Поиск и изучение транспортеров, осуществляющих экскрецию пуриновых соединений у штаммов Bacillus и Escherichia coli

Шеремет, Анастасия Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поиск и изучение транспортеров, осуществляющих экскрецию пуриновых соединений у штаммов Bacillus и Escherichia coli
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Поиск и изучение транспортеров, осуществляющих экскрецию пуриновых соединений у штаммов Bacillus и Escherichia coli"

На правах рукописи

4854388

ШЕРЕМЕТ АНАСТАСИЯ СЕРГЕЕВНА

ПОИСК И ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСПОРТЕРОВ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ ЭКСКРЕЦИЮ ПУРИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ У ШТАММОВ BACILLUS Ж ESCHERICHIA COLI

03.02.07-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 0E3 2011

Москва 2011

4854388

Работа выполнена в лаборатории №4 Закрытого Акционерного Общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, ЗАО «АГРИ»

Закатаева Наталия Павловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ФГУП «ГосНИИгенетика»

Цыганков Юрий Дмитриевич

доктор биологических наук, Большакова Татьяна Николаевна

ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи», Минздравсоцразвития России

Ведущая организация:

Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева

Защита диссертации состоится « ^» февраля 2011 года в /3 — на заседании Диссертационного Совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат диссертации разослан « /V» января 2011 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук

Т.Л.Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пуриновые соединения, полученные микробиологическим синтезом, широко используются в фармацевтической и пищевой промышленности. Так, соли пуриновых нуклеотидов инозинмонофосфата (ИМФ) и гуанозинмонофосфата (ГМФ) наряду с глутаматом натрия обладают высокой способностью усиливать вкус и поэтому являются важными компонентами пищевых добавок. Из-за очень высокой способности инозината и гуанозината усиливать вкус пищи добавление этих соединений к глутамату натрия позволяет использовать в четыре раза меньше такой пищевой добавки по сравнению с чистым глутаматом натрия. ИМФ и ГМФ получают как прямой ферментацией, так и путем ферментации до пуриновых нуклеозидов - инозина и гуанозина - с последующим ферментативным фосфорилированием до соответствующих мононуклеотидов (Mori et al„ 1997). Кроме того, инозин используют непосредственно для получения различных медицинских препаратов (инозин пранобекс, рибоксин), которые применяют как иммуномодуляторы, кардио- и гепатопротекторы.

Штаммы Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens обладают большим потенциалом для биотехнологического производства инозина и гуанозина (Ishii and Shiio, 1972; Matsui et al„ 1977; Zakataeva et al„ 2005). Так как производство и потребление пуриновых производных с каждым годом возрастает, дальнейшее повышение продуктивности соответствующих штаммов-продуцентов на основе Bacillus с помощью методов метаболической инженерии является актуальной задачей. Один из подходов к ее решению состоит в усилении экспрессии генов, продукты которых обеспечивают экскрецию пуринов из клеток. Увеличение внутриклеточной концентрации целевого продукта в клетках продуцентов может ингибировать активность ферментов пути его биосинтеза, репрессировать гены и опероны, кодирующие эти ферменты, а также влиять на глобальные регуляторные системы, контролирующие метаболизм клетки. Все это может негативно воздействовать на биосинтез и накопление целевого продукта. Поэтому при создании штаммов-продуцентов большое значение приобретает способность клетки активно выводить синтезируемый продукт в культуральную среду. В связи с этим поиск генов, участвующих в экскреции пуриновых нуклеозидов у бактерий, является очень важной практической задачей.

Пути синтеза пуринов de novo, усвоения и превращения пуринов (salvage путь) у Escherichia coli и В. subtilis достаточно хорошо изучены (Nygaard, 1983; Neuhard and Nygaard, 1987; Zhang et al., 2008). Имеется в литературе и информация о генах, продукты которых осуществляют транспорт пуриновых оснований и нуклеозидов в клетки. Так, у В. subtilis известно несколько транспортеров для усвоения пуринов: NupG -транспортер пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов, обладающий

широкой специфичностью, PbuG - транспортер гуанина и гипоксантина, PbuX - транспортер ксантина и NupC - транспортер аденозина и пиримидиновых нуклеозидов (Christiansen, 1997; Saxild and Nygaard, 1987). Однако о системах вывода (экскреции) пуриновых производных из клетки известно очень мало. Так, к моменту начала настоящего исследования был найден и охарактеризован только один ген, продукт которого осуществляет экскрецию пуриновых нуклеозидов - nepl (yicM) из Е. coli (Gronskiy et al., 2005). Был также описан экспортер пуриновых оснований, в частности, аденина - белок PbuE (YdhL) из В. subtilis (Johansen et al., 2003; Nygaard and Saxild, 2005). Дальнейшее изучение систем выведения пуриновых соединений из клеток бактерий позволит глубже понять метаболизм пуринов и механизмы контроля внутриклеточных пулов этих важнейших для клетки соединений.

Исходя из вышеизложенного следует, что поиск и изучение генов, продукты которых вовлечены в экскрецию пуриновых соединений у бактерий, представляется актуальной задачей не только с практической, но и с научной точки зрения.

Цель и задачи работы. Работа посвящена поиску и изучению генов, участвующих в экскреции пуриновых производных из клеток Bacillus и Е. coli, а также изучению влияния повышенной экспрессии этих генов на продуктивность соответствующих штаммов-продуцентов. В процессе работы решались следующие задачи:

1. провести поиск генов, участвующих в экскреции пуриновых нуклеозидов у Bacillus;

2. клонировать ген pbuE из В. amy/oliquefaciens и изучить регуляцию его экспрессии в клетках Е. coli, определить субстратную специфичность экспортера PbuE;

3. на примере штаммов-продуцентов показать эффект повышенной экспрессии pbuE на продукцию инозина, гуанозина и аминоимидазолкарбоксамид рибонуклеозида (AICAr);

4. изучить возможность функционирования экскреторных белков из грамположительных бактерий в грамотрицательных и наоборот;

5. провести поиск новых генов, которые могут принимать участие в экскреции пуриновых соединений у Е. coli, фенотипически охарактеризовать их и изучить некоторые аспекты их регуляции.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе клонирован и изучен ген pbuE из В. amyloliquefaciens, исследована регуляция его экспрессии под собственными регуляторными элементами в Е. coli. Для его продукта, белка PbuE, ранее охарактеризованного как экспортер пуриновых оснований, в частности, аденина, показана новая функция: экскреция пуриновых нуклеозидов аденозина, инозина и гуанозина, а также AICAr. Установлено, что мембранные белки экскреции PbuE и его гомолог из Е. coli Nepl способны функционировать как в

грамположительных, так и грамотрицательных бактериях. Практическая значимость исследования продемонстрирована на примере увеличения продукции пуриновых рибонуклеозидов штаммами-продуцентами В. amyloliquefaciens и Е. coli. Путем создания библиотеки генов на фазмиде Mu d5005 с последующей селекцией вставок по устойчивости к ингибирующим концентрациям инозина и гуанозина осуществлен поиск транспортеров пуриновых производных у Е. coli. Найден ген yidY, продукт которого обладает низкой специфичностью к пуриновым нуклеозидам. Показано, что гены rhtA, leuE (yeaS), ydeD и ygaZH, известные как гены, кодирующие транспортеры экскреции аминокислот, усиливают при повышенной экспрессии экскрецию пуриновых соединений. Показана зависимость экспрессии генов /еиЕ и ygaZH от метаболизма пуринов, а именно от аллельного состояния генов purR и deoD, а также зависимость экспрессии leuE от наличия в среде культивирования пуриновых нуклеозидов и аналогов пуринов в качестве индукторов.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 2 печатные работы в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 сообщение в материалах Международной научной конференции (Лиссабон, Португалия, декабрь 2009 г.). Материалы диссертации дважды докладывались автором на конкурсе молодых ученых НИИ Аджиномото-Генетика (июнь 2007 г., июнь 2009 г.), а также были представлены на III Международной конференции по микробиологии окружающей среды, промышленной и прикладной микробиологии BioMicroWorld2009 (Лиссабон, Португалия, декабрь 2009 г.).

Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре НТС НИИ Аджиномото-Генетика и секции «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 20 декабря 2010 года.

Стуктура и объем работы. Диссертация состоит из 7 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на страницах, включая рисунка и таблиц. Список цитируемой литературы содержит ^Wисточника, в том числе О. на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Поиск и изучение генов, участвующих в экскреции пуриновых

нуклеозидов у Bacillus 1.1. Клонирование генов В. subtilts, продукты которых гомологичны

белку NepI из Е. coli

Ранее было показано, что ген nepl из £ coli кодирует мембранный белок, который экскретирует пуриновые нуклеозиды из клеток (Gronskiy et al., 2005). Усиление экспрессии этого гена обеспечивало устойчивость к ингибирующим концентрациям нуклеозидов и аналогов пуринов за счет их активного выведения из клеток. Nepl принадлежит к большому суперсемейству транспортных белков MFS, а также входит в кластер ортологичных групп (COG) №2814, представители которого осуществляют транспорт различных соединений. У В. subtilis было найдено 6 белков, принадлежащих к этому кластеру. Их кодируют гены ydhL (pbuE), ybcL, ytbD, yfhl, yvifA и усе J. С целью поиска генов, участвующих в экскреции нуклеозидов у Bacillus, эти гомологичные nepl гены были клонированы под собственными регуляторными элементами и изучена их способность при амплификации сообщать клеткам устойчивость к пуриновым нуклеозидам и их аналогам. Было установлено, что только один из клонированных генов, pbuEßs, обладал такими свойствами. Плазмида pYDHLl, содержащая pbuEes, обеспечивала клеткам штамма Е. coli устойчивость к повышенным концентрациям пуриновых нуклеозидов, а также аналогам пуринов - 6-меркаптопурину и 2,6-диаминопурину.

Продукт гена pbuEBs - PbuE - это мембранный белок с 12 трансмембранными сегментами, описанный в литературе как транспортер пуриновых оснований аденина и гипоксантина из клеток (Johansen et al, 2003; Nygaard and Saxild, 2005). Регуляция экспрессии гена pbuEßs осуществляется по механизму аденин-зависимого рибопереключателя, который напрямую без белковых посредников регулирует транскрипцию гена (Johansen et al:, 2003; Nygaard and Saxild, 2005). В 5'-нетранслируемой области гена расположена консервативная последовательность (А-бокс), которая образует вторичную структуру мРНК, обеспечивающую преждевременную терминацию транскрипции. В присутствии аденина, а также его аналога 2,6-диаминопурина происходит нарушение формирования терминатора и обеспечивается сквозная транскрипция гена pbuE. В A-боксе была описана замена нуклеотида Т на С (Т—>С), повышающая экспрессию pbuEns даже в отсутствии аденина за счет нарушения образования терминаторной шпильки (Mandai and Breaker, 2004).

Вывод об участии продукта гена pbuEns в экскреции пуриновых оснований был сделан авторами на основе косвенных данных, а именно индукции экспрессии pbuE^s пуриновым основанием аденином, а также снижении внутриклеточных пулов пуриновых оснований при увеличении экспрессии гена (Johansen et al., 2003; Nygaard and Saxild, 2005). Целью

нашей работы было показать напрямую увеличение экскреции пуриновых оснований при сверхпродукции белка PbuE, а также выявить, являются ли другие пуриновые соединения, в частности, нуклеозиды, субстратами для этой помпы.

1.2. Клонирование гена pbuE из В. amyloliquefaclcns

Поскольку кроме В. subtilis важными продуцентами пуриновых нуклеозидов являются штаммы, полученные на основе В. amyloliquefaciens, мы клонировали и изучили ген pbuE из этого микроорганизма ipbuEHA). К моменту начала нашего исследования нуклеотидная последовательность хромосомы В. amyloliquefaciens не была опубликована, поэтому клонирование гена pbuEBA осуществляли с помощью техники «shot-gun». Хромосому штамма В. amyloliquefaciens IAM1523 обрабатывали ферментами £coRI, Sail или Pstl, и полученные фрагменты клонировали в малокопийный вектор pMW118. Для селекции плазмид со вставками использовали минимальную среду М9 с глюкозой (4 мг мл"1) и ампициллином (100 мкг мл'1), содержащую 6-меркаптопурин (400 мкг мл"1) и/или 2,6-диаминопурин (400 мкг мл"1). В результате было отобрано несколько рекомбинантных плазмид, содержащих EcoRI-EcoRI-фрагмснты ДНК размером 1,5 т.п.н.

Секвенирование вставок и анализ предсказанной аминокислотной последовательности открытой рамки считывания, содержащейся на этих вставках, а также сравнение этой последовательности ■-, с последовательностью белка PbuE из В. subtilis показал, что эти белки имеют 86% идентичных аминокислотных остатков. Таким образом, отобранные вставки содержат ген рЬиЕцд. Плазмида pYDHL2 с клонированным геном рЬиЕвл также, как и плазмида pYDHLl, содержащая pbuEf& сообщают клеткам штамма Е. coli GS72 (TGI AdeoD gsk-З) устойчивость к пуриновым нуклеозидам (таблица 1).

Таблица 1. Влияние повышенной экспрессии гена pbuE из Bacillus на устойчивость штамма Е. coli GS72 к пуриновым нуклеозидам.

