Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт аминокислот из клеток Escherichia coli: генетический контроль, регуляция и применение при конструировании штаммов-продуцентов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лившиц, Виталий Аркадьевич

Микроорганизмы способны поглощать и выделять в окружающую среду различные низкомолекулярные соединения, а также биополимеры. Поскольку фосфолипидный бислой цитоплазматической мембраны клеток является очень эффективным барьером даже для небольших растворимых молекул, перемещение всех этих веществ через мембрану обычно осуществляется при участии специальных транспортных систем. Гены и их продукты, отвечающие за транспорт низхомолекулярных соединений а клетку, достаточно хорошо изучены и охарактеризованы. В то же время о генетическом контроле процесса экскреции таких соединений известно немного. Более того, этот вопрос долгое время даже не возникал, поскольку казалось невероятным, что микроорганизмы могут, например, активно выбрасывать в среду такие ценные метаболиты, как аминокислоты. Развитие микробиологической промышленности привело к созданию штаммов-продуцектов аминокислот, нуклеозидов, витаминов и пр., которые накапливали в среде очень высокие концентрации (0,1 - 0,5 М) эгих соединений. Долгое время предполагалось, что эти вещества выводятся из клеток пассивно, в результате диффузии или каких-то дефектов цитоплазматической мембраны. Однако с конца 70-х годов прошлого века в связи с исследованием лекарственной устойчивости у бактерий начинает появляться все больше данных о существовании транспортных систем, осуществляющих активный выброс из клеток таких веществ, таких как антибиотики, антисептики, красители, органические растворители, ионы тяжелых металлов и пр. (Li and Nikaido, 2004). Одновременно с этим пришло понимание того, что выведение метаболитов из клетки также не может быть результатом только простой диффузии. Первые биохимические и физиологические данные о существовании в клетках Corynebactermm glulamicum систем активной экскреции аминокислот получили в начале 90-х годов прошлого века немецкие исследователи, работавшие в лаборатории Крамера (Krämer, 1994). Эти же авторы в 1996 году обнаружили и описали ген и соответствующий белок-транспортёр, LysE, осуществляющий активный транспорт лизина из клеток этих бактерий (Vrljic et al., 1996). В связи с этим представлялось актуальным выявление аналогичных или новых систем экскреции аминокислот у других микроорганизмов, в частности, у Escherichia coli, и выяснение их физиологической функции. Эта проблема имеет также большое практическое значение в связи с развитием промышленного производства аминокислот с помощью микробилогического синтеза и потребностью создания высокопродуктивных штаммов-продуцентов.

Настоящая работа обобщает результаты исследований, посвященных поиску, идентификации и изучению свойств генов, контролирующих транспорт аминокислот из клеток Escherichia coli. Эти исследования были начаты в конце 70-х годов прошлого века во ВНИИгенетика, когда по инициативе и под руководством проф. В.Г. Дебабова и Ю.И. Козлова в

Институте осуществлялась комплексная работа по созданию штамма-продуцента треонина. В процессе этой работы были получены мутации, которые придавали клеткам Е. coli высокий уровень устойчивости к треонину и гомосерину и существенно повышали продуктивность штамма-продуцента треонина. Одна из таких мутации имела плейотропный эффект и не затрагивала известные гены, контролирующие биосинтез треонина. Изучение природы этой мутации привело к обнаружению гена, участвующего в экскреции треонина и гомосерина из клеток £ coli.

Цель и задачи исследования.

Основная цель работы состояла в поиске, идентификации и изучении функций и регуляции генов, участвующих в транспорте аминокислот из клеток Е. coli.

В соответствии с этим решались следующие задачи:

1. Изучить природу мутации rhtAZi, которая сообщает клеткам Е coli устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина, и идентифицировать соответствующий ген.

2. Разработать метод поиска и идентификации генов, кодирующих транспортные белки, участвующие в экскреции аминокислот.

3. Осуществить поиск новых генов, контролирующих экскрецию аминокислот.

4. Изучить стенотипические свойства найденных генов.

5. Провести компьютерный анализ белков, кодируемых обнаруженными генами: рассчитать их молекулярную массу, гидрофобно-гидрофильный профиль, трансмембранные сегменты.

6. Провести поиск белков-гомологов, построить их выравнивание, выделить консервативные области.

7. Исследовать регуляцию экспрессии выявленных генов.

8. Разработать новые методы получения штаммов-продуцентов аминокислот на основе использования генов, контролирующих экскрецию аминокислот.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые обнаружены и охарактеризованы гены Escherichia coli, которые кодируют мембранные белки - транспортёры, осуществляющие активный транспорт аминокислот из клеток. Это гены rhtA, rhtB и rhtC, участвующие в экскреции треонина и гомосерина; ген yeaS (JeuE), участвующий в экскреции лейцина, метионина и гисгидина, гены yddG и yedA, участвующий в экскреции фенилалаяина и других аминокислот. Таким образом, показано, что у Е. coli перемещение аминокислот через бактериальную мембрану из клетки наружу - это активный процесс, который контролируется на генетическом уровне.

Показано, что повышенная экспрессия генов, кодирующих соответствующие транспортёры экскреции, повышает устойчивость клеток бактерий к подавляющим рост концентрациям аминокислот и аналогам аминокислот. На этом основании предложен метод поиска генов, кодирующих соответствующие транспортёры экскреции.

Выделено новое семейство мембранных белков, осуществляющих транспорт аминокислот из клеток бактерий. Впервые обнаружено, что одни и те же аминокислоты могут выводиться из клетки транспортёрами, принадлежащими к разным семействам белков. Получены данные, свидетельствующие о том, что эти белш-транспортёры обладают не только перекрывающейся, но и широкой специфичностью, т.е. одни и те же транспортёры могут экспортировать очень разные по структуре аминокислоты, и в этом отношении напоминают транспортёры множественной лекарственной устойчивости.

Показано, что экскреция аминокислот при участии белков-транспортёров зависит от трансмембранного потенциала, т.е. эти транспортёры являются вторичными переносчиками.

Впервые исследована регуляция новых генов, кодирующих транспортёры экскреции аминокислот. Показано, что экспрессия некоторых из этих генов не индуцируется транспортируемыми субстратами, а контролируется системами общей регуляции, такими как белок Lrp, зависит от фазы роста бактериальной культуры, состава среды и некоторых стрессовых факторов: pH, осмотического шока, уровня аэрации.

Кроме того, в процессе выполнения работы впервые обнаружен метаболический транспозон, Тп2555, несущий гены усвоения сахарозы, которые нашли широкое применение при конструировании штаммов-продуценга® аминокислот на основе Е coli,

Обнаружена также новая плазмида, plFl 3 И, из LactobaciHns fermentum, которая имеет очень широкий круг хозяев, включая Е. coli и многие виды грамположительных бактерий. Челночные векторы, полученные на основе этой плазмида, использовались при исследовании экспрессии некоторых генов, кодирующих мембранные белков Е. coli, в клетках Bacillus subtilis.

Показано, что повышенная экспрессия генов, кодирующих белки транспортёров экскреции, заметно увеличивает уровень накопления аминокислот в среде соответствующими штаммами-продуцентами. На этом основании разработаны новые методы повышения эффективности штаммов-продуцентов аминокислот. Штаммы-продуценты аминокислот, созданные с помощью этих методов, используются в промышленном производстве аминокислот в ряде стран мира.

Первые этапы работы, представленной в диссертации, проведены в лаборатории генетики и селекции продуцентов аминокислот ВШИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (заведующая - д.б.н., профессор Жданова Н.И.) в период выполнения комплексного исследования, связанного с созданием штамма-продуцента треонина на основе Е. coli. Работа была продолжена в руководимой автором лаборатории молочнокислых и анаэробных бактерий

ВНИИгенетики (с 1992 - ГоеНИИгенетаки), и завершена в научно-исследовательском Институте Аджиномото-Генегика (ЗАО «АГРИ»). Основные результаты, изложенные в диссертации, получены автором самостоятельно или под его «епосредственным руководством в соавторстве с В.В. Алешиным, Н.П. Захатаевой, М.В. Витушкиной, Е.А. Кутуковой, В.Г. Дорошенко, В.Н. Данилевичем, П.В. Трошиным, ИЛ. Токмаковой, Н.В. Горшковой и A.B. Беларевой. Конструирование отдельных штаммов-продуцентов аминокислот и их оценка осуществлялись совместно с М.М. Гусятинером, P.C. Шакуловым, Е.М. Хургесом, В.З. Ахвердяном, C.B. Машко и Ю.В. Йомантасом при участии сотрудников их подразделений. Ферментации продуцентов аминокислот в мини-ферментерах проводились совместно с А.К. Соколовым и Т.А. Бачиной. Определение внутриклеточной концентрации аминокислот проводилось совместно с Е.А. Тимохиной и В. М. Серебрянниковым; определение точки инициации транскрипции генов проводилось совместно с JI.P. Птициным и И.Б Альтман. Автор выражает искреннюю благодарность всем коллегам за участие в проведении представленного к защите исследования. В.В. Алешина хочется также поблагодарить за помощь в освоении некоторых молекулярно-биологнческих и компьютерных методов. Автор выражает признательность проф. Ю.И. Козлову за интерес и поддержку данной работы.

