка, тельца включения, образующиеся в процессе ферментации штамма BL21DE3(pETIL-4d2), характеризовались наибольшим удельным содержанием Ы1.-482 (60-70%), что являлось существенным преимуществом при реализации процесса ренатурации и очистки рекомбинантного цитокина. Последнее обстоятельство и определило выбор штамма BL21DE3(pETIL-4d2) в качестве продуцента рекомбинантного ML-482.
Успешное осуществление процесса ренатурации полипептида из «телец включения» зависит от учета особенностей формирования третичной структуры белка. hIL-4 принадлежит к группе цитокинов с характерной «up-up-down-down» топологией четырех структурообразующих а-спиралей, соединенных протяженными неструктурированными участками (Powers et al, 1992). Третичная структура hIL-4 стабилизирована тремя дисульфидными мостами, сформированными следующими парами цистеиновых остатков: Cys3-Cysl27, Cys24-Cys65, и Cys46-Cys99 (рис. 11). При этом свободные остатки Cys в молекуле белка отсутствуют. Участок межспиральной Н1-Н2 петли, отсутствующий в hIL-452, содержит цистеиновый остаток (С24 в структуре hlL-4), поэтому в молекуле белка один из оставшихся цистеинов должен оставаться иеспаренным. В настоящее время существуют две модели структурной организации делеционной формы интерлейкина-4. Согласно «консервативной модели», общая топология структурообразующих а-спиралей остается неизменной, при этом неспаренным остается аминокислотный остаток Cys65. Согласно «Flipw-модели, в результате делеции пептида, кодируемого вторым экзоном,
1 IS Hi 20 HKSDIIrL--jEUKTINSLTEQKTLgTElf^: 30* 40 Н2 50_
щш&Отфквгтияутнвв i
60 7с нз ер_
I-;£KETPjlLGb^qQrHg.K№LIRFbKRLD |
90 133 110 Н4
IFgiLWSL^GLSsfevKERKaST^ESFLEaLl
Рис. 11. Структурная организация ЫЬ-4 и Ы 1.-452. А - Первичная структура ЫЬ-4. Прямоугольниками указаны структурообразующие а-спирали. Серым цветом выделен участок аминокислотной последовательности, отсутствующий в Ы1_-4й2. В-Схематическая модель ЫЬ-4. Прямоугольниками указаны дисульфидные связи между цистеиновыми остатками. Пунктиром указано расположение делетированных в ЫЬ-482 аминокислотных остатков.
в структуре ЫЬ-482 происходит пространственная переориентация одной из четырех а-спиралей, формирующих структуру белка (Н1, рис. 11), что приводит к образованию новой дисульфидной связи СуяЗ-СуБбб, при этом СуэШ остается неспаренным (¿а\'угЛо\ е1 а!., 1997). Хотя рентгеноструктурный анализ ЫЬ-482 до сих пор не сделан, полученные косвенные данные о структурной организации этого белка (УаэШеу е1 а1, 2003) свидетельствуют в пользу «консервативной модели».
Таким образом, особенность методики ренатурации и очистки hIL-482 состояла не только в необходимости обеспечения корректного образования двух S-S мостов в процессе формирования третичной структуры hIL-452, но и в блокировании процесса агрегации (мультимеризации) частично или полностью ренатурированных форм белка, «катализатором» которого может служить остающийся неспаренным цистеиновый остаток. В этой ситуации определяющее значение приобретали следующие факторы: 1) степень гомогенности препарата телец включения, 2) подбор оптимальных значений концентрации белка на разных этапах его ренатурации, 3) оптимизированный по времени процесса ренатурации градиент редокс-потенциала белкового раствора, 4) правильный выбор типа хроматографической очистки ренатурированного белка и условий ее проведения. В таблице 8 приведены основные этапы разработанного нами метода ренатурации и очистки рекомбинантного hIL-452. Для получения максимально гомогенного по составу препарата телец включения разрушение клеток проводили в присутствии неионного детергента Triton Х-100, а последующие промывки осадка фракции нерастворимых белков - в присутствии 3 М мочевины. Восстанавливающие реагенты (ДТТ, меркаптоэтанол) на этом этапе не вводились из-за возможности потерь, связанных с частичным растворением телец включения. Данная методика позволила получить препараты телец включения с удельным содержанием целевого белка до 8090%. Осадок, содержащий тельца включения, растворяли в 100 мМ Трис-буфере pH 8.0 в присутствии 6 М гуанидингидрохлорида (Gn-HCl) и глутатионовой редокс-системы. Процесс ренатурации состоял из двух этапов. На первом, исходный раствор медленно разбавляли буфером, содержащим 0.5 М Gn-HCl в присутствии глутатионовой редокс-системы при pH 8.0 до конечной концентрации Gn-HCl равной 1 М. Выход растворимого белка при этом составил порядка 65%. На втором этапе проводили дальнейшее снижение концентрации Gn-HCl: сначала до концентрации 0,4 М диализом белкового раствора против 10 мМ натрий-фосфатного буфера pH 7.4, содержащего 0,2 М Gn-HCI и 0,1 мМ 2-меркалтоэтанола, а затем, до конечной концентрации 0,02 М диализом против того же буфера, но без Gn-HCl. Общий выход процесса ренатурации в данных условиях составил 41%.
Ионообменная хроматография hIL-452 на катионообмсннике SP-Sephadex G-25 с использованием «batclm-метода нанесения образца была использована для дополнительной очистки препарата ренатурированного белка. Чистота полученного препарата по результатам сканирования электрофореграмм фракций элюата, содержащих hIL-452, составляла не менее 90% (рис. 12).
Как известно, hlL-4 - мощный костимулятор пролиферации Т-лимфоцитов (Mitchell et al., 1989). Напротив, рекомбинантный hIL-452, полученный в результате экспрессии в клетках дрожжей Pichia pastoris, при 20-200 кратном избытке оказывал ингибиругащее действие на пролиферацию Т-лимфоцитов, активированных hIL-4, вне зависимости от того, какая из форм препарата - гликозилированный или негликозилированный hIL-452, использовались в данных экспериментах (Atamas et al., 1996). Механизм антагонистического действия hIL-452, по-видимому, состоит в прямой конкуренции между hIL-4 и его делеционным вариантом за связывание с общими рецепторами или другими клеточными детерминантами (Atamas et al., 1996). Таким образом, hIL-452 представляет собой уникальный пример регуляции биологической активности цитокина посредством генерации белка-антагониста в виде собственной изоформы.
Биологическая активность выделенного препарата hIL-452 была оценена с использованием клеток тимоцитов человека, стимулированных конканавалином А (СопА).
Стадия Концентр. Оп-НС! Редокс-потенциал Концентр, белка,мг/мл Объем, мл Выход, %
1 .Пиготовление препарата телец включения ЫЬ-482 36 мг 100
2. Растворение препарата телец включения ЫЬ-482 в денатурирующем буфере. 6М 2 мМ ОвН 0,2 мМ С^в 1,7 20 94
3. Ренатурация-стадия I. Снижение концентрации Оп-НС1 медленным разбавлением. Градиент 6М-1 М 2 мМ йвН 0,2 мМ С88С 0,1 220 61
4.Рснатурация -стадия II. Снижение концентрации Оп-НС1 с одновременной сменой буфера с помощью диализа Градиент 1 М-0,02 М 0,1 мМ 2-МЕ 0,06 220 40
5. Хроматография на ЗР-БерЬаёех в-25 - 0,1 мМ 2-МЕ 1 7,5 21
Рис.12. Ренатурация рекомбинантного ЫЬ-452. Дорожки 1 и 5- маркеры молекулярных масс; 2-препарат ЫЬ-4 (3 мкг.); 3,4 - препарат ЫГ-482, 0.5 и 1.5 мкг.
Тимоциты человека получали при оперативном вмешательстве для лечения пороков сердца у детей 3-5 лет. Ткань тимуса гомогенизировали и освобождали от эритроцитов и нежизнеспособных тимоцитов центрифугированием в градиенте плотности. Клетки в концентрации 106/мл культивировали в течение 72 часов в СОг-инкубаторе. Для стимуляции пролиферации тимоцитов в культуральную среду добавляли СопА до концентрации 0.8 мкг/мл, определенные дозы ЫЬ-4, МЬ-482 или их комбинации, после чего продолжали инкубацию в течение 72 часов. Уровень пролиферации клеток определяли по включению [3Н]тимидина. Пролиферацию тимоцитов определяли в трех повторах, рассчитывая среднее значение и стандартное отклонение. Процент ингибирования оценивали по формуле: 100*[1-(распад/мин для культур с ЫЬ-4 и ЫЬ-482)/(распад/мин для культур с ЫЬ-4)]. Как видно из данных, представленных на рисунке 13, препарат ЫЬ-452 ингибировал Ь1Ь-4-стимулированную пролиферацию тимоцитов и данный эффект усиливался с увеличением концентрации Ы1.-462. При замене в культуральной среде ЫЬ-452 на альбумин эффект ингибирования практически отсутствовал. Интересной особенностью ингибирующего действия ЫЬ-482 является эффект насыщения. Пятикратное увеличение дозы ЫЬ-452 (от 100 нг/мл до 500 нг/мл) приводит не более чем к 1,25-кратному увеличению эффекта ингибирования пролиферативной активности ЫГ-4 для всех использованных его концентраций (5 нг/мл -20 нг/мл).
Известно, что циклоспорин А (СэА) является ингибитором пролиферации стимулированных тимоцитов. Механизм действия циклоспорина связан с избирательным
Эффект ингнбированая. %
О S 10 t5 20 25 ML4. нг/ил
Рис. 13. Влияние рекомбинантного ЫЬ-462 на ЫЬ-4- костимулированную пролиферацию тимоцитов: А -эффект ингибирования в присутствии Ы1.-452. Дозы ЫЬ-452(нг/мл): 0 [1], 100 [2], 500 [3]. Б - Процент ингибирования оценивали по формуле: 100*[1-(распад/мин для культур с ЫЬ-4 и ЫЬ-452)/(распад/мин для культур с 1Ш..-4)] при концентрации ЫЬ-482(нг/мл): 500 [1], 100 [2] или в присутствии 500 нг/мл альбумина [3].
и обратимым изменением функции лимфоцитов путем подавления образования и секреции цитокинов и их связывания со специфическими рецепторами. Нами было показано, что характер зависимости «доза-эффект» для СэА и ЫЬ-482 практически одинаков (рисунок 14), а одновременное присутствие в культуральной среде обоих белков усиливает ингибирующие действие друг друга, что косвенно свидетельствует о наличии прямого взаимодействия рекомбинантного ЫЬ-462 с рецепторами ЫЬ-4 (детальное описание методов оценки биологической активности М1.-482 представлены в работах Птицын ЛР и др., 1999, и Смирнов СВ канд. дисс. 2003).
К^ИМП/МИН
Рис. 14. Ингибированне ЫЬ-4- костимулированной пролиферации тимоцитов рекомбинантным ЫЬ-482 и/или циклоспорином А (СзА). Концентрации СопА, СвА, и ЫЬ-482 одинаковы для каждого эксперимента и составляют 0.8 мкг/мл, 100 нг/мл и 200 нг/мл, соответственно. 1 -инкубация тимоцитов в присутствии ЫЬ-4; 2 - в присутствии ¡111.-4 и СвА; 3 - в присутствии ЫЬ-4 и ЫЬ-482; 4 - в присутствии ЫЬ-4, ЫЬ-482 и СбА.
10 15 20 25 htL-4, нг/мл
Подводя итог, можно сказать, что препарат негликозилированного рекомбинантного hIL-452, полученный путем экспрессии соответствующего гена в клетках Е. coli, обладает ингибирующим действием на hIL-4-зависимую стимуляцию пролиферативной активности тимоцитов, то есть, биологически активен.
2.1.3. Интерлейкин-10 человека - hIL-10.
Интерлсйкин-10 (hIL-Ю) был впервые обнаружен как продукт хелперных Т-клеток мыши типа 2 (Th2) и сначала получил название "фактор - ингибитор синтеза цитокинов" (cytokine synthesis inhibitory factor - CSIF) в связи со своей способностью ингибироватъ
синтез ряда цитокинов, таких как у-интерферон, интерлейкин-2, интерлейкин-3, фактор некроза опухолей, колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов, хелперными Т-клетками типа 1 (Thl). hIL-10 проявляет множественные биологические активности, в частности, костимулирует пролиферацию и дифференциацию В-клеток человека, тимоцитов мыши, Т-клеток, тучных клеток, регулирует биосинтез главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса B-клетками мыши (Moore KW, eî al., 1993). Предполагалось, что в связи с натичием иммунорегуляторных свойств hIL-10 будет иметь широкое клиническое применение, в частности, при разнообразных аутоиммунных заболеваниях, а также как потенциальное противовоспалительное средство.
Нами был получен синтетический ген hIL-10 и исследована возможность его экспрессии в клетках Е. coli с использованием нескольких экспрессионных систем. Дизайн искусственного гена hIL-10 был выполнен, исходя из опубликованной аминокислотной последовательности белка IL-10 (Vieira P., et al., 1991) с учетом встречаемости кодонов в клетках Е. coli (Andersson SGE et al., 1990).
Два первых варианта экспрессионных плазмид (pKKIL-10 и pBTIL-10) были получены путем клонирования последовательности гена в векторах рКК233-3 и pBTIL-3. Однако уровень экспрессии гена рекомбинантного белка в клетках Е. coli TG 1, несущих данные плазмиды, был очень низок, и hIL-10 не обнаруживался при SDS-электрофорезе суммарного клеточного белка (электрофореграммы не представлены). Таким образом, несмотря на использование двух вариантов RBS при прямой цитоплазматической экспрессии, мы не получили существенного уровня продукции hIL-10. Данный эффект может быть связан как с протеолитическим расщеплением синтезируемого белка, так и с особенностями структуры mRNA hIL-10. Как известно, структура 5'-нетранслируемой области mRNA оказывает существенное влияние на уровень биосинтеза белка. Показано, что вовлечение нуклеотидов, формирующих последовательности RBS, и/или стартового кодона AUG в двухцепочечные участки вторичной структуры mRNA, как правило, приводит к снижению эффективности процесса биосинтеза (Gheysen D, et al.,. 1982; deSmit MH et al., 1990).
Для исследования влияния структуры 5'-нетранслируемой области mRNA, прилежащей к AUG-кодопу, на уровень синтеза рекомбинантного белка 5'-концевой фрагмент гена /МО плазмиды pBTIL-10 был заменен на фрагмент следующей структуры: TNNNNN АТС (A/T)(G/C)N CCN GGN CA(A/G) GGT ANNNNN TAC (T/A)(C/G)N GGN CCN GT(T/C) CCA
где N - любой из четырех нуклеотидов в данной позиции в последовательности гена,
введенный с помощью синтетических олигонуклеотидов.
Частичная рандомизация (т.е. случайное встраивание в результате химического синтеза одного из возможных оснований в каждое конкретное место последовательности) 5'-концевого участка гена между SD последовательностью и кодоном шестой аминокислоты hIL-10, как мы полагали, позволит найти структуры mRNA, более эффективные для инициации трансляции. Использование последовательностей (A/T)(G/C)N в качестве кодона второй аминокислоты белка обеспечиваю возможность синтеза мутантных вариантов hIL-10, содержащих во второй позиции следующие аминокислотные остатки: Ser, Arg, Cys, Trp, Thr или терминирующий кодон UGA. Известно (Looman АС, et al.,. 1987), что тип аминокислоты во второй позиции последовательности также может влиять на уровень продукции белка а введение добавочного остатка цистеина может усиливать эффективность процесса формирования телец включения при синтезе рекомбинантного полипептида.
Серия плазмид pBTVarIL-IO, содержащих варианты последовательности гена hi!-\О, была получена при клонировании в векторе рВТ11.-10/ÄamHI-A/wiI фрагмента BamHl-EcoRV плазмиды pIIL-3tac, несущего промотор Ршс, два /ас-операторных участка и RBS гена 10 фага Т7, а также смеси рэндомизированных олигонуклеотидов.
Уровень продукции рекомбинатного белка в сорока клонах штамма TGl(pBTVarIL-10) анализировали методом SDS-электрофореза. Было показано, что только один клон TGl(pBTVarIL-10-2) в присутствии индуктора 1PTG продуцирует рекомбинантный полипептид с молекулярной массой 19 кДа в виде телец включения; продукт составляет около 20% суммарного клеточного белка (рис. 15). Во всех остальных случаях не было отмечено образования заметных количеств рекомбинантных продуктов. Результаты секвенирования соответствующих фрагментов ДНК рекомбинантных плазмид, выделенных из пяти клонов, представлены в таблице 9. Как видно, образование рекомбинантного белка (очевидно, в тельцах включения) имеет место только в случае мутантного варианта, содержащего Cys в качестве второго аминокислотного остатка.
Рис. 15. Электрофореграммы препаратов суммарного клеточного белка штаммов Е. coli TG1 (pBTVarIL-10-n), варианты 1, 2, 3, 36, выращенных в отсутствие IPTG (2, 4, 6, 8) и в присутствии IPTG (3, 5, 7, 9); 1 - маркеры молекулярных масс. Стрелкой указано положение целевого продукта
Таблица 9 .Структура 5'-концевой области рекомбинантных плазмид рВТVarIL-1 On.
Клон Последовательность 5'-концевого фрагмента Аминокислотны й остаток в позиции «2» Наличие рекомбинантного продукта
pBTVarIL-10-l tagacgATG TGA CCAGGGCAGGGT stop -
pBTVarIL-lü-2 taggaaATG TGT CCGGGACAAGGT Cys +(19 кДа)
pBTVarIL-10-З tccattATG TGC CCAGGGCAGGGT Cys -
pBTVarIL-lO-lO tgaccgATG TGA CCCGGTCAGGGT stop -
pBTVarIL-10-36 taaagaATG TCT CCTGGGCAGGGT Ser -
pBTIL-10 (исх) atatccATG TCT CCAGGTCAAGGT Ser -
Анализ формирования вторичной структуры mRNA мутантных вариантов белка hlL-10(Cys-2) показал, что для варианта, кодируемого плазмидой pBTVarlL-10-З, в отличие от pBTVarlL-10-2, характерно участие нукпеотидов последовательности SD и кодона AUG в формировании шпилечных структур, что, по-видимому, снижает эффективность трансляции mRNA (данные не представлены). Возможно, уменьшение скорости биосинтеза рекомбинантного белка замедляет процесс формирования телец включения и, как следствие, ведет к интенсивному прогеолигическому расщеплению растворимой формы hIL-10(Cys-2) цитоплазматическими протеиназами в штамме TGl(pBTVarIL-10-3). Следовательно, уровень продукции данного рекомбинантного белка в виде телец
кДа 1 2 3 4 5 6 7 8 9
" -I щ
включения зависит как от структуры mRNA в районе кодона AUG, так и от типа второго аминокислотного остатка в структуре белка. Появление остатка Cys-2 в структуре белка способствует образованию телец включения. Следует отметить, что нами анализировалась лишь малая часть из теоретически возможных вариантов струкгур (более 50000 вариантов).
Как известно, в ряде случаев достаточно хорошие результаты могут быть достигнуты при экспрессии рекомбинантных полипептидов в виде "слитых" белков.
Как было описано выше, плазмида pBTIL-З обеспечивает высокоэффективную экспрессию ML-3 человека. Сконструированная с использованием pBTIL-З плазмида pBTIL-3-Ю несла ген hil-10, "слитый" с 5'-концевым фрагментом гена hil-З (кодирующим N-концсвой фрагмент hIL-З размером 69 аминокислотных остатков) посредством спейссра, кодирующего олигопептид -Asn-Ser-G!n-Iie-. Штамм TGl(pBTIL-3-10) при выращивании без индукции /ас-промотора продуцировал рекомбинантный полипептид с молекулярной массой около 28 КДа, что соответствует гибридному белку "фрагмент интерлейкина-3 - интерлейкин-10", в количестве около 30% от суммарного клеточного белка (рис. 16).
Дальнейшая модификация данного экспрессионного вектора осуществлялась с целью, во-первых, введения фрагмента ДНК, кодирующего сайт расщепления протеазы Ха и, во-вторых, получения регулируемой экспрессии рекомбинантного белка.
кДа 1 2 3 J^ 5_
V -М, ft«! '"Л*
«шшшйш
— • щ
30 i; v . . : мтт шЩШ
ЧШ ^^
20 ;■
Для этого фрагмент £соШ-Вй/П плазмиды рВТ1Ь-3-10 был заменен на последовательность, кодирующую сайт расщепления для протеазы Ха (-Не-Ии-Оу-А^-), с использованием синтетических олигонуклеотидов. Штамм ТС1(рВТ1Ь-3-Ха-10) при выращивании в условиях репрессии /ас-промотора также обеспечивает достаточно высокий уровень продукции ЫЬ-Ю в виде "слитого" полипептида (около 30% суммарного клеточного белка) (рис. 16). Для более строгой регуляции синтеза гибридного белка была сконструирована плазмида рШЬ-З-Ха-Ю, экспрессия рекомбинантного гена в которой контролируется /ас-промотором. Плазмида была получена путем замены фрагмента ВатН1(Кленов)-А'М в плазмиде рВТШ-З-Ха-Ю на фрагмент Руи11-ХЬа1 плазмиды рисТ1Ь-4, содержащий последовательность /ас-промотора и дистальную часть ЯВБ гена 10 фага Т7. Штамм ТС1 (рШЬ-З-Ха-Ю) выращивали в среде ЬВ в отсутствие и в присутствии 1РТО. Как видно из рис. 16, в отсутствие индуктора синтез гибридного белка незначителен, в то время как в присутствии 1РТС уровень его сравним с таковым в описанных выше штаммах.
Рис. 16. Элекггрофореграмма белков штаммов TG-1 (pBTIL-3-Ха-Ю) (2, 3) и TG1 (pUIL-3-Ха-Ю) (4, 5). Клетки выращивали либо в отсутствие (2, 4) либо в присутствии (3, 5) IPTG в среде. (1) - белки бесплазмидного реципиентного штамма.
Таким образом, было показано, что в клетках Е. coli может бьггь получена высокоэффективная цитоплазматическая экспрессия hIL-10 в виде "слитого" белка. Проведенные нами предварительные эксперимешы по выделению и очистке данного рекомбинангного продукта свидетельствуют, что гомогенный препарат может быть получен с использованием стандартных процедур выделения телец включения путем растворения их в денатурирующих условиях и перевода "слитого" белка в растворимое состояние в условиях, обеспечивающих его ренатуращпо. Следовательно, препарат может быть использован дня получения зрелого hIL-10 человека при протеолитическом расщеплении его протеазой Ха.
2.1.4. Нейротрофиц глиалыюго происхождения человека - GDNF.
Нейротрофин глиального происхождения человека (Glial Cell Derived Neurotrophic Factor, GDNF), был впервые выделен и исследован в 1993 году. Оказалось, что данный белок способствует выживанию эмбриональных допаминергических нейронов среднего мозга, дегенерирующих при болезни Паркинсона (Lin et al., 1993), и является ростовым фактором для спинномозговых моторных нейронов (Henderson et al., 1994). Было показано, что GDNF способствует регенерации сенсорных аксонов при травмах позвоночника (Ramer et al., 2000), участвует в процессах сперматогенеза (Meng et al 2000) и морфогенеза ночек (Pichel et al., 1996). GDNF обладает большим терапевтическим потенциалом и может быть использован для лечения многих нейропатологий, включая болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз и др. (Lin et al., 1993; Lin et al., 1994, Hunot et al., 1996; Bohn 1999; Ozawaet al., 2000).
Часто при экспрессии гетерологичных генов в Е. coli возникает проблема присутствия в структуре данных эукариотичесхих mRNA так называемых «редких» кодонов, соответствующих, как правило, слабо представленным в общеклеточном пуле Е. coli молекулам tRNA (Gouy et al., I982;Ikemura 1985; Kane 1988; Brinkman et al., 1989; Gutman et al., 1989, Chen et al., 1994).
Вопрос об актуальности этой проблемы для гстерологичной экспрессии GDNF был впервые поставлен в работе (Liew et al., 1997). Было показано, что максимум продукции целевого белка в клетках Е. coli, достигаемый при экспрессии природной cDNA gdnf в системе рЕТ под контролем Т7-промотора и RBS гена ipW, не превышает 3% от общего клеточного белка, несмотря на интенсивное накопление соответствующей mRNA. Однако, при экспрессии этой cDNA в виде слитого гена с 5'- проксимальными участками генов, кодирующих N-концевые фрагменты тиоредоксина (105 аминокислот) и глутатион S-трансферазы (220 аминокислот), был достигнут существенно больший уровень продукции слитых белков Trx-GDNF и GST- GDNF (соответственно 17% и 13% от общего клеточного белка).
Анализ природной последовательности cDNA, соответствующей зрелому белку GDNF, обнаружил присутствие в ней большого числа редких кодонов. Так, 16 аргининовых кодонов представлены триплетами AGA (8 кодонов), AGG (4 кодона) и CGG (4 кодона). При этом 4 из них образуют два тандемных кластера AGA11AGA12 и CGG31AGA32, а 9 локализованы в пределах первых 40 N-концевых аминокислот (рис. 17). Возможно, именно первичная структура mRNA hgdnf (в первую очередь, область первых 100 - 120 пуклеотидов) является негативным фактором, влияющим на эффективность процесса трансляции. Поэтому в синтезированном нами гене в первых 120 нуклеотидах кодирующей части mRNA hgdnf были заменены все триплеты, относительная частота использования которых в Е. coli (р) в 2 и более раз меньше этого параметра для наиболее встречающегося синонимичного кодона. Так, все аргшпшовые кодоны AGA
(p=0,05), AGG (р=0,03) и CG G (р=0,1) были заменены на триплеты CGT (р=0,38) или CGC (р=0,38). Пролиновый ССА (р=0,2) и глутаминовый CAA (р=0,34) кодоны были заменены на CCG (р=0,51) и CAG (р=0,66). В остальной части гена hgdnf была произведена модификация всех указанных выше аргининовых кодоиов и замена изолейцинового триплета ATA (р=0,09) на синонимичный кодон АТС (р=0,4) (рис. 17).
r.rw.: л. з-л.- Г" ii 21 21 41 fl Zcoï.l M S F t-KQvÄVL?RHER t* -"TítátgtCáccgjáteSAcagritvgr.sgttcttecAcgtcgtgaac t-rA^aratvSaacaaiatsgc>gcttccta'gáagagAgó
Пгирсз. gdr * €1 ii il ¿1 iOi Ш HRÇAAAA S ? S nsrgkc-rrgq gta»eo«fcc&ngc^gcageagctaarccagaaa*etctcgfcggta:-ia^t:ogtegotfgta
^тнте--. П7-irr-: л, 9-Л7 f 221 m 141 .151 ie: 111 ftgknrfîcvltalhlhvtbl O aaegtggt2àa&âcegt~çtt.gcgtactgac>;!caatecaeetgaacgtt£rtgatet<Tg
Синтез. 5Í- f i3i iai ZC-Î 2ii 2zi lgyetkee I î Г R Y с s g s с i a qc-rtgggttaeqa*accaaagaaga*ct<iat" ttcogttacL^ctctggttcttsic^ats
с-лытет. ПЕир.-д. Э-.1Г 241 251 2-íl 2~l 23i 251 aetty dkilkslsrhrrlvs cacrtaaaaet*ceteCvóc¿aAatcetqaí!*a3cctgfccfcegfcaace<jtC3cet£.:grttt r^gc-tgagae»aegc.c:c5%ca3.4at*ttgaààaàcttatecaga4atagaaggctçgtga
Пкиг-од. geir f 301 313 921 321 341 3Si dkvgç AC crplxpdddlsrl ctg*taaag«tggtc-3^:TcatTCtcrccgtccaatcgcattegaeg= tTsrctatcettco gtgacaaagtagggca-pç :ât?ttvcagacccAt cçcctttgatçatçacrtgtcgtttt
W«- gdr f 351 3"/1 331 3?1 itl 411 d D m I» v v H i lrkh s а к r с g c 1 tgsatgacaacctcgtt'íaTcataCtctgcgcaaacattcCeCíc ààc^ctst^gctgta ta-iätgataaretg^t vt.ggatgt.a
Синтет. Пгл^рсл qir f Hinilll fsp tctaaget tetga
Рис. 17. Первичная структура природной и «оптимизированной» cDNA hgdnf. Жирным шрифтом выделены все изменения нуклеотидного состава cDNA hgdnf. Серыми прямоугольниками выделены замененные «редкие» кодоны. Остальные замены произведены с целью оптимизации реакции отжига олигонуклеотидов в процессе сборки синтетического гена hgdnf Подчеркнуты области сопряжения олигоиуклеотидов по «липким» концам. Терминирующий кодон tga заменен на taa с одновременным введением в структуру гена сайта рестриктазы HindiII.
Хорошо известно, что вовлечение AUG кодона и SD-последовательности в образование стабильных шпилечных структур затрудняет доступ к этим сайтам 30S рибосомалыюй субъединицы и блокирует стадию инициации трансляции (de Smit et al., 1990; Hartz et al 1991). Поэтому в процессе оптимизации кодонового состава учитывалась потенциальная вторичная структура 5'-проксимальной области mRNA синтетического гена. Нуклеотидные замены проводили таким образом, чтобы и AUG кодон и SD-последовательность не входили в состав протяженных спиральных участков потенциальной вторичной структуры mRNA-транскрипта hgdnf (рис. 18).
AUG
Рис. 18. Потенциальная вторичная структура 5'-проксимального участка mRNA hgdnf. Представлены вероятные вторичные структуры 5'-проксимального участка mRNA hgdnf (первые 189 нуклеотидов, соответствующие: А) - природной последовательности gdnf, В) - синтетическому гену hgdnf). Для каждой структуры указаны значения свободной энергии спиральных участков (кКал/моль), локализация участка связывания рибосом (SD) и стартового кодона (AUG). Расчеты вторичной структуры РНК (метод описан в работе Смирнов СВ канд. дисс. 2003) проводились с помощью Web-ресурса GeneBee - Molecular Biology Server (http://www.genebee.msu.w/genebee.htSm).
EcoRI-Hindlli фрагмент, содержащий синтетический ген hgdnf с измененным составом кодонов, клонировали по соответствующим сайтам в составе вектора pUC18; правильность структуры гена была подтверждена секвенированием соответствующего фрагмента ДНК. Ген hgdnf в составе Ndel-Hindlll фрагмента плазмиды pUC18-gdnf был лигирован с Xhal-Nde] фрагментом плазмиды рЕТ-22Ь(+), содержащим 3'-проксимальную часть RBSio, после чего Xbal - HindlU фрагмент, содержащий синтетический ген hgdnf с подстыкованным к нему RBSio был субклонировали в составе вектора рВТ1Ь-4Ш>а1-HimB.ll (плазмида pBT-GDNF).
Штамм TGl(pBT-GDNF) продуцировал рекомбинантный hGDNF в количестве 17% от общего клеточного белка, что явилось прямым подтверждением гипотезы о негативном влиянии первичной структуры mRNA природного гена на эффективность его гетерологичной экспрессии в Е. coli. Существенным недостатком полученного штамма был высокий базальный уровень продукции целевого белка (11-15%), что, учитывая токсичность GDNF для клеток Е. coli (Suter-Crazzoiara el al., 1995), могло являться причиной нестабильности плазмидного штамма-продуцента при его культивировании и хранении. Для снижения фоновой продукции hGDNF в структуру плазмиды pBT-GDNF был введен ген репрессора лактозного оперона lacl. С этой целью BamHl-Pvul фрагмент плазмиды pBT-GDNF, содержащий ген hgdnf под контролем экспрессионного модуля Р1ас-2 CWRBSio (ER-5) (рис 19) и 5'-проксимальную часть гена Ыа, клонировали в составе вектора рЕТ15Ь/ BamHl-Pvul (рис. 19). Продукция hGDNF в штамме TGl(pBT-lacI-GDNF) была стабильна и составляла в среднем 40%. При этом возросла и фоновая редукция hGDNF, которая составила 20% (рис. 20). Следовательно, хотя увеличение дозы гена lacl значительно увеличило продукцию белка за счет стабилизации штамма-продуцента, базальная продукция hGDNF оставалась слишком высокой. Усиление контроля
экспрессии гена hgdnf было достигнуто путем клонирования в составе pBT-laci-GDNF аллеля lacP , усиливающего примерно на порядок экспрессию репрессора Lad.