Штамм Экспрессия pbuE МИК (мкг мл"')"

Инозин Гуанозин Аденозин

GS72* (pMWl 18) - 400 7,5 500

GS72 (pYDHLl) pbuEfts >30000 10 >4000

GS72 (pYDHL2) рЬиЕвл >30000 15 >4000

GS72 (pYDHL5) рЬиЕт^с >30000 25 >4000

TGI hdeoDgsk-3

Минимальная ингибирующая концентрация

Внесенная с помощью сайт-направленного мутагенеза в регуляторную область рЬиЕВА замена Т—>С, усиливающая экспрессию гена, приводит к дальнейшему повышению устойчивости штамма к нуклеозидам

и, в частности, к гуанозину (таблица 1, плазмида pYDHLS). Эти данные указывают на то, что регуляция экспрессии генаpbuE по механизму аденин-зависимого рибопереключателя, описанная в литературе, может сохраняться и в клетках Е. coli. Повышенная устойчивость к нуклеозидам и аналогам пуринов, которую придает клеткам штаммов Е. coli экспрессия генов рЬиЕвл и pbuEBможет быть результатом усиленного выброса этих соединений из клеток Е. coli.

1.3. Изучение регуляции гена рЬиЕцл в Е. coli

Сравнение нуклеотидных последовательностей генов рЬыЕВл и pbuEBS показало, что в 5'-нетранслируемой области рЪиЕ из В. amyloliquefaciens по сравнению с pbuE из В. subtilis имеются замены. Однако, последовательности А-бокса, который участвует в образовании структуры, обеспечивающей регуляцию гена по механизму аденин-зависимого рибопереключателя, практически идентичны. Это позволяет предположить для гена pbuE из В. amyloliquefaciens аналогичную регуляцию.

Для изучения регуляции экспрессии рЬиЕвл в Е. coli на малокопийном векторе pMWF были получены трансляционные слияния генаpbuEBA дикого типа (pbuEßA-lacZ, плазмида pMWFl), а также содержащего мутацию Т-^С в регуляторной области (pbuET^c-lacZ, плазмида pMWF2) с геном lacZ. Полученными плазмидами трансформировали штамм Е. coli GS262 (МС4100 AdeoD Aadd) и по активности ß-галактозидазы оценивали экспрессию рЬиЕвл и pbiiEj-c в присутствии пуриновых оснований и нуклеозидов. Так как в штамме GS262 отсутствуют ферменты пуриннуклеозидфосфорилаза (AdeoD) и аденозиндезаминаза (Aadd), у него нарушено превращение нуклеозидов в основания, а также аденозина в инозин, что позволяет изучать влияние на экспрессию именно добавленных нуклеозидов, а не продуктов их метаболизма.

Рисунок 1. Влияние пуриновых производных и мутации Т^С на экспрессию pbuEßA-lacZ в клетках Е. coli. Активность ß-гапактозидазы в штамме GS262 (pMWFl) (белые столбцы) и GS262 (pMWF2) (черные столбцы) после выращивания в минимальной среде с глюкозой без добавления пуринов (М9), с добавлением аденина (Ade), гуанина (Gua), гипоксантина (Нх), аденозина (AR), гуанозина (GR) и инозина (HxR).

Как видно из рисунка 1, уровень экспрессии pbuEBA повышается в присутствии аденина и не меняется при добавлении остальных нуклеозидов и оснований. Введенная в А-бокс мутация Т—>С заметно повышает уровень экспрессии рЬиЕвл даже в отсутствии аденина.

Таким образом, было показано, что экспрессия гена pbuE под контролем собственных регуляторных элементов в Е. coli сохраняет основные характеристики аденин-зависимого рибопереключателя: активируется аденином и усиливается при введении мутации Т—>С.

1.4. Поиск предпочтительных субстратов для экспортера PbuE

С целью выявления наиболее предпочтительных субстратов для экспортера PbuE определяли скорость роста пуринового ауксотрофа на различных пуриновых основаниях и нуклеозидах как источниках пуринов. Можно предположить, что усиленная экскреция того или иного пуринового производного будет приводить к замедлению роста штамма на этом соединении.

Для эксперимента был выбран штамм Е. coli В1215, так как он является пуриновым ауксотрофом вследствие делеции в гене purD, не способен разрушать пуриновые нуклеозиды до оснований из-за делеции в гене deoD и благодаря мутации gsk-11 растет даже на низких концентрациях нуклеозида как источнике пуринов по причине более эффективного превращения гуанозина и инозина в ГМФ и ИМФ, соответственно. Штамм В1215 трансформировали вектором pMW118 в качестве контроля и плазмидой pYDHL2, содержащей клонированный под собственными регуляторными элементами ген pbuEBA. Полученные трансформанты В1215 (pMWl 18) и В1215 (pYDHL2) выращивали в жидкой минимальной среде с глюкозой и добавлением различных пуринов и определяли время удвоения

.ffc Ф

Рисунок 2. Влияние повышенной экспрессии рЬиЕцл на скорость роста пуринового ауксотрофа Е. coli. Время удвоения оптической плотности для В1215 (pMWI 18) (белые столбцы) и В1215 (pYDHL2) (черные столбцы) на минимальной среде с глюкозой с добавлением различных нуклеозидов и оснований в качестве источника пуринов: инозина (HxR), аденозина (AR), гуанозина (GR), гипоксантина (Нх), аденина (Ade) и гуанина (Gua).

Штамм с повышенной экспрессией pbuEBA обнаруживал значительное замедление скорости роста при низких концентрациях инозина и аденозина, что может свидетельствовать об усилении экскреции этих пуриновых нуклеозидов из клетки при повышенной продукции белка PbuE. Отсутствие замедления скорости роста штамма с повышенной экспрессией рЬиЕвл на среде с гуанозином можно объяснить эффективным превращением этого нуклеозида в ГМФ мутантной гуанозинкиназой (мутация gsk-11) или более

оптической плотности культуры (рис. 2).

■ I

HxR AR GR Hx Ade Gua

низкой специфичностью помпы PbuE к этому нуклеозиду. Хотя PbuE описан в литературе как экспортер оснований, в данном эксперименте экспрессия рЬиЕвл практически не влияла на скорость роста штамма на аденине, гипоксантине и гуанине. Можно предположить, что пуриновые основания эффективнее усваиваются клетками Е. coli, чем экскретируются этим транспортером во внешнюю среду. Полученные результаты свидетельствует о том, что функция PbuE может распространяться на пуриновые нуклеозиды.

1.5. Изучение влияния повышенной экспрессии рЬиЕвл на экзогенное

накопление инозина штаммами Е. coli

Ранее в нашей лаборатории было показано, что повышенная экспрессия nepl в штамме Е. coli TGldeoD, не способном превращать нуклеозиды в основания, приводит к выбросу из клетки и накоплению в культуральной среде инозина (Gronskiy et al, 2005). Влияние различного уровня экспресии гена рЬиЕвл на накопление пуриновых нуклеозидов и оснований было изучено в клетках Е. coli TGI и TGldeoD.

Таблица 2. Влияние повышенной экспрессии рЬиЕвл на экзогенное накопление гипоксантина и инозина клетками Е. coli.

Штамм Экспрессия pbuE Накопление пуринов, мг л"'

Гипоксантин Инозин

TGI (pMWl 18) - 8,0±1,4 <0,5

TGI (pYDHL2) рЬиЕвл 7,0±2,8 <0,5

TGI (pYDHL5) рЬиЕт-^с 5,0±2,8 <0,5

TGldeoD (pMWl 18) - <0,5 <2,0

TGldeoD (pYDHL2) рЬиЕвл <0,5 14,0±1,4

TGldeoD (pYDHL5) pbuET-.c <0,5 27,0±4,0

Из данных, представленных в таблице 2, видно, что штамм TG1 накапливает гипоксантин, и экспрессия рЬиЕвл не увеличивает накопление этого основания. В штамме TGldeoD с нарушенным превращением нуклеозидов в основания наличие продукта генарЬиЕцА, белка PbuE (штамм с плазмидой pYDHL2), приводит к значительному накоплению инозина в культуральной среде. При этом увеличение экспрессии гена, а значит и синтеза PbuE в штамме TGldeoD (pYDHL5), приводит к почти двукратному увеличению накопления инозина по сравнению со штаммом, содержащим амплифицированный ген дикого типа. Эти данные показывают, что PbuE осуществляет функцию, аналогичную функции Nepl, т.е. экскретирует инозин в культуральную жидкость. Отсутствие эффекта амплификации рЬиЕвл на экскрецию гипоксантина в штамме TG1 может говорить о более низком по сравнению с пуриновыми нуклеозидами сродстве экспортера PbuE к основаниям.

1.6. Изучение влияния экспрессии рЪиЕвл на накопление инозина и

гипоксантина штаммами-продуцентами Е. coli

Для изучения влияния экспрессии рЬиЕвл на накопление инозина и гипоксантина штаммами с усиленным биосинтезом пуринов использовали штаммы Е. colt продуцент инозина FADRadd (pMWKQ) и продуцент гипоксантина GS192 (pMWKQ). Плазмида pMWKQ содержит ген purFKQ, кодирующий нечувствительную к ретроингибированию фосфорибозил-пирофосфат (ФРПФ) амидотрансферазу - ключевой фермент пути биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo. Благодаря этой плазмиде, а также ряду дополнительных мутаций {purA, purR, add), обеспечивается повышенное внуриклеточное накопление и сверхпродукция пуринов этими штаммами. Штаммы FADRadd (pMWKQ) и GS192 (pMWKQ) трансформировали плазмидами pYDHL2 и pYDHL5, содержащими, соответственно,и pbuEi^c, а также вектором pMW118 в качестве контроля. С полученными трансформантами проводили ферментацию в пробирках в среде с глюкозой в качестве источника углерода и затем определяли накопление инозина и гипоксантина в среде культивирования.

5 о

0 т

1 Е

■ И

FADRadd FADRadd FADRadd (pMWKQ, (pMWKQ, (pMWKQ, pMW118) pYOHL2) pYDHLS)

GS192 GS1S2 GS192

(pMWKQ, (pMWKQ, (pMWKQ, PMW118) pYDHL2) pYDHLS)

Рисунок 3. Влияние повышенной экспрессии рЬиЕвл на уровень накопления инозина (А) и гипоксантина (Б) соответствующим штаммом-продуцентом. Накопление пуриновых оснований и нуклеозидов в культуральной жидкости относили к оптической плотности культуры при 600 нм (ООбоо).

Как видно из рисунка ЗА, при амплификации pbuEBA накопление инозина штаммом FADRadd (pMWKQ) увеличивается на 40%. Дальнейшее увеличение экспрессии гена за счет мутации Т—>С (амплификация гена рЬиЕт^с) приводит к двукратному возрастанию продукции инозина. Ферментация со штаммами-продуцентами гипоксантина (рис. ЗБ) показала, что амплификация генов рЬиЕвл и pbuET^c привела к увеличению накопления гипоксантина на 64%. Эти данные свидетельствуют о том, что PbuE из Bacillus функционирует в Е. coli как экспортер пуриновых нуклеозидов и оснований.

1.7. Изучение влияния повышенной экспрессии pbuEßA на накопление инозина и гуанозина штаммом-продуцентом В. amyloliquefaciens Изучение влияния экспрессии рЪиЕвл на накопление инозина и гуанозина у Bacillus проводили в штамме В. amyloliquefaciens AJ1991. Этот штамм является ауксотрофом по аденину и изолейцину, содержит мутацию устойчивости к 8-азагуанозину и обладает благодаря этим мутациям способностью к одновременному накаплению инозина и гуанозина в культуральной среде. Были получены производные этого штамма с различными аллельными вариантами гена рЬиЕвл, а именно: с делецией гена на хромосоме и амплификацией аллелей рЬиЕвл (плазмида pYDHL4) и pbuEj-^c (плазмида pYDHL6) на малокопийном челночном векторе pMWMXl.

Инактивация гена рЬиЕвл на хромосоме штамма AJ1991 привела к значительному снижению накопления инозина и гуанозина, что, очевидно, свидетельствует о том, что PbuE является одним из основных транспортеров этих соединений у Bacillus (рис. 4). Амплификация гена, напротив, приводит к увеличению накопления инозина. Особенно сильно этот эффект проявляется при введении плазмиды pYDHLö, обеспечивающей наибольшую экспрессию гена рЬиЕвл- Умеренный эффект на продукцию инозина амплификации гена дикого типа, по-видимому, объясняется низкой копийностью плазмиды pMWMXl. Отсутствие эффекта амплификации рЬиЕ$ц на накопление гуанозина можно объяснить снижением образования ГМФ из ИМФ из-за превращения ИМФ в эффективно экскретируемый инозин.

Рисунок 4. Влияние повышенной экспрессии рЬиЕвл на степень экзогенного накопления инозина и гуанозина продуцентом

нуклеозидов В. amyloliquefaciens AJ1991. Белые столбцы накопление инозина, черные столбцы - накопление гуанозина. Накопление пуриновых оснований и нуклеозидов отнесено к оптической плотности клеток при 600 нм (OD«ki).

Эти результаты показывают, что PbuE является одним из основных транспортеров, участвующих в экскреции пуриновых нуклеозидов у Bacillus. Повышенная экспрессия гена pbuE может быть использована при получении промышленных штаммов-продуцентов пуриновых нуклеозидов.