Апробация работы.

Диссертационная работа была апробирована на совместном заседании секции генетики Ученого совета ФГУП «Гос.НИИгеяетика» и Закрытого акционерного общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ») в 2005 г.

Материалы диссертации докладывались и представлялись на Международных и Российских Конгрессах и Съездах, в том числе, на 17-ом Международном конгресс по биохимии и молекулярной биологии (Сан-Франциско, 1997 г.), на 11-ом Международном Конгресс по бактериологии и прикладной микробиологии (Сидней, 1999 г.), на III Съезде ВОГИС (Москва, 2004 г.).

МАТЕРИАЛЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы, плазмиды и фаги. Генотип и происхождение исходных штаммов бактерий, пяазмид и фагов, использованных в работе, приведены в Табл. 1.

Таблица

Характеристика и происхождение исходных штаммов бактерий, плазмид и фагов.

Штаммы Генотип, происхождение или описание свойств Происхождение шш бактерий ссылка

Escherichia coli

W3350 F- galKT ЩггпВ-rmF) ВКПМ*

N99 W3350 rpsL ВКПМ*

С600 thil thrBl 1еиб lacYl supE44 tonA21 rpsL rfiDl Sambrook et al.,

TGI supE ksdA5 thi A(lac-proAB) T'(traD36 pro AB* lacPlacZ AMIS) SambrookeiaZ. (1989)

BL21(DE3) OmpT (Ion) hsdSs (fm~),E. coli В Novagen

JC7623 recBC sbcB thr leu pro arg his rpsL ВКПМ*

Bacillus subtilis

B. subtilis 168 trpC2 ВКПМ*

Исходные плазмиды

F126 Эписома, несущая фрагмент хромосомы Е. coli от оперона galKTE до локуса гас (от 17 до 31 мин) Low (1972) pUC21 ч Vieira, Messing, pOK.12 Km Vieira, Messing, pUK21 KmR Vieira, Messing, pJEL246 ApR lacZ'YA Valentin-Hansen

ApRKmR (черезА.С. Миронова) pACYC177 ВКПМ* pET22b ApR Novagen

PMC1871 TcR Pharmacia pUC4K KmK Promega pVIC40 SmR, thrAmBC US patent pAL4 ApR thr А ВКПМ * pLFÍ4 Челночный вектор для Е. coli vi Bacillus Shevelev et al, pLF22 Челночный вектор для Е, coli и Bacillus Tarakanoy et al., pAYC32 SmR Вектор средней коиийносги на основе Christoserdov, плазмиды RSF1010 Tsygankov, pMrV-5JS Малокошшный интегративный вектор на основе M.Зиятдинов miniMu, содержит между концами фага Ми ген (Kutukova et al., 2005). cat (CmR), ApR pMIV-A/po Производный pMIV-5 JS, содержит между M. Зиятдинов концами фага Ми промотор и RBS гена nlpD (Kutukova et al., 2005). pMW119 ApR, малокопийный вектор Nippon Gene pMWLT Производный pMW119, содержит ген lacZ из рМС1871 и терминатор транскрипции гена ггпВ. (Kutukova et al., 2005).

Фаги и фазмиды

PI Vir ВКПМ*

Mu cts 62 ВКПМ*

Mud5005 KmR ВКПМ*

Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов.

Устойчивости,придаваемыеплазмидами: Ар11-к ампициллину; Ктк- к канамицину. Тск-к тетрациклину; Сшк" к хлорамфениколу; Бт* - к стрептомицину.

На основе исходных штаммов бактерий и плазмид были получены десятки новых штаммов и гибридных плазмид. Подробные процедуры их получения содержатся в публикациях, список которых приведен в конце диссертации.

Приведенные в Табл. 1 векторы pLF14 (Shevelev et al., 2000) и pLF22 (Тараканов и др., 2004) сконструированы на основе описанной нами критической плазмиды pLFl 311 из LactobacilJus fermentum ВКМ1311. Плазмида pLF1311 принадлежит к семейству рЕ194-подобных плазмид, реплицирующихся по механизму катящегося кольца. Она имеет очень широкий круг хозяев, включая Е. coli и многие виды грамположительных бактерий (Livshits et al., 1990; Aleshin et al., 1999; Алешин и др., 2000). Вектор pLF22 - это челночный вектор, содержащий между генами герЛ и герВ ген lacZ с полилинкером из вектора pUC19.

Штаммы-продуценты аминокислот, использованные в работе, приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Штаммы Е. coli - продуценты аминокислот

Штамм Описание Ссылка

VL472 (pYN7) ВКПМ В

MG442(pVIC40) NZ

NZ10 (pAL4) VL

УЬ2151 УЬ

W3350aгgE::TnlO (рКАЮ) ВКПМ В

ВКПМВ-8125 ВКПМВ

ВКПМ В-8197 (АЛ2739) 8У164 (рОН5) УЬ

Устойчивости: БО11 -к сульфагунидину, ТКАР' -кЮЬ-1,2,4-триазол-3-аланину, АЬК - к 4-аза-Р1,-лейцину, НЬК - к 3-гидрокси-ОЬ-лейцину, - Ь-норлейцину, АБС* - к Б(2- аминоэтил)-цистеину.

Некоторые из этих штаммов-продуцентов были исходными для получения мутантов и клонирования генов, кодирующих транспортёры экскреции аминокислот, но большинство ihrC ilvA scr+(Плазмидный продуцент треонина) thrC itvA rfitA23 tdkr:Ta5 scr+(pVIC40) (Плазмидный продуцент треонина) F'thrA442 ilvA442 (Слабый продуцент треонина) MG442 (Плазмидный продуцент треонина) С600 leu* (Модельный продуцент гомосерина) С600 leu* (Плазмидный продуцент гомосерина) В-3996, но rhtA* Тп 10 tdk (Kms), без pVIC40, но PR-thrAmBC (Продуцент треонина с генами thr-оперона под PR -промотором в хромосоме) W3350 рюВ* AputAP TnlO (Модельный продуцент пролина) hisG* (Модельный продуцент гистидина) (Модельный продуцент аргинина)

Ш Níman-add) rha deoD cäd &{pro-lac) hisG~ SGR

TRA Str* (Продуцент гистидина) thr HomR NLr (Модельный продуцент метионина)

ValR ALeHLr Leu" (Модельный продуцент лейцина)

Продуцент глугаминовой кислоты tyrA: :Тп 10, tyrR (Модельный продуцент фенилаланина)

Модельный продуцент триптофана) thrA metLM dapA* rhtA'Ii (AEC ) (Модельный продуцент лизина)

VL613 rhtA* Тп5 (Модельный продуцент лизина)

A.C. СССР № 904325 A.C. СССР № 1694643 (US patent No. 5175107) Гусятанер и др., 1978 Livshits et al., 2003 Zakataeva et al., 1999 Zakataeva el al., 1999 Патент РФ N«

Патент РФ Ks

Патент РФ Ks 2175351 Харитонов и Тарасов,

Патент РФ Ks

Патент РФ №2209248 Патент РФ №

Патент Франции Ns

Патент РФ №

US patent 6,180,373 A.C. СССР №

Патент РФ № использовалось для оценки влияния повышенной экспрессии или инактивации этих генов на продукцию соответствующих аминокислот. С этой целью в штаммы-продуценты с помощью трансдукции вносили мутации, повышающие экспрессию генов транспортёров, или плазмиды, несущие эти гены. Инактивацию генов в хромосоме осуществляли, встраивая в них маркеры устойчивости к антибиотикам.

Среды. Клетки Е. coli выращивали при 30°С или 37°С на среде LB или на минимальной среде М9 (Миллер, 1976), в которую вносили глюкозу и необходимые добавки и антибиотики.

Ферментации продуцентов аминокислот в пробирках и ферментерах проводили в условиях, описанных в соответствующих патентах и публикациях (Таблица 2). В опытах с «краткосрочной ферментацией» культуры, выращенные в течение ночи в LB, тщательно отмывали физраствором, сгущали и ресуспендировали в соответствующей ферментационной среде, (концентрация клеток соответствовала 1-2 мг/мл белка). Пробы среды отбирали каждый час. Концентрации аминокислот в среде определяли с помощью бумажной хроматографии или с помощью ВЭЖХ.

Внутриклеточный пул аминокислот определяли, как описано (Ebbughausen et al.,1989), измеряя их концентрации с помощью аминокислотного анализатора Biotronic LC2000 (ФРГ).

Для определения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) аминокислот и аналогов аминокислот культуры, выращенные в течение ночи в минимальной среде с необходимыми добавками и антибиотиками (в случае плазмидных штаммов), разводил® и 104 клеток высевали на чашки с различными концентрациями аминокислот или аналогов. Рост оценивали через 48 часов. Каждый эксперимент проводился не менее 3 раз.