С этой целью, с использованием в качестве матрицы ДНК F-фактора из штамма Е. coli TGI, был амгшифицирован с помощью ПЦР фрагмент ДНК, содержащий ген lacl4, и клонирован в составе вектора pBT-GDNF (рис.19). Продукция целевого белка в штамме TGl(placIQ-GDNF) возросла незначительно, до - 44%, однако фоновая продукция упала до 1-3% (рис 20). Такой базальный уровень экспрессии рекомбинантного белка уже не оказывал практически никакого влияния на стабильность штамма при его хранении.
Рис. 19.
Экспрессионные плазмиды pBT-lacI-GDNF и placIQ-GDNF.
ER-S -- - V
Ptac ОМс СУяс KBSIfl SD ATG
Рис. 20. Электрофореграммы препаратов суммарных белков штаммов- продуцентов hGDNF. Дорожки: 1 - маркер молекулярных весов; 2,4 -неиндударованные штаммы TG1 (placIQ-GDNF) и TG 1 (pBT-laci-GDNF), соответственно; 3,5 — штаммы, индуцированные 0,5 мМ 1PTG в течение 3 часов.
Таким образом, было показано, что для обеспечения эффективной продукции рекомбинантного hGDNF в клетках Е. coli необходимо и достаточно оптимизировать кодоновый состав и обеспечить строго регулируемую экспрессию соответствующего гена.
2.1.5. Фактор роста кератиноцитов человека - hKGF.
Фактор роста кератиноцитов человека, относящийся к семейству факторов роста фибробластов (FGF), был выделен из кондиционированной среды эмбриональных фибробластов человека и идентифицирован как FGF-7 (Rubin JS et al., 1989). hKGF обладает выраженной специфичной биологической активностью - стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток, не оказывая действия на фибробласты и эндотелиальные клетки. Этот фактор экспрессируется стромальными фибробластами многих эпителиальных тканей. Аминокислотная последовательность зрелого белка hKGF была определена, исходя из структуры cDNA (Finch Р et al., 1989) и данных по секвенированию N-концевого пептида (Rubin JS et al., 1989). Продукция рекомбинантных препаратов hKGF и серии его мутаятных вариантов с рядом последовательных делеций в
N-концевом домене была получена в клетках Е. coli с использованием Т7 системы экспрессии (Ron D et al., 1993). Было показано, что рекомбинантный препарат обладает митогенной активностью, в 10 раз превышающей таковую для природного KGF, и его мутантные варианты с делещ!ями до 10 N-концевых аминокислотных остатков сохраняют биологическую активность, сравнимую с интактным KGF.
С целью исследования возможности эффективной продукции hKGF в клетках Е. coli мы осуществили химико-ферментативный синтез гена hkgf. Первичная последовательность синтетического гена hkgf была определена на основании приведенных выше публикаций (Finch Р et al., 1989; Ron D et al., 1993), с учетом частоты встречаемости кодонов в клетках Е. coli. Последовательность основной части гена hkgf, ограниченная сайтами рестрикгаз EcoRl и Hindlil, была клонирована в векторе pUC 18/EcoIll-HindllL Полученная плазмида pUC-kgf-c несла фрагмент Xho\-Hind[\\, включающий 444 п.о. (с 49 до 492 нуклеотида) кодирующей части гена hkgf. Данный фрагмент использовали далее для конструирования экспрессионных плазмид.
Плазмида pBTIL-З (см. раздел 2.1.1), была использована в качестве вектора на первом этапе работы. В результате лигирования вектора рВТ!Ь-3/Л'со1-Я<исЛП с олигонуклеотидами, кодирующими 5'-концевую последовательность гена hkgf (\-48 п.о.), и АМ-Я/гкЛП-фрагменгом гена была получена плазмида pBT-kgf, в которой экспрессия зрелого белка hKGF контролировалась промотором tac. Ген содержал стартовый кодон ATG и последовательность ДНК, кодирующую зрелый белок hKGF, то есть последовательность Cys-32 - Thr-194 белка-предшественника (в соответствии с нумерацией, приведенной в работе Finch Р et al., 1989). Известно, что hKGF обладает высоким сродством к гепарину (Rubin JS et al., 1989), поэтому продукцию рекомбинантного белка в штамме Е. coli TGI (pBT-kgf), индуцированным 0,5 мМ IPTG, оценивали методом SDS-электрофореза связывающейся с гепарин-сефарозой фракции растворимого клеточного белка К сожалению, уровень продукции hKGF в штамме TGl(pBT-kgl) был невысок и составлял менее 0,6% суммарного клеточного белка (данные не представлены). Как известно, тип аминокислотного остатка во второй позиции в последовательности полипептида оказывает влияние на эффективность трансляции прокариотических белков и, в частности, Oys в этой позиции снижает эффективность трансляции (Looman А.С et al., 1987). Также, было показано, что включение А1а-31 (последнего аминокислотного остатка лидерной последовательности белка hKGF) в структуру рекомбинантного hKGF приводит к увеличению уровня экспрессии белка без изменения его биологической активности (Ron D et al., 1993). Поэтому нами была сконструирована экспрессжншая плазмида (pl-kgt), несущая модифицированный ген зрелого hKGF, включающий добавочный кодон А1а-31 белка-предшественника. Структура 5' -концевой последовательности гена hkgf и наличие добавочного кодона GCT после стартового кодона ATG в полученной плазмиде pl-kgf была подтверждена секвенировашгем соответствующего участка последовательности плазмиды.
Штамм TGl(pI-kgf) использовали для продукции рекомбинантного hKGF. Синтез белка индуцировали добавлением 0,5 мМ IPTG. Уровень продукции оценивали с помощью SDS-электрофореза фракции суммарного белка клеток, связывающейся с гепарин-сефарозой, и последующего денсигометрического сканирования полиакрнламидных гелей. Было показано, что количество рекомбинантного hKGF составляет около 1-1,5% суммарного клеточного белка.
Выделение и очистку hKGF проводили с использованием трех хроматографических стадий, что давало практически гомогенный препарат белка (по результатам SDS-электрофореза, рис. 21). Выход очищенного hKGF составляет около 0,5 мг на 1 л культуры
TGl(pI-kgf). Количество белка оценивали, исходя из Л2м = 140 для 1% раствора (Rubin JS et al., 1989). Молекулярная масса полипептида составляла около 21 kDa, что соответствует природному K.GF (рис. 21, г).
Как ранее отмечалось, KGF является достаточно токсичным продуктом для клеток Е. coli, а также интенсивно расщепляется протеазами цитоплазмы клеток в процессе его биосинтеза с образованием полипептидов массой 16-17 kDa в качестве промежуточных продуктов его деградации (Ron D et al., 1993). По-видимому, эти два эффекта существенно ограничивают возможность использования клеток Е. coli для достижения высокоэффективной продукции рекомбинантного hKGF. Уровень продукции hKGF в штамме TGl(pI-kgf) сравним с уровнем продукции данного белка в ранее описанной Т7-системе экспрессии в клетках BL21(DE3)plysE (Ron D et al., 1993). Однако мы не наблюдали образования значительного количества продуктов деградации с молекулярной массой 16-17 kDa при продукции hKGF в штамме TGl(pl-kgf). Возможно, это связано с некоторыми различиями в naöopt протеаз в цитоплазме использованных клеток-хозяев.
Рис.21. Очистка hKGF ионообменной (S-сефароза) (а, в) и аффинной (гепарин-сефароза) (б) хроматографией. Оси ординат: слева - оптическая плотность при 280 нм, справа - концентрация NaCl; сплошная линия - профиль элюции препаратов, прерывистая линия - градиент концентрации NaCl. Стрелкой указано положение пика hKGF; (г) - электрофореграммы препаратов маркеров молекулярных масс (1) и hKGF (2), фракция 25 (в).
Рис. 22. Стимуляция включения Зн тимидина эпидермальными клетками кератиноцитов человека препаратом рекомбинантного hKGF. Данные трех экспериментов, размер символа превышает величину стандартного отклонения.
■F 2400 -
Концентрация hKGF. иг/мл
Биологическую стимуляции включения
активность препарата рекомбинантного hKGF определяли по 3Н~тимидина эпидермальными кератиноцитами человека (ЭКЦ), культивируемыми в среде с низким содержанием ионов Са2+. Максимальный эффект действия hKGF (увеличение уровня синтеза ДНК на 68%) наблюдался при концешрации фактора 20 нг/мл (рис. 22). Эти результаты согласуются с данными (Márchese С., et al., 1990), показывающими, что пролиферативный эффект KGF проявляется при культивировании ЭКЦ в среде с низким (около 0,05 мМ) содержанием ионов кальция.
Следовательно, препарат рекомбинантного hKGF обладает биологической активностью, присущей нативному фактору роста кератиноцитов.
2.1.6. Рецепторный антагонист интерлейкина-1 человека - hlL-lra.
Для оптимизации экспрессии синтетического гена hlL-lra, любезно предоставленного нам проф. Ю.А.Берлиным (ИБХ РАН), первоначально был использован метод конструирования TGATG-оверлаппонов (Mashko et al., 1990). При этом конструирование рекомбинантных ДИК было проведено таким образом, что ген hlL-lra был дистально расположенным цистроном в составе гибридных оперонов, транскрибирующихся либо с промотора Рц фага X., либо с промотора cplO, узнаваемых РНК полимеразами E.coli и фага Т7, соответственно. При конструировании оверлаппонов использовалась структура межцистронной области trpE-trpD Е. coli для обеспечения высокоэффективной трансляции дистально расположенного гена за счет реинициации белкового синтеза рибосомами, транслировавшими проксимальную часть mRNA. Полученные штаммы Е. coli BL21 (pPR-TGATG-IL-lra) и BL21 (DE3 )(pET-TGATG-hlL-lга) после индукции (повышением температуры культивирования с 28 до 42°С или, соответственно, добавлением в сред}' культивирования 1PTG) обеспечивали накопление полипептида с молекулярной массой около 19 kDa, характерной для hlL-lra (рис. 23). При этом неожиданным явилось то, что более высокий уровень продукции наблюдался в случае использования для транскрипции гибридного оверлаппона промотора Рц. менее эффективного, чем поздний промотор фага Т7, возможно, вследствие нестабильности дисгалыюй части полицистронной mRNA. Применение оверлаппонов подразумевает, что при терминации трансляции mRNA проксимального гена 30S субчасгаца рибосомы не диссоциирует от матрицы, а получает возможность реинициировать трансляцию дистального цистрона. Поскольку этот процесс требует определенного времени, а транскрипция полицистронной mRNA в это время продолжается, то, фактически, несколько нарушается характерное для клеток прокариот сопряжение транскрипции и трансляции. Этот эффект может усиливаться в случае транскрипции оверлаппонов РНК полимеразой фага Т7, для которой скорость элонгации транскрипции в 3-5 раз выше, чем для РНК полимеразы E.coli. Хотя прямого определения стабильности mRNA нами не проводилось, однако, примеры снижения эффективности экспрессии генов, обусловленной нестабильностью свободной от рибосом mRNA при транскрипции РНК полимеразой фага Т7, хорошо известны из литературы (Yarchuk et al., 1992).
Необходимо также отметить, что 10%-ый уровень синтеза целевого полипептида ранее был получен в работе (Лебеденко ЕН и др., 1994) при транскрипции гена hlL-lra с промотора flO, но в результате создания других рекомбинантных плазмид.
Мы попытались увеличить накопление целевого полипептида путем создания рекомбинантных плазмид с «моноцистронной» локализацией экспрессирующегося гена за счет организации перед ним высокоэффективного RBS. На первом этапе использовалась нлазмида pIIL-3-Ю (см. раздел 2.1.3). Амплифицированный ген hil-lra клонировали в нлазмиду pIIL-3-Ю, в результате чего была получена плазмида pTac-IL-lra, в которой ген hil-lra находится под конторолем промотора Р,ас с дополнительной копией оператора лактозного оперона Oi„c и RBS гена белка 10 фага Т7.
Для конструирования экспрессионной плазмиды pET-lL-lra ген hil-lra из pTac-iL-lra клонировали в состав плазмиды pET-hIL-8 (Lomakin IB et al., 1993). в которой ген hil-8 был локализован в векторе серии рЕТ, модифицированном путем введения дополнительного терминатора транскрипции для РНК полимеразы фата Т7. В полученной
рекомбинантной плазмиде ген ИИ-1га находится под контролем сильного промотора фага Т7 - <р№ и КВЗю фага Т7.
Предварительный компьютерный анализ потенциальных вторичных структур 5'-концевых участков пЛЫЛ показал, что в них не должно происходить формирования нежелательных элементов вторичной структуры, и поэтому можно было расчитывать на эффективную экспрессию рекомбинантных молекул ДНК в бактериальных клетках.
Уровень продукции ЫЬ- 1га в клетках, несущих плазмиды рТас-ЫЬ-1га и рЕТ-ЫЬ-1га достигал соответственно 32% и 39% от суммарных клеточных белков через три часа после индукции (рис. 23). При этом, если под контролем Р,„с без добавления 1РТО в клетках регистрировалось не более 8% рекомбинантного полипептида от суммарных бактериальных белков, то использование системы экспрессии на основе РНК полимеразы Т7 приводило к накоплению до 25% ЫЬ-1га в неиндуцированной биомассе без каких-либо заметных изменений жизнеспособности клеток. Последнее обстоятельство может иметь существенное практическое и, потенциально, коммерческое значение для использования штамма с плазмидой рЕТ-ЫИга при организации крупномасштабного культивирования, так как избавляет от необходимости добавления дорогостоящего 1РТО без значительной потери в выходе целевого продукта.
кДа 1 2 34 5 67 89
Рис. 23. Электрофореграмма суммарных клеточных белков штаммов TGI (pTacIL-1га) (2, 3) и BL21(DE3), содержащих плазмиды pETIL-lra (4, 5), pET-TGATG-IL-lra (6, 7), pPR-TGATG-lL-1 га (8,9). Бактериальные клетки выращивались в условиях репрессии (2,4,6, 8) или дерепрессии (3, 5, 7, 9) промоторов. 1-маркерные белки.
В принципе, нельзя было исключать, что различие в уровне продукции hIL-lra обусловлено не только или не столько особенностями процессов транскрипции РНК полимеразами фага Т7 или Е, coli, а связано с разной представленностью внутриклеточных нротеаз в использованных штаммах. Клетки BL21(DE3), дефектные по двум генам {Ion, отрТ) системы протеолиза Е. coli, могли обеспечивать более высокую продукцию белка из-за его повышенной стабильности в клетке.
2.1.7. у-интерферон быка - bIFN-y.
Для обеспечения эффективной транскрипции полусинтетического гена bißt-у в клетках Е. coli на первом этапе была использована система экспрессии на основе РНК полимеразы бактериофага Т7 и узнаваемых ею фаговых промоторов. Компьютерный анализ потенциальных вторичных структур mRNA, способных образовываться при транскрипции с промотора (р10 плазмид серии рЕТ при интеграции в них гена у-интерферона быка показал, что можно ожидать достаточно эффективную инициацию трансляции этого цистрона в результате использования высокоэффективного RBS в составе вектора серии рЕТ.
Заметный уровень биосинтеза гетерологичного белка с молекулярной массой около 17 кОа, характерной для зрелого у-интерферона быка, наблюдался в клетках Е. coli BL21(DE3)(pET-bIFN-y). По данным SDS-электрофореза содержание рекомбинантного полипептида достигало около 20-25% от суммарных клеточных белков через 2-3 часа после индукции, что было значительно выше, чем описано в работах других авторов (например, Cerretti et al., 1986), при этом уровень фоновой продукции составлял 10 - 12%. При исследовании локализации bIFN-y в растворимой и/или нерастворимой фракциях бактериальных белков выяснилось, что основная часть синтезируемого полипептида (около 85-90%) была локализована в растворимой фракции.
Однако в ходе работ по оптимизации ферментации был вскрыт ряд существенных недостатков данного штамма. Это выражалось в: 1) сниженной жизнеспособности культуры при поддержании на твердых питательных средах; 2) высокой частоте потери рекомбинантной плазмиды при росте бактерий в жидкой среде (даже при добавлении антибиотика), что, по-видимому, было обусловлено высокой токсичностью bIFN-y для продуцирующих его бактериальных клеток.
Для создания штамма-продуцента с улучшенными технологическими характеристиками была предпринята попытка снижения «фонового» уровня синтеза целевого продукта. Было осуществлено конструирование двух новых рекомбинантных плазмид pBT-blFN-y и pET22-bIFN-y со строгой регуляцией экспрессии гена.
В составе первой плазмиды ген bifri-y был расположен под транскрипционным контролем промотора Ршс с дополнительной копией оператора лактозного оперона, а инициация трансляции обеспечивалась за счет RBS!0 фага Т7. Штамм Е. coli TGl(pBT-blFN-y) обеспечивал высокий уровень накопления целевого белка (около 35% от суммарных полипептидов бактериальной клетки), основная часть которого (90%) локализовалась во фракции растворимых клеточных белков (рис. 24). Штамм был стабилен при длительном хранении и культивировании на твердых и жидких минимальных средах.
Рис. 24. Электрофореграмма белков, синтезируемых клетками E.coli TG1 (pBT-blFN-y) в условиях до (2) и через 2 ч после (3-6) добавления 1PTG: 2, 3 - препараты суммарных клеточных белков, полученные разрушением бактерий путем кипячения в буфере с SDS и ß-меркаптоэтанолом; 4, 5 - фракции растворимых клеточных белков после У3-разр)'шения клеток в буфере при pH 8,0 и pH 10,0. соответственно; 6 -растворимые белки, полученные разрушением протопластов с помощью УЗ в буфере при pH 8,0 после удаления периплазматической фракции бактериальных клеток; 1,7- маркерные белки.
Однако было обнаружено, что при разрушении клеток ультразвуком в стандартных буферных системах наблюдалось протеолитическое расщепление рекомбинантного полипептида. Уровень протеолиза можно было снизить за счет повышения pH используемого при разрушении буфера до 10,0, либо предварительным удалением фракции псриплазматических белков, что свидетельствовало об участии периплазматических протеаз в процессе деградации целевого белка в клеточных
KDa
20 — 14— :
ЫГИ-7
3 4 5
б 7
экстрактах. В составе плазмиды pET22-bIFN-y, производной вектора рЕТ-22Ь, ген bifn-y находился под транскрипционным контролем гибридной промоторно-операторной области <р10-0(ос, а локализованный в плазмиде ген лактозного репреесора, lad, обеспечивал строго регулируемую и индуцируемую добавлением IPTG РНК полимераза фага Т7-зависимую экспрессию гетерологичного цистрона в клетках Е. coli BL21(DE3) (Giordano et al., 1989; Studier et al., 1990; 1991). Уровень накопления blFN- у составлял 3032% от суммарных клеточных белков, при этом разрушение клеток в стандартных условиях для последующего выделения интерферона не приводило к заметному снижению доли целевого продукта (рис. 25), по-видимому, вследствие существенного подавления протеолиза в реципиентом штамме (за счет наличия мутации по периплазматической протеазе ОшрТ).
Рис 25. Электрофореграмма белков штамма BL21(DE3)(pET-22-bIFN-y). (1, 2) - суммарные клеточные белки в отсутствие (1) и в присутствии (2) IPTG; фракция нерастворимых (3) и растворимых (4) полипептидов после индукции добавлением IPTG, (5) - маркерные белки
2.2. Экстраклеточная продукция эпидермального фактора роста человека -hEGF.
Эпидермальный фактор роста человека (hEGF), 6 кДа (53 аминокислотных остатка) полипептид, содержащий 3 дисульфидные связи, обладает рядом биологических активностей, связанных с эмбриональным ростом и регенерацией тканей (GreenhaJgh DG, 1996), и, в частности, играет ключевую роль в процессе регенерации эпителия роговицы глаза (Schuller S et al., 1996). Продукция рекомбинангного hEGF была получена с использованием целого ряда экспрессионных систем в клетках Е. coli (Smith J et al., 1982; Oka T et al., 1985; Kishimoto F et al., 1986; Батчикова HB и др., 1992), В. subtilis (Flock JL et al., 1984), дрожжах (Udrea MS et al. 1983; Hamsa P et al., 1998), B. brevis (Yamagata H et al., 1989). Как известно, hEGF в определенной степени подвержен деградации цитоплазматическими протеазами Е. coli, секреция же полипептида в периплазму клеток предотвращает его протеолитическое расщепление (I.e HV et al., 1991).
Для клеток Е. coli была показана возможность экскреции периплазматических растворимых белков посредством биосинтеза определенного количества белка Kil плазмиды ColEl (Kato С et al., 1986) или белка, обеспечивающего экскрецию бактериоцина (bacteriocin release protein - BRP) плазмиды pCloDF13 (Hsiung HM et al., 1989), что вызывает увеличение проницаемости внешней мембраны Е. coli для периплазматических белков и, как следствие, "вытекание" в культурачьную среду рекомбинантных белков, секретируемых в периплазму клеток. Предполагается, что белок Kil опосредованно способствует деградации пептидогликановой оболочки, возможно, за счет активации фосфолипазы А, локализованной на внешней мембране клеток Е. coli (Aono R, 1991).
KDa
1 2 3 4 5
Ранее в нашей лаборатории периилазматическая продукция hEGF была получена при экспрессии гена hegf, слитого с геном лидерной последовательности белка OmpF Е. coli под контролем промотора tac (Батчикова HB и др., 1992). Уровень биосинтеза hEGF в штамме Е. coli TGI, несущем плазмиду с двумя копиями слитого гена ompF-hegf, составлял около 10 мг рекомбинантного белка на 1 л культуры клеток, причем дальнейшее увеличение числа копий гена в экспрессионной плазмиде не приводило к увеличению накопления hEGF в периплазме клеток, но сопровождалось частичной экскрецией синтезируемого hEGF (до 30%) в культуральную среду.
Поэтому мы сконструировали экспрессионную плазмиду, обеспечивающую эффективную регулируемую экскрецию hEGF за счет одновременной индукции биосинтеза рекомбинантного продукта и необходимого для секреции периплазматических белков в культуральную среду уровня биосинтеза белка Kil.
Фрагмент (0.67 т.п.о.) ДНК плазмиды ColEl, содержащий последовательность гена kil (0.14 т.п.о.) и р-нсзависимый терминатор транскрипции после гена, посредством ряда генно-инженерных манипуляций был клонирован на плазмиде pUC18 по сайтам рестрикгаз Pstl и Hindlll под контроль промотора lac (плазмида pUKT). Однако уровень сшггеза белка Kil в штамме TGl(pUKT) в условиях индукции промотора оказался слишком высоким, вследствие чего при культивировании клеток в присутствии 0,2 мМ IPTG наблюдалось уменьшение оптической плотности культуры и частичный лизис клеток, сопровождавшийся появлением цитоплазматических белков в культуральной среде (по данным SDS-электрофореза, данные не представлены). Для снижения уровня продукции Kil по сайту Accl плазмиды pUKT был клонирован химически синтезированный модифицированный терминатор транскрипции Т„рЛ (31 п.о.) (плазмида pUTKT). Как известно, Т,гРл является сильным терминатором транскрипции (эффективность около 95%), поэтому для снижения "силы" терминатора обратный повтор, образующий в нем шпильку, был уменьшен на одно основание по сравнению с природным Т,грл. Выращивание штамма TGl(pUTKT) в LB-среде в условиях дерепрессии промотора lac не приводило к заметному лизису клеток, но сопровождалось "вытеканием" белков периплазмы клеток в культуральную среду.
Плазмида pPTK-hEGF2 была получена при лигировании трех фрагментов: вектора pUTKT/ffmdlll-PvuI; Hindlll-Bglll фрагмента плазмиды pTEGF, содержащего часть экспрессионной кассеты "промотор tac - "слитый" ген ompF-hegf, включающую 5'-концевую часть гена hegf, Bgtll-Pvul фрагмента плазмиды pBT-hEGFj (Батчикова HB и др., 1992), несущего последовательность З'-концевой части hegf и вторую копию слитого гена ompF-hegf с терминатором транскрипции Тгтц. Таким образом, сконструированная плазмида содержала две экспрессионные кассеты, имеющие общий механизм регуляции их экспрессии: 1) ген kil, фланкированный терминаторами транскрипции, под ко!ггролем промотора lac и 2) тандем "слитых" генов ompF-hegf под контролем промотора tac.
Полученной плазмидой трансформировали штаммы Е. coli НВ101 и TG1 и исследовали продукцию и локализацию hEGF, а также степень проницаемости внешней мембраны клеток для периплазматических белков при росте культур в условиях индукции промоторов tac и lac. Уровень сшггеза и локализацию hEGF определяли с помощью иммуноферментного анализа, а степень проницаемости внешней мембраны клеток оценивали по активности ß-лактамазы (в качестве субстрата использован PADAC) в периплазме клеток и культуральной среде (таблицы 10, 11). Штаммы E.coli TGl(pPTK-hEGF2) и HB101(pPTK-hEGF2) культивировали в среде М9 с добавлением 0,5% казаминовых кислот при различных температурах (30, 35, 37 °С). Для штамма TGl(pPTK-hEGF2) максимальная продукция hEGF наблюдалась при температуре культивирования
35°С и времени культивирования - 14 ч (таблица 10); для штамма НВ101(рРУК.-Ы£СР2) -при 35 °С и 18 ч (таблица 11). При этих условиях практически весь ЬЕйР находился в культуральиой среде, а в перигагазматической фракции клеток сохранялось менее 5% рекомбинантного полипепгида. Уровень продукции ЬЕСН (по данным ИФА) составлял около 25-30 мг белка на 1 л культуры. Процесс экскреции (3-лактамазы в данных условиях культивирования протекает также достаточно эффективно и более 90% белка обнаруживается в культуральной среде. Однако 35-45% суммарных периплазматических белков остается в периплазме клеток. По-видимому, вероятность процесса экскреции белков в значительной степени зависит от степени их взаимодействия с другими компонентами периплазмы и, в частности, клеточными мембранами.
Таблица 10. Уровни накопления рекомбинантного hEGF и ß-лактамазы в периплазме и культуральной среде штамма Е. coli TGl(pPTK-hEGF2)._
Время культивир-я Суммарный белок Накопление hEGF Активность Р-лактамазы
Периплазма Среда Периплазма Среда Периплазма Среда
ч мг/л мг/л мг/л % мг/л % мкМ/мин % мкМ/мин %
5 120 16 4,5 100 nd 0 1,5 83 0,3 17
14 240 420 1,7 5 30 95 1,6 8 17,2 92
16 280 430 1,3 5 26 95 1,5 8 18,0 92
18 300 430 1,3 6 20 94 1,8 9 18,8 91
Таблица 11. Уровни накопления рекомбинантного hEGF и ß-лактамазы в периплазме и культуральной среде штамма Е. coli HB101(pPTK-hEGF2)_
Время культивир-я Суммарный белок Накопление hEGF Активность 5-лактамазы
Периплазма Среда Периплазма Среда Периплазма Среда
ч мг/л мг/л мг/л % мг/л % мкМ/шин % мкМ/шин %
8 248 30 4,0 100 nd 0 2,75 73,3 1,0 26,6
16 320 380 1,9 7 26 93 1,75 10 16,2 90
18 320 400 1,4 4 32 96 1,5 9 16,0 91
20 280 420 1,2 4 26 96 1,9 10 16,2 90
Сконструированная нами система экскреции, основанная на одном типе регуляции экспрессии гена целевого полипептида и гена kil, позволяет осуществлять одновременную индукцию как продукции рекомбинантного белка, так и механизма, обеспечивающего его секрецию в культуральную среду в клетках E.coli.
При выделении hEGF из культуральной жидкости использовали кислотное осаждение для удаления основной части примесных белков, затем три стадии ионообменной и ВЭЖХ хроматографии. Количественные данные по выходу целевого белка на разных стадиях очистки препарата представлены в таблице 12. Концентрацию hEGF определяли методом ИФА. По данным SDS-электрофореза и обратно-фазовой ВЭЖХ чистота препарата превышала 97% (рис 26).
N-концевая аминокислотная последовательность выделенного препарата белка соответствовала (по результатам 25 циклов секвенирования) известной N-концевой аминокислотной последовательности hEGF.
Биологическую активность препарата hEGF анализировали в условиях in vitro и in vivo. Анализ включения [3Н]тимидина в ДНК клеток кератиноцитов и фетальных фибробластов человека в присутствии разных концентраций hEGF показал, что препарат
стимулирует синтез ДНК в районе концентраций 1-20 нг/мл; максимальный эффект набтодался при концентрациях 5-10 нг/мл. В тесте на открытие глаз новорожденных мышей (/я vivo) иа группах из 12 животных при дозе hEGF 200 пикоМ/г*д были получены следующие результаты: в контрольной группе открытие глаз наблюдали на 13-14 день, в опытной группе - на 8-9 день (методы определения биологической активности детально описаны в работах Альтман ИБ канд. дисс., 1998, Птицын JIP и Альтман ИБ, 1999).
Таблица 12. Выделение и очистка рекомбинантного hEGF.
Стадии очистки Суммарный белок hEGF
мг мг %
Культуральная среда 330 22,0 100
Осаждение примесей уксусной кислотой 60 15,6 71
Си-концентрирование 25 6,7 31
ОЕАЕ-Сефароза 12 6,1 28
О-Сефароза 5,9 5,6 26
С18-НРЬС 5,0 5,0 23
Рис. 26. Обращенно-фазовая хроматография hEGF на колонке p-Bondapak Сц: 10 мкг препарата hEGF, колонка 4.6 х 250 мм, буфер А: 0.1 % трифторуксусная кислота (TFA) в 4% ацетонитриле, буфер Б: 0.1 % TFA в 60% ацетонитриле, скорость протока 1 мл /мин (а); SDS-электрофорез hEGF в 18% ПААГ: 1 - препарат hEGF (25 мкг), 2 - hEGF (5 мкг), 3 - маркеры молекулярных масс.
Из приведенных данных можно сделать вывод, что рекомбинантный hEGF в процессе секреции и последующей экскреции в культуральную среду корректно процессируется лидерной пепгидазой клеток Е. coli и продуцируется в биологически активной форме. Следовательно, предлагаемая нами экспрессионная система обеспечивает достаточно высокую продукцию биологически активного рекомбинантного hEGF.
Заключение.
Таким образом, было показано, что оптимизация дизайна экспрессионных векторов, включающая подбор дозы генов, силы промоторов и эффективную регуляцию транскрипции, выбор оптимальных рибосом-связывающих последовательностей (оптимизация трансляции) в ряде случаев (штаммы-продуценты hIL-3, hIL-4, WL4-82, hlL-lra), явилась необходимым условием для получения высокого уровня продукции соответствующих рекомбинантных белков в виде телец включения в клетках Е. coli. Однако в ряде случаев, применение других стратегий повышения продукции целевых белков является строго необходимым, как то: i) модификация первичной структуры 5'-нетранслируемой области mRNA, оптимизация состава кодонов (штаммы-продуценты hGDNF, hIL-10), ii) использование клеток-хозяев, несущих мутации по клеточным
протеазам (штаммы-продуценты у-интерферона быка, hKGF), iii) щггоплазматическая продукши белков в виде их гибридных вариантов (штамм-продуцент hIL-10), или iiii) экстраклеточная продукция целевого белка (штамм-продуцент hEGF).