AJ1991 AJ1991 AJ1991 AJ1991 (pMWMXl) pbuE::cat (pYDHL4) (pYDHL6) (pMWMXl)

1.8. Конструирование бесплазмидного штамма-продуцента с повышенной экпрессией рЬиЕ. Гетерологичная экспрессия пер1 в штамме В. атуЫ'щие/ааепз

Из-за существующих законодательных ограничений нельзя использовать штаммы, содержащие плазмиды и антибиотические маркеры, для промышленного производства пищевых добавок. Для того чтобы получить бесплазмидные штаммы с повышенной экспрессией рЬиЕВА, в регуляторную область гена на хромосоме В. атуЫ'щие/ааеги была введена точечная замена Т—>С. Введение мутации осуществляли с помощью термочувствительной по репликации плазмиды рЖТ1-рЬиЕТс и метода двустадийной гомологичной рекомбинации с замещением аллелей. Для определения экзогенного накопления пуриновых нуклеозидов с полученным штаммом АЛ991рЬиЕт_с проводили ферментацию в пробирках. Из данных, представленных на рисунке 5, видно, что введение точечной мутации в регуляторную область рЬиЕвл привело к существенному увеличению накопления инозина.

Рисунок 5. Влияние повышенной экспрессии гена рЬиЕ и гетерологичной экспрессии пер! на экзогенное накопление инозина и гуанозина штаммом-продуцентом АЛ 991. Накопление пуриновых нуклеозидов в культуральной среде отнесено к оптической плотности, измеренной при длине волны 562 нм (005б2).

Как следует из приведенных в предыдущих разделах данных, экспортер РЬиЕ из В. amyloliquefaciens сохраняет свои функции ив Е. coli. С целью исследования возможности экспортера Nepl из Е. coli функционировать в грамположительном микроорганизме В. amyloliquefaciens ген nepl был клонирован под промотором пуринового оперона бацилл Рриг, и полученная конструкция была, интегрирована в ген аргЕ хромосомы штамма AJ1991 с помощью термочувствительной по рекомбинации плазмиды pNPZTl-aprE-Ppur-nepI и метода двухстадийной гомологичной рекомбинации с замещением аллелей.

Результаты ферментации в пробирках показали, что гетерогенная экспрессия nepl под промотором Рриг приводит к увеличению продукции инозина штаммом AJ1991Ppur-nepI более чем в 2 раза по сравнению с контрольным штаммом. Это свидетельствует о функционировании Nepl в грамположительных бактериях (рис. 5).

450 400

О 300

С 250 2

1т 200

AJ19S1 AJ1S31pbuEM AJ13S1Ppur-nepl

Таким образом, было показано, что белки-транспортеры PbuE и Nepl способны осуществлять свои функции в неродственных микроорганизмах, что является важным аспектом для их применения в биотехнологии.

1.9. Влияние экспрессии PbuE и Nepl на продукцию AICAr

Инозин и гуанозин являются сырьем для получения ИМФ и ГМФ, используемых в пищевой промышленности. Кроме того, инозин непосредственно применяется для производства различных медицинских препаратов. Еще один пуриновый нуклеозид AICAr, который также используется в медицине, в настоящее время получают методом химического синтеза. Конструирование штаммов-продуцентов AICAr с использованием методов метаболической инженерии позволило бы получать это соединение биотехнологическим путем. В этой связи идентификация и амплификация генов, участвующих в экскреции AICAr, представляется актуальной задачей.

С целью изучения возможности PbuE и Nepl экскретировать AICAr был сконструирован штамм-продуцент этого рибонуклеозида путем внесения делеции в ген ригН (рис. 6).

Рисунок 6. Упрощенная схема путей биосинтеза нуклеозидов у Bacillus. AICAR - 5-аминоимидазол-4-карбоксамид (AICA) рибонуклеотид, AICAr - AICA рибо-нуклеозид, FAICAR - 5-формамидо-имидазол-4-карбоксамид риботид, HxR -инозин, GR -, гуанозин.

Полученный штамм AJ1991ApurH накапливает более 5 г л"1 AICAr (таблица 3). Введение в хромосому этого штамма мутации, усиливающей экспрессию гена рЬиЕвл, привело к увеличению экзогенного накопления AICAr на 20% (таблица 3, штамм AJ1991ApurHpbuET-c)- Этот результат показывает, что субстратная специфичность PbuE также распространяется и на AICAr, поэтому повышенная экспрессия pbuE может использоваться для создания соответствующих штаммов-продуцентов.

Таблица 3. Влияние повышенной экспрессии гена pbuE и гетерологичной экспрессии nepl на накопление AICAr.

Штамм OD562 AICAr, г л"'

AJ1991 23,6 <0,01

AJ1991ApurH 26,0 5,5±0,4 .

AJ1991 ApurHpbuEr^c 25,5 6,6±0,4

AJl99lÄpurHPpur-nepI 24,1 4,8±0,3

АМР

vo (рйн) (ршн) I -> AICAR4*"-» FAICAR^-*1МР—>-GMP

I I I

AICAr

HxR

In |

pbuE ptiuE pbuEl

Out 1

AICAr

HxR

Однако, гетерологичная экспрессия гена nepl из Е. coli не привела в штамме AJ1991ApurH к увеличению продукции AICAr (таблица 3, штамм АЛ991ДригНРриг-пер1). Таким образом, несмотря на гомологию между PbuE и Nepl и их широкую субстратную специфичность, экскретируемые этими транспортерами соединения различны.

2. Поиск Ii изучение новых генов, продукты которых обеспечивают

экскрецию пурииовых производных у Е. coli 2.1. Поиск и идентификация генов, сообщающих при амплификации устойчивость к ингибирующим концентрациям инозина и гуанозина

Как уже упоминалось, ранее в нашей лаборатории был найден и охарактеризован транспортер пуриновых рибонуклеозидов у Е. coli Nepl. С целью поиска дополнительных генов, кодирующих белки экскреции пуриновых нуклеозидов у Е. coli, путем клонирования in vivo с использованием фазмиды Mu d5005 была получена библиотека генов. Селекцию вставок осуществляли в специально сконструированном чувствительном к пуриновым нуклеозидам штамме GS72 (TGI AdeoD gsk-3) на минимальной среде с добавлением 500 мкг мл"1 инозина или 10 мкг мл"1 гуанозина. Штамм GS72 содержит нечувствительную к ретроингибированию гуанозинкиназу (gsk-3). Поэтому при добавлении в среду выращивания гуанозина и других пуриновых нуклеозидов в клетках резко увеличивается пул АДФ, что приводит к ингибированию фермента ФРПФ-синтетазы, снижению пула ФРПФ и голоданию клеток по целому ряду важнейших метаболитов, таких как аминокислоты, пуриновые, пиримидиновые и пиридиновые нуклеотиды. Мы предположили, что амплификация генов, продукты которых обеспечивают активное выведение пуриновых нуклеозидов из клеток, должна снимать ингибирующий эффект этих соединений на рост штамма GS72.

В результате клонирования на минимальной среде с инозином и гуанозином было отобрано 38 фазмид с различными вставками. Так как продукт гена deoD разрушает нуклеозиды до оснований, продукт гена атп снижает внутриклеточное накопление АДФ, а продукт гена nepl осуществляет выброс нуклеозидов из клеток, можно предположить, что амплификация этих генов будет снимать ингибирующий эффект нуклеозидов в штамме GS72. Действительно, анализ отобранных вставок с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) показал, что 25 из них содержат названные гены. Эти фазмиды были исключены из рассмотрения. Вставки, содержащиеся на оставшихся 13 фазмидах были секвенированы, и гены, находящиеся на этих фрагментах ДНК, были идентифицированы по полученным последовательностям с помощью выравнивания их с известными последовательностями базы данных GenBank (таблица 4).

В первую очередь нас интересовали вставки, которые содержали открытые рамки считывания (ORF), предположительно кодирующие мембранные белки. Фазмид с такими вставками оказалось большинство.

Наибольшую устойчивость клеткам Е. coli сообщали фазмиды Mu_l, Ми_15 и Ми_37 (таблица 4). Путем минимизации вставок, содержащихся на фазмидах Ми_15 и Ми_37 мы установили, что входящие в их состав гены, кодирующие мембранные белки, не обеспечивают устойчивость к инозину и гуанозину. Очевидно, этот фенотип сообщает амплификация генов, продукты которых являются цитоплазматическими белками.

Таблица 4. Гены, содержащиеся на фрагментах ДНК, клонированных из Е. coli с помощью селекции по устойчивости к пуриновым нуклеозидам.

Фазмиды Гены* МИК, мкг мл"1

Гуанозин Инозин

Ми_1 thdFtnaL tnaA tnaB yidYyidZyieFyieG 15 1000

Ми_8 yjiC yjiD yjiE iadA frwC yjiH yjil yjU frwB yjiL yjiM pflDyjiO 10 500

Ми_9 wzc wzb wzayegH asmA dcd udk уegE alkA yegD yegl Ь2071 Ь2072 b2073 mdtA mdlB mdtC 10 500

Ми_12 ybaX ybaE cof ybaO mdlA glnK ami В tesB ybaY ybaZ 10 500

Ми_13 yidJ yidK yidL glvG glvC 10 500

Ми_15 b2792 syd yqcD ygdH sdaC sdaB exo fucO fucA fucP fucP fucK fuel1 fucR ygdE ygdD gcvA Ъ2809 b2810ygdK 50 1000

Ми_16 b2299yfcE yfcF yfcG folX 10 500

Ми_22 dmsA dmsC ycaC ycaD ycaM ycaN ycaK pflA pflB focA ycaO ycaP serC aroA ycaL cmk rpsA himD ycal msbA ycaHycaO 10 500

Ми_23 atoD atoA atoE atoB Ь2225 Ь2226 yfaSR Ь2229 yfaA gyrA ubiGyfaL 10 500

Ми_25 и>гс wzb wzayegH asmA dcd udk у egE alkA yegD yegl Ь207! Ь2072 Ь2073 mdtA mdtB mdtC mdtD baeS 10 500

Ми_35 relE relB Ы565 flxA Ы567 Ы568 dicC dicA yd/A ydfB ydfC dicF dicB ydfD ydfE Ы 578 10 500

Ми_37 radC dfp dut ttk pyrE rph yicC dinD yicG yicF gmk rpoZ spoTspoil recG gltSyicEyicHyic/yicJ seIC selCyicL nlpA 50 1000

Ми_38 Ы555 essQ cspB cspF Ы559 Ы560 rem relF relE relB Ы565 flxA Ы567 Ы568 dicA yd/A yd/Byd/C dicFdicC dicByd/DydJE Ы578 Ы579 10 500

*ORF, кодирующие белки с трансмембранными сегментами, отмечены жирным шрифтом

Минимизация вставки фазмиды Ми_1 показала, что устойчивость к инозину и гуанозину обеспечивается геном yidY. Продукт этого гена, YidY, описан как белок, обеспечивающий множественную лекарственную устойчивость (Nishino and Yamaguchi, 2001). Фенотипические исследования

показали, что устойчивость клеток к инозину и гуанозину, а также небольшой положительный эффект на продукцию инозина проявляется только при очень высокой экспрессии гена yidY. По-видимому, YidY обладает очень низким сродством к этим соединениям.

Таким образом, с помощью селекции на инозине и гуанозине кроме ранее охарактеризованного экспортера NepI нам не удалось идентифицировать другие, высоко специфичные к нуклеозидам транспортеры .

2.2. Поиск и изучение генов, сообщающих при амплификации

устойчивость к аналогам пурннов

Ранее у Е. coli были идентифицированы гены, продукты которых участвуют в экскреции аминокислот (Livshits et al., 2003; Zakataeva et al., 1999; Dassler et al, 2000; Kutukova et al., 2005; Tabolina et al., 2005; Park et al., 2007). Было обнаружено, что некоторые из этих генов {rhtA, ygaZH, leuE, ydeD) при амплификации на плазмиде сообщают устойчивость к аналогу пуринов 8-азааденину.

Для более детального изучения этого фенотипа перечисленные гены амплифицировали на хромосоме штамма Е. coli GS72. С этой целью гены leuE и ydeD помещали под контроль конститутивного промотора PnlpDg, гены оперона ygaZH, продукты которого YgaZ и YgaH совместно осуществляют экскрецию разветвленных аминокислот, - под контроль фагового промотора Р/, а повышенная на порядок экспрессия гена rhtA достигалась введением точечной мутации rhtA23 в его регуляторную область. Было показано, что усиленная экспрессия этих генов приводит к повышению устойчивости к ряду аналогов пуриновых оснований, а генов leuE и ygaZH - также и к гуанозину (таблица 5).

Таблица 5. Влияние амплификации генов rhtA, leuE, ygaZH и ydeD на устойчивость к пуриновым нуклеозидам и аналогам пуриновых оснований.