Коньюгационные я трансдукцноиные скрещивания проводили по стандартным схемам (Миллер, 1976).

Клонирование in vivo генов, амплификация которых придает устойчивость к треонину и гомосерину, осуществляли с помощью фазмиды Mu d5005, согласно описанной методике (Groismaii and Casadaban, 1986). Фазмиды, содержащие вставки, отбирали на среде М9 с канамицином (50 мг/л) и гомосерином (10 мг/мл) или треонином (50 мг/мл).

Манипуляции с ДНК осуществляли, используя стандартные методы (Sambrook et al., 1989) и следуя инструкциям производителей ферментов для молекулярной биологии (Fermentas, New England Biolabs). Полимеразную цепную реакцию (ГЩР) проводили на приборе фирмы «Perkin Elmer Cetas».

Нуклеотидные последовательности ДНК определяли по Сэнджеру (Sanger et al, 1977) или на автоматическом секвенаторе.

Для определения уровня экспрессии генов получали трансляционные слияния (фьюзы) 5'-концевых областей соответствующих генов с геном lacZ', кодирующим ß-галактозидазу, который содержался в плазмидах pJEL246 или pMWLT. Измереяия и пересчет активности на единицу белка проводили по методу, описанному Миллером (Миллер, 1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава I. Изучение природы мутации гЫА2Ъ и идентификация генов, участвующий в транспорте из клеток Escherichia coli треонина, гомосерина и фенилаланина.

Треонин является одной из аминокислот семейства аспарагиновой кислоты, кула входят также лизин, метионин. Поскольку треонин является предшественником изолейцина, иногда к этому семейству относят и изолейцин (рис.1). Первую общую реакцию пути биосинтеза этих аминокислот у Е. coli катализируют три изозима фермента аспартаткяназы, которые кодируют гены thrA, metL и lysC. Вторую реакцию катализирует фермент дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты, кодируемый геном asd. Третью реакцию катализируют два изозима фермента гомосериндетидрогеназы, кодируемые геном thrA и metL. Последующие реакции биосинтеза треонина катализируют ферменты гомосеринкнназа и треонинситетаза, кодируемые генами thrB и thrC, которые вместе с геном thrA образуют греониновый оперон, расположенный на 0 мин карты хромосомы Е. coli,

АСЛАРТКТ—* АСПАРГИЛ—»• АСПАРТАТ —► ГОМОСЕРИН —► ГОМОСЕРИН —► ТРЕОНИН ФОСФАТ ПОЛУАЛЬДЕГИД ФОСФАТ | thrA asd thrA thrB thrC | metL ^'t metL |

ЛИЗИН ИЗОЛЕЙЦИН

Рис. 1. Схема биосинтеза аминокислот семейства аспарагиновой кислоты.

Как видно на рис. 1, гомосерин является предшественником треонина. В связи с тем, что на минимальных средах оя подавляет рост многих бактерий, а также учитывая ингибирование им активности фермента тлутаматдегидрогеназы, высказыыалось предположение о том, что гомосерин может играть какую-то роль в регуляции клеточного метаболизма (Kotre et al., 1973). Так или иначе, но известно, что у некоторых бактерий производные гомосеринлактона в качестве сигнальных веществ обеспечивают скоординированные реакции клеточной популяции при достижении культурой определённой плотности (Завильгельский, Манухов, 2001).

1.1. Получение и генетическое картирование мутации rhtA

В процессе работы по улучшению технологических свойств штамма Escherichia coli VL472 (pYN7) - продуцента треонина, мы обнаружили, что его рост подавляется высокими концентрациями этой аминокислоты. Возникло предположение, что это подавление может отрицательно влиять на накопление щелевого продукта до высоких концентраций. Поэтому были получены мутанты штамма-продуцента, устойчивые к 50 мг/мл треонина. Среди них был отобран штамм Е. coli VL472T, продукция треонина у которого заметно повысилась (Лившиц и др., 1980).

Однако этот штамм оказался нестабильным: после более или менее длительного культивирования в неселективных условиях большинство клонов утрачивает указанный фенотип. Мк предположили, что устойчивость к треонину штамма Е. coli VL4-72T обусловлена амплификацией в хромосоме какого-то гена, подобно тому, как это происходит в случае возникновения устойчивости к ампициллину (Edlund, Normark, 1981). Как показали эти исследователи, высокий уровень устойчивости к указанному антибиотику у Е. coli обусловлен множественными копиями гена атрС, которые образуются в результате тандемных дупликаций участка хромосомы, несущего этот ген, кодирующий ß-лактамазу. Если это так, то устойчивость к треонину может возникать и в результате регуляторяых мутаций, повышающих уровень экспрессии соответствующего гена. Штамма Escherichia coli VL472(pYN7) обработали мутагеном - N-метил-Ы'-нитро-]\[-яитрозогуанидидам (Миллер, 1976) и получили серию новых мутантов, устойчивых к треонину. Среди нях был отобран стабильных штамм, Е. coli VL472T23, который оказался также способным к росту на среде, содержащей ингибирующие концентрации (>5 мг/мл) гомосерина. По сравнению с исходным штаммом, продуктивность штамма Е. coli VL472T23 существенно возросла (Лившиц и др., 1981; Debabov et al., 1997). Соответствующая мутация была в дальнейшем обозначена как rhlA23 (resistance to Aomoserine and threonine - устойчивость к гомосерину и треонину). Оказалось, что с помощью трансдукции фагом РЗ vir ее можно переносить в различные штаммы, отбирая рекомбияанты, устойчивые к треонину или гомосерину.

Предварительное картирование мутации устойчивости к треонину и гомосерину было проведено опытах с прерыванием конъюгации. Штаммы-доноры Hfl-, несущие мутацию rhtA23, скрещивали с различными полиауксотрофными штаммами F" в качестве реципиентов. В результате этих экспериментов мутация rhtA23 была локализована в районе оперона galKTE. Дальнейшее картирование проводили с помощью трансдукций фагом PI vir. Результаты представлены на рис. 1. Эти опыты показали, что мутация устойчивости к треонину располагается в районе 18 мин. генетической карты Е. coli и тесно сцеплена с генами оперона glnHPQ-, сцепление rhtA23 с генами gInP и glnH генами составляет, соответственно, 93 и 98%.

17мин 18 мин 19 мин

Т---Н—--1-п-———+-1gltA galKTE glnHPQ deoR cmlA

49% -»j

0% ^ 29% ^

---------i*

Рис. 2. Генетическое картирование мутации гЫЛ23. Частота совместного переноса соответствующих маркеров в трансдукционных скрещиваниях указана в процентах.

Таким образом, мы обнаружили, что исследуемая нами мутация не затрагивает структурные гены биосинтеза треонина, а локализуется в районе оперона, кодирующего белки высоко специфичной АТФ-зависимой системы транспорта глутамина в клетки, С помощью трансдукциояных скрещиваний нам не удалось определить, локализуется ли она в пределах оперона glnHPQ, или вне этого оперона. Однако мы показали, что мутации в генах glnP и gínff не сообщают штаммам устойчивость к треонину и гомосерину.

Чтобы определить, является мутация rhtA23 рецессивной или доминантной, сконструировали штамм-меродипяоид, несущий мугангный аллель гена rhtA на хромосоме и дикий аллель на эписоме F'126, которая содержит участок хромосомы от galKTE оперона до области гас (от 17 до 31 мин карты К coli). Такой штамм проявлял фенотип устойчивости к треонину и гомосерину, что, очевидно, свидетельствует о доминантном характере мутации.

1.2. Клонирование в идентификация гена rhtA

С помощью фазмиды мини-Mu d5005 (Groisman and Casadaban, 1986) дикий и мутантный аллели гена rhtA клонировали in vivo. В качестве донора хромосомной ДНК использовали штаммы MG442 Mu cts и MG442 rhtA23. Это - лизогеинные по фагу Mu eis производные штаммов MG442 и MG442 rhtA23, соответственно. Как при клонировании из штамма, несущего дикий аллель гена rhtA, так и при клонировании из штамма, несущего мутацию rhtÁ23, были отобраны рекомбинангные фазмиды, сообщающие клеткам устойчивость к высоким концентрациям треонина н гомосернна. Отобранные фазмиды были проанализированы с помощью рестрикционного анализа. Оказалось, что они содержат фрагменты, принадлежащие к двум разным областям хромосомы.