Разработаны методы выделения и очистки ряда субстанций рекомбинантных белков и показана их биологическая активнос ть в in vitro и in vivo (для EGF человека) тестах.
Субстанции белков hIL-4 и hIL-452 использовались в Институте инженерной иммунологии для структурно-функциональных исследований рекомбинантного делеционного варианта ингерлейкина-4; hIL-452 передан в Институт Цитологии Новосибирского отделения РАМН для изучения роли этого цитокина в ткане-специфической регуляции иммунных реакций на разных этапах онтогенетического развития. Штамм-продуцент hGDNF передан в НПЦ «Фосфосорб» для дальнейших исследований по изучению возможности создания на основе белка GDNF эффективных лекарственных биопрепаратов. Биологически активные субстанции hEGF и hKGF были использованы при выращивании атлогенных эпидермальных пластов (Институт биологии развития РАН), которые, в свою очередь, применялись для трансплантации больным при глубоких ожогах и незаживающих трофических язвах. Высокоэффективные штаммы продуценты рекомбинантного hIL-lra были переданы в ГНЦ РФ ГосНИИОЧБ (СанкгПетербург), где впоследствии были разработаны методы выделения и очистки целевого белка в препаративных количествах, показана биологическая активность hIL-1 га и начаты доклинические испытания препарата. Штамм £ coli BL21(DE3) [pET-22-bIFN-y] был передан в АО «МосАгроГен» для разработки промышленного регламента выделения и очистки рекомбинантного у-интерферона быка с целью последующего создания комбинированных препаратов ветеринарного назначения на основе природных и рекомбинантных интерферонов и цитокинов.
Данная часть работы частично финансировалась грантом ISTC Project #1880.
Глава 3. Оптимизация ряда биосинтетических путей в клетках Е. coli с целью
повышения продукции аминокислот.
Как уже отмечалось, задачу метаболической инженерии прокариотических штаммов-продуцентов низкомолекулярных веществ можно определить как целенаправленное изменение клеточной активности штаммов с целью перераспределения потока клеточных метаболитов таким образом, чтобы при сохранении технологических показателей (например, скорость роста бактерий) обеспечить образование целевого продукта за счет минимизации непродуктивных материальных (избыточный выброс СО2 и синтез побочных продуктов) и энергетических (оптимизация синтеза АТР и восстановленных эквивалентов) затрат (Bailey JE, 1991). Другими словами, синтез целевого продукта должен быть скоординирован с общим метаболизмом клетки.
Определенные запреты на использование плазмедсодержащих штаммов в крупных микробиологических производствах по соображениям их возможного нежелательного распространения среди микроорганизмов окружающей среды вызвали потребность в разработке подходов к конструированию нового поколения «бесплазмидных» штаммов-продуцентов. Поэтому современные подходы к созданию штаммов микроорганизмов дня производства целевых продуктов базируются на применении технологий рекомбинантных ДНК с целью изменения на уровне клеточного генома метаболических путей в клетках, используя модификацию активностей или свойств специфических ферментов,
координацию их экспрессии, индукцию «молчащих» или введение новых метаболических путей и т.д.
Описанию некоторых подходов с целью получения высокопродуктивных штаммов аминокислот посвящен настоящий раздел.
3.1 Модификация путей трапспорта нсточпиков углерода с целью увеличения
продукции аминокислот Е. coli штаммами-продуцентами.
До настоящего времени большинство промышленных технологических процессов основаны на использовании глюкозы или сахарозы в качестве источника углерода, при этом интенсивно исследуются возможности применения альтернативного сырья (спирты, пенгозы, углеводороды, жирные кислоты) для промышленных ферментаций. Способность клеток метаболизировать углеводы является решающим фактором для скорости роста клеток и их продуктивности. Следовательно, можно ожидать, что модификации систем транспорта углерода могут внести серьезный вклад в эффективность биотехнологических процессов.
3.1.1. Мутантные варианты пермеазы PtsG и исследование возможности
транспорта глюкозы белком EIIN°e.
Хотя основными транспортерами глюкозы в клетках Е. coli являются пермеазы PtsG и ManXYZ (компоненты фосфотрансферазных систем, PTS), в литературе описаны мутанты, способные утилизировать глюкозу посредством других PTS-зависимых пермеаз (MalX, BglF, FmA). В клетках дикого типа, растущих на глюкозе, синтез PtsG индуцируется, в то время как экспрессия manXYZ оперона репрессируется. Инактивация генов, кодирующих IICIc комплекс, снимает репрессию manXYZ, что сопровождается изменением скорости роста клеток на глюкозе (около 84% по сравнению с клетками дикого типа) (Gosset G, 2005). Также были описаны PTS независимые транспортеры глюкозы (MglABC, GalP, XylE, FucO), способные перемешать глюкозу внутрь клетки без ее фосфорилирования (см. например, Сливинская ЕА, канд. дисс., 2011). Реакцию фосфорилирования в этом случае осуществляет белок Glk. Значительное количество работ, посвященных увеличению эффективности транспорта глюкозы в клетку, было связано именно с модификацией активности PTS и, в частности, с усилением активности PtsG (Gabor Е, 2011). Нами были предприняты попытки модифицировать акивность PtsG сайт-направленным и спонтанным мутагенезом. Штамм TGlAptsGAmanXYZ, несущий рекомбинантную плазмиду с мутантным геном ptsG-43 (замены в последовательности белка: Ala263Val, Ilc359Leu), показал некоторое улучшение ростовых характеристик при росте на глюкозе и маннозе по сравнению со штаммом, несущим плазмиду с геном дикого типа (таблица 13). Мутации Ala263Val, lle359Leu в белке PtsG не были описаны в литературе (см. Котлярова ВА и др., Патент РФ 2335536), однако, по современным представлениям о возможной структурной организации PtsG, они локализованы в большой цитоплазматической петле между трансмембранными доменами VI и VII (Ala263Val) и в домене 355-371 аа. (lle359Leu), который, в соответствии с разными моделями белка, может иметь трансмембранную или цитоплазматическую локализацию (Gabor Е, 2011). Мутация Ile359Leu локализуется между известными мутациями, приводящими к так называемым "relaxed substrate specificity" и "uncoupled" фенотипам PtsG. Так как уменьшение времени удвоения клеток с мутантным PtsG-43 более выражено при росте штамма на среде с маннозой, то, по-видимому, данный мутант можно отнести к мутантах» с "ослабленной" субстратной специфичностью. Детального исследования каждой мутации на скорость роста штамма в рамках данной работы не проводилось.
Введение плазмиды с мутантным в штамм-продуцент треонина увеличивало
продукцию треонина (таблица 14) при сохранении ростовых характеристик штамма.
Таблица 13. Время удвоения штаммов на М9-среде с 0.4% глюкозой и на М9-среде с 0.4*'? манпозой.
Штамм Замены в послед-ти белка t удв (glc), час t удд (man), час ty3(man)/ tÍIB(glc)
TGI (pMW118) - 1,5 2,7 1,8
TG 1 AptsG (pMW 118) 4 4,3 1,07
TG 1 AptsGAmanXYZ (pMW118) - 8 >10 -
TG 1 AptsGAmanXYZ(p MW-ptsG-wt) - 1,4 2,4 1,7
TGlAptsGAmanXYZ (pMW-ptsG-43) Ala263Val, Ile359Leu 1,3 2,1 1,6
Таблица 14. Влияние амплификации мутантного гена р^С на продукцию треонина штаммом В3996. Условия культивирования: штаммы выращивались в пробирках при 37°С в течение 48-и часов на роторной качалке.
штамм OD5W Thr, г/л
B3996(pMWl 18-ptsG-wt) 13.5 10.7±0.7
B3996(pMW 118-ptsG-mut-43) 13.3 12.0±0.5
В ходе изучения возможности роста штамма MG 1655AptsGAmanXYZ на минимальной среде М9, содержащей глюкозу в качестве единственного источника углерода, было обнаружено появление спонтанных мутантов после 36-ти часов инкубации. Время удвоения (tyM) полученных мутантов составляло около 2-х часов. Исследование уровней экспрессии mRNA в данных мутантах методом "DNA Array'' показало более чем 20-кратное увеличение представленности mRNA гена nagE на фоне не столь значительных изменений уровня mRNA остальных генов (таблица 15). Данная индукция является опосредованной, так как секвенирование по методу Сэнгера регуляторной и кодирующей последовательностей гена nagE показало отсутствие мутаций в этой области хромосомы. Механизм индукции нами определен не был, однако было показано, что инактивация гена nagE в мутангных штаммах приводит к существенному увеличению времени удвоения клеток. Замена методом Red-зависимой модификации (Datsenko KA and Wanner BL, 2000) хромосомы регуляторной области гена nagE в штамме MG1655AptsGAmanXYZ на промотор tac привела к существенному увеличению скорости роста (tyM~2,3 час) штамма, из чего можно сделать два вывода: 1) в норме экспрессия этого белка при росте на минимальной среде, содержащей глюкозу как единственный источник углерода, отсутствует; 2) при искусственном увеличении уровня экспрессии белка скорость утилизации глюкозы системой EIlABCNag сравнима со скоростью ее утилизации основными PTS транспортерами.
Дивергентный оперон nagE-BACD кодирует белки, вовлеченные в транспорт внутрь клетки и деградацию N-ацетилглюкозоамина (GlcNAc). Ген nagE кодирует N-ацетилглюкозоамино-специфичный транспортер PTS, участвующий в импорте GlcNAc в клетку и в синтезе внутриклеточного GlcNAc-6-фосфата, в то время как гены nagBACD кодируют два фермента, которые катализируют деградацию GlcNAc-6-фосфата во
: VJ. MG1655.
Ген Отношение MG 1655AptsGAmanXYZ-mut./MG 1655 Функция
nagE 24,21 транспортер
Ы498 13,34 Предполагаемая сульфатаза
malE 7,81 Ма1КРОЕ - система транспорта мальтозы
malK 3,02
rbsD 7,03 Пираназа глюкозы
acs 5,42 Ас-СоА синтетаза
yhdM 4,47 активатор транскрипции
nmpC 4,44 Белок внешней мембраны
yjcG 4,10 Ацетат / гликолат транспортер
фрукгозу-6-фосфат (глкжозоэмнн-Р деаминаза, NagB) и N-ацетилглюкозоамино-б-фосфат (деацетилаза, NagA), транскрипционный регулятор nag регулона (NagC) и ген с нешвестной функцией, который, тем не менее, гомологичен функционально охарактеризованным фосфатазам (NagD) (Potsma, et al., 1996). Penpeccop NagC, кодируемый геном nagC, связывается с двумя операторами, которые перекрываются с промоторами nagE и nagB и образует репрессионную петлю ДНК (Plumbridge J and Kolb A, 1998). Экспрессия обоих генов nagE и nagB стимулируется образованием комплекса с сАМР/САР, этот эффект, в частности, изучен для nagE. Сайт связывания сАМР/САР расположен между двумя соответствующими промоторами, то есть находится внутри участка ДНК, образующего петлю. Регулон nag индуцируется параллельно GlcNAc и глгокозоамином (GlcN), но индукционные характеристики клеток при росте на GlcNAc и GlcN различны (Plumbridge J, 1990). Информация об импорте других Сахаров с помощью NagE практически отсутствует.
Фермент II (IINae), кодируемый геном nagE, содержит три функциональных домена IICBAN>S, объединенных в одном полипептиде. GlcNAc транспортируется через E1IC, и, следовательно, фосфат также переносится с EIIA через компонент EIIB на С6-гидроксилыгую группу импортированной молекулы GlcNAc. Сам EIIA фосфорилируется посредством фосфоенолпирувата (PEP), с участием основных ферментов PTS каскада (EI и НРт). Следовательно, NagE несет в себе и функцию Crr (catabolite repression regulator -регулятор катаболитной репрессии) в Сгг-зависимом транспорте карбогидратов и фосфорилировашш.
Для проверки влияния альтернативного пути транспорта глюкозы на продукцию треонина (Thr), кассета "Рцс-nagE" была введена в хромосому штамма-продуцента треонина MG1655Atdh::rhtA(pVIC40) а кассета "Pu^-nagE" - в хромосому штамма-продуцета аргинина "237". Продукция треонина в результате экспрессии nagE возросла на 30%, причем инактивация Crr путем делеции гена crr даже увеличила продукцию аминокислоты, а аргинина (Arg) - на 50% (при использовании более сильного промотора Puac) по сравнению с родительскими штаммами (таблицы 16 и 17). Этот эффект сопровождался некоторым уменьшением оптической плотности культур. Возможно, конкуренция между пермеазами ИВС№ и IIABCNas (NagE) изменяет характеристики потока глюкозы в клетку, что отражается на распределении ее между биосинтезом целевой аминокислоты и наращиванием клеточной массы.
Таблица 16. Влияние амплификации мутанпюго гена nagE на продукцию треонина.
Штамма OD540 Thr, г/л
MG1655Atdh, rhtA* (pVIC40) 30.5+0.4 6.0±0.3
MG1655Atdh, rhtA*, PtacnapE(pVIC40), Cm" 26.8+0.7 7.3±0.5
MG1655Atdh, rhtA*, P„tnagE, Acrr (pVIC40), CmR, TetR 26.5+0.6 8.1±0.3
" - Плазмида pVIC40 детально описана в патенте США 5,705,371
Таблица 17. Влияние амплификации мутантного гена nagE на продукцию аргинина.
Штамм OD540 Arg, г/л
237 20.4±0.4 3.5±0.2
237::PLtacnagE, CmR 20.2±0.5 5.2±0.3
3.1.2. Возможности использования этанола в качестве альтернативного источника углерода.
Одним из способов увеличения продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислот и уменьшения стоимости целевого продукта является использование альтернативных источников углерода, таких как спирты, в частности, этанол.
Алкогольдегидрогеназа (этанолоксидоредуктаза, AdhE) Е. coli является многофункциональным ферментом, который катализирует ферментативный синтез этанола путем двух последовательных реакций NADH-зависимого восстановления ацетил-коэшима А (АсСоА). AdhE синтезируется в больших количествах (примерно ЗхЮ4 копий на клетку) при анаэробном росте бактерий в среде, содержащей глюкозу, и образует спиральные структуры, называемые спиросомами, длиной примерно 0,22 мкм, которые содержат 40-60 молекул AdhE (Kessler D et al., 1992). Когда клетки Е. coli переводят из анаэробных условий культивирования в аэробные, транскрипция гена adhE уменьшается и поддерживатся в пределах 10% от уровня, наблюдаемого в анаэробных условиях (Membrillo-Hernández, and Lin, 1999). Трансляция mRNA AdhE регулируется РНКазой III (Membrillo-Hernández, and Lin, 1999). AdhE является основной мишенью при стрессе, вызванном перекисью водорода (Tamarit 3 et al., 1998).
Несмотря на обратимый характер реакций, катализируемых AdhE, штаммы Е. coli не обладают способностью к росту на этаноле в аэробных условиях, если спирт используется в качестве единственного источника углерода и энергии, поскольку в аэробных условиях снльно снижена транскрипция гена adhE, а белок AdhE инактивируется (metal-catalyzed
oxidation, МСО) (Leonardo MR et al., 1993).
Мутшггные штаммы Е. coli, способные расти в аэробных условиях на этаноле, были получены и описаны ранее (мутшгты с заменой Ala267Thr растут на этаноле со скоростью удвоения 240 мин; мутанты с заменами Ala267Thr и Glu568Lys - со скоростью удвоения 90 мин при 37°С, согласно данным Membrillo-Hernández J et al, 2000; Holland-Staley CA et al, 2000). Очевидно, что при катализе двух последовательных реакций в направлении, противоположном физиологическому, синтез АсСоА становится лимитирующей стадией. В противовес увеличению скорости реакции Vm„, при замене А267Т в белке AdhE, снижается термостабильность фермента и повышается его чувствительность к повреждению окислением (МСО). Введение второй мутации, Е568К, в AdhE (А267Т/Е568К) частично восстанавливает стабильность белка и устойчивость к повреждению МСО без улучшения каталитической активности фермента.
Сайт-направленным мутагенезом нами был сконструирован вариант гена adhE, несущий основную мутацию, ответственную за резкое снижение чувствительности белка к кислороду, Glu568Lys (в дальнейшем, adhE-IS) (Membrillo-Hernández J et al, 2000). Два варианта экспрессионных кассет: "PuaCadhE-Lys568" и "PLlac3dhE-wt", были получены и интегрированы с хромосому штамма Е coli MG1655Atdh, rhtA* методом Red-зависимой интегращш (детально процедуры клонирований описаны в Птицын и др., Патент РФ 2364628). Штаммы выращивали в среде М9, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода. Было показано, что родительский штамм MG1655Atdh, rhtA* и штамм с усиленной экспрессией (промотор PLtac) природного гена алкогольдегидрогеназы не способны расти на среде, содержащей этанол (2%) в качестве единственного источника углерода (данные не показаны). Штамм MG1655Atdh, rhtA*, P|lacadhE-Lys568 (adhE-18) после 25 ч инкубации демонстрировал слабый, но устойчивый рост на среде с этанолом (рис. 27).
О 20 40 00 00
Время инкубации, чае
Рис. 27 Кривые роста штаммов MG1655Дtdh, г!иА*(Рь1,-каёЬП-и1) и MG1655Дtdh, гМА*(Ри^ЬЕ-18) в среде М9, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода
В результате спонтанного мутагенеза штамма MG16S5Дtdh, гЫА*(айЬЕ-18) были получены варианты, демонстрировавшие ускоренный рост на этаноле (рис 28).
Рис. 28 Кривые роста штаммов МС1655А1ёЬ, гМА^Рь^аЗМЫР,), MG1655Дtdh, гМА*(Ри«аЛ1Е-1), М01655Д1(Ш, г1ИА*(Ри1саи11Н-13) и миезэмак г1иА*(1\,«ааЬЕ-м2) в среде М9, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода.
BpeWR мнкубации, час
Секвенирование гена adhE в данных клонах показало, что ген приобрел дополнительные мутации: клон adhE-l - РЬе566Уа1; клон adhE-IЗ - 01и560Ьуз; клон асйхЕ-м2 - множественные мутации 01и2201у, МеШ6Уа1, Туг461Су5, Пе5543ег, А1а786Уа1. Следовательно: 1) мы подтвердили литературные данные о недостаточной стабильности AdhE с единичной мутацией С1н568Ьуз; 2) получили более стабильные варианты AdhE с не описанными ранее мутациями, способными улучшить рост бактерии в среде,
содержащей этанол в качестве единственного источника углерода. Также было показано, что для хорошего роста клеток необходимым условием является усиленная экспрессия гена, кодирующего алкогольдегидрогеназу. Тем не менее, рост полученных штаммов на среде с этанолом характеризуется наличием достаточно протяженной лаг-фазы (периода задержки роста микроорганизмов, в течение которого бактерии адаптируются к новым условиям обитания), возникающей, по-видимому, вследствие необходимости включения процессов глюконеогенеза для обеспечения роста клеток.
3.1.3. Оптимизация метаболических путей клеток Е. coli для эффективного
биосинтеза целевого продукта при использовании сред, содержащих этанол.
Экспрессионные кассеты с мутантными вариантами гена adhE были интегрированы в хромосому штамма-продуцента треонина MG1655Atdh::rhtA(pVIC40) и полученные штаммы ферментировали в средах, содержащих этанол в качестве единственного источника углерода Результаты продолжительной (72 час) ферментации штаммов на минимальной среде с 2% этанолом показали, что как рост культур, так и продукция треонина выше при наличии в хромосоме экспрессионной кассеты с мутантным геном adhE-ul (таблица 18). Можно полагать, что множественные мутации обеспечивают более высокую активность и/или стабильность белка AdhE в процессе ферментации.
Таблица 18. Продукция Thr при ферментации штаммов на М9 среде с 2% этанолом (72 ч).
Штамм OÜ540 Thr, г/л
MG1655Atdh. rhtA* (pVlC40) 1.4±0.1 <0.1
MGI655Atdh, rhtA*, PL,«adhE-wt (pVlC40) 7.6±0.2 0.9±0.1
MG1655Atdh, rhtA*, PL,acadhE-18 (pVIC40) 13.7±0.4 2.3±0.3
MG165SAtdh, rhtA*, PLtacadhE-l (pVIC40) 12.5±0.3 2.1±0.3
MG1655Atdh, rhtA*, PLlacadhE-M2 (pVIC40) 14.3±0.3 2.8±0.1
MG1655Atdh, rhtA*, adhE-M2(pVIC40) 2.1±0.1 <0.1
Продолжительность ферментации является важным технологическим параметром. Поэтому для ускорения процесса синтеза треонина были проведены ферментации на средах, содержащих смеси глюкозы и этанола (таблица 19).
Как следует из данных таблицы 19, при ферментации на средах, содержащих смесь глюкозы и этанола в разном соотношении, штамм MG1655 Atdh,rhtA*,Pi.öcadhE-m2 (pVIC40) не может использовать эффективно этанол как источник углерода (биомасса клеток и продукция Thr уменьшаются на среде глюкоза/этанол = 4%/1,5% по сравнению с контролем), а небольшое возрастание продукции при росте на среде глюкоза/этанол = 4%/0,5% связано, по-видимому, с компенсацией недостатка NADPH, возникающего при биосинтезе треонина в данном штамме, за счет утилизации части этанола.
Результаты легко объяснимы из общих соображений: штаммы-продуценты треонина нуждаются в восстановленных эквивалентах, необходимых для эффективного функционирования пути биосинтеза треонина, но в тоже время избыточный синтез АсСоА негативно сказывается как на росте клеток, так и на продукции треонина.
Следовательно, для эффективной утилизации этанола необходимо перераспределение и согласование потоков метаболитов, образующихся при утилизации двух субстратов, глюкозы и этанола, клетками Е. coli.
Оптимальным, как будет показано ниже, является направление интермедиатов, образующихся из глюкозы в гликолигическом пути, в цикл трикарбоновых кислот через
Таблица 19. Продукция Thr при ферментации штаммов на М9 среде с глюкозой и этанолом (24 ч).____
Штамм Глюкоза/этанол= Глюкоза/этанол= Глюкоза/этанол=
4%/l,5% 4%/0,5% 4%/0,1 %
OD.M0 Thr, г/л ODjjii Thr, г/л OD, » Thr, г/л
MG1655 Atdh,rhtA* (pVIC40) 28.0 3.7 28.1 3.4 28.4 4.0
MG1655 Atdh,rhtA*,PLucadhE-m2 22.0 2.4 31.4 4.3 30.2 4.0
(pVIC40)
алаплеротический путь (посредством карбоксилировшшя фосфоенолпирувата ферментом Ррс). При этом возможна оптимизация соотношения оксалоацетата (ОАА), образующегося го глюкозы, и АсСоА - in этанола, на стадии синтеза цитрата в цикле трикарбоновых кислот. Такая возможность была нами показана на примере синтеза глутамата (Glu) штаммами MG1655Atdh,rhtA,Pi.lacadhE-m2 и MG1655Atdh,rhtA, ApykF.PuacadhE-mî (таблица 20). Во первых, штамм MG1655Atdh,rhtA,PuacadhE-m2 способен синтезировать Glu при росте на среде, содержащей смесь: 2% глюкоза/1.3% этанол; но при этом количество образующейся клеточной биомассы резко снижается (более чем в два раза) по сравнению с ферментацией па среде с эквимолярным (по углероду) количеством глюкозы (таблица 20). При введении делеции по гену pykF (пируват киназа I) синтез гшрувата из фосфоенолпирувата должен резко снижаться (т.к. PykF - основная пируват киназа в клетках Е. coli) и, как следствие, поток метаболитов через анаплеротический Ррс-опосредованный путь должен возрастать и количество синтезируемого Glu увеличиваться. Приведенные в таблице 20 данные подтверждают это предположение: штамм MG1655Atdh,rhtA, ApykF,PuacadhE-m2 синтезирует на 35% больше Glu, чем штамм MG1655Atdh,rhtA,Pi.uc-adhE-m2 при ферментации па среде, содержащей смесь глюкоза/этанол.
Таблица 20. Продукция Glu при ферментации штаммов па М9 среде с глюкозой и этанолом (48 ч).____
Штамм Источник углерода в среде od510 Glu, g/1
MG 1655Atdh,rhtA,PL,acadhE-m2 4% глюкоза 25.8±0.6 0.5±0.2
MG1655Atdh,rhtA, ApykF, PLlacadhE-m2 4% глюкоза 20.8±0.4 0.3±0.2
MG1655Atdh,rhtA,PLiacadhE-m2 2% глюкоза 1.3% этанол 10.1±0.5 2.3±0.3
MG1655Atdh,rhtA, ApykF, PUl=adhE-m2 2% глюкоза, 1.3% этанол 17.9±0.4 3.1±0.3
При теоретическом рассмотрении возможности эффективного синтеза треонина с использованием смешанных сред становится ясной необходимость введения дополнительных, к описанным выше, модификаций метаболических потоков, а именно:
1) Общий путь биосштгеза треонина условно можно разделить на две части: от глюкозы до ОАА, или от этанола до ОАА, и, далее, от ОАА до треонина.
2) Потребление глюкозы может бьгть реализовано двумя путями: через РТБ- систему (первый вариант) или поп-РТБ систему (второй вариант). Общее уравнение для синтеза ОАА через РТБ-зависимый путь усвоения глюкозы:
Глюкоза +4МАБ+ +АОР + 3/2Н20 = 3/20АА +4ЫЛОН +АТР (выход (г/г, %) = 110%) (А) Потребление глюкозы через поп-РТЭ систему может быть достигнуто путем усиления экспрессии генов ферментов, обеспечивающих транспорт и АТР-зависимое фосфорилирование глюкозы, например, galP, ху!Е и g№; инактивацией РТБ системы;
инактивацией пируваткиназы(-з). В результате вся глюкоза теоретически может превратиться в ОАА через анашгеротический путь (реакцию карбоксилирования фосфоенолпирувата ферментом Ррс). Суммарная реакция для синтеза ОАА в этом случае: Глюкоза + 2 NAD+ + 2 С02 = 2 ОАА + 2 NADH
Но в этом случае необходим еще один субстрат для синтеза АсСоА, например, этанол: Этанол + 2 NAD+ + СоА = АсСоА + 2 NADH
И, в результате, возможно последующее удвоение количества ОАА через глиоксилатный шунт цикла Кребса:
ОАА + 2АсСоА = Сукцинат + Малат = 20АА
Следовательно, оптимальное соотношение ОАА (из глюкозы) и АсСоА (из этанола) для удвоения ОАА путем сшпеза через глиоксилатный шунт - 1/2 (моль/моль). Таким образом, мы получаем следующее уравнеме синтеза ОАА при усвоении смеси глюкозы и этанола:
Глюкоза + 4 Этанол + 2 С02+ 14 NAD++ 6 Н20 = 4 ОАА +14 NADH (выход 145%) (В)
3) Сравнение уравнений (А) и (В) ясно показывает: усиление PTS независимого транспорта глюкозы в штаммах-продуцентах, культивируемых на смеси глюкозы и этанола, и направление интермедиатов, образующихся из глюкозы, через анаплеротический путь в цикл трикарбоновых кислот, дает более высокий выход ОАА -предшественника многих L-аминокислот, таких как глутамат, пролин, треонин, лизин, аспартат, аспарагин, метионин, серии, валин, лейцин, изолейцин, цистеин, аргинин, и пиримидинов. Оптимальное молярное соотношение глюкозы и этанола для вышеупомянутого процесса - 1/4.
Суммарное уравнение дня биосинтеза Thr через PTS-зависимый путь усвоения глюкозы может быть представлено я следующем виде:
Глюкоза +4 NAD* + 9/2 NADPH + 2 ATP + 3/2 NII3 + 3/2 Н20 = 3/2 Thr + 4 NADH + 9/2 NADP+ + 2 ADP + 3 Pi
При этом теоретический выход синтеза Thr из глюкозы (без учета расходов на биомассу и энергетических затрат) составляет 99%.
Суммарное уравнение для биосинтеза Thr через АТР-зависимое фосфоршшрование глюкозы, с учетом инактивации пируваткиназы(-з) и активации анаплеротического пути для интермедиатов гликолиза (через Ррс):
Глюкоза + 4 Этанол + 2 С02+ 14 NAD+ +12 NADPH + 8 АТР+ 10 Н20 + 4 NH3 = 4 Thr + 14 NADH + 12 NADP+ + 8 ADP + 8 Pi
Теоретический выход Thr в данном процессе равен 131%, из чего можно заключить, что использование смеси глюкозы и этанола в качестве источников углерода в ферментационных средах может заметно увеличить выход целевого продукта (Thr) при использовании штаммов с метаболически модифицированными путями усвоения субстратов (рис. 29).
Еще одна важная особенность заключается в том, что использование смеси глюкоза/этанол для продукции треонина приводит к фиксации 2-х молекул С02 из окружающей среды на 4 молекулы синтезируемого треонина, т.е. процесс имеет экологические преимущества.
[Ghicose 1 4
- A
SI /¿]
: * т "dhE VyyCiCaA ~1 Ij ....... |Eib.mol
4
И
Рис. 29. Метаболические пути усвоения источников углерода в продуценте треонина. (Л) - при ферментации на глюкозе; (В) - при оптимизации путей совместного потребления глюкозы и этанола; (С) - при ферментации на этаноле.
3.2. Модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина.
Одним из важнейших аспектов общей стратегии создания штаммов-продуцентов аминокислот и других биогенных молекул является модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов их биосинтеза. Частный случай аллостерической регуляции, ретроингибирование, является одним из основных способов контроля скорости биосинтеза аминокислот и других биогенных молекул. Очевидно, что для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов аминокислот необходимо конструирование таких мутантных ферментов, аллостерическое ингибирование которых конечными продуктами реакций было бы нарушено (fbr, feed back resistance фенотип). Как правило, fbr фенотип фермента достигается как результат замены одного аминокислотного остатка на другой в одном или нескольких сайтах белковой последовательности. Поиск и идентификация fbr мутантов всегда являлось достаточно трудоемкой задачей. Эти
мутации обычно возникают спонтанно при благоприятных для этого условиях и соответствующей системе отбора (Vyas and Maas, 1963; Гаврилова и др., 1988; Di Girolamo et al., 1988). С другой стороны, основываясь на анализе трехмерной структуры белка, можно вводить те или иные замены аминокислотных остатков, изменяя его кинетические характеристики. Однако, современный уровень понимания структурно-функциональных связей в белках пока еще недостаточен для проведения успешного рационального дизайна ферментов, и полученные таким образом мутанты часто имеют существенно более низкую специфическую активность по сравнению с ферментом дикого типа (например, в случае мутантов фермента SAT (Nakamori et al., 1998); мутантов пантотенат киназы (Rock et al., 2003); мутантов префенат дегидратазы (Hsu et al., 2004)).
К настоящему времени разработано множество методов искусственного ускорения эволюции белков, основанных на разных видах мутагенеза генов, кодирующих эти белки (Cadwell RC et al., 1992; Stemmer WP, 1994; Zhao H et al., 1998; Shafikhani S et al., 1997; Hermes JD et at., 1989). Мутагенез с помощью рандомизировашгых олигонуклеотидов (random oligonucleotide mutagenesis) позволяет ввести широкий спектр случайных мутаций в определенные участки белковой последовательности путем конструирования библиотеки мутантных генов (Sneeden JL and Loeb LA, 2003) и выбрать фермент с необходимыми свойствами из всего разнообразия полученных мутантных белков, отличающихся только несколькими заменами в данной конкретной области.
3.2.1. Селекция мутантных вариантов N-ацетилглутамат синтетазы (NAGS).
