Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование штаммов Escherichia coli с терморегулируемым синтезом треонина и изолейцина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование штаммов Escherichia coli с терморегулируемым синтезом треонина и изолейцина"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

Для служебного пользования

Экз. №/3_

РОДИОНОВ Олег Александрович

КОНСТРУИРОВАНИЕ ШТАММОВ Escherichia coli С ТЕРМОРЕГУЛИРУЕМЫМ СИНТЕЗОМ ТРЕОНИНА И ИЗОЛЕЙЦИНА

03.00.03. — Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1995

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: доктор биологических наук кандидат биологических наук

Е. М. Хургес

Д. А. Перумов А. С. Яненко

Ведущая организация — Институт молекулярной генетики РАН.

Защита состоится « в »иння 1995 г. в 11 час__мин.

на заседании диссертационного Совета Д.098.12.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИГенетика.

Автореферат разослан _»__ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

ОБЕЦЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Треонин и изолейцин относятся к числу к называемых незаменимых аминокислот, которые должны поступать в ор-яизм человека и высших животных с пищей Будучи незаменимыми иноКислотаын, треонин и изолейцин. находят широкое применение как в шо'тноводстве — в качестве добавок к кормам, так и в медицине — и парентерального питания. В связи с тем, что вышеуказанные отрасли гсьг-швают большую потребность в незаменимых аминокислотах, следования, св$.-.анные с разработкой н рационализацией методов их лучения, ' представляются весьма актуальными. Большинство незаменимых иноки слот получают методами химического синтеза, а также путем гид-низа белков. Однако в настоящее время получгл ргспростране-е ферментационный метод, основанный на использовании бактериальных аммов-продуцентов. так как он позволяет получать аминокислоты только в

биологически активной L-форме. Именно гомогенность получаемого проста составляет основ.юе преимущество этого метода перед методом хнми-:кого синтеза, конечным продуктом «оторого является смесь стереоизоме-

I.

Регуляция биосинтеза треонина и изолейцнна в бактериях, и в частности Escherichia coli, достаточно хорошо изучена. Она включает ингибирование эчевых ферментов биосинтеза конечным продуктом, а также аггенюаиню нскрипции соответствующих генов. При этом треонин синтезируется из арагиновой кислоты, а изолейцин— из треонина (рис.1). Таким образом, онин является предшественником изолейцина и необходим дли его синтеза. >ые того, изолейцин относится х разветвленным аминокислотам, и его тез тесно связан с синтезом родственных ему аминокислот — валина и дина. Знание вышеуказанных закономерностей, позволяющее еналравленно получать мутации, обеспечивающие сверхсинтез этих иокислот в клетках, с одной стороны, и методы генной инженерии, с другой позволяют создавать вьгсокспродухтивные штгммы-прод^цег.тг; треснипа н лейцина.

Цель работы. Исследования, проведенные в настоящей работе, были на-вденк на конструирование высокоэффективных штаммоа-продуцентов трео-л н изолейцнна с терморегулируемой экспрессией генов биосинтеза этих иокислот. Для »того структурные гены соотзетству?с::сих спероноз без

Аспартат

' АК I* (thrA) АК И (tnelL) АК III OysC)

Лизин аспар™л-

\ фосфат

|аПДГ (asd) аспартат-полуальдегид I ГДГ I* (thrA)

Иэолейцин ТрВ

а-кето-р-метил-валериат

Ва^ин Лейцй*

(UvE) ТрВ

(avtA) ТРС

а-кетоизо-валериат

I ГДГ И (melL) MQi

гомосерин

UhrB)

Метион'

ж

(ltvD)

гомосерин-фосфат

| ТС (1ЬгС)

Треонин ТД" (ilvA)

L-—»а-кетооутират

а.р-дигидрокси-р-метилвалериат

|ир (ilvC)

а-ацстогидрокси-бутират

САОК Г** CAOKII САОК III***

ДГ

а,р-дигидрокси-изовалериат

ир J

а-ацед-олактат 'CAOKI

(ilvBN) (UvGM) САОК II

(МН)"

nipylar

пир;

ват

Рис.1. Биосинтез треонина, нзолемцина и валина. АК I, II, III — гспартокиназы I, II, III; АПДГ—асчартзтполуальдсгидпеп1Я.ро1-енлза; ГДГ !, II — гомосеринаегкдрогеназы I, И; ГК — гомоссринлинала; ТС — треонинглштаза; ТД — треониндезаминаза; САОК I, И, III — сннтазы I, 1!, Hi ацктогнд)чч "HKiic.iov, ИР — нзомероредухта.о ацетогидроксмхвслот; ДГ — де-гнарата;;л дноксикис.>.".т; ТрВ — трэлсамнназа В, ТрС — трансамилаза С. * — фермент ин-гибкруется треонином. * * — иигнбируетсл изолсГадпмом.. *** — ннгибируется валяно«. В слиО.-.ix указаны гены, кодирующие соответствующие ферменты биосинтеза. "

■вогх регуляторных участков были клонированы под контролем терморегули-lyeworo промотора PR фага % в составе мультикопийных плазмид. Предполагаюсь, что штаммы с такими плазмидами могли бы обладать некоторыми прей-|ущсствами. Например, отсутствием у них репрессии генов биосинтеза трсо-ина и изолейцина, так как стратегия встраивания их под контроль терморегулируемого промотора, предполагала удаление аттенюаторов транскрипции, редшествующих этим генам. Другим преимуществом могла бы стать озможиость регулирования уропня биосинтеза ' этих аминокислот в летке с помощью температуры, что позволило бы подбирать условия, при зторых рост культуры и продуктивность клеток были бы оптимальными, роме того, предполагалось, что встраивание генов биосинтеза треонина и юлейцина под промотор более сильный, нежели их собственный, позволит элучить штаммы, продуктивность которых была бы выше, чем у ранее полу-:нных штаммов-продуцентов.

