Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли протеинкиназы Pho85p в регуляции метаболизма дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Попова, Юлия Георгиевна

Введение.

Глава I. Циклин-зависимые протеинкиназы в регуляции клеточного цикла и метаболизма у эукариот (Обзор литературы).

1. Введение.

1.1. Фосфорилирование как способ модификации активности транскрипционных факторов.

2. Структура и функции протеинкиназ.

3. Регуляция активности CDK.

3.1. Первый этап активации CDK - взаимодействие с циклинами.

3.2. САК (CDK-activating kinase) взаимодействует с протеинкиназным комплексом и активирует CDK.

3.3. Тирозиновая протеинкиназа ингибирует активность CDK.

3.4. Действие фосфатаз семейства CDC25 восстанавливает активность CDK.

3.5. Белки CKI ингибируют активность CDK.

3.6. Влияние белков CKS на активность CDK.

4. Семейство CDK дрожжей S.cerevisiae.

4.1. Роль Cdc28p в регуляции стадий клеточного цикла.

4.2. Kin28p фосфорилирует С-концевой домен большой субъединицы РНК-полимеразы II.

4.3. Caklp регулирует активность протеинкиназ.

4.4. Ssn3p в составе комплекса холоэнзима РНК-полимеразы II регулирует транскрипцию различных генов.

4.5. Общие свойства Pho85p и Cdc28p.

5. Роль Pho85p и циклинов семейства Pel в регуляции клеточного цикла и метаболизма S.cerevisiae.

5.1. Участие Pho85p-Pcllp и Pho85p-Pcl2p в регуляции стадии Gi клеточного цикла.

5.2. Влияние Pho85p-Pcllp напротеолиз Siclp.

5.3. Участие Pho85p-Pcl2p в регуляции реакции клетки на воздействие афактора.

5.4. Роль Pho85p-Pcl9p в регуляции перехода от стадии М к стадии Gi клеточного цикла.

5.5. Pho85p и циклины подсемейства Рс11,2 участвуют в регуляции морфогенеза.

5.6. Функции Pho85p и циклинов Рс18р, PcllOp, и Pho80p в регуляции накопления гликогена.

5.7. Pho85p-Pho80p репрессирует стресс-индуцируемые гены.

5.8. Влияние Pho85p на стабильность белка Gcn4p.

6. Участие Pho85p в метаболизме фосфата.

6.1. Структурные гены кислых фосфатаз.

6.2. Протеинкиназный комплекс Pho85p-Pho80p регулирует синтез рКФ.

6.3. Позитивные регуляторы экспрессии гена РНОЗ.

6.4. Фосфорилирование Pho4p.

6.5. Белок Pho81p ингибирует активность Pho85p-Pho80p.

6.6. Модель регуляции экспрессии гена РНОЗ в зависимости от концентрации неорганического фосфата в среде.

7. Влияние генов РНО на другие пути метаболизма и наследование органелл.

7.1. Общие элементы в регуляции биосинтеза метионина и фосфата.

7.2. Взаимодействие генов РНО и гена PLC1 в процессе поддержания роста клеток при высокой температуре.

7.3. Влияние мутаций в генах РНО на наследование вакуолей.

Глава П. Материалы и методы.

1. Основные обозначения.

2. Основные штаммы и условия их культивирования.

2.1. Штаммы.

2.2. Условия культивирования штаммов.

3. Методы.

3.1. Трансформация дрожжей с помощью PLATE.

3.2. Трансформация бактерий с помощью МпС12.

3.3. Выделение хромосомной ДНК из дрожжевых клеток.

3.4. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

3.5. Электрофорез фрагментов ДНК.

3.6. Лигирование фрагментов ДНК.

3.7. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli.

3.8. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.

3.9. ПЦР с праймерами к гену РН085.

ЗЛО. Качественное определение активности репрессибельной кислой фосфатазы.

3.11. Определение активности (З-галактозидазы в жидкой среде.