Биосинтез аргинина из глутамата в клетках Е. coli состоит из восьми последовательных реакций, инициируемых ацетилированием Glu посредством N-ацетилглутамат синтетазы (NAGS; ЕС2.3.1.1.), кодируемой геном arg А. Этот процесс регулируется как на транскрипционном (репрессия arg регулона), так и на эгаиматическом уровне (ретроингибирование NAGS аргинином) (Cunin R et al., 1986). Ранее химическим мутагенезом были получены некоторые jbr мутанты белка NAGS (Eckhardt Т and Leisinger Т, 1975; Rajagopal BS, 1998). Для каждого из них были определены мутации, ответственные за fir фенотип (HislSTyr, Tyrl9Cys, Ser54Asn, Arg58His, Gly287Ser и Gln432Arg).
В данном исследовании мы синтезировали библиотеку мутантных генов NAGS, кодирующих белки с заменами в N-концевом участке последовательности, где ранее уже были локализованы отдельные fir мутации (Hisl5Tyr, Tyrl9Cys) (Rajagopal BS, 1998). Был полностью рандомизирован 15-ти нуклеотидный фрагмент гена argA, кодирующий участок от 15 до 19 аминокислотного остатка. Совокупность мутантных генов была клонирована в вектор рКК233-2 под контролем tac промотора. Данная рандомизация дает набор 415 или около 109 различных последовательностей ДНК, которые могут кодировать 205 различных вариантов последовательностей аминокислотных остатков (включая стоп-кодоны) в 5-мерпом пептиде. Простые вычисления показывают, что рандомизация фрагмента гена argA, в кодирующей части от 15 до 19 аминокислотного остатка, может давать примерно 2,5 миллиона различных вариантов мутантных ферментов NAGS. В качестве матрицы была использована плазмида pUC 19-ArgA, а в качестве праймеров; PI: 5'-cgagggattccgcNNNNNNNNNNNNNNNatcaatacccaccggg-3', частично комплементарный последовательности гена argA, Р2 - стандартный М13 reverse праймер и
РЗ: 5'-tgccatggtaaaggaacgtaaaacc-3', гомологичный 5'-концу последовательности гена argA.
Фрагмент ДНК, кодирующий совокупность мутантных вариантов полноразмерного гена arg А. был клонирован в векторе рКК233-2. В результате трансформации реципиентных клеток Е. coli TGI было получено около 104 рекомбинантных клонов.
Суперэкспрессия NAGS в рекомбинантных клетках E.coli приводит к угнетению клеточного роста, так как Ы-ацстил-Ь-глутамат в больших количествах токсичен дм я клетки. Поэтому для скрининга мутантных вариантов был использован визуальный отбор клонов TGl(pKKArgA-random), колонии которых имели меньшую плотность и размер по сравнению с колониями штамма TGl(pKKArgA-wt). Из наиболее мелких клонов (rl 1, г12, г13) были выделены плазмиды, и нуклеотидная последовательность гена argA была определена секвенированием по методу Сэнджера (таблица 21).
Другой тип селекции был основан на предположении, что клетки, несущие fir мутанты гена argA, могут быть отобраны при использовании штамма E.coli В16-4 (argD' ,ргоВЛ~), который не может производить L-пролин вследствие ингибирования wt NAGS L-арпшином, и, следовательно, не может расти при избыточном количестве L-аргинина в среде. При наличии fir мутации в ArgA, штамм приобретает способность расти на минимальной среде, т.к. полуальдегид глутамата, предшественник L-пролина, может быть сшггезирован ацетилорнитин деацетилазой (продуктом гена argE) из N-ацетилглутамат полуальдегида, предшественника L-аргинина (Eckhardt Т & Leisinger Т (1975).
Для селекции мутантов, рекомбинакгные клетки B16-4(pKK-argA-NN) после пяти дней культивирования в минимальной среде М9, содержащей L-аргинин, были высеяны на чашку с М9-агаром, содержащую по 100 мкг/мл L-аргинина и ампициллина. Были выделены плазмиды из 10 рекомбинантных клонов, в которых определяли 5'- концевую последовательность мутантного гена argA. Неожиданно, 6 из 10 мутантов несли последовательность -Gly-Trp-Pro-Cys-Val- в мутагенизированном участке фермента (в таблице 21 представлена последовательность одного из клонов - г32). Этот эксперимент показал, что условия селекции предопределили комбинацию аминокислотных замен в регионе от 15 до 19 а. о. NAGS, которые обеспечивали оптимальный уровень активности фермента для роста рекомбинантных клеток в данных селективных условиях.
Активность NAGS оценивали в реакции биосинтеза N-ацетнд-Ь-глутамата из L-глутамата и ацетил-коэнзима А в присутствии 5 мМ L-аргинина и в его отсутствие:
NAGS
L-GIu + AcCoA -► N-AcGlu + CoA
Было показано (таблица 21), что специфические активности мутантов NAGS-rll и NAGS-rl3 более чем в 2,5 раза превышают активность NAGS-wt при отсутствии его ингибирования. Специфическая активность других мутантов NAGS-rNj (колонии которых имели одинаковый размер по сравнению с колониями штамма TGl(pKKArgA-wt), например, NAGS-r20) была существенно ниже активности фермента дикого типа в неингибированном состоянии. Фермент NAGS-4, содержащий единственную замену Tyrl9Cys и описанный как наиболее активный вариант в работе Rajagopal et al., 1998, был сконструирован нами посредством сайт-специфического мутагенеза и имел существенно более низкую активность, чем фермент дикого типа. В присутствии 5 мМ L-аргинина уровень активности мутантных ферментов не изменялся, в то время как фермент дикого типа существенно ингибировался аргинином (остаточная активность менее 1/10).
Таким образом, применение метода комбинаторного мутагенеза позволило в данном случае отобрать ftir варианты целевого белка путем анализа менее чем 0,2% от числа теоретически возможных вариантов при заданном уровне рандомизации.
Таблица 21. Структура и активность (в клетках Е. coli В3083 (argA. metB)) некоторых мутантных NAGS, полученных методом мутагенеза рандомизированными олигонуклеотидами.
Клон, содержащий рекомбинантную плазмиду Последовательность рандомизированного фрагмента гена argA (5'->3') Последовательность рандомизированного участка белка NAGS (15—>19 а.о.)*> Активность в клеточном экстракте, нмодь/мг/минЬ) Активность в присутствии 5 мМ Arg, %
pKKArgA-rl 1 GTAGTATGGCGGGCA ValValTrpArgAla 3390±75 103
pKKArgA-rl2 TTGTTCGGATTGCAC LeuPheGlvLeuHis 1220^34 100
pKKArgA-rl 3 TCGGCGGCGTCCAGA SerAlaAlaSerArg 3120±82 107
pKKArgA-r20 GTTATTTGGGGGTTA VallleTrpGIyLeu 260±9 99
pKKArgA-r32 GGGTGGCCATGCGTG GlyTrpProCysVal 10,3±1,5 109
pKKArgA-4 CATTCGGTTCCCTGT HisSerValProCys 300±П 91
pKKAigA-wf CATTCGGTTCCCTAT HisSerValProTyr 1200±28 <10%
а) - Последовательности, указанные жирным шрифтом, соответствуют природным
argA и NAGS.
Ь) - Все измерения были проведены независимо, не менее 4-х раз.
Анализ профиля белков грубых клеточных лизатов плазмидных штаммов выявил существенные различия в количестве синтезированных рекомбинашных NAGS (рис. 30). Это явление могло быть следствием множества причин: разной стабильности mRNA при транскрипции мутантных вариантов гена или эффективности трансляции этой mRNA (все мутации находятся в S'-области гена), а так же разной чувствительности полученных вариантов NAGS к протеолитической деградации. Поэтому для корректного сравнения кинетических параметров сконструированных ферментов было необходимо провести их исследование с использованием высокоочшценных белковых субстанций.
Fbr варианты мутантной N-ацетилглутамат сшпетазы NAGS-rll, NAGS-rl3, NAGS-4 и NAGS-wt были очищены согласно методике, описанной Marvil and Leisinger, 1977, с модификациями. Чистота выделенных субстанций белка NAGS-4, как и NAGS-rll, составляла около 70%, а чистота NAGS-wt и NAGS-r 13 - около 90%.
На рис. 31 представлены результата SDS-элекгрофореза выделенных белков NAGS-г13 и NAGS-rll. Видно, что белок NAGS-rll более чувствителен к протеолизу в клетках Е. coli (на электрофореграмме NAGS-rl 1 присутствуют две полосы, соответствующие -50 кДа и -48 кДа) по сравнению с NAGS-rl3 (одна полоса -50 кДа), следовательно, можно предположить существование сайта расщепления протеазой (протеазами) на участке аминокислотной последовательности белка, сформированной в результате мутагенеза.
Очищенные субстанции белков были использованы для определения кинетических свойств ферментов. Величины Км и V„« для трех мутантных ферментов и белка дикого типа были определены по кривым насыщения по глутамату и АсСоА, которые были приведены методом наименьших квадратов к уравнению Михаэлиса-Ментена. Разделение компонентов реакции и измерение количества синтезированного N-ацетилглутамата было осуществлено посредством капиллярного электрофореза.
Из классической теории кинетики односубстратной реакции следует, что при низких концентрациях субстрата произведение его концентрации на величину к^/Км определяет удельную активность фермента. В случае двух-субстрапгай реакции, аналогичные отношения кажущихся констант для одного субстрата (например - АсСоА) можно также рассматривать в качестве характеристики специфической активности NAGS при низких
концентрациях этого субстрата (АсСоА) и насыщающих концентрациях второго субстрата (Ю1и) и наоборот. Таким образом, сравнивая значения отношений 1ча|/Км для разных ферментов и разных субстратов, можно приближенно оценить относительную эффективность работы млтантных белков в условиях недостатка каждого субстрата (метод оценки кинетических параметров детально описан в работах Птицын ЛР и др., 2003, Котлярова ВА канд. дисс, 2006).
kDa
94 ^
Km«-t 8S
NAGS М Щф
¡¡gl ж,- - mm ш» : тУ
94
(¡7
43
30
67 ш
NAGS-rl 1 -
43 ш,
зо т
N.4GS-rl3
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 30. Экспрессия мутантных ферментов NAGS и NAGS-wt в клетках Е. coli TGI, содержащих рекомбинантные плазмиды:
2 - pKKargA-w/, не индуцированная культура;
3 - pKKargA-ii'i; 4 - pKKargA-rl 1; 5 - pKKargA-rl2; 6 - pKKargA-rl3; 7 - pKKargA-r20; 8 -pKKargA-r32; 9 - pKKargA-r4; 3-9 - культуры, индуцированные 1PTG; 1, 10 - белковые маркеры.
20
1 2 3
Рис. 31. ЗОЗ-электрофорарамма очищенных белков NAGS-rl 1 (2) и NAGS-rl 3 (3), 1 - белковый маркер.
Таблица 22. Кинетические свойства вариантов NAGS, (все измерения проводились независимо, не менее 4-х раз).
Насыщение по L-глутамату Насыщение но ацетил-коэнзиму А
Фермент Glu V v max каж хЮ3, АсСоА V v max каж хЮ3,
Км каж мкмоль kcal/Км Км каж мкмоль kcal/Км
мМ мг"! мин"' с"' М-1 мМ мг~' мин"' с'1 М-1
NAGS-wt 3,0 ±0,6 37 ±3 10.2 2.5 ±0,5 47 ±5 15,6
NAGS-4 8,4 ± 1,1 50 ±3 4,9 0,70 ± 0,08 35 ±3 41,5
NAGS-r 11 3,7 ± 0,5 115 ±5 25,8 0,32 ±0,02 111+12 287,9
NAGS-rl3 9,5 ± 1,3 139 ± 10 12,1 0,69 ± 0,07 120 ± 10 144,3
Как следует из данных, представленных в таблице 22, в условиях низких концентраций глутамата вариант вариант NAGS-rl 1 в два с половиной раза более эффективен, чем фермент дикого типа, который, в свою очередь, в два раза более эффективен, чем вариант NAGS-r4. В случае АсСоА, разница между значениями kcai/KM для фермента NAGS дикого типа и его вариантами NAGS-rl3 и NAGS-rl 1 еще более
велика и составляет уже один порядок. Нужно отметить, что в изменении кинетических параметров мутантных вариантов NAGS прослеживается определенная корреляция. Действительно, величины Км для глутамата для всех трех мутантных ферментов возрастают с одновременным увеличением сродства к АсСоА и увеличением каталитической константы. Таким образом, можно предположить, что аминокислотные остатки с 15 по 19, включительно, принимают непосредственное участие в формировании активного центра NAGS. Полученные результаты наглядно свидетельствуют об эвристической ценности комбинаторного метода.
Было исследовано влияние L-аргинина на скорость синтеза N-AcGlu для трех мутантов NAGS. Аргинин является сильным ингибитором (концентрация, необходимая для ингибирования активности фермента на 50% [ICos] составляет 25 рМ для белка дикого типа (рис. 32,А)). Для мутанта с единичной заменой NAGS-4 величина ICo.s примерно на три порядка выше, около 30 мМ (рис. 32,В). У мутанта с пятью аминокислотными заменами NAGS-rl3 обнаруживается увеличение активности в присутствии аргинина, что характерно только для NAGS эукариотов (клеток мышей или человека (Caldovic et al., 2003)).
Arginlne (цМ) Arginine (mM) Citrulllne (mM)
Рис. 32. Ингибирование NAGS аргинином (A -NAGS-wt(4); В -NAGS-4(»),NAGS-rl 1(Т), NAGS-rl3(m)) и цитруллином (С). Реакции были проведены в присутствии 5 мМ АсСоА и 20 mML-GIu.
В клетках прокариот и .млекопитающих функции фермента NAGS различны. У млекопитающих N-AcGlu не используется как предшественник при биосинтеза аргинина, а фермент NAGS скорее всего вовлечен в цикл мочевины (Caldovic et al., 2003). Единственная известная функция NAGS в клетках млекопитающих - это снабжение митохондриальной карбамоилфосфат синтеташ необходимыми ей кофакторами. Как было показано для NAGS из клеток печени крыс (Sonoda Т and Tatibana М, 1983) и недавно установлено для NAGS из рекомбинантных клеток мышей и человека (Caldovic et al., 2002), аргинин может вызывать активацию фермента, при этом специфическая активность повышается в 2 - 5 раз. Фермент NAGS млекопитающих, как и в Е. coli, имеет мультимерную структуру. В Е. coli его наименьшая активная единица представляет собой тример (Marvil DK and Leisinger, 1977), а его олигомеризация может зависеть от концентрации аргинина. Предшествующие исследования показали, что NAGS Е. coli и млекопитающих имеют слабое сходство и возникли независимо в процессе эволюции (Caldovic et al., 2002). Было неожиданным, что замена нескольких аминокислот в N-коице фермента NAGS из Е. coli приводит к образованию мутантного фермента, который
активируется в присутствии аргинина, как это имеет место в случае NAGS из клеток мышеП или человека
В случае ингибирования цитруллнном 1Со з для NAGS-wt составляет около 10 мМ, но этот интермедиаг биосшггеза аргинина вообще не влияет па активность мутантных ферментов NAGS (рис. 32,С).
Таким образом, нами было показано, что: 1) введение случайных мутаций в область 15-19 а.о. фермента NAGS привело к образованию мутантов, кинетические параметры которых колеблются в широких пределах (Км для различных субстратов у полученных мутантов изменяется в 3 и более раза по сравнению с соответствующим параметром для фермента дикого типа); 2) мутанты в различной степени подвержены протеолизу, что позволяет предположить возникновение протеолитического сайта в N-концевом участке фермента; 3) применение метода комбинаторного мутагенеза позволило получить мутшгты NAGS, с более высокой специфической активностью по сравнению с ферментом NAGS дикого типа.
Поскольку ацетилирование глутамата является ключевой стадией биосшггеза аргинина, гены Jbr мутантных NAGS были экспрессированы в составе низкокопийных гшазмид в штамме-продуценте аргинина В7925 (/7vvl::Tn5, argR). Данный штамм содержит точечную мутацию в гене argR (Glyl23Asp), что приводит к инактивации репрессии аргининового оперона, и, следовательно, к активированию всего пути биосинтеза аргинина. Последовательности ДНК, содержащие мутантные гены NAGS-r4, 11, 12 и 13 под контролем trc промотора, были клонированы в составе малокопийного вектора pMW119. Введение в штамм В7925 рекомбинантных плазмид, содержащих гены мутантных ферментов ArgA-rll и -г13, позволило повысить уровень продукции аргинина примерно в 2 раза по сравнению с контрольным штаммом (табл. 23) и на 15% по сравнению со штаммом, экспрессирующим ген мутантного белка с единственной аминокислотной заменой.
Таблица 23. Синтез аргинина в штамме В7925, несущем рекомбинантные плазмиды.
Штамм OD550, o.e. Arg, г/л
В7925 (pMWl 19) 23,2 4,7
В7925 (pMWI 19argA-4) 22,4 8,7
В7925 (pMWl 19argA-ll) 19,0 10,0
B7925 (pMWl 19argA-12) 18,5 7,6
B7925 (pMWl 19argA-13) 18,1 9,1
3.2.2. Селекция мутантных вариантов карбамоилфосфат синтетазы (CPSase).
Вторым ключевым субстратом в пути биосшггеза аргинина (а также в пути биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов) является карбамоилфосфат (СР), синтезируемый карбамоилфосфат синтетазой (CPSase).
CPSase Е. coli катализирует комплекс реакций синтеза карбамоилфосфата из бикарбоната, глутамина и двух молекул Mg-ATP с получением глутамата, фосфата и двух молекул Mg-ADP (Meister А, 1989). СР в паре с орнитином используются ферментом оршггин карбамошпрансферазой (OTCase) на шестом шаге пути биосшггеза аргинина (начинающемся с глутамата). CPSase активируется орнитином и инозин-монофосфатом (IMP, предшественником пуриновых нуклеотидов), и ингибируется уридин-монофосфатом (UMP). Транскрипция саг А В оперона, кодирующего две субъединицы фермента, кумулятивно репрессируется конечными продуктами обоих путей (Kholti А, 1998). CPSase E.coli представляет собой гетеродимер, состоящий га малой (41270 Da) и
большой (117710 Da) субъединиц, которые кодируются генами сагА и сагВ, соответственно. Малая субъединица фермента катализирует гидролиз глутамина н ответственна за перемещение NH3 к большой субъединице, где и происходит синтез СР. Большая субъединица содержит сайты связывания для бикарбоната, аммония, два различных сайта для Mg-ATP и С-концевой участок (18 Юа), который представляет собой регуляторный домен (Cervera J, 1996). Была описана кристаллическая структура аллостерически активированной CPSase (Thoden JB, 1999). Первые три отдельных домена: А, В и С в большой субъединице очень похожи по структурной организации, в то время как четвертый (D) существенно от них отличен. Этот домен (аминокислотные остатки 937 - 1073) отвечает за связывание с аллостерическими регуляторами IMP, UMP и орнитином. Также было показано, что два аминокислотных остатка, Ser948 и Thrl042 оказываются критичными для аллостерической регуляции фермента (Delannay S, 1999). Замена Ser948Phe в СагВ приводит к нечувствительности фермента (fbr фенотипу) к IMP и UMP, а активация орнитином сохраняется, хотя и в меньшей степени. Замена Thrl042Ile приводит к еще большему падению активации орнитином.
С целью конструирования CPSase, нечувствительной к UMP, была синтезирована большая совокупность мутантных генов сагВ путем частичной рэндомизации 15-нуклеотидного фрагме1тта гена, кодирующего участок белковой молекулы от Leu947 до Glu951 в домене D, в котором ранее была локализована единичная мутация Ser948Phe, приводящая к fir фенотипу мутантной CPSase (Delannay et al., 1999). Данная рэндомизация дает набор 412 или около 1.5х107 различных последовательностей ДНК, которые могут кодировать 4x10s вариантов последовательностей аминокислот в 5-мерном пептиде, и, следовательно, приводит к образованию около 400000 вариантов мутантных CPSases.
Несмотря на то, что селекцию мутантных CPSase проводили, используя не полностью репрезентативную библиотеку (был проведен скрининг около 1% теоретически возможных вариантов), было получено несколько высокоактивных fl>r вариантов CPSase, значительно превосходящих по каталитическим свойствам мутант CPSase Sei948Phc и близких по этим параметрам к CPSase дикого типа.
Совокупность рекомбинантных плазмид pEL-carAB-NN, производных вектора рЕТ22-Ь(+), в котором промотор Т7 был заменен на P¡„, контролирующий экспрессию мутантных вариантов оперона сагАВ, была использована для трансформации клеток Е. coli штамма B6969(carß::TnlO).
На первом этапе селекции трансформационную смесь высевали на чашки с агаризованной средой М9 для отбора клонов, продуцирующих варианты активных CPSase. В результате была выявлена группа хорошо растущих рекомбинантных клонов, в 40 из которых на втором этапе селекции активность мутантных ферментов была оценена по реакции биосинтеза цитрулина из оршггина, катализируемой совместно CPSase и OTCase (ArgI) в соответствии со следующей схемой:
CPSase + OTCase
NH3 +НСО3' +2MgATP + Orn -* Cit + 2MgADP + 2P¡
В качестве источника аммония в реакции использовали (NHtbSOj, ферментативную активность CPSase и их устойчивость к ретроингибированию UMP оценивали по уровню синтеза цитрулина, измеряемого с помощью TLC. Тест система включала белковые экстракты штаммов B6969(ca/-ß::TnlO)(pEL-carAB-NN) и TGl(pUC18-argl), полученные осаждением грубых клеточных экстрактов 75%-ым сульфатом аммония,
а также АТР (8 шМ), Ме304 (8 тМ), (Ш^С^ (8 шМ), Ма^СМ (8 тМ), и орнитин (1 тМ) в буфере трнс-НС1 (50 тМ), рН 7,5.
Для дальнейшего изучения были отобраны клоны, продуцирующие ферменты с наиболее высокой активностью и устойчивостью к ретроингибированию. Клеточные экстракты были обогащены осаждением в растворе сульфата аммония. Активности мутантных ферментов оценивали в реакции синтеза СР из глутамина или аммония в соответствии со следующими схемами реакций:
I. С1п + НСОэ" + 21^АТР -> ЫН2С00Р032" + 2М§АОР +01и +Р1
И. 1ч[Нз + НСОз" + 2М8ЛТР КН2С00Р032" + 2М§АОР+Р|
Измерение количеств синтезированного СР проводили с помощью капиллярного электрофореза (таблица 24). Также, серия реакций I была проведена в присутствии 10 тМ иТР для определения уровня ретроингибирования ферментов. Рекомбинантные плазмиды из 10 клонов были выделены, и мутагенизированные последовательности гена сагВ были определены секвенировапием по методу Сэнджера (таблица 25).
Из представленных данных можно заключить, что: 1) фермент СРБаяе, содержащий единичную мутацию 8ег948РЬе, практически нечувствителен к ЦМР, но активность его существенно ниже активности фермента дикого типа (приблизительно в 4 раза в присутствии глутамина, и в 2 раза - в присутствии (ЫИ^^О-! в качестве источника аммония); 2) мутанты СРЭа^е с множественными заменами в регионе 947-951 а.о. демонстрируют /Ьг-фепотип и имеют различные уровни ферментативной активности, вплоть до уровня СРБазелЛ Наиболее высокой активностью обладал мутант 31, несущий три неконсервативные замены Ьеи947Рго, Уа1949С1у, Ст1и951Л^, одну консервативную замену 8ег948ТЬг и сохранивший в положении 950 остаток Активность этого фермента составляла около 108% от активности фермента дикого типа и уменьшалась до 73% от первоначальной в присутствии 10 мМ ЦМР (при этих условиях активность СРБазе-^ составляла -13% от первоначальной (таблица 24)). Все остальные полученные варианты СРЗаяе полностью нечувствительны к 10 мМ ЦМР, но их активность в 2 - 4 раза меньше, чем активность фёрмента дикого типа. Более того, введение различных мутаций в район 947-951 а.о. в определенной степени изменяет субстратную специфичность мутшгшых белков к источникам аммония. Уровень синтеза СР мутантными СРЭаве при замене в реакционной смеси 5 мМ С1п, как источника аммония, на 200 мМ (МЬ^ЯСи снижается в 2 — 7 раз в зависимости от последовательности аминокислотных остатков в участке 947-951 а.о. мутантного фермента. Эти данные также показывают, что, несмотря на некоторое изменение сродства к свободному аммиаку у разных вариантов СРБазе, ферменты используют его в качестве субстрата в среднем примерно на два порядка менее эффективно, чем глутамин.
Селекция среди множества вариантов, несущих замены аминокислотных остатков в непосредственной близости от ранее идентифицированной мутации 8ег948Р1ю, позволила отобрать варианты структур, которые, по-видимому, компенсируют негативный эффект единичной мутации на активность фермента. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что фрагмент белка от 947 до 951-го аминокислотного остатка ответственен не только за ингибирование активности СРЭазе ЦМР, но и за уровень ее каталитической активности. Также, мутации в этом регионе приводят к определенному изменению субстратной специфичности белка (к глутамину или аммонию).
В результате рентгеноструктурного анализа (Т1юс1еп .ТВ е1 а!., 1997) локализованы три активных центра фермента, осуществляющие гидролиз глутамина (малая субъединица), синтез карбоксилфосфата и карбамата (Ы-концевой домен большой
Таблица 24. Активности мутантных белков CPSase (все измерения проводились
независимо, не менее 3-х раз, относительная погрешность измерений - 10%).
Активность, (CP, nmol/mgxmin)
№ клона Субстрат: 5 mM Gin Субстрат: 5 mM Gin; Аллостерический регулятор: lOmMUMP Субстрат 200 mM (NHjbSOj
wt 4200(100%)° 520 (12,4%)b 1389 (33%)c
#6 (Ser948Phe) 933 (22%) 933 (100%) 636 (68%)
#10 2157(51%) 2157(100%) 667 (31%)
#12 1706(41%) 1706(100%) 280 (16%)
#13 1538 (37%) 1538(100%) 180(12%)
#27 2354 (56%) 2354 (100%) 1257 (53%)
#31 4545 (108%) 3303 (73%) 1481 (32%)
#33 2000 (48%) 2000 (100%) 818(41%)
#34 2898 (69%) 2898 (100%) 1200(42%)
#36 1167(28%) 1167(100%) 267 (23%)
#37 1696 (40%) 1696 (100%) 723 (43%)
а- в скобках - активность в % к активности wt CPSase.
ь- в скобках - активность в % к активности фермента в отсутствии 10 mM UMP. с- в скобках - активность в % к активности фермента в присутствии 5 mM Gin как субстрата.
Таблица 25. Последовательности рандомизированного фрагмента гена сагВ и
рандомизированного участка белка СагВ.
№ клона Последовательность рандомизированного фрагмента гена сагВ (5'—>3') Последовательность рандомизированного участка белка СагВ (947-+951 а а.)
wt CTTTCCGTGCGCGAA -Leu-Ser-Val-Arg-Glu-
#6 (Ser948Phe) CTTTTCGTGCGCGAA -Leu-PAe-Val-Arg-Glu-
#10 CCTCTCCGTGAGGGT -Pro-Leu-Arg-Ghi-Gly-
#12 GCTGTCGCTTTGAAA -Ala-Val-Ala-Leu-Lys-
#13 GGTGTCTTCCTAATG -Glv- Val-Phe-Leu-Met-
#27 TTTTTCTGTTTTGGG -Phe-Phe-Cys-Phe-Gly-
#31 CCTACCGGTAGGAGA -Pro-Thr-Gty-Aig-Arg-
#33 TTCGCCTGTGGGGTG -Phe-Ala-Cys-Gly- Val-
#34 GTTTTCGGTAGTAGT - Val-Phe-Gly-Ser-Ser-
#36 GCTTCCGGCGTTGAG -Ala-Scr-Gly- Val-Giu-
#37 GCCTTCTGTGGGGTG -Ala-Phe-Cys-Gly- Val-
субъединицы) и синтез CP (С-концевой домен большой субъединицы). Интересно, что эти активные цешры связаны длинным молекулярным туннелем длиной около 100 ангстрем, функция которого - перемещать между ними реакционные интермедиаты. Фермент продуцирует молекулы аммиака внутримолекулярно, гидролизуя глутамин, и перемещает их по каналу длиной около 45 ангстрем, соединяющему малую и большую субъединицы (Mullins LS et al., 1999). Канал для карбамата, соединяющий два гомологичных активных центра внутри N- и С-коицевых доменов, образован тридцатью аминокислотными остатками (Kim J and Raushel FM, 2004). D домен, отвечающий за связывание с аллостерическими регуляторами IMP, UMP и орнигином, расположен около СР-
синтезирующего активного центра и канала карбамата. Полученные нами мутантные CPSase несут замены аминокислот в небольшом фрагменте D домена, локализованном достаточно близко от CP синтезирующего активного центра и канала карбамата. Поэтому влияние мутированных последовательностей в D домене на эффективность функционирования активного центра легко объяснимо. Однако их способность в определенной степени изменять сродство фермента к свободному аммиаку является достаточно неожиданной, так как модифицированная последовательность пространственно достаточно удалена от второго активного центра, субстратом для которого являются молекулы аммиака.
Влияние экспрессии одного из полученных fir мутантов фермента, CPSase-34, на продукцию аргинина и оротовой кислоты было оценено в соответствующих модельных штаммах-продуцентах (подробности - в патенте РФ 2264459).
Уровень продукции аргинина и цитруллина в рекомбинангном штамме 333, экспрессирующем мутантный белок CPSase-34, был примерно на 50% выше, чем в штамме, экспрессирующем фермент дикого типа. Модельный штамм-продуцент оротовой кислоты 311, несущий плазмиду с мутантным геном сагВ-34, продуцировал примерно в 4 раза больше целевого продукта, чем штамм, содержащий плазмиду с геном carB-wt. Таким образом, экспрессия мутантного фермента CPSase-34, нечувствительного к ретроингибированию, в штаммах E.coli приводит к увеличению синтеза продуктов аргининового и пиримидинового путей биосинтеза.
Так как оротовая кислота является прямым предшественником пиримидиновых нуклеотидов, входящих в состав нуклеиновых кислот, ее соли рассматриваются как вещество анаболического действия и применяются в фармацевтике при нарушениях белкового обмена как общие стимуляторы обменных процессов (Степура и др., 2002; Classen, 2004). Обычно применяют калиевую или магниевую соли оротовой кислоты в сочетании с другими средствами (витаминами и др.) при заболеваниях печени, дистрофии миокарда, прогрессирующей мышечной дистрофии, или для улучшения анаболических процессов при напряженных физических нагрузках.
В свете этих данных, штамм-продуцент оротовой кислоты может использоваться не только как родительский штамм при создании продуцентов пиримидиновых нуклеотидов, но и иметь самостоятельное практическое значение для микробиологической промышленности.
33. Идентификация генов, кодирующих ферменты пути I деградации
путресцина (pathway: putrescine degradation I).
При конструировании штаммов-продуцентов аминокислот необходима оптимизация функционирования не только основного биосинтетического пути целевого продукта, но и большого числа клеточных процессов (энергетического обеспечения, предотвращения деградации продукта, его секреции и т.д.), и в том числе, предотвращение возможной деградации или неоптимального перераспределение метаболитов пути биосинтеза целевой аминокислоты.
3.3.1. Функция белка YgjG.
В частности, к началу данных исследований, в клетках Е. coli были идентифицированы ADC (arginine decarboxylase) и AST (arginine succinyl-transferase) пути деградации аргинина и ODC (ornithine decarboxylase) путь деградации орнитина. Также, рамка считывания YgjG Е. coli Kl2 была аннотирована как предполагаемая (putative)
орнитин аминотрансфераза, фермент, который способен конвертировать оршггин в пирролин-5-карбоксилат.