Научная новизна. Впервые проведено клонирование генов биосинтеза еонина и изолейцина Е. coli К-12 под контролем терморегулируемого лромо-ра Рц фага X. Показано, что путем повышения температуры можно достать более высокого уровня их экспрессии, чем тот, который возможен при эк-рессии этих генов с их собственных промоторов. Показано, что уровень син-3S треонина и изолейцина клетками, содержащими полученные в настоящей боте плазмиды, можно регулировать с помощью температуры. Сконструиро-н быстрорастущий штамм-продуцент треонина, уровень продукции которого гулируется температурой и не подавляется экзогенным изолейщ-шом. Скопирован штамм-продуцент изолейцина, в клетках которого находится плаз-да содержащая под контролем промоторов Рд как гены биосинтеза треонина, с и гены биосинтеза изолейцина. Этот штамм не нуждается для синтеза изо-5цина в экзогенном треонине в качестве предшественника.

Структура н объем диссертация. Диссертация состоит из следующих щелав: ззедения, обзора литературы, посвященного регуляции биосинтеза ;онина и изолейцина, экспериментальной части, включающей обсуждение ¡ультатов, и выводов. Изложена на № стр. машинописного текста, включает рисунка и 11 таблиц. Список цитированной литературы содержит 213 на-жований.

Апробация. Материалы диссертации докладывались на IV-ой Республн-[ской научно-теоретической конференции молодых ученых и специалистов фобиологов, Ташкент 1989, на семинарах лаборатории генной инженерии и ела биотехнологии ГНИИГенетика, а также на совместных семинарах с ныыи фирмы "AJINOMOTO" (Москва 1991 — 1993, Токио 1992 — 1993).

з

Штамм-продуцент треонина, сконструированный в настоящей работе, был зап тентован в СССР, подана заявка на получение патента США.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы, плаэмнды, фзгн н среды. Штаммы Е.сс К-12, плазм иды н фаги представлены в табл.1.

Таблица 1. Бактериальные iштаммы, фаги н плазмиды

Штаммы, шшмиды, фаги

Генотип

Ссылка или неточных

Штаммы Е. colt К-12

1-17 1-17' КХЗГ, V1.472 VL527 УШИ

tixi-6 tix;-7

[

X i>i!v2l \ ,)ili-2I-'R2

Фаги

Плдя«*иды

рР!«7 р: '.439

pAYC32 •

pYNT

¡iVIC'50'

pi'ИТ 14

рРКТ614

pVRl

pVR",04

pV!i60-1

pVRT21

pVRT43

ik-S17

Клк 1-17, но sac+ Knx !-17. но ileS* thrC ¡IvA sac+ thrO ilvA

thrA::Tn9 ilvG5 ilvA7434 ihS17 thKI ilvA442 idh Как TDO-Ъ, 1ю ilvA+

Содержит гены ilvGMEDA YC дикого типа iivG5MEDA7434 YC

ApR, Рр-промотор, его' и cI857 Как pPR37, но содержит сайт Cla I для клонирования SmR , ApH ApR, thrABC SmR, IhrABC

Арй, cI857—Pjj—thrABC SmR, c!857—Pr— thrABC . TcR. iM35MEDA7434 и iWYC ApR , cI857—Pr—ilvG5M£DA7434 Smn, d 857 —Pr—ilvG5MEDA7434 SmR, cl857—Рд— ¡M35MEDA7434 Рц—thrABC

Обличается от pVRT21 ориентацией IhrABC

и

ih'YC и iWYC и UvYC,

Гаврилоаа О. Ф. Лившиц В. А.

Гусятине р М. М. Данная работа

Лаг^епаеп Р. Данная работа

Лапндус А. Л.

Чистосерлов А. Лвт.свид.№69464 Авт.свид.Л»8|75Ь6 Данная работа

II качестве полноценных сред использовали Ь-бульон, Ь-агар, бульон I аг.ф Хогт.шгера, в качестве минимальной среды — жнл.-:ую илз агарнлоьикпую среду Лдамса. Антибиотики добавляли до следующих конечны: концентрация (мкг/мл): ампициллин — 100, стрептомицин — .100

тетрациклин — 20. Для поддержания ' роста ауксотрофных штаммов минимальная среда содержала, глюкозу— 0,4%, тиамин — ! м-:;-/мл я аминокислоты (если . не оговорено специально) — 50 мет/мл. 1л я проведения ферментации использовали стандартные ферментационные cs*,^.

Измерение активности гомосериндегидр<}[£нз.зы провел/ли г. бесклеточных экстрактах по методу, предложенному J. С. Pctte с соав.х; : (1963). Удельную активность выражали в микрс.молл.ч НпД-восстановленного за 1 минуту, в пересчете на 1 мг белка (чкМ НАДФ/м::;! ■ мг белка).

Измерение активности треониндезаминазы проводил;; в оескле-точных экстрактах колориметрическим методом Т. Б. Frieikm;;nn и G., F. Haugen (1943), основанным на определения концентрации а-кетобутирата в присутствии 2,4-динитрофенилгидразина. Удельную активность выражали в микрограммах а-кетобутирата, синтезкрэванного за 1 минуту, в пересчете на 1 мг белка (мкг а-кетобутирата/'мин • мг белка).