3.12. Определение запасов гликогена.

3.13. Получение мутантов с помощью УФ-излучения.

3.14. Анализ случайной выборки аскоспор.

Глава Ш. Результаты. Исследование новых фенотипических проявлений мутаций в гене РН085.

1. Изучение участия протеинкиназы Pho85p в катаболизме пролина.

1.1. Фенотипическая характеристика роста мутантов pho85 на средах, содержащих разные источники азота.

1.2. Генетический анализ признака Pro" мутантовpho85.

1.3 Изучение влияния мутаций pho85 на транспорт и катаболизм пролина.

1.4. Секвенирование мутаций pho85-3,pho85-7,pho85-21.

1.5. Влияние мутации pho4 на рост мутантов pho85 на среде с пролином.

1.6. Анализ промоторных областей генов PUT1 и PUT2 катаболизма пролина.

2. Участие Pho85p в репрессии гена HSP82.

2.1. Изучение влияния мутацииpho85 на экспрессию HSP82.

2.2. Выяснение влияния мутацииpho4 на экспрессию HSP82.

2.3. Анализ последовательности промоторной области гена HSP82.

3. Изучение наследования признаков «дыхательная некомпетентность» и «термочувствительностъ» мутантов pho85.

3.1. Рост мутантов pho85 на разных источниках углерода.

3.2. Генетический анализ признаков Eth", Gly', Ts мутантов pho85.

3.3 Выяснение митохондриального характера признаков Eth" и Gly" мутантов pho85.

3.4. Изучение возникновения дыхательной некомпетентности и термочувствительности на фоне отсутствия продукта гена

РН085.

Глава IV. Идентификация гомолога РН085 у метилотрофных дрожжей

Pichia pastoris.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование роли протеинкиназы Pho85p в регуляции метаболизма дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris"

Одной из важных задач современной биологии является понимание того, как клетка воспринимает сигналы, поступающие из окружающей среды, и реагирует на них изменением экспрессии генов разных путей метаболизма. Для решения этой проблемы необходима идентификация внешнего индуктора, а так же факторов, передающих сигнал от поверхности к ядру, и выявление генов, изменение экспрессии которых формирует ответ клетки на внешнее воздействие.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae имеют ряд преимуществ по сравнению с клетками высших эукариот при изучении данной проблемы. Сахаромицеты прекрасно изучены с генетической стороны, их геном полностью секвенирован. Простота культивирования S. cerevisiae на разных питательных средах, возможность количественного определения экспрессии генов в зависимости от условий роста позволяет использовать & cerevisiae как модельный объект для изучения реакции клетки на изменение внешних условий.

В последнее время благодаря применению методики «biochip» у S. cerevisiae стала возможной диагностика транскрипционной активности генов в ответ на разные условия культивирования. Использование этой методики показало, что в зависимости от концентрации глюкозы или фосфата в среде, стационарной'фазы роста культуры и других факторов происходит изменение экспрессии определённой части генома дрожжей. Это свидетельствует о наличии координированной регуляции экспрессии генов в ответ на изменение внешних условий. Несмотря на достоинства данной технологии, в некоторых случаях более точные данные о механизме регуляции активности генов можно получить, используя классические методы генетики.

С помощью этих методов у дрожжей S. cerevisiae были разработаны генетические модели, включающие регуляторные и структурные гены, контролирующие отдельные пути метаболизма, выяснено их взаимодействие и последовательность функционирования.

Среди моделей, используемых для изучения механизма передачи внешнего сигнала от поверхности к ядру, особенно удобна система синтеза репрессибельной кислой фосфатазы (рКФ). Простая гистохимическая методика позволяет работать с признаком «наличие» или «отсутствие» кислой фосфатазы как с обычным генетическим маркёром. Перенос клеток в среду с фосфатом позволяет легко переводить их из условий дерепрессии в условия репрессии.