Котфующая YgjG последовательность гена yg/G (Ь3073, Blatner; GenBank accession number gi| 1789454), размером 1491 п.н., расположена на 69,35 минуте хромосомы Е. coli после аег гена. Для установления типа ферментативной активности полипептида YgjG и проверки данных о Ntr-зависимой индукции (Zimmer et al., 2000), 1791-п.н. фрагмент, включающий последовательности yg/G и aer-ygjG межгенную область, был получен ПЦР-амплификацией соответствующего района хромосомы штамма Е. coli KI2 MG1655 и клонирован под контролем промотора Р|ас в составе мультикопийного вектора pUC18. Клетки Е. coli TGI были трансформированы плазмидой pUC18-ygjG и плазмидой pUC18, использовавшейся в качестве контроля. Для индукции биосинтеза полипепгида YgjG штаммы культивировали в следующих условиях: а) на богатой LB среде (индукция 1 мМ IPTG, 2 ч); б) на минимальной среде М9, содержащей пролин вместо аммония в качестве единственного источника азота (в условиях азотного голодания).
Аминотрансферазную активность в клеточных лизатах оценивали, используя в качестве доноров аминогрупп следующие соединения с дистальными аминогруппами: путресцин, орнитин, ацетилоршггин (АсО), GABA, диаминопропан (DAP) и некоторые аминокислоты. В качестве возможных акцепторов были использованы а-кетоглутарат (а-KG), пируват, а-кетобутират. Анализ продуктов реакции трансаминирования проводили методом тонкослойной хроматограф™. Специфическая аминотрансферазная активность была обнаружена только в случае субстратной пары путресцин - a-KG при щелочных значениях pH в штамме TGl(pUC18-ygjG). Существенная индукция путресцин аминотрансферазной (ПАТ) активности (до 10 раз) обнаруживалась при росте TGl(pUC18-ygjG) в условиях азотного голодания (47 нмоль мин"1 мг'1) по сравнению с ростом на богатой среде (5 нмоль мин"1 мг"'). В контрольном штамме TGl(pUC18) данная активность не детектировалась ни на богатой среде, ни в условиях азотного голодания (т.е. была меньше нижнего предела разрешения методики измерения -1 нмоль мин"1 мг"'). Орнитин аминотрансферазная (ОАТ) активность, аннотированная для YgjG, не фиксировалась ни в опытном, ни в контрольном штамме. Таким образом, было показано, что амплификация 1,8-т.п.н. фрагмента, несущего ген yg/G, в составе мультикопийной плазмиды приводит к появлению специфической ПАТазной активности, которая индуцируется при выращивании клеток в условиях лимитации по неорганическому азоту.
В базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information), как результат компьютерного анализа нуклеотидной последовательности yg/G и aer-ygjG межцистронного района, были приведены две предполагаемые промоторные последовательности, специфичные для а70 и а54 субъединиц ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. coli, соответственно, а также сайт связывания регуляторного белка FIS (рис. 33). Необходимо отметить, что последовательность а70-зависимого промотора была локализована в регуляторной области гена, в то время как промотора <754 - в 5'-кодирующей части гена yg/G. В соответствии с этим данными были аннотированы две рамки считывания для потенциального продукта трансляции mRNA (рис. 33). Первая из них, описанная как yg/G, кодировала полипегггид размером 496 а.о., биосинтез которого возможен только при условии инициации транскрипции соответствующей mRNA с ст70-зависимого промотора (orf - на рис 33), а инициация транскрипции другой рамки -одноименного гена (gi|1171884) размером 1290 п.н. (обозначенной на рисунке 33 как orfl и кодирующей полипептид размером 429 а.о. (Р42588)), была возможна с любого из промоторов. Обе рамки имели классический стартовый кодон AUG.
(-312) GGMTCGATTAATTTGATTTAGATCGCAATTTGCG
ЗагаН I
XHP
TCTAA----TTGATT
-277 ATTTAAACACAAAICTAATTCCjTIGAT^TAAAATAÇT
-35 -10
NEj NKj
TGCACCA---TGGTGCA TGCACCA---TGGTGCA
-207 TATCTTGCCCAAAAATCAGGCA/lTTATTGCCCTGAAAACGTGCATTTGCGCAGCAATCATCAAATCCATA
FIS start
-137 CCCGACAAAAACCGTGCAAAATAACAACAAATGTTAACAGATAGCATTAAATATTGCACAAAIGATAACC
ygjG (orf)-----------
(T54
TGGCACAA---TTGCAAT +1
-67 GAATTTGTGTTTATCCCGATTTTCGCGATCGCAGCCGGAGTG^gcaatccctgcftatacl'TAAATCGGT
Bgll
SD start
+4 ATCATGTGATACGCGAGCCTCCGGAGCATATTltSAACAGGTTACCTTCGAGCGCATCGGCTTTAGCGTG AcclII orf2
SD start
+74 CAGCGCCCACGCCCTGAATCTCATTGAGAAGCGAACGCTGGATCATGAGGAGi&6AAAGCACTTAACCGA
orfl—-
Рис. 33. Нуклеотидная последовательность 5'-концевой области yg/G и aer-ygjG межгенной области. Нумерация нуклеотидов приведена относительно положения "+Г старта mRNA выделенного курсивом. Анонсированные последовательности «-10» и «-35» предполагаемого а70 промотора выделены рамкой, а возможный сайт связывания FIS подчеркнут сверху. Сайты рестрикгаз выделены курсивом. Последовательности а промотора и предполагаемых сайтов связывания NR1 и IHF выделены жирным шрифтом, выше приведены соответствующие консенсусные последовательности. SD последовательности подчеркнуты сверху. Три вероятных стартовых кодона трансляции рамок ygjG {orf), orfl и orf2 выделены жирным шрифтом.
Проведенный нами дополнительный анализ нуклеотидной последовательности района, расположенного слева от предполагаемой последовательности о54-промотора (Reitzxr et al., 2001), выявил потенциальный сайт связывания регуляторного белка IHF и два сайта связывания белка-регулятора Ntr-ответа NR1 (Самсонова НН, канд. дисс., 2004), участие которых, как известно, необходимо для обеспечения инициации транскрипции с54-зависимой РНК полимеразой Е. cotí в условиях азотного голодания (Magasanik, 1996). Соответствующие предполагаемые последовательности указаны на рис. 33. Также при анализе нуклеотидной последовательности, расположенной справа от о54-промотора, была выявлена еще одна возможная рамка считывания, обозначенная на рисунке 33 как orfl. Эта рамка кодирует полипептид размером 459 а.о., экспрессия которого возможна при инициации транскрипции с каждого из промоторов. Трансляция orfl должна инициироваться с редко используемого стартового кодона UUG, что, как правило, отражает механизм регуляции скорости биосинтеза белка на трансляционном уровне (Parsons et al, 1988).
Рамки считывания orfl и orfl имеют легко узнаваемые потенциальные SD (Shine-Dalgarno) последовательности, расположенные на функционально значимом расстоянии (5-13 оснований) от инициирующего кодона (Makrides, 1996), однако, теоретически каждая из трех рамок считывания может транслироваться in vivo.
Для проверки, какой из промоторов, с70 или er'4. реально функционирует в клетке, были сконструированы три «гибридные» экспрессионные кассеты, в которых различные участки фрагмента BamHl-AcclU регуляторной области гена ПАТазы, были слиты со структурной частью гена-репортера lacZ (рис 34). При этом в данных конструкциях экспрессия гена ß-галактозидазы определялась: а) в случае кассеты I, содержащей полноразмерный фраг мент регуляторной области ПАТазы, - как результат действия обоих промоторов; б) в случае кассеты II - только активностью промотора сг4; в) в случае кассеты III - только активностью промотора о™. Экспрессионные кассеты были клонированы в составе плазмиды pBRP (см. рисунок 2), не содержащей каких-либо промоторных последовательностей в районе последовательности полилинкера. В качестве контрольной плазмиды использовали pBR-0-lacZ, несущую только структурную часть гена lacZ.
Рекомбинантные штаммы Е. coli TGI, несущие полученные плазмиды, культивировались в различных (по содержанию азота) условиях роста: на богатой LB среде, на минимальной среде М9, и в описанных выше условиях азотного голодания (таблица 26).
3 -
03
pUC18-ygjG
pBR-IacZ-3 pBR-o54lacZ-I pBR-o54IacZ-2
I
tr< с4.
«3+ о54 Г"
NRI-NRI III
orf2
lacZ
О
Рис. 34. Схема конструирования плазмид рВК- о541ас7,-1, рВК- о541ас2-2 и pBR-lacZ-3. Три различных участка регуляторной области гена ПАТазы (обозначенные как I, II, III и содержащие: предполагаемые последовательности с70, а34 промоторов и сайтов связывания клонированы в виде слитых с 1ас2 генов в составе векторной плазмиды рВ1У.
Полученные данные свидетельствовали, во-первых, о практически полном отсутствии экспрессии гена ПАТазы при росте на богатой среде, и, во-вторых, об отсутствии промоторных последовательностей в 287-п.н. фрагменте ВатН1-В§11 (таблица 26). Рост штамма TGl(pBR-cт'4-lacZ-l) на бедных средах, особенно в условиях азотного голодания, сопровождался существенным возрастанием активности Р-галактозидазы По сравнению со штаммом Т01(рВК-<г4-1асг-2), уровень экспрессии /ocZ в Т01(рВК-сг54-\zlcZA) увеличился в 9 раз на М9 среде и в 28 раз на безазотной среде с пролином. При использовании в качестве источника азота других аминокислот - апанина, орнитина или аргинина, увеличение активности р-галактозидазы в этих штаммах в условиях азотного голодания составило 22,5 раза в присутствии аргинина или орнитина, и 19,5 раза в случае использования аланина. Следовательно, BamШ-Bgll фрагмент чрезвычайно существенен для экспрессии гена ПАТазы в условиях роста на М9 и в условиях азотного голодания, что обусловлено, по-нашему мнению, наличием в составе этого фрагмента сайтов связывания NRI и, возможно, ШИ сайга. На основании этих результатов нами был сделан вывод о том,
что 56-п.н. фрагмент действительно содержит' последовательность о1"1
промотора, который является основным для экспрессии ПАТазы, и уровень о54-зависимой транскрипции снижается при отсутствии N111 энхансера, как это отмечалось в литературе ранее (Маёазашк, 1996).
Таблица 26. Уровень экспрессии /ас2Г в рекомбинантных пггаммах при различных условиях роста.
Штамм Активность ß-галактозидазы, MUa
LB M9 M9, без аммонийных солей, плюс пролин
TG 1 (pBR-o54/acZ-1) 190 3,500 22,500
TGl(pBR-o54/acZ-2) 140 400 800
TG l(pBR-/acZ-3) 110 130 170
TG 1 (pB R-0-/acZ) 140 190 220
° в единицах Миллера
Учитывая нехарактерное для Ntr-зависимой регуляции расположение IHF выше сайтов NR1, нельзя исключать вероятность того, что 1HF участвует не в регуляции гена ПАТазы, a r регуляции соседнего противоположно ориентированного гена аег (Rebbapragada et al., 1997).
Данные эксперименты позволяют сделать вывод о том, что транскрипция mRNA гена ПАТазы инициируется только с54 промотором при росте штаммов на минимальной среде М9, достигая максимума в условиях азотного голодания, и строго репрессируется на богатой LB среде.
Для подтверждения функциональности сг54 промотора было проведено определение положения старта транскрипции mRNA ПАТазы. Были выделены препараты mRNA штамма TGl(pUC18-ygjG), выращенного на всех трех средах, описанных выше, а в качестве контроля - препарат mRNA штамм TGl(pUC18). Реакции синтеза cDNA проводили, используя радиоактивно меченый олигонуклеотид 5'-CGCTTCTCAATGAGATTCAGGGCGTGG-3', комплементарный последовательности «+88» - «+115» относительно 3'-фланкирующего нуклеотида о54 промотора. Анализ данных (рис. 35) позволил идентифицировать в качестве возможного первого основания mRNA - гуанозин (G), локализованный на расстоянии 10 нуклеотидов относительно 3'-фланкирующего нуклеотида а54 промотора. Соответствующий cDNA транскрипт детектировался только для препаратов mRNA, полученных из клеток, выращенных на стандартной М9 среде и в условиях азотного голодания, причем в количественном отношении эти транскрипты оценивались примерно как 1:4 (рисунок 35).
Наши эксперименты показали некорректность анонсирования ORF ygjG (gl789454, Ь3073) как гена размером 1491 п.н., кодирующего полипептид размером 496 а.о. (SWISS-PROT Database, Q8XAN1). Анонсированный для этой ORF о70-зависимый промотор также не функционирует при выращивании клеток ни на богатой LB среде, ни на минимальной среде М9, ни в условиях азотного голодания. Установление факта инициации транскрипции гена ygjG с промотора о54 ограничивает выбор ORF, кодирующей активную ПАТазу только двумя альтернативными вариантами - orfl или orfl. Для анализа продуктов трансляции orfl и orfl мы сконструировали экспрессионные плазмиды, обеспечивающие биосинтез полипетидов, кодируемых этими рамками считывания, в виде гибридных белков, «слитых» с лидерным пептидом his6-tag. Последовательности
Рис. 35. Определение положения старта инициации транскрипции у&О. Полученные по методу достройки радиоактивно-меченого праймера препараты сОКА, а также сиквенсовые реакции, анализировали в 6% ПААГ: препараты сЭ^ полученные из шЯМА штамма 'ГС1(риС18-уаб) выращенного: в условиях азотного голодания - дорожка I; - в минимальной среде М9 - дорожка 2, - в ЬВ -дорожка 3. На 4 дорожке нанесен препарат сОКА, полученный из т!ША штамма Т01(р11С18), выращенного в условиях азотного голодания.
обеих рамок считывания были амплифицированы и клонированы в составе вектора рЕТ-15b(+) (Novagen, США). ПАТ активность в штаммах BL21(DE3)(pET15b-Ht-ORFl) и BL2I(DE3)(pET15b-Ht-ORP2) составила 0,05 и 2,16 мкмоль мин"'.мг"'. В кошрольном штамме BL21(DE3)(pET15b) ПАТ активность не детектировалась. Электорофоретический анализ белков из клеточных лизатов штаммов показал, что, спустя два часа после индукции синтеза слитых белков, их удельное содержание в растворимой фракции клеточных белков составило 2.4 % для Ht-ORFl и 8,5 % для Ht-ORF2 соответственно (рис 36).
Для сравнения удельных активностей Ht-ORFl и Ht-ORF2 были получены очищенные субстанции слитых белков. Наличие полигистидиновых последовательностей в N-концевой части гибридных белков Ht-ORPl и Ht-ORF2 позволило использовать для их эффективной очистки 1МАС хроматографию (immobilized-metal-affmity chromatography). Полипептид Ht-ORF2 был выделен с чистотой около 95% (рис. 36). Содержание же белка Ht-ORFl в полученном препарате не превышало 65%, что, по-видимому, было вызвано его протеолитической деградацией. Молекулярные массы выделенных полипептидов Ht-ORFl (48 kDa) и Ht-ORF2 (52 kDa) соответствовали сумме расчетных значений Mr ORF1 = 46,3 kDa, а также Mr ORF2 = 49,6 kDa, и his6-tag лидерного пептида - 2,1 kDa, соответственно.
Анализ ПАТ активности белков Ht-ORFl и Ht-ORF2, показал, чпо удельная активность Hl-ORF2 составляет 11,7 мкмоль мин"1 мг"1, в то время как активность Ht-ORFl - только 0,2 мкмоль мин"' мг"1. По-видимому, элиминация первых 30 N-концевых аминокислот практически инакгивирует фермент. Полученный результат свидетельствует о том, что orf2 является истинной рамкой гена ygjG, кодирующей биологически активный белок YgjG (ПАТазу) размером 459 а.о.
kDa 12 3 4 5 6 Рис. 36. Биосинтез Ht-ORPl и Ht-ORF2 в
клетках Е. coli Очистка этих белков
97 —». > методом IMAC хроматографии
1 -маркер молекулярных масс; 2, 3, 4 -
66 —» ft раегворимая фракция клеточного лизата
штаммов BL21(DE3) (pET15b),
•• m BL21 (DE3)(pET 15b-Ht-ORF2) и
45 —> BL2I(DE3)(pET15b-Ht-ORF 1 ),
В соответственно, через 2 часа после индукции
зо—> — синтеза слитых белков; 5,6- препараты Ht-
ORF2 (3,5 мкг) и Ht-ORFl (4 мкг)
20-y « " Щ am соответственно.
14 —> * . sa
Чтобы охарактеризовать каталитическую активность YgjG, а также проверить соответствие синтезирующегося ш v/vo белка ПАТазы продукту трансляции оф, мы выделили нативный препарат YgjG.
С этой целью ген, соответствующий orJ2, был экспрессироваи в составе мультикопийного вектора, с заменой NtrC-регулируемого промотора о54 на сильный промотор фага Т7. Анализ ПАТ активности в лизате клеток штамма BL21(DE3)(pET22b-ORF2) показал, что, спустя два часа после индукции синтеза ПАТазы, ее активность составляла порядка 0,34 мкмоль мин' мг"1. Процедура очистки YgjG из растворимой фракции тотального клеточного белка штамма BL21(DE3)(pET22b-ORF2) включала стадии фракционирования в растворе (NH^SO-i, обогащения при высокотемпературной инкубации и три хроматографических стадии очистки (таблица 27). Все этапы очистки проводили при 4 "С. Присутствие 10 цМ PLP в буферных растворах на всех этапах очистки способствовало сохранению ПАТ активности фермента. Высокий уровень термостабильности YgjG позволил ввести этап очистки с помощью термоинкубации при 60°С. Хроматографическая очистка препарата на ДЕАЕ-ссфарозе и гидроксилапатите (ГАП) позволили достичь 95% чистоты YgjG (рис. 37) с выходом 36%. Удельная ПАТ активность очищенного препарата YgjG составила 14,1 мкмоль мин"1 мг (таблица 27). Полученный препарат был достаточно стабилен, сохраняя 90% активности в течение двух суток при +4 °С, либо в течение 2 месяцев при -70 °С.
Молекулярная масса выделенного белка YgjG по данным SDS-электрофореза составила около 50 kDa, что согласуется с расчетным значением и подтверждает сделанное нами ранее заключение о том, что каталитически активный белок YgjG (ПАТаза) является продуктом трансляции оф. Молекулярная масса YgjG, определенная с помощью гель-фильтрации на колонке Сефакрил S-300, составила 203,4±9,3 kDa, что свидетельствует о тетрамерной структуре белка в растворе при нейтральном рН.
С целью определения влияния N-концевой гекса-гистидиновой последовательности на биологическую активность нативного белка YgjG, исследование субстратной специфичности, основных физических и кинетических параметров проводили как для нативного белка YgjG, так и для его производного - Ht-YgjG.
Определение субстратной специфичности белков Ht-YgjG и YgjG проводили, используя в качестве доноров аминогрупп следующие соединения с дистальными аминогруппами: путресцин, кадаверин, спермидин, спермин, агматин, L-орнитин,
Этап очистки Белок (мг) ПАТ активность (мкмоль мин"1) Удельная I1AT активность (мкмоль мин"1 мг"1) Выход (%) Степень очистки
Лизаг 41 13.93 0.34 100 1
(NH4)2S04 (35-65 %) 21.3 12.98 0.61 93 1.8
Температурная инкубация 5.3 12.87 2.41 92 7.1
Гидроксилапатит (Iм) 1.2 10.94 9.12 79 26.8
ДЕАЕ-сефароза 0.6 7.11 11.85 51 34.9
Гидроксилапатит (2™) 0.36 5.08 14.1 36 41.5
Рис. 37. ЗБЗ-РАОЕ электрофорез этапов очистки препарата УщЭ 1 - растворимая фракция клеточного лизата (12 мкг белка), 2 - очистка сульфатом аммония (10 мкг), 3 - температурная обработка (2 мкг), 4 - препарат УщС после первого этапа ГАП хроматографии (6 мкг), 5 - препарат У^в после последовательно проведенных ДЕАЕ и второй ГАП хроматографии (2 мкг), 6 - маркер молекулярных масс.
ацетилорнитин, GABA, DAP, ß-аланин, а также основные L-аминокислоты. В качестве возможных акцепторов были проверены a-KG, пируват, a-кетобутират, фенилпируват, а-кетоизовалериат, a-кетоизокапроат и а-кето-р-метилвалериат.
Было показано, что оба фермента проявляют схожую субстратную специфичность (таблица 28). Для обоих ферментов максимальные значения активности достигались при использовании в качестве акцептора аминогрупп - a-KG, а в качестве доноров аминогрупп - путресцина (100%) или кадаверина (95-97%). Полученный результат показывает, что YgjG, также как и ПАТаза, выделенная Kim (Kim, 1964) из мутантного штамма Е. coli, является диамин-аминотрансферазой. Гораздо менее эффективен как донор аминогрупп для ферментов YgjG и Ht-YgjG спермидин (27-32%). Практически не активны в качестве доноров L-аланин, агматин и L-орнитин (1-4%). Ферментативная активность не обнаруживалась в присутствии таких полиаминов, как спермин и DAP. ß-аланин, GABA; ацетилорнитин и орнитин также не активны в реакциях, катализируемых YgjG и Ht-YgjG.
Следует отметить, что YgjG также достаточно эффективно катализировал перенос аминогруппы глутамата на пируват, проявляя тем самым глутамат.пируват аминотрансферазную (GPT) активность. GPT активность препарата Ht-YgjG значительно ниже. Ни одна из известных к настоящему времени аминотрансфераз III группы не
1 2 3 4 5 6
ш - р 1" I ^—
1 —
# г § —
§ ш .щ
ü —
1
проявляет GPT активности, хотя присутствие ОРТазы (КФ 2.6.1.2), способной катализировать синтез L-аланина в грубых экстрактах клеток Е. coli, ранее было обнаружено (Reitzer, 1996). Фрагмент ДНК, который, как полагали, содержит ген alaü, кодирующий GPTa3y, был клонирован на мультикопийном векторе (Wang, 1987). Однако приведенные в работе Wang, 1987, данные рестрикционного анализа клонированного фрагмента не совпадают с рестриктной картой гена ygjG, что свидетельствует о том, что авторами был клонирован отличающийся от нашего фрагмент хромосомы Е. coli.
Таблица 28. Субстратная специфичность очищенных препаратов Ht-YgjG и YgjG с различными донорами и акцепторами аминогрупп.
Субстрат" Ht-YgjG 1 YgjG
Донор аминогрупп6 Относительная активность (%)"
Путресцин 100 100
Кадаверин 97 95
Спермидин 32 27
L-Аланин 4 4
Агмдаш 2 2
L-Оршгтин 2 1
Ь-Глутама/ 21 30
Акцептор аминогрупп*
а-Кетоглутарат 100 100
а-Кетобутират 12 23
Пируват 38 34
а определение субстратной специфичности проводилось в линейном диапазоне концентраций детектируемого продукта реакции при насыщающих концентрациях субстратов.
6 в качестве акцептора во всех реакциях, за исключением GPT, использовался a-KG. ■ PAT активность с a- KG была принята за 100%. г GPT активность.
д в качестве донора аминогрупп во всех реакциях использовался путресцин.
Способность кетокислот выступать в качестве акцепторов аминогрупп исследовали с использованием путресцина в качестве донора аминогрупп. Было показано, что YgjG и Ht-YgjG осуществляют перенос аминогруппы на пируват и a-кетобутират. Однако, эффективность этого процесса существенно ниже, чем в случае a-KG. Такие кетокислоты, как фенилпируват, а-кетоизовалериат, a-кетоизокапроат и a-кето-р-метилвалериат были полностью инертны в качестве акцепторов.
Белки YgjG и Ht-YgjG проявляли активность преимущественно в диапазоне щелочных значений pH, с максимумом активности при pH 9. При pH 7 активность ферментов значительно снижалась (в 5 - 6 раз). Эти результаты достаточно хорошо согласуются с данными Kim (Kim, 1964), полученными для ПАТазы, выделенной из мутантиого по утилизации путресцина штамма Е. coli В (способного использовать путресцин в качестве единственного источника азота и углерода). Однако согласно другим данным, оптимум активности препарата ПАТазы, выделенного из мутантного по утилизации GABA и путресцина штамма E.coli К-12, наблюдался при pH 7,2 (Prieto-Santos
е1 а1., 1986). Возможно, это несоответствие вызвано существованием отличного от УдО фермента, катализирующего ПАТ реакцию с максимальной активностью при рН 7,2.
Для определения кинетических параметров ПАТ реакции, протекающей по механизму с замещением фермента ("пинг-понг-би-би" механизм) были исследованы зависимости начальных скоростей реакции от концентрации одного из субстратов при насыщающей концентрации второго субстрата (Корниш-Боуден, 1979). Для каждой из исследованных пар сопряженных субстратов с помощью регрессионного анализа экспериментальных данных определялись кажущиеся значения параметров Кп°рр и Ута^рр После чего, на основе известных теоретических зависимостей (Корниш-Боуден, 1979), рассчитывались значения Утас и К„ для соответствующих субстратов. Значения каталитической константы ксЫ (числа оборотов фермента) были определены на основании расчетных значений Утаг и М, белка (детально эксперименты описаны в работе Самсоновой НН, канд. дисс., 2004). Полученные кинетические параметры (К„, ксш, ксЛС„) ПАТ реакции, катализируемой препаратами Ущв и НЬУщС, представлены в таблице 29. Для нативного белка дополнительно были определены кинетические параметры реакции трансаминирования кадаверина и спермидина
Таблица 29. Основные кинетические параметры" Ш-Ущй и У^в.
Фермент Мг, Ша Субстрат Кт, мМ V ' тахг дмоль мин"1 мг"1 кал, с"1 кса/Кт, с"1 мМ"1
Уа'о 50 а-Кетоглутарат 4,2 ±0,5 20,1 ±0,8 16,8 4,0
Путресцин 1,9 ±0,3 17,1 ±0,9 14,3 7,5
Кадаверин 6,1 ±0,3 14,6 ±0,3 12,2 2,0
Спермидин 26,1 ±6,2 12,8 ± 1,9 10,7 0,4
Ш-У^О 52 а-Кетоглутарат 7,2 ±1,5 22,5 ±2,0 23,3 3,2
Путресцин 4,8 ± 0,9 19,6 ±1,3 17,3 3,6
* Приводятся расчетные значения кинетических параметров У„„ и Кт.
Анализ значений кса,/К„, для трех основных доноров УщС - путресцина, кадаверина и спермидина, показывает, что путресцин является наиболее предпочтительным субстратом, и свидетельствует о том, что белок действительно является путресцин: а-К<} аминотрансферазой. Кадаверин также может служить донором аминогрупп, хотя сродство У&й к этому субстрату в три раза ниже, чем к путресцину, а отношение к^Кт - в четыре раза ниже. Для спермидина соответствующие параметры на порядок ниже.
Сравнение кинетических параметров УщО и Ш-У^ув, показывает, что хотя значения Утах дня них достаточно близки, сродство к субстратам у У а в примерно в два раза выше. При этом, значения кш1Кт дня путресцина также отличаются в два раза, а для а-Кй практически совпадают. Таким образом, можно заключить, что присутствие М-концевого Ыяб^ пептида в структуре ЬЙ-УщО, не сильно сказываясь на физических свойствах белка, дольно сильно влияет на его кинетические параметры по сравнению с УВыше описанные эксперименты по оценке активности белка, кодируемого ог/1 (рисунок 33) показали, что элиминация первых 30 К-концевых аминокислот практически инактивирует фермент. Следовательно, Ы-концевая область Ущв существенна для его ферментативной активности. Хотя определенные нами значения кинетических параметров белка У^ув могут показаться достаточно высокими, однако известно (http://www.brcnda.unikoeln.de),
что для многих ферментов, принадлежащих к подгруппе III PLP-зависимых аминотрансфераз, значения К„ характеризуются как микромолярными, так и миллимолярными величинами (например - 2,5 мМ для a-KG и 0,48 мМ для ацетилорнитина в случае ацетилорнитин-АТазы Е. coli).
Таким образом, на основании приведенных данных можно сделать вывод что фермент YgjG является путресцин: a-кетоглутарат аминотрансферазой и участвует в утилизации путресцина в клетках Е. coli.
3.3.2. Функция белка YdcW.
Описанная выше основная активность белка YgjG, осуществляющая реакцию:
Путресцин + 2-кетоглутарат => у-аминобутиратальдегид + L-глутамат предполагает наличие у-аминобутиратальдегид дегидрогеназной активности (ABALDIí) для утилизации данного шггермедиата. Наличие ABALDH активности в белковых экстрактах клеток Е. coli было показано ранее (Prieto MI, 1987), однако соответствующий ген, кодирующий эту активность, не был идентифицирован к началу данной работы, хотя его положение на хромосоме было приблизительно определено между 28 и 32 мин методом конъюгации (Snaibe Е et al.,1985). Поиск последовательностей гомологичных ABALDII (Р49189) человека в геноме Е. coli К12 MG1655 выявил 9 открытых рамок считывания (ORF), имеющих высокую степень идентичности последовательности: BetB (Р17475, 51%), Ynel (Р76149, 39%), YdcW (Р77674, 36%), НрсС (Р42269, 35%), AldA (Р25553, 35%), AldB (Р37685, 34%), GabD (P25526, 34%), FeaB (P80668, 34%) and AldH (P23883, 32%). Три гена из перечисленных локализованы между 28 и 32 мин на хромосоме. Каждый из них был аннотирован как альдегид дегцдрогеназа ранее (Gruez A et al., 2004; Heim R. and Strehler E. 1991; Limon A et al., 1997), но не было никакой информации о возможности использования у-аминобутиратальдегида (ABAL) в качестве их субстрата.
Мы осуществили выделение и очистку белка ABALDH из клеток Е. coli К12 MG1655, выращенных на LB-среде и на минимальной среде с разными вариантами источников углерода и азота (таблица 30).
Таблица 30. Индукция ABALDH активности в Е. coli К12 MG1655 в зависимости от ростовых условий.____ ___
Условия роста0 I II III IV V VI
Источник углерода Источник азота LB Glue NH4+ Glyc NH4+ Ptr NH4+ Gluc Ptr Glyc Ptr
ABALDH активность (наномоль/мин*мг) 25 5,2 16,5 17,1 20,6 40,1
"-сокращения: LB, LB-среда; Ptr, путресцин; Glue, глюкоза; Glyc, глицерин; NHi+, (NH)2S04.
Процедура очистки белка включала этапы, перечисленные в таблице 31. В результате был получен белок АВАЬОН с выходом 15% и 353-кратной степенью очистки. Гомогенность полученного препарата была подтверждена БОБ-электрофорезом, на электрофореграмме присутствовала единственная полоса белка с М\¥ = 51±3 кОа: Молекулярный вес нативного препарата АВАЕОН был оценен с помощью гель-фильтрации и составил 202 ± 29 Ша, из чего можно заключить, что активная форма фермента - гомотетрамер.
Препарат очищенного белка АВАЕОН был экстрагирован из акрнламидного геля и обработан трипсином. Масс-спектрометрический анализ полученной смеси пептидов
Таблица 31. Очистка ABALDH из Е. cali К12 MG1655.
Стадия Белок (МГ) Общая активность (цмоль/мин) Удельная активность (цмоль/мин*мг) Выход (%) Степень очистки.