Термоиндукция. Ночные культуры штаммов заращенные в L-бульоне' с антибиотиком при ?8—30°С, разводили в 50 раз в свежей среде того же состава и продолжали выращивание при той же температуре. В середине логарифмической фазы роста каждую клеточную культуру делили на две равные части. Одну часть помещали в баню с температурой 42-—43°С, другую — инкубировали црн комнатной температуре. Через 15 минут культуры вновь помещались на качалку. При этом индуцированные культуры выращивали при 39—4?РС, а неиндуцированные — при 28—30°. Культура.тьные пробк, отобранные через определенные интервалы времени после термлнндукции, использовали для измерения ферментативных :-, .тиьностей.

Определение концентрации аминокислот в культуральной жидкости. Концентрацию аминокислот определяли методом бумажной или тонкослойной хроматографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конструирование штамма с терморегулируемым синтезом треонина 1.1. Конструирование плазмкд н их свойства

Для' обеспечения терморегулируемого синтеза треонина в клетках щтам-моя Е. coli К-12 структурные гены треснннсвого сперона thrABC клишировали под контролем терморегу.тар'уего промотора Pr фага X. В качеств лектора испслъзовзли плазкиду pPR39, з качестве "^егг^жка^треониносых > нов —

2-М2, • . ~..... • ..' •

Вв1 II ' 1ашН I

еЬкС

плазмиду рУК7. Плазмида, полученная в результате проведенного клонирования была обозначена как рР!Ш4 (рис. 2).

Изучение свойств плазмида рРКГ14 было проведено с помощью реципиентного штамма ТОС-б, ауксотрофного по треонину и изоЛсйцину. Как видно из таблицы 2, ''ч\ клетки этого штамма с плазмидой рРЯТН

9,4 т.п.н.ДргЬ !—р6ь I пр^ высеве их на минимальный агар Адамса / были протрофными при 37°С и оставались

изблойциноаыми ауксотрофами при 28°С. Да-лное обстоятельство . объясняется природой их изолейциновой ауксотрофности: присутствующая в них мутация ИуА442 ке инактивирует первый фермент биосинтеза изолейцина — треониидезаминазу, а лишь снижает его сродство к треонину. Таким образом, изольйциноваяауксотрофность в клетках штамма ТОй-б может

Рис.2. Физическая н рестрикционная картг. плззмиды рР1Ш4.

Таблица 2. Влияние температуры на фенотип клеток штамма

Плазмида Температура Фенотип

Без плазмиды 28-С ТНН-

37*С ТНЙ* 1ЬЕ*

рРЯТН 28°С ТНЙ+1ЬЕ-

37°С ТНГ1+11.Е+

рУМ 28°С ТНЙ+ИЕ+

37"С . тшг+ИЕ+

супрессироваться высокими концентрациями треонина. Наблюдаемы!1 температурозависимый фенотип клеток этого; штамма с плазмидой рРКТ!^ указывает на то, что при 37°С содержание треонина в" них выше, чем при 28"С что ь свою очередь свидетельствует о том, что экспрессия генов биосинтез) треонина на вышеуказанной плазмиде подвержена терморегуляции. О том ж< самом свидетельствует и повышение удельной активноеп гомоссриндсгидрогеназы — продукта гена 1ЬгД — й клетках штамма Т1Хл-6 < плазмидой рРКТИ после их термоиндукции и отсу. ;твие подобного эффекта ] клетках с плазмидой рУ№, содержащей те же самые гены, но под контроле» их собственного промотора (рис. 3). , '.

100

È

И-с индукцией □ -без индукцни О-с индукцией О-без индукции.

л ь о о

я «

я

>5

Ркс.З.Термонндукция гомо-сериндегидрогеназы ЦГДГ) в клетхах штамма TPG-0 с ллзгмидзми pPRTJ4 ч pYN7.

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Время ггосле тершжндукгши (часы)

При этом важно отметить, что уровень экспрессии треонино-вых генов, достигаемый после термо-инду<ции в клетках с pPRTH, сущс стоенно превышает уровень их экспрессии в клетках с шшмидой pYN7.

Таким образом, на основании гемпера-турозависимого характера экспрессии гомосериндегидрогеназы в клетках с pPRTM можно сделать по крайней мере два вывода, Первый — что треонииовые гены на плазмиде, pPRT14 встроены под контроль терморегулируемого промотора Рр, и второй — что они »кспрессируются'.с этого промотора намного эффективнее, чем со своего собственного. Тем не менее плазмида рРНТИ характеризовалась низким уровнем сегрегационной стабильности (рисА). Причт фактором, провоцирующим сегрегационную нестабильность этой плазмида била температура: особенно драматический эффект на уровень ее сегрегационной стабильности оказывала высокая температура 37°— 42"С, .,

Стабильный вариант плязмиды, обеспечивающей терморегулируемую экспрессию треониновых генов, был получен путем клонирования большого Ват И Ь—Psi I-фрагмента плагмида pPRTM в составе ректс?цон п.п азмиды pAYC32, созванной на оснопс RSFJ0I0. Полученная таким образом гибридная плазмида рРПТбИ (рис б), была еегрегшшпно стабильной: при всех испытанных температура доля клеток, потерявших плазмиду, никогда не превышала 2%,

Плазмида рРЯТбИ была иснытзиа >;а способность обеспечивать сверх лро-дукциго треонина в клетхах штамма TDG-6. С этой целью их кулътшзпрг^зли г;

60

1 • а <

и

3 80 »