Для отбора фазмид со вставками, локализующимися в районе оперона g/reHPQ, мы провели скрининг штаммов, полученных в результате клонирования, методом гибридизации колоний с радиоактивномечешшм зовдом (Sambrook: et al., 1989). В качестве зонда использовали смесь 6 меченных Р32 фагов EMBL4 из коллекции Кохары (Kohara et al, 1987), перекрывающих область 17,5-18,5 мин. карты хромосомы. Это фаги 3D4, 24F9, 1В4, 10АВ, ЗЕ5, 1Е2. В результате были отобраны фазмиды со вставками как из хромосомы штамма rhtA23 (pNPZIOR), так и из хромосомы штамма rhtA* (pNPZ4S), сообщающие клеткам устойчивость к треонину и гомосерину и локализующиеся в районе 18,3 мин генетической карты (рис. 3). Рестрикционный анализ показал, что размер отобранных вставок варьирует от 9 до 16,5 тысяч пар нуклеогидов (т.п.н.), и все они содержат перекрывающийся фрагмент хромосомы, составляющий, приблизительно 7 т.п.н. Субклонирование различных фрагментов этой области перекрывания в мультикопийные векторы выявило минимальный фрагмент, который обеспечивает устойчивость к гомосерину и треонину. Он, составляет 1,2 т.п.н (конструкции pNPZ 16 (pRhtA) и pNPZ17) и включает известную как ybiF (GenBank U00096)), открытую рамку считывания (ORF) расположенную между генами рехВ и отрХ (рис. 3). Делеция фрагмента, затрагивающего 5'- концевую область ybiF и 18 нуклеотидов вправо от инициаторного кодона этой ORF (конструкция pNPZi8) приводит к утрате фенотипа устойчивости к треонину в гомосерину (рис.3).

Таким образом, мы идентифицировали ген rhtA как ORF между генами рехВ и отрХ и показали, что увеличение числа копий (амплификация) дикого аллеля гена также сообщает клеткам устойчивость к треонину и гомосерину. pNPZIOR pNPZ4S +2 U и и ВЫ

10 kb sos « e.ä ■ ! II I—Ii I Уf ^ glr.Q glnP glnH pexB rfaA отрХ ^/biP pNPZ14 pNPZ pNPZ16, dNPZ17 pNPZiS ' pNPZ

Устойчивость к гомосерину в треонину

ZT кап

Рис. 3. Идентификация гена rhtA.

Вверху приведены фазмиды, несущие участки хромосомы из района 18 мин генетической карты Е. coli и рестрикционная карта фрагмента ДНК рядом с опероном gfeHPQ. Под ней черными стрелками обозначены гены и направления их считывания. Слева расположены названия плазмид, несущих клонированные фрагменты хромосомы,, представленные линиями в центре, а справа -фенотип клеток, несущих эти плазмиды.

Другой тип вставок, клонированных на фазмиде мини-Mu d5005 по устойчивости к треонину и гомосерину, содержал фрагменты хромосомы из области 86 мин генетической карты. Этот фенотип обеспечивает сверхэкспрессия генов rhlB и rhtC (см.

Глава 2).

1.3. Нуклеотидная последовательность дикого и мугантного аллелей гена rhtA и влияние мутации rhtA23 на его экспрессию

Мы определили нуклеотидную последовательность дикого и мугантного аллелей гена rhtA. Нуклеотидная последовательность дикого аллеля совп&та с имеющейся в базе данных GenBank последовательностью, а в мутантном найдена транзиция G на А в положении -1 по отношению к стартовому кодону ATG (рис.4). Известно, что состав нуклеотидов в промежутке между участком присоединения рибосомы (RBS или SD-последовательностью) и стартовым кодоном и, в особенности, характер нуклеотидов, непосредственно предшествующих этому кодону, играют важную роль в эффективности трансляции мРНК. При этом уровень экспрессии генов может варьировать в 20 раз (Gold et ей., 1981).

• MPGSLRKMPG I RRP ADPVV rhta* tgtgggagaaagGatgcctggttcattacgtaaa/.tgccggggatccgtcgacctgcagatcccgtcgtt

ФРАГМЕНТ ПОЛИЛИНКЕРА LacZ

MPGSLRKMPG I RRP ADPVV rhtA23 TGTGGGAGAAAG/^ATGCCTGGTTCATTACGTAAMTGCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGATCCCGTCGTT

ФРАГМЕНТ ПОЛИЛИНКЕРА LacZ

Рис, 4, Нуклеотидная последовательность участка гена rhtA и его мугантного аллеля rhtAZi в районе стартового кодона и их трансляционного слияния с геном lacZ.

Фрагменты нуклеотидных последовательностей в районе слияния rhtA+'-'lacZ (плазмида pAZl) и rhtA23'~'lacZ, (плазмида pAZ2). Показана замена G на А (жирный курсив), которая привела к повышению устойчивости клеток к треонину и гомосерину. Стартовый кодон выделен жирным шрифтом. Предполагаемая последовательность SD подчеркнута.

Влияние мутации rhtA23 на экспрессию определяли с помощью транскрипционно-трансляционных слияний (фьюзов) регуляторных областей гена rhtA и его мутантного аллеля с геном lacZ, кодирующим ß-галактозидазу (рис.4). Плазмидами, содержащими трансляционное слияние rhtA-lacZ (плазмида pAZl) и rhtA23-lacZ (плазмида pAZ2) трансформировали штамм TQ1 и определяли активность ß-галакгозидазы в клетках штаммов TGI (pAZl) и TGI (pAZ2) (рис. 5).

У обоих штаммов наблюдалась низкая активность ß-галактозидазы, что, очевидно, указывает на слабую экспрессию гена rhtA в клетках Е. coli. Вместе с тем, у штамма, несущего плазмиду pAZ2, активность ß-галакгозидазы почти на порядок выше, чем у штамма, несущего плазмиду pAZl (рис. 5). Это свидетельствует о том, что идентифицированная нами мутация rhtA23, сообщает устойчивость к треонину и гомосерину, очевидно, повышая уровень экспрессии гена rhtA. Как уже отмечалось, к аналогичному результату приводит и амплификация дикого аллеля этого гена при клонировании его в мульгикопийные векторы.

Время, часы

Рис, 5. Влияние мутации rhtA23 на экспрессию rhtA-lacZ фьюзов.

О - ОП540 штамма TGI (pNPZl); О- активность Р-галактозидазы штамма T'G1 (pNPZl); • - ОП540 штамма TGI (pNPZ2); ■ - активность р-галактозидазы штамма TGI (pNPZ2).

1.4. Ген rhtA кодирует гидрофобный мембранный белок.

Гея rhtA кодирует белок, состоящий из 295 аминокислотных остатков, и имеющий рассчитаную молекулярную массу 31,2 тысяч дальтон (кияодальгон, кДа). Построенный по методу Кайта и Дулитгла (Kyle and Doolittle, 1982) гидрофобно-гидрофильный профиль белка лежит з области положительных значений (рис. 6), что указывают на его гидрофобный характер и, очевидно, свидетельствует о взаимодействии с мембранными структурами клетки.

Рис. 6. Гидрофобно-гиброфильяый профиль белка RhtA. Использовался алгоритм Кайга и Дулитгла при окне в 9 аминокислотных остатков.

Для определения клеточной локализации белка RhtA мы экспрессировали ген rhtA под контролем промотора фага Т7 in vivo с помощью РШС-полимеразы этого же фага (Т7-РНК-полимеразы). Для этого ген rhtA был амплифицирован методом PCR с использованием праймеров, которые были комплементарны соответствующим участкам хромосомной ДНК штамма МБ 1655 и содержали сайты рестрикции для рестриктаз Ше\ и ЕсоЯ1. Амплификат клонировали в вектор рЕТ-22Ь(+) и получили конструкцию рЕТ-22Ь-гМА, в которой ген гЫА находится под контролем промотора фага Т7. Плазмидой рЕТ-22Ь-гМА трансформировали штамм ВЬ21(Т>ЕЗ), несущий на хромосоме ген Т7 РНК-шшимеразы под контролем 1асОТ5 промотора лактозного оперона. Полученный штамм ВЬ2!(ОЕЗ, рЕТ-22Ъ-йцА) использовали в опыте. В качестве контроля был взят штамм ВЬ21(ОЕЗ,рЕГ-22Ь(+)), несущий вектор рЕТ-22Ь(+) без вставки.

Т7-РНК-полимеразу индуцировали с помощью 1РТО и синтезируемые в клетках штаммов ВЬ21 (БЕЗ, рЕТ-22Ъ-гЫА) и ВЬ21(ОЕЗ, рЕТ-22Ь+) белки метили [358]метионином. После индукции клетки разрушали и фракционировали с помощью дифференциального центрифугирования, затем белки осадка или растворимых фракций, внесенные в одинаковом объёме в 15% 8Б8-подиакриламидный гель, разделяли с помощью электрофореза (ЬаеттМ, 1970) и авгорадиографировали. Полученная авторадиограмма представлена на рис.7.

1 2 £

§ «

Й^ИрерЫ*** в7— ;

43— ;

Щттт ■■ |

29— I

Рис. 7. Определение клеточной локализации белка RhtA.

Авторадиограмма, меченых [358]-мегионином клеточных белков штамма Е. coli, в котором ген rhtA экспрессирован с использованием системы промотор/РНК-полимераза фага Т7.