Клеточный экстракт 187,20 4,493 0,024 100,0 1
Сульфат аммония (60-85%) 9,60 4,426 0,461 98,6 19
Source 15Q FPLC 1,08 3,054 2,828 68,0 117
Resource РНЕ FPLC 0,08 0,678 8,478 15,1 353
проводили с использованием MALDI-TOF масс-спектрометра, набор полученных 19-и масс-пиков был подвергнут дальнейшему анализу и сравнению полученных последовательностей с последовательностями предполагаемых ABALDH с использованием базы данпых MG1655 (рис 38). Было показано хорошее совпадение идентифицированных пептидов с последовательностью YdcW (SWISS-PROT Database, Р77674) (score parameter 204). Таким образом, выделенный белок бал идентифицирован как YdcW. Этот результат был ожидаемым, т.к. YdcW имеет высокую степень гомологии с ABALDH человека и его ген локализован на 32,63 мин хромосомы Ecoli. Ранее, His-tag-слитый белок YdcW был очищен и охарактеризован как альдегид дегидрогеназа со специфичностью к среднецепочечным альдегидам (Gruez A et al., 2004), причем фермент проявлял активность в форме тетрамера. Мы определили кинетические характеристики нативного YdcW в реакции окисления ABAL (таблица 32). Значения Км для ABAL, NAD+ and NADP+ составили 41±7, 54±10 и 484±2 цМ, соответственно. Эти значения сравнимы с приведенными ранее Prieto MI (Prieto MI et al., 1987), для ABALDH, выделенной из мутантиых клеток Е. coli К12. Из наших данных следует, что для белка YdcW каталитическая эффективность (к^-УКм) для NAD+ как субстрата более чем на порядок выше, чем для NADP+, что соответствует данным Gruez et al., что аффинность YdcW к NAD+ значительно выше, чем к NADP+. Определенное нами значение Км для субстрата ABAL для выделенного белка YdcW было значительно ниже значений Км для 14-и альдегидов, анализированных в работе Gruez et al. Более того, к^/Км параметр для ABAL на два порядка выше аналогичного для бутиральдегида, который обеспечивал самую высокую каталитическую эффективность среди использованных Gruez et al. альдегидов. Суммируя эти данные мы можем утверждать, что у-аминобутиратальдегид (ABAL) является природным субстратом для YdcW, и природная биохимическая функция белка -окисление ABAL до to у-аминобутирата:
4-aminobutanal + NAD+ + Н20 <=> 4-aminobutanoate + NADH + 2 H'.
Изучение индукции синтеза ABALDH клетками MG1655 показало, что процесс находится под контролем механизмов как катаболитной репрессии, так и азотной лимитации (таблица 30). Инактивация гена ydcW в хромосоме клеток MG1655 приводила к исчезновению ABALDH активности в клеточных экстрактах белка. При этом, в условиях азотного голодания, в культуральной среде клеток MG1655AydcW::kan накапливался ABAL (до 0,76 тМ) (данные не показаны), хотя при аналогичных условиях культивирования в среде штамма MG1655 альдегид отсутствовал. Исходя из этих данных, мы можем полагать, что в клетках Е. coli К12 белок YdcW является единственной ABAL дегидрогеназой.
Peptide
Jft Mr. Da Sequent
1 739.38 FFAGAAR
2 »43.53 LGAAVATLK
5 859.49 V1TGGEKR
■1 1037.57 GIYDTCVEK
5 1121.60 TVGDPLTGHPK
6 1253.69 AVEEAKATGHIK
7 1306.71 GKTVGDPLTGHPK
S 1563.73 AADAAFAEWGQTTPK
9 mam DMSLYGIEOY7VVR j
io 1676.77 OMSLYGLEDYTWR Oxidation (M)
II 2013.98 APVlVFDDAOiEAWEGVR
12 2266.02 tSGYGKOM3CYGt.EDYTWR
13 2281.01 SGAPDDESTELGPLSSLAHLER
14 24*12 13 NCGKPIMSAFNDEIPAIVDVFR
15 2496 23 MVSLTGSlATGEHliSHrASSIKR
16 2512.23 MVSCTGSIATGEHIISHTASSiKR Oxidötbn (Ml
17 2867.35 THMECGGKAPVIVFTOAOIEAVVEGVR
18 2883.35 TUMELGGKAPV1VFDDAUIEAWEGVR Oxidation [Ml
19 3998 84 EVFGPWSVl PFDNEEQWNWANOSQYGLASSVWTK
!MHKLL!NGELVSGeGEKaPVYNPATGDVU.EIAEASAEQVDMVR!««^É^!ÍSttT!l<
;14 ¡1 i
|RAECLLKLADVIEENGQOTAELESR®eie»WÖEIPÄ)®fa®SBCLNGLAAGE j
lYLEGHTSMIRRDPLGWASIAPWNYPLMMAAWKlAPAUAAtíNCWLKPSEITPLTALKlAELA !
£7iS i i 15, (1Б) t'4,B) )1< '
¡ i< I» i»
i IWDBADlEAVV£GVRTFGYYNAGQIXTMCRIYAQKGlWtLV^tö%ÄM®SSfffli.?;
I >1« i3 J tí? i
i"Í2 ¡9.(101 i
VSmpHOGOtf^jgiglÍg8jMMgBj»WMVKH
Рис 38. Масс-спектрометрический анализ препарата белка АВАЬОН.
(A) Набор пептидов, идентифицированных в трипсиновом гидролизате АВА1Л)Н.
(B) Карта совпадения идентифицированных пептидов с последовательностью белка УёсШ. Сайты протеолиза показаны вертикальными стрелками.
Таблица 32. Кинетические характеристики белка YdcW Е. coli.
Субстрат Vmax (рмоль/мин*мг) ЫРМ) kcal (МИН') кса/Км
ABAL a 9.08 ± 0.42 41 ±7 461 ± 17 11.25
Бутиральдегид ' 0.36 ±0.02 196 ± 40 18 ± 1 0.09
NAD+b 6.67 ± 0.36 54± 10 339 ± 14 6.27
NADP+b 2.51 ±0.2 484 ± 72 127 ±4 0.26
* - 0.5 шМ NAD+ использован как коэнзим;ь - 0.5 niM ABAL использован как субстрат.
Возможность конверсии путресцина в у-аминобутират (GABA) при совместном действии путресцин аминотраисферазы и ABALDH была продемонстрирована в модельном эксперименте in vitro (рис 39). Эксперимент показал, что при инкубации смеси путресцина и a-KG в присутствии NAD+, PLP и препаратов YgjG и YdcW белков имеет место накопление GABA через интермедиат ABAL.
Следовательно, в клетках Е. coli KL2 совместное действие YgjG и YdcW может быть существенным для поддержания внутриклеточного баланса путресцина in vivo.
Идентифицироват1ЫЙ нами путь деградации путресцина в GABA в базе данных ЕсоСус получил наименование пути I деградации путресцина (pathway: putrescine degradation I).
Позднее, еще один: путь II деградации путресцина в клетках E.coli (pathway: putrescine degradation II) был обнаружен Kurihara S, et al. , 2005.
Рис. 39. HPLC-мониторинг компонентов реакции.
(A) энзиматическая реакция образования ABAL и L-Glu: (1) нач&чьная реакционная смесь, содержащая путресцин (Putr) и a-KG; (2) реакционная смесь после инкубации с YgjG .
(B) Энзиматическое окисление ABAL в GABA: (1) начальная реакционная смесь, содержащая ABAL и NAD+; (2) реакционная смесь после инкубации с YdcW. (С) Энзиматическая конверсия путресципа в GABA: (1) начальная реакционная смесь, содержащая путресцин, a-KG и NAD+; (2) реакциошия смесь после инкубации с YgjG и YdcW.
Заключение.
В данной части работы показаны возможности модификации метаболических путей штаммов Е. coli сцелью повышения продуктивности аминокислот. Так, потребление глюкозы штаммами может быть усилено при использовании мутантных генов пермеазы PtsG или усиленной экспрессии пермеазы EIINas.
Возможность интенсивного усвоения глюкозы клетками Е. coli посредством пермеазы ЕИ№8 была показана впервые.
Интеграция в хромосому клеток Е. coli мутантных вариантов алкоголь дегидрогеназы-альдегид дегидрогеназы Е. coli (AdhE), обеспечивает рост клеток на средах с этанолом в качестве единственного источника углерода в аэробных условиях культивирования.
Введение в хромосому штаммов-продуцентов (например, треонина или глутаминовой кислоты) мутантных генов adhE под контролем сильного промотора позволяет получить продукцию аминокислоты при росте клеток на средах с этанолом в качестве единственного источника углерода и на глюкоза/этанол - содержащих средах.
Теоретически показаны необходимые модификации путей усвоения источников углерода (усиление non-PTS транспорта глюкозы, введение делеций по генам пируват киназ, усиление экспрессии фосфоенолпируват карбоксилазы, экспрессия мутантной алкоголь дегидрогеназы-альдегид дегидрогеназы) для эффективной продукции аминокислот при использовании в ростовых средах смесей глюкоза/этанол (на примере штамма-продуцента треонина).
На примерах N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Е. coli, ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина, показана возможность получения высокоактивных ферментов, не подверженных ретроингибированию, при случайном множественном мутагенезе коротких фрагментов их последовательностей. Экспрессия
этих мутантных ферментов приводит к существенному увеличению продукции аминокислоты Гены этих мутантных белков были использованы при конструировании высокопродуктивных промышленных штаммов-продуцентов.
Полученные результаты защищены рядом российских и иностранных патентов, приведенных в списке работ по теме диссертации.
Впервые идентифицированы гены (и охарактеризованы соответствующие белки) одного из путей деградации путресцина в GABA в Е. coli. Данный путь в базе данных ЕсоСус получил наименование пути I деградации путресцина (pathway: putrescine degradation Г).
Глава 4. Поиск новых пнзкомолекулярных биологически активных веществ
растительного происхождения и возможность их микробиологического синтеза.
Растения были и до сих пор остаются одним из главных источников биологически активных препаратов, широко используемых в официальной и народной медицине, а также в производстве физиологически активных ингредиентов для продуктов «функционального питания». Показано, что тысячи разнообразных соединений, выделенных из растений и химически идентифицированных, оказывают благотворное влияние на здоровье человека, проявляя антиоксидативное, противовоспалительное, противоопухолевое, гипотензивное и т.д. действие. В качестве примеров можно привести такие соединения как эпигаллокатехин галлат (СгзН^Ои, MW 458 г/моль), один из активных компонентов экстрактов зеленого чая; транс-ресвератрол, с потреблением которого связывают низкий риск развития сердечно-сосудистых заболеваний у французов («французский парадокс»), содержащийся в красном вине, кожуре винограда и некоторых растениях (СнНцОз, MW 228 г/моль); кверцетин - флавонол, содержащееся в яблоках, луке, чернике, черном и зеленом чае и входящий в состав лекарственных препаратов, применяемых в лечении бронхиальной астмы, заболеваний сердечно-сосудистой системы, ожогов, обморожений, воспалений (С15Н10О7, MW 302 г/моль); берберин - алкалоид, содержащийся в листьях барбариса, желчегонное средство (C20H19NO5, MW 353 г/моль) и многие другие. Некоторые из них, такие как таксол (паклитаксел, C47H51NO14, MW 854 г/моль), вещество, выделяемое из коры тиса коротколистного (Taxus brevifolia), и его производные прочно вошли в медицинскую практику в качестве одних из наиболее мощных противораковых препаратов.
Значительный прогресс в развитии метаболической инженерии Е. coli, использующей клонирование наборов генов растений, кодирующих пути биосинтеза новых («чужеродных» для прокариот) низкомолекулярных веществ, был достигнут в последнее десятилетие. Этому способствовало как развитие методологий генетической инженерии и биохимии, так и внедрение новых аналитических методов высокого разрешения (LC-MS, LC-MS/MS, NMR) и Х-омных подходов анализа синтезирующихся интермедиатов и финальных продуктов. Ярким примером успешного применения комплекса современньк методов метаболической инженерии Е. coli являются работы по конструированию штаммов-продуцентов поликетидов, в частности, флавоноидов и стильбенов, обладающих высокой степенью природного разнообразия (Kiselev К, 2011; Katsuyama Y et al., 2007), а также, штаммов-продуце1ггов полиизопреновых соединений, в частности таксаденина, шггермедната в пути биосинтеза таксола (Ajikumar PK et al., 2010; Jiang M et al, 2012). Таким образом, поскольку последние достижения в метаболической инженерии и синтетической биологии открывают новые возможности в промышленном
микробиологическом производстве достаточно сложных в химическом отношении веществ, поиск потенциально фармацевтически важных соединений растительного происхождения является насущной и важной научной задачей.
В рамках данной работы мы провели скрининг более ста коммерчески доступных растений, используемых в России как в официальной, так и в народной медицине (список растений представлен в публикациях: Ivanov SA et а]., 2012; и Kalinkevich К et al., 2013).
4.1. Методы и тест-системы, использованные для скрининга этапольных экстрактов сухих растительных препаратов.
Биологическую активность этанольных экстрактов сухих растительных препаратов оценивали in vitro с использованием нескольких методов или тест-систем:
1) Разработанная нами тест-система для поиска ингибиторов ангиотензшшревращающею фермента (angiotensin I-convefting enzyme (АСЕ I) была основана на энзиматическом расщеплении субстрата М-[3-(2-фурил)акршюил]-Ь-фенилаланил-глицил-глицин (FA-PGG) ферментом АСЕ I (Sigma-Aldrich, США) и последующей модификации отщепляющегося дипептида Gly-GIy (GG) 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS). Количество образующегося в результате (2,4.,6-тринитрофенил)-глицил-глицина (TNP-GG) оценивали спектрофотометрически по поглощению при 420 нм (рис. 40). Ингибирующую активность экстрактов (1С, %)
А Рис. 40. Схема
АСЕ1 O^s^u*. реакции гидролиза
и Д -0 Т Giy-Giy субстпата FAPGG
о о
gtycy^g'ycffie (GG,
>ЧИ2-Г1«У0ое(у1о*11чт»пу1ок1пи- N-IH2-Fur«ocrYlov«H- фсрМЯГГОМ ACE I (А)
[FAPGG, -ptalyMmm (FAf)
О NOj NOj
^no2 -H2° ^ реагенту TNBS.
GG TNBS TNP-GG
91уе*41усНти 2.4,5-Wnitrobenzeiiesulfbnic N42.4,64reiilrapheoylVglycyt-glycine
acid
Äma, = 420 nm
оценивали no следующей формуле:
1С = [1 — (Ajample ~ А^алк sample) I (Aconlrc! — Ablank control)] X 100, где Acntoi and Аы„к- control представляли собой величины поглощения соответствующих растворов без добавления раствора экстракта.
Ингибирующий потенциал растительных экстрактов сравнивали, используя значения концентраций, вызывающих 50% от максимального ингибирование АСЕ I (IC50), и определяли эти значения из кривых зависимости «доза-эффект». Капгоприл (Captopril), известное лекарственное средство с выраженным гипотензивным эффектом, использовали как позитивный контроль.
2) В тесте по оценке противовоспалительного потенциала растительных экстрактов была использована клеточная линия моноцитов человека ТНР-1 (LPS-stimulated human differentiated acute monocytic leukemia THP-1 cells), стимулированная липополисахаридом. Воспаление - это комплексный многостадийный процесс, возникающий в ответ на повреждение клеточных структур организма или действие патогенного раздражителя и проявляющийся в реакциях, направленных на устранение продуктов повреждения. Макрофаги играют центральную роль в контроле
и реакции присоединения пептида GG к
воспалительного процесса, в частности, посредством увеличения продукции про-воспалительных цитокинов и медиаторов, индуцируемых фактором некроза опухолей (tumor necrosis factor a, TNF-a) и циклооксигеназой 2 (cyclooxygenase 2, СОХ-2) (Allam R and Anders Ш, 2008; Uchida K, 2008). СОХ-2 продуцирует простагландииы (prostaglandins, PQs), которые являются медиаторами болевых ощущений и развития воспалений. В частности, простагландин Е2 (PGE2) вызывает расширение кровеносных сосудов и увеличение их проницаемости, усиливает болевой эффект, вызываемый гистамииом или брадикинином. В более позднюю стадию развития воспаления PGE2 подавляет обмен веществ в лейкоцитах, угнетает фагоцитоз и различные функции лимфоцитов. Супрессия этих медиаторов является эффективной стратегией предотвращения воспалительных процессов (Iwalewa ЕО et al., 2007).
Ингибирование продукции TNF-a и PGE2 клетками ТНР-1 в присутствии растворов экстрактов оценивали с помощью наборов для иммуноферментного анализа Human TNF-a ELISA Ready-SET-Go! kit (eBioscience, USA) и R&D Systems Parameter PGE2 kit (R&D Systems, USA).
3) Антиоксидантную активность растительных экстрактов оценивали, используя метод колориметрии свободных радикалов в модификации, предложенной в работе Hsu С-Y (Hsu C-Y, 2006). В результате реакции восстановления DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгцдразил свободного радикала, растворенного в спирте, с образцом антиоксиданта (АН) по схеме: DPPH* + АН —> DPPH-H + А*, снижается пурпурно-синяя окраска DPPH в спирте, а реакция контролируется по изменению оптической плотности при 514 нм обычными методами спектрофотометрии. Количественно, уровень антиоксиданпюй активности выражали как концентрацию тестируемого раствора, требуемую для захвата 50% свободных радикалов DPPH (SC50). Это значение определяли из кривых «доза-эффект» для каждого тестируемого экстракта.
4) Для поиска веществ, ингибирующих панкреатическую липазу (IIPL) человека, и анализа HPL-ингибирующего потенциала полученных нами растительных экстрактов был использован in vitro метод, основанный на использовании 4-метилумбеллиферил олеата (methylumbelliferyl oleate, 4-MUO) в качестве субстрата для HPL (Sigma-Aldrich, США), активированной панкреатической колипазой (porcine pancreatic colipase, PPCL). После инкубации реакционной смеси (37°С, 60 мин), количество образующегося 4-метилумбеллиферона измеряли с использованием флуориметрического ридера ((Genios FL, Тесап, США) при X« = 360 нм и >-е„ = 460 нм.
Вещества, ингибирующие HPL, которая ответственна за расщепление 50-70% процентов жиров, поступающих с пищей, являются мощным инструментом снижения абсорбции жиров (Thomson ABR et al., 1997; Foster-Schubert KE et al., 2006) . При ипгибировании этого фермента теряется способность расщеплять жиры, поступающие с пшцей в форме триглицеридов, на всасывающиеся свободные жирные кислоты и моноглицериды. В результате поиска веществ из растительных источников, способных противодействовать ожирению, было найдено, что многие вещества, относящиеся к разным классам химических соединений, такие как полифенолы, флавоны, флавонолы, танины, хальконы, терпены и др., с той или иной эффективностью способны ингибировать HPL (Birari RB and Bhutani КК, 2007).
5) Для оценки 5'-АМР-активируемая протеинкиназа (adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK) - активирующего потенциала растительных экстрактов мы разработали тест-систему с использованием дифференцированных клеток мышиных миобластов С2С12 и иммуноферментного метода (ELISA) оценки уровня фосфоршгарованной формы АМРК (фосфо-АМРКа1(Т174), р-АМРК). Процесс
дифференцировки С2С12 миобластов в миотрубки (миотубулы) проводили по ранее описанному методу (Epting CL et al., 2004). Процедуру ELISA проводили согласно протоколу для DuoSet 1С набора для тестирования внутриклеточной p-AMPKal(T174) (R&D systems, США). Концентрацию клеточного белка оценивали с помощью набора "Bio-Rad protein assay kit".
АМРК - клеточная протеинкиназа, контролирующая энергетический баланс клетки, активируется при значительном потреблении энергии (например, при физической нагрузке) и нарастании внутриклеточного уровня AMP. Недавние исследования показали, что каскад реакций, индуцируемый АМРК, тесно связан с регуляцией уровней глюкозы и липидов, сигнальной функцией инсулина, биогенезом митохондрий и т.д., что делает этот каскад перспективной целью при лечении тучности и диабета 2-ого типа (Viollet В et al., 2006). Показано, что ряд природных соединений, например, ресвератрол, эпигаллокатехин галлат (EGCG), кверцетин, берберин, теафлавин, усиливающие уровень фосфорилирования АМРК, могут быть использованы для профилактики и лечения некоторых заболеваний (Hwang JT et al., 2009). АМРК является гетеротримерным комплексом, состоящим из трёх белков: альфа-субъедшшцы, которая обладает собственно киназной активностью, и двух регуляторных субъединиц, бета и гамма АМРК-а — белок с молекулярной массой 63 Ша, состоит из двух доменов: С-концевой домен обеспечивает связывание с регуляторными субъединицами, N-концевой домен обладает киназной активностью и содержит активирующий участок фосфорилирования (треонин-172).
4.2. Результаты скрииипга этанольных экстрактов растительных препаратов.
1) Одиннадцать экстрактов вызывали 50% ингибирование активности ACE I при конципрациях меньших 0.3 мг/мл, что, в соответствии с критерием, предложенным в работе (Eibl G and Wagner H., 1991), свидетельствовало о наличии специфического ингибирования фермента (таблица 33).
Таблица 33. ACE I ингибирующая активность экстрактов растений (ICso <0,3 мг/мл)
Экстракт Семейство IC50 (мг/мл)
Герани луговой трава Geraniaceae 0,081 ±0,022
Кровохлебки корень Rosaceae * 0,084 ±0,007
Кипрея узколистного (Иван-чая) трава Onagraceae 0,087 ±0,017
Ольхи соплодия Betulaceae 0,091 ±0,013
Лапчатки гусиной трава Rosaceae 0,091 ±0,014
Лапчатки корневища Rosaceae 0,110 ±0,011
Бадана корневище Saxifragaceae 0,128 ±0,019
Малины красной листья Rosaceae 0,160 ±0,010
Ежевики семена Rosaceae 0,169 ±0,055
Таволги (лабазника) трава Rosaceae 0,264 ±0,021
Земляники лесной листья Rosaceae 0,275 ± 0,023
* - Розовые (лаг. Rosáceae) — семейство двудольных раздельнолепестных растений, входящее в порядок розоцветных (Rosales). Содержит примерно 3000-4000 видов в 100120 родах. Ранее семейство называлось «Розоцветные».
Значения IC50 для данных экстрактов составляли от 81 мкг/мл для экстракта герани до 275 мкг/мл для экстракта листьев земляники. При этом IC50 для каптоприла было равно 0,65 нг/мл. Вид кривых «доза-эффект» для активных растительных экстрактов напоминал аналогичные данные, полученные при анализе чистых веществ флавоноидов и их
гликозилированных производных (Loizzo MR ct al., 2007). Мономерные соединения, такие как флавоноиды, кеаптоиы, фенилпропапоиды, цианидины и др., а также олигомерные гидролизуемые танины и проантоцианидины могут ингибировать АСЕ I в условиях in vitro (Loizzo MR et ai., 2007). Поскольку присутствие гидролизуемых танинов было обнаружено в 9-и экстрактах из 11-й, за исключением листьев малины и Иван-чая (данные не представлены), мы предположили, что эффект ингибирования может быть связан с присутствием в экстрактах танинов. Возможный механизм ингибирования может включать неспецифическое хелатирование ионов цинка в активном сайте молекулы фермента или осаждение белка (Kang DG et al., 2003; Liu JC et al., 2003). Экстракты листьев малины и земляники показали значительно более выраженную ингибирующую активность, чем плоды этих растений. Возможно, потенциальные антигипертензивные вещества в растениях семейства Розоцветньпс более представлены в листьях, чем в плодах.
Наше исследование показало, что первоочередными кандидатами для выделения потенциальных ингибиторов ACE I и идентификации их химической структуры могут быть растения семейства Розоцветных.
2) Ряд экстрактов в количествах, нетоксичных для клеток, ингибировал продукцию TNF-a и PGE2 клетками ТНР-1 (рис 41, 42, более подробные данные в публикации Kalinkevich К et al., 2013). Действие 16-и экстрактов вызывало дозо-зависимое снижение продукции TNF-a и действие 15-н экстрактов - PGE2. Экстракты коры калины, цветков пижмы, травы курильского чая, травы грушанки круглолистной и травы зимолюбки зонтичной ингибировали синтез обоих воспагнггельных медиаторов, TNF-a и PGE2, в диапазоне концентраций экстрактов от 0,01 до 1,0 мг/мл. Следует отметать, что два последних растения принадлежат к одному семейству - Грушанковые (Pyrolaceae).
Эффект действия экстрактов сравнивали с эффектами двух синтетических нестероидных противовоспалительных препаратов: дексаметазона (dexamethasone), ингибитора IL-ip, TNF-a, NO and PGE2 синтеза (Li G et al., 2005), и нимесулида (nimesulide), специфического COX-2 ингибитора (FitzGerald GA and Patrono С, 2001).
При концентрации 0,1 мг/мл 16 экстрактов вызывают значительное (>30%) снижение уровня продукции TNF-a клетками ТНР-1, сравнимое с действием 3,9 мкг/мл раствора дексаметазона, при этом 12 экстрактов не оказывают токсического действия на рост клеток даже при концентрации 1,0 мг/мл (рис. 41).
В тесте на PGE2, более высокие концентрации экстрактов и более продолжительное время инкубации клеток в присутствие экстрактов требовались для достижения значительного эффекта ингибирования синтеза PGE2 (рис 42). 15 экстрактов при концентрации 1,0 мг/мл снижали уровень PGE2 более чем на 33%, хотя только 6 из них: базилик, трава горца змеиного, трава горца перечного (водяного перца), трава горца почечуйного, фрукты фейхоа и цветки бессмертника песчаного, не давали цитотоксического эффекта При концентрации 0,1 мг/мл, только экстракт травы грушанки круглолистной вызывал более чем 30% снижение синтеза PGE2 без снижения выживаемости клеток. Для сравнения, 3,9 мкг/мл раствор нимесулида снижал концентрацию PGE2 в культуратьной среде на 83%.
Следует отметить, что некоторые экстракты специфически ингибировали продукцию только одного из анализируемых медиаторов воспаления, так, препараты семян чечевицы и лисичек проявили наибольшую активность в TNF-a-тесте, в то время как препараты травы горца перечного, горца почечуйного, ортит однобокой и базилика - в PGF,2-tcctc.
» о
тщ^
■ш
90 *
; ш1.о |
1 f «0.1
Рис. 41. Эффект экстрактов растений (0.01, 0,1 или 1,0 мг/мл) и
дексаметазона (3,9 мкг/мл, 10 цМ) на иигибирование продукции ТТ^-а (%, столбики), и выживаемость ТНР-1 клеток (%, символы); 4 ч инкубация. Результаты двух независимых экспериментов.
Рис. 42. Эффект экстрактов растений (0,01, 0,1 или 1,0 мг/мл) и нимесулида (10 цМ) на интбирование продукции РОЕ2 (%, столбики), и выживаемость ТНР-1 клеток (%, символы); 24 ч инкубация. Результаты двух независимых экспериментов.
3) Данные по антиоксидантной активности пяти наиболее активных в ОРРН-тесте экстрактов представлены в таблице 34.
Таблица 34. Антиоксвдантная активность экстрактов.
Экстракт SC50, мкг/мл1
Ольхи соплодия 2,1 ±0,1
Лапчатки корневища 2,5 ±0,1
Дуба кора 3,5 ±0,2
Черники обыкновенной побеги 3,7 ±0,2
Бадана корневище 3,7 ±0,1
концентрация, требуемая для захвата 50% свободных радикалов DPPH (half-scavenging concentration).
4) Ряд экстрактов эффективно и дозо-зависимо ннпгопровал фермент НРЬ. Данные по уровням концентраций, требуемых для 50%-ого ингибирования НРЬ, для пяти наиболее эффективных в этом отношении экстрактов представлены в таблице 35.
Таблица 35. HPL ингибирующая активность экстрактов растений.
Экстракт ICso, мг/мл
Бадана корневище 0,0013 ± 0,0007
Горца перечного (водяного перца) трава 0,0026 ± 0,0004
Таволги (лабазника) трава 0,0058 ±0,0014
Малины красной листья 0,0112 ±0,0051
Лапчатки корневища 0,0115 ±0,0014
5) Только двадцать экстрактов растений, для которых в литературе по народной медицине имелись указания об антидиабетическом действии, анализировали в тесте на активацию АМРК (в связи с высокой стоимостью данного теста). Полученные данные для четырех экстрактов представлены в таблице 36.
Таблица 36. Уровень индукции фосфо-АМРК в С2С12 миотубулах (в контрольных клетках содержание р-АМРК принято за I) в присутствии разных концентраций экстрактов. Время инкубации 3 ч.
Экстракт Концентрация, мг/мл
0,01 1 0,05 0,2 0,5
Степень индукции р-АМРК
Барбариса обыкновенного корень 3,4+1,4 3,75+0,75 3,0+0,1
Бархата амурского кора и лыко 2,8+0,3
Грушапки круглолистной трава 0,55+0,15 2,0+0,2 1,8+0,1
Горца птичьего трава 1,1+0,1 0,95+0,25 1,6+0,12
Метформин, 1,4 мг/мл 3,2+1,6
Берберин, 0,03 мг/мл 3,45+1,35
4.3. Идентификация новых соединений из экстрактов, активных в in vitro
тестах.
Несколько из проанализированных экстрактов показали высокую активность в более чем одном тесте: экстракт соплодий ольхи - в DPPH и ACE I тестах, экстракт из корневищ бадана - в HPL and ACE I тестах, экстракт грушанки круглолистной - в АМРК и PGE2 тестах. Поэтому мы предприняли попытки выделения активных индивидуальных веществ из этих экстрактов.
4.3.1. Идентификация нового эллагитаннина из экстракта соплодий ольхи.
Экстракт соплодий ольхи фракционировали в водно-органических растворах с использованием ряда органических растворителей. Вещества водной и бутанольной фракций показали наибольший уровень антиоксидангной активности и были подвергнуты дальнейшему фракционированию с использованием RP HPLC. В результате фракционирования материала водной фазы были выделены хроматографически гомогенные вещества 1 и 2, а бутанольной фазы - вещества 1 и 2 и 3 (рис 43,С).
Масс-спектроскопический анализ (LC TOF/MS ESI") соединения 1 показал наличие молекулярного иона с m/z = 783.0647 [М-Н]', что соответствовало молекулярной формуле
[С34Н23О22]". На основании результатов 'Н ЯМР анализа этого соединения, данных по определению продуктов его кислотного и ферментативного (танназа) гидролиза, а также анализа UV спектров этих веществ и сравнения комплекса полученных данных с имеющимися в литературе (Khanbabaee и Großer, 2003; Okuda, et al. 1983), соединение 1 было идентифицировано как педункулагин (pedunculagin, соединение 1, рис 43,С). Масс-спектр вещества 3 показал наличие молекулярного иона с m/z = 933.0604 [М-Н]', что соответствовало молекулярной формуле [C41H25O2S]". 'Н ЯМР спектр имел сигналы валонеоилыюй группы (Hatano et al., 1991), гексагидроксидифеноильной группы (hexahydroxydiphenoyl, HHDP) и сигнал Н-6" (5 6.98), показывающий присутствие депсидной связи в структуре соединения. На основании наших и опубликованных (Hatano et al., 1991) данных, соединение 3 было идентифицировано как праекоксин Д (соединение 3, praecoxin D, рис 43,С).