Для понимания механизма реакции клетки на внешнее воздействие необходимо идентифицировать общие элементы в регуляции разных путей метаболизма.

Протеинкиназа Pho85p контролирует транскрипцию генов системы синтеза рКФ (Oshima, 1991). Известно, что помимо регуляции ответа клетки на концентрацию неорганического фосфата в среде, протеинкиназа Pho85p контролирует накопление гликогена в клетках, принимает участие в процессе сборки актинового цитоскелета, а так же вовлечена в регуляцию клеточного цикла.

Известно, что протеинкиназа Pho85p S.cerevisiae является гомологом Cdk5 человека (Huang et al, 1996). Cdk5 необходима для регуляции нейрогенеза (Rashid Т. et al 2001). Нарушение функциональной активности Cdk5 в нервных клетках является одной из причин развития болезни Альцгеймера (Vulliet et al, 1992). Нарушение работы Cdk5 приводит к нейрофагии и вызывает амиотрофный латеральный склероз ALS (amyotrophic lateral sclerosis) (Bajaj, 2000). Протеинкиназа Cdk5 так же функционирует в эндокринной системе (Foury, 1997). Важно отметить, что главной задачей нейро-эндокринной системы организма является быстрое реагирование на изменение в окружающей среде. Циклин-зависимые протеинкииазы отличает консервативность структуры и функции в эволюции (Hanks, Hunter, 1995). Исходя из принципа генетической универсальности, особенно важно изучение роли гомолога Cdk5 - Pho85p, это может способствовать пониманию молекулярного механизма возникновения заболеваний у человека.

В настоящей работе идентифицирован гомолог РН085 у метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, проведено исследование фенотипического проявления дизрупции РН085 у P.pastoris и S.cerevisiae.

В результате работы показано, что протеинкиназа Pho85p функционирует в регуляции метаболизма фосфора и азота у S.cerevisiae и P.pastoris.

Выяснено, что ген HSP82, кодирующий белок-шаперон, относится к генам Р/ТО-регулона и его экспрессия зависит от концентрации неорганического фосфата в среде.

Изучение наследования признаков Ts и EthVGly" у мутантов pho85 показало, что эти признаки не являются плейотропным проявлением мутаций pho85, а связаны с мутациями в ядерных и митохондриальных генах. В данной работе обнаружено, что дизрупция гена РН085 приводит к быстрому накоплению мутаций, которые проявляются как термочувствительность и дыхательная некомпетентность. На основании полученных результатов высказано предположение, что отсутствие функциональной протеинкиназы Pho85p оказывает мутагенное действие на геном. Необходимо отметить, что эти данные указывают на ограничение использования метода «biochip» при исследовании участия Pho85p в регуляции транскрипции различных генов, поскольку выявленные с помощью данной методики эффекты делеции Apho85 могут быть связаны с мутациями в других генах.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Попова, Юлия Георгиевна

Заключение.

Одним из условий существования клеток является их способность реагировать на внешние сигналы. Клеточный цикл дрожжей определяется сигналами, поступающими из окружающей среды. Переход от одной стадии клеточного цикла к другой инициируют циклин-зависимые протеинкиназы Cdc28p и Pho85p (Measday et al, 1997).

Известно, что в зависимости от внешних условий Pho85p взаимодействует с определёнными циклинами семейства Pel, которое состоит из десяти белков (Measday et al, 1997). Поскольку Pho85p образует десять функциональных комплексов, вероятно, она выполняет в клетке, по меньшей мере, десять функций.

Известно, что субстратами Pho85p являются Pho4p, Gsy2p, Siclp, Rvsl67p и Gcn4p. Протеинкиназа Pho85p контролирует их функциональную активность, локализацию и стабильность (Oshima, 1991; Timblin, Bergman, 1997; Nishizawa et al, 1998; Colwill et al, 1999; Meumoun et al, 2000). Фосфорилируя свои субстраты, протеинкиназа Pho85p регулирует клеточный цикл и разные пути метаболизма.