М9 с добавлением Рост штамма GS72

пурииовых производных, Повышенная экспрессия гена

мкг мл 1 Нет rhtA leuE ygaZH ydeD

Гуанозин, 20 - - + + -

Инозин, 300 - - - - -

Аденозин, 300 - - - - -

Пурин, 80 - - - + -

8-Азааденин, 150 - + + + +

2,6-Диаминопурин, 200 - + - + +

6-Меркаптопурин, 150 - + - + -

6-Тиогуанин, 300 - + + +

«+» - хороший рост клеток,«-» - отсутствие роста

Влияние повышенной экспрессии генов rhtA, leuE, ygaZH и ydeD, кодирующих экспортеры аминокислот, на экскрецию пуриновых нуклеозидов было изучено в штамме-продуценте инозина FADRadd (pMWKQamp).

Как видно из таблицы 6, повышенная экспрессия ygaZH привела к увеличению накопления гуанозина и гипоксантина в культуральной среде, а повышенная экспрессия генов ydeD, leuE и rhtA - к увеличению накопления инозина. Эти данные могут свидетельстовать о том, что белки-транспортеры RhtA, LeuE, YgaZ, YgaH и YdeD способны к экскреции не только различных аминокислот, но и пуриновых нуклеозидов и оснований. По своей широкой специфичности они напоминает белки множественной лекарственной устойчивости (MDR), которые осуществляют выброс из клетки целого ряда структурно несхожих антибиотиков и токсичных соединений (Zgurskaya et al„ 2009). Физиологическая роль белков множественной лекарственной устойчивости до конца не понятна и продолжает изучаться. Недавно для клеток дрожжей было показано, что белки семейства MDR, выполняя важную функцию в клеточном метаболизме, детоксикации клеток, а также в отклике клеток на стрессовое состояние организма, способны продлевать клеткам жизнь, а их отсутствие, напротив, приводит к преждевременному старению клеток (Eldakak et al, 2010). Можно предположить похожую функцию и для белков RhtA, LeuE, YgaZ, YgaH и YdeD, которые, очевидно, поддерживают необходимые, нетоксичные для клеток пулы аминокислот, пуринов и их производных, а также, возможно, участвуют в коммуникации бактерий, обеспечивая так называемое чувство кворума (quorum sensing) и выживание клеточной популяции.

Таблица 6. Влияние повышенной экспрессии генов ygaZH, ydeD, yeaS и rhtA на накопление инозина, гуанозина и гипоксантина штаммом-продуцентом Е. coli FADRadd (pMWKQamp).

Штамм Накопление в культуральной среде, г л"1

Инозин Гуанозин Гипоксантин

FADRadd* (pMWKQamp) 1,10±0,04 <0,02 0,29±0,03

FADRadd ?\-ygaZH (pMWKQamp) 0,93±0,06 0,05±0,01 0,36±0,02

FADRadd PnlpD»-ydeD (pMWKQamp) 1,33±0,06 <0,02 0,24±0,03

FADRadd PnIpD8->'£>a.S- (pMWKQamp) 1,40±0,0б <0,02 0,23±0,01

FADRadd rhtA23 (pMWKQamp) 1,50±0,01 <0,02 0,16±0,01

♦FADRadd (purFpurA purR deoD add)

3. Изучение регуляции экспрессии генов 1еиЕ \iygaZH

Известно, что экспрессия гена 1еиЕ и оперона ygaZH регулируется глобальным регулятором аминокислотного обмена - белком Lrp (КиШкоуа

et al, 2005; Park et al., 2007). Поскольку продукты этих генов участвуют в экскреции не только аминокислот, но и пуриновых соединений, можно предположить, что их экспрессия также зависит от белков, участвующих в регуляции метаболизма пуринов.

3.1. Анализ регуляторной области генов leuE и ygaZ на наличие сайтов связывания с белком PurR

С помощью компьютерных программ MEME и TOMTOM (http://merne.sdsc.edu) и соответствующей матрицы из базы данных DPInteract (http://arep.med.harvard.edu/dpinteract/, рис. 7) 5'-нетрансли-руемые области генов leuE и ygaZ были проанализированы на наличие возможных сайтов связывания с глобальным регулятором пуринового метаболизма белком PurR. В регуляторных областях обоих генов были обнаружены близкие к консенсусным сайты связывания PurR (рис. 7).

N N G (А. Т. С) А А (А,Т,С) С G (Т, G) (T,GJ Т N с N (Т,С)

Номер

основания 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Б

Регуляторная область гена leuE

cactggagcatgcctgattaatgattcaattatcgggttgatatcaggttaaaacc tgattttctcctttctaagccgctacagattggttagcatattcacctttaatcgcg catgatcgaaagataattaaagjaggttaatgtgttcgcfrgaatacggggttctga attactggacctatctggttggggccatttttattgtgttggtgccagggccaaat АСС

Регуляторная область гена ygaZ

ggttaacttactggtctggtggcgaggttttcatcgtcaggaagccgcaaattaag

caa|cagcaaccgttttcgt|ggctttacacttataagggtgttaagaagcccatcag

tctgataaggttaagatattcattcagtctatttataatattaacaatcgttaagc gtacactctatggaaagccctactccacagcctgctcctggttcggcgaccttcat ggaaggatgcaaagacagtttaccg

Рисунок 7. А. Консенсусная последовательность сайта связывания PurR из базы данных DPInteract (http://arep.med.harvard.edu/dpinteract/). Консервативные нуклеотиды выделены жирным шрифтом, курсивом - наиболее часто встречающиеся, буква N обозначает любой нуклеотид в соответствующей позиции, буквы в скобках указывают нуклеотиды, встречающиеся в соответствующих позициях. Б. 5'-нетранслируемая область и начало кодирующей области гена leuE. В. 5'-нетранслируемая область и начало кодирующей области reHa>gaZ. Сайты начала трансляции белков LeuE и YgaZ подчеркнуты, предполагаемый сайт связывания белка PurR выделен рамкой.

3.2. Влияние аллельного состояния гена purR на экспрессию leuE и

ygaZ

Для изучения влияния аллельного состояния гена purR на экспрессию гена leuE и оперона ygaZH на малокопийном векторе pMWLT были сконструированы трансляционные слияния генов ¡еиЕ и ygaZ с репортерным геном lacZ. Полученными плазмидами трансформировали штаммы Е. coli TGI и изогенный штамм с делецией гена purR, TGlApurR. Полученные трансформанты выращивали на минимальной среде М9 с глюкозой до логарифмической фазы роста, экспрессию генов leuE и ygaZ оценивали по активности ß-галактозидазы.

Рисунок 8. Влияние аллельного состояния генаригН на уровень экспрессии генов ¡еиЕ и у%а2. Измерение проводилось в логарифмической фазе роста на среде М9 с глюкозой.

Оказалось, что экспрессия ygaZ на порядок выше чем ¡еиЕ (рис. 8). Деления в генеригЯ приводит к повышению уровня экспрессии гена 1еиЕ на 150% и ygaZ на 22%. Таким образом, наличие белка РигЯ, прямо или косвенно, подавляет экспрессию ¡еиЕ и ygaZ.

3.3. Влияние пуриновых нуклеозидов, оснований и аналогов пуринов на экспрессию leuE n ygaZ

Мы изучили влияние различных соединений на экспрессию трансляционного слияния leuE-lacZ. Влияние пуриновых оснований и их аналогов изучали в штамме TG1, а влияние нуклеозидов - в штамме с их нарушенным превращением в основания TGldeoD.

Было обнаружено, что экспрессия leuE индуцируется основаниями аденином и гуанином, а также аналогами пуринов - 6-тиогуанином и 6-меркаптопурином, но не зависит от присутствия пуриновых нуклеозидов (рис. 9). Подобный эксперимент провели и для трансляционного слияния ygaZ-IacZ. В отличие от результатов, полученных для ¡еиЕ, добавление в среду выращивания пуриновых нуклеозидов, оснований, а также их аналогов не привело к изменению уровня экспрессии гена ygaZ.

TGIAdeoD(pMWLT-leuE-lacZ)

TGI(pMWLT-leuE-lacZ)

Рисунок 9. Влияние пуриновых нуклеозидов (А), оснований (Б) и аналогов пуринов (В) на уровень экспрессии гена 1еиЕ. Измерение проводилось в клетках в логарифмической фазе роста после четырех часов индукции соответствующим соединением. М9 -среда М9 с глюкозой без индуктора. Индукторы: АИ - аденозин, -гуанозин, НхЯ - инозин, ХЯ -ксантозин, А(1е - аденин, виа -гуанин, X - ксантин, Нх -гипоксантин, 6-ТО - 6-тиогуанин, 6-МР - 6-меркаптопурин, 8-Ага - 8-азааденин.

TG1 (pMWLT-leuE-lacZ)

6-TG 6-МР

3.4. Влияние аллельного состояния гена deoD на экспрессию leuE и

ygaZ

Продукт гена deoD, пуриннуклеозидфосфорилаза, участвует в salvage пути биосинтеза пуриновых нуклеотидов, обеспечивая превращение нуклеозидов в основания. Было изучено влияние аллельного состояния гена deoD на экспрессию трансляционных слияний leuE-lacZ и ygaZ-lacZ в штамме TG1 и его производном, в котором вследствие делеции гена purR отсутствует репрессор биосинтеза пуринов PurR. Оказалось, что делеция в гене deoD приводит к увеличению экспрессии ygaZ по сравнению с

контролем на 26% (рис. 10А). Деления ригЯ приводит к дальнейшему увеличению экспрессии этого гена.

У 5 ?

Я"

Ч % а N

--¿я N 0) э ■о-0» £ а а .2 2 "ш "

О. ш 5 £ 11 <3 ¡т 5

5 а. |в ш

Рисунок 10. Влияние аллельного состояния генов (1еоО и ригЯ на уровень экспрессии генов Уёа2 (А) и 1еиЕ (Б). Измерение проводилось в логарифмической фазе роста культуры на минимальной среде М9 с глюкозой.

Влияние алелльного состояния <1еоО на экспрессию гена /еиЕ отлично от у%а2. Отсутствие в клетках репрессора биосинтеза пуринов РигЯ существенно увеличивает экспрессию гена ¡еиЕ. Внесение в штамм с делецией гена ригЯ дополнительной мутации Дс1еоО снимает этот эффект (рис. 10Б).

Таким образом, на экспрессию оперона ygaZH и гена 1еиЕ влияет наличие белков РигЯ и ЭеоО. Полученные данные не позволяют детально описать механизм регуляции экспрессии этих генов, однако можно сделать вывод, что в нее вовлечены белки, контролирующие как метаболизм пуринов (РигЯ и ВеоО), так и аминокислот (Ьгр). Дальнейшее изучение механизмов регуляции этих генов, возможно, позволит прояснить их роль в физиологии клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Было показано, что PbuE из Bacillus участвует в экскреции не только пуриновых оснований, но и пуриновых нуклеозидов аденозина, инозина и гуанозина, а также AICAr. Экспрессия pbuE из В. amyloliquefaciens сохраняет в Е. coli основные характеристики аденин-зависимого рибопереключателя, а именно: активируется аденином и усиливается при введении в регуляторную область гена (А-бокс) замены Т—>С. Также было установлено, что PbuE и его ортолог Nepl из Е. coli способны выполнять свои экскреторные функции как в грамположительных, так и грамотрицательных бактериях.

Помимо основного экспортера пуриновых нуклеозидов Nepl у £ coli имеется ряд других белков, таких как RhtA, LeuE, YgaZ, YgaH и YdeD, также способных выполнять эту функцию. Ранее эти белки были охарактеризованы как транспортеры аминокислот. Таким образом, специфичность указанных белков оказалась очень широкой. Было показано, что регуляция генов ygaZH и 1еиЕ зависит от пуринового метаболизма, а именно: регулятор пуринового обмена PurR и продукт гена deoD, пуриннуклеозидфосфорилаза, влияют на экспрессию этих генов. Кроме того, экспрессия гена leuE индуцируется в присутствии пуриновых оснований аденина и гуанина, а также аналогов пуринов - 6-тиогуанина и 6-меркаптопурина.

выводы

1. Клонированы и фенотипически охарактеризованы ортологичные гены pbuE из В. subtilis и В. amyloliquefaciens. Показано, что гетерологичная экспрессия гена pbuE из В. amyloliquefaciens в неродственной бактерии Е. coli сохраняет основные характеристики аденин-зависимого рибопереключателя: активируется аденином и усиливается при введении мутации Т—>С.

.2. Показано, что PbuE функционирует как экспортер пуриновых нуклеозидов, пуриновых оснований и AICAr. PbuE и его ортолог Nepl из Е. coli способны выполнять свои экскреторные функции как в грамположительных, так и грамотрицательных бактериях.

3. Повышенная экспрессия генов Е. coli rhtA, ydeD, leuE и оперона ygaZH, продукты которых ранее охарактеризованы как белки экскреции аминокислот, повышает устойчивость к пуриновым нуклеозидам и аналогам пуринов, а также обеспечивает повышенную продукцию инозина, гуанозина или гипоксантина штаммами-продуцентами.

- экспрессия leuE и ygaZH увеличивается в отсутствии регуляторного белка PurR;

- экспрессия leuE индуцируется пуриновыми основаниями аденином и гуанином, а также аналогами пуринов - 6-тиогуанином и 6-меркаптопурином;

- на экспрессию генов leuE и ygaZH влияет аллельное состояние гена deoD.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Zakataeva N.P., Gronskiy S.V., Sheremet A.S., Kutukova E.A., Novikova A.E., Livshits V.A. A new function for the Bacillus PbuE purine base efflux pump: efflux of purine nucleosides. Res. Microbiol. 2007,158:659-665.