Соединение 2 в масс-спектре имело пик молекулярного иона [М-Н]" со значением m/z = 1235.0785, что соответствовало формуле [С55Н31О34]" (рис. 43, A). UV спектр соединения позволил предположить присутствие остатка эллаговой кислоты, а родаминовый тест и результаты кислотного и ферметггативного (танназа) гидролиза -отсутствие неэтерифицированного остатка галловой кислоты (только 13% соединения 2 расщеплялось танназой за 2 час, давая 5,7% эллаговой кислоты без образования галловой кислоты). !Н ЯМР спектр соединения 2 (рис. 43, В) был близок к спектру давурицшша Mi (davuriciin М[, соединение 4 на рис. 43,С) (Yoshida et al., 1989). Спектр содержал сигналы характерные для двух HHDP групп, остатков галловой, эллаговой кислот и комплекс семи протонов глюкозы. Исходя из данных, что 1) С-1 гидроксильная группа ацетилирована (Н-1 (8 6.09, J 8.5 Hz)), 2) кислотный гидролиз дает 2 соединения - эллаговую кислоту и соединение с m/z 469.05, [М-Н]", молекулярная формула [С21Н9О13У, которое состоит из остатков галловой и эллаговой кислоты в соотношении 2:1 ('Н ЯМР данные для препарата выделенного данного соединения), 3) данных HPLC анализа кислотных и танназных гидролизатов соединения 2 и его фрагментов и родаминового теста, мы заключили, что:
1) С-1 гидроксильная группа соединения 2 образует связь с остатком галловой кислоты,
2) синглетный сигнал двойной интенсивности протонов остатка галловой кислоты показывает, что остаток соединен с остатком эллаговой кислоты посредством С-4' (para) гидроксильной группы. В давурициине Mi эта связь реализована через С-3' (meta) гидроксил (Yoshida et al., 1989).
Структура, подобная соединению 2, в литературе еще не описана, поэтому мы назвали соединение 2 глутиноином (glutinoin). Эллагоил-галлоил мотив глутиноина представляет собой структурный изомер дилактона валонеиновой кислоты (valonéate acid dilactone), выделенной из Quercus valonea (Schmidt и Komarek, 1955), и дилактона сангвисорбиновой кислоты (sanguisorbic acid dilactone), обнаруженной в Sanguisorba officinalis (Nonaka et al., 1982). Соединение с р-СОС-типом связи между двумя структурными единицами, соответствующее эллагоил-галлоил мотиву в структуре 2, мы назвали дилакгоном глутиноиловой кислоты и соответствующую группу — глутиноилом (R1, рис 43, С). Педункулагин (1), глутиноин (2) и праекоксин Д (3), изолированные из соплодий ольхи, показали высокую шггиоксидантную активность в DPPH тесте (таблица 37) - значения SC50 для этих соединений сравнимы с активностью таких известных антиокевдантов, как галловая и аскорбиновая кислоты.
К". I-1
10
J из QB'6 393 9MS202.UC27
V У,,. ".^p8"
1235 OTES 1333.0834,1237.001«
Группа Протон AueTon-d6, 400 MHz
1 6,09-6,11
2 5,09-5,15
3 5,35-5,40
Glucose 4 5,2-5,3
5 4,4
б, 6' 5,09-5,15
3,77-3,80
6,37
HHDP 6,48
6,55
6,70
Ellagoyl 7,65
GalloyI 7,26
7,26
Рис. 43. (А) Масс-спектр (TOF/MS ESI') соединения 2; (В) 'H ЯМР данные (химический сдвиг протонов, в ррт) для соединения 2; (С) Химическая структура педункулагина (1), глутиноина (2), и праекоксина D (3), а также давурициина Ml (4). Структуры глутююилыюй (Ri) and сангвисорбиноильной (R2) групп соединений 2 и 4 показаны отдельно.
Таблица 37. Антиоксидантная активность соединений 1-3 и двух известных антиоксидантов.
Соединение SC50 (мкг/мл) SC5i) (мкМ)
1, Педункулагин 0,95 ±0,02 1,21 ±0,03
2, Глутиноин 1,00 ±0,10 0,81 ±0,08
3, Праекоксин D 1,01 ±0,06 1,08 ±0,06
Галловая кислота 0,59 ±0,06 3,47 ±0,35
Аскорбиновая кислота 1,75 ±0,04 9,93 ±0,22
4.3.2. Идентификация нового ингибитора липазы.
Экстракт корневищ бадана был подвергнут дальнейшему фракционированию с использованием гидрофобной хроматографии низкого давления и многоступенчатой RP HPLC (детально описано в публикации Ivanov SA et al., 2011). На финальной стадии фракционирования были выделены два индивидуальных соединения и фракция широкого пика элюции, показавшие высокий уровень ингибирования HPL (IC5o ~ 0,5-0,8 мкг/мл).
Соединение 5 в масс-спектре (LC TOF/MS ESI+) имело пик молекулярного иона с m/z 595.1046 [М+Н]\ что соответствовало молекулярной формуле С25Н23О14 .Значения химических сдвигов в 400-MHz 'Н ЯМР спектре соединения 5 были близки спектру (-)-катехин З-О-галлата, полученного в аналогичных условиях анализа (таблица 38), за исключением небольшой разницы в Ьн сигналов Н-4а и Н-4Ь. Синглетный сигнал с двойной интенсивностью при 6 6,94 ррш свидетельствовал о присутствии З-О-галлоильного остатка в соединении 5. Такой же сигнал при 6 7,15 ррт в совокупности со сдвигом в более высокую область для ароматических протонов Н-6 (8 6,26) и Н-8 (6 6,35) показывал присутствие второго галлоилыюго остатка при С-5 (Hyoung JK et al., 2009). На основании этих данных мы предположили, что соединение 5 содержит (+/-)-катсхин-подобную коровую структуру. Для определения абсолютной конфигурации молекулы соединение 5 гидролизовали танназой, разделяли компоненты HPLC хроматографией и анализировали методом кругового дихроизма (КД), используя в качестве стандартов препараты (+)-катехина и (-)-катехина (рис 44). Полученные спектры показали, что коровая структура соединения 5 является (+)-катехином. Таким образом, на основании данных масс-спектров, данных 'Н и 13С ЯМР, а также спектров КД, соединение 5 было идентифицировано как (+)-катехин 3,5-ди-О-галлат ((+)-catechin 3,5-di-O-gallate). Предложенная структура была подтверждена спектрами двумерного ЯМР НМВС (Ileteronuclear Multiple Bond Coherence) (рис 45). Анализ литературы показал, что это соединение не было получено или описано ранее и является новым фенольным соединением растительного происхождения. Методами, аналогичными описанным выше, соединение 6 было идентифицировано как (+)-катехин З-О-галлат ((+)-catechin 3-O-gallate) (таблица 38; рис 45).
Фракция широкого пика элюции, упомянутого ранее, по данным MALDI-TOF масс-спектра состояла из олигомеров проантоцианидинов (данные не представлены).
Сравнение HPL ингибирующей активности (таблица 39) и антиоксидантной активности (таблица 40) выделе!шых соединен™ с известными соединениями показывает, что (+)-катехин 3,5-ди-О-галлат является сильным ингибитором HPL, сравнимым по активности с кагехиновыми производными зеленого и «улуи» чаев (Nakai М et al., 2005), а также проявляет сильную шггиоксидашную активность.
4.3.3. Идентификация активатора АМРК.
Известно, что препараты барбариса обыкновенного и бархата амурского являются источниками берберина и родственных ему соединений, а берберин, в свою очередь, является сильным индуктором фосфорилирования АМРК (Yin J et al., 2008). При этом, берберин усиливает метаболизм глюкозы в клетках, стимулируя гликолиз, но ингибируя окисление глюкозы в митохондриях.
Фракционирование экстрактов препаратов барбариса обыкновенного и бархата амурского методами HPLC позволило выделить несколько индивидуальных соединений, активных а АМРК тесте. Масс-спектрометрический и ЯМР анализы этих веществ показали, что они представляют собой известные соединения: берберин или его производные (джатроризин (Jatrorrizine), ламбертин (Lambertine) и палматин (Palmatine) в
Таблица 38. 'H (400 MHz, CD3OD) и 13С ЯМР (100 MHz, CD3OD) спектры соединений S и 6 и (-)-катехин З-Огаллата (химический сдвиг 8 в ррт, константы спин-спинового
e Wako Со, Япония.
< tu ^¡<Ьв
■t.t of Л. 3-i>4li-c«:U»t.v
Гкл
i —-"-
i *-(Г_
в
Соединение S '-)-Катехин З-О-галлат " Соединение 6
Протон 8„ Углерод Se Протон 5я 8„
2 5,18, d (5,2) 2 79,S 2 5,06, d 5,05, d
3 5,38, q (5,4) 3 70,8 3 5,36, q 5,37, q
4а 2,66, dd 4 24,4 4a 2,71, dd 2,65, dd
4Ь 2,75, dd 5 152,2 4b 2,81, dd 2,79, dd
6 6,26, d (2.4) 6 104,2 6 5,93,d 5,93, d
8 6,35, d (2,4) 7 158,8 8 5,95, d 5,95, d
2' 6,82, s 8 102,1 2' 6,83,s 6,83, s
5',6' 6,72, m 9 156,9 5',6' 6,71,d 6,71,m
2",б" 6,94, s 10 105,6 6' 6,96, s 6,95, s
2"',6'" 7,15,s Г 131,5 2",6"
2' 114,6 2'",6'"
3',4' 146,8; 146,9
5' 116,8
6' 119,4
3-O-galIoyl
Г' 121,6
2",6" 110,6
3",5" 146,9
4" 140,4
C'OO 167,9
5-O-galloyl
Г" 120,6
2"',6'" 111,0
3"';5"' 147,1
4"' 141,0
C'OO 166,8
H
i HOyk
S
H
'Tj
он
В - H: (4>ca*«<fiin зозапаю, 2 В - gaïioyl: (+VcaHK)iin 3.s-d».0-Ba!tate. 1
Рис. 45. (A) HMBC протон-углеродные корреляции (+)-кэтехин 3,5-ди-О-галлата; (В) структуры (+)-катехин 3,5-ди-О-галлата (1) и (+)-катехин 3-0- галлата (2).
Рис. 44. Спектры КД соединения 5, (+)-катехина и (-)-катехина.
Таблица 39. HPL ингибирующая активность катехннов.
(+)-катехин 3,5-ди-О-гал.чат (5) (+)-катехин 3-О- галлат (6) (-)-катехин 3-О- галлатJ (-)-эпикатехин З-О- галлата
IC50, мкг/мл 0,42 ± 0,03 2,02±0,11 2,45 ±0,23 3,22±0,25
а - Wako Со, Япония.
Таблица 40. Антиоксидантиая активность соединений 5 и 6 и котрольных соединений.
Соединение SC51) (мкг/мл) SC5„ (рМ)
5. (+)-катехин 3,5-di-O- галлат 1,04 ± 0,06 1,75±0,10
6, (+)-катехин З-О- галлат 1,33 ±0,05 3,01±0,11
Галловая кислота 0,59 ±0,06 3.47±0,35
(+)-катехин гидрат 1,97 ±0,23 6,79±0,79
Butylated Hydroxy Toluene (ВНТ) 5,90 ± 0,74 26,8±3,4
случае экстракта барбариса; и палматин и оксипалматин в случае экстракта бархата амурского).
Поэтому, дальнейшая работа была сфокусирована на идентификации активного компонетгта га экстракта грушанки круглолистной. Экстракт фракционировали с помощью органических растворителей, и активные фракции разделяли далее методом RP HPLC (детали процесса приведены в работе Ptitsyn et al., 2011). В результате было выделено индивидуальное соединение, дающее на масс-спектре пик молекулярного иона [М+Н]+ с m/z 203.0681, что соответствует молекулярной формуле СцНцОз (соединение 7). 'Н ЯМР спектр показал наличие сигналов трех ароматических протонов (5 7.94, 7.77, и 7.98), одного хипоноидного протона (5 6.97 (1Н, q, J=1.5 Hz)), одного хинонондного метила (8 2.09 (ЗН, d, J=1.5 Hz)), а также наличие дублета (8 4.66) для двух протонов и триплета для протона гидроксильной группы (5 5.55, D20 обменивающийся) (таблица 41). Сигнал с 5 62.5 в спектре 13С ЯМР указывал на присутствие -СН2ОН группы в структуре соединетм. Спектры 'Н и ,ЭС ЯМР в совокупности с другими данными (масс- и UV спектры) указывали, что выделенное вещество является нафтохиноном, а именно, 2-метил-7-гидроксиметил-1,4-нафтохиноном (2-methyl-7-hydroxymethyl-l,4-naphthoquinone (M-HM-NQ)) (рис. 46). Локализация заместителей в коровой структуре нафтохинона была подтверждена методами гетероядерного резонанса (HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) и HMBC). Было показано, что Н-2' метальной группы коррелирует с С-1 (5 185.5), С-2 (5 148.3) и С-3 (5 135.6); Н-7' -СН2- группы взаимодействует с С-7 (5 149.7) и С-8 (5 123.7), а протон гидроксильной группы - с С-7' (8 62.5) и С-7, что однозначно указывает на локализацию гидроксильной группы при С-7. 2-метил-7-гидроксиметил-1,4-нафтохинон (7'-hydroxy-chimaphilin) был ранее обнаружен среди нафтохинонов в препарате Pyrolae herba (Kagawa К et al., 1992), однако исследования его биологической активности ранее не проводились.
M-HM-NQ в диапазоне концентраций 1-20 мкг/мл дозо-зависимо активировал АМРК в дифференцированных клетках С2С12 (рис. 47). При концентрации 10 мкг/мл (50 цМ) уровень фосфо-АМРК в миотубулах повышался почти в 4 раза по сравнению с контролем. Таким образом, этот активатор АМРК сравним по активности с ресвератролом (стимулирование АМРК при 25 рМ, Park СЕ et al., 2007) или гинзенозидом 20(S)-Rg3 (1050 цМ, Park MW et al., 2008) и может быть перспективен в качестве компонента функционального питания.
Таблица 41. Соединение 7. 'H (400 MHz, DMSO-d6) и 13С ЯМР (100 MHz, DMSO-d6) спектры (химический сдвиг 8 в ррт, константы спин-спинового взаимодействия /(в скобках) в Hz).
Углерод 5с Ьн
1 185,5
2 148,3
3 135,6 6,97, q (1,5)
4 184,8
5 126,0 7,94, d (7,9)
6 132,1 7,77, dd (8,0, 1,0)
7 149,7
8 123,7 7,98, d (0,9)
9 131,7
10 130,8
2' 16,3 2,09, d (1,5) (3H)
7' 62,5 4,66, d (5,7) (2H)
5,55, t (5,7) (OH)*
НО
Рис. 46. Структура соединения 7 (2-метил-7-гидроксиметил-1,4-нафтохинон).
DMSO-dc + D20
Рис. 47. Уровень фосфо-АМРК в С2С12 миотубулах (в контрольных клетках принят за 1) в присутствии разных концентраций М-НМ-ЫС*. Время инкубации 3 ч.
M-HM-NQ, »«г/мл
4.4. Заключение. Потенциальная возможность микробиологического сиитеза идентифицированных соединений.
Ряд растительных экстрактов, проявивших высокую активность в in vitro тестах, являются перспективными объектами для дальнейшей идентификации биологически активных соединений, потенциально пригодных для разработки препаратов, направленных на профилактику и лечение комплекса различных метаболических нарушений человека (метаболического синдрома).
В ходе работы впервые были идентифицированы индивидуальные вещества: а) глутиноин (из экстракта соплодий ольхи) показавший высокую антиоксидаитную активность, сравнимую с активностью таких известных антиоксидантов, как галловая и аскорбиновая кислоты; б) (+)-катехин 3,5-ди-О-галлат (из корневищ бадана), обладающий
высокой аптиоксидантной и HPL ингибирующей активностями, сравнимыми с препаратами известных антиоксидантов и дипазных ингибиторов растительного происхождения.
Для соединения 2-метил-7-гидроксиметил-1,4-нафтохинона (из экстракта грушанки круглолистной) впервые показана способность индуцировать фосфорилирование ЛМРК в
эукариотических клетках.
Биологические эффекты (+)-катехинов в последнее время интенсивно изучаются. Так, было показано, что данные препараты удлиняют жизнь круглых червей - нематод (Saul, N et al., 2009), снижают развитие атеросклероза у АроЕ-дефицнтных мышей (Auclair S et al., 2008), ингибируют развитие интестнальных опухолей у мышей (Weyant M J et al., 2001). Показано, что (+)-катехин более активен, чем (-)-эпикатсхнн в предотвращении оксидативных повреждений ДНК (Haza AI and Morales P, 2011 ).
Достигнутые в последние годы успехи в метаболической инженерии в клетках E.coli биосинтеза метаболитов - предшественников флавононов (Leonard Е et al., 2007), биосинтеза флаванонов (Leonard Е et al., 2007) и флавонолов (Katsuyama Y et al., 2007), дают хорошие шансы разработать стратегию микробиологического сщггеза катехипов (флаван-3-олов) путем реализации в E.coli искусственных путей их биосшггеза, включающих в дополнение к схемам, упомянутым выше, экспрессию генов дигидрофлаваиол-4 редукгазы и лейкоагггоцианидин редуктазы.
Также, известно, что хотя большинство 1,4-нафтохшюнов, найденных в природе, продуцируются растениями, мотивы нафтохинона, присутствующие в ряде антибиотиков (например, в рифампищшах), синтезируются микроорганизмами с использованием метаболитов ггути биосинтеза шикимата (Bentley R, 1975).
Таким образом, использование принципов метаболической инженерии, включающее комбинацию и оптимизацию биосишетических путей микроорганизмов и растений в клетках индустриальных микроорганизмов (и, в частности, E.coli) дает возможность осуществления продухщ™ таких молекул, как (+)-катехин 3,5-ди-О-галлат или 2-мегал-7-гидроксиметил-1,4-нафтохинон.
ВЫВОДЫ
1. Впервые сконструирован рекомбинантный штамм Е. coli для биолюминесцентной оценки SOS-ответа клеток на действие ДНК-повреждающих факторов. На его основе создана тест-система (SOS-te тест) для оценки генотоксичносш химических веществ и физических факторов (у-и UV-излучение).
2. С использованием SOS-lux теста проведена оценка генотоксичности и общей токсичности ряда соединений платины, проявляющих противоопухолевую активность, в частности, показано, что генотоксический эффект щс-ДДП и циклоплатама коррелирует с их антимитотическим действием. Таким образом, SOS-lux тест может быть использован для анализа генотоксичносга при скрининге вновь синтезируемых противоопухолевых веществ.
3 На основе клеток Е. coli сконструирован ряд штаммов-продуцентов щпокинов и факторов роста (IL-3, IL-4, IL4-82, IL-10, GDNF, KGF, IL-lra, EGF человека, у-шггерферона быка (blFN-y)) с использованием синтетических или полусингетических генов данных белков. Высокоэффективная продукция белков была достигнута за счет: оптимизации силы промоторов в экспрессионных плазмидах; применения высокоэффективных рибосом-связывающих последовательностей; строгой регуляции
транскрипции генов; оптимизации состава кодонов синтетических генов; а также, в ряде случаев, модификации первичной структуры 5'-нетранслируемых областей mRNA и предотвращения протеолиза целевых продуктов путем использования цггаммов Е. coli, дефектных по некоторым протсазам.
4. Для продукции EGF человека сконструирована система экскреции, основанная на одновременной регуляции экспрессии гена целевого полипептида и гена kil, что позволяет осуществлять одновременную индукцию как синтеза рекомбинантного белка, так и механизма, обеспечивающего его секрецию в культуральную среду клеток E.coli.
5. Для ряда рекомбинантных белков разработаны методы их выделения и очистки.
6. Впервые показана возможность интенсивного усвоения глюкозы штаммами E.coli при усиленной экспрессии пермеазы EIINas.
7. Получены новые мутантные варианты алкоголь дегидрогеназы - альдегид дегидрогеназы Е. coli (AdhE), обеспечивающие рост клеток на средах с этанолом в качестве единственного источника углерода в аэробных условиях культивирования. На примере продукции треонина показана необходимость модификации ряда метаболических путей Е. coli (усиление non-PTS транспорта глюкозы, введение делеций по генам пируват киназ, усиление экспрессии фосфоенолпируват карбоксилазы, экспрессия мутантной алкоголь дегидрогеназы-альдегид дегидрогеназы) для эффективной продукции аминокислоты при использовании в ростовых средах смесей глюкоза/этанол.
8. Получены новые, устойчивые к ретроингибированию, варианты мутантных N-ацетилглутамагг сингетазы и карбамоилфосфат сшгтетазы £. coli, ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина, которые были использованы при конструировании промышленных штаммов-продуцентов.
9. Впервые идентифицированы гены (ygjG и ydcW) и охарактеризованы соответствующие белки одного га путей деградации путресцина в E.coli, получившего в базе данных ЕсоСус наименование pathway; putrescine degradation I.
10. С использованием ряда тестов in vitro проведен скрининг более ста препаратов этшюльных экстрактов растений, произрастающих на территории России. Выявлены экстракты, обладающие высокой ACEI и HPL ингибирующей, противовоспалительной, антиоксидангной, а также АМРК активирующей активностями.
11. Иде1ггифицирован ряд индивидуальных веществ, включая два ранее неизвестных ((+)-катехин 3,5-ди-О-галлат - HPL ингибитор и глутиноин - ангиоксидант), высокоактивных в указанных выше тестах. Возможность микробиологического синтеза идентифицированных соединений обсуждается с учетом достигнутых в последние годы успехов в метаболической инженерии Е. coli.
Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:
1. Птицын Л.Р., Гуревич В.Б., Барсанова Т.Г., Шендеров А Н., Хайкинсон М.Я., Степанов А.И. Клонирование и инсерционный мутагенез фрагмента ДНК, кодирующего люминесцентную систему Photobacterium leiognathi. // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. - 1988. - №10. -С. 17-19.
2. Птицын Л.Р., Фатова М.А, Степанов А.И Экспрессия генов биолюминесцентной системы Photobacterium leiognathi в Escherichia coli. // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. - 1990. —№2. -С. 26-29.
3. Луценко С.В., Гуревич А.И., Птицын Л.Р., Рязанова Л.А., Смирнов В.А. Системы экспрессии в E.coli рекомбинантного интерлейкина-З. //Биоорганическая химия. - 1992. -Т. 18(3). - С. 391 -397.
4. Птицын Л.Р., Альтман И.Б. Рекомбинантаые штаммы Escherichia coli, обеспечивающие высокий уровень экспрессии интерлейкина-З и интерлейкина-4 человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1995. - № 1. - С. 83-85.
5. Птицын Л.Р., Альтман И.Б., Гуров М.В., Куркин А Н. Экспрессия интерлейкина-10 человека в клетках Е. coli. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1995. - №3. - С. 324327.
6. Птицын Л.Р. Биолюминесцептный анализ SOS-ответа клеток Escherichia coli. // Генетика -1996. - Т. 32(3). - С. 354-358.
7. Рязанова Л.А., Птицын Л.|\, Иванов В.Б., Быстрова Е.И., Яковлев К.И., Рожкова Н.Д Сравнительная оценка генотоксическогодействия комплексных соединений платины в про- и эукариотических тест-системах. // Доклады Академия Наук. — 1996. —Т. 350(2). — С. 259-262.
8. Евдокимова A.A., Птицын Л.Р., Альтман И.Б., Фомин Б.А., Калужский В.Е., Машко С.В Использование высокоэффективной системы транскрипции бактериофага Т7 для создания штамма E.coli — продуцента рекомбинантного гамма-интерферона быка // Биотехнология. -1996. -№10. - С. 3-11.
9. Rettberg P., Horneck G., Krasavin Е., Komova О., Ptitsyn L., Kozubeck S. Plasmid und damit transformierter Mikroorganismus fur ein Verfahren zur luminometrischen Bestimmung der mutagenen und/oder karzinogenen Potenz eines Agens. Deutsches Patent N 19544374, (20.02.1997), -8 p.
10. Птицын Л.Р., Рязанова Л.А., Иванов B E. Применение recF мутатних штаммов Escherichia coli для анализа генотоксичности комплексных соединений платины. // Генетика. - 1997. - Т. 33(7). -С. 1020-1024.
11. Птицын Л.Р., Альтман И.Б., РогожкинаЕ.В., Ломакин И.Б., Винецкий Ю.П., Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Машко С.В. Эффективный биосинтез рекомбинантного рецепторного антагониста и1перлейкина-1 человека в клетках Escherichia coli. // Биотехнология. - 1997. — №1. -С. 3-11.
12. Альтман И.Б., Птицын Л.Р., Смирнов С.В., Калужский В.Е., Машко С.В. Создание штамма-продуцента рекомбинантного у-интерферона быка, пригодного для эффективного биотехнологического производства. //Биотехнология. — 1997. -№11-12. - С 3-13.
13. Ptitsyn L., Horneck G., Komova О., Kozubek S., Krasavin E., Bonev M„ Rettberg P. A biosensor for environmental genotoxin screening based on an SOS lux assay in recombinant Escherichia coli cells. // Appl Environ Microbiol. - 1997. - V. 63(11). - P. 4377-4384.
14. Птицын Л.Р., Альтман И.Б., Гуров M.B. Экспрессия синтетического гена интерлейкина-10 человека и его вариантов в клетках Е. coli. // Биоорганическая химия. - 1998. Т. 24(1). - С. 48-57.
15. Птицын Л.Р., Альтман И.Б., Гуров М.В., Васильев A.B., Воротеляк Е.А., Терских В В. Продукция рекомбинантного фактора роста кератаноцитов человека в клетках Escherichia coli. // Биоорганическая химия. - 1998. - Т. 24(7). - С. 523-529.
16. Rettberg R, Horneck G., Krasavin E., Komova 0., Pticyn L., Kozubeck S. Verfahren zur luminometrischen Bestimmung der mutagenen und'oder karzinogenen Potenz einer zu untersuchenden Probe oder eines zu untersuchenden Faktors (Agens). // Deutsches Patent N 19549417 (13.08.1998) -8 p.
17. Rettberg P., Baumstark-Khan C., Bändel K., Ptitsyn L.R., Horneck G., Microscale application of the SOS-LUX-test as biosensor for genotoxie agents. // Analytica Chimica Acta. - 1999. - V. 387. - P. 289-296.
18. Птицын JI.P., Смирнов С В., Альтман И.Б., Самсонова H.H., Ходякова A.B., Василенко Р.Н. Продукция рекомбинантного 1L-452 - природной изоформы интерлейкина-4 человека, в клетках Escherichia coli. // Биоорганическая химия. - 1999. - Т. 25(8). - С. 623-629.
19. Птицын Л.Р., Альтман И.Б. Экстраклеточная продукция рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (hEGF) в клетках Escherichia coli. // Биоорганическая химия. - 1999. - Т. 25(12).-С. 923-929.
20. Samsonova N.N., Smirnov S.V., Altman IB., Ptitsyn LR. Molecular cloning and characterization of Escherichia coli K12 ygjG gene. // BMC Microbiol. - 2003. - V. 3(1:2). - P. 1-10.
21. Гусятинер M M., Козлов Ю.И., Птицын Л.Р., Альтман И.Б., Ворошилова Э.Б., Йомантас Ю-А.В., Ямпольская Т.А. Способ получения L-аминокисяоты методом ферментации, штамм бактерии Escherichia coli - продуцент L-аминокислоты (варианты) // Патент РФ RU 2207376 (27. 06. 2003).-7 с.
22. Vasiliev AM., Vasilenko R.N., Kulikova N.L., Andreev S M., Chikileva I.O., Puchkova G.Y., Kosarev I.V., Khodyakova A.V., Khlebnikov V S., Ptitsyn L.R., Shcherbakov G.Y., Uversky V.M., DuBuske L.M., Abramov V.M Structural and functional properties of IL-452, an alternative splice variant of human IL-4. // J Proteome Res. - 2003. - V. 2(3). -P. 273-281.
23. Гусятинер M.M.; Леонова T.B.; Птицын Л.Р., Ямпольская Т.А. Способ получения L-арпшина, штамм Escherichia coli - продуцент L-аргинина // Патент РФ RU 2208640 (20.07.2003). - 4 с.
24. Птицын Л.Р., Альтман И.Б., Смирнов С.В., Ростова Ю.Г., Ямпольская Т.А., Леонова ТВ., Гусятинер М.М. Мутантная N-ацетилглутамат синтаза (варианты), фрагмент ДНК, штамм бактерии Escherichia coli - проду цент аргинина (варианты) и способ получения L-аргинина. // Патент РФ RU 2215783 (10.11.2003). - 7 с.
25. Gusyatiner MM, Kozlov Yu.I., Ptitsyn L.R., Altman I.B., Voroshilova E.B., lomantas Y.A.V., Yampolskaya T.A. Method for producing L-amino acids by fermentation of an Escherichia strain which is transformed with a pyruvate carboxylase-encoding gene from Bacilus subtilis. // European Patent EP 1092776 (07-07-2004). - 26 p.
26. Ptitsyn L.R,, Altman I.B„ Smimov S.V., Rostova Y.G., Yampolskaya T.A., Leonova T.V., Gusyatiner M.M Mutant N-acetylglutamate synthase and method for L-arginine production. // USA Patent 6,790,647 (14 09.2004). - 13 p.
27. Gusyatiner M.M., Leonova T.V., Ptitsyn L.R., Yampolskaya T.A. L-arginine producing Escherichia coli and method of producing L-arginine. // USA Patent 6,841,365 (11.01.2005). - 5 p.
28. Gronskiy S.V., ZakataevaN.P., Vitushkina M.V., Ptitsyn L.R., Altman LB., Novikova A.E., Livshits V.A. The yicM (nepl) gene of Escherichia coli encodes a major facilitator superfamily protein involved in efflux of purine ribonucleosides. // FEMS Microbiol Lett . - 2005. - V. 250(1). - P. 39-47.
29. Gusyatiner MM., Kozlov Yu.I., Ptitsyn L.R., Altman I.B., Voroshilova E.B., lomantas Y.A.V., Yampolskaya T.A. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren mittels Fermentation eines Escherichia Stammes, transformiert mit einem Pyruvat-carboxylase Gen aus Bacillus subtilis // Deutsches Patent DE 60011974 (10.03.2005). - 25 p.
30. Ptitsyn L.R., Altman IB., Smirnov S.V., Rostova Y.G., Yampolskaya T.A., Leonova T.V., Gusyatiner M M, Neue N-Acetylglutamatsynthase-Mutante und ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin. // Deutsches Patent DE 60106526 (18.08.2005). -15 p.
31. Samsonava N.N., Smirnov S.V., Novikova A.E., Ptitsyn L.R. Identification of Escherichia coli K12 YdcW protein as a gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase. // FEBS Lett. - 2005. - V. 579(19). -P. 4107-4112.
32. Kutukova E.A., Livshits V.A., Altman I B., Ptitsyn L.R., Zyiatdinov M.H., Tokmakova I L , Zakataeva N.P. The yeaS (leuE) gene of Escherichia coli encodes an exporter of leucine, and the Lrp protein regulates its expression // FEBS Lett. - 200S. V. 579(21). - P. 4629-4634.
33. Птицын JLP., Смирнов С В., Альтман И.Б., Новикова А.Е., Котлярова В.А, Гусятинер М.М., Ростова Ю.Г., Ямпольская Т А. Новая мутантная карбамоилфосфатсинтетаза и способ продукции соединений - производных карбамоилфосфата. И Патент РФ RU 2264459 (20.11.2005).-22 с.
34. Ptitsyn L.R., Smirnov S,V„ Altman I.B., Novikova A.E., Kotliarova V.A, Gusyatiner M.M., Rostova Y.G., Yampolskaya T.A. Mutant carbamoylphosphate synthetase and method for producing Compounds derived from carbamoylphosphate. // USA Patent 6,991,924 (31.01 2006). - 25 p
35. Gusyatiner M.M., Kozlov Yu.L, Ptitsyn L.R., Altman LB., Voroshilova E.B., lomantas Y.A.V., Yampolskaya I.A. Fermentation method of producing L-amino acid. II Патент КНР CN 1247783 (29.03. 2006).-30 p.
36. Gusyatiner M M., Leonova T V., Ptitsyn L.K., Yampolskaya T.A. L-arginine producing Escherichia coli and method of producing L-arginine. II USA Patent 7,052,884 (30.05.2006. - 5 p.
37. Смирнов C.B., Котлярова B.A., Альтман И.Б., Птицын JLP. Получение мутантов карбамоилфосфатсинтетазы Escherichia coli методом мутагенеза с помощью рандомизированных олигокуклеотидов. И Биотехнология. - 2006. - № 1. -С. 3-11.