к ¡г

о I-

и >>

40

аз о

ч о

к

к к , о

«Ч

После 20 генераций После 40 генераций

20

0

28 34° 37° 42° 28° 34° 37° 42°

0 рРКТМ

рРПЗЭ

Рис.'1. Сегрегационная стабильность плазмид рРРШ4 (гибридной) и рРГ$9 (векторной) в к.-'с.кал шгамма ТОО-6 при разных температурах. Ночные культурь-, выращенные из омсльных ампициллин-устойчивых колоний (Ар®) в Ь-бульоне с ампициллином (Ар) при 28° С, р.овздили до титра 10- в той же среде, но без ампициллина, и выращивали при указанных тс:.:пс[-'"¡гурах. По достижении стационарной фаза роста, что соответствовало приблизительно 20 клеточным генерациям, культуры вновь разводили до исходного титра и продолжали > £.цраи.ивать ир*-! тох же условиях. После хаждопз такого цикла культуры высьв«:1И на ага-риясЕйи):ую с>:-ду Хогтингера. Среди выросших колоний методом реплик определяли долю }ст«и-шбзд ч .'.»пициллику.

ВагаН 1 Ь-ВД II

/Г:

// рратб14 • . .

Ц ~1ЙТ.П.Н. ^

X \

р* I

Л\ г?'' ■ ^

Рнс.5. Фялгческдя и рестрикционная карта плазмиды рРЕТ514.

>ерментаиионнон среде с сахарозой, в пробирках. Оказалось, что по с;: о ой пособнссти обеспечивать сверхсинтез треонина з клетках плазчида pPRTo! 1 е уступает плазмиде pVIClO. использованной ранее для конструирсаанил ¡тамма-продуиента треонина ВНИИГенетпка-6'10. Клетки как с о ".не ¡ лазмидей, так и с другой накапливали в культуральной жидкости в те^с-рие 8 часов до 20 г/л треонина. При этом способность плазмиды pPRTfii 1 обй-печивать продукцию треонина носила ярко выраженный темпе.ратурозаписн-нй характер (табл. 3).

Таблица 3. Влияние температуры культивирозлния на продукцию

треонина метками штамма TDG-5 с плазмидами рРКТбН и pVíCiO

Плазмида Температура Треонин Продухтипностъ

(т/а)

28° 4.8 0.3

PPRT614 37° 7.2 0,5

40° 19,4 1,0

28° 20,3 1.1

pVIC40 37° 18,5 1,1

40° 19.2 0,0

Культивирование в пробирках в течение 48 часов в ферментационной среде с сахарозой. Продуктивность — отношение концентрации треонина в срс-де к оптической плотности культуры.

Так как перед треониновыми генами на вышеуказанной плазмнде нет тенюаторз транскрипции, представляло как научный, так и практический гтерес выяснить, подвержен ли синтез треонина в клетках с плазмндой *ЙТ614 негативной регуляции. В связи с этим проводили ферментацию в >исутствии экзогенного изолейщша — аминокислоты, участвующей в тенгоации треонинового оперона (табл.4).

Как видно из таблицы, экзогенный изолейцин не влиял на синтез сна клетками с плазмндой рРЯТ6]4, тогда как бактерии с плазмндой ЯС40 заметно сниждлн спою продуктивность.

Таким образом, мы получили пдазмиду рРКТбМ со структурными ген:;" ! еотшового оперона под контролем термсрегулнрусмсто промотора Р^. [азмида дает возможность регулировать экспрессию указанных ген.:!! ~ 1Мощыо температуры и о'беспсчивает сверхсинтез треонина, уровень кот«", '

не подавляется изслейцином и зависит только от степени термоинактивации

рсгрсссора Обо/.

Таблица 4. Влияние экзогенного пзолейцина на продукцию тресшша клстксми штьмма ТОй-б с плазмидами рРИТбИ и рУЮЮ___

Эашгекный Продукция

Плазммда изелеыц,«! <г/л) треонине (г/л)

0.00 19.5

рРЭТбН о.сз 19.8

1.00 19.2

о.ос- 20.4

р\1С40 ' 0.05 16.5

1.00 5.3

Клетки штампы с слазм-даки ррЛТ614 в р\ЛС40 (ырввшшдя » пробирках,

» ферментационной среде с изолейдивом и без яего, при 40 С и 37°С, ^-ротвегствсвяо, » течсиие 48 ч»со».

1.2. Создание реципнснтвого штамма

Бес треонкноеие продуценты, ранее полученные в нашем институте, содержали хроеосокшую кутанию йуА442. Низкая концентрация изолейцина, которая создается в пленках ь результате этой мутации, дерелрессирует гены биосинтеза треонина. Как было показано, мутация ¡1уА442 вносит существенный б клад в обеспечение высокой 1фоду~тивносш штаммов: штаммы без этой кутании продуцируют в 2 раза меньше треонкй-з. Однако низкое содержание и. плейцина в клетках штаммо&продуцентов иегаткйпг сказывается на скорости их роста.

Поскольку треонишвые гены на плазмиде рРйТбН не содержат аттенюатор!, а изолейцин не- подавляет продукцию треонина в клетках с этой плазмн-дой, -о надобность в мутации ПуА442 отпадает. Поэтому с помощью транедук-IV:и мк заменил» кутг' :тный аллель 1>»-А442 в клет аХ штамма ТШ-6 на ген ¡и Д дикого типа. Полученный таким образом новый решпнентный штамм обозначили как ТОО-?. Г л вьедении в клетки этого штамма плазмиды рРНТбИ был получен штамм ТОа-7(рРСТ614) — его скорость роста значительно выше, чему штамма Т1ХЬб(рР{ГГ614), и ьь зависит от присутствия ¡¡золеймкна в среде (рис.6). Так как указанное различие между двумя штам

Рис.6. Кривые роста штаммов Т1М5-7(рРЙТб14) и ТЕК|-6(рРкТ6}4) в минимальной :реде Лдамса с изолейцином и 5ез нчмейцина. Культивирование в колбах при 34'-'С.