Дорожка I: контрольный штамм, содержащий вектор рЕТ22Ь; дорожка 2: осадок центрифугирования при 15000 g; дорожка 3: супернатант центрифугирования при 15000 g; дорожки 4 и 5: осадок и супернатант центрифугирования при 180000 g; дорожки 6 и 7: осадок и супернатант центрифугирования при 180000 g после обработки мембранной фракции 1 М KCl. Слева приведены молекулярные маркеры (в kDa). Стрелка указывает RhtA.

Как видно на рис. 7, RhtA осаждается совместно с мембранной фракцией (дорожка 4) и отсутствует во фракции растворимых белков (дорожка 5), а после обработки мембранной фракции 1 М KCl остается с ней связанным (дорожки 6 и 7). Эти данные свидетельствуют о том, что белок RhiA интегрирован в мембрану. Следует отметить, что электрофоретическая подвижность RhtA соответствует молекулярной массе приблизительно 25 Ша вместо предсказанной 31,2 kDa, что может быть следствием его сильной гидрофобности.

Таким образом, мы показали, что ген rhtA кодирует гидрофобный мембранный белок.

1.5. Инактивация гена rhtA и изучение влияния различных его аллелей на устойчивость клеток Е, coli к аминокислотам и аналогам аминокислот.

Для изучения функций белка RhtA в метках Е. coli, мы инактивировати ген rhtA. С этой целью на основе плазмиды pNPZl 6 предварительно была сконструирована плазмида p№"Z30, в которой ген кап, вырезанный из вектора pUC4K, встроили в середину кодирующей области гена rhtA. (Рис. 3). Было установлено, что мутация по гену rhtA яе влияет заметным образом на жизнеспособность бактерий.

Затем изучали влияние разных аллелей rsmrhtA (rhtA^ rhtA23 и rhtA\:kari), и амплификации этого гена на плазмиде (pNZ! 6) на устойчивость клеток штамма E.coli N99 к аминокислотам и их аналогам. С этой целью определяли минимальные ингибирующие концентрации (МИК) этих соединений при добавлении их в агаризованную глюкозо-минеральную среду М9 (Таблица 3).

Оказалось, что мутация rhtA23, прежде всего, очень значительно (более чем на два порядка) повышает устойчивость клеток к гомосерину. Более чем в три раза повышается устойчивость к треонину. Но, кроме того, эта мутация, а также амплификация гена rhtA на плазмиде сообщает клеткам Е. coli повышенную устойчивость и к другим аминокислотам и целому ряду их аналогов: DL-оксинорвалину (аналогу треонина); 8-(2-аминоэтил)-Ь-цистеину (анатогу лизина); 4-аза-ПЬ-лейцину (аналогу лейцина); 2,4-дегидроЛ>Ь-лролину (аналогу пролина); (табл. 1). Сходный эффект, хотя и несколько менее выраженный, дает амплификация дикого алледя гена rhtA. С другой стороны, при инактивации гена rhtA повышается чувствительности клеток штамма Е. coli N99 к треонину, серину, цистеину и некоторым аналогам аминокислот (табл.1). Результаты этих экспериментов аналогичны тем, что были получены при исследовании множественной лекарственной устойчивости, обусловленной активным транспортом из клеток бактерий различных ингибиторов роста. В случае такого типа устойчивости повышение уровня экспрессии генов, участвующих в экскреции токсичных соединений, увеличивает степень резистентности бактерий, а инактивация этих генов делает клетки сверхчувствительными к ингибиторам роста (Li and Nikaidc, 2004).

Мутация rhtA23 однако не влияла на устойчивость £. coli х антибиотикам хлорамфениколу, ампициллину, тетрациклину, полимиксияу, а также к акридину и дезоксихолевой кислоте. Кроме того, она не влияла на рост бактерий в гипертонических средах (данные не приведены).

Таблица 3.

Минимальные ингибирующие концентрации (МЖК) некоторых аминокислот и аналогов аминокислот для клеток штаммов Е.соИ, несущих разные аллели гена гШ

Аминокислота или аналог аминокислоты МИК (мг/мл) для клеток штамма Е. coli

N99 rhtA4' N99 rhtATi N99 (pNZ16) N99 rhtAv.kan

L-Гомосерин 0,75 >100 50 0,

L-Треонин 30 >

L-Гистидин 5 20 10 2,

L-Пролин

L-Лизин 60 70 и.о.

L-Глутамат (Na соль) 10 30 н.о.

L-Аспарагин 50 80 н.о.

L-Глутамин 75 90 н.о.

L-серин

L-цистеин 2 6 н.о.

Глицин 15 20 н.о.

L-Валин 0,001 0,003 н.о. 0,

L-Изслейцин 20 20 н.о.

DL-оксииорваиш 0,1 1 1 н.о. 0,

L-Триптофан 15 15 н.о.

L-Фенилаланин 10 10 н.о.

0,Ь-оксинорвалин 0,1 0,5 0,2 0,

S -(2-аминоэтид)-Ь-цнстеин 0,01 0,25 н.о. 0,

4-аза-ОЬ-лейцин 0,05 0,5 0,25 0,

2,4-дегидро-ОЬ-пролин 0,01 0,1 н.о. 0, и.о. - не определяли.

1.6. Сверхэкспрессия гена rhtA снижает накопление в клетках гомосерина и треонина.

В свете данных, представленных выше, логично предположить, что мутация rhtA23 усиливает экскрецию соответствующих аминокислот и их аналогов. Известно, что в случае повышенной экспрессии (сверхэкспрессии) генов, кодирующих транспортёры множественной лекарственной устойчивости, накопление соответствующих ингибиторов в клетках снижается (Nikaido, 1996). В связи с этим определяли накопление меченых [3Н]-гомосерина и [3Н]-треонина клетками Е. coli, несущими разные аллели гена rhtA (рис. 8).

Как показано на рис. 8, А, через 8,5 мин в клетках штамма гШ* накапливается в 5 раз больше меченого гомосерина, чем в клетках штамма гЫА23. Анатогичный результат получен и для меченого треонина (рис. 8, Б).

12345678 Время {мин)

Время (мин)

Рис. 8. Влияние мутации rhtA23 на накопление гомосерина и треонина в клетках Е. coli. А. Накопление [3Н] гомосерина в клеткахшгамма: 9-Е. coli N99 rhtA+; И - Е. coli N99 vhtA23. Б. Накопление [3Н] треонина в клетках штамма: • - Е. coli N99 rhtAт - Е. coli N99 rhtA23).

В условиях нашего эксперимента синтез белка подавлен хлорамфениколом, и уровень накопления аминокислоты является результатом двух одновременных процессов: транспорта аминокислоты в клетку и выброса ее из клетки. Любое изменение каждого из этих процессов может влиять на накопление метки. Известно, что ауксотрофные по треонину мутанты с нарушенным транспортом треонина в клетку могут расти только при очень высокой (~10 мМ) концентрации этой аминокислоты в среде и не растут при низкой (0,1 мМ) ее концентрации (Okamoto et al„ 1997). В то же время, они хорошо растут при низкой концентрации треонин-содержащих дипептидов, которые поступаю г в клетки с помощью специальных систем транспорта для пептидов и расщепляются пептидазами с образованием треонина. Мутация rhtA2i, очевидно, не влияет на транспорт треонина в клетки, поскольку ауксотрофный по треонину штамм N99 thr:.TnlO rhtA2i рос почти одинаково хорошо на среде, содержащей 0,1 мМ треонина или 0,1 мМ Ь-аланил-Ь-треонина. Следовательно, снижение уровня накопления треонина и гомосерина в клетках штамма Е. coli N99 rktATi (рис. 8, А и Б) связано с усиленной экскрецией этих аминокислот под влиянием мутации гЫА2Ъ.

Следует также отметить, что в этих опытах не удалось обнаружить заметного влияния мутации rhtAr.kan на накоплении указанных аминокислот. Возможно, что это связано с очень низким уровнем экспрессии гена rhtA в клетках дикого типа, а также с наличием альтернативной системы экскреции треонина и гомосерина из клеток (см. ниже).

1.7. Сверхэкспрессия гена rhtA в клетках штаммов-продуцентов увеличивает скорость накопления треонина в гомосерина в среде в снижает их содержание в клетках.

Штамм £ coli MG442 является слабым продуцентом треонина, у которого нарушена негативная регуляция биосинтеза этой аминокислоты (Гусятинер и др., 1978). Продуктивность этого штамма может быть значительно повышена введением плазмиды pVIC40, которая содержит гены треонинового оперон thrAuiBC (Debabov et al., 1992). Мутация thrA^z в этом опероне придает бифункциональному ферменту аспартаткиназе (ЕС 2,7.2.4)-гомосериндегидрогнназе-1 (ЕС 1.1.1.3) устойчивость к подавлению конечным продуктом пути биосинтеза - треонином. Так был получен штамм £. coli MG442(pVIC40).

Штамм NZ10 способен продуцировать гомосерин, поскольку содержит мутацию в гене thrB, кодирующем гомосеркнжиназу (ЕС 2,7.1,39). Его продуктивность повышается при введении плазмиды pAL4, несущей гев thrA дикого типа.

В опытах с «краткосрочной ферментацией» штаммов-продуцентов мутация rhtA23 повышала скорость накопления аминокислот в среде. Как показано на рис. 9, А, через 3 часа клетки штамма Е. coli MG442 rhtA23 (pVIC40), несущего эту мутацию, выделили в среду приблизительно в два раза больше треонина, чем клетки его изогеннного rhtÄ*-варианта Е. coli MG442 (pVIC40). Точно так же, клетки штамма Е. coli NZ10 rhiAZ%pKLA) выделяли гомосерин с большей скоростью, чем клетки его азогеннный г/ггЛ^-варианта NZ10 гйгЛ23(рАЬ4) (рис. 9, Б).

Time (min> Time (mln|

Рис. 9. Влияние мутации rhtA23, инактивации гена rhtA и добавленя СССР на накопление треонина и гомосерина в среде.

А. Накопление треонина в среде культивирования клетками штаммов Е coli:

• - MG442 rhtA+ (pVIC40); ■ - MG442 rhtA23 (pVIC40); * - MG442 rhtA::kan (pVIC40)

- MG442 rhtA23 (p VIC4Ö) при добавлении с самого начала 20 |хМ СССР.

Б. Накопление гомосерина в среде культивирования в клетках штаммов Е. coli:

• - NZ10 rhtA+(pALi), л - NZ10 rktA23 (pAL4), a- NZ10 rhtA::kan (pAL4).

- NZ10 гЫЛ23 (pAL4) после добавления 20 цМ СССР в момент, указанный стрелкой.

При добавлении 20 мкМ протонофора карбонилцианид-т-хлорфенилгидразона (СССР), который снижает трансмембранный электрохимический потенциал, (но не влияет на рост бактерий), накопление аминокислот в среде немедленно прекращалось (рис. 9, А и Б). Таким образом, выделение аминокислот клетками зависит от протоядвижущей силы.

Эффект мутации rhtA23 не связан с ее влиянием иа биосинтез треонина и его накопление в клетках, поскольку эта мутация даже снижала внутриклеточное содержание этой аминокислоты. Так, пул треонина в клетках штамма MG442 (pVIC40) составлял 183±53 нмоль/мг сухого веса клеток, а в клетках штамма MG442 rhtA23(pV!C40) он был существенно меньше и составлял 30±8 нмоль/мг сухого веса клеток

Таким образом, сверхэкслрессия гена rhtA в клетках штаммов-продуцентов увеличивает скорость накопления соответствующих аминокислот в среде и снижает их содержание в клетках.

1.8. Сверхэкспрессия гена rhtA в клетках Bacillus subtilis повышает их устойчивость к гомосерину.

В совокупности полученные данные свидетельствуют о том, что ген rhtA участвует в экскреции треонина и гомосерина, очевидно, кодируя белок-транспортёр (RhtA), который осуществляет зависимый от протондвижущей силы транспорт этих аминокислот из клеток. Однако в отсутствие прямых экспериментальных данных о транспортной функции RhtA правомочно также предположение о том, что RhtA является регуляторным белком, активирующим продукцию неизвестного транспортного белка, который и осуществляет экскрецию аминокислот. Для проверки этого предположения мы эхспреесировали ген rhtA в клетках Bacillus subtilis и изучали его влияние на фенотип этой бактерии. Если RhtA является

-рКзп

Рис. 10. Схема гибридной плазмиды pLF-RhtA. регуляторным белком, то его продукция не должна влиять на устойчивость клеток бациллы к гомосерину, поскольку Е. coli и Bacillus subtilis, будучи не родственными микроорганизмами, очевидно, имеют разные механизмы регуляции экспрессии генов. С другой стороны, известно, что чужеродные транспортные белки могут встраиваться в мембраны бактерий и осуществлять присущую им функцию (Evans et al., J 995).

Для экспрессии в Bacillus subtilis кодирующую область гена rhtA клонировали в челночный вектор pLF14 (Sheveiev et al., 2000). Клонирование было проведено таким образом, чтобы ген rhtA экспрессировался под контролем промотора гена кап плазмиды pLF14 и имел сайт связывания рибосом генаригЕ из Bacillus subtilis 168. Рекобинантную гшазмиду pLF-rhtA (рис. 10), а также исходный вектор трансформировали в штамм Bacillus subtilis 168. Затем определяли способность полученных штаммов к росту на минимальной среде, содержащей различные концентрации гомосерина (Таблица 3).

Таблица 3.

Рост штаммов В. subtilis(pLFl 4) и В. subtilis (pLF-RhtA) в присутствие различных

Штамм Рост* в присутствии гомосерина, мг/мл

В. subtilis 168 (pLF14) + +

В. subtilis 168 (pLF-rhtA) + + +

Культуры выращивались при 37 С в течение 44 часов на минимальной агаризованной среде, содержащей указанные концентрации гомосерина: + хороший рост, - отсутствие роста.

Как видно из Таблицы 3, гомосерин в концентрации 15 мг/мл полностью подавлял рост штамма, содержащего вектор. В то же время штамм, несущий гшазмиду с геном rhtA, хорошо рос в этих условиях. Полученный результат свидетельствует о том, что продукт гена rhtA, белок RhtA, -это транспортёр, способный осуществлять свою функцию и в клетках чужеродных бактерий.

1.9. Белок RhtA принадлежит к обширно,«)' семейству транспортных белков.

Поиск с помощью программ PSI-BLAST (Altschul et al„ 1998) в базах данных бактериальных геномов выявил большое число белков (>250), гомологичных RhtA. Эти белки принадлежат микроорганизмам различных видов, и функции большинства из них не известны. Один из белков с известной функцией, YdeD, участвует в экскреции аминокислоты цистеина и его производных из клеток E.coli (Daßlei et al., 2000). Другой, - РесМ, участвует в экскреции голубого пигмента из клеток Erwinia chrysanthemi (Rouanet and Nasser, 2001). Следует отметить, что эти публикации появилась уже после того, как мы сообщили предварительные результаты исследований, свидетельствующие об участии RhiA в экскреции треонина и гомосерина (Zakataeva et al., 1997), и авторы первой из цитируемых статей ссылаются на нашу работу.

В геномах эухариотов также обнаруживаются белки, гомологичные RhtA. Это транспортёры нуклеозидфосфатов, гексозофосфагов и триозофосфатов (Berninsone et а!., 2000; Hirschberg et al, 2001: Knappe et al., 2003), а также большое число белков с неизвестной функцией. Все эти белки имеют близкие, рассчитанные по последовательности нуклеотидов, молекулярные массы и сходную локализацию потенциальных трансмембранных сегментов, т.е., очевидно, является мембранными белками и, вероятно, также участвуют в транспорте различных соединений. Они относятся к семейству белков Pfam00892 (DUF6) (Bateman et al, 2000). Кроме того, эти белки включены в надсемейство DMT транспортёров ядов и метаболитов (Jack et al., 2001).

Филогенетический анализ, проведенный в нашей лаборатории В.В. Алешиным, показал, что несколько групп гомологов RhtA (которые можно рассматривать как различные семейства или подсемейства) включают белки бактерий, архей и эукариотов. Эти данные свидетельствует о том, что гомологи RhtA появились рано в процессе эволюции, и общий предшественник живых организмов уже имел несколько таких гомологов.

Согласно современной классификации транспортных белков, белок RhtA включен в семейство экспортеров ядов и метаболитов (ТС 2.А.7.З. The 10 TMS Drug/Metabolite Exporter (DME) Family) под номером ТС 2.А.7.3.6 (http.V/www.tcdb.org). Кроме того, он входят в кластер ортояогичных групп пермеаз ядов и метаболитов, COG0697 (Tatusovet а!., 2003).

Геномы некоторых бактерий содержат множество генов, кодирующие гомологи (паралоги) RhtA. Так, в геноме Е. coli имеется, по крайней мере, 10 таких генов, а в геноме В. subiilis - 14 таких генов.

1.10. Поиск генов Е. coli, участвующих в экскреции фенилаланина.

Из результатов описанных выше опытов следует, что, во-первых, большинство аминокислот при определенных (обычно высоких) концентрациях подавляют рост Е. coli на минимальной среде. Во-вторых, сверхэкспрессия гена, участвующего в выведении аминокислоты из клеток, повышает их устойчивость к этой аминокислоте. Следовательно, гены, кодирующие белки-транспортёры экскреции данной аминокислоты, можно найти среди тех генов, апмплификация которых повышает устойчивость к этой аминокислоте (или её аналогам). Этот подход был успешно реализован при поиске новых генов, участвующих в экскреции аминокислот.