С помощью вспомогательных факторов (циклинов, ингибиторов подобных Pho81p), которые определяют специфичность Pho85p к субстратам и влияют на её активность, протеинкиназа Pho85p воспринимает внешние сигналы и, вероятно, согласует клеточный цикл и метаболизм клетки с условиями среды.

Для того, чтобы расширить представление о роли Pho85p в регуляции разных процессов, был предпринят поиск новых проявлений мутации pho85.

Исследование показало, что протеинкиназа Pho85p и фактор транскрипции Pho4p вовлечены в регуляцию катаболизма пролина. В ходе работы было выяснено, что, в отличие от системы синтеза рКФ, при регуляции катаболизма пролина специфичность Pho85p к её субстрату

Pho4p определяет не Pho80p, а другой циклин (Попова с соавт., 2000). В этом процессе протеинкиназа Pho85p взаимодействует с циклином Рс17р, поскольку известно, что делеция Лрс17 приводит к отсутствию роста клеток на среде с пролином в качестве источника азота (Lee et al, 2000). Вероятно, в катаболизме пролина протеинкиназный комплекс Pho85p-Рс17р играет роль позитивного фактора регуляции. Pho4p, скорее всего, является негативным фактором транскрипции генов катаболизма пролина и его фосфорилирование предотвращает репрессию этих генов.

Важно отметить, что пролин выполняет защитные функции при осмотическом, температурном и окислительном стрессах (Iyer, Caplan, 1998; Hong et al, 2000; Hellmann et al, 2000). Увеличение концентрации пролина снижает уровень свободных радикалов (Hong et al, 2000). Процесс превращения пролина, вероятно, имеет большее значение, чем просто использование клетками этого соединения в качестве источника азота.

Мутация pho85 приводит к гибели клеток на среде с высокой концентрацией пролина, что, вероятно, вызвано накоплением токсичного соединения А1 -пирролин-5-карбоксилата (Р5С). Известно, что накопление пролина и А^пирролин-б-карбоксилата (Р5С) в клетке происходит в ответ на неблагоприятные условия среды (высокая концентрация солей, температурный стресс). Возможно, соединение Р5С может действовать как сигнальная молекула, активирующая апоптоз клетки (Hellmann et al, 2000).

Можно предположить, что протеинкиназа Pho85p регулирует катаболизм пролина и контролирует концентрацию пролина и пирролин-5-карбокеилата (Р5С) в клетке в зависимости от внешних условий.

В отличие от утилизации пролина, где Pho85p, вероятно, играет роль позитивного фактора регуляции, в других процессах Pho85p осуществляет негативный контроль.

В условиях роста клеток в богатой среде протеинкиназа Pho85p негативно регулирует транскрипцию генов РН05 и GSY2, а так же стабильность белка Gcn4p (Oshima, 1991; Huang et al, 1996; Meumoun et al,

2000). Известно, что в этих условиях Pho85p так же участвует в репрессии транскрипции генов СТТ1, HSP12 и UBI4. Продукты этих генов функционируют в неблагоприятных условиях (при окислительном и температурном стрессе, в стационарной фазе роста) (Craig, 1992; Timblin, Bergman, 1997).

Необходимо отметить, что стационарная фаза роста сопряжена с накоплением резервных соединений (гликогена, полифосфата, аминокислот и т.д.). Экспрессия генов: РН05, GSY2, GCN4, HSP12, СТТ1, UBI4 активирована в стационарной культуре (Craig, 1992). Отсутствие протеинкиназы Pho85p приводит к активации этих генов. Можно предположить, что отсутствие протеинкиназы Pho85p моделирует состояние стационара, т.е. старой культуры. Следствием стационара является апоптоз. На основании данных, полученных в данной работе, сделано предположение, что отсутствие протеинкиназы Pho85p вызывает накопление Л1 -пирролин-5-карбоксилата (Р5С). Показано, что у растений повышение концентрации этого соединения в клетках индуцирует апоптоз (Hellmann et al, 2000). Нельзя исключить, что у дрожжей действует этот же механизм.