«ами наблюдали при 34°С, когда уровень продукции треонина клетками с илазмидой рРИТ614 весьма невелик, то можно было предположить, что скорость роста штамма ТОО-7(рР11Т614) не зависит, или почти не зависит, от уровня дерепрессии треонинового опсрона на плазмиде рРКТ614. В то же зремя уровни продуктивности этих штаммов при ферментации в пробирках оказались практически одинаковыми (результаты не пригодятся).

Таким образом, в результате сочетания ренипиентного штам'.м Т1Х!-7 н плазмиды рРПТ614 был получен штамм ТОО-7(рРРЛ'6М) — . ,-оду!ю;т греоннна. Оч отличается от продуцентов, полученных ранее, тем чтг содержит мутации ¡1уА442, скучающей скорость роста клеток, V, те*.;, продуктивность этого штам:.:л загасит только от температуры ку.'ллштри-ак:.; л не зависит от аминокислотного состава фермент;луюннои средь'

1.3. характеристика итамма ТОС-7 (рРНТ614) — продуцента

треонина

Относительно полная характеристика штамма ТОО-7(рРР.Т6И) как про дуне.нта треонина была получека при культивировании , его в ферментерах !1?е;кд1- всего представляло интерес определить оптимальную температуру дл* ивироиания этого штамма. С этой целью его выращивали при разных температура?:, охватывающих диапазон 35° — 40°С (рис. 7).

СП

" 40

§

= 20

2. 10 >>

н £

>.

л »-

о о

н

с к с

к <0 ¡С о

V

(С

$0 40

за 20 ю

35*С

36 С

з?с

во

ьо

40

30 20 10

4 » и К »24 за 31 36 « < * 3 1620 34» 3*36 40

Время (часы)

Рхс.7. Влияние температурь! продукцию треокиаа кяетк." в штамма ТОС 7(рРКТ6|4)-

Культквироыгчие в фермеигере, л стандартной <{>ерментацио:шой среде с сахарозой. Белыми квадратиками показаны кривые уоста культур, черныш» кружками — кривые накопления трсонша.

Из рисунка видно, что при 35° — 37°С продукция треонина была незначительней, в то времк как при 38е — 40°С она достигала довольно высокого уровня. Увеличению продукции треонина также сопуитповал рост коэффициента конверсии сахарозы в треонин (отношение синтезированного тре-

энина к количеству потребленного сахарз). Интересно отметить, что повышена температуры всего на 1°С (с 376 до 38"С) приводило к двукратному увеличению коэффициента конверсии. В то же время самый высокий коэффициент конверсии — 47% соответствовал 39°С. Таким образом, вышеуказанна температура, по-видимому, является оптимальной для. культивирована щтамма ТОО-7(рРКТ614). Как видно из рисунка 7, рост клеточкой сультуры при все испытанных температурах проходил одинаково и не зависеч >т продукции треонина. По-видимому, клеткам продуцента хватает ресурсов сак для обеспечения собственного деления, гак и для сверхсинтеза треонина. 3 связи с этим было высказано предположение о том, что повышение темпера-гуры (термоиндукция ) на любой фазе роста культуры должно вызывать юзрастание уровня ферментов биосинтеза треонина в клетках и :оответственно увеличивать продукцию треонина. Для проверки этого федположения, сравнили удельные активности гомосериндегидрогеназк, фовни продукции треонина и коэффициенты конверсии клеточных культ} юдвергшихся термоиндукции на разных фаз:- роста (рис. 8). А

120 (ОС1 эо

Е>

20 £Я

1 I

Г -т

г

г."

0 3.1 5 В,5 13^5

I»- Ф-» 6- Ф*

во

40 20 О

Трвоиия (г/я) 1

И

I

О 3,* 5 8.5 13,5

50 40 3020 М> О

Кскгерскя (%)

Рнс.£>. Термоиндукция хлеточной культуры шт-мма ТЕЮ-7(рРКТ614)

на разных фазах ее роста при культивировании ■ лабораторном 4 :рнен-тере, з стандартной ферментационной среде с сахарозой. А — кривая роста хультуры: . стрелками с числами показаны моменты проведения термоиндукции. Культивирование начинали при 35°С, и по достизкеччк клетками определенней фазы ростг температуру в ферментере повышали

¡о 333С (тсриоиндукция).Б— максимальные з.чгче!1ия: удельной активности гомосеркпгегилро-еназы, продукция тртеьннэ :> .тэнверсин сахарозы в треонин после термоиндукции клеточной ;ультуры ухагашого штамма на разных фазах ее роста.

Стационарная флаа (с. ф.) Экспоненциальна* фаз» (>. ф.) гЛ»г-фма (л. ф.)

3£ «I

Время (часы)

® Уд. актипиостъ

гоиосеряндегидрогеназа

30

О 2,5 Ь 8,5 13,Ь

[>• Ф-1 с- Ф1

Время начала термовндукцин (чэсы)

Как видно из рисунка 8, чем позднее фаза роста, на котору приходится термоиндукция, тем хуже индуцируется треониновый оперон соответственно ниже продуктивность биомассы. Таким образом, можн считать, что оптимальным режимом для культивирования юте то к штамм TDG-7(pPRT614) является режим, при котором рост клеточной культур: происходит при постоянной температуре 39°С.