2. Zakataeva N.P., Sheremet A.S., Gronskiy S.V., Livshits V.A. Enhancement of extracellular purine nucleoside and AICA ribonucleoside accumulation by Bacillus strains through the genetic modification of genes involved in nucleoside export. Ill International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology. 2009. Lisbon, Portugal, p. 583.

3. Sheremet A.S., Gronskiy S.V., Akhmadyshin R.A., Novikova A.E., Livshits V.A., Shakulov R.S., Zakataeva N.P. Enhancement of extracellular purine nucleoside accumulation by Bacillus strains through genetic modifications of genes involved in nucleoside export. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2011, 38:65-70.

Подписано в печать: 14.01.2011

Заказ № 4827 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шеремет, Анастасия Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цель и задачи работы

Научная новизна и практическая значимость работы

Публикации и апробация работы

Структура и объем работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Метаболизм пуринов и его регуляция у Bacillus и Е. coli

1.1. Путь биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo

1.2. Регуляция биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo на уровне 19 транскрипции

1.2.1. Репрессия PurR

1.2.2. Терминация транскрипции по механизму гуанин- 22 зависимого рибопереключателя

1.3. Ретроингибирование ферментов биосинтеза пуринов de novo

1.4. Усвоение пуриновых соединений и их взаимопревращение

1.4.1. Резервный (salvage) путь биосинтеза пуриновых 25 нуклеотидов

1.4.2. Взаимопревращение пуриновых нуклеотидов

1.4.3. Транспорт внутрь и утилизация пуриновых соединений

2. Экскреция различных соединений из клеток Е. coli и В. subtilis

2.1. Экскреция аминокислот из клеток Е. coli

2.2. NepI — белок экскреции пуриновых нуклеозидов у Е. coli

2.3. PbuE - белок экскреции пуриновых оснований у В. subtilis AI

3. Применение пуринов 51 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Бактериальные штаммы, фаги, плазмиды

2. Методы работы с ДНК

3. Трансформация, трансдукция, электротрансформация, сайт- 63 направленный мутагенез, клонирование in vivo и получение генетических модификаций в хромосоме Е. coli

4. Трансформация, трансдукция, и получение немаркированных 65 генетических модификаций в хромосоме штаммов Bacillus

5. Определение минимальных ингибирующих концентраций

6. Определение концентраций пуриновых производных в культуральной 67 среде

7. Проведение ферментаций в пробирках со штаммами-продуцентами 67 Е. coli и В. amyloliquefaciens

8. Определение активности ß-галактозидазы 68 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Поиск и изучение генов, участвующих в экскреции пуриновых 69 нуклеозидов у Bacillus

1.1. Клонирование генов В. subtilis, продукты которых гомологичны 69 белку Nepl из Е. coli

1.2. Клонирование генаpbuE из В. amyloliquefaciens

1.3. Изучение регуляции генарЬиЕвл в Е. coli

1.4. Поиск предпочтительных субстратов для экспортера PbuE

1.5. Изучение влияния повышенной экспрессии рЬиЕвл на экзогенное 78 накопление инозина штаммами Е. coli

1.6. Изучение влияния экспрессии рЬиЕвл на накопление инозина и 80 гипоксаптина штаммами-продуцентами Е. coli

1.7. Изучение влияния повышенной экспрессии рЬиЕвл на 81 накопление инозина и гуанозина штаммом-продуцентом

В. amyloliquefaciens

1.8. Конструирование бесплазмидного штамма-продуцента с 82 повышенной экспрессией pbuE

1.9. Гетерологичная экспрессия пер1ъ штамме В. amyloliquefaciens

1.10. Влияние экспрессии PbuE и Nepl на продукцию AICAr

2. Поиск и изучение новых генов, продукты которых обеспечивают 87 экскрецию пуриновых производных у Е. coli

2.1. Поиск и идентификация генов, сообщающих при амплификации 87 устойчивость к ингибирующим концентрациям инозина и гуанозина

2.1.1. Получение коллекции фазмид, обеспечивающих 88 устойчивость к пуриновым нуклеозидам

2.1.2. Идентификация генов, содержащихся на фазмиде Ми37 90 и обеспечивающих устойчивость к пуриновым нуклеозидам

2.1.3. Идентификация генов, содержащихся на фазмиде Ми15 91 и обеспечивающих устойчивость к пуриновым нуклеозидам

2.1.4. Идентификация генов, содержащихся на фазмиде Ми1 93 и обеспечивающих устойчивость к пуриновым нуклеозидам

2.1.5. Изучение фенотипических эффектов делеции и 95 повышенной экспрессии гена у1с1У

2.2. Поиск и изучение генов, сообщающих при амплификации 97 устойчивость к аналогам пуринов

2.3. Изучение регуляции экспрессии генов leuEиygaZH

2.3.1. Анализ регуляторной области генов 1еиЕ и ygaZ на 100 наличие сайтов связывания с белком РигК

2.3.2. Влияние аллельного состояния гена ригЯ на экспрессию

1еиЕ и ygaZ

2.3.3. Влияние пуриновых нуклеозидов, оснований и аналогов 102 пуринов на экспрессию 1еиЕ и у^аХ

2.3.4. Влияние аллельного состояния гена йеоБ на экспрессию

1еиЕ и ygaZ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск и изучение транспортеров, осуществляющих экскрецию пуриновых соединений у штаммов Bacillus и Escherichia coli"

Актуальность проблемы

Пуриновые соединения, полученные микробиологическим синтезом, широко используются в фармацевтической и пищевой промышленности. Так, соли пуриновых нуклеотидов инозинмонофосфата (ИМФ) и гуанозинмонофосфата (ГМФ) наряду с глутаматом натрия обладают высокой способностью усиливать вкус и поэтому являются важными компонентами пищевых добавок. Из-за очень высокой способности инозината и гуанозината усиливать вкус пищи добавление этих соединений к глутамату натрия позволяет использовать в четыре раза меньше такой пищевой добавки по сравнению с чистым глутаматом натрия. ИМФ и ГМФ получают как прямой ферментацией, так и путем ферментации до пуриновых нуклеозидов - инозина и гуанозина — с последующим ферментативным фосфорилированием до соответствующих мононуклеотидов (Mori et al., 1997). Кроме того, инозин используют непосредственно для получения различных медицинских препаратов («Инозин пранобекс», «Рибоксин»), которые применяют как иммуномодуляторы, кардио- и гепатопротекторы.

Штаммы Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens обладают .большим потенциалом для биотехнологического производства инозина и гуанозина (Ishii and Shiio, 1972; Matsui et al., 1977; Zakataeva et al., 2005). Так как производство и потребление пуриновых производных с каждым годом возрастает, дальнейшее повышение продуктивности соответствующих штаммов-продуцентов на основе Bacillus с помощью методов метаболической инженерии является актуальной задачей. Один из подходов к ее решению состоит в усилении экспрессии генов, продукты которых обеспечивают экскрецию пуринов из клеток. Увеличение внутриклеточной концентрации целевого продукта в клетках продуцентов может ингибировать активность ферментов пути его биосинтеза, репрессировать гены и опероны, кодирующие эти ферменты, а также влиять на глобальные регуляторные системы, контролирующие метаболизм клетки. Все это может негативно воздействовать на биосинтез и накопление целевого продукта. Поэтому при создании штаммов-продуцентов большое значение приобретает способность клетки активно выводить синтезируемый продукт в культуральную среду. В связи с этим поиск генов, участвующих в экскреции пуриновых нуклеозидов у бактерий, является очень важной практической задачей.

Пути синтеза пуринов de novo, усвоения и превращения пуринов (путь salvage) у Escherichia coli и В. subtilis достаточно хорошо изучены (Nygaard, 1983; Neuhard and Nygaard, 1987; Zhang et al., 2009). Имеется в литературе и информация о генах, продукты которых осуществляют транспорт пуриновых оснований и нуклеозидов в клетки. Так, у В. subtilis известно несколько транспортеров для усвоения пуринов: NupG — транспортер пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов, обладающий широкой специфичностью, PbuG — транспортер гуанина и гипоксантина, PbuX — транспортер ксантина и NupC - транспортер аденозина и пиримидиновых нуклеозидов (Christiansen, 1997; Saxild and Nygaard, 1987). Однако о системах вывода (экскреции) пуриновых производных из клетки известно очень мало. Так, к моменту начала настоящего исследования был найден и охарактеризован только один ген, продукт которого осуществляет экскрецию пуриновых нуклеозидов — nepl (yicM) из Е. coli (Gronskiy et al., 2005). Был также описан экспортер пуриновых оснований, в частности, аденина - белок PbuE (YdhL) из В. subtilis (Johansen et al., 2003; Nygaard and Saxild, 2005). Дальнейшее изучение систем выведения пуриновых соединений из клеток бактерий позволит глубже понять метаболизм пуринов и механизмы контроля внутриклеточных пулов этих важнейших для клетки соединений.

Исходя из вышеизложенного, следует, что поиск и изучение генов, продукты которых вовлечены в экскрецию пуриновых соединений у бактерий, представляется актуальной задачей не только с практической, но и с научной точки зрения.

Цель и задачи работы

Работа посвящена поиску и изучению генов, участвующих в экскреции пуриновых производных из клеток Bacillus и Е. coli, а также изучению влияния повышенной экспрессии этих генов на продуктивность соответствующих штаммов-продуцентов.

В процессе работы решались следующие задачи:

1. провести поиск генов, участвующих в экскреции пуриновых нуклеозидов у Bacillus',

2. клонировать ген pbnE из В. amyloliquefaciens и изучить регуляцию его экспрессии в клетках Е. coli, определить субстратную специфичность экспортера PbuE;

Научная новизна и практическая значимость работы

В настоящей работе клонирован и изучен ген рЪиЕ из В. amyloliquefaciens, исследована регуляция его экспрессии под собственными регуляторными элементами в Е. coli. Для его продукта, белка PbuE, ранее охарактеризованного как экспортер пуриновых оснований, в частности, аденина, показана новая функция: экскреция пуриновых нуклеозидов аденозина, инозина и гуанозина, а также AICAr. Установлено, что мембранные белки экскреции PbuE и его гомолог из Е. coli Nepl способны функционировать как в грамположительных, так и грамотрицательных бактериях. Практическая значимость исследования продемонстрирована на примере увеличения продукции пуриновых рибонуклеозидов штаммами-продуцентами В. amyloliquefaciens и Е. coli. Путем создания библиотеки генов на фазмиде Mu d5005 с последующей селекцией вставок по устойчивости к ингибирующим концентрациям инозина и гуанозина осуществлен поиск транспортеров пуриновых производных у Е. coli. Найден ген yidY, продукт которого обладает низкой специфичностью к пуриновым нуклеозидам. Показано, что гены rhtA, leuE (yeaS), ydeD и ygaZH, известные как гены, кодирующие транспортеры экскреции аминокислот, усиливают при повышенной экспрессии экскрецию пуриновых соединений. Показана зависимость экспрессии генов leuE и ygaZH от метаболизма пуринов, а именно от аллельного состояния генов purR и deoD, а также зависимость экспрессии leuE от наличия в среде культивирования пуриновых нуклеозидов и аналогов пуринов в качестве индукторов.

Публикации и апробация работы

По теме диссертации опубликовано 2 печатные работы в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 сообщение в материалах Международной научной конференции (Лиссабон, Португалия, декабрь 2009 г.). Материалы диссертации дважды докладывались автором на конкурсе молодых ученых НИИ «Аджиномото-Генетика» (июнь 2007 г., июнь 2009 г.), а также были представлены на Ш Международной конференции по микробиологии окружающей среды, промышленной и прикладной микробиологии ВюМ1сго\¥ог1с12009 (Лиссабон, Португалия, декабрь 2009 г.). Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре НТС НИИ «Аджиномото-Генетика» и секции «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 20 декабря 2010 года.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из 7 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список цитированной литературы». Работа изложена на 127 страницах, включая 26 рисунков и 18 таблиц. Список цитированной литературы содержит 198 источников, в том числе 10 на русском языке.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Шеремет, Анастасия Сергеевна

выводы

2. Показано, что PbuE функционирует как экспортер пуриновых нуклеозидов, пуриновых оснований и AICAr. PbuE и его ортолог Nepl из Е. coli способны выполнять свои экскреторные функции как в грамположительных, так и грамотрицательных бактериях.

4. В регуляторной области генов leuE и ygaZH найдены возможные сайты связывания с регулятором метаболизма пуринов PurR. Изучение регуляции экспрессии генов leuE и ygaZH показало, что: экспрессия leuE и ygaZH увеличивается в отсутствие регуляторного белка PurR; экспрессия leuE индуцируется пуриновыми основаниями аденином и гуанином, а также аналогами пуринов — 6-тиогуанином и 6-меркаптопурином; на экспрессию генов leuE и ygaZH влияет аллельное состояние гена deoD.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью селекции на устойчивость к аналогам пуринов был проведен поиск транспортеров экскреции пуриновых соединений у Bacillus. В результате были клонированы и изучены ортологичные гены рЪиЕ из В. subtilis (pbuEss) и В. amyloliquefaciens (рЬиЕвл), амплификация которых сообщала устойчивость к пуриновым нуклеозидам, а также их аналогам — 2,6-диаминопурину и 6-меркаптопурину.