38. Птицын Л.Р., Альтман И.Б., Смирнов СВ., Самсонова H.H., Ермлшев В.Ю. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-аргинина и способ получения L-аргинина. // Патент РФ RU 2276686 (20.05.2006). - 10 с.
39. Ахвердян В.З., Саврасова Е.А., Самсонова H.H., Ермишев В.Ю., Альтман И.Б., Птицын JI.P. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia - продуцент L-треонина и способ получения L-треонина. // Патент РФ RU 2288264 (27.11.2006). - 21 с.
40. Ptitsyn L.R., Altman LB., Smirnov S.V., Rostova Y.G., Yampolskaya T.A., Leonova T.V., Gusyatiner M.M. Mutant N-acetylglutamate synthase and method for L-arginine production. // USA Patent 7,169,586 (30.01 2007). - 10 p.
41. Ptitsyn L R, Smirnov S V, Altman IB, Novikova A E, Kotliarova V A, Gusyatiner M M, Rostova Y G, Yampolskaya T A. Mutant carbamoylphosphate synthetase and method for producing compounds derived from carbamoylphosphate. USA Patent 7,211,419 (01.05.2007), 24p.
42. Птицыв Л.Р., Альтман И.Б., Котлярова В.А., Козлов Ю.И. Способ получения L-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia // Патент РФ RU 2312893 (20.12.2007). -89 с.
43. Gusyatiner MM, Kozlov YuL, Ptitsyn L.R., Altman I.B, Voroshilova E.B., lomantas Y.A.V., Yampolskaya T.A. Bacterium belonging to the genus Escherichia being transformed by the gene encoding pyruvate carboxylase and which produces L-amino acid, and fermentative method for producing L-amino acid // Патент Словакии SK 285997(07.01.2008). -22 p.
44. Gusyatiner MM., Leonova T.V., Ptitsyn L.R., Yampolskaya T.A. Escherichia coli generating L-arginine and method for production L-arginine. И Патент КНР CN 100365115 (30.01.2008). - 9 p.
45. Gusyatiner M.M., Leonova T.V., Ptitsyn L.R., Yampolskaya T A. L-arginine producing Escherichia coli and method of producing L-arginine. // European Patent EP 1170358 (14.05.2008). - 8 p.
46. Котлярова B.A., Птицын Jl.Г., Альтман И.Б., Козлов Ю.И. Мутантная IIB/IIC субъедншща глюкозоспецнфической пермеазы системы PTS, фрагмент ДНК, бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-треонина и способ получения L-треонина. // Патент РФ RU 2335536 (10.10.2008). - 60 с.
47. Альтман И.Б., Птицын Л.Р. Способ получения L-треонина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в которой инактивирован ген lrhA. // Патент РФ RU 2337956 (10.11.2008). -23 с.
48. Ptitsyn L.U., Altman I.B., Kolliaro va V.A., Kozlov Y.I. Method for producing L-amino acids using bacterium of the Enterobacteriaceae family. // European Patent EP 1853714 (26.11.2008). - 63 p.
49. Gusyatiner M.M., Leonova T.V., Ptitsyn L.R., Yampolskaya T.A. Escherichia coli productora de L-argininay procedimiento para producir L-arginina. //Spanish Patent ES 2305015 (01.11.2008). -7 p.
50. Птицын Л.Р., Альтман И.Б., Котлярова В,А., Мохова О.Н., Ямпольская Т.А., Козлов Ю.И., Terashita М., Usuda Y., Matsui К. Способ получения L-аминокислот с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae П Патент РФ RU 2364628 (20.08.2009). - 69 с.
51. Альтман И.Б., Птицын Л.Р. Способ получения L-треонина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в которой инактивирован ген yahN. // Патент РФ RU 2392322 (20.06.2010). - 14 с.
52. Ямпольская Т.А., Стойнова Н.В., Ерёмина Н.С., Альтман И.Б., Птицын Л.Р. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia (ydbK gene). // Патент РФ RU 2395579 (27.07.2010). - 65 с.
53. Akhverdian V.Z., Savrasova Е.А., Samsonova N.N., Ermishev V.Y., Altman I.B., Ptitsyn L.H. Method for producing L-threonine using bacteria belonging to the genus Escherichia. // Патент КНР CN 1997747 (08.12.2010).-21 p.
54. Птицын Л.Р., Альтман И.Б., Ямпольская T.A. Способ продукции полезного метаболита. // Патент РФ RU 2408731 (10.01.2011) - 89 с.
55. Ivanov S.A., Nomura К., Malfanov I.L., Sklyar I.V., Ptitsyn L.R. Isolation of a novel catechin from Bergenia rhizomes that has pronounced lipase-inhibiting and antioxidative properties. // Fitoterapia. -2011. - V. 82(2). - P. 212-218.
56. Ptitsyn LR., Nomura K., Sklyar I.V., Ravcheeva A.B. The 1,4-naphthoquinone derivative from Pyrola rotundifolia activates AMPK phosphorylation in C2C12 myotubes. // Fitoterapia. - 2011. - V. 82(8).-P. (285-1289.
57. Ivanov S.A., Nomura K„ Malfanov I.L., Ptitsyn L.U. Glutinoin, a novel antioxidative ellagitannin from Alnus glutinosa cones with glutinoic acid dilactone moiety. // Nat Prod Res. - 2012. - V. 26(19). -P. 1806-1816.
58. Altman I.B., Ptitsyn L.R. Method for producing L-threonine using bacterium of Enterobacteriaceae family, having attenuated expression of the yahN gene. // European Patent EP 2185683 (18.04.2012). -23 p.
59. Ivanov S.A., Garbuz S.A., Malfanov I.L., Ptitsyn L.R. Screening of Russian medicinal and edible plant extracts for Angiotensin I-converting enzyme (ACE I) inhibitory activity. // Химия растительного сырья. -2012. -№2. -С. 165-172.
60. Kalinkevich К., Karandashov V.E., Ptitsyn IJR. In vitro study of the anti-inflammatoiy activity of some medicinal and edible plants growing in Russia. // Химия растительного сырья. - 2013. - Jfel. -С. 113-118.
Статьи в сборниках:
61. Komova O.V., Krasavin Е.А., Kozubek S., Ptitsyn LR, Egorov P.E., Yufang W. SOS-response in UvrD and UmuC mutants of E.coli cells after UV and ^-irradiation. // In "Radiation Biology and its Application in Space Research" (Eds.: S.Kozubek and G Horneck), Kiramo. - 1995. - P. 121-125,
62. Horneck G., Ptitsyn LR., Rettberg P., Komova O,, Kozubeck S., Krasavin E.A. Monitoring of Genotoxieity, 5.1. Recombinant Escherichia coli cells as biodeteetor system for genotoxins. // In 'Biosensors for Environmental Diagnostics" (Ed. by B.Hock, D.Barcelo, K.Cammann, et.al.). Stuttgart, Leipzig. - 1998. - P. 215-232.
63. Rink H., Yang T.C., Böhm L., Govorun R, Hader D P., Homeck G., Kaina В., Kozubek S., Liu S.Z., Potten C., Ptitsyn L. Cellular Responses, recommendations for future research needed. // Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation (Baumstark-Khan C. et al. (eds.)), Kluwer Academic Publishers. Netherlands. - 1999. - P. 339-344.
64. Ptitsyn LR. A biosensor for environmental genotoxins, chemical mutagens and radiation factors, based on the SOS response function of Escherichia coli. // Fundamentals for the Assessment of Risk from Environmental Radiation (Baumstark-Khan C. et al. (eds.)), Kluwer Academic Publishers. Netherlands - 1999.-P. 161-166.
65. Vasilenko R., Vasiliev A., Chikileva I., Khodyakova A., Puchkova G„ Kulikova N., Kosarev I., Andreev S., Ptitsyn L., Pavlov V., Khlebnikov V., Uversky V., Kiselevsky M., Abramov V. IL-4 and IL-4delta2 system in host defense mechanism against allergic and tumor diseases. // Proceedings of the 2nd International Conference on "Tumor Microenvironment. Progression, Therapy&Prevention". Monduzzi Editore (International Proceeding Division) Edit. IP.Witz. -2002.-P. 115-119.
Материалы конференций, конгрессов и симпозиумов:
66. Ппшын JI.P., Кондрашова М.А., Степанов А И. Анализ SOS-ответа клеток E.coli с помощью бактериальной люминесценции. // Всесоюзная научная конференция «Генетические последствия действия биологических и химических факторов окружающей среды по проблеме «Человек и Биосфера»». Киев. - 1988. - С. 95.
67. Пгицып JLP-, Кондрашова М.А., Ингель Ф.И., Ревазова Ю.А., Степанов А.И. Действие генотоксических веществ на SOS-индуцируемую биолюминесценцию в E.coli. // Всесоюзная научная конференция «Генетические последствия действия биологических и химических факторов окружающей среды по проблеме «Человек и Биосфера»». Киев. - 1988. - С. 96.
68. Птицын JLP. Экстрахлеточная продукция эпидермального фактора роста человека (hEGF) клетками Е. coli. // V Конференция РФ «Новые направления биотехнологии». Пущино. -1992. -С. 35.
69. Рязанова Л.А., Альтман И.Б., Птицын JI.P., Батчикова Н.В. Экспрессия синтетического гена ингерлейкина-4 человека в рекомбинантных штаммах Е. coli. // V Конференция РФ «Новые направления биотехнологии». Пущино. -1992. - С. 38.
70. Птицын JLP., Альтман И Б. Продукция эпидермального фактора роста человека (hEGF) клетками Escherichia coli. // VI Конференция РФ «Новые направления биотехнологии». Пущино.-1994.-С. 112.
71. Птицын JI.P., Альтман И.Б., Куркин А.Н., Гуров М.В. Химико-ферментативный синтез гена интерлсйюша-10 человека и экспрессия его в клетках Е. coli. И VI Конференция РФ «Новые направления биотехнологии» . Пущино. - 1994. - С. 113.
72. Птицын Л.Р., Рязанова JI.A. Биояюминесцентный анализ SOS-ответа с использованием Rfa-мутантов Escherichia coli. // VI Конференция РФ «Новые направления биотехнологию). Пущино. -1994. -С. 115.
73. Рязанова JI.A., Птицын JI.P., Иванов В.Б. Индукция SOS-ответа клеток Escherichia coli при действии соединений платины (II). // VI Конференция РФ «Новые направления биотехнологии». Пущино. -1994. - С. 117.
74. Ptitsyn L.R., Altman I B., Vasiliev A.V., Terskikh V.V. Production of recombinant growth factors and its using for keratinocyte grafting. // Baev International Conference of Biotechnology. Moscow. Russia. -1996.-P. 312.
75. Rettberg P., Ptitsyn L.R., KomovaO., Kozubek S., Krasavin E., Bonev M., Homeck G. The SOS lux test for the detection of genotoxic agents. // 7-th International Conference on Environmental Mutagens. SOS Chromotest Workshop at the 7th ICEM Meeting, Toulouse . France. 7-12 Sept. -1997. {In: Mutation Research. -1997. -V. 379(Issuel, Suppl.l). - P. S206.)
76. Vasilenko R., Khodyakova A., Chemovskaya Т., Vasiliev A, Ptitsyn L., Puchkova G., Rudenko E., Abramov V., Zav'yalov V. Antiproliferative properties of the recombinant aglycosilated alternative interleukin-4 splice variant, IL-452. // 2nd Joint Meeting of the ICS and the IS1CR. Jerusalem. Israel. (In: Eur.Cytokine Network - 1998. V. 9(3). -P. 437.)
77. Ptitsyn L.R., Altman 1.В., Smirnov S.V., Uvarov V.Yu., I.yashsnko A.A., Markin S.S. Design and analysis of the E.coli produced strains of the recombinant glial-cell-line-derived neurotrophic factor (GDNF). // 2nd Joint Meeting of the ICS and the 1SICR. Jerusalem. Israel. (In: Eur.Cytokine Network. -1998.-V. 9(3).-P. 480.)
78. Птицын JI.P., Альтман И.Б., Смирнов С В., Уваров В Ю., Ляшенко A.A. Получение рекомбинантного иейротрофина глиального происхождения на базе штамма-продуцента E.coli. // VI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Москва. - 1999. - С. 462.
79. Vasilenko R.N., Puchkova G.Yu., Kosarev I.V., Khodyakova A V., Vasiliev A.M., Chikileva I.O., Sharova N.I., Yarilin A.A., Ptitsyn L.R., Abramov V.M IL-4 and IL-4delta2 as a system of immune response regulation. H Annual meeting of the International Society for Interferon and Cytokine Research, ISICR 2001. Cleveland, Ohio. October 7-11. - 2001. (In: J Interferon&Cytokine Res. -
2001. -V. 21(Supplement 1). -P-l-53.)
80. Vasilenko R., Puchkova G., Chikileva I., Khodyakova A., Ptitsyn L., Vasiliev A., Pchelinzev S., Abramov V. IL -462 takes part in regulation of Thl and Th2 type immune response. H In: Intern. J. Immunorehabilitation. - 2001. - V. 3. - P. 33.
81. Tuguz A.R, Abramov V.M., Vasilenko R.N., Chikileva I.O., Buydenok Y.V., Kiselevsky M.V., Ptitsyn L.R., Vasiliev A.M. Influence of IL-482 - IL-4 form derived by alternative splicing, on cytotoxicity of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and granulocytes towards NK-sensitive K-562 cell line. // Eighteenth UICC International Cancer Conference. Oslo. Norway. June 30-July 5. -
2002. {In\ Intern. J. Cancer. - 2002. (Suppi.) - P. 445.)
82. Самсонова H.H., Смирнов C.B., Альтман И.Б., Птицын JI.P. Изучение регуляции, транскрипции и функциональная характеристика продукта трансляции гена ygjG Е. coli К12. // 6-я Путинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. - 2002. - С. 315.
83. Самсонова Н.Н, Смирнов С.В., Альтман И.Б., Птицын JI.P. Идентификация гена Escherichia coli К12, кодирующего путресцин аминотрансферазу. // Научная сессия МИФИ-2003. Сб. научных трудов. Москва. — 2003. — Т. 5. — С. 32-33.
84. SamsonovaN.N., Smirnov S.V., Altman IB., Ptitsyn L.R. Characterization of Escherichia coli YgjG protein as putrescine:2-oxoglutarate aminotransferase with broad substrate specificities. // l" FEMS congress of European Microbiologists. Ljubljana Slovenia - 2003. (In: FEMS Letters. - 2003. V. 222(S). - P. 346.)
85. Vasilenko R„ Chikileva I., Khodyakova A„ Puchkova G., Kulikova N., Vasiliev A., Kosarev I., Khlebnikov V., Kiselevsky M., Ptitsyn L, DuBuske L., Abramov V. Immunoregulatoiy properties of IL-4 and IL-4S2 system. // Eleventh International Cytokine Society Conference. Dublin. Ireland. -
2003. - Abstract N 243. (In: European Cytokine Network. - 2003. - V. 14(3). - P. 89.)
86. Ptitsyn L.R., Smirnov S.V., Kotlyarova V.A., Altman I B. Random oligonucleotide mutagenesis of Escherichia coli argA gene and selection of high active N-acetylglutamate synthetase mutants. // ЗО" FEBS Congress "The Protein World". Budapest. Hungary. - 2005. (In: The FEBS Journal. - 2005. -V. 272(Suppl. 1). - P. 515.)
87. Smirnov S.V., Kotlyarova V.A., Altman I.B., Ptitsyn L.R. Constructing of feedback resistant E.coli carbamoylphosphate synthetase mutants by random oligonucleotide mutagenesis. // Ъ" Moscow International Congress "Biotechnology:state of art and prospects of development". Moscow. Russia. -2005.-P. 317,
Подписано в печать:
24.10.2013
Заказ № 8975 Тираж - 90 экз. Печать трафаретная. Объем: 6,7 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Птицын, Леонид Романович, Москва
На правах рукописи
05201352076
птицын
Леонид Романович
Метаболическая инженерия штаммов Escherichia coli - биосенсоров, продуцентов цитокинов, факторов роста и низкомолекулярных веществ.
03.01.03 - молекулярная биология
ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2013
г
Работа выполнена во ВНИИ биотехнологии (АО «Биотехнология»), ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, ЗАО «НИИ Аджиномото-Генетика»
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, Вейко Владимир Петрович
профессор, главный научный сотрудник
лаборатории молекулярной инженерии,
ФГБУН «Институт биохимии им. А.Н. Баха» РАН
доктор химических наук, Вартапетяи Андрей Борисович
профессор, заведующий отделом химии и биохимии нуклеопротеидов, НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова
доктор биологических наук, Абилев Серикбай Каримович
профессор, заместитель директора по научной работе, ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН)
Защита диссертации состоится « 3 » декабря 2013 года
в_14_часов на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП
«Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545 Россия, г. Москва, 1 -й Дорожный проезд, д. 1.
С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИГенетика»
Автореферат разослан (РКУЯ /^р^К_2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат химических наук, доцент /1) Воюшина Татьяна Львовна
г
ОГЛАВЛЕНИЕ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ....................................................... 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................ 7
ВВЕДЕНИЕ............................................................................................. 10
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.............................. 11
Глава 1. Конструирование рекомбинантных клеток Е. coli - биосенсеров для анализа генотоксичности химических соединений и физических факторов........... 11
1.1. Клонирование фрагмента ДНК, кодирующего оперон биолюминесценции
P. leiognathi....................................................................................................... 12
1.2. Биолюминесцентный анализ SOS-ответа клеток Е. coli..................................... 15
1.3. Индукция SOS-ответа под действием веществ - мутагенов (SOS lux тест)............. 17
1.4. Индукция SOS-ответа под действием UV или у-излучений................................ 20
1.5. Анализ генотоксического действия комплексных соединений платины и сравнительная оценка их генотоксичности в эукариотической тест-системе............... 20
1.6. Возможности проведения SOS lux теста в полуавтоматическом варианте в
микропланшетах или использования иммобилизованных клеток в тест системе........... 25
Заключение................................................................................................. 26
Глава 2. Экспрессия синтетических генов в клетках Е. coli.................................27
2.1. Цитоплазматическая экспрессия синтетических генов в клетках Е. coli.................28
2.1.1. Модификации штаммов-продуцентов интерлейкина-3 и интерлейкина-4 человека. 28
2.1.2. Делеционная форма интерлейкина-4 человека -IL4-52................................... 32
2.1.3. Интерлейкин-10 человека - hIL-10........................................................... 38
2.1.4. Нейротрофин глиального происхождения человека - GDNF............................ 41
2.1.5. Фактор роста кератиноцитов человека - hKGF............................................. 45
2.1.6. Рецепторный антагонист интерлейкина-1 человека -hlL-lra............................ 47
2.1.7. у-интерферон быка - bIFN-y................................................................................. 48
2.2. Экстраклеточная продукция эпидермального фактора роста человека - hEGF........ 50
Заключение................................................................................................ 53
Глава 3. Оптимизация ряда биосинтетических путей в клетках Е. coli с целью
повышения продукции аминокислот............................................................. 54
3.1 Модификация путей транспорта источников углерода с целью увеличения продукции аминокислот Е. coli штаммами-продуцентами...................................... 55
3.2. Модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина.................................................................................................... 63
3.3. Идентификация генов, кодирующих ферменты пути I деградации путресцина
(pathway: putrescine degradation I)..................................................................... 73
Заключение................................................................................................ 86
Глава 4. Поиск новых низкомолекулярных биологически активных веществ растительного происхождения и возможность их микробиологического синтеза... 87
4.1. Методы и тест-системы, использованные для скрининга этанольных экстрактов сухих растительных препаратов....................................................................... 88
4.2. Результаты скрининга этанольных экстрактов растительных препаратов.............. 90
4.3. Идентификация новых соединений из экстрактов, активных в in vitro тестах......... 93
4.4. Заключение. Потенциальная возможность микробиологического синтеза идентифицированных соединений................................................................... 99
ВЫВОДЫ................................................................................................. 100
Список публикаций по теме диссертации...................................................... 102
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы.
Современная биотехнология, разрабатывающая и использующая генно-инженерные и клеточные методы создания генетически модифицированных биологических объектов для получения новых видов биологических и химических продуктов различного назначения и повышения эффективности их производства, возникла в 70-х гг. прошлого века. Развитие данных технологий на первых этапах было основано на манипуляциях in vitro с фрагментами ДНК из различных источников и/или синтетическими фрагментами ДНК, с последующим введением их в составе плазмид в живую клетку, где «искусственная» ДНК была способна реплицироваться, а кодируемая ею информация - экспрессироваться. В дальнейшем для повышения уровня продукции целевых соединений были разработаны методы целенаправленного и прецизионного внесения модификаций в бактериальный геном путем замены структурных и/или регуляторных областей биосинтетических генов, их внутрихромосомной амплификации и модуляции уровня экспрессии; делеции генов, контролирующих синтез нежелательных метаболических интермедиатов и побочных продуктов целевого биосинтеза; оптимизации клеточных систем потребления источников питания и систем секреции целевых продуктов и т.д.
Наглядными примерами успехов современной биотехнологии являются крупнотоннажное производство природных протеиногенных L-аминокислот, основанное на микробных продуцентах, создание новых эффективных лекарственных средств на основе низкомолекулярных биологически активных веществ и БАВ белковой природы -рекомбинантных гормонов и цитокинов.
Клетки Escherichia coli до сих пор являются одним из наиболее генетически и биохимически изученных микроорганизмов, что обусловливает их широкое применение как в биотехнологических исследованиях, так и в промышленности.
Настоящая диссертационная работа, представляемая в виде научного доклада, обобщает результаты исследований, посвященных: разработке биологических тест-систем (биосенсоров) на основе SOS-ответа клеток Е. coli для оценки генотоксичности химических соединений и физических факторов; конструированию штаммов-продуцентов ряда цитокинов и факторов роста человека и других белков на основе бактерии Е. coli; оптимизации ряда биосинтетических путей в клетках Е. coli с целью повышения продукции аминокислот; поиску новых биологически активных низкомолекулярных веществ растительного происхождения, синтез которых может быть в будущем реализован микробиологическим путем.
Цели и задачи исследования.
Основная цель работы состояла в создании рекомбинантных штаммов Е. coli, выполняющих функции биосенсоров для оценки генотоксичности, штаммов-продуцентов ряда белков (цитокинов и факторов роста) и низкомолекулярных соединений (аминокислот), и в поиске новых биологически активных низкомолекулярных веществ растительного происхождения, потенциальных объектов для микробиологического синтеза.
В соответствии с этим решались следующие задачи:
1. Конструирование рекомбинантных штаммов Е. coli, несущих оперон биолюминесценции Photobacterium leiognathi под контролем индуцируемого SOS-системой Е. coli промотора гена cda плазмиды ColD
2. Разработка условий проведения теста на генотоксичность химических веществ и физических факторов с использованием рекомбинантных штаммов Е. coli (SOS lux тест).
3. Анализ генотоксического действия комплексных соединений платины, потенциальных противораковых препаратов, с помощью SOS lux теста и сравнительная оценка их генотоксичности в эукариотической тест-системе.
4. Синтез генов некоторых цитокинов и факторов роста [интерлейкин-3, интерлейкин-4, делеционная форма интерлейкина-4 - IL4-52, интерлейкин-10, нейротрофин глиального происхождения (GDNF), фактор роста кератиноцитов (KGF), рецепторный антагонист интерлейкина-I (hlL-lra), эпидермальный фактора роста (EGF) человека; у-интерферон быка (bEFN-y)] и разработка систем их экспрессии в клетках Е. coli.
5. Разработка методов выделения ряда цитокинов и факторов роста и оценка их биологической активности.
6. Оптимизация систем транспорта глюкозы в клетках Е. coli путем модификации пермеазы PtsG и усиления экспрессии пермеазы EIINag с целью увеличения продукции аминокислот штаммами-продуцентами.
7. Получение штаммов Е. coli, способных использовать этанол в качестве источника углерода, и поиск необходимых модификаций путей основного метаболизма Е. coli, приводящих к повышению выхода аминокислот при совместном использовании глюкозы и этанола в качестве источников углерода.
8. Модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина (N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы) для конструирования высокопродуктивных штаммов-продуцентов аминокислоты.
9. Исследование путей возможной деградации интермедиатов синтеза аргинина.
10. Поиск новых биологически активных низкомолекулярных веществ растительного происхождения, синтез которых может быть в будущем реализован микробиологическим путем.
Научная новизна и практическая значимость результатов исследования.
Впервые сконструирована тест-система (SOS-Iwc test) для оценки генотоксичности химических веществ и физических факторов (у- и UV- излучение), основанная на измерении SOS-ответа клеток Е. coli на действие ДНК-повреждающих факторов, в которой в качестве гена-"репортера" использован оперон биолюминесценции P. leiognathi под контролем промотора гена cda плазмиды ColD. Тест применялся при оценке генотоксичности и общей токсичности ряда соединений платины, проявляющих противоопухолевую активность, в частности г/мс-ДЦП и циклоплатама. Сконструированная тест-система нашла широкое применение при исследованиях общетоксических и мутантных свойств поллютантов (см. например, Масленникова (ИЭГМ, УроРАН), 2007, Кхатаб З.С. (Южный федеральный университет, г. Ростов-на-Дону), автореф. дисс., 2013; Е. П. Гуськов, и др., (НИИ биологии при ЮФУ, г. Ростов-на-Дону), 2009); при разработке следующего поколения биосенсоров для оценки генотоксичности (SOS-LUX-LAC-FLUORO test (Rabbow Е. et al, 2003, Horneck G et al., 2010 (DLR, Institute of Aerospace Medicine, Cologne, Germany)). Данная часть работы частично финансировалась в 1995-1997 г.г. грантами ENTAS (93-2850) и COPERNICUS (CIPA СТ-94 0122, European Commission).
Сконструирован ряд Е. coli штаммов-продуцентов цитокинов и факторов роста (IL-3, IL-4, IL4-82, IL-10, GDNF, KGF, hlL-lra, EGF человека; у-интерферона быка (bIFN-y)) с использованием синтетических или полусинтетических генов данных белков.
Высокоэффективная продукция белков достигалась с использованием следующих генно-инженерных подходов: а) оптимизация силы промоторов и использование высокоэффективных рибосом-связывающих последовательностей, б) строгая регуляция транскрипции, в) модификация первичной структуры mRNA белков для оптимизации трансляции, г) предотвращение протеолиза целевых продуктов путем использования штаммов Е. coli дефектных по некоторым протеазам, д) цитоплазматическая продукция белков в виде телец включения, продукция белков в виде их гибридных вариантов, или, в случае EGF, экстраклеточная продукция целевого белка. Разработаны методы выделения и очистки некоторых субстанций белков.
Субстанции белков hIL-4 и hIL-482 использовались в Институте инженерной иммунологии для структурно-функциональных исследований рекомбинантного делеционного варианта интерлейкина-4; hIL-482 передан в Институт Цитологии Новосибирского отделения РАМН для изучения роли этого цитокина в ткане-специфической регуляции иммунных реакций на разных этапах онтогенетического развития. Штамм-продуцент рекомбинантного hGDNF передан в НПЦ «Фосфосорб» для дальнейших исследований по изучению возможности создания на его основе эффективных лекарственных биопрепаратов. Биологически активные субстанции hEGF и hKGF применялись при выращивании аллогенных эпидермальных пластов (Институт биологии развития РАН) с последующей их трансплантацией больным при глубоких ожогах и незаживающих трофических язвах. Высокоэффективные штаммы продуценты рекомбинантного hIL-lra были переданы в ГНЦ РФ ГосНИИОЧБ (СанктПетербург), где впоследствии были разработаны методы выделения и очистки целевого белка в препаративных количествах, показана биологическая активность hIL-1 га и начаты доклинические испытания препарата. Штамм Е. coli BL21(DE3) (pET-22-blFN-y) был передан в АО «МосАгроГен» для разработки промышленного регламента выделения и очистки рекомбинантного у-интерферона быка с целью последующего создания комбинированных препаратов ветеринарного назначения на основе природных и рекомбинантных интерферонов и цитокинов.
Показана возможность усиления потребления глюкозы штаммами Е. coli при экспрессии в них мутантной пермеазы PtsG или при усиленной экспрессии пермеазы EIINag. Возможность интенсивного усвоения глюкозы клетками Е. coli посредством пермеазы EIINag была показана впервые.
Получены новые мутантные варианты алкоголь дегидрогеназы-альдегид дегидрогеназы Е. coli (AdhE), обеспечивающие рост клеток на средах с этанолом в качестве единственного источника углерода в аэробных условиях культивирования.
Введение мутантных генов adhE под контролем сильного промотора в хромосому штаммов-продуцентов (например, треонина или глутаминовой кислоты) позволяет получить аминокислоту при росте клеток на средах с этанолом в качестве единственного источника углерода. Теоретически показаны необходимые модификации пути гликолиза для эффективной продукции аминокислоты при использовании в ростовых средах смесей глюкоза/этанол (на примере штамма-продуцента треонина).
Получены новые варианты мутантных N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Е. coli, ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина, резистентных к ретроингибированию. Гены мутантных ферментов использованы при конструировании высокопродуктивных штаммов-продуцентов аминокислоты.
Впервые идентифицированы гены (и охарактеризованы соответствующие белки) одного из путей деградации путресцина в GABA в Е. coli. Данный путь в базе данных
ЕсоСус получил наименование пути I деградации путресцина (pathway: putrescine degradation I).
Скрининг более ста препаратов этанольных экстрактов растений, произрастающих на территории России, проведенный с использованием in vitro тестов: 1) ингибирование ангиотензинпревращающего фермента ACE I; 2) ингибирование продукции TNF-a и PGE2 клетками моноцитов человека ТНР-1; 3) оценка антиоксидантной активности (DPPH тест); 4) ингибирование панкреатической липазы (HPL) человека; 5) активация фосфорилирования 5'-АМФ-активируемой протеинкиназы (АМРК) - выявил препараты с высокой специфической активностью в данных тестах.
Несколько экстрактов показали высокую активность в более чем одном тесте: экстракт соплодий ольхи - в DPPH и ACE I тестах, экстракт из корневищ бадана - в HPL and ACE I тестах, экстракт грушанки круглолистной - в АМРК и PGE2 тестах.
Идентифицированы индивидуальные вещества, высокоактивные в указанных выше тестах: а) из экстракта соплодий ольхи выделены глутиноин (соединение обнаружено и структура идентифицирована впервые), педункулагин и праекоксин Д, показавшие антиоксидантную активность в DPPH тесте сравнимую с активностью таких известных антиоксидантов, как галловая и аскорбиновая кислоты; б) из корневищ бадана выделены (+)-катехин 3,5-ди-О-галлат (обнаружен и структура идентифицирована впервые) и (+)-катехин З-О-галлат, показавшие высокую антиоксидантную и HPL ингибирующую активности, сравнимые с известными препаратами антиоксидантов и липазных ингибиторов растительного происхождения; в) в экстракте грушанки круглолистной обнаружен 2-метил-7-гидроксиметил-1,4-нафтохинон, для которого впервые была показана способность индуцировать фосфорилирование АМРК в дифференцированных
-
Птицын, Леонид Романович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2013
-
ВАК 03.01.03
- Поиск путей транспорта D-глюкозы в клетки Escherichia coli, альтернативных фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системе
- Транспорт аминокислот из клеток Escherichia coli: генетический контроль, регуляция и применение при конструировании штаммов-продуцентов
- Метаболическая регуляция в процессе роста и голодания культуры Escherichia coli M-17
- Поиск и изучение генов, участвующих в транспортировке пуриновых производных из клеток Escherichia coli
- Изучение генов, кодирующих белки семейства RhtB у Escherichia coli