После оптимизации процесса ферментации было показано,. чт полученный в настоящей работе штамм TDG-7(pPRT614) способе накапливать за 35 часов ферментации более 85 г/л треонина с коэффициента конверсии более 40%. Кроме того, при использовании в качестве источник углерода мелассы — отхода сахарного производства — этот штамм име коэффициент конверсии не меньше, чем при культивирований.его на среде сахарозой, что выгодно отличает его от штамма-Продуцента треонина, пс лученного ранее.

Таким образом, мы получили штамм-продуцент треонича, характеризую щийся следующими особенностями: ; морегулируемым синтезом треонина высокой скоростью роста, отсутствием подавления синтеза треонина йзолейци ном и высоким коэффициентом конверсии как при росте на среде с сахарозой так и на среде с мелассой. •

Ввиду того, что треонин является предшественником изолейцина, i рамках настоящей работы п';заставляло интерес получить продуцент изолейци на, поскольку изолейцин в норме подавляет синтез треонина, в то время Kai принцип регуляции биосинтеза треонина, осуществленный в настоящей работе

исключает такую возможность. ;

2. Конструирование штамма с терморегулируемым синтезом

изолейцина

2.1. Клонирование генов биосинтеза изолейцина

В качестве донора генов бнсо нтеза изолейцина был использован штамм VLS91, содержащий две регуляторные мутации — ilvA7434 и ilvGS, обеспечива ющне сесрхси;пез изолейцина. Первая муташг; обусловливает устойчивосп ,азы к ретроингмбнрованшо изолейцином, Вторая — увеличивает уровень транскрипции оперона ilvGMEDA и приводит " образованию валин устойчивой синтазы ацетогидроксикислот II. Сначала гены биосинтез* изолейцина из вышеуказанного штамма были получены в составе фага. Для ьгого фаг / pilv21, несущий'кластер ilvGMEDAYC дикого типа, размножали нг

летках штамма VL891 и отбирали фага, способные трансДуцировать признак alR (мутация ilvG5). Среди 20 отобранных таким образом фагов был Знаружен фаг, обозначенный как kpilv21-R2, который трансдуцировал как утантный ген ilvG5, так и мутантный ген iivA7434. ДНК этого фага спользовали для клонирования ilv-генов в составе плазмиди pBR322. В гзультате была получена плазмида pVR4, содержащая кластер генов fG5MEDA7434 YC из штамма VL891.

Несмотря на то, что амплификация ilv-генов на плазмиде повышает внут-■нслеточный уровень ферментов биосинтеза изолейцина, введение плазмиди VR4 в различные штаммы Е. coli не позволило получить штамм, который кон-гртировал бы треонин в изолейцин. Кроме того, в штамме с мутацией ;S17, снижающей сродство изолейцил-тРНК-синтетазы к изолейцкну, чазмида pVR4 характеризовалась структурной нестабильностью, обусловлен-ж, по-видимому, дерепрессирующим влиянием мутации ileS на ilv-гены. В ¡язи с вышеприведенными фактами было предложено клонировать структур-ые гены оперона ilvG5MEDA7434 под контролем терморегулируемого промо-)ра Рк.

2.3 Конструирование плазмид, содержащих гены биосинтеза изолейцина под контролем промотора PR

Кластер ilvG5MEDA7434YC, присутствующий на плазмиде pVR4, был кло--¡рован в составе плазмиды pPR37, которая содержит терморегулируемый эомотор Рр. В результате проведенного клонирования получили пласлшду /R504, несущую структурные гены оперона ilvG5MEDA7434 под контролем «неуказанного промотора. На следующем этапе конструкция "cI857—Pr— /G5MEDA7434—YC" была клонирована в составе стабильной векторной иазмиды pÄYC32. Полученная таким образом плазмида, обозначенная JK pVR604, обеспечивала высокий внутриклеточный уровень треонин-¡ззминазы после термоиндукции клеток с этой плазмидой (рис.9 А, В).

Удельная активность треониндезаминазы в клетках с плазмидой pVR604 зеле термоиндукции была существенно выше, чем в клетках с плазмидой на которой оперок находится под контролем собственного промотора.

Таким образом, клонирование ilv-геноз под контролем терморегулируемого ромотора Рн позволило не только сделать их экспрессию терморегулиру-ой, но и повысить ее уровень.

Однако, вопреки ожидаемому, плазмида pVR604, будучи введенной в яетки двух изогенных штаммов, отличающихся лишь, аллелями гена ileS, 5еспечшзала сверхсинтез изолейцина только в клетках штамма с мутацией eSi7 (табл.5). Причем ¡сябтяк с гско^ iicS содержание

вышеуказанную плазмиду, не продуцировали изолейцина даже тогда, когдг ферментационная среда содержала треонин.

В

РЛ Г

1 ^ Р. »»

150-

100 500"

Л5 1.0 1.5 II

Время после териошиушдиа |«сы)

Риг.9. А. Физичсска« и рестрихционная карта плазмиды рУИ604. В. Термоиндукция треаьшиеззминазы (ТД) з клетках штамма УХ527 с плазм идами рУН604 и рУЙ4. Индуцированные клеточные культуры выращивали прн 40°С.

Таблица 5. Влияние аллельнаго состояния гена ¡1е5 на способность штамме»

Штамм Ген Пев Продукций нзолейцкнв <г/д) не среде: с треонином без треонина Остаток треонш (г/л)

И7(рУ11604) Пе517 5,7 2,0 0

035(рУПС04) Дикий тип Следы Сл^ды 2-3

Культнви^и^!!:-;'- проводили в яробгрг.ах с фермсатацнонной средой, содержавшей глюкозу (6%) и стрептомицин, с дабаако») ... .::ина (5 мг/мл), либо без нее. Температура— 38°С.

Время — 48 часов.

В настоящее время невозможно дать какое-либо объяснение влиянию стации ЛсЭ17 на способность плазмида рУ1?604 обесечиватъ продукцию изоденшта. Хотя иг результатов измерения удельной активности треониндезамииазы можно заключить, что в штамме с мутацией йе317 имеет

есто дерспрессия нзолеицин-оалиновы.х геноа, клонированных под контролем д, уровень этой дерепрессии не столь значителен, чтобы объяснит:) аблюдаемый феномен дерепрессирующими свойствами данной мутации габл.6).

Каким бы в действительности ни был механизм влияния мут а изолейцин-валиновые гены, клонированные под контролем промотора

аблида 8. Удельная активность треониндезамнназы з гличаюшихся аллельным состоянием гена ileS

штамма.

Штамм

Аллельное состояние гена ileS

Температура

Удельная активноегъ греон и н дезами начы Без Не С

30° 79 «

1-17 ¡IeS 17 4<Г 39 J

30° 156 150

1-17(pVR604) ileS 17

40" 459 450

30° ! о

КХ35 Дикий тип

40° о 0

30" ,6 14

CX35(pVR604) Дикий тип

40° -'91

дельную активность треониндезамнназы изморили з экстрактах клеток, нодсеу-пшцшдсч !40°С) либо не подвергавшихся (30°С) термонндухции. Измерение проводили чего-. 2,5 -^.гл осле термоиндухдии. Так кзх нлазмндз pVR604 содержит ген UvA7434. xos :v:i рео'шндезаниназу, устойчивую х .ретрештибнроваки«--» изол^'.'иноч, а штаммы ¡-17 ¡! КХ7" ген !ivA дикого типа, измерение проводили как а отсутствие, тзк ц 9 прнсутст^и золейшзда (5 !iM) в пробах.

'д, можно утверждать, что наличие этой мутации у реципиент-: — [еобходи.мое ус ловие для сперхсинтеза изолепцинз з клетках..

2.3. Копстру:?розапие плазмкд, обеспечивающих прямой синтез изолейцнна з клетках. Хара^-^рнсгикл продуцента изплрйцчн 1 Как было показано выше, клетки с плазмпдой pVR60-4 KOiORvr.i'wt огенный треонин в изелейцин. Однако полупсине изолейцнна из ->:..<;•■ реонина, по понятным г --¡чинам, невыгодно. П сья я! : >т.'--

п

интерес представляют штаммы-продуценты, способные к прямому синтезу на лейцина, то есть в отсутствие экзогенного треонина в ферментационной сре/ В настоящей работе для создания такого штамма были сконструированы плг миды, содержащие как гены биосинтеза изолейцина, так и гены биосинте треонина. Причем как те, так и другие были подставлены под контроль теры регулируемого промотора Рд.' Были получены две плазмиды рУЛТ21 и рУИ^ отличающиеся ориентацией трсонимовых генов относительно нзол£йцнноз2

Рис.8. Физические и рестрикционные карту плазиид рУ1ГГ21 и рУВТ49.

*

Термоиндукция вызывала одновременное увеличение как гомоссриндега рогеназион, так и треониндезаминазной активностей в клетках с исследуемы! плазмидами (рис. 10)., При атом уровни ферментативных актианостс обеспечиваемых ялазмидэмн рУВТ21 и рУКТ43, были практически такими » как и у плазмид рРПТ614 и рУП604.

Таким образом, объединение в состаае одной плазмиды генов биоси теза треонина и изолейцина, встроенных под контроль промоторов Г позволило получить конструкции, которые обеспечивают в клетк терморегулируемую экспрессию как одних генон, так '' других. В дальней»! исследованиях использовали плазмиду рУЯТ21. Она была введена в .клет штамма 1-17* и полученный таким образом штамм М7'(рУЙТ21) эффектин оттезировал изолейцин даже в отсутствие экзогенного треонина (табл.7). 3 обстоятельство свидетельствует о том, что синтс; изолейцина в данном случ происходит главным образом за счет внутриклеточного треонина, и, еледо! тсльно, плазында рУНТ21 способна обеспечивать прямой синтез изолейцина.

кс. 10. Удельные ахтивиости треониндезлминазы и гомосеринлегндрогеюзи з клетках и-там-I Т1)0-в С плазмнязми рУНТ21, рУНТ43, рУН004 и рРВТ014 с терчомиукадей Л39=С) без термоиндукдии (30°С) Культивирование в ¡.-бульоне со стрсптомищпюм. Время после рмоивдухции — 2,5 часа.

Таблица 7. Продукция изолейцина клетками штамма 1-17' с ;;-ъ:з.унл;зми рУйТ2) и рУИбСИ_

! Продукция изолейцина (г/'л) на среде: Пл&змилг | I Осъ треонина с треонином

1 ' г\'кТ2) 1 11,8 I 12,3

рУШМ 6,6 10,7

Культивирование проводили в пробирках с ферментационной средой, содержавшей стрептомицин и сахарозу (6%), при температуре 38°С, в тг-чеимь 46 часоп. Концентрация добавляемого в среду треонина — 5 г/л.