Изучение регуляции экспрессии гена рЬиЕвл в неродственной бактерии Е. coli показало, что уровень экспрессии рЬиЕвл повышается в присутствии аденина и не меняется при добавлении остальных нуклеозидов и оснований. Введенная в А-бокс мутация Т—>С заметно повышает уровень экспрессии рЬиЕвл даже в отсутствие аденина. Таким образом, экспрессия рЪиЕ из В. amyloliquefaciens сохраняет в Е. coli основные характеристики аденин-зависимого рибопереключателя: активируется аденином и усиливается при введении в регуляторную область гена (А-бокс) замены Т—>С.

Ряд экспериментов, направленных на выяснение функции PbuE, показал, что PbuE из Bacillus участвует в экскреции не только пуриновых оснований, но и пуриновых нуклеозидов, таких как аденозина, инозина и гуанозина, а также AICAr. Так, изучение влияния экспрессии рЬиЕвл на накопление инозина и гипоксантина штаммами-продуцентами Е. coli показало, что амплификация рЬиЕвл приводит к накоплению инозина штаммом-продуцентом Е. coli FADRadd (pMWKQ). Увеличение экспрессии гена за счет мутации Т—»C приводит к дальнейшему возрастанию продукции инозина. Амплификация гена рЬиЕвл с аллелем дикого и мутантного (замена Т—>С) типа увеличивает накопление гипоксантина соответствующими штаммами-продуцентами Е. coli. Эти данные свидетельствуют о том, что PbuE из Bacillus функционирует в Е. coli как экспортер пуриновых нуклеозидов и оснований, а повышенная экспрессия гена рЪиЕ может быть использована при получении промышленных штаммов-продуцентов.

Изучение влияния экспрессии рЬиЕвл на накопление инозина и гуанозина у Bacillus проводили в штамме В. amyloliquefaciens AJ1991 с различными аллельными вариантами гена рЬиЕвл• Инактивация гена рЬиЕвл на хромосоме штамма AJI991 приводила к значительному снижению накопления инозина и гуанозина, что, очевидно, свидетельствует о том, что PbuE является одним из основных транспортеров этих соединений у Bacillus. Амплификация гена, напротив, приводила к увеличению накопления инозина.

Из-за существующих законодательных ограничений нельзя использовать штаммы, содержащих плазмиды и антибиотические маркеры. Для того чтобы получить бесплазмидный продуцент нуклеозидов с усиленной экспрессией pbuE, мы ввели точечную замену Т—>С в регуляторную область этого гена на хромосоме В. amyloliquefaciens. Проведенная ферментация показала, что введение такой замены привело к существенному увеличению накопления инозина.

Помимо широко используемых в пищевой промышленности ИМФ и ГМФ, практическое значение имеет еще один пуриновый нуклеозид — AICAr, получаемый в настоящее время методом химического синтеза. С целью изучения возможности PbuE и Nepl экскретировать AICAr путем внесения делеции в ген ригН был сконструирован штамм-продуцент этого рибонуклеозида — AJ1991ApurH. Мы показали, что такой штамм накапливает более 5 г л"1 AICAr. Введение в хромосому этого штамма мутации, усиливающей экспрессию гена рЬиЕвл, привело к увеличению экзогенного накопления AICAr. Однако гетерологичная экспрессия гена nepl из Е. coli в штамме АЛ991ДригН не сопровождалась увеличением продукции AICAr. Таким образом, PbuE из Bacillus участвует в экскреции не только гипоксантина, аденина, аденозина, инозина и гуанозина, но также и AICAr. Несмотря на гомологию между PbuE и Nepl и их широкую субстратную специфичность, спектр транспортируемых ими субстратов различен. Было установлено, что PbuE и его ортолог Nepl из Е. coli способны выполнять свои экскреторные функции как в грамположительных, так и грамотрицательных бактериях.

С целью поиска новых генов, кодирующих белки экскреции пуриновых нуклеозидов у Е. coli, путем клонирования in vivo с использованием фазмиды Mu d5005 была получена библиотека генов. Селекцию вставок осуществляли в специально сконструированном чувствительном к пуриновым нуклеозидам штамме GS72 на минимальной среде с добавлением пуриновых нуклеозидов. Был найден ген yidY, амлификация которого на многокопийном векторе придавала штамму устойчивость к инозину и гуанозину. Дальнейшие фенотипические исследования показали, что устойчивость клеток к пуриновым нуклеозидам, а также небольшой положительный эффект на продукцию инозина проявляется только при очень высокой экспрессии гена у1с1У. По-видимому, У1с1У обладает очень низким сродством к инозину и гуанозину.

Помимо основного экспортера пуриновых нуклеозидов №р1 у Е. соН имеется ряд других белков, таких как 1ША, ЬеиЕ, YgaZ, У§аН и УёеБ, также способных выполнять эту функцию. Ранее эти белки были охарактеризованы как транспортеры экскреции аминокислот. Было показано, что амплификация этих генов приводит к повышению устойчивости к пуриновым нуклеозидам и аналогам пуриновых оснований, а также увеличивает продукцию пуриновых нуклеозидов и оснований штаммом-продуцентом. Таким образом, специфичность указанных транспортеров оказалась очень широкой. Этим они похожи на известные белки множественной лекарственной устойчивости. Изучение регуляция генов ygaZ и 1еиЕ выявило ее зависимость от пуринового метаболизма, а именно: регулятор пуринового обмена РигЫ и продукт гена ¿еоБ, пуриннуклеозидфосфорилаза, влияют на экспрессию этих генов. Кроме того, экспрессия гена 1еиЕ индуцируется в присутствии пуриновых оснований аденина и гуанина, а также аналогов пуринов - 6-тиогуанина и 6-меркаптопурина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шеремет, Анастасия Сергеевна, Москва

1. Артамонов В.И. (1976) О некоторых общебиологических аспектах опухолеобразования. П. Изменения в энергетическом обмене. Успехи современной биологии 81:141-556.

2. Гронский С.В., Закатаева Н.П., Лившиц В.А. Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты, штамм Escherichia coli продуцент инозина. Патент РФ №2244004, 2005.

3. Закатаева Н.П., Кутукова Е.А., Гронский С.В., Трошин П.В., Лившиц В.А., Алешин В.В. (2006) Экспорт метаболитов белками семейств DMT и RhtB и их возможная роль в межклеточной коммуникации. Микробиология 75:112.

4. Закатаева Н.П., Лившиц В.А., Гронский С.В. Способ получения инозина и 5-инозиновой кислоты, штамм Escherichia coli продуцент инозина. Патент РФ №2244003, 2005.

5. Лившиц В.А., Закатаева Н.П., Гронский С.В., Витушкина М.В., Новикова А.Е. Способ получения пуриновых нуклеозидов и нуклеотидов, штамм-продуцент пуриновых нуклеозидов (варианты). Патент РФ №2239656, 2004.

6. Лившиц В.А., Закатаева Н.П., Наканиши К., Алешин В.В., Трошин П.В., Токмакова И.Л. Фрагмент ДНК из Escherichia coli, определяющий повышенную продукцию L-аминокислот (варианты), и способ получения L-аминокислот. Патент РФ № 2175351, 2001.

7. Лобанов К.В., Королькова Н.В., Еремина С.Ю., Лопес Л.Э., Прошкин С.А., Миронов А.С. (2007) Мутации, приводящие к изменению специфичности сенсорной РНК, кодируемой геном pbuE Bacillus subtilis. Генетика 43:859864.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984, 480 е., под ред. Баева А.А., Скрябина К.Г.

9. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976, 436 е., под ред. Алиханяна С.И.

10. Цыренов В.Ж. Микробиологический синтез нуклеозидфосфатов. — М.: Наука, 1990,200 е., под ред. Безбородова A.M.

11. Aiba A., Mizobuchi К. (1989) Nucleotide sequence analysis of genes purH and parD involved in the de novo purine nucleotide biosynthesis of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264:21239-21246.

12. Aleshin Y.V., Zakataeva N.P., Livshits V.A. (1999) A new family of amino-acid-efflux proteins. Trends Biochem. Sei. 24:133-135.

13. Andrews S.C., Guest J.R. (1988) Nucleotide sequence of the gene encoding the GMP reductase of Escherichia coli K-12. Biochem. J. 255:35-43.

14. Antopyuk S.V., Grebenko A.I., Levdikov V.M., Urusova D.V., Melik-Adamyan V.R., Lamzin V.S., Wilson K.S. (2001) X-ray study of SAICAR synthase complexes with adenosinetriphosphate. Kristallografiya. 46:687-691.

15. Baugh C.M., Krumdieck C.L. (1969) Biosynthesis of riboflavine in Corynebacterium species: the purine precursor. J. Bacteriol. 98:1114-1119.

16. Beaman T.C., Hitchins A.D., Ochi K., Vasantha N., Endo Т., Freese E. (1983) Specificity and control of uptake of purines and other compounds in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 156:1107-1117.

17. Bellmann A., Vrljic M., Pätek M., Sahm H., Krämer R., Eggeling L. (2001) Expression control and specificity of the basic amino acid exporter LysE of Corynebacterium glutamicum Microbiol. 147:1765-1774.

18. Bera A.K., Zhu J., Zalkin H., Smith J.L. (2003) Functional dissection of the Bacillus subtilis pur operator site. J. Bacteriol. 185:4099-4109.

19. Berlin R.D., Stadtman E.R. (1966) A possible role of purine nucleotide pyrophosphorylases in the regulation of purine uptake by Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 241:2679-2686.

20. Blatny J.M., Brautaset Т., Winther-Larsen H.C., Haugan K., Valla S. (1997) Construction and use of a versatile set of broad-host-range cloning and expression vectors based on the RK2 replicon. Appl. Environ. Microbiol. 63:370379.

21. Brune M., Schumann R., Wittinghofer F. (1985) Cloning and sequencing of the adenylate kinase gene (adk) of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 13:71397151.

22. Buchanan J.M. (1982) Covalent reaction of substrates and antimetabolites with formylglycinamide ribonucleotide amidotransferase. Methods Enzymol. 87:7684.

23. Burton K. (1994) Adenine transport in Escherichia coli. Proc. R. Soc. Lond. Ser. B. Biol. Sci. 255:153-157.

24. Busch W., Saier M.H. Jr. (2004) The HJBMB-Endorsed transporter classification system. Mol. Biotech. 27:253-262.

25. Buxton R.S. (1975) Genetic analysis of thymidine-resistant and low-thymine-requiring mutants of Escherichia coli K-12 induced by bacteriophage Mu-1. J. Bacteriol. 121:475-484.

26. Cardinaud R. (1978) Nucleoside deoxyribosiltransferase from Lactobacillus helveticus. Methods Enzymol. 51:446-455.

27. Casadaban M.J., Cohen S.N. (1979) Lactose genes fused to exogenous promoters in one step using a Mu-lac bacteriophage: in vivo probe for transcriptional control sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4530-4533.

28. Chandrashekar J., Hoon M.A., Ryba N.J., Zuker C.S. (2006) The receptors and -cells for mammalian taste. Nature 444:288-294.

29. Charman A.G., Atkinson D.E. (1973) Stabilization of adenylate energy charge by the adenylate deaminase reaction. J. Biol. Chem. 248:8309-8312.

30. Choi K.Y., Zalkin H. (1992) Structural characterization and corepressor binding of the Escherichia coli purine repressor. J. Bacterid. 174:6207-6214.

31. Corton J.M., Gillespie J.G., Hawley S.A., Hardie D.G. (1995) 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside. A specific method for activating AMP-activated protein kinase in intact cells? Eur. J. Biochem. 229:558-565.

32. Craig J.E., Zhang Y., Gallagher M.P. (1994) Cloning of the nupC gene of Escherichia coli encoding a nucleoside transport system, and identification of an adjacent insertion element, IS 186. Mol. Microbiol. 11:1159-1168.

33. Dahm R. (2005) Friedrich Miescher and the discovery of DNA. Dev. Biol. 278:274-288.

34. Dandanell G., Szczepanowski R.H., Kierdaszuk B., Shugar D., Bochtler M. (2005) Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase II, the product of the xapA gene. J. Mol. Biol. 348:113-125.

35. Dassler T., Maier T., Winterhalter C., Bock A. (2000) Identification of a major facilitator protein from Escherichia coli involved in efflux of metabolites of the cysteine pathway. Mol. Microbiol. 36:1101-1112.

36. Datsenko K.A., Wanner B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645.

37. Diesveld R., Tietze N., Reth A., Bathe B., Sahm H., Eggeling L. (2009) Activity of exporters of Escherichia coli in Corynebacterium glutamicum, and their use to increase L-threonine production. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 16:198-207.

38. Diesveld R., Tietze N. Reth A., Bathe B., Sahm H., Eggeling L. (2008) Activity of exporters of Escherichia coli in Corynebacterium glutamicum and their use to increase L-threonine production. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 16:198-207.

39. Doi M., Asahi S., Tsunemi Y., Akiyami S.J. (1989) Mechanism of uridine production by Bacillus subtilis mutants. Appl. Microbiol. Technol. 30:234-238.

40. Doroshenko V.G., Airich L.G., Vitushkina M.V, Kolokolova A.X., Livshits V.A., Mashko S.V. (2007) YddG from Escherichia coli promotes export of aromatic amino acids. FEMS Microbiol. Lett. 275:312-318.