Таким образом, можно предположить, что протеинкиназа Pho85p репрессирует активность генов и ферментов, которые необходимы в стационаре и при голодании.

В настоящей работе обнаружено, что экспрессия HSP82, кодирующего шаперон, активируется в условиях недостатка неорганического фосфата в среде. Недостаток фосфата, вероятно, относится к факторам умеренного стресса. В данном исследовании выяснено, что протеинкиназа Pho85p необходима для репрессии транскрипции HSP82 в условиях роста клеток в среде с фосфатом. Протеинкиназа Pho85p негативно регулирует экспрессию HSP82, взаимодействуя не с Pho80p, а с другим циклином. Фактор транскрипции Pho4p необходим для активации экспрессии HSP82 в условиях недостатка фосфата в среде. HSP82 можно считать геном РНО-регулона (Popova, Sambuk, 2000).

Можно предположить, что при росте клеток в богатой среде протеинкиназа Pho85p репрессирует гены, продукты которых необходимы при неблагоприятных условиях. К неблагоприятным условиям у микроорганизмов относятся такие изменения окружающей среды, которые приводят к замедлению скорости роста клетки (недостаток глюкозы, фосфата, азота и т.д.). Возможно, что с помощью протеинкиназы Pho85p сигналы о недостатке питательных соединений в среде передаются регуляторам клеточного цикла, что приводит к увеличению его продолжительности в неблагоприятных условиях.

В настоящей работе обнаружено, что дизрупция гена РН085 вызывает накопление спонтанных мутаций, приводящих к термочувствительности и отсутствию роста на средах с глицерином и этанолом в качестве источника углерода. Генетический анализ наследования признаков Ts и EthVGly" у мутантов pho85 показал, что признак Ts является проявлением мутации в ядерных генах, которые не сцеплены с РН085. Признаки EthVGly" являются следствием нарушения функции митохондрий у мутантов pho85. Известно, что делеция Apho85 вызывает снижение уровня мРНК генов PIF1, RFC3 и MSH2, продукты которых участвуют в процессе репликации и репарации и необходимы для поддержания стабильности генома (http://cmgm.stanford.edu/pbrown/phosphate/). Возможно, что отсутствие протеинкиназы Pho85p приводит к тому, что репарация спонтанных повреждений проходит по мутагенному механизму.

Необходимо отметить, что нестабильность генома является одной из характеристик старой культуры клеток. Нельзя исключить, что накопление спонтанных мутаций, которые проявляются как признаки Ts и EthVGly", является адаптацией клетки к отсутствию функциональной протеинкиназы Pho85p. Эффекты мутации pho85, обнаруженные в данной работе, представлены на рисунке 17 в виде схемы.

MSH2, RFC3

V * нестабильность генома катаоолизм пролина

HSP82 ядерного митохондрии отсутствие роста на среде с пролином l t дыхательная некомпетентность термочувствительность

Рисунок 18. Влияние отсутствия Pho85p на клетку.

Известно, что протеинкиназа Pho85p S.cerevisiae является гомологом Cdk5 человека, которая необходима для дифференциации клеток нервной, мышечной и половой систем организма человека и нарушение её работы приводит к серьёзным заболеваниям - болезни Альцгеймера и амиотрофному латеральному склерозу (Vulliet et al, 1992; Bajaj, 2000). В связи с тем, что структура и функции циклин-зависимых протеинкиназ консервативны в эволюции, можно предположить, что подобно Pho85p, протеинкиназа Cdk5 участвует в регуляции катаболизма пролина, транскрипции генов, кодирующих белки-шапероны семейства Hsp90 и необходима для поддержания стабильности генома в клетках человека.