]Ь*'л характеристики штамма 1-17'(р\'ИТ21) как продуцента изолейци использовали Лабораторный ферментер. Клетки штамма.культивировали ш [; температурах. Било показано, что при температуре 38°С как продукт и.,слейцина, так и конверсия сахарозы в "изолейцин были максимальны! Наб.-

Таблица 8. Температура культивирования и некоторые свойства штамма

Теипгрктурл Прогукцмя ылоясЬинна (г/г) Нродукцма а-аминобутирлтг <т/х) Кокверсца (%> ор суитуры (540 км)

4,6 о' 4.4 28,6

: • 16.8 следы 12.5 28,0

1 | А',!'- 6.3 0,36 11,1 11,5

» Не определилась Не определялась Не определялась Отсутствие роста культуры

Клетки кудьтйыфоеалв и ферментерах М1ииЬЬЫ, е стандартной ферментационной ср< с с.^ро.тон, р отсутствие строт.токкцина, в течение 40 ч. В таблице ааиведе какгиммьиые зкэчыжг ягекдугкых шфвметрЬв да» каждой темпер" ;т>ы.

При температуре выше 38°С наблюдалось замедление культуральцигэ роста вплоть до полной его остановки. При этом в среде обнаруживался а-аминобутнрат, что свидетельствовало о накоплении в клетках а-кетобутнрата вследствие их неспособности переработать его в изолейцин. Последнее, очевидно, связано с неэффективностью синтаз аистогндроксикислот, от уровня активности которых зависит скорость утилизации а-кетобутирата. Накопление токсичного для клеток а-кетоб тирата — наиболее вероятная причина остановки роста культуры. По-видимому, высокая температура неблагоприятно сказывается на активности синтаз зцетогидрокснкислот.

Рчс.И. Ферментация штамма Г17{рУЙТ21) а ферментере — ■ стжкиргжЛ

ферментационной среде с сахарозой, з отсутствие стрептомицина, при

В отдельных экспериментах штамм Ы7"(рУЯТ21) приблиэительло за АО ьчсов накапливал в среде хульттширования более 20 г/л нзолсйцин: Вместг г «золейшнюм в среде обнаруживался п. ¡н, который состаплал от 5 до Ю"4 фовня накопления изолсйцнна (рис. 11).

выводы

ч

1. Осуществлено клонирование под контроль терморегулируемого промотор; Рц фага л структурных генов треонинового оперона Е. coli (плазмид; рРНТбМ) и структурных генов 'изолейцин-валинового оперона Е. col (плазмнда pVRGO-1). Обе плазмиды стабильны и обеспечивают высоки? уровень экспрессии клонированных генов после термоиндукпии.

2. Получен рецнпиеитный штамм Е. coli со сниженной потребностью в ростовых факторах. Введение в клетки этого штамма плазмиды pPRT614 приводит к образованию высокоэффективного продуцента треонина, который способен накапливать в ферментационной среде более 85 г/л треонина за 35 часов, при коэффициенте конверсии сахара в треонин не менее 40%.

3. Показано, что плазмида pVR604 после те,рмонндукции способна обеспечивать продукцию изолейцина из экзогенного треонина в клетках штамма с мута!шей в гене ileS, снижающей сродство изолейцил-тРНК-синтетазы к изолейцилу. •

4. Сконструирована плазмида pVRT21, содержащая одновременно гены биосинтеза треонина и изолейцина иод контролем терморегулируемых промоторов PR. Клетки штамма с этой плазмвдой синтезируют изолейцин, не используя для этого экзогенный треонин.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Родионов О. А., Кричевская С. М., Хургес Е. М. "Клонирование генов биосинтеза изолейцина, несущих регуляторную мутацию". — Тезисы стендовых сообщений конференции "Генетика и биохимия микроорганизмов — биотехнология", Москва, 1986, стр. 6—7.

Гаврилова О. «Т>., Кричевская С. AL, Лившиц В. А., Николаевская Е. Ем Родион -л О. А., Хургес Е. М., Козлов 10. И. "Амплификации генов биосинтс.1 изолейцина, несущих регуляторную мутацию, в клетка?: Е. coli К-12". — Биотехнология, 1988, т.4. № 5. стр. 600-607.

Гаврилова О. Ф., Миронов А. С., Николаевская Е. Е., Родионов О. А., Хургес Е. М. "Генетическое картирование мутации i!vA7434, обеспечивающей устойчивость треониндезамнназы к иигибироианню и.шлеГпи-ном у Escherichia co!i".— Генетика, 1988, т. XXIV, N° 1, стр. 13—22.

Родионов О. А., Гаврилова О. Ф., Болотин А. П., Хургес Е. М.

"Мутация, приводящая к повышенному синтезу изолейцина, нзмсп-лст свойства треониндезамнназы". — Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", Пущино. 1988, стр. 101.

Гаврилова О. Ф., Родионов О. А., Хургес Е. М. "Транспозонный мутагенез плазмиды, содержащей гены биосинтеза н изолейцина и валнна". — Там же, стр. 6.

Родионов О. А., Гаврилова О. Ф., Хургес Е. М. "Терморегулируемая экспрессия генов ilvGMEDA-оперона в клетках Е. coli К-12". — Тезисы докладов lV-ой Республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых и специалистов микробиологов "Биология, культивирование и биотехнология микроорганизмов", Ташкент, 1989, стр.77.

Гаврилова О. Ф., Миронов А. С., Родионов О. А., Хургес Е. А1. "Влияние дозы генов биосинтеза изолейцина на экспрессию ilv-опероиои у Escherichia coli". — Там же, стр.73.

Патент СССР №1714927 "Штамм Escherichia coli — продуцент I. треонина, 1991.

О Лит. снидетсльстно СССР №1759023 "Штамм Escherichia coli -продуцент L-изоленцкна", 1991.

Лшпшаа » n«n 1»х*!-ФМ(М1Л&. оемы 1.5 ti. ж. Тир. И an. (Watt» дфолои. )к. JO

АО .Ч«ет*»*есжжж UM«. Моом. Чгаотл кna, 1Яа