41. Ebbole D.J, Zalkin H. (1987) Cloning and characterization of a 12-gene cluster from Bacillus subtilis encoding nine enzymes for de novo purine nucleotide synthesis. J. Biol. Chem. 262:8274-8287.

42. Eftimie A.M., Toma F., Costache A.Z., Bucurenci N. (2007) Characterization of guanylate kinase from gram positive and gram negative microorganisms; preliminary results. Roum. Arch .Microbiol. Immunol. 66:22-25.

43. Eldakak A., Rancati G., Rubinstein B., Paul P., Conaway V., Li R. (2010) Asymmetrically inherited multidrug resistance transporters are recessive determinants in cellular replicative ageing. Nat. Cell. Biol. 12:799-805.

44. Endo T., Uratani B., Freese E. (1983) Purine salvage pathways of Bacillus subtilis and effect of guanine on growth of GMP reductase mutants. J. Bacteriol. 155:169-179.

45. Flannigan K.A., Hennigan S.H., Vogelbacker H.H., Gots J.S., Smith J.M. (1990) Purine biosynthesis in Escherichia coli K-12: structure and DNA sequence studies of the purHD locus. Mol. Microbiol. 4:381-392.

46. Franke I., Resch A., Dassler T., Maier T., Bock A. (2003) YfiK from Escherichia coli promotes export of Oacetylserine and cysteine. J. Bacteriol. 185:1161-1166.

47. Freese E. (1989) Control of differentiation by GTP. Nucleosides Nucleotides. 8:975-978.

48. Freese E., Heinze J., Mitani T., Freese E.B. (1978) Limitation of nucleotides induces sporulation, p. 277-285. In G. Chambliss and J.C. Vary (ed.), Spores. VII. American Society for Microbiology, Washington, DC, USA.

49. Galinanes M., Mullane K.M., Bullough D., Hearse D.J. (1992) Acadesine and myocardial protection. Studies of time of administration and dose-response relations in the rat. Circulation 86:598-608.

50. Gentry D., Bengra C., Ikehara K., Cashel M. (1993) Guarníate kinase of Escherichia coli K-12. J. Biol. Chem. 268:14316-14321.

51. Gilbert H.J., Drabble W.T. (1980) Active-site modification of native and mutant forms of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase from Escherichia coli K-12. Biochem. J. 191:533-541.

52. Gilbert H.J., Lowe C.R., Drabble W.T. (1978) Inosine 5'-monophosphate dehydrogenase of Escherichia coli. Purification by affinity chromatography, subunit structure and inhibition by guanosine 5'-monophosphate. Biochem. J. 183:481-494.

53. Ginder N.D., Binkowski D.J., Fromm H.J., Honzatko R.B. (2006) Nucleotide complexes of Escherichia coli phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthetase. J. Biol. Chem. 281:20680-20688.

54. Girons I.S., Gilles A.M., Margarita D., Michelson S., Monnot M, Fermandjian S., Danchin A., Barzu O. (1987) Structural and catalytic characteristics of Escherichia coli adenylate kinase. J. Biol. Chem. 262:622-629.

55. Groisman E.A., Casadaban M.J. (1986) Mini-mu bacteriophage with plasmid replicons for in vivo cloning and lac gene fusing. J. Bacteriol. 168:357-364.

56. Guyer M.S., Reed R.E., Steitz T., Low, K.B. (1981) Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 45:135-140.

57. Hama H., Almaula N., Lerner C.G., Inouye S., Inouye M. (1991) Nucleoside diphosphate kinase from Escherichia coli\ its overproduction and sequence comparison with eukaryotic enzymes. Gene 105:31-36

58. Hammer-Jespersen K. (1983) Nucleoside catabolism, p. 203-258. In A. Munch-Petersen (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganisms. Academic Press, London, United Kingdom.

59. Hammer-Jespersen K., Munch-Petersen A., Schwartz M., Nygaard P. (1971) Induction of enzymes involved in the catabolism of deoxyribonucleosides and ribonucleosides in Escherichia coli K-12. Eur. J. Biochem. 19:533-538.

60. Haneda K., Kodaira R. (1987) Mechanism of adenosine production by xanthine-requiring mutants derived from a Bacillus strain. J. Ferment. Technol. 65:145151.

61. Hardie D.G., Hawley S.A. (2001) AMP-activated protein kinase: the energy charge hypothesis revisited. Bioassays 23:1112-1119.

62. He B., Zalkin H. (1992) Escherichia coli purB gene: cloning, nucleotide sequence and regulation by purR. J. Bacteriol. 174:130-136.

63. He B., Zalkin H. (1993) Regulation of Escherichia coli pur A by purine repressor, one component of a dual control mechanism. J. Bacteriol. 176:1009-1013.

64. Hershey H.V., Taylor M.W. (1986) Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Escherichia coli adenine phosphoribosyltransferase and comparison with other analogues enzymes. Gene 43:287-293.

65. Horinouchi S., Weisblum B. (1982) Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J. Bacteriol. 150:815-825.

66. Hoskins A.A., Anand R., Ealick S.E., Stubbe J. (2004) The formylglycinamide ribonucleotide amidotransferase complex from Bacillus subtilis: metabolite-mediated complex formation. Biochemistry 43:10314-10327.

67. Hou Z., Cashel M., Fromm HJ., Honzatko R.B. (1999) Effectors of the stringent response target the active site of Escherichia coli adenylosuccinate synthetase. J. Biol. Chem. 274,17505-17510.

68. Houlberg U., Jensen K.F. (1983) Role of hypoxanthine and guanine in regulation of Salmonella typhimurium pur gene expression. J. Bacteriol. 153:837-845.

69. Hove-Jensen B., Nygaard P. (1989) Role of guanosine kinase in the utilization of guanosine for nucleotide synthesis in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 135:1263-1273.

70. Ishii K., Shiio I. (1972) Improved inosine production and derepression of purine nucleotide biosynthetic enzymes in 8-azaguanine resistant mutants of Bacillus subtilis. Agric. Biol. Chem. 36:1511-1522.

71. Jensen K.F. (1978) Two purine nucleoside phosphorylases in Bacillus subtilis. Purification and some properties of the adenosine-specific Phosphorylase. Biochim. Biophys. Acta 525:346-356.

72. Jensen, K.F., Nygaard, P. (1975) Purine-nucleoside phosphoiylase from Escherichia coli and Salmonella typhimurium: purification and some properties. Eur. J. Biochem. 51:253-265.

73. Jochimsen B. (1979) GMP reductase-guanosine kinase: regulation. Thesis, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark.

74. Johansen L.E., Nygaard P., Lassen C., Agerse Y., Saxild H.H. (2003) Definition of a second Bacillus subtilis pur regulon comprising the pur and xpt-pbuX operons pluspbuG, nupG (yxjA) andpbuE (ydhL) J. Bacteriol. 185:5200-5209.

75. Justino M.C., Vicente J.B., Teixeira M., Saraiva L.M. (2004) New genes implicated in the protection of anaerobically grown Escherichia coli against nitric oxide. J. Biol. Chem. 280:2636-2643.

76. Kawasaki H., Shimaoka M., Usuda Y., Utagawa T. (2000) End-product regulation and kinetic mechanism of inosine-guanosine kinase from Escherichia coli. Biosci. Biotech. Biochem. 64:972-979.

77. Kessler A.I., Gots J.S. (1985) Regulation of guaC expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. 164:1288-1293.

78. Kim J.N., Breaker R.R. (2008) Purine sensing by riboswitches. Biol. Cell 100:111.

79. Kocharian A.M., Melkumian M.A., Kocharian S.M. (1985) Regulatory mutants for synthesis of a second purine nucleoside phosphorilase in Escherichia coli K-12. II. Mapping and dominance studies of pndR mutations. Mol. Gen. Genet. 21:220-228.

80. Romberg A., Lieberman I., Simms E.S. (1955) Enzymatic synthesis and properties of 5'-phosphoribosylpyrophosphate. J. Biol. Chem. 215:389-402.

81. Kuninaka A. (1987) Nucleic acid, nucleotides and related compounds, p. 71-114. In HJ. Rehm and G. Reed (ed.), Biotechnology. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany.

82. Leung H.B., Kvalnes-Krick K.L., Meyer S.L., deRiel J.K., Schramm V.L. (1989) Structure and regulation of the AMP nucleosidase gene (amn) from Escherichia coli. Biochemistry 28:8726-8733.

83. Leung H.B., Schramm V.L. (1980) Adenylate degradation in Escherichia coli. The role of AMP nucleosidase and properties of purified enzyme. J. Biol. Chem. 255:10867-10874.

84. Li C., Kappock T.J., Stubbe J., Weaver T.M., Ealick S.E. (1999) X-ray crystal structure of aminoimidazole ribonucleotide synthetase (PurM), from the Escherichia coli purine biosynthetic pathway at 2.5 A resolution. Structure. 7:1155-1166.

85. Li X.Z., Nikaido H. (2004) Efflux-mediated drug resistance in bacteria. Drugs 64:159-204.

86. Livshits V.A., Zakataeva N.P., Aleshin V.V., Vitushkina M.V. (2003) Identification and characterization of the new gene rhtA involved in threonine and homoserine efflux in Escherichia coli. Res. Microbiol. 154:123-135.

87. Lomovskaya O., Zgurskaya H. I., Bostian K. (2010) Transporters as Drug Carriers: Structure, Function, Substrates. Bact. Mult. Transp. Mol. Clin. Asp. 44:119-157.

88. Lu, Q., Inouye, M. (1996) Adenylate kinase complements nucleoside diphosphate kinase deficiency in nucleotide metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5720-5725.

89. Luo Z., Saha A.K., Xiang X., Ruderman N.B. (2005) AMPK, the metabolic syndrome and cancer. Trends Pharmacol. Sci. 26:69-76.

90. Magasanik B., Karibian D. (1960) Purine nucleotide cycles and their metabolic role. J. Biol. Chem. 235:2672-2681.

91. Mager J., Magasanik B. (1960) Guanosine 5'-phosphate reductase and its role in the interconversion of purine nucleotides. J. Biol. Chem. 235:1474-1478.

92. Maguin E., Prevost H., Ehrlich S.D., Gruss A. (1996) Efficient insertional mutagenesis in lactococci and other Gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 178:931-935.

93. Mandal M., Boese B., Barrick J.E., Winkler W.C., Breaker R.R. (2003) Riboswitches control fundamental biochemical pathways in Bacillus subtilis and other bacteria. Cell 113:577-586.

94. Mandal M., Breaker R.R. (2004a) Adenine riboswitches and gene activation by disruption of a transcription terminator. Nat. Struct. Mol. Biol. 11:29-35.

95. Mandal M., Breaker R.R. (20046) Gene regulation by riboswitches. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5:451-463.

96. Mantsala P., Zalkin H. (1992) Cloning and sequence of Bacillus subtilis purA and guaA, involved in the conversion of IMP to AMP and GMP. J. Bacterid. 174:1883-1890.

97. Marolewski A.E., Mattia K.M., Warren M.S., Benkovic S.J. (1997) Formyl phosphate: a proposed intermediate in the reaction catalyzed by Escherichia coli PurT GAR transformylase. Biochemistry 36:6709-6716.

98. Marolewski A.E., Smith J.M., Benkovic S.J. (1994) Cloning and characterization of a new purine biosynthetic enzyme. A non-folate glycinamide ribonucleotide transformilase from E. coli. Biochemistry 33:2531-2537.

99. Matsui H., Kawasaki H., Shimaoka M., Kurahashi O. (2001) Investigation of various genotype characteristics for inosine accumulation in Escherichia coli W3110. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:570-578.

100. Matsui H., Sato K., Enei H., Hirose Y. (1977) Mutation of an inosine-producing strain of Bacillus subtilis to DL-methionine sulfoxide resistance for guanosine production. Appl. Environ. Microbiol. 34:337-341.

101. Meng L.M., Kilstrup M., Nygaard P. (1990) Autoregulation of PurR repressor synthesis and involvement ofpurR in the regulation ofpurB, purC, purL, purMN mdguaBA expression in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 187:373-379.

102. Meng L.M., Nygaard P. (1990) Identification of hypoxanthine and guanine as the corepressors for the purine regulon genes of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 487:2187-2191.

103. Messenger L.J., Zalkin H. (1979) Glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase from Escherichia colt purification and properties. J. Biol. Chem. 254:3382-3392.

104. Mironov A.S., Gusarov I., Rafikov R., Lopez L.E., Shatalin K., Kreneva R.A., Perumov D.A., Nudler E. (2002) Sensing small molecules by nascent RNA: mechanism to control transcription in bacteria. Cell 111 :747-756.

105. Miyagawa K., Kanzaki N., Kimura H., Sumino Y., Akiyama S., Nakao Y. (1989) Increased inosine production by a Bacillus subtilis xanthine-requiring mutant derived by insertional inactivation of the IMP dehydrogenase gene. Biotechnology 7:821-824.

106. Miyagawa K., Kimura H., Nakahama K., Kikuchi M., Doi M., Akiyama S., Nakao Y. (1986) Cloning of the Bacillus subtilis IMP dehydrogenase gene and its application to increased production of guanosine. Biotechnology 4:225-228.