Как отмечалось, поиск с помощью программы PSI-BLAST выявил, что в геноме E.coli Кприсутствуют, по крайней мере, еще 9 генов, кодирующих гомологи (паралоги) RhtA. Это гены ydeD, yedA, yddG, yijE, yicL, yigM, ytfF, yfbJnyhbE. Из них ген ydeD кодирует белок, участвующий в экскреции цистеина, его предшественников и производных (DaBler et al., 2001), а функции остальных генов оставались неизвестными. Мы предположили, что некоторые из этих генов могут также участвовать в выведении аминокислот из клеток E.coli. С практической точки зрения особый интерес представляло выявление генов, участвующих в экскреции ароматических аминокислот - фенилаланина и триптофана. Будучи гидрофобными, эти аминокислоты, могут эффективно проникать через бактериальную мембрану (Krämer, 1994), и необходимость в специальных экспортерах для них совсем не очевидна. Вместе с тем, при высоких концентрациях они токсичны для клеток, и поэтому мы предположили, что подобно другим токсичным гидрофобным соединениям, они могут выводиться из клеток системами активного транспорта. На основе имеющейся в базе данных нуклеотидной последовательности хромосомы Е. coli (Blattoer et al., 1997) были синтезированы праймеры для ПЦР с таким расчетом, чтобы амплифицировать указанные гены, включая их собственные регуляторные области. Полученные фрагменты ДНК, содержащие также сайты узнавания ферментами рестрикции ВатШ и Sah, клонировали в мультиколийньш вектор pUC19, а затем переклонировали в вектор с умеренным числом копий pAYCTER3. Плазмиды на основе того и другого вектора, несущие соответствующие гены, обозначались под номером 1 и 2 (например, pYddGl и pYddG2). Вектор pAYCTER3 - очень стабильный вектор, производный плазмиды RSF1010. Он был сконструирован в АГРИ путем введения лолилинкера из pUC 19 и сильного терминатора гена ггпВ в вектор pAYC32 (см. Табл. 2).

Полученные рекомбннантные плазмиды трансформировали в штамм E.coli TGI. Оказалось, что не все плазмиды, несущие перечисленные выше гены, могут поддерживаться в клетках Е. coli. Так, несмотря на неоднократные попытки, нам не удалось получить стабильные трансформанты, несущие в pUC19 гены yjbJ и yhbE. Возможно, это связано с «токсичностью» соответствующих белков при сверэкспрессии их в клетках.

Полученные штаммы проверяли на устойчивость к ароматическим аминокислотам я т. аналогам. Концентрации аминокислот и аналогов в этих опытах были взяты с таким расчетом, чтобы они заметно превышали минимально иягибирующие контрольный штамм E.coli TGI, несущий векторы pUC19 и pAYCTER3.

В результате было обнаружено два гена, yedA и yddG, амплификация которых повышала устойчивость клеток к фенилаланину и его аналогам, а также к аналогу триптофана (Таблица. 4). При этом сверхэкспрессия гена yedA сообщала устойчивость также к ряду других аминокислот я аналогов: гомосерину, треонину, цистеину, гисткдину, аналогу лизина 8(2-аминоэтил)-Ь-цистеину и аналогу лейцина4-аза-ОЬ-лейцину, а сверхэкспрессия гена yddG повышала также устойчивость клеток к гистидину.

Таблица 4.

Минимальные ингибирующие концентрации некоторых аминокислот и аналогов аминокислот для клеток штаммов E.coli, несущих плазмиды с генами yedA v. yddG.

Соединение Концентрация, мг/мл Рост штамма E.coli TGI, несущего плазмиды pUC19* pYedAl pYedA2 pYddGl pYddG

- - Н- + + -ь "Г

L-фенилалания 20.0 - + - + ±

L-гомосерин 3.0 - + + -

L-треонин 50.0 - + т -

L-цистеин 7.5 + н.о. -

L-гистидин 20.0 - + н.о. + + п-фтор-ОЬ-фенилаланин 1.0 + + + + п-фтор-ПЬ-фенилаланин 2.0 - + - + +

5-фтор-ОЬ-трипгофан 0.0005 - + - 4 +

8(2-аминоэтил)-Ь-цистеин 0.4 - + +

4-аза-ОЬ-лейцин 1.0 + н.о. - Аналогичные результаты были получены для штамма TG1, содержащего вектор pAYCTER3. Рост оценивали через 44 часа культивирования на минимальной среде М9, содержащей указанные соединения. +: хороший рост; ±: слабый рост; -: остутствие роста; и.о.; нет определяли.

Следует отметить, что в этих опытах прослеживается зависимость уровня устойчивости от копийяости плазмиды. Так, ген yedA сообщает устойчивость к 2.0 мг/мл фенилалаяина, 2 мг/мл р-фтор-ПТ-фенилаяаяина, также к 5-фтор-ОЬ-гриптофану только при клонировании его в мультикопийный вектор pUC!9 (Таблица 4). Интересно, что ген yddG придает определенную устойчивость к тем же соединениям даже при клонировании в вектор умеренной коликностк pAYCTER3. Как будет показано ниже, эти два гена способны повышать продуктивность соответствующих штаммов-продуцентов, очевидно, активируя экскрецию соответствующих аминокислот. При этом продукт гена yddG, видимо, обладает наибольшей специфичностью к фенилаланину. Таким образом, впервые обнаружены транспортёры, участвующие в экскреции ароматических аминокислот.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Лившиц, Виталий Аркадьевич

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Лившиц В.А.,Соколов А.К, Дебабов В.Г., Жданова Н.И., Козлов Ю.И., Хургес Е.М., Бачта Т.А., Козырева Л.Ф. 1980. Способ получени L-треонина. Авторское свидетельство СССР № 904325 (Опубл. 1990).

2. Лившиц В.А.,Соколов А.К, Бенина Т.А., Дебабов ВТ., Жданова Н.И., Козлов Ю.И., Беларёва А.В., Гусятинер М.М., Хургес ЕМ., Гупъко М.А., Тевелев Г.Х., Позднякова Т.М., Горячева Н.А., Мошенцева В.Н., Ребентиш Б.А., Шолип А.Ф., Янковский Н.К. 1981. Способ получени L-треоника. Авторское свидетельство СССР № 974817 (Опубл. 1990).

3. Лившиц В.А., Хайкинсон М.Я., Сорокин А.В., Мурзина Л.Н., Богуш В.Г. 1982. Тп2555: новый транспозон, несущий детерминанты усвоения сахарозы. // В сб. Метаболические плазмиды бактерий. Тезисы докладов Всесоюзной конференции. Таллин, 1982. С.131-133.

4. Астауроеа О.Б., Лившиц В.А., Бежрева А.В., Соколов А.К. 1985. Аминирование у штаммов Е. coli, эффективно продуцирующих треонин // Прикладная биохимия и микробиология. Т. 21. No. 5. С. 611-616.

5. Дорошенко В.Г. Лившиц В.А. 1987. Свойства транспозона Тп2555, несущего гены утилизации сахарозы // Мол. генетика микробиология вирусология. No.6. С. 23-28.

6. Дебабов В.Г., Козлов Ю.И., Хургес Е.М., Лившиц В.А., Жданова Н.И., Гусятинер М.М., Соколов А.К., Бачина Т.А., Янковский Н.К., Цыганков Ю.Д., Чистосердов А.Ю., Плотникова Т.Г., Шакалис И.О., Беларёва А.В.,Арсатяиц Р.А., Шолин А.Ф., Позднякова Т.М. 1987. Штамм бактерий Escherichia coli - продуцент треонина // Авторское свидетельство СССР № 1694643 (Опубл. 1991). Аналоги: Патенты США №5175107, 1992; № 5538873, 1996; № 5705371, 1998; № 5976843, 1999; № 6165756,2000; №6297031, 2001 6653111,2003.

7. Дорошенко В.Г., Даншевич В.Н., Каратаев Г.И., Лившиц В.А. 1988. Структурная и функциональная организация транспозояа Тп2555, несущего гены утилизации сахарозы // Молекулярная Биология. Т.22. Вып. 3. С. 645-658.

8. Дорошенко В.Г., Даяшевич В.Н., Лившиц В.А. 1988. Изучение детерминант утилизации сахарозы транспозонаТп2555 Н Мол. генетика микробиология вирусология. № 11. С. 29-35.

9. Гавршова О. Ф., Кричевская СМ., Лившиц В.А., Николаевская Е.Е., Родионов O.A.,

Хургес Е.М., Козлов Ю.И. 1988. Амплификация генов биосинтеза изолейцина, несущих регуляторную мутацию, в клетках Е. coli К-12. Биотехнология. Г.4 №5. С. 600-607.

10. Livshits V.A., Torban Е.В., lomantas J.V., Doroshenko V.C., Setnyonova E. V. 1990. A new broad host range plasmid from Lactobacillus fermentum // IUMS Congress: Bacteriology & Mycology - Osaka, Japan 1990. Program & Abstracts. P.212.

11. Дебабов В.Г., Козлов Ю.И., Хургес E.M., Лившиц В. А., Жданова Н.И., Гусятинер М.М., Соколов А.К., Банта Т.А., Чистосердов А.Ю., Цыганков Ю.Д., Янковский Н.К., Машко С.В., Лапидус А.Л., Гавршова О.Ф., Родионов O.A. 1991. Штамм бактерий Escherichia coli - продуцент треонина // Авторское свидетельство СССР № 1714927,

12. Livshits V.A., Debabov V.G., Gavrilova O.F., Zakataeva KP., Shakulov R.S., Bachina T.A., Khurges EM 1996. Production of isoleucine by Escherichia colt having isoleucine auxotrophy and no negative feedback inhibition of isoleucine production. US patent No. 5534421.

13. Debabov V.G., Kozlov J.I., Khurges E.M., Livshits V.A., Zhdanova N.I., Gusyatiner M.M.,Sokolov A.1С, Bachina T.A. 1997. Bacterial strain of Escherichia coli YNIIGenetika 472T23 as the producer of threonine. US patent No. 5631157.

14. Zakataeva N.P., Ahshin V.V., Livshits V.A. 1997. Characterization of a pleiotropic mutation that confers upon Escherichia coli cells resistance to homoserine and threonine // 17th International Congress of Biochemistry and Mol. Biology in conjunction with 1997 Annua! Meeting of the American Society for Biochemistry and Mol. Biology, San Francisco, i997//FASEB J. V.ll. A935.

15. Livshits V.A., Debabov V.G., Gavrilova O.F., ZakataevaN.P., Shakulov R.S., Bachina T.A., Khurges E.M. 1997. Strains of Escherichia coli which produce isoleucine or valine and a method for their production. US patent No. 5658766.

16. Aleshin V.V., Zakataeva N.P. , Lvshits V.A. 1999. A new family of amino-acid-efflux proteins // Trends Biochem. Sei. V. 24. P. 133-135.

17. Aleshin V.V., Semenova E. K, Doroshenko V.G., Jomantas Y.V., Tarakanov B.V., Lvshits V.A. 1999. The broad host range plasmid pLF1311 from Lactobacillus fermentumVKM1311 // FEMS Microbiol. Lett. V. 233. P.353-359.

18. Zakataeva N.P., Aleshin V.V., Tokmakova I.L., Troshin P.V., Livshits V.A. 1999. The novel transmembrane Escherichia coli proteins involved in the amino acid efflux // FEBS Letters. V. 452. P. 228-232.

19. Livshits V.A., Zakataeva N.P., Aleshin V.V., Troshin P.V. 1999. Study of E. coli genes involved in amino acid excretion // IX-th International Congress of Bacteriology & Applied Microbiology IUMS. Sydney, 1999. Abstract book. P. 8 5.

20. Zakalaeva N.JP., Aleshin V.V., Tokmakova I.L., Livshits V.J. 1999. A new family of efflux proteins from eubacteria and archaea. Ibid. P. 86.

21. Алешин В.В., Семёнова У. В., Тараканов Б.Б., Лившиц В.А. 20Ö0. Семейство челночных векторов для молочнокислых и других грамположительных бактерий, основанных на репликоне плазмиды pLF1311 // Микробиология. Г. 69. Jfe 1. С. 75-80.

22. Лившиц В.А., Закатаева H.H., Алешин В.В., Беларева A.B., Токмакова И.Л. 2000. Фрагмент ДНК rhtß, кодирующий синтез белка RhtB, придающего устойчивость к гомосерину бактериям Escherichia coli, и способ получения L-аминокислот. Патент РФ № 2144564.

23. Shevelev A.B., Aleoshin V.V., TrachukL.A., Granovsky A.K, Kogan Y.N., Rumer L.M., Serkina A.V., Semenova E.V., Buskueva A.M., Livshits V.A., Kostrov S.V., Scheglov A.S., Novikova S.I., Chestukhina G.G. 2000. Expression of Bacilar glutamyl endopeptidase genes in Bacillus subtiiis by a new mobiiizabie single-repiicon vector pLF // Plasmid. V 43. P. 190-199.

24. Лившиц B.A., Закатаева H.H., Алешин В.В., Беларева A.B., Токмакова И.Л. 2000. Фрагмент ДНК rhtC, кодирующий синтез белка RhtC, придающего повышенную устойчивость к L-треонину бактериям Escherichia coli, и способ получения L-аминокислот. Патент РФ № 2148642.

25. Лившиц В. А., Закатаева Н.П., Алёшин В.В. 200!. Изучение природы мутации rhtA23, которая придаёт клеткам Е. coli устойчивость к треонину и гомосерину, повышая одновременно их способность к продукции этих аминокислот // Бисмедицинские технологии. Вып. 16. С. 8-18.

26. Лившиц В.А., Закатаева Н.П., Наканишш К., Алешин В.В., Трошин П.В., Токмакова И.Л. 2001. Фрагмент ДНК из Escherichia coli, определяющий повышенную продукцию аминокислот (варианты), и способ получения L-аминокислот!/ Патент РФ №2175351.

27. livshits V.A. , Zakataeva N.P., Aleshin V.V., VitushMna M.V. 2003. Identification and characterization of the new rhtA gene involved ill threonine and homoserine efflux in Escherichia coli // Res. Microbiol. V. 154. P. 123-135.

28. Лившиц B.A., Дорошенко В.Г., Горшкова Н.В., Беларева A.B. Ивановская Л. В.,

Хургес Е.М., Гусятшер М.М., Козлов Ю.И. 2003. Малая субъедикица изозима III и изозим III синтетазы ацетогидроксикислот из Escherichia coli, фрагмент ДНК (варианты), штамм бактерии Escherichia coli - продуцент L-валина (варианты) и способ получения L-валина // Патент РФ ЛЬ 2209246.

29. Лившиц В.А., Дорошенко В.Г., Машко С.П., Ахвердян В.З., Козлов Ю.И. 2003.

Способ получешм L-аминокислот, штамм Escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) //Патент РФ №22124-47.

30. Doroshenko V.G., Livshits V.A. 2004. Structure and mode of transposition of Tn2555 carrying sucrose utilization//FEMS Microbiol Lett. V. 233.P. 353-359.

31. Лившиц В.А., Витушкина М.В., Машко С.В., Дорошенко ВТ., Бирюкова КВ., Каташкина Ж.И., Скороходова А.Ю., Беларева А.В. 2004. Способ получения L-аминокислот, штамм Escherichia coli - продуцент аминокислоты // Патент РФ №2222596.

32. Лившиц В.А., Витушкина М. В., Гусятинер М.М., Зиятдшов М.Х., Ахвердяп В.З.,

Саврасова Е.А., Дорошенко В.Г., Машко С.В. 2004. Способ получения L-аминокислот, штамм Escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты). Патент РФ № 2229513.

33. Лившиц В.А., Закатаева Н.П., Гронский С.В., Витушкина М.В., Новикова А.Е. 2004.

Способ получения пуриновых нуклеозидов и нуклеотидов, штамм-продуцент луриновых нуклеозидов. Патент РФ № 2239656.

34. Кутукова Е.А. , Закатаева Н.П., Лившиц В.А. 2005. Экспрессия генов, кодирующих белки семейства RhtB, зависит от глобального регулятора Lrp // Молекулярная Биология. Т.39. № 5. С. 374-381.

35. Kutukova ЕЛ, Livshits V.A., Altrnan IP., Ptitsyn L.R., Zyiatdinov M.H., Tokmakova I.L., Zakataeva N.P. 2005. The yeaS (leuE) gene of Escherichia coli encodes an exporter of ieucine, and the Lrp protein regulates its expression // PEBS Lett. V. 579. P.4629-4634.

4.6. Заключение

Таким образом, в процессе выполнения настоящего исследования разработаны новые методы получения штаммов-продуцентов аминокислот. Предварительные разработки касались использования мутаций по аминоацил-тРНК-сянтетазам и транслозона, несущего детерминанты усвоения сахарозы. На основе самого траиспозона или генов, обеспечивающих усвоение сахарозы, можно получать штаммы-продуценты аминокислот, усваивающие содержащие сахарозу субстраты, и заметно повысить их продуктивность.

Однако основной практический результат исследования - это создание методов получения штаммов-продуцентов аминокислот на основе использования генов, кодирующие транспортёры экскреции аминокислот. Показано, что повышенная экспрессия соответствующих генов заметно

62 увеличивает уровень накопления аминокислот в среде штаммами-продуцентами и повышает их эффективность. Поскольку транспорт аминокислот из клеток часто бывает «узким местом» при сверхсинтезе аминокислоты, его активацию целесообразно осуществлять уже на ранних этапах генетико-селекционной работы с продуцентами.

Новые методы получения штаммов-продуцентов аминокислот для промышленности на основе использования генов, кодирующие транспортёры, защищены Российскими и международными патентами. Продуценты, полученные с помощью этих методов, используются в ряде стран для получения аминокислот с помощью микробиологического синтеза.