107. Moat A.G., Foste J.W., Spector M.P. (2002) Microbial Physiology. 4th edn, Wiley-Liss, NY, USA.

108. Mellgaard H. (1980) Deoxyadenosine/deoxycytidine kinase from Bacillus subtilis. Purification, characterization and physiological function. J. Biol. Chem. 255:8216-8220.

109. Mori H., Iida A., Fujio T., Tetsushiba S. (1997) A novel process of inosine 5'-monophosphate production using overexpressed guanosine/inosine kinase. Appl. Microbiol. Biotechnol. 48:693-698.

110. Moyed H.S., Magasanik B. (1960) The biosynthesis of the imidazole ring of histidine. J. Biol. Chem. 235:149-153.

111. Munch-Petersen A., Jensen N. (1990) Analysis of the regulatory region of the Escherichia coli nupG gene, encoding a nucleoside-transport protein. Eur. J. Biochem. 190:547-551.

112. Munch-Petersen A., Mygind B. (1983) Transport of nucleic acids precursors, p. 259-305. In A. Munch-Petersen (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganisms. Academic Press, London, United Kingdom.

113. Murakami K. (1979) AMP deaminase from baker's yeast: kinetic and molecular properties. J. Biochem. 86:1331-1336.

114. Nagy P.L., McCorkle G.M., Zalkin H. (1993) purU, a source of formate for /wr^-dependent phosphoribosyl-N-formylglycinamide synthesis. J. Bacteriol. 175:7066-7073.

115. Nandieni R., Gowrishankar J. (2004) Evidence for an arginine exporter encoded by yggA (argO) that is regulated by the LysR-Type transcriptional regulator ArgP in Escherichia coli. J. Bacteriol. 186:3539-3546.

116. Nandineni M.R., Gowrishankar J. (2004) Evidence for an arginine exporter encoded by yggA (argO) that is regulated by the LysR-type transcriptional regulator ArgP in Escherichia coli. J. Bacteriol. 186:3539-3546.

117. Nishino K., Yamaguchi A. (2001) Analysis of a complete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli. J. Bacteriol. 183:5803-5812.

118. Norholm M.H.H., Dandanell G. (2001) Specificity and topology of the Escherichia coli xanthosine permease, a representative of the NHS subfamily of the Major Facilitator Superfamily. J. Bacteriol. 183:4900-4904.

119. Nudler E., Mironov A.S. (2004) The riboswitch control of bacterial metabolism. Trends Biochem. Sei. 29:11-17.

120. Nygaard P. (1983) Utilization of preformed purine bases and nucleosides, p. 2793. In A. Munch-Petersen (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganisms. Academic Press, London, United Kingdom.

121. Nygaard P., Bested S.M., Andersen K.A., Saxild H.H. (2000) Bacillus subtilis guanine deaminase is encoded by the yknA gene and is induced during growth with purines as the nitrogen source. Microbiology 146:3061-3069.

122. Nygaard P., Duckert P., Saxild H.H. (1988) Purine gene organization and regulation in Bacillus subtilis, p. 57-61. In A.T. Ganesan and J.A. Hoch (ed.), Genetics and biotechnology of Bacilli, vol. 2. Academic Press, San Diego, CA, USA.

123. Nygaard P., Duckert P., Saxild, H.H. (1996) Role of adenine deaminase in purine salvage and nitrogen metabolism, and characterization of the ade gene in Bacillus subtilis. J. Bacterid. 178:846-853.

124. Nygaard P., Saxild H.H. (2005) The purine efflux pump PbuE in Bacillus subtilis modulates expression of the PurR and G-Box (XptR) regulons by adjusting the purine base pool size. J. Bacteriol. 187:791-794.

125. Oeschger M.P., Bessman M.J. (1966) Purification and properties of guanylate kinase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 241:5452-5460.

126. Pao S.S., Paulsen I.T., Saier M.H. Jr. (1998) Major facilitator superfamily. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:1-34.

127. Park J.H., Lee K.H., Kim T.Y., Lee S.Y. (2007) Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of L-valine based on transcriptome analysis and in silico gene knockout simulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7797- 7802.

128. Peeters E., Nguyen Le Minh P., Foulquie-Moreno M., Charlier D. (2009) Competitive activation of the Escherichia coli argO gene coding for an arginine exporter by the transcriptional regulators Lrp and ArgP. Mol. Microbiol. 74:1513-1526.

129. Petersen C. (1999) Inhibition of cellular growth by increased guanine nucleotide pools. Characterization of an Escherichia coli mutant with a guanosine kinase that is insensitive to feedback inhibition by GTP. J. Biol. Chem. 274:5348-5356.

130. Pittman M.S., Corker H., Wu G., Binet M.B., Moir A.J.G., Poole R.K. (2002) Cysteine is exported from the Escherichia coli cytoplasm by CytDC, an ATP-binding cassette-type transporter required for cytochrome assembly. J. Biol. Chem. 277:49841-49849.

131. Rabinovich P.M., Iomantas Iu.V., Khaikinson M.I., Stepanov A.I. (1984) In A.I. Ganesan and J.A. Hoch (ed.), Genetics and biotechnology of Bacilli. Academic Press, USA, p. 297-308.

132. Rachmeler M., Gerhart J., Rosner J. (1961) Limited thymidine uptake in Escherichia coli due to an inducible thymidine phosphorylase. Biochim. Biophys. Acta 49:222-225.

133. Rappu P., Leppihalme M., Mantsala P. (2005) Mutational analysis of the Bacillus subtilis pur A operator site. Curr. Microbiol. 51:322-326.

134. Rappu P., Pullinen T., Mantsala P. (2003) The in vivo effect of mutations at the PRPP binding site of the Bacillus subtilis purine repressor. J. Bacteriol. 185:6728-6731.

135. Rappu P., Shin B.S., Zalkin H., Mantsala P. (1999) A role for a highly conserved protein of unknown function in regulation of Bacillus subtilis purA by the purine repressor. J. Bacteriol. 181:3810-3815.

136. Rinas U., Hellmuth K., Kang R., Seeger A., Schlieker H. (1995) Entry of Escherichia coli into stationary phase is indicated by endogenous and exogenous accumulation of nucleobases. Appl. Environ. Microbiol. 61:4147-4151.

137. Rolfes J.R., Zalkin H. (1990) Autoregulation of Escherichia coli purR requires two control sites downstream of the promoter. J. Bacteriol. 172:5758-5766.

138. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.

139. Saxild H.H., Andersen L.N., Hammer K. (1996) dra-nupC-pdp operon of Bacillus subtilis: nucleotide sequence, induction by deoxyribonucleosides and transcriptional regulation by the deoR-encoded DeoR repressor protein. J. Bacteriol. 178:424-434.

140. Saxild H.H., Nygaard P. (1987) Genetic and physiological characterization of Bacillus subtilis mutants resistant to purine analogs. J. Bacterid. 169:2977-2983.

141. Saxild H.H., Nygaard P. (1988) Gene-enzyme relationships of the purine biosynthetic pathway in Bacillus subtilis. Mol. Gen. Genet. 211:160-167.

142. Saxild H.H., Nygaard P. (1991) Regulation of levels of purine biosynthetic enzymes in Bacillus subtilis: effects of changing purine nucleotide pools. J. Gen. Microbiol. 137:2387-2394.

143. Schendel F.J., Mueller E., Stubbe J., Shiau A., Smith J.M. (1989) Formylglycinamide ribonucleotide synthase from Escherichia coli: cloning, sequencing, overproducing, isolation and characterization. Biochemistry 28:2459-2471.

144. Schrimsher J.L., Schendel F.J., Stubbe J., Smith J.M. (1986) Purification and characterization of aminoimidazole ribonucleotide synthetase from Escherichia coli. Biochemistry 25:4366-4371.

145. Schuch R., Garibian A., Saxild H.H., Piggot P., Nygaard P. (1999) Nucleosides as a carbon source in Bacillus subtilis'. characterization of the drm-pupG operon. Microbiol. 145:2957-2966.

146. Seeger C., Poulsen C., Dandanell G. (1995) Identification and characterization of genes (xapA, xapB and xapR) involved in xanthosine catabolism in Escherichia coli. J. Bacterid. 177:5506-5516.

147. Segeer C. (1993) Identification and characterization of the xapA gene in Escherichia coli. Thesis, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark.

148. Shankar S., Schlictman D., Chakrabarty A.M. (1995) Regulation of nucleoside diphosphate kinase and an alternative kinase in Escherichia coli: role of the sspA and rnk genes in nucleoside triphosphate formation. Mol. Microbiol. 17:935-943.

149. Shao Z., Lin R.T., Newman E.B. (1994) Sequencing and characterization of the sdaC gene and identification of the sdaCB operon in Escherichia coli K-12. Eur. J. Biochem. 222:901-907.

150. Shatalin K.Y., Neyfakh A.A. (2005) Efficient gene inactivation in Bacillus anthracis. FEMS Microbiol. Lett. 15:315-319.

151. Shiio I., Ishii K. (1969) Regulation of purine ribonucleotide synthesis by end product inhibition. EL Effect of purine nucleotides on phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase of Bacillus subtilis. J. Biochem. 66:175-181.

152. Shin B.S., Stein A., Zalkin H. (1997) Interaction of Bacillus subtilis purine repressor with DNA. J. Bacteriol. 179:7394-7402.

153. Sinha S.C., Smith J.L. (2001) The PRT protein family. Curr. Opin. Struct. Biol. 11:733-739.

154. Smith J.L., Zaluzec E.J., Wery J.-P., Niu L., Switzer R.L., Zalkin H., Satow Y. (1994) Structure of the allosteric regulatory enzyme of purine biosynthesis. Science 264:1427-1433.

155. Tabolina E.A., Rybak K.V., Khourges E.M., Voroshilova E.B., Gusyatiner M.M. Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia. US Patent 2005/0239175, 2005.

156. Tsai M., Koo J., Yip P., Colman R.F., Segall M.L., Howell P.L. (2007) Substrate and product complexes of Escherichia coli adenylosuccinate lyase provide new insights into the enzymatic mechanism. J. Mol. Biol. 370:541-554.

157. Vieira E., Slaw E. (1961) The utilization of purines in the biosynthesis of folic acid. J. Biol. Chem. 236:2507-2510.

158. Vieira J., Messing J. (1991) New pUC-derived cloning vectors with different selectable markers and DNA replication origins. Gene 100:189-194.

159. Vincent M.F., Marangos P.J., Gruber H.E., Van den Berghe G. (1991) Inhibition by AICA riboside of gluconeogenesis in isolated rat hepatocytes. Diabetes 40:1259-1266.

160. Vitreschak A.G., Rodionov D.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. (2004) Riboswitches: the oldest mechanism for the regulation of gene expression? Trends Genet. 20:44-50.

161. Weng M., Nagy P.L., Zalkin H. (1995) Identification of the Bacillus subtilis pur operon repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7455-7459.

162. Westh Hansen S.E., Jensen N., Munch-Petersen A. (1987) Studies on the sequence and structure of the Escherichia coli K-12 nupG gene, encoding a nucleoside-transport system. Eur. J. Biochem. 168:385-391.

163. White B.A. (ed.) (1993) PCR protocols: Current methods and applications. Humana Press, Totowa, NJ, USA.

164. Wrinkler W., Nahvy A., Breaker R.R. (2002) Thiamine derivatives bind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression. Nature 419:952956.

165. Yamaguchi S., Kumiko N. (2000) Umami and food palatability. J. Nutr. 130:921S-926S.

166. Yasuo T., Kusuhara Y., Yasumatsu K., Ninomiya Y. (2008) Multiple receptor systems for glutamate detection in the taste organ. Biol. Pharm. Bull. 31:18331837.

167. Zakataeva N.P., Aleshin V.V., Tokmakova I.L., Troshin P.V., Livshits V.A. (1999) The novel transmembrane Escherichia coli proteins involved in the amino acid efflux. FEBS Lett. 452:228-232.

168. Zalkin H. (19936) The amidotransferases. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 66:203-309.

169. Zeng X., Galinier A., Saxild H.H. (2000) Catabolite repression of dra-nupC-pdp operon expression in Bacillus subtilis. Microbiology 146:2901-2908.

170. Zeng X., Saxild H.H. (1999) Identification and characterization of a DeoR-specific operator sequence essential for induction of dra-nupC-pdp operon expression in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 181:1719-1727.

171. Zgurskaya H.I. (2009) Covalently linked AcrB giant offers a new powerful tool for mechanistic analysis of multidrug efflux in Bacteria. J. Bacteriol. 191:17271728.

172. Zhang Y., Morar M., Ealick S.E. (2009) Structural biology of the purine biosynthetic pathway. Cell Mol. Life Sci. 65:3699-3724.

173. Zhou G., Smith J.L., Zalkin H. (1994) Binding of purine nucleotides to two regulatory sites results in synergistic feedback inhibition of glutamine 5-phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase. J. Biol. Chem. 269:6784-6789.

174. Zimmerman H. (1992) 5'-Nucleotidase: molecular structure and functional aspects. Biochem. J. 285:345-365.

Информация о работе

Шеремет, Анастасия Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Поиск и изучение транспортеров, осуществляющих экскрецию пуриновых соединений у штаммов Bacillus и Escherichia coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы