Сравнительный анализ экспрессии гетерологичных генов в дрожжах Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris и изучение условий повышения продукции рекомбинантных белков

Падкина, Марина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный анализ экспрессии гетерологичных генов в дрожжах Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris и изучение условий повышения продукции рекомбинантных белков
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ экспрессии гетерологичных генов в дрожжах Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris и изучение условий повышения продукции рекомбинантных белков"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ПАДКИНА Марина Владимировна

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ В ДРОЖЖАХ 5АССЫАЯОМУСЕ8 СЕЯЕ^ЫЕ И Р1СН1Л РАБТОШ И ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ

специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики Биологического научно-исследовательского института Санкт-Петербургского государственного университета и на кафедре биохимии Санкт-Петербургского государственного университета

Официальные оппоненты: член-корр. Российской технологической

академии, доктор биологических наук Градова Нина Борисовна

профессор, доктор биологических наук Лутова Людмила Алексеевна

доктор биологических наук Евтушенко Владимир Иванович

Ведущее учреждение: ГУ Научно-исследовательский институт

экспериментальной медицины РАМН

Защита диссертации состоится « »005 г. в часов на

заседании Диссертационного совета Д. 212. 232. 12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан« 3 »

2005 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д. 212. 232. 12 кандидат биологических наук

Л.А.Мамон

Ддоь-ч ЦМШ

4 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Успешное завершение международной программы «Геном человека» способствовало более глубокому пониманию молекулярных процессов, происходящих в многоклеточных организмах. В результате проведенных исследований были выявлены десятки тысяч генов, полиморфизм которых отвечает за предрасположенность к различным заболеваниям, определяет индивидуальную чувствительность к медицинским препаратам. Полученная информация открывает перспективы для лечения заболеваний различной этиологии, дает возможность определить новые мишени для используемых лекарственных препаратов и ставит задачу создания лекарственных препаратов нового поколения на основе белков человека и животных. В первую очередь речь должна идти о белках-иммуномодуляторах, интерферонах (ИФН) и интерлейкинах (ИЛ), которые обладают широким спектром биологических активностей: активируют иммунную систему, участвуют в формировании и регуляции защитных реакций организма, оказывают антивирусное, антимикробное, противоопухолевое, радиопротективное действие. Многообразие обнаруженных и изученных физиологических функций этих белков указывает на их потенциальную значимость для медицины. Подобные препараты, несомненно, позволят проводить направленную терапию, действовать непосредственно на причину заболевания, снизить вероятность побочных эффектов. Получение ИФН и ИЛ из традиционных источников проблематично вследствие ограниченности ресурсов донорской крови, из которой выделяют эти белки, а также в связи с существующей опасностью заражения ВИЧ и вирусами гепатитов В, С. Таким образом, возникает практическая необходимость гетерологичной продукции этих белков.

Благодаря успехам генной инженерии созданы штаммы Escherichia coli -продуценты целого ряда цитокинов. В настоящее время в России зарегистрированы и применяются в клинической практике препараты рекомбинантного ос2-ИФН человека («Роферон», Hoffman-La Roche AG, Швейцария; «Реапьдирон», Biotechna, Литва; «Реаферон», Вектор-Медика, Россия; «Интераль», ОЧБП, Россия), ß-ИФН человека («Бетаферон», Schering AG, Германия), ИЛ-1 человека («Беталейкин», ОЧБП, Россия), ИЛ-2 человека («Пролейкин», Chiron Corp., США).

Использование рекомбинантных цитокинов восполняет дефицит эндогенных молекул, повышает эффективность иммунотерапии за счет целенаправленного восстановления иммунной дисфункции. В настоящее время иммунотерапия рекомбинантными цитокинами является одним из наиболее перспективных и постоянно расширяющихся направлений иммунофармакологии. Однако бактерии как прокариотические организмы не способны осуществлять посттрансляционную модификацию белков, характерную для эукариотических организмов, а вследствие условной патогенности прокариотических штаммов-продуцентов рекомбинантные белки могут содержать примеси эндотоксинов, поэтому длительное применение рекомбинантных белков бактериальной природы сопровождается нежелательными побочными эффектами. В связи с этим возникла настоятельная необходимость поиска других организмов для продукции белков человека и животных. Системы экспрессии, созданные на основе многоклеточных эукариотических организмов (культура клеток млекопитающих, трансгенные растения и жрбСГШй)иОФОДрляют получать аутентичные гетерологичные белки. Существенным н< достаМШЛИОвСКйстем является достаточная

С.Петевйлм- ^ л I

'ZPZ8J

сложность работы с культурами клеток и трудоемкость получения трансгенных растений и животных, что увеличивает стоимость получаемых рекомбинантных белков.

Компромиссным решением является использование дрожжевых систем экспрессии У дрожжей подробно изучены механизмы регуляции матричных процессов и метаболизма, при работе с ними используются стандартные методы генной инженерии, дрожжи легко культивировать на относительно дешевых субстратах. В то же время, дрожжи являются эукариотическими микроорганизмами, поэтому они способны обеспечивать корректную посттрансляционную модификацию белков человека и животных. Длительный опыт использования дрожжей в хлебопекарной промышленности, пивоварении, виноделии доказал их непатогенность для человека, а также способствовал развитию технологий масштабного культивирования дрожжей. Использование относительно простых питательных сред и возможность выращивания штаммов-продуцентов в строго заданных условиях позволяют выполнять GLP (Good Laboratory Practice) и GMP (Good Manufacturing Practice) требования при производстве гетерологичных белков.

Инициатива создания штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуцентов белков медицинского назначения в России принадлежит коллективу ученых лаборатории биохимической генетики Биологического НИИ Санкт-Петербургского государственного университета. В результате их исследований были впервые получены и запатентованы в России штаммы дрожжей S cerevisiae - продуценты ИЛ-2, лейкоцитарного (сс16) и фибробластного ((3) ИФН человека, иммунного (у) ИФН быка. Уровень продукции ИЛ-2 оказался достаточно высоким, что позволило использовать полученный штамм для производства рекомбинантного белка. В настоящее время «Ронколейкин» (рекомбинантный ИЛ-2 человека), производимый ООО «БИОТЕХ» (Санкт-Петербург), зарегистрирован Фармкомитетом МЗ РФ в качестве лекарственного препарата. Несомненным достоинством «Ронколейкина» является практически полное отсутствие побочных эффектов при его применении, что объясняется использованием в качестве продуцента непатогенных дрожжей, не содержащих токсических и пирогенных факторов, следует отметить и относительно невысокую стоимость препарата. Эти факторы обусловили широкое применение «Ронколейкина» для лечения септических состояний, ряда онкологических и инфекционных заболеваний.

Уровень продукции а16-ИФН и Р-ИФН человека дрожжами S cerevisiae оказался недостаточным для производства этих белков В связи с этим особый интерес представляют метилотрофные дрожжи Ptchia pasloris. Достоинствами этих дрожжей является накопление значительной биомассы при культивировании на недорогих минеральных средах и более высокий уровень синтеза гетерологичных белков. Вошожность интеграции интересующего гена в хромосомную ДНК дрожжей обеспечивает стабильность полученных штаммов - продуцентов. Кроме того, i ликопротеины, секретируемые дрожжами Р pastoría, в отличие от дрожжей-сахаромицетов, не содержат терминальных al,3-связанных маннозных остатков, которые являются сильными антигенными детерминантами. Это позволяет использовать в клинической практике и секреторные формы гетерологичных белков. Гликозилирование рекомбинантного белка повышает его стабильность, что имеет значение при выделении белка и использовании его в качестве лекарственного средства. Углеводный компонент играет существенную роль в функционировании

гликопротеинов, он вовлечен в процессы связывания антител с антигенами, определяем степень иммуногенности некоторых антигенов, например, поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), что необходимо учитывать при создании рекомбинашных вакцин. Возможность получения секреторных продуцентов ИФН человека и животных, ИЛ-2 человека особенно актуальна в связи с тем, что природные ИФН и ИЛ являются секреторными белками и только в процессе секреции принимают правильную конформацию

Целью работы являлось сравнительное изучение эффективности функционирования систем экспрессии гетерологичных генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris и исследование влияния различных факторов на продукцию рекомбинантных белков.

В задачи исследования входило: создание векторов экспрессии, обеспечивающих синтез и внутриклеточное накопление р-ИФН человека в дрожжах S cerevisiae и Р pastoris, а также векторов экспрессии, обеспечивающих синтез и секрецию а16-ИФН, Р-ИФН, ИЛ-2 человека, у-ИФН быка, синтаксина Б мозга крысы, HBsAg клетками дрожжей Р pastoris;

• получение коллекции мутантов дрожжей Р pastoris;

• получение штаммов дрожжей S cerevisiae и Р pastoris, экспрессирующих гетерологичньге гены и синтезирующих белки человека, животных, вирусов, имеющие важное медицинское значение;

• изучение влияния генотипа штаммов - продуцентов дрожжей S cerevisiae на уровень продукции рекомбинантных ИФН и выяснение возможных причин негативного влияния гетерологичных белков на жизнеспособность штаммов - продуцентов;

• оптимизация условий культивирования штаммов - продуцентов и разработка схемы очистки рекомбинантных а16-ИФН и р-ИФН человека, у-ИФН быка;

• сравнение эффективности систем экспрессии гетерологичных генов у дрожжей .V cerevisiae и Р pastoris и выяснение влияния особенностей метаболизма этих дрожжей на уровень продукции рекомбинантных ИФН.

Основные положения, выносимые на защиту. Уровень продукции гетерологичного белка определяется особенностями метаболизма штамма-продуцеша, что со всей очевидностью доказывает необходимость детального изучения механизмов регуляции метаболизма и клеточной физиологии используемых микроорганизмов В настоящее время использование дрожжей для производства белков высших эукариотических организмов позволяет с наименьшими затратами получать рекомбинантные белки по всем параметрам максимально приближенные к нативным

Научная новизна исследования. Впервые получены штаммы дрожжей /' pastoris - продуценты а16-ИФН и р-ИФН человека, у-ИФН быка, синтаксина Б мозга крысы. Впервые получены ade2, pho85 мутанты Р pastoris. При выяснении причин снижения жизнеспособности штаммов дрожжей S cerevisiae - продуцентов р-ИФ11 человека обнаружено влияние рекомбинантного белка на активность цитохром С-оксидазы дрожжей. Показано, что синтез рекомбинантных ИФН не оказывает негативного влияния на штаммы-продуценты в случае дрожжей Р pastoris. При этом основная масса несекретируемых рекомбинантных ИФН в клетках дрожжей Р pastoris, в отличие от дрожжей S cerevisiae, находится в растворимом состоянии. Впервые для объяснения более высокой эффективности работы системы экспрессии гетерологичных

генов у дрожжей Р рамоих и их повышенной устойчивости к негативным воздействиям рекомбинантных белков предложена гипотеза, основанная на особенностях метаболизма метилотрофных дрожжей

Теоретическое и практическое значение работы. Работа вносит существенный вклад в изучение регуляции метаболизма дрожжей - продуцентов гетерологичных белков. В ходе ее выполнения не только выявлены факторы, определяющие уровень продукции гетерологичных белков дрожжами 51 сегеушае к Р рая/огм, но и продемонстрировано, что эффективность работы системы экспрессии дрожжей и их устойчивость к негативным воздействиям гетерологичных белков зависит от особенностей метаболизма штамма-продуцента. Полученные данные являются фундаментом для дальнейшего совершенствования штаммов-продуцентов в рамках нового направления современной биотехнологии - метаболической инженерии, которая обеспечивает целенаправленное изменение метаболизма штаммов для повышения их продуктивности. Результаты экспериментальных исследований, приведенные в работе, используются при подготовке курсов лекций и практических занятий для бакалавров и магистров биолого-почвенного факультета СПбГУ, специализирующихся в области генетики дрожжей, биохимии, микробиологии, молекулярной биологии

Полученные штаммы дрожжей сегеутае и Р раяюпя - продуценты сх16-ИФН, Р-ИФН, ИЛ-2 человека, у-ИФН быка, HBsAg, синтаксина Б могут быть использованы для производства рекомбинантных белков медицинского назначения в Центре малотоннажного производства медицинских препаратов методами генной инженерии, создаваемого по программе развития г. Петергофа как наукограда РФ. Условия оптимизации процессов культивирования штаммов-продуцентов, схема очистки рекомбинантных белков могут быть положены в основу технологического регламента для такого производства. На основе рекомбинантных ИФН и ИЛ-2 могу! быть созданы отечественные лекарственные препараты нового поколения, необходимые для лечения вирусных, онкологических заболеваний, рассеянного склероза и способные заменить зарубежные аналоги. HBsAg может быть использован для разработки еще одной отечественной вакцины для профилактики гепатита В. Синтаксин Б мозга крысы может быть востребован в фармакологии при проведении исследований, направленных на создание лекарственных препаратов, которые избирательно действуют на различные типы нейрорецепторов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях и симпозиумах: XIV Международный генетический конгресс (Москва, 1978), конференция биохимиков прибалтийских республик, Белорусской ССР, Ленинграда (Рига, 1981), конференция по метаболической и генетической регуляции у дрожжей (Иена, 1983), конференция «Ферменты в биохимических анализах» (Киев, 1984), Всесоюзная конференция по биологии клетки (Тбилиси, 1985), Всесоюзный симпозиум «Молекулярные механизмы генетических процессов» (Москва, 1990), Всесоюзный симпозиум «Структура и функции клеточного ядра» (Гродно, 1990), Всесоюзный симпозиум «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии» (Самарканд, 1991), Международный специализированный симпозиум по дрожжам (Рига, 1991), конференция Американского генетического общества по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Мэдисон, 1996), съезд ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000), конференция «Биотехнология-2000» (Пущино, 2000), XX Международная конференция по генетике

и молекулярной биологии дрожжей (Прага, 2001), Международная научно-практическая школа-конференция «Цитокины Воспаление. Иммуните!» (Саша-Петербург, 2002), Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - науки XXI века" (Пущино, 2003), Международный форум "Биотехнология и современность" (Санкт-Петербург, 2003), I, II, III Международный конгресс «Биотехнология -состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, Москва, 2003, Москва, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 46 печатных pa6oi в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, резулыаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитированной литературы, насчитывающего 775 источников. Работа изложена на 394 страницах машинописною текста, иллюстрирована 77 рисунками и 5 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы. В работе использовали штаммы дрожжей S cerevisiae Петергофской генетической коллекции (ПГК) и Американской генетической коллекции (АГК), а также штаммы дрожжей Р pastoris GS115 (Invitrogen) и 4-GSI15, полученный в данной работе. Для амплификации плазмидной ДНК использовали штамм DH5a Е coli. Генотипы и происхождение всех штаммов приведены в работе.

Плазмиды. На отдельных этапах создания векторов экспрессии использовали плазмиды YEp!3, pJDB207, pRS426, pUC19, pBluescript SK+, pPIC9, pHIL-D2. При амплификации структурных генов а16-ИФН, ИЛ-2 человека, y-ИФН быка, основного белка HBsAg матрицей в ПЦР служили плазмиды pJDB(MS105), pJDB(MSIL), pYGIB, pJDB207(S-adw), содержащие интересующие гены под контролем промотора и терминатора гена РН05 дрожжей S cerevisiae. Для амплификации структурного гена ß-ИФН человека в ПЦР в качестве матрицы использовали плазмиду pPR-IFN-b-15, содержащую ген IFNBI человека под контролем Т7 промотора, для амплификации структурного гена синтаксина Б крысы - плазмиду pBISK-GR33, содержащую ieii < STXIB под контролем собственного промотора Для получения штамма дрожжей Р pastoris с дизрупцией гена PpP¡I085 использовали плазмиду pJGP16, содержащую ген ScPHOR5, рамка считывания которого нарушена за счет встраивания гена /IISI дрожжей Р pastoris Описание этих плазмид и источники, из которых они были получены, приведены в работе. Плазмида pHBI, содержащая ген IFNR1 человека под контролем промотора и терминатора гена РН05 дрожжей S cerevisiae, а также плазмиды pHIN, pHIF, pHIF2, pHIVB, pHIL2, pPIC9(IFN-y), pBIG, pHGRll, pPIC(GR33), pPIC9(S-adw), pPIC9(S-ayw), pHBS(S-adw/ayw), содержащие структурные гены а16-ИФН, ß-ИФН, ИЛ-2 человека, у-ИФН быка, синтаксина Б крысы, основного белка HBsAg под контролем промотора и терминатора гена AOXI дрожжей Р pastons, были сконструированы в данной работе.

Для выращивания штаммов дрожжей cerevisiae использовали минеральную синтетическую среду (Захаров и др., 1976) или полные среды ПЕП и ПЕПФО (Падкнпа и др, 1974). Выращивание штаммов дрожжей Р pastoris проводили на минеральной среде MGY или полной среде BMGY (Sreekrishna et а/., 1988; Clare et а!, 1991а)

Синтез интересующего белка индуцировали переносом биомассы дрожжей в среду с метанолом ММ или BMMY (Clare et al., 1991а) Во всех случаях, кроме отмеченных особо, дрожжи выращивали при 30°.

Методы. Трансформацию бактерий и дрожжей, выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток и хромосомной ДНК дрожжей, гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции, обработку фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1, лигирование фрагментов ДНК, амплификацию фрагментов ДНК при помощи ПЦР, разделение фрагментов ДНК в полиакриламидном (ПААГ) или агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из геля проводили по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984; Yamada et al., 1998; Fujimura a. Sakuma, 1993).

Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Электрофоретическое разделение белков в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Анализ электрофореграмм проводили с помощью компьютерной программы «ImageJ1.32» [http:rsb info.nih.gov/ij/]. Перенос белков на нитроцеллюло:,ную мембрану и гибридизацию с моноклонапьными антителами проводили по ранее описанной методике (Al-Maghrebi et al., 2002).

Идентификацию углеводов после электрофореза проводили : помощью реактива Шиффа (Краснопевцева и др., 1979). Дегликозилирование Кф и ß-ИФН человека проводили по методике, приведенной ранее (Краснопевцева и др., 1986).

Определение содержания HBsAg и а16-ИФН человека проводили при помощи иммуноферментного анализа, используя тест-системы Вектогеп Ei-HBs-антиген-стрип (ЗАО «Вектор-Бест») и ProCon IF2plus («Протеиновый контур», Санкт-Петербург), соответственно.

Биологическую активность рекомбинантных а16-ИФН и ß-ИФН человека определяли по подавлению цитопатической активности вируса везикулярного стоматита в первичной культуре L-41 кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, чувствительной к ИФН a-типа (Liu et al., 2001). В качестве стандарта использовали человеческий лейкоцитарный интерферон ОСО 42-28-90-87 (ГИСК, Москва). Биологическую активность рекомбинантного ИЛ-2 человека определяли по способности обеспечивать пролиферацию ИЛ-2-зависимых Т-лимфоцитов мыши линии CTLL-2 (Gearing a. Thorpe, 1988). В качестве стандарта использовали BRMP Reference reagent human IL-2 (NCI, США).

Определение активности Кф и разделение изозимов Кф на ДЭАЭ-целлюлозе проводили по ранее предложенным методикам (Падкина и др., 1974; Краснопевцева и др., 1979; Краснопевцева и др., 1986).

Гель-фильтрацию рекомбинантных ИФН проводили насефакриле S100 или S200, уравновешенном 50 мМ Na-ацетатным буфером (pH 5,5), содержащим 0,25 М NaCl. При проведении гель-фильтрации в денатурирующих условиях в состав буфера дополнительно включали 0,1% ДСН, 2,5 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДГА), 2 мМ дитиотреитол.

Выделение митохондрий из клеток дрожжей проводили по методу, предложенному Зинсером и Даумом (Zinser a. Daum, 1995).

Активность цитохром С-оксидазы определяли по методике, описанной в работе Сторри и Маддена (Storrie a. Madden, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Создание системы экспрессии гетерологичных генов под контролем промотора гена PHOS дрожжей S. cerevisiae

Изучение июгимпого состава кислой фосфатазы дрожжей - сахаромицетов. Одним из основных условий эффективной экспрессии чужеродного гена в дрожжах является использование сильного и регулируемого промотора. Этим требованиям должны отвечать промоторы генов, кодирующих структуру ферментов, синтез которых зависит от характера питания дрожжей. В качестве подобного фермента была выбрана неспецифическая кислая фосфатаза (КФ 3.1.3.2). Нами было установлено, что дрожжи S cerevisiae ПГК синтезируют и секретируют три изозима Кф: Кф1, Кф2 и КфЗ, которые различаются по оптимуму pH ферментативной активности, константе Михаэлиса, термостабильности (Падкина и др., 1974; Краснопевцева и др., 1986). Синтез Кф2 и КфЗ репрессируется в присутствии неорганического фосфата, тогда как Кф1 является конститутивным ферментом (рис. 1) (Краснопевцева и др., 1979; Уразманова и др., 1985). Кф2 является основным изозимом репрессибельной Кф (Краснопевцева и др., 1986). Аналогичный спектр изозимов Кф был обнаружен нами у штамма дрожжей GRF18 АГК, любезно предоставленного нам доктором А. Хинненом (Германия) (рис.1).

Рис. 1. Фракционирование кислых фосфата? на ДЭАЭ-целлюлоте. а - штаммы 1Г-Ш88 и GRF18, выращенные на срелс ПГИ; б - штаммы 1Г-П188 и GRF18, выращенные на среде ПЕПФО.

Генетико-биохимический анализ мутантов с нарушением активности Кф I, а также сопоставление пептидных карт фермента штаммов дикого типа и мутантов позволили сделать вывод, что ген PI 101 является структурным геном Кф 1 (Краснопевцева и др , 1979). Аналогичная система доказательств была использована для идентификации структурных генов Кф2 (АСРЗ) и КфЗ (ACPI) (Самбук, 1985; Краснопевцева и др., 1986; Падкина и др., 1991). В дальнейшем была показана аллельность генов PHOl, АСРЗ, ACPI генам PHOS PHOS, PI ЮН дрожжей АГК (Краснопевцева и др., 1986; Самбук и др., 1991).

При изучении мутантов с измененной регуляцией синтеза репрессибельной Кф2, которое параллельно проводилось в лаборатории биохимической генетики БиНИИ СПбГУ и лаборатории доктора Ошимы (Япония), было выяснено, что экспрессию структурного гена Кф2 (PHOS) регулируют факторы позитивного и негативного контроля. К позитивным регуляторам биосинтеза Кф2 относятся основной белок

активатор - Pho4p, белок Pho2p, усиливающий действие Pho4p, и белок Pho81p -медиатор передачи сигнала о наличии неорганического фосфата в среде и ингибитор негативных регуляторов (Oshima, 1982; Koren et al., 1986; Sengstag а Hinnen, 1987; Самбук и др., 1988; Yoshida et al., 1989; Самбук и др., 1991). Негативными регуляторами являются циклинзависимая протеинкиназа Pho85p и связанный с ней циклим Pho80p (Ueda et al., 1975), которые регулируют локализацию белка Pho4p и его связывание с промотором гена PHOS в зависимости от концентрации неорганического фосфата (Kaffman et al., 1998b). Мутации в генах РН02, РН04, РН081 приводят к отсутствию синтеза Кф2 в условиях дерепрессии, а мутации в генах РН080, РН085 - к конститутивному синтезу фермента. Совместное функционирование регуляторных белков обеспечивает синтез Кф2 в среде, содержащей низкие концентрации фосфата. В условиях дерепрессии активность Кф2 возрастает, по меньшей мере, в 100 раз, содержание фермента может достигать 1% от суммарного клеточного белка (Rogers et al., 1982).

Таким образом, результаты исследования Кф дрожжей S. cerevisiae демонстрируют возможность строгой регуляции неорганическим фосфатом экспрессии гена PHOS, кодирующего структуру Кф2, а также способность промотора обеспечивать эффективную транскрипцию этого гена в условиях дерепрессии (Bostian et al., 1980), что подтверждает перспективность использования промотора гена PHOS для экспрессии гетерологичных генов.

Зависимость синтеза Кф2 от уровня белков активаторов. Уровень продукции чужеродного белка зависит не только от эффективности используемого промотора, но и от количества копий клонированного гена. Однако, как правило, выход белка не возрастает пропорционально копийности клонированного гена. Одной из причин может быть низкий уровень экспрессии гетерологичного гена, обусловленный недостатком регуляторных белков в клетке дрожжей. В то же время, суперпродукция белков активаторов, в частности Pho4p, часто сопровождается снижением скорости роста штаммов-продуцентов, что приводит к уменьшению выхода соответствующих гетерологичных белков (Dumont et al., 1989; Legrain et at., 1989). Негативный эффект, возможно, обусловлен полифункциональностью Pho4p, который участвует в регуляции транскрипции целого ряда генов, не связанных с метаболизмом фосфата, например, гена (777, кодирующего структуру цитратсинтазы, первого фермента цикла Кребса (Падкина, 1998; Падкина и др., 2003). Принимая во внимание эти данные, решили оценить способность имеющихся в клетке Pho2p и Pho4p активировать транскрипцию генов, клонированных под контролем промотора гена РН05 в составе мультикопийных плазмид. В качестве модели были использованы штаммы-суперпродуценты Кф.

Создание штаммов-суперпродуцентов кислых фосфатаз. Для получения штаммов с повышенным уровнем синтеза Кф штамм GRF18 трансформировали илазмидами YEpl3 и pJDB207, содержащими гены РНОЗ, PHOS. Выбор плазмид обусловлен тем, что они могут поддерживаться в клетке в количестве 10-40 копий (YKpl3) (Parent et al, 1985) или 200-400 копий (pJDB207) (Erhart a. Hollenberg, 1983). Измерение активности Кф2 показало, что трансформанты GRF18(YEp 13/Р//Ш,Р//0.5) синтезируют и секретируют в 4,1 раза, а трансформанты GRF18(pJDB207/P//OJ,/>//O5) в 6,5 раза больше фермента, чем исходный штамм. Таким образом, происходит повышение продукции белка при увеличении дозы клонированного гена, наблюдается некоторая корреляция между количеством Кф2 и копийностью вектора экспрессии,

однако переход от плазмиды YEpl3 к pJDB207 не сопровождается пропорциональным увеличением выхода фермента (Падкина и др., 1989). Незначительные отличия в количестве Кф2 у трансформантов GRF18( YKp 1УРНОЗ. PHOS) и GRF18(pJDB207//>//6>3,/J//0.5) могут быть обусловлены недостатком как белков активаторов, так и компонентов трансляционного и/или секреторного аппарата клетки дрожжей. В связи с тем, что в этих экспериментах определяли только количество секретированной Кф2, не представляется возможным решить, что является лимитирующим фактором. Тем не менее, полученные результаты дают возможность говорить о том, что имеющиеся в клетке Pho2p и Pho4p способны, по крайней мере, в 6 раз повысить выход Кф2, и что использование мультикопийной плазмиды pJDB207 для клонирования чужеродных генов под контролем РН05 промотора в дрожжах S cerevisiae позволяет ожидать увеличения продукции рекомбинантного белка.

Клонирование генов фибробластного ИФН человека и иммунного ИФН быка под контролем промотора гена PHOS дрожжей S. cerevisiae

ИФН обеспечивают противовирусную защиту организма. Кроме этою, они оказывают антимикробное, противовоспалительное, иммуномодулирующее, противоопухолевое и радиопротективное действие (Ершов и Новохатский, 1980; Ершов, 1996). Использование ИФН для лечения заболеваний различной этиологии имеет существенные преимущества по сравнению с традиционными антибиотиками и химиотерапевтическими препаратами за счет широкого спектра действия, обусловленного активацией иммунной системы, и из-за отсутствия побочных эффектов. Клинические испытания показали возможность использования а-ИФН для лечения вирусных (Tilg, 1997; Melian a. Plosker, 2001; Brassard et al., 2002; Estern et a!., 2003; Cinatl et ai, 2003), онкологических (Bukowski, 2000; Mickisch et a!., 2001; Brassard et al., 2002) и ауюиммунных заболеваний человека (Ершов, 1996) Получены обнадеживающие результаты применения ß-ИФН при рассеянном склерозе (Paty a. Li, 1993, Lou et al., 1999; Тотолян, 2000; Fischer et al., 2000), некоторых вирусных инфекциях (Rusconi et al., 1994; Ruiz-Moreno et al., 1997; Ikeda et al., 2000). Бычий, свиной у-ИФН являются эффективными препаратами для лечения различных заболеваний животных (Kishko a. Vasilenko, 1998; Sentsui et al, 2001; Zhang et al, 2002). По мнению экспертов ВОЗ, цитокиновая терапия особенно актуальна в связи с опасностью появления в продуктах питания патогенных микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам (Lowenthal et al., 1999).

В лаборатории биохимической генетики БиНИИ СПбГУ были созданы штаммы дрожжей S cerevisiae - продуценты а16-ИФН (Мясников и др., 1988а; Мясников и др , 19886) и ß-ИФН человека (Останин и др., 1989), а также у-ИФН быка (Мясников и др., 19896), существенным недостатком которых была низкая продуктивность.

Получение рекомбинантной плазмиды pHttl. Продукция гетерологичноto белка зависит от целого ряда факторов, в частности, от структуры промотора транскрипции в векторе экспрессии, генотипа штамма-продуцента и стабильности синтезированного белка.

В ранее полученном векторе экспрессии ген IFNB1 человека был клонирован под контролем гибридного промотора РН05-МР -alpha-1, содержащего фрагмент промотора гена РН05, делетированный непосредственно за UAS2 (регуля горной

активирующей последовательностью) для активатора транскрипции Pho4p (Останин и др., 1989), что могло препятствовать взаимодействию белка активатора с промотором и явиться причиной недостаточно эффективной транскрипции гена IFNBI и, как следствие, низкого уровня продукции рекомбинантного ß-ИФН человека. Поэтому при создании вектора экспрессии pHBI (рис. 2) на основе плазмиды pJDB207 использовали полноразмерный PHG5 промотор (Падкина и др., 1998).

Влияние генотипа штамма-продуцента на продукцию фибробластного ИФН человека и иммунного ИФН быка. Для изучения влияния генотипа штамма-продуцента на уровень продукции ß-ИФН человека и у-ИФН быка в качестве реципиентов использовали гаплоидные штаммы дрожжей S cerevisiae 1-GRF18, 2Р4-GRF18 (рер4) и диплоидный штамм D576 (pho3/pho3). Штамм 2P4-GRF18, несущий мутацию в структурном гене вакуолярной протеиназы А (РЕР4), позволял выявить влияние неспецифического протеолиза на выход гетерологичных белков. Использование штамма D576 представляло определенный интерес в связи с тем, что диплоидные штаммы накапливают больше биомассы, и количество внутриклеточного белка возрастает пропорционально плоидности (Тер-Аванесян, 1974). Штаммы-реципиенты трансформировали полученной нами плазмидой pHBI и плазмидой pYGIB (Мясников и др., 19896), которая содержит ген IFNG быка ei составе такой же экспрессионной кассеты. При выращивании исходных штаммов и трансформантов, синтезирующих рекомбинантные ИФН, наблюдали более ранний переход к стационарной фазе роста у штаммов-продуцентов, что может указывать на отрицательное влияние чужеродных белков на клетки дрожжей. Дополнительным свидетельством негативного воздействия ИФН млекопитающих на клетки дрожжей была митотическая нестабильность плазмид pHBI и pYGIB. Полученные результаты говорят о том, что продукция гетерологичных ИФН является серьезной метаболической нагрузкой для клеток дрожжей и необходимо использовать двухстадийное выращивание, позволяющее разделить накопление биомассы и синтез чужеродных белков.

В предварительных экспериментах было установлено, что у цельное содержание гетерологичных белков у динлоидов D576/pHBI и D576/pYGIB ниже, чем у гаплоидных штаммов-продуцентов Для дальнейшей работы по очистке рекомбинантных белков были выбраны штаммы 2P4-GRF18/pHBI и 2Р4-GRF18/pYGIB, у которых можно ожидать повышения стабильности рекомбинантных ИФН за счет мутации в гене PI P4. Уровень продукции ß-ИФН человека штаммом 2Р4-GRF18/pHBI был в два раза выше, чем у штамма-прототипа ВКПМ Y-876 (Останин и др., 1989), и составил 1 мг/л, что позволило запатентовать полученный штамм ВКПМ Y-2286 в качестве продуцента фибробластного ИФН человека (Падкина и др., 1998). Увеличение выхода рекомбинантного ß-ИФН могло быть об>словлено, с одной стороны, использованием полноразмерного PHOS промотора, что создает более

благоприятные условия для взаимодействия белков активаторов Pho4p и Pho2p с собственными UAS, повышает эффективность работы Р1Ю5 промотора и уровень транскрипции гена li-NBI человека, а с другой стороны, повышенной стабильностью ß-ИФН у рер4 мутанта. В случае у-ИФН быка продукция гетерологичного белка составила 14 мг/л, что в 1,4 раза превышает продуктивность штамма-прототипа ВКПМ Y-1223 (Мясников и др., 19896). Учитывая, что штаммы ВКПМ Y-1223 и 2Р-GRF18/pYGIB содержат одинаковую плазмиду, увеличение выхода рекомбинантного у-ИФН быка определяет мутация в гене РЕР4.

Выделение фибробластного ИФН человека и иммунного ИФН быка из клеток дрожжей S. cerevisiae. Рекомбинантные ИФН накапливаются в цитоплазме в виде отдельных дискретной включений, называемых «тельцами включения», что позволяет уже на первых стадиях отделить гетерологичные белки от белков дрожжей (Парфенова, 2002).

Схема выделения рекомбинантных ИФН, включающая осаждение белков

полиэтиленгликолем 6000, экстракцию примесных белков NaCl и мочевиной, экстракцию гетерологичных ИФН ДСН и гель-фильтрацию на сефакриле S200, позволила избавиться от значительной части примесных белков и получить препараты, содержащие около 40% ß-ИФН человека и у-ИФН быка (рис. 3). Полученный ß-ИФН человека обладает биологической активностью 3,7x107 ME, что соответствует данным об актйвнзсти рекомбинантного белка, выделенного из клеток Ecoli (Runkel et al., 1998). Процесс очистки рекомбинантных ИФН из клеток дрожжей - сахаромицетов является достаточно трудоемким, и вькод белка на стадии гель-фильтрации составляет менее 10%. Поэтому, несмотря на более высокую продуктивность полученного штамма ВКПМ Y-2286, использование его для крупномасштабного производства ß-ИФН человека нецелесообразно. Следует отметить, что уровень продукции ß-ИФН человека оказался на порядок ниже уровня синтеза достаточно близкого по свойствам иммунного ИФН быка, что позволяет говорить о токсичности ß-ИФН человека для дрожжей.

Выяснение причин токсичности ß-ИФН человека для клеток дрожжей S. cerevisiae. Продукция гетерологичного белка может приводить к снижению скорости роста и жизнеспособности клеток дрожжей, негативный эффект наблюдается чаще всего при синтезе гетерологичных белков, выполняющих жизненно важные функции и имеющих гомологи в клетке дрожжей (Kurtz el al., 1995; Superati-Furga et al., 1996; Tournier et al., 1996). В то же время, известны случаи негативного воздействия чужеродных белков, гомологи которых у дрожжей отсутствуют (Ligr et al., 1998). Похожая ситуация наблюдалась при продукции ß-ИФН человека и у-ИФН быка, которые согласно базе данных «Proteome»

[http.//www.proteome.com/datebases/YPD/reports] не имеют гомологов в клетках дрожжей S cerevisiae. Токсичность ß-ИФН может быть связана с высокой

Рис 3. Дснситограммя разделения в ПААГ рекомбинантных р-ИФН человека и у-ИФН быка. Маркеры мол. массы, кДа (овальбумин-45,0, трипсиноген - 24,0, ингибитор трипсина - 20,5, лшоцим -14,4, фрагмент миоглобина Г,- 8,1)

г идрофобностью белка, которая вызывает повышенную агрегацию синтезированных молекул и приводит к необратимому связыванию с белками шаперонами, что сопровождается снижением жизнеспособности штамма-продуцента (Remaut et al., 1983). Однако этому утверждению противоречит ряд данных, полученных в настоящей работе С одной стороны, у штамма CSG55(pRS426-IFNBl) - продуцента ß-ИФН человека не повышается экспрессия гена HSP82, которая индуцируется в ответ на различные стрессовые факторы (Csermely et al., 1998), а конститутивный синтез ß-ИФН человека не влияет на митотическую стабильность плазмиды pHBI у штамма с 10-1-GRF18 (pho80). Следовательно, синтез и накопление ß-ИФН человека в агрегированном состоянии не являются факторами стресса для клетки дрожжей и не должны сопровождаться снижением ее жизнеспособности. С другой стороны, у pho85 мутанта (c21-l-GRF18) негативное влияние гетерологичного белка усиливается, несмотря на то, что мутации в гене РН085 сопровождаются повышением уровня белков шаперонов, призванных исправить неправильную конформацию рекомбинантного ß-ИФН (Ogawa et al., 2000; Самбук и др., 2002).

Кумулятивный эффект мутации в гене РП085 и гетерологичного ß-ИФН человека может быть обусловлен тем, что в том и другом случае примерно на 30% снижается активность цитохром С-оксидазы, мультисубъединичного комплекса IV дыхательной цепи (рис. 4) (Parfenova a. Padkina, 2001; Парфенова и др, 2002). Полученные результаты позволяют предположить, что токсичность

рекомбинантного белка может быть связана с гем, что ß-ИФН человека оказывается вовлечен в метаболизм клетки дрожжей и нарушает функцию митохондрий так же, как и у млекопитающих (Lewis et al., 1996).

Высказанное предположение о механизмах негативного влияния рекомбинантного ß-ИФН человека, позволяет, по-видимому, объяснить и низкий уровень продукции а16-ИФН человека в клетках дрожжей S cerevisiae (Мясников и др , 1988а; Мясников и др., 19886), т.к. действие обоих ИФН в клетках млекопитающих опосредовано одним рецептором (Runkel et al., 2000)

Одним из возможных путей преодоления высокой токсичности гетерологичного белка для клетки дрожжей является использование секреторных продуцентов Однако рекомбинантные белки, секретируемые дрожжами S cerevisiae и имеющие потенциальные сайты для N- и О-гликозилирования, будут подвергаться гипергликозилированию. Присоединение высокомолекулярных маннанов приводит к увеличению молекулярной массы и часто сопровождается изменением физико-химических свойств гетерологичных белков (Romanos et al., 1992; Eckart a. Bussineau, 1996), а терминальные а1,3-связанные маннозные остатки, входящие в состав рекомбинантных гликопротеинов, иммуногенны для млекопитающих, что ограничивает применение таких белков в медицине (Ballou, 1974; Sudbery, 1996)

Или

12 3 4

Рис. 4. Удельная активность цитохром С-оксидазы у различных штаммов дрожжей: 1 - 1-С1т8, 2 - с21-1-СКР18, 3 - сЮ-1-01Ш8, 4 - 2Р4-С1М18/рНВ1 (представлены средние 1начения трех независимых определений).

Гипергликозилирование - не единственная проблема, возникающая при использовании системы экспрессии дрожжей S cerevisiae К существенным недостаткам следует отнести отсутствие сильных строго регулируемых промоторов, подавление роста культуры и, следовательно, синтеза рекомбинантных белков вследствие накопления этилового спирта, продукта ферментации глюкозы. Широкий выбор видов дрожжей, используемых в настоящее время в биотехнологии и отличающихся особенностями физиологии и метаболизма, позволяет найти наиболее подходящую систему экспрессии для решения конкретной задачи. При этом удается сохранить достоинства системы экспрессии эукариотических одноклеточных микроорганизмов и избавиться от основных недостатков, характерных для дрожжей-сахаромицетов.

Клонирование генов ИФН человека и животных, гена ИЛ-2 человека под контролем промотора гена АОХ1 дрожжей Р. pastoris

Использование для гетерологичной экспрессии метилотрофных дрожжей /' pastoris представляет особый интерес. Достоинствами этих дрожжей является накопление значительной биомассы при культивировании на недорогих минеральных средах и высокий уровень синтеза рекомбинантных белков (Sreekrishna et al., 1988) Возможность интеграции интересующего гена в хромосомную ДНК дрожжей обеспечивает стабильность полученных штаммов-продуцентов. Гликопротеины, секретируемые дрожжами Р pastoris, не содержат иммуногенных терминальных «1,3-связанных маннозных остатков, что позволяет получать аутентичные секреторные формы гетерологичных белков (Montesino et al., 1998; Bretthauer a. Castellino, 1999). Определенным недостатком этой системы является малое количестве дрожжевых селективных маркеров, входящих в состав векторов (ADE1, ARG4, HIS4, URA3), и ограниченный выбор соответствующих ауксотрофных мутантов (Cereghino a Cregg, 2000).

Создание штаммов дрожжей Р. pastoris с мутациями в генах, гомологичных генам ADE2 и РН085 дрожжей S. cerevisiae. Создание множественно маркированных штаммов Р pastoris является важной задачей, так как появление новых маркеров расширяет возможности конструирования штаммов - продуцентов гетерологичных белков.

Нами впервые получены ade2 мутанты дрожжей Р pastoris и показано, что ген ADE2 дрожжей S cerevisiae компенсирует ауксотрофность по аденину у метилотрофных дрожжей. Это дает возможность использовать ген ScADE2 для конструирования векторов экспрессии, позволяющих интегрировать клонируемые гены в локус ADE2 Р pastoris Впервые получены штаммы дрожжей Р pastoris с дизрупцией гена, гомологичного гену РП085 дрожжей S cerevisiae. Наличие pho85 мутантов позволяет использовать ген ScPII085 в качестве дополнительного селективного маркера при конструировании векторов экспрессии или для дизрупции определенных генов Р pastoris. Кроме того, в процессе культивирования подобных мутантов могут спонтанно возникать мутации, повышающие жизнеспособность штаммов и усиливающие выход гетерологичных белков (Hall, 1992)

Создание штаммов дрожжей Р. pastoris с дизрупцией гена РЕР4. Использование рер4 мутантов дрожжей Р pastoris, как и в случае дрожжей-сахаромицетов, позволяет увеличить выход рекомбинантных белков за сче!

предотвращения их протеолича (Brankamp et а/,1995, Henry et а/, 1997; Weiss et а/, 1998). Принимая во внимание тот факт, что вакуолярная карбоксипептидаза Y дрожжей Р pastoris, в созревании которой участвует Рер4р, секретируется в культуральную среду (Ohi et а!, 1996), можно ожидать, что мутаиия в гене РЕР4 будет стабилизировать белки как при внутриклеточной продукции, так и при секреции. Для дизрупции гена РрРЕР4 использовали гомологичный ген дрожжей S cerevisiae, рамка считывания которого нарушена геном ScADE2 или геном ScPH085 Линейным фрагментом ДНК ScPEP4::ScADE2 или ScPEP4::ScPH085 трансформировали штаммы 3-GS115 (his4 ade2) или 85-GS115 (his4 ade2 pho85 ADE2). В первом случае отбирали трансформанты Ade фенотипа, во втором - клоны с отсутствием активности Кф на среде с неорганическим фосфатом. Интеграцию фрагментов ДНК ScPEP4::ScADE2 или ScPEP4::ScPH085 в локус РЕР4 генома дрожжей Р pastoris доказывали при помощи ПЦР с праймерами, комплементарными 5' и 3' концам гена ScPEP4. Штамм 4-GS115 (his4 ade2 pho85 ADE2 рер4- РН085) в дальнейшем использовали для клонирования и экспрессии гетерологичных генов, штамм 43-GS115 (his4 ade2 рер4 ADE2) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-2991.

Создание штаммов дрожжей Р. pastoris, синтезирующих и секретирующих ß-ИФН человека. Создание секреторного продуцента ß-ИФН человека особенно актуально, т.к. белок является гликопротеином, и только в процессе секреции он подвергается гликозилированию и приобретает правильную конформацию. Гликозилирование предотвращает образование межмолекулярных дисульфидных связей, препятствует образованию нерастворимых агрегатов ß-ИФН, повышает термостабильность белка (Runkel et al., 1998). Кроме того, накопление рекомбинантного белка в культуральной жидкости значительно упрощает его очистку.

Для создания вектора экспрессии pHIF (рис. 5) использовали челночную интегративную плазмиду рР1С9, в состав которой входят промотор и терминатор гена AOXI, структурного гена алкоюльоксидазы I, и фрагмент ДНК, кодирующий структуру сигнального пептида а-фактора дрожжей S cerevisiae, который обеспечивает секрецию рекомбинантного белка в культуральную среду.

Уровень экспрессии генов, находящихся под контролем AOXI промотора, эффективно регулируется источниками углерода. Транскрипция гена AOXI полностью блокирована при выращивании дрожжей на среде с глюкозой и с глицерином. Использование метанола в качестве единственного источника углерода индуцирует экспрессию гена AOXI и всех генов, находящихся под контролем AOXI промотора, что позволяет регулировать синтез ß-ИФН в клетках дрожжей. Промотор гена AOXI относится к числу наиболее сильных промоторов. В условиях дерепрессии синтеза содержание Aoxlp может составлять 30% суммарного клеточного белка.

о ...Psrt

ВашШ / Xh0,

Pstl/PvuII

Т AOXI EcbRI

IFNBiyg- Not|

PstT

Pvull

Sali

Sphl

BglJI

Рис. 5. Схема илачмиды pHIF.

Ген IFNBI человека амплифицировали с помощью ПЦР. Последовательность прямого праймера включала сайт для эндонуклеазы Xhol, используемой при конструировании рекомбинантной плазмиды, триплеты для лизина и аргинина, которые необходимы для работы пептидазы К.ех2р, отщепляющей сигнальную последовательность а-фактора. Обратный праймер содержал сайт для эндонуклеазы EcoRI. При сравнении нуклеотидных последовательностей нативного и амплифицированного генов /FNB1 человека обнаружили две замены нуклеотидов: A(256)G и A(296)G, в результате чего аспарагин в 87 положении замещается аспарагиновой кислотой, а лизин в 99 положении - аргинином. Обе мутации находились за единичными сайтами рестрикции для PvuII и Pstl (рис. 5), поэтому для

i получения вектора экспрессии с нормальным геном IFNBI заменили З'-конец мутантного гена, ограниченный сайтами PvuII и EcoRI, на соответствующий фрагмент нативного гена.

При трансформации штамма-реципиента 4-GS115 фрагментом плазмиды pHIF, который содержит жспрессионную кассету, маркерный ген и фланкирован 5' и 3' последовательностями гена AOXI, происходило замещение хромосомной копии гена АОХ1 этим фрагментом ДНК. Фенотип интегрантов - His Muf, они отличаются слабым ростом на среде с метанолом. Это обусловлено тем, что у них отсутствует Aoxlp, и первую реакцию утилизации метанола катализирует минорный изозим Аох2р. Интегранты, полученные при замещении хромосомного гена АОХ1, стабильны, и, самое главное, они не представляют потенциальной опасности, т.к. не содержат бактериального репликона и генов антибиотикоустойчивости (Cregg a. Madden, 1988).

В культуральной среде штаммов-продуцентов появлялись два дополнительных белка с молекулярной массой 20 и 22 кДа (рис. 6), которые давали положительную реакцию с моноклональными антителами к (3-ИФН человека, что доказывает принадлежность этих белков к (3-ИФН. Проявление

электрофореграммы реактивом Шиффа, а также обработка белков эндо-P-N-

ацетилглюкозаминидазой Н показали, что дрожжи Р paslotis секретируют гликозилированную и негликозилированную формы р—ИФН, при этом белок с молекулярной массой 22 кДа является гликопротеином с N-типом гликозилирования. Увеличение молекулярной массы секрежруемого р-ИФН человека, имеющего 1 сайт гликозилирования, составляет примерно 2 кДа, это значит, что длина углеводной цепочки не превышает 10 моносахаридных остатков, и рекомбинантный белок в дрожжах Р pasloris не подвергается гипергликозилированию.

Появление минорной полосы негликозилированного Р-ИФН, по-видимому, говорит о насыщении маннозилтрансфераз и означает, что для этого гетерологичного белка достигнут некий предельный уровень секреции Продукция Р-ИФН составила не

12 3 4 5

Рис. 6. Электрофореграмма белков культуральной среды ипаммя-рсцшшспта и штаммов-мродуцептов Р-ИФН человека. 1 - маркеры мол. массы, кДа (овальбумнн - 45,0, карбоянгидраза - 31,0, иш иби гор трипсина - 20,5, лшоцим -14,4), 2, 3 - ра1личныс клопы ■шамма-продуцеша 4-Г,8115/р1ПР2, 4 -иламм-продуцент 4-0$П5/рШГ, 5 -шшмм-рециниенг 4-С8115.

менее 25 мг/л среды, что значительно превышает продуктивность штаммов дрожжей-сахаромицетов ВКПМ У-876 (Останин и др., 1989) и ВКПМ У-2286 (Падкина и др, 1998), обеспечивающих секрецию или внутриклеточное накопление рекомбинантного белка. Штамм дрожжей Р разЮпя 4-С8115/рН1Р2 (ВКПМ У-2470) - продуцент Р-ИФН человека защищен патентом РФ (Падкина и др., 2000а).

Уровень секреции мутеина оказался в 1,5-2 раза выше, чем нормального белка, несмотря на то, что произошедшие замены нуклеотидов привели к появлению более редкого для дрожжей Р рая/опя триплета для аргинина (АСС). Увеличение выхода мутеина, вероятно, следует объяснять тем, что замены аспарагин—»аспарагиновая кислота и лизин—»аргинин приводят к образованию конформации белка, которая способствует повышению эффективности секреции. В пользу этого предположения говорят данные о 6-кратном увеличении секреции (3-лактоглобулина вследствие единичной аминокислотной замены (Квакша е! а1., 1999).

Оба рекомбинантных Р-ИФН человека обладали одинаковой биологической активностью 2x107 МЕ/мг, это связано, по-видимому, с тем, что мутационные изменения в молекуле мутеина произошли вне сайта связывания с рецептором

Создание штамма дрожжей Р. рах1огк, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление рекомбинантного Р-ИФН человека. Высокий уровень синтеза и секреции рекомбинантного (3-ИФН человека не сопровождался замедлением скорости роста и снижением жизнеспособности штаммов - продуцентов дрожжей Р рах(от, в отличие от дрожжей 5 сегеутае. Для того, чтобы выяснить, чем обусловлено отсутствие негативного влияния чужеродного белка: секрецией или особенностями метаболизма дрожжей Р рая1ош, получили продуцент, обеспечивающий внутриклеточное накопление р-ИФН. При конструировании вектора экспрессии рН1УВ из плазмиды рН1Р удалили фрагмент ДНК, кодирующий сигнальный пептид МРа. Продукция Р-ИФН штаммом 4-С8115/рШВV составила не менее 10 мг/л среды, что в 10 раз превышает значения, полученные для штамма-продуцента дрожжей-сахаромицетов ВКПМ У-2286, при этом не происходило снижения скорости роста штамма-продуцента. Основная масса рекомбинантного Р-ИФН человека в клетках дрожжей Р раэ^пБ, в отличие от дрожжей $ сегеч'тае, находилась во фракции водорастворимых белков. Присутствие гетерологичного белка в растворимом состоянии, достаточно высокий уровень синтеза Р-ИФН человека и отсутствие негативного влияния гетерологичного белка на жизнедеятельность дрожжей Р раМоги, возможно, обусловлены особенностями дыхательного метаболизма метилотрофных дрожжей, связанного с усиленным синтезом шаперонов и ферментов, обеспечивающих защиту клетки от оксидативного и других видов стресса (Сос1оп е1а1., 1998).

Создание штаммов дрожжей Р. рещог'н, синтезирующих и секретирующих а16-ИФН человека. Интерес к а 16-ИФН обусловлен тем, что этот белок относится к подтипу а4-ИФН, который совместно с а!-ИФН и а2-ИФН составляет основную фракцию ИФН в индуцированных лейкоцитах (ЖбсоН е/ а/., 1984). Использование дрожжей Р ран1опэ для продукции а 16-ИФН человека позволяло рассчитывать на более высокий выход рекомбинантного белка, открывало возможность получения секреторного продуцента и использования упрощенной процедуры очистки гетерологичного белка.

При конструировании плазмиды pHIN, содержащей ген IFNA16 человека под контролем промотора и терминатора гена АОХ1, и получении штамма дрожжей Р pasforis, синтезирующего и секретирующего а16-ИФН человека, использовали те же приемы, что при получении штамма-продуцента ß-ИФН человека. При сравнении спектра секретируемых белков у штамма-продуцента 4-GS115/pHIN обнаружили две дополнительные белковые полосы: основную - с молекулярной массой около 20 кДа, что соответствует молекулярной массе а!6-ИФН, и минорную - 22 кДа (рис. 7а). Оба белка давали положительную реакцию с антителами к а2-ИФН человека и не являлись гликопротеинами, как и нативный а16-ИФН Появление рекомбинантного белка с большей молекулярной массой, по-видимому, является следствием неправильного' процессинга а16-ИФН человека, обусловленного особенностями его структуры. Он содержит две внутримолекулярные дисульфидные связи, в образовании одной из которых принимает участие N-концевой цистеин (Wetzel, 1981; Pestka, 2000). В связи с тем, что замыкание дисульфидных связей происходит в эндоплазматичёском ретикулуме (Zapun et al., 1999; Rossanese et al., 1999), могут возникать стерические препятствия для работы пептидазы Кех2р, локализованной в поздних цистернах аппарата Гольджи (Julius eta/., 1984).

Уровень продукции а16-ИФН человека составил примерно 15 мг/л культуральной среды, что превышает, как минимум, в 15 раз продуктивность штаммов дрожжей-сахаромицетов ВКПМ Y-789 и ВКПМ Y-790 (Мясников и др., 1988а; Мясников и др., 19886). Это позволило запатентовать штамм 4-GS115/pHlN (ВКПМ Y-2949) в качестве продуцента лейкоцитарного интерферона-16 человека {Падкина и др., 2002). Биологическая активность рекомбинантного а16-ИФН человека составляла 3x107 МЕ/мг.

12 4 4

Ш»

ЩФЩ

25,0

18,4

»j—а-ИФН

у-ИФН-

г;

ил-2

14,4 *4"* « э -

я б

Рис. 7. Олектрофорегрямма белков культуральной среды штамма 4-08115 и штяммов-

продуцентов а16-ИФН человека (я), у-ИФН быка (б), ИЛ-2 человека (в).

а: 1 - маркеры молекулярной массы, кДа (р-галякточидаза - 116,0, БОА - 66,0,

овальбумин- 45,0, лактатдегндрогеназа - 35,0, рестриюат В«р981 - 25,0, (З-лакчо! лобин -

18,4, лизоцим - 14,4), 2 - штамм-продуцент 4-08115/рШГ^, 3 - пилим 4-СЯ115;

б: I, 2 - штяммы-продуценты 4-С8115/рР1С9(1Р1Ч-у), 3 - шгямм 4-ОЯП5, 4 - маркеры

молекулярной массы (как в «а»);

в: 1 - штамм-продуцент 4-С8115/рН11Л, 2 - штамм 4-08115, 3 - маркеры молекулярной массы (как в «я»).

Создание штаммов дрожжей Р. раьШчь, синтезирующих и секретирующих у-ИФН быка. у-ИФН быка является гликопротеином, использование секреторных

продуцентов позволяет получить рекомбинантный белок в гликозилированной форме Конструирование вектора экспрессии pPIC9(lFN-y) проводили так же, как векторов экспрессии pHlF и pHIN. Среди белков, секретируемых штаммом-продуцентом 4-GS1 !5/pPlC9(IFN-y), присутствовали дополнительные белки с молекулярной массой около 18 и 20 кДа, которые давали положительную реакцию с моноклональными антителами к у-ИФН человека (рис. 76). В молекуле у-ИФН быка существует 2 потенциальных сайта N-гликозилирования, поэтому полученные рекомбинантные белки могут различаться степенью гликозилирования (Cerretti et a!, 1986). Незначительное увеличение молекулярной массы секретируемого у-ИФН быка позволяет говорить, что рекомбинантный белок не подвергается гипергликозилированию. *

Клетки дрожжей штамма 4-GS115/pPIC9(JFN-y) секретировали примерно 15 мг у-ИФН быка на литр культуры дрожжей (Николаев и др., 2002), что незначительно \ превышало продуктивность штаммов дрожжей-сахаромицетов ВКПМ Y-1223 » (Мясников и др., 19896) и 2P4-GRF18(pYGIB), полученного в настоящей работе. Одной из причин относительно невысокой продукции у-ИФН быка может быть малое количество копий экспрессионной кассеты в геноме штамма 4-GS115/pPIC9(lFN-y). Несмотря на то, что использование дрожжей Р pastoris не привело к такому же существенному увеличению выхода рекомбинантного у-ИФН быка, как в случае рскомбинантных а16-ИФН и р-ИФН человека, полученный штамм 4-GS115/pPIC9(IFN-y) имеет определенное преимущество по сравнению со штаммами-продуцентами дрожжей S cerevisiae, которое заключаются в том, что рекомбинантный белок секретируется в культуральную среду и является гликопротеином, как нативный у-ИФН быка

Создание штаммов дрожжей P. pastoris, обеспечивающих синтез и внутриклеточное накопление у-ИФН быка. Применение непатогенных микроорганизмов - дрожжей в качестве продуцентов белков животных позволяет не только получать рекомбинантные белки, пригодные для ветеринарной медицины, но и # использовать штаммы-продуценты в качестве иммунопробиотических пищевых добавок, что позволяет исключить трудоемкую процедуру выделения и очистки рекомбинантного ИФН. Кроме того, дрожжи являются прекрасным источником белка ^ и витаминов, а липополисахариды, входящие в состав клеточной стенки микроорганизмов, активируют систему местного иммунитета и индуцируют продукцию собственных цитокинов (Navarro a. David, 1999; Coates a. McColl, 2001). При этом особенности создания штаммов-продуцентов исключают возможность попадания в клетки дрожжей и, следовательно, в организм животных последовательности бактериальной ДНК, содержащей гены антибиотикоустойчивости.

Вектор pBlG, обеспечивающий синтез и внутриклеточное накопление у-ИФН быка, получали тем же способом, что и соответствующий вектор pHIVB для продукции Р-ИФН человека (Градобоева и др., 2002) Рекомбинантный у-ИФН быка, подобно Р-ИФН человека, в клетках дрожжей Р pastoris присутствует, в основном, в растворимом состоянии, а не в виде «телец включения», как в дрожжах-сахаромицетах. Уровень синтеза у-ИФН быка составляет 15-20 мг/л, что превышает продуктивность штамма-протогипа ВКПМ Y-1223 (Мясников и др., 19896). Полученный штамм ВКПМ Y-2990 -внутриклеточный продуцент у-ИФН быка, защищенный патентом РФ (Градобоева и

др, 2002), может быть использован не только в качестве иммунопробиотической добавки, повышающей устойчивость животных к различным заболеваниям, по и для выделения рекомбинантного белка.

Таким образом, сравнение дрожжей S cerevisiae и Р posions в качестве продуцентов гетерологичных ИФН свидетельствует об определенных преимущесгвах метилотрофных дрожжей, которые выражаются в более высоком уровне продукции, отсутствии или уменьшении агрегации синтезируемых полипептидов, менее выраженном негативном влиянии рекомбинантных белков.

Создание штаммов дрожжей P. pastoris, синтезирующих и секретирующих ИЛ-2 человека. ИЛ-2, как и ИФН, синтезируется в виде предшественника, в процессе секреции происходит отщепление сигнального пептида, образование внутримолекулярной дисульфидной связи и гликозилирование белка. Присоединение углеводных остатков повышает стабильность молекулы и увеличивает время ее циркуляции в кровотоке (Robb et al, 1984). Существующий штамм дрожжей S cerevisiae - продуцент ИЛ-2 человека обеспечивает достаточно высокий уровень синтеза рекомбинантного белка (Мясников и др, 1989а). Однако ИЛ-2 человека накапливается внутри клеток в виде "телец включения" и не содержит углеводного компонента, поэтому создание штамма дрожжей Р pastoris, секретирующего ИЛ-2 человека, казалось весьма перспективным.

Для получения вектора экспрессии pH!L2 и штамма дрожжей Р pastoris, секретирующего ИЛ-2 человека, использовали те же методические приемы, что при создании штамма ВКПМ Y-2470 - продуцента Р-ИФН человека Анализ спектра белкой культуральной жидкости одного из интегрантов 4-GS115/pHIL2 показал появление дополнительного белка с молекулярной массой около 16,5 кДа, что на 1 кДа превышает молекулярную массу негликозилированной формы ИЛ-2 человека, отсюда следует, что длина олигосахаридной цепи должна быть не более 5-6 моносахаридных остатков (рис. 7в). Уровень продукции рекомбинантного ИЛ-2 человека не превышал 10-15 мг/л культуральной жидкости и оказался ниже, чем у штамма-прототипа ВКПМ Y-79I (Мясников и др., 1989а) Однако секретируемый рекомбинантный ИЛ-2 человека обладал в 4 раза более высокой биологической активностью, чем ИЛ-2, выделяемый m клеток дрожжей S cerevisiae (Gradoboeva et al, 2005) Возможно, это обусловлено тем, что в процессе секреции происходит правильное замыкание внутримолекулярной дисульфидной связи, и рекомбинантный ИЛ-2 человека принимает нативную конформацию.

Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов рекомбинантных секреторных ИФН. Уровень продукции гетерологичных белков и значительной степени зависит от условий культивирования штаммов-продуцеигон (Sreekrishna et а!., 1988; De Roubin et ai, 1992; Issaly et al, 2001; Xie et al., 2003) Мы изучали влияние концентрации глицерина и метанола, температурного режима, солевого состава и рН культуральной среды на выход рекомбинантного белка (Panteleeva et al., 2003). В качестве модельного штамма использовали 4-GS115(pHIN) -секреторный продуцент а16-ИФН. Накопление биомассы оценивали по гусюгс клеточной суспензии, количество секретируемого а16-ИФН человека определяли при помощи иммуноферментного анализа (рис. 8)

Показали, что повышение концентрации питательных веществ на первой стадии культивирования не сопровождалось увеличением клеточной биомассы. Обнаружили,

что уменьшение объема среды при индукции синтеза а16-ИФН человека, часто используемое при культивировании штаммов-продуцентов фенотипа Met (Murasugi et al., 2001; Zhang el al., 2001, Xu et al., 2002, Kawai et al., 2003), приводило к уменьшению суммарного количества а 16-ИФН человека. Увеличение концентрации метанола до 1% повышало продукцию «16-ИФН человека в 1,6 раза, что является, вероятно, следствием изменения уровня транскрипции гена IFNA16. Понижение до 20° температуры во время индукции синтеза а16-ИФН человека сопровождалось 2-кратным увеличением количества секретируемого белка, что можно объяснить замедлением метаболизма продуцента, вследствие чего появляются свободные шапероны и другие вспомогательные белки, обеспечивающие более эффективный фолдинг, посттрансляционную модификацию и секрецию рекомбинантного белка. Понижение температуры приводит также к уменьшению активности экстраклеточных протеаз и сопровождается стабилизацией секретируемого белка. Наши результаты согласуются с данными других исследователей о влиянии температуры на выход рекомбинантных белков (Li et al., 2001, Sarramegna et al., 2002; Xu el al2002; Jahic et al., 2003). Увеличение выхода а 16-ИФН человека при более высокой концентрации дрожжевого экстракта, вероятно, объясняется блокированием экстраклеточных протеаз. Обнаруженное негативное влияние фосфатного буфера на выход а 16-ИФН человека может свидетельствовать о том, что неорганический фосфат ингибирует какие-то этапы экспрессии клонированного гена или синтеза и секреции ® гетерологичного белка у дрожжей Р pastoris Сочетание оптимальных условий выращивания штамма-продуцента обеспечивает увеличение выхода а16-ИФН человека более, чем в 2 раза (рис. 8) Анализ возможных причин влияния f исследованных факторов на продукцию рекомбинантного а 16-ИФН человека дает основание полагать, что многие выявленные закономерности окажутся общими для штаммов дрожжей Р pastoris - секреторных продуцентов белков человека.

Разработка схемы очистки рекомбинантных а16-ИФН и р~ИФН человека, секретируемых клетками дрожжей P. pastoris. Секреция гетерологичного белка в культуральную жидкость существенно упрощает его выделение и может рассматриваться в качестве первой стадии очистки Предложенная нами относительно простая процедура выделения рекомбинантных а 16-ИФН и (3-ИФН человека, включающая ультрафильтрацию, осаждение белков сульфатом аммония и гель-фильтрацию (Пантелеева и др, 2003), позволяет с минимальными потерями получать рекомбинантные белки, на 80% очищенные от примесных белков (рис. 9). При выделении рекомбинантных белков из культуральной среды могут возникать проблемы, связанные с образованием межмолекулярных агрегатов интересующего белка и пептидосодержащих компонентов питательной среды (Капауа et al., 1989; Вае

I 25°1 й

МН! •

О о .,,.. , , ни , ни , ь- , „,„■, [ (

| 12 3 4 5 6 ^

Рис. 8. Содержание а16-ИФН человека в культуральной жидкости штамма 4-СХ115/рП1М: 1 - стандартные условия культивирования, 2-1% метанол, 3-0,1 М ци1 ратный буфер, 4 - 3% дрожжевой экстракт, 5 - индукция при 20°, 6 -оптимальные условия культивирования (приведены средние значения трех независимых определений).

eI al., 1999). Аномальное поведение а16-ИФН и р-ИФН человека при гель-фильтрации на сефакриле S100 может быть следствием подобной агрегации. Среди

высокомолекулярных примесей в полученных препаратах а16-ИФН и Р-ИФН человека могут присутствовать не только агрегаты этих белков с пептидами культуральной среды, но и олигомеры самих рекомбинантных белков На возможность олигомеризации указывают данные об образовании димеров а2Ь-ИФН и Р-ИФН в присутствии ионов Zn2+, которые взаимодействуют с остатками гистидина мономеров (Radhakrishnan el al., 1996; Karpusas el al., 1997). Димеризация Р-ИФН может происходить и за счет межмолекулярной дисульфидной связи, в образовании которой участвует цистеин (С 17) (Mark etal., 1984).

Фракционирование рекомбинантных белков в присутствии 0,1% ДСН, 2 мМ дитиотреитола или 4 М мочевины сопровождалось увеличением доли мономеров <х 16-ИФН и Р-ИФН, но не приводило к исчезновению высокомолекулярных агрегатов. Эти результаты позволяют говорить о том, что образование агрегатов секретируемых а16-ИФН и Р-ИФН человека обусловлено взаимодействиями различной природы. Для предотвращения агрегации рекомбинантных белков следует выделять их в присутствии супрессора агрегации L-аргинина (Lu el al., 2001), неионных детергентов (Вае el al., 1999) или полиэтиленгликоля (Cleland el al., 1992; Tsumoto el al, 2003).

Создание штаммов дрожжей P. pastoris - продуцентов синтаксина Б, пресинаптического глутаматного рецептора мозга крысы

Конструирование вектора экспрессии, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление синтаксина Б. Синтаксин Б участвует в регуляции проницаемости мембраны нейронов и генерировании постсинаптического потенциала. Изучение функциональной организации и структуры активного центра белков-рецепторов необходимо для понимания механизмов возникновения ряда заболеваний центральной нервной системы (Дамбинова, 1989).

При конструировании вектора экспрессии pHGR33 структурный ген синтаксина Б крысы (STXIB) клонировали под контролем промотора и терминатора гена АОХ1 в плазмиде pHIL-D2, которая не содержит фрагмента ДНК, кодирующего структуру сигнального пептида ос-фактора дрожжей S cerevisiae, вследствие чего рекомбинантный белок не секретируется

Получение интегрантов дрожжей P. pastoris, содержащих в геноме ген STX1B, и оценка уровня продукции рекомбинантного синтаксина Б. Во фракции

Рис. 9. Электрофоре! рамма (а) и деиснгограмма (б) рекомбинантных «16-ИФН и р-ИФН человека. 1 - маркеры молекулярной массы (кДа), как на рис. 7,2 - Р-ИФН, 3 - а16-ИФН

мембранных белков штамма-продуцента 4-GS115/pHGR33 появлялся дополнительный белок с молекулярной массой около 33 кДа (рис. 10), который давал положительную реакцию с моноклональными антителами к синтаксину Б мозга крысы. Тот факт, что рекомбинантный синтаксин Б в клетках дрожжей, как и в клетках млекопитающих, связан с мембранами, позволяет говорить о сходстве сигнальных последовательностей, определяющих мембранную локализацию белков, у дрожжей Р posions и млекопитающих. Уровень синтеза рекомбинантного белка составил около 5 мг/л культуральной среды. Относительно невысокая продукция синтаксина Б, вероятно, обусловлена не только его мембранной локализацией и изменением морфологии колоний дрожжей (Самбук и др., 2001), но и возможным участием рекомбинантного белка во внутриклеточном транспорте белков у дрожжей Р pastoris В пользу этого предположения говорят данные о значительной гомологии синтаксина Б и белков Ssolp, Sso2p, Sed5p, Рер12р, связанных с везикулярным транспортом в клетках дрожжей-сахаромицетов (Aalto et al., 1993).

Получение штаммов дрожжей P. pastoris, секретирующих рекомбинантный синтаксин Б. Мы полагали, что транслокация гетерологичного синтаксина на поверхность клетки могла предотвратить его встраивание во внутренние мембраны клетки дрожжей и уменьшить негативное воздействие При создании вектора экспрессии pPIC(GR33), обеспечивающего синтез и секрецию синтаксина Б, использовали те же методические приемы, что при конструировании вектора pHIF.

Анализ спектра секретируемых белков показал, что в культуральной жидкости штамма-продуцента 4-GS115/pPIC(GR33) появляются 2 дополнительных белка с молекулярной массой около 34-35 кДа (рис. 11). Увеличение молекулярной массы секреторного синтаксина Б может быть вызвано присоединением углеводных остатков в двух сайтах N-гликозилирования. Полученный штамм секретирует не менее 5 мг/л синтаксина Б, что не превышает продуктивность штамма 4-GS115/pHGR33 (Градобоева и др., 2003) Достоинством секреторного продуцента является возможность использования более простой процедуры очистки гетерологичного белка.

Экспрессия гена STXIB в дрожжах Р pastoris не только открывает возможность получения синтаксина Б для проведения фармакологических исследований, но имеет важное прикладное значение. Известно, что суперпродукция белков синтаксинов Ssolp и Sso2p у дрожжей S cerevisiae сопровождается увеличением секреции а-амилазы

Рис. 10. Денситограмма разделения в ПААГ мембранных белков, сиитетируемых клетками дрожжей штаммов 4-С.8115 и 4-С8115/рПС1Ш. Маркеры мол. массы, кДа (карбоангидра >а - 31,0; ингибитор трипсина 20,5, лиюцим -14,4).

1 2 3 116,0 *

14,4

Рис. 11. '>лектрофореграмма бел коп культуральной среды штаммов 4-ввий и 4-(;8ля/рР1г:(01Ш). 1 -маркеры молекулярной массы (кДа), как на рис. 7, 2 - штамм 4-08115, 3 -штамм 4-С8115/рР1С(СИЗЗ).

Bacillus sp (Ruohonen et al., 1997). При помощи ПЦР нами доказано, что в геноме дрожжей Р pastoris присутствуют гены, гомологичные STXIB, поэтому можно ожидать, что штаммы дрожжей Р pastoris продуценты синтаксина Б, будут отличаться повышенной секрецией других чужеродных белков.

Клонирование гена, кодирующего структуру основного белка HBsAg, под контролем промотора гена АОХ1

Создание штамма-продуцента HBsAg особенно актуально в связи с широким распространением гепатита В и возросшей потребностью в отечественных рекомбинантных вакцинах Метилотрофные дрожжи были успешно использованы для % производства вакцины «Heberbiovac» на Кубе (Penton et al., 1994).

Конструирование вектора экспрессии, обеспечивающего секрецию рекомбинантного HBsAg adw и ayw серотипов. Выбор данных серотипов был * обусловлен тем, что они наиболее распространены в Северной Европе (Norder et al, ч 1993) и в России (Bichko et al, 1985; Борисова и Мельников, 1999). Создание рекомбинантной плазмиды pP!C9(S-adw), обеспечивающей синтез и секрецию основного белка HBsAg (S белка) adw серотипа, проводили по схеме, использованной ранее для создания плазмиды pHIF Структурный ген S белка ayw серотипа, отличающийся от гена S-adw одним нуклеотидом (Okamoto et al., 1987), синтезировали при помощи ПЦР.

Получение штаммов дрожжей P. pastoris, секретирующих рекомбинантный HBsAg. Анализ спектра белков, синтезируемых интегрантами 4-GS115/pPIC9(S-adw) и 4-GS115/pPIC9(S-ayw), показал, что они синтезируют 2 белка, иммунологически родственных S белку, которые не секретируются в культуральную среду, а оказываются во фракции мембранных белков (Падкина и др., 20006). Белок с молекулярной массой около 28 кДа, очевидно, является гликозилированной формой S белка (Peterson, 1981), следовательно, рекомбинантный белок проходит, по крайней мере, первые этапы секреторного пути. Появление белка с большей молекулярной } массой, по-видимому, является следствием неэффективной работы Кех2р, активность которой может быть ингибирована гликозилированием белка-субстра1а (Weiss et а!., 1998). Согласно базе данных Swiss-Prot, в молекуле S белка присутствуют 2 потенциальных сайта N-гликозилирования, один из которых (N3) находится вблизи oi сайта расщепления эндопротеазы [http://cn.expasy.org/cgi-bin/niceprot.pI7P31873].

Отсутствие секреции S белка, скорее всего, можно объяснить тем, что он содержит 4 трансмембранных домена (Khan et al., 2004) и может вести себя как интегральный мембранный белок, в отличие от синтаксина Б, который является периферическим мембранным белком и имеет один трансмембрапный домен [http://cn.expasy.org/cgi-bin/niceprot.pl7P32853].

Получение штамма дрожжей P. pastoris, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление рекомбинантного HBsAg. Работу по созданию штаммов дрожжей, не секретирующих S белок, начали с получения векторов экспрессии pHBS(S-adw) и pHBS(S-ayw), для этого из плазмид pPlC9(S-adw) и pPIC9(S-ayw) удалили фрагменты ДНК, кодирующие сигнальную последовательное п> а-фактора дрожжей. При подобном конструировании плазмид перед стартовым AUG кодоном гена S в -3' положении оказывался аденозин, что является характерной

особенностью генов дрожжей S cerevisiae, экспрессируемых с высокой эффективностью (Yun et al., 1996).

Среди белков штамма-продуцента 4-GS115/pHBS(S-adw) обнаружили дополнительные белки с молекулярной массой 24 и 28 кДа (рис. 12), иммунологически родственные белку S. Белок 24 кДа соответствует негликозилированной форме белка S (Peterson, 1981). Появление белка с молекулярной массой 28 кДа, который является, очевидно, гликозилированной формой

рекомбинантного белка (Peterson, 1981), означает, что часть S белка, несмотря на отсутствие сигнального пептида a-фактора, попадает в эндоплазматический ретикулум дрожжей Р pastoris, где подвергается гликозилированию. Возможно, что сигналом для транслокации S белка у дрожжей, как и у млекопитающих, служат последовательности, определяющие мембранную локализацию этого белка (Khan et al., 2004). Суммарный уровень продукции двух форм S белка составил не менее 3040 мг/л среды, что превышает в 4 раза продуктивность штамма дрожжей Р pastoris NRRL Y-!5851(HBS), экспрессирующего ген S под контролем АОХ1 промотора (Tschopp et al., 1990), и в 6-8 раз продуктивность штамма дрожжей-сахаромицетов ВКПМ Y-2203, который используется для производства отечественной вакцины для профилактики гепатита В (Друца и др., 1997). Одно из отличий штамма NRRL Y-15851(HBS) заключается в том, что в экспрессионной кассете -3 положение занимал не аденозин, как в штаммах 4-GS115/pHBS(S-adw) и 4-GS115/pHBS(S-ayw), а тимидин. Полученные данные свидетельствуют о том, что выход гетерологичного белка зависит от последовательности нуклеотидов перед стартовым кодоном. Кроме того, можно сделать вывод о том, что структурные особенности лидерной области мРНК, обнаруженные у дрожжей S. cerevisiae, характерны и для дрожжей Р pastoris, и это необходимо учитывать при конструировании векторов экспрессии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе проведен сравнительный аналив отечественных и зарубежных исследований по экспрессии гетерологичных генов в дрожжах S cerevisiae и Р pastoris и экспериментально изучено влияние различных параметров на продукцию рекомбинантных белков в клетках дрожжей. Решение поставленных задач стало возможным благодаря интегральному подходу, сочетающему методы генетики, молекулярной биологии, генной инженерии, биохимии и микробиологии. Для увеличения выхода гетерологичного белка требуется оптимизация каждого этапа создания штамма-продуцента, начиная от конструирования вектора экспрессии и заканчивая выделением и очисткой интересующего белка. Результаты наших исследований свидетельствуют о более высокой эффективности системы экспрессии дрожжей Р pastoris и их повышенной устойчивости к негативным воздействиям

Рис. 12. Дснситограмма разделения в ПААГ белков штамма-продуцента 4-СЯ115/рНВ8(8-а<1«') и штамма-реципиента 4-С8115. Маркеры молекулярной массы, кДа (глутаматдсгидрогсиаза - 55,0, карбоангилраза 31,0,

триозофосфоизомераза - 26,6, ингибитор трипсина - 20,5, мио( лобин - 17,8, лизоцнм - 14,4).

гетерологичных белков, что обусловлено особенностями метаболизма метилотрофных дрожжей.

Главным итогом работы является создание штаммов дрожжей .V сегеупчае и Р раМог/я, синтезирующих гетерологичные белки медицинского назначения Нами впервые получены штаммы дрожжей Р рая/опч - продуценты а16-ИФН и р-ИФН человека, у-ИФН быка, синтаксина Б мозга крысы, а штамм дрожжей Я сеге\пх1ас -продуцент (3-ИФН человека и штамм дрожжей Р рая1ош - продуцент I ГВэАц превосходят по продуктивности известные аналоги. Пять штаммов-продуцентов рекомбинангных белков защищены патентами РФ (табл. 1).

Таблица 1

Штаммы дрожжей 5 сегехтае и Р раь1от - продуценты белков различной природы, полученные в настоящей работе

Штамм Система экспрессии Белок Способ и уровень продукции Наличие анало! ов Примечание

2P4-GRF18/ рНВ1 (ВКПМ Y-2286) Промотор гена PHOS дрожжей S cerevtsiae Р-ИФП человека Внутриклст 1 мг/л ВКПМ У-876,0,5 мг/л (Останин и др , 1989) Получен патент РФ (1998 1 )

4-GS115/ pHIF (BKXIM Y-2470) Промотор гена AOXI дрожжей Р postons Р-ИФП человека Секреция, 25 мг/л 08115/рР1С9/Н'п 6-12 мг/л (Зкоко е1 а1, 2003) Получен патент РФ (2000 г)

4-GS115/ pH IN (ВКПМ Y-2949) — а 16-ИФН человека Секреция, 15 мг/л отсутствуют Получен патент РФ (2002 г.)

4-GS115/ pPIC9/lFN-y — » — у-ИФН быка Секреция, 15 мг/л отсутствуют

4-GS115/ pBIG (ВКПМ Y-2990) у-ИФН быка Внуфиклет , 15-20 мг/л отсутствуют Получен патент РФ (2002 г)

4-GS 115/ pIIIL2 — » — ИЛ-2 человека Секреция, 15 м|/.1 1 г/л (УеЬсееЬ), личн сообщ, цит гю Cregg е1 а!, 1993)

4-GS115/ pHBS/S-adw (ВКПМ Y-2532) — Поверхности антиген вируса гепатита В Внутриклш , 30-40 мг/л мономера. 8,4 мг/л мономера (ТьсНорр с1 а1, 1990) Получен патент РФ (2000 г)

4-GS 115/ pHGR33 (ВКПМ Y-2478) — » — Синтаксин Б мозга крысы Внутриклет, 5 м|/л оюутствуют Шгамм депонирован в ВКПМ

4-GS 115/ pPÏC(GR33) — » — Синтаксин Б мозга крысы Секреция, 5 м|/л отсутствуют

Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что белки различной природы могут быть успешно синтезированы в клетках дрожжей, при этом рекомбинантные белки по всем параметрам будут максимально приближены к нативным белкам. Учитывая степень разработанности дрожжевых систем экспрессии и простоту работы с ними, можно заключить, что в настоящее время системы экспрессии дрожжей являются наиболее удобными и экономически выгодными для производства белков высших эукариотических организмов.

ВЫВОДЫ

1 Использование рер4 мутанта дрожжей S cerevisiae и модификация вектора экспрессии, которая заключается в замене фрагмента MF-alpha-1 промотора с областью инициации транскрипции в гибридном промоторе PHOS-MF-alpha-l аналогичным фрагментом РН05 промотора, сопровождается увеличением продукции рекомбинантного ß-ИФН человека в 2 раза. Аналогичная мутация штамма-продуцента у-ИФН быка повышает выход рекомбинантного белка в 1,4 раза.

2 Обнаружено, что синтез ß-ИФН человека и у-ИФН быка негативно влияет на рост штаммов дрожжей cerevisiae - продуцентов рекомбинантных белков и повышает частоту потери экспрессионных плазмид. Продукция ß-ИФН человека сопровождается снижением на 30% активности цитохром С-оксидазы штамма-продуцента.

3. Создана коллекция штаммов дрожжей Р pastoris - реципиентов для клонирования гетерологичных генов, впервые у дрожжей Р pastoris получены ade2 и pho85 мутанты.

4. Сконструированы векторы экспрессии, несущие структурные гены а16-ИФН, ß-ИФН, ИЛ-2 человека, у-ИФН быка, синтаксина Б мозга крысы, основного белка поверхностного антигена вируса гепатита В под контролем АОХI промотора и обеспечивающие синтез и секрецию гетерологичных белков в дрожжах Р pastoris.

5 Впервые созданы штаммы дрожжей Р pastoris - продуценты а16-ИФН, ß-ИФН человека, у-ИФН быка, синтаксина Б мозга крысы. Получен штамм дрожжей Р pastoris - продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В, превосходящий по уровню продукции известные аналоги. Штаммы-продуценты а16-ИФН, ß-ИФН человека, у-ИФН быка, поверхностного антигена вируса гепатита В защищены патентами РФ.

6 Показано, что штаммы дрожжей Р pastoris - продуценты а16-ИФН и ß-ИФН человека синтезируют и секретируют примерно в 20 раз больше рекомбинантного белка, чем штаммы-прототипы дрожжей-сахаромицетов При этом высокий уровень синтеза гетерологичных белков не сопровождается снижением скорости роста штаммов-продуцентов. В отличие от дрожжей S cerevisiae, основная часть цитоплазматической формы рекомбинантных ß-ИФН человека и у-ИФН быка находится в клетках дрожжей Р pastoris в растворимом состоянии. Полученные результаты свидетельствуют о повышенной устойчивости дрожжей Р pastoris к негативным воздействиям гетерологичных белков и о более эффективной работе аппаратов транскрипции, трансляции и секреции по сравнению с дрожжами S cerevisiae.

7. Обнаружено, что синтаксин Б мозга крысы в клетках дрожжей Р pastor ts, как и в клетках млекопитающих, является мембранным белком, что позволяет говорить о сходстве у этих организмов сигнальных последовательностей, определяющих мембранную локализацию белков.

8. При оптимизации условий культивирования штамма-продуцента а16-ИФН человека установлено, что продукция рекомбинантного белка зависит от концентрации метанола, дрожжевого экстракта, неорганического фосфата, рН культуральной среды и температуры во время индукции синтеза а16-ИФН человека. Сочетание оптимальных условий при выращивании штамма-продуцента обеспечивает увеличение выхода а16-ИФН человека более, чем в 2 раза.

9 Разработана схема получения а16-ИФН и р-ИФН человека из культуральной жидкости дрожжей Р pastoris, которая позволяет получить рекомбинантные белки, обладающие биологической активностью и на 80% очищенные от примесей

Список публикаций по материалам диссертации:

1. Kozhin S.A , Samsonova M.G., Atanasov В.К., Padkina M.V., Krasnopevtseva NO,, Smirnov M.N. The characteristics of yeast acid phosphatase 2 and genes that control its structure // Abstr. of 14th Intern. Congr. on Genetics.- Moscow.- 1978,- P.l 16.

2. Padkina M.V., Krasnopevtseva N.G., Ter-Avanesyan M.D., Smirnov M N The biochemical mapping of mutations in PHOI yeast gene // Abstr. of 14lh Intern. Congr on Genetics.- Moscow.- 1978,- P. 187.

3. Shabunov B.E., Krasnopevtseva N.G., Padkina M.V., Smirnov M.N., Kozhin S.A. Comparative genetical and biochemical study of acid phosphatases regulation in yeast of different origin // Abstr. of 14lh Intern. Congr. on Genetics.- Moscow.- 1978,- P.206.

4. Краснопевцева Н.Г., Падкина M.B., Атанасов Б.К., Смирнов М.Н. Генегико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей III. Выделение и характеристика кислой фосфатазы 1 // Вестник Ленингр. ун-та.- 1979.- Сер.З.- Вып.15.- С.97-103.

5. Krasnopevtseva N.G., Padkina M.V., Urazmanova N.A., Miasnikov A.N, Kozhin S.A., Smirnov M.N. Yeast acid phosphatase isoenzymes and regulation of their biosynthesis // Abstr. of Conf. on Yeast Metabolic and Genetic Regulation.- Jena.- 1983.- P.26

6. Падкина M.B., Краснопевцева Н.Г., Уразманова H.A., Смирнов М.Н. Выделение и характеристика трех изозимов неспецифических кислых фосфатаз дрожжей // Тез докл. конф. «Ферменты в биохимических анализах»,- Киев.- 1984,- С.27.

7. Уразманова Н.А., Падкина М.В., Мясников А.Н., Краснопевцева Н.Г , Смирнов М.Н. Изозимный состав и регуляция биосинтеза кислых фосфатаз дрожжей // В с б Нуклеазы, их биологическая роль и практическое применение,- Киев : Наукова думка -1985.-С.61-65.

8. Павлова Н.А., Падкина М.В., Смирнов М Н. Использование мультикопийнои плазмиды pJDB207 для суперпродукции кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyc о cerevisiae // Труды 4-й Всесоюзн. конф. по биологии клетки,- Тбилиси - 1985,- С.537-539.

9. Падкина М.В , Краснопевцева Н Г., Павлова Н.А., Смирнов М.Н. Клонирование гена РИ080, участвующего в регуляции синтеза репрессибельных кислых фосфата! дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Труды 4-й Всесоюзн конф. по биологии клетки -Тбилиси,- 1985.- С.540-541.

Ю.Краснопевцева II.Г., Уразманова НА, Падкина М.В , Мясников АН, Атанасов Б.К., Смирнов М Н. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей XII Выделение и характеристика репрессибельных кислых фосфатаз у дрожжей // Вестник Ленингр. ун-та,- 1986,- Сер 3,- Вып.З,- С.98-106.

11.Самбук Е.В., Павлова Н.А., Шарыпова Л.А., Падкина MB., Мясников А Н , Смирнов М.Н. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей 14. Идентификация и клонирование гена АСР5 // Вестник Ленингр. ун-та.- 1988.- Сер.З.-Вып.24,- С.300-307.

12.Падкина М.В., Самбук Е.В , Смирнов М.Н., Павлова Н.А., Белова И.В. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуцент кислой фосфатазы дрожжей // А. с SU 1639052 А1,- MKHC12N 1/19,- 1989.

13.Лучникова И.Л., Самбук Е.В., Падкина М.В. Картирование гена ACPI, кодирующего структуру КФЗ дрожжей-сахаромицетов // Тезисы докл. X Всесоюзн симпозиума «Структура и функции клеточного ядра».- Гродно.- 1990.- С.55.

14.Белова И.В., Самбук Е.В., Падкина М.В., Павлова Н А., Смирнов М.Н. Клонирование гена ACPI - структурного гена кфЗ дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Тезисы докл. X Всесоюзн. симпозиума «Структура и функции клеточного ядра».-Гродно,- 1990,-С.61.

15.Belova I.V., Sambuk Е V., Padkina M.V. The effect of substitution of PH02 activator protein by GCN4 protein on acid phosphatases synthesis in yeast // Abstr. of 15th Intern. Special. Symposium on yeast.- Riga.- 1991,- P.22.

16.Падкина M.B., Павлова H.A., Самбук E.B., Смирнов М.Н. Анализ функции гена ACPI //В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов.- М.: Наука.- 1991.-С. 186-190.

17 Самбук ЕВ , Кучкартаев А.И., Падкина М.В Картирование генов, регулирующих синтез кислых фосфатаз у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Петергофских генетических линий // Генетика.- 1991.- Т.П.- С.644-648.

18.Белова И.В., Самбук Е.В , Падкина М.В., Смирнов М.Н. Активаторы транскрипции РН02 и GCN4 в регуляции синтеза кислых фосфатаз у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика.- 1992,- Т.28- С. 11 -18.

19.Padkina M.V., Karsten S.L., Sambuk E.V. PH02 and PH04 proteins are involved in the regulation of (777 gene transcription in yeast // Abstr of GSA meeting on yeast genetics and mol. bio!.- Madison. USA.- 1996,- P.241 A.

20.Падкина М.В. Неспецифические кислые фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae: регуляция биосинтеза // Вестник СПбГУ.- 1998,- Сер.З.- Вып.4,- С.52-57

21.Падкина М.В., Парфенова Л.В., Самбук ЕВ., Смирнов М.Н. Рекомбинантная плазмидная ДНК, обеспечивающая синтез фибробластного интерферона человека клетками дрожжей, способ ее конструирования и штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуцент фибробластного интерферона человека // Патент РФ RU 2180003 С2 - МКИС 12 N 15/22,- 1998.

22 Парфенова Л В., Падкина М В Экспрессия гена фибробластного интерферона человека в дрожжах Pichia pastoris // Тезисы докл. И съезда ВОГиС,- С -Петербург.-2000.-Т.2.-С 17.

23.Самбук Е.В., Сахарова Е.Д., Падкина М.В. Экспрессия синтаксина Б - белка пресинаптического глутаматного рецептора крысы в дрожжах Pichia pastoris // Тезисы докл. II съезда ВОГиС,- С -Петербург.-2000,- Т.2.- С. 19

24.Николаев Я.В., Парфенова J1.B , Падкина М.В. Экспрессия рекомбинан гною у-интерферона быка в дрожжах Pichia pasioris. 11 Тезисы докл. конф. «Биотехнология-2000».- Пущино.- 2000.- С.98.

25.Самбук Е.В., Падкина М.В., Смирнова Т.М., Парфенова J1.B., Сахарова L-Д, Смирнов М.Н. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris - продуцента рекомбинантного пресинаптического глугаматного рецептора мозга крысы // Гезисы докл конф. «Биотехнология-2000».- Пущино.- 2000.- С. 103.

26 Падкина М.В., Парфенова Л.В , Самбук Е.В., Смирнов М.Н. Штамм дрожжей Pithia pastoris - продуцент бета-интерферона человека. Рекомбинантная плазмидная ДНК pHlF и способ ее конструирования // Патент РФ RU 2180687 CI.- МКИ С 12 N 1/19, 15/22.-2000.

27.Падкина М.В., Парфенова Л.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. Рекомбинантная плазмидная ДНК pHBS, обеспечивающая биосинтез поверхностного антигена вируса гепатита В, способ конструирования плазмиды, штамм дрожжей Pichia pastoris PS1039pHBS) - продуцент указанного антигена // Патент РФ RU 2201452 С2,- МКИ С 12 N 15/51, 15/64, 1/19.-2000.

28.Самбук П.В., Падкина М.В., Смирнова Т.М, Парфенова Л.В , Сахарова Ь.Д., Смирнов М Н. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris- продуцента рекомбинантного пресинаптического глутаматного рецептора мозга крысы // Биотехнология,- 2001.- № 2,- С.23-30.

29 Parfenova L, Padkina М The expression of human fibroblast 1FN in Sacchai omyce.s cerevisiae adversely effects on yeast cytochrome с oxidase activity // Abstr. of XX Intern. Conf. on Yeast Genet. Mol. Biol.- Prague.- Yeast.- 2001,- V.18.- S.286.

30.Парфенова Л.В., Смирнов М.Н., Самбук Е.В., Падкина М.В. Продукция (3-интерферона человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae ведет к снижению активности цитохром С-оксидазы // Биотехнология,- 2002.- №6,- С.3-10.

31.Самбук Е В., Попова Ю.Г., Падкина М В. Изучение влияния фосфата и мутаций в генах РН085, РН080, РН04 на транскрипцию гена IISP82 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae И Вестник СПбГУ,- 2002,- Сер.З,- Вып.2- №11,- С.34-41.

32.Николаев Я.В , Парфенова Л.В., Падкина MB., Смирнов М.Н. Использование дрожжей Pichia pastoris в качестве продуцента рекомбинантною у-интерферона быка // Цитокикы и воспаление,- 2002,- Т.1.- С.28-29.

33 Падкина М.В, Парфенова Л.В., Пантелеева И.Г., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. Производство белков человека в клетках дрожжей // Цитокины и воспаление,- 2002.-Т.1.- С.29-30.

34.Самбук Е В., Падкина М.В., Парфенова Л.В., Смирнов М Н Влияние продукции гетерологичных белков на метаболизм штаммов-продуценюв // Циюкипы и воспаление,- 2002 - Т 1С 30.

35 Padkina М V., Parfenova L.V., Sambuk E.V., Smirnov М N. Production ol the recombinant cytokines of higher eukaryotes in yeast // Abstr. of Г'1 Intern C'ongr "Biotechnology - state of the art and prospects of development".- Moscow.- 2002.- P.63.

36 Падкина М.В , Парфенова Л.В., Самбук Е В , Смирнов М Н. Штамм дрожжей 1'ichui pastoris - продуцент лейкоцитарною интерферона-16 человека, рекомбинан шая плазмидная ДНК pHIN и способ ее конструирования И Патент РФ RU 2203950 С1,-МКИ С 12 N 15/21, 15/23, 1/19.-2002.

37.Градобоева А.Е., Падкина М.В., Парфенова Л.В., Самбук Е.В , Смирнов М.Н. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS105(pBlG) - продуцент внутриклеточною иммунного интерферона быка, рекомбинантная плазмидная ДНК, обеспечивающая биосинтез внутриклеточного иммунного интерферона быка и способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рВЮ // Патент РФ RU 2231545 С1.- МКИ С 12 N 1/19, 15/23, 15/81,- 2002.

38 Самбук Е.В., Попова Ю.Г., Физикова А.Ю., Падкина М.В. Генетический анализ плейотропных эффектов мутаций pho85 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика,- 2003.- V.39.- №8,- Р. 871-877.

39 Падкина М.В., Тарасов С.А., Карстен С.Л., Парфенова JI.B., Попова Ю.Г., Самбук Е.В. Влияние мутаций pho85 на катаболитную репрессию гена С/77 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика.- 2003,- Т.39,- С.732-738.

40.Градобоева А.Е., Падкина М.В. Экспрессия пресинаптического глутаматного рецептора мозга крысы в дрожжах Pichia pastoris // Тезисы докл. 7 школы-конф. "Биология - наука XXI века".- Пущино.- 2003.- С.96.

41.Пантелеева И.Г., Парфенова Л.В., Андреева О.С., Падкина М.В. Получение и очистка рекомбинантного интерферона альфа человека, экспрессируемого в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris // Тезисы докл. 7 школы-конф. "Биология -наука XXI века".- Пущино,- 2003.- С. 121.

42.Парфенова Л.В., Падкина М.В. Экспрессия фибробластного интерферона человека в клетках дрожжей // Тезисы докл. 7 школы-конф. "Биология - наука XXI века".-Пущино,- 2003.-С.121.

43.Padkina M.V., Parfenova L.V., Panteleeva I.G., Gradoboeva A.E., Doobrogorskaya M.V., Sambuk E.V., Smimov M.N. Comparative studies of human and animal interferon genes expression in yeast Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris II Abstr. of Intern. Forum "Biotechnology and the present"- S.-Petersburg.- 2003.- P.7-8.

44.Smirnov M.N , Padkina M.V. Production of human recombinant proteins on the base of yeast system // Abstr of 2nd Intern Congr. "Biotechnology - state of the art and prospects of development".- Moscow.- 2003,- P.59-60.

45.Panteleeva I.G., Alekseeva M.F , Sambuk E.V., Padkina M.V. Optimization of cultivation process of methylotrophic yeast Pichia pastoris strain - producer of recombinant human interferon-al6 // Abstr. of 2nd Intern. Congr. "Biotechnology - state of the art and prospects of development".- Moscow - 2003,- P 153-154.

46.Gradoboeva A.E., Parfenova L.V., Shved N Yu., Padkina M.V. The construction of yeast Pichia pastoris strain - producer of secreted human interIeukin-2 // Abstr. of 3d Intern. Congr. "Biotechnology - state of the art and prospects of development".- Moscow - 2005 -P 113-114.

Подписано в печать 14.10.2005 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. листов 1,86. Тираж 100 экз. Заказ № 30.

ЦОП типографии Издательства СПбГУ 199061, С-Петербург, Средний пр., д.41.

»20753

РНБ Русский фонд

2006-4 19291

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Падкина, Марина Владимировна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. СИСТЕМЫ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ДРОЖЖЕЙ

SACCHAROMYCES CEREVISIAE И PICHIA PASTORIS.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Продукция рекомбинантных белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.

1.1.1. Векторы экспрессии дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

1.1.2. Структура промоторов дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

1.1.3. Промоторы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемые в биотехнологии.

1.1.3.1. Промоторы генов, кодирующих гликолитические ферменты.

1.1.3.2. Регулируемые промоторы.

Промотор гена ADH2.

Промоторы G^L-генов.

Промотор гена РН05.

Транскрипционный активатор, кодируемый геном РН04.

Белки регуляторы, кодируемые генами РН080 и РН

Белок, кодируемый геном РН081.

1.1.4. Терминаторы транскрипции генов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемые в биотехнологии.

1.1.5. Зависимость уровня гетерологичной экспрессии от эффективности основных матричных процессов дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

1.1.5.1. Транскрипция.

Роль DAS и DRS регуляторных последовательностей в эффективности транскрипции у дрожжей.

Элонгация транскрипции.

Терминация транскрипции.

Сплайсинг матричной РНК.

1.1.5.2. Стабильность матричной РНК.

1.1.5.2. Трансляция.

Инициация трансляции.

Элонгация трансляции.

Терминация трансляции.

1.1.6. Сворачивание (фолдинг) полипептидной цепи и шапероны.

1.1.7. Посттрансляционная модификация белков.

1.1.7.1. Удаление N-концевого метионина.

1.1.7.2. Ацетилирование N-концевой аминокислоты.

1.1.7.3. Фосфорилирование, N-миристоилирование и фарнезилирование белков.

1.1.8. Стабильность гетерологичных белков.

1.1.8.1. АТФ-зависимый протеолиз с участием убиквитина.

Сигналы деградации белков.

1.1.8.2. Неспецифический АТФ-независимый протеолиз в вакуолях.

1.1.9. Секреция чужеродных белков.

1.1.9.1. Сигнальные последовательности.

1.1.9.2. Протеолиз секреторных белков.

1.1.9.3. Гликозилирование секреторных белков.

1.1.9.4. Фолдинг секреторных белков.

1.2. Продукция рекомбинантных белков в дрожжах Pichiapastoris.

1.2.1. Особенности метаболизма метилотрофных дрожжей.

1.2.2. Промоторы генов дрожжей Pichia pastoris, используемые в биотехнологии.

1.2.2.1. Промотор гена ЛОХ/.

1.2.2.2. Промотор гена GAP.

1.2.2.3. Промотор гена FLD1.

1.2.2.4. Промоторы генов РЕХ8, YPT1.

1.2.3. Векторы экспрессии дрожжей Pichia pastoris.

1.2.4. Секреция гетерологичных белков.

1.2.4.1. Сигнальные последовательности.

1.2.4.2. Протеолиз секреторных белков.

1.2.4.3. Гликозилирование секреторных белков.

1.2.4.4. Формирование дисульфидных связей и внутриклеточный транспорт секреторных белков.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Штаммы.

2.1.2. Плазмиды.

2.1.3. Условия культивирования штаммов.

2.2. Методы.

2.2.1. Трансформация бактерий и дрожжей.

2.2.2. Выделение ДНК.

2.2.3. Методы молекулярного клонирования.

2.2.4. Полимеразная цепная реакция.

2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.2.6. Электрофорез фрагментов ДНК.

2.2.7. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.

2.2.8. Определение концентрации белка.

2.2.9. Электрофорез белков в ПААГ.

2.2.10. Дегликозилирование белков.

2.2.11. Гибридизация рекомбинантных белков с моноклональными антителами.

2.2.12. Иммуноферментный анализ.

2.2.13. Определение биологической активности ИФН и ИЛ-2.

2.2.14. Определение активности кислых фосфатаз.

2.2.15. Определение константы Михаэлиса.

2.2.16. Ионообменная хроматография изозимов Кф на ДЭАЭ-целлюлозе

2.2.17. Гель-фильтрация Кф, рекомбинантных ИФН и HBsAg.

2.2.18. Выделение митохондриальной фракции из клеток дрожжей.

2.2.19. Определение активности цитохром С-оксидазы.

2.2.20. Определение активности Р-галактозидазы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Создание системы экспрессии гетерологичных генов под контролем промотора гена PHOS дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

3.1.1. Изучение изозимного состава кислой фосфатазы дрожжей -сахаромицетов.

3.1.2. Зависимость синтеза Кф2 от уровня белков активаторов.

3.1.3. Создание штаммов-суперпродуцентов кислых фосфатаз.

3.2. Клонирование генов фибробластного интерферона человека и иммунного интерферона быка под контролем промотора гена РН05 дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

3.2.1. Получение рекомбинантной плазмиды pHBI.

3.2.2. Влияние генотипа штамма-продуцента на продукцию фибробластного интерферона человека и иммунного интерферона быка.

3.2.3. Выделение фибробластного интерферона человека и иммунного интерферона быка из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

3.2.4. Выяснение причин токсичности Р-ИФН человека для клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

3.2.4.1. Влияние рекомбинантного Р-ИФН на синтез белка теплового шока Hsp82p.

3.2.4.2. Изучение влияния мутацийpho80 иpho85 на жизнеспособность штаммов-продуцентов Р-ИФН человека.

3.2.4.3. Влияние рекомбинантного Р-ИФН и мутаций в гене РН085 на активность цитохром С-оксидазы.

3.3. Клонирование генов интерферонов человека и животных, гена интерлейкина-2 человека под контролем промотора гена АОХ1 дрожжей Pichia pastoris.

3.3.1. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris с мутациями в генах, гомологичных генам ADE2 и РН085 дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

3.3.2. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris с дизрупцией гена РЕР

3.3.3. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих Р-ИФН человека.

3.3.3.1. Создание вектора экспрессии pHIF.

3.3.3.2. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного гена/FM?./ человека.

3.3.3.3. Создание вектора экспрессии pHIF2, обеспечивающего синтез нативного Р-ИФН человека.

3.3.3.4. Получение интегрантов дрожжей, несущих плазмиды pHIF и pHIF

3.3.3.5. Оценка продуктивности штаммов 4-GS115/pHIF и 4-GS115/pHIF

3.3.3.6. Определение углеводного компонента рекомбинантного Р-ИФН человека, секретируемого дрожжами Pichia pastoris.

3.3.4. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление рекомбинантного Р-ИФН человека.

3.3.4.1. Создание вектора экспрессии pHIVB.

3.3.4.2. Оценка уровня продукции рекомбинантного Р-ИФН человека штаммом 4-GS115/рШУВ.

3.3.5. Создание штаммов дрожжей Pichiapastoris, синтезирующих и секретирующих а16-ИФН человека.

3.3.5.1. Создание вектора экспрессии pHIN.

3.3.5.2. Получение штамма-продуцента а16-ИФН человека и оценка его продуктивности.

3.3.6. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих у-ИФН быка.

3.3.6.1. Создание вектора экспрессии pPIC9(IFN-y).

3.3.6.2. Получение штамма-продуцента у-ИФН быка и оценка его продуктивности.

3.3.7. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, обеспечивающих синтез и внутриклеточное накопление у-ИФН быка.

3.3.8. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих интерлейкин-2 человека.

3.3.9. Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов рекомбинантных секреторных интерферонов.

3.3.10. Разработка схемы очистки рекомбинантных а16-ИФН и р-ИФН человека, секретируемых клетками дрожжей Pichia pastoris.

3.4. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris - продуцентов синтаксина Б, пресинаптического глутаматного рецептора мозга крысы.

3.4.1. Конструирование вектора экспрессии, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление синтаксина Б.

3.4.2. Получение интегрантов дрожжей Pichia pastoris, содержащих в геноме ген STX1B и оценка уровня продукции рекомбинантного синтаксина Б.

3.4.3. Получение штаммов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих рекомбинантный синтаксин Б.

3.5. Клонирование гена, кодирующего структуру основного белка поверхностного антигена вируса гепатита В, под контролем промотора гена АОХ1.

3.5.1. Конструирование вектора экспрессии, обеспечивающего секрецию рекомбинантного HBsAg adw и ayw серотипов.

3.5.2. Получение штаммов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих рекомбинантный HBsAg.

3.5.3. Получение штамма дрожжей Pichia pastoris, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление рекомбинантного HBsAg.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

Влияние структуры вектора экспрессии и числа копий клонированного гена на уровень продукции гетерологичных белков.

Влияние структуры лидерной области мРНК и присутствия редких кодонов на продукцию гетерологичных белков.

Посттрансляционная модификация гетерологичных белков.

Влияние особенностей метаболизма дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris на фолдинг рекомбинантных белков.

Стабильность гетерологичных белков.

Влияние гетерологичных белков на жизнедеятельность клетки дрожжей

Секреция гетерологичных белков.

Продукция синтаксина Б и HBsAg.

Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов.

Выделение и очистка гетерологичных белков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ экспрессии гетерологичных генов в дрожжах Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris и изучение условий повышения продукции рекомбинантных белков"

Актуальность проблемы. Международная программа «Геном человека», в реализации которой принимали участие ученые различных стран, в том числе и России, была успешно завершена к концу XX века. Установление структуры генома человека явилось фундаментом для более глубокого понимания молекулярных процессов, происходящих в многоклеточных организмах. В результате этих исследований были выявлены десятки тысяч генов, полиморфизм которых отвечает за предрасположенность к различным заболеваниям, определяет индивидуальную чувствительность к медицинским препаратам. Полученная информация открывает перспективы для лечения заболеваний различной этиологии, дает возможность определить новые мишени для используемых лекарственных препаратов и ставит задачу создания лекарственных препаратов нового поколения на основе белков человека и животных. В первую очередь речь должна идти о белках-иммуномодуляторах, интерферонах и интерлейкинах, которые обладают широким спектром биологических активностей: активируют иммунную систему,' участвуют в формировании и регуляции защитных реакций организма, оказывают антивирусное, антимикробное, противоопухолевое, радиопротективное действие. Многообразие обнаруженных и изученных физиологических функций этих белков, несомненно, указывает на их потенциальную значимость для медицины. Без сомнения подобные препараты позволят проводить направленную терапию, действовать непосредственно на причину заболевания, снизить вероятность побочных эффектов. Получение интерферонов и интерлейкинов из традиционных источников весьма проблематично вследствие ограниченности ресурсов донорской крови, из которой выделяют эти белки, а также в связи с существующей опасностью заражения ВИЧ и вирусами гепатитов В, С. Таким образом, возникает практическая необходимость гетерологичной продукции этих белков.

Благодаря успехам генной инженерии созданы штаммы Е. coli -продуценты целого ряда цитокинов. В настоящее время в России зарегистрированы и применяются для лечения препараты рекомбинантных а2-интерферона человека («Роферон», Hoffman-La Roche AG, Швейцария; «Реальдирон», Biotechna, Литва; «Реаферон», Вектор-Медика; «Интераль», НИИ ОЧБ, Россия), Р-интерферона человека («Бетаферон», Schering AG, Германия), интерлейкина-1 человека («Беталейкин», НИИ ОЧБ, Россия), интерлейкина-2 человека («Пролейкин», Chiron Corp., США).

В связи с этим возникла настоятельная необходимость поиска других организмов для продукции белков человека и животных. Системы экспрессии, созданные на основе многоклеточных эукариотических организмов (культура клеток млекопитающих, трансгенные растения и животные) позволяют получать аутентичные гетерологичные белки. Существенным недостатком этих систем является достаточная сложность работы с культурами клеток и трудоемкость получения трансгенных растений и животных, что увеличивает стоимость получаемых рекомбинантных белков.

Компромиссным решением является использование системы экспрессии дрожжей. Дрожжи являются эукариотическими микроорганизмами, поэтому способны обеспечивать корректную посттрансляционную модификацию белков человека и животных. У дрожжей подробно изучены механизмы регуляции матричных процессов и метаболизма, при работе с ними используются стандартные методы генной инженерии, дрожжи легко культивировать на относительно дешевых субстратах. Длительный опыт использования дрожжей Saccharomyces cerevisiae для производства хлеба и напитков свидетельствует о том, что они не являются патогенными для человека. Применение системы экспрессии дрожжей позволяет сочетать простоту бактериальных систем экспрессии и качество белка, получаемое в культуре клеток млекопитающих.

Инициатива создания штаммов дрожжей S. cerevisiae - продуцентов белков медицинского назначения в России принадлежит коллективу ученых лаборатории биохимической генетики Биологического НИИ СПбГУ. В результате их исследований были впервые получены и запатентованы в России штаммы дрожжей S. cerevisiae - продуценты интерлейкина-2, а 16-интерферона, p-интерферона человека и у-интерферона быка.

Уровень продукции интерлейкина-2 оказался достаточно высоким, что позволило использовать полученный штамм для производства рекомбинантного белка. В настоящее время «Ронколейкин» (рекомбинантный интерлейкин-2 человека), производимый ООО «БИОТЕХ» (Санкт-Петербург) зарегистрирован Фармкомитетом МЗ РФ в качестве лекарственного препарата. Несомненными достоинствами «Ронколейкина» являются практически полное отсутствие побочных эффектов при его применении, что объясняется использованием в качестве продуцента непатогенных дрожжей, не содержащих токсических и пирогенных факторов, а также относительно низкая стоимость препарата. Эти факторы обусловили широкое применение

Ронколейкина» для лечения септических состояний, ряда онкологических и инфекционных заболеваний.

Уровень продукции а16-интерферона и Р-интерферона человека дрожжами S. cerevisiae оказался явно недостаточным для производства этих белков. В связи с этим особый интерес представляют метилотрофные дрожжи Pichia pastoris. Достоинствами этих дрожжей является накопление значительной биомассы при культивировании на недорогих минеральных средах и более высокий уровень синтеза гетерологичных белков. Возможность интеграции интересующего гена в хромосомную ДНК дрожжей обеспечивает стабильность полученных штаммов - продуцентов. Кроме того, гликопротеины, секретируемые дрожжами P. pastoris, в отличие от дрожжей-сахаромицетов, не содержат терминальных а1,3-связанных маннозных остатков, которые являются сильными антигенными детерминантами. Это позволяет использовать в клинической практике и секреторные формы гетерологичных белков. Гликозилирование рекомбинантного белка повышает его стабильность, что имеет важное значение при выделении белка и использовании его в качестве лекарственного средства. Углеводный компонент играет существенную роль в функционировании гликопротеинов, он вовлечен в процессы связывания антител с антигенами, определяет степень иммуногенности некоторых антигенов, например, поверхностного антигена вируса гепатита В, что необходимо учитывать при создании соответствующей вакцины. Возможность получения секреторных продуцентов интерферонов человека и животных, интерлейкина-2 человека особенно актуальна в связи с тем, что природные интерфероны и интерлейкины являются секреторными белками и только в процессе секреции принимают правильную конформацию.

Целью работы является сравнительное изучение эффективности функционирования систем экспрессии гетерологичных генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris и исследование влияния различных факторов на продукцию рекомбинантных белков.

В задачи исследования входит:

• создание векторов экспрессии, обеспечивающих синтез и внутриклеточное накопление (3-интерферона человека в дрожжах S. cerevisiae и P. pastoris, а также векторов экспрессии, обеспечивающих синтез и секрецию а 16-интерферона, (3-интерферона, интерлейкина-2 человека, у-интерферона быка, синтаксина Б мозга крысы, поверхностного антигена вируса гепатита В клетками дрожжей P. pastoris',

• получение коллекции мутантов дрожжей P. pastoris;

• получение штаммов дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris, экспрессирующих гетерологичные гены и синтезирующих белки человека, животных, вирусов, имеющие важное медицинское значение;

• изучение влияния генотипа штаммов - продуцентов дрожжей S. cerevisiae на уровень продукции рекомбинантных интерферонов и выяснение возможных причин негативного влияния гетерологичных белков на жизнеспособность штаммов - продуцентов;

• оптимизация условий культивирования штаммов - продуцентов и разработка схемы очистки рекомбинантных а16-интерферона и (3-интерферона человека, у-интерферона быка;

• сравнение эффективности систем экспрессии дрожжей S. cerevisiae и Р. pastoris и выяснение влияния особенностей метаболизма этих дрожжей на уровень продукции рекомбинантных интерферонов.

Научная новизна исследования. Впервые получены штаммы дрожжей Р. pastoris - продуценты а16-интерферона и (3-интерферона человека, у-интерферона быка, синтаксина Б мозга крысы. Впервые получены ade2, pho85 мутанты P. pastoris. При выяснении причин снижения жизнеспособности штаммов дрожжей S. cerevisiae - продуцентов (3-интерферона человека получены данные о возможном функционировании этого гетерологичного белка в клетках дрожжей. Показано, что форма нахождения рекомбинантных интерферонов в клетках дрожжей зависит от вида штаммов-продуцентов. Впервые предложена гипотеза, объясняющая более высокую эффективность работы системы экспрессии метилотрофных дрожжей и их устойчивость к негативным воздействиям гетерологичных белков.

Практическая ценность. Полученные штаммы дрожжей S. cerevisiae и Р. pastoris - продуценты а16-интерферона, Р-интерферона, интерлейкина-2 человека, у-интерферона быка, синтаксина Б, поверхностного антигена вируса гепатита В, могут быть использованы для производства рекомбинантных белков медицинского назначения в создаваемом "Центре малотоннажного производства медицинских препаратов методами генной инженерии", который включен в научно-инновационный блок Программы развития Петергофа как наукограда РФ. Условия оптимизации процессов культивирования штаммов - продуцентов, схема очистки рекомбинантных белков могут быть положены в основу технологического регламента для такого производства.

На основе рекомбинантных интерферонов и интерлекина-2 могут быть созданы лекарственные препараты нового поколения, способные насытить фармакологический рынок России отечественными препаратами и заменить многие зарубежные аналоги. Поверхностный антиген вируса гепатита В может быть использован для разработки еще одной отечественной вакцины для профилактики этого опасного заболевания. Синтаксин Б мозга крысы может быть востребован в фармакологии при проведения исследований, направленных на создание лекарственных препаратов, которые избирательно действуют на различные типы нейрорецепторов.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Падкина, Марина Владимировна

выводы

1. Использование рер4 мутанта дрожжей S. cerevisiae и модификация вектора экспрессии, которая заключается в замене фрагмента MF-alpha-1 промотора с областью инициации транскрипции в гибридном промоторе PHOS-MF-alpha-l аналогичным фрагментом РН05 промотора, сопровождается увеличением продукции рекомбинантного р-ИФН человека в 2 раза. Аналогичная мутация штамма-продуцента у-ИФН быка повышает выход рекомбинантного белка в 1,4 раза.

2. Обнаружено, что синтез р-ИФН человека и у-ИФН быка негативно влияет на рост штаммов дрожжей S. cerevisiae - продуцентов рекомбинантных белков и повышает частоту потери экспрессионных плазмид. Продукция р-ИФН человека сопровождается снижением на 30% активности цитохром С-оксидазы штамма-продуцента.

3. Создана коллекция штаммов дрожжей P. pastoris - реципиентов для клонирования гетерологичных генов, впервые у дрожжей P. pastoris получены ade2 и pho85 мутанты.

4. Сконструированы векторы экспрессии, несущие структурные гены а 16-ИФН, Р-ИФН, ИЛ-2 человека, у-ИФН быка, синтаксина Б мозга крысы, поверхностного антигена вируса гепатита В под контролем АОХ1 промотора и обеспечивающие синтез и секрецию гетерологичных белков в дрожжах P. pastoris.

5. Впервые созданы штаммы дрожжей P. pastoris - продуценты а16-ИФН, р-ИФН человека, у-ИФН быка, синтаксина Б мозга крысы. Получен штамм дрожжей P. pastoris — продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В, превосходящий по уровню продукции известные аналоги. Штаммы-продуценты продуценты а16-ИФН, Р-ИФН человека, у-ИФН быка, поверхностного антигена вируса гепатита В защищены патентами РФ.

6. Показано, что штаммы дрожжей P. pastoris - продуценты а16-ИФН и Р-ИФН человека синтезируют и секретируют примерно в 20 раз больше рекомбинантного белка, чем штаммы-прототипы дрожжей-сахаромицетов. Высокий уровень синтеза гетерологичных белков не сопровождается снижением скорости роста штаммов-продуцентов. В отличие от дрожжей S. cerevisiae, основная часть цитоплазматической формы рекомбинантных Р-ИФН человека и у-ИФН быка находится в клетках дрожжей P. pastoris в растворимом состоянии. Полученные результаты свидетельствуют о повышенной устойчивости дрожжей Р. pastoris к негативным воздействиям гетерологичных белков и о более эффективной работе аппаратов транскрипции, трансляции и секреции по сравнению с дрожжами S. cerevisiae.

7. Обнаружено, что синтаксин Б мозга крысы в клетках дрожжей P. pastoris, как и в клетках млекопитающих, является мембранным белком, что позволяет говорить о сходстве у этих организмов сигнальных последовательностей, определяющих мембранную локаликацию белков.

8. При оптимизации условий культивирования штамма-продуцента а 16-ИФН человека установлено, что продукция рекомбинантного белка зависит от концентрации метанола, дрожжевого экстракта, неорганического фосфата, рН культуральной среды и температуры во время индукции синтеза а16-ИФН человека. Сочетание оптимальных условий выращивания штамма-продуцента обеспечивает увеличение выхода а16-ИФН человека более, чем в 2 раза.

9. Разработана схема получения а16-ИФН и Р-ИФН человека из культуральной жидкости дрожжей P. pastoris, которая позволяет получить рекомбинантные белки, обладающие биологической активностью и на 80% очищенные от примесей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в настоящей работе проведен сравнительный анализ отечественных и зарубежных исследований по экспрессии гетерологичных генов в дрожжах S. cerevisiae и P. pastoris и экспериментально изучено влияние различных параметров на продукцию рекомбинантных белков в клетках дрожжей. Решение поставленных задач стало возможным благодаря интегральному подходу, сочетающему методы генетики, молекулярной биологии, генной инженерии, биохимии и микробиологии. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что для повышения выхода гетерологичного белка требуется оптимизация каждого этапа создания штамма-продуцента, начиная от конструирования вектора экспрессии и заканчивая выделением и очисткой интересующего белка.

Главным итогом работы является создание штаммов дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris, синтезирующих гетерологичные белки медицинского назначения. Нами впервые получены штаммы дрожжей P. pastoris -продуценты а16-ИФН и Р-ИФН человека, у-ИФН быка, синтаксина Б мозга крысы, а штамм дрожжей S. cerevisiae - продуцент Р-ИФН человека и штамм дрожжей P. pastoris - продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) превосходят известные аналоги. Пять штаммов-продуцентов рекомбинантных белков защищены патентами РФ (табл. 5).

Экспериментально продемонстрировано влияние структуры промотора и генотипа штаммов-продуцентов на уровень продукции гетерологичных ИФН человека, что со всей очевидностью доказывает необходимость детального изучения механизмов регуляции метаболизма и клеточной физиологии используемых микроорганизмов. Впервые в нашей работе получены ade2 и pho85 мутанты дрожжей P. pastoris, что позволяет расширить спектр используемых векторов экспрессии и создает предпосылки для получения штаммов, содержащих множественные встройки клонируемых генов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Падкина, Марина Владимировна, Санкт-Петербург

1. Адлер Ю.П., Маркова Е.В., Грановский Ю.В. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий // М.: Наука.- 1971,- 283 с.

2. Альтман И.Б., Птицын Л.Р., Смирнов С.В. и др. Создание бактериального штамма-продуцента рекомбинантного у-интерферона быка, пригодного для эффективного биотехнологического производства // Биотехнология.- 1997.-№11-12.- С.3-13.

3. Аммосов А.Д. Гепатит В // Кольцово.: Институт средств медицинской диагностики. ЗАО «Вектор-Бест».- 2000.- 75 с.

4. Бакулина Л.Ф., Тимофеев И.В., Перминова Н.Г. и др. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии // Биотехнология.- 2001.- №2.- С.48-56.

5. Белова И.В., Самбук Е.В., Падкина М.В. и др. Активаторы транскрипции РН02 и GCN4 в регуляции синтеза кислых фосфатаз у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика.- 1992.- Т.28.- С. 11-18.

6. Борисова В.Н., Мельников В.А. Отечественная вакцина для профилактики гепатита В // Вакцинация (инф. бюллетень).- 1999.- №4.

7. Быковская С.В., Троценко Ю.А. Метаболизм метилотрофных дрожжей Candida methylica II Микробиология.- 1980.- T.XLIX.- С.695-701.

8. Градобоева А.Е., Падкина М.В. Экспрессия пресинаптического глутаматного рецептора мозга крысы в дрожжах Pichia pastoris II Тез. 7-ой школы-конф. "Биология наука XXI века".- Пущино.- 2003.- С.96.

9. Дамбинова С.А. Нейрорецепторы глутамата // Ленинград: Наука.- 1989.145 с.

10. Дарбре А., Кламп Д.Р. Аналитические методы // В кн.: Практическая химия белка.- М.: Мир.- 1989.- С.293-334.

11. Дебабов В.Г., Лившиц В.А. Современные методы создания промышленных микроорганизмов // М.: Высшая школа.- 1988.- 208 с.

12. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии // М.: Медицина.-1996.

13. Ершов Ф.И., Новохатский А.С. Интерферон и его индукторы // М.: Медицина.- 1980.

14. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н. и др. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов// Л.: Наука.- 1976.- 143 с.

15. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев Ф.Ф. Эндогенные иммуномодуляторы // С.-Петербург.: Гиппократ.- 1992.- 256 с.

16. Кожин С.А., Самсонова М.Г. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей IV. Генетический контроль активности кислой фосфатазы 2//Генетика.- 1975.- Т.2.- С.104-112

17. Колб В.А. Котрасляционное сворачивание белков // Молекулярная биология.- 2001.- Т.35.- С.682-690.

18. Краснопевцева Н.Г., Падкина М.В., Атанасов Б.К. и др. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей. III. Выделение и характеристика кислой фосфатазы 1 // Вестн. Ленингр. ун-та,- 1979.- Сер.З.-Вып.15.- С.97-103.

19. Краснопевцева Н.Г., Уразманова Н.А., Падкина М.В. и др. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей. XII. Выделение и характеристика репрессибельных кислых фосфатаз у дрожжей // Вестн. Ленингр. ун-та.- 1986.- Сер.З.- Вып.З.- С.98-106.

20. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование // М.: Мир,- 1984. 480 с.

21. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике // М.: Мир.- 1976.- 436 с.

22. Николаев Я.В., Парфенова Л.В., Падкина М.В. и др. Использование дрожжей Pichia pastoris в качестве продуцента рекомбинантного у-интерферона быка // Цитокины и воспаление.- 2002.- Т.1.- С.28-29.

23. Падкина М.В. Изучение функции генов, контролирующих активность кислой фосфатазы 1 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук.- ЛГУ.- Ленинград.- 1978.

24. Падкина М.В. Неспецифические кислые фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae'. регуляция биосинтеза // Вестник СПбГУ,- 1998.-Сер.З.- Вып.4.- С.52-57.

25. Падкина М.В., Краснопевцева Н.Г., Петрашень М.Г. и др. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей. I. Характеристика кислых фосфатаз разных штаммов // Генетика.- 1974.- Т. 10.- С. 100-111.

26. Падкина М.В., Павлова Н.А., Самбук Е.В.и др. Анализ функции гена ACPI // В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов.- М.-1991.- С.186-190.

27. Падкина М.В., Парфенова Л.В., Самбук Е.В. и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК, обеспечивающая синтез фибробластного интерферона человека клетками дрожжей, способ ее конструирования и штамм дрожжей

28. Saccharomyces cerevisiae продуцент фибробластного интерферона человека // Патент РФ RU 2180003 С2.- МКИ С 12 N 15/22.- 1998.

29. Падкина М.В., Парфенова JI.B., Самбук Е.В. и др. Штамм дрожжей Pichia pastoris продуцент фибробластного интерферона человека, рекомбинантная плазмидная ДНК pHIF и способ ее конструирования // Патент РФ RU 2180687 С1.-МКИ С 12N 1/19, 15/22.- 2000а.

30. Падкина М.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. и др. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae — продуцент кислой фосфатазы дрожжей // А. с. SU 1639052 Al.- С12 N 1/19, 9/16.- 1989.

31. Падкина М.В., Тарасов С.А., Карстен C.JI. и др. Влияние мутаций pho85 на катаболитную репрессию гена CIT1 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика.- 2003.- Т.39.- С.732-738.

32. Парфенова J1.B., Самбук Е.В., Смирнов М.Н., Падкина М.В. Продукция (3-интерферона человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae ведет к снижению активности цитохром С-оксидазы // Биотехнология.- 2002.- №6.-С.3-10.

33. Попова Ю.Г. Исследование роли протеинкиназы Pho85p в регуляции метаболизма дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris II Дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук.- СПбГУ,- СПб.- 2002.

34. Попович A.M. Интерлейкин-2: иммунобиология и иммунотерапия- С.Петербург.: Скиф.- 2004,- 36 с.

35. Самбук Е.В. Изучение регуляции синтеза фосфатаз у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук.-ЛГУ.- Ленинград.- 1985.

36. Самбук Е.В., Кучкартаев А.И., Падкина М.В. Картирование генов, регулирующих синтез кислых фосфатаз у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Петергофских генетических линий // Генетика.- 1991.- Т.27.- С.644-648.

37. Самбук Е.В., Павлова Н.А., Шарыпова Л.А., Падкина М.В. и др. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей. 14. Идентификация и клонирование гена АСР5 II Вестн. Ленингр. ун-та.- 1988.- Сер.З,- Вып.24.-С.300-307.

38. Самбук Е.В., Падкина М.В., Смирнова Т.М. и др. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris продуцента рекомбинантного пресинаптического глутаматного рецептора мозга крысы // Биотехнология.- 2001.- №2.- С.23-30.

39. Самбук Е.В., Попова Ю.Г., Падкина М.В. Генетический анализ спонтанных супрессоров мутаций pho85 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика.- 2003.- Т.39.- С. 18-24.

40. Самбук Е.В., Попова Ю.Г., Падкина М.В. Изучение влияния фосфата и мутаций в генах РН085, РН080 и РН04 на транскрипцию гена HSP82 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Вестник СПбГУ.- 2002.- Сер.З.-Вып.2.- С.33-40.

41. Самсонова М.Г., Падкина М.В., Кожин С.А. и др. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей. V. Генетический контроль регуляции синтеза КФ2 // Генетика.- 1975.- Т11.- С. 104-116.

42. Самсонова М.Г., Смирнов М.Н., Кожин С.А. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей. IX. Получение и анализ доминантных мутаций конститутивного синтеза кислой фосфатазы 2 // Генетика.- 1980.Т. 16.-С.212-222.

43. Симбирцев А.С. Цитокины новая система регуляции защитных реакций организма // Цитокины и воспаление.- 2002.- Т.1.- С.9-16.

44. Тер-Аванесян М.Д. Генетический контроль активности экзогенной кислой фосфатазы 1 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук,- ЛГУ.- Ленинград.- 1974.

45. Тотолян Н.А. Диагностика и лечение рассеянного склероза с позиций доказательной медицины // Мир медицины.- 2000.- №5-6.

46. Троценко Ю.А. Метилотрофные эукариоты // Успехи микробиологии,-1983.- Т. 18.- С.18-37.

47. Уразманова Н.А., Падкина М.В., Мясников А.Н. и др. Изозимный состав и регуляция биосинтеза кислых фосфатаз дрожжей // В сб.: Нуклеазы, их биологическая роль и практическое применение.- Киев: Наукова думка.-1985.- С.61-65.

48. Aalto М.К., Ronne Н., Keranen S. Yeast syntaxins Ssolp and Sso2p belong to a family of related membrane proteins that function in vesicular transport // EMBO J.- 1993.- V.12.- P.4095-4104.

49. Abdulaev N.G., Рорр M.P., Smith W.C. et al. Functional expression of bovine opsin in the methylotrophic yeast Pichiapastoris II Protein Expres. Purif.- 1997,-V.10.- P.61-69.

50. Adolf G.R., Kalsner I., Ahorn H. et al. Natural human interferon-alpha 2 is O-glycosylated // Biochem. J.- 1991.- V.276.- P.511-518.

51. Affolter M., Schier A., Gehring W.J. Homeodomain proteins and regulation of gene expression // Curr. Opin. Cell Biol.- 1990.- V.2.- P.485-495.

52. Agarwal N., Kamra D.N., Chaudhary L.C. et al. Selection of Saccharomyces cerevisiae strains for use as a microbial feed additive // Lett. Appl. Microb.-2000.- V.31.- P.270-273.

53. Agashe V.R., Hartl F.U. Roles of molecular chaperones in cytoplasmic protein folding // Semin. Cell Biol.- 2000.- V.l 1.- P. 15-25.

54. Ailor E., Betenbaugh M.J. Overexpression of cytosolic chaperones to improve solubility and secretion of a recombinant IgG protein in insect cells // Biotechnol. Bioeng.- 1998.-V.58.- P.196-203.

55. Al-Maghrebi M., Brule H., Padkina M. et al. The 3' untranslated region of human vimentin mRNAinteracts with protein complexes containing eEF-ly and HAX-1 // Nucl. Acids Res.- 2002.- V.30.- P.5017-5028.

56. Aimer A., Horz W. Nuclease hypersensitive region with adjacent positioned nucleosomes mark the gene boundaries of the PH05/PH03 locus in yeast // EMBOJ.- 1986.-V.5.- P.2681-2687.

57. Aimer A., Rudolph H., Hinnen A. et al. Removal of positioned nucleosomes from the yeast PH05 promoter upon PH05 induction release additional upstream activating DNA elements // EMBO J.- 1986.- V.5.- P.2689-2696.

58. Alting-Mees M.A., Short J.M. pBluescript II: gene mapping vectors // Nucleic Acids Res.- 1989.- V.25.- P.9494.

59. Altmann M., Wittmer В., Methot N. et al. The Saccharomyces cerevisiae translation initiation factor Tif3 and its mammalian homolog, eIF4B, have RNA annealing activity // EMBO J.- 1995.- V.l4.- P.3820-3827.

60. Ammerer G., Hunter C.P., Rothman J.H. et al. PEP 4 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes proteinase A, a vacuolar enzyme required for processing of vacuolar precursors // Mol. Cell Biol.- 1986.- V.6.- P.2490-2499.

61. Anspach B.F., Curbelo D., Hartmann R. et al. Expanded-bed chromatography in primary protein purification // J. Chromatogr. A.- 1999.- V.865.- P.129-144.

62. Arkov A.L., Korolev S.V., Kisselev L.L. Termination of translation in bacteria may be modulated via specific interaction between peptide chain release factor-2 and the last peptidyl-transfer RNA (Ser/Phe) // Nucl. Acids Res.- 1993.- V.21.-P.2891-2897.

63. Arndt K.T., Styles C.A., Fink G.R. Multiple global regulators control HIS4 transcription in yeast // Science.- 1987.- V.237.- P.874-880.

64. Aulitzky W.E., Peschel C., Despres D. et al. Divergent in vivo and in vitro antileukemic activity of recombinant interferon beta in patients with chronic-phase chronic myelogenous leukemia // Ann. Hematol.- 1993.- V.67.- P.205-211.

65. Austin A.J., Jones C.E., Heeke G.V. Production of human tissue factor using the Pichia pastoris expression system // Protein Expres. Purif.- 1998.- V.13.-P.136-142.

66. Azaryan A.V., Friedman T.C., Cawley N.X. et al. Characteristics of YAP3, a new prohormone processing aspartic protease from S. cerevisiae II Adv. Exp. Med. Biol.- 1995.- V.362.- P.569-572.

67. Bae C.S., Yang D.S., Ltt J. et al. Improved process for production of recombinant yeast-derived monomeric human G-CSF // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1999.- V.52.- P.338-344.

68. Bajwa W., Meyhack В., Rudolph H. et al. Structural analysis of the two tandemly repeated acid phosphatase genes in yeast // Nucl. Acid Res.- 1984.-V.12.- P.7721-7739.

69. Ballou C.E. A study of the immunogenicity of three yeast mannans // J. Biol. Chem.- 1970.- V.245.- P.l 197-1203.

70. Ballou C.E. Some aspects of the structure, immunochemistry, and genetic control of yeast mannans // Adv. Enzymol.- 1974.- V.40.- P.239-270.

71. Barbaric S., Munsterkotter M., Goding C. et al. Cooperative Pho2-Pho4 interaction at the PHOS promoter are critical for binding of Pho4 to UASpl and efficient transactivation by Pho4 at UASp2 // Mol. Cell. Biol.- 1998.- V.18.-P.2629-2639.

72. Barr P.J., Cousens L.S., Lee-Ng C.T. et al. Expression and processing of biologically active fibroblast growth factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem.- 1988.- V.263.- P.16471-16478.

73. Barr P.J., Steimer K.S., Sabin E.A. et al. Antigenicity and immunogenicity of domains of the human immunodeficiency virus (HIV) envelope polypeptide expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Vaccine.- 1987a.- V.5.- P.90-101.

74. Barr P.J., Gibson H.L., Lee-Ng C.T. et al. Heterologous gene expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Proc. Alko Symp. on Industr. Yeast Genet.-Helsinki, 1987b.-V.5.-P.139-148.

75. Batard Y., Hehn A., Nedelkina S. et al. Increasing expression of P450 and P450-redutase proteins from monocots in heterologous systems // Arch. Biochem. Biophys.- 2000,- V.379.- P.161-169.

76. Bateman A., Chothia C. Fibronectine type III domains in yeast detected by a hidden Markov model // Curr. Biol.- 1996.- V.6.- Р.1544-1547/

77. Bayne M.L., Applebaum J., Chicchi G.G. et al. Expression, purification and characterization of recombinant human insulin-like growth factor 1 in yeast // Gene.- 1988.- V.66.- P.235-244.

78. Beatrix В., Sakai H., Wiedmann M. The a and P subunit of the nascent polypeptide-associated complex have distinct functions // J. Biol. Chem.- 2000.-V.275.- P.37838-37845.

79. Bennetzen J.L., Hall B.D. The primary structure of the Saccharomyces cerevisiae gene for alcohol dehydrogenase // J. Biol. Chem.- 1982a.- V.257.-P.3018-3025.

80. Bennetzen J.L., Hall B.D. Codon selection in yeast // J. Biol. Chem.- 1982b.-V.257.- P.3026-3031.

81. Bentley D. The mRNA assembly line transcription and processing machines in the same factory // Curr. Opin. Cell Biol.- 2002.- V.14.- P.336-342.

82. Berben G., Legrain M., Hilger F. Studies on the structure, expression and function of the yeast regulatory gene PH02II Gene.- 1988.- V.66.- P.307-312.

83. Bergman L.W. A DNA fragment containing the upstream activator sequence determines nucleosome positioning of the trancriptionally repressed PHOS gene of Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell Biol.- 1986.- V.6.- P.2298-2304.

84. Bichko V., Pushko P., Dreilina D. et al. Subtype ayw variant of hepatitis В virus. DNA primary structure analysis // FEBS Lett.- 1985.- V.185.- P.208-212.

85. Biggs A.I. A spectrophotometric determination of the dissociation constants of p-nitrophenol and papaverin // Trans. Fard. Soc.- 1954.- V.50.- P.800-803.

86. Bishop P.D., Teller D.C., Smith R.A. et al. Expression, purification and characterization of human factor XIII in Saccharomyces cerevisiae II Biochemistry.- 1990.- V.29.- P.1861-1869.

87. Bitter G.A. Transcription initiation in eukaryotes: analysis of heterologous in vitro systems utilizing components from mammalian and yeast cells // Mol. Gen. Genet- 1983.- V.191.-P.434-441.

88. Bitter G.A., Chen K.K., Banks A.R. et al. Secretion of foreign proteins from Saccharomyces cerevisiae directed by a-factor gene fusions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1984.- V.81.- P.5330-5334.

89. Bitter G.A., Egan K.M. Expression of heterologous genes in Saccharomyces cerevisiae from vectors utilizing the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene promoter // Gene.- 1984.- V.32.- P.263-274.

90. Bitter G.A., Egan K.M. Expression of interferon-gamma from hybrid yeast GPD promoters containing upstream regulatory sequences from the GAL1-GAL10 intergenic region // Gene.- 1988.- V.69.- P.193-207.

91. Bitter G.A., Egan K.M., Butnette W.N. et al. Hepatitis В vaccine produced in yeast // J. Med. Virol.- 1988.- V.25.- P.123-140.

92. Bjornsson A., Monttagui-Tabar S., Isaksson L.A. Structure of the C-terminal end of the nascent peptide influences translation termination // EMBO J.- 1996.-V.15.- P.1696-1704.

93. Blanco P., Thow G., Simpson C.G. et al. Mutagenesis of key amino acids alters activity of a Saccharomyces cerevisiae endo-polygalacturonase expressed in Pichia pastoris I/FEMS Microbiol. Lett.- 2002.- V.210.- P. 187-191.

94. Blanquet S., Antonelli R., Laforet L. et al. Living recombinant Saccharomyces cerevisiae secreting proteins or peptides as a new drug delivery system in the gut //J. Biotechnol.- 2004.- V.l 10.- P.37-49.

95. Boehm Т., Pirie-Shepherd S., Trinh L.B. et al. Disruption of the KEX1 gene in Pichia pastoris allows expression of full-length murine and human endostatin // Yeast.- 1999.- V.15.- P.563-572.

96. Boer H., Teeri T.T., Koivula A. Characterization of Trichoderma reesei cellobiohydrolase Cel7A secreted from Pichia pastoris using two different promoters // Biotechnol. Bioeng.- 2000.- V.69.- P.486-494.

97. Bostian K.A., Lemire J.M., Cannon L.E. et al. In vitro synthesis of repressible acid phosphatase: identification of multiple mRNA and products // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1980.- V.77.- P.4504-4508.

98. Boteva R., Visser A.J., Filippi B. et al. Conformational transitions accompanying oligomerization of yeast alcohol oxydase, a peroxisomal flavoenzyme //Biochemistry.- 1999.- V.38.- P.5034-5044.

99. M.Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem.- 1976.- V.72.-P.248-254.

100. Brake A.J., Merryweather J.P., Coit D.G. et al. a-factor-directed synthesis and secretion of mature foreign proteins in Saccharomyces cerevisiae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1984.- V.81.- P.4642-4646.

101. Brankamp R.G., Sreekrishna K., Smith P.L. et al. Expression of a synthetic gene encoding the anticoagulant-antimetastatic protein ghilanten by the methylotropic yeast Pichia pastoris II Protein Expres. Purif.- 1995.- V.6.- P.813-820.

102. Brassard D.L., Grace M.J., Bordens R.W. Interferon-alpha as an immunotherapeutic protein // J. Leukoc. Biol.- 2002.- V.7.- P.565-581.

103. Braun A., Alsenz J. Development and use of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for the detection of protein aggregates in interferon-alpha (IFN-a) formulations // Pharmaceut. Res.- 1997.- V.14.- P. 1394-1400.

104. Braun A.W., Svendsen I., Sorensen S.O. et al. A high-affinity inhibitor of yeast carboxypeptidase Y is encoded by TFS1 and shows homology to a family of lipid binding proteins // Biochemistiy.- 1998.- V.37.- P.3351-3357.

105. Braun P., Tommassen J., Filloux A. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa II Mol. Microbiol.- 1996.-V.19.- P.297-306.

106. Braus G., Mosch H.-U., Vogel K., et al. Interpathway regulation of the TRP4 gene of yeast // EMBO J.- 1989.- V.8.- P.939-945.

107. Brazas R.M., Bhoite L.T., Murphy M.D. et al. Determining the requirements for cooperative DNA binding by Swi5p and Pho2p (Grfl0p/Bas2p) at the HO promoter// J. Biol. Chem.- 1995.- V.270.- P.29151-29161.

108. Bretthauer R.K., Castellino F.J. Glycosylation of Pichia pastoris-derived proteins // Biotechnol. Appl. Biochem.- 1999.- V.30.- P. 193-200.

109. Brickelmaier M., Hochman P.S., Baciu R. et al. ELISA methods for the analysis of antibody responses induced in multiple sclerosis patients treated with recombinant interferon-beta // J. Immunol. Meth.- 1999.- V.227.- P.121-135.

110. Briggs M.S., Gierasch L.M. Molecular mechanisms of protein secretion: the role of the signal sequence // Adv. Prot. Chem.- 1986.- V.38.- P. 109-180.

111. Brod S.A. Marshall G.D. Jr., Henninger E.M. et al. Interferon-beta lb treatment decreases tumor necrosis factor-alpha and increases interleukin-6 production in multiple sclerosis //Neurology.- 1996.- V.46.- P.1633-1638.

112. Brodsky J.L., Lawrence J.G., Caplan A.J. Mutations in the cytosolic DnaJ homologue, YDJ1, delay and compromise the efficient translation of heterologous proteins in yeast// Biochemistiy.- 1998.- V.37.- P. 18045-18055.

113. Brown C.M., Dalphin M.E., Stockwell P.A. et al. The translational termination signal database//Nucl. Acids Res.- 1993.- V.21.- P.3119-3123.

114. Brummer M.H., Richard P., Sundqvist L. et al. The GDI1 genes from Kluyveromyces lactis and Pichia pastoris: cloning and functional expression in Saccharomyces cerevisiae II Yeast.- 2001.- V.18.- P.897-902.

115. Bukowski R.M. Cytokine combinations: therapeutic use in patients with advanced renal cell carcinoma// Semin. Oncol.- 2000.- V.27.- P.204-212.

116. Bulawa C.E. Genetics and molecular biology of chitin synthesis in fungi // Ann. Rev. Microbiol.- 1983.- V.47.- P.505-534.

117. Burglin T.R. The yeast regulatory gene PH02 encodes a homeo box I I Cell.-1988.- V.53.- P.339-340.

118. Butler J.S.,Sadhale P.P., Piatt T. RNA processing in vitro produces mature 3' ends of a variety of Saccharomyces cerevisiae mRNAs // Mol. Cell. Biol.- 1990.-V.10.- P.2599-2605.

119. Butz J.A., Niebauer R.T., Robinson A.S. Co-expression of molecular chaperones does not improve the heterologous expression of mammalian G-protein coupled receptor expression in yeast // Biotechnol. Bioeng.- 2003.- V.84.-P.292-304.

120. Cabiscol E., Piulats E., Echave P. et al. Oxidative stress promotes specific protein damage in Saccharomyces cerevisiae I I J. Biol. Chem.- 2000.- V.275.-P.27393-27398.

121. Cadenas E. Biochemistry of oxygen toxicity // Ann. Rev. Biochem.- 1989.-V.58.- P.79-110.

122. Calera J.A., Paris S., Monod M. et al. Cloning and disruption of the antigenic catalase gene of Aspergillus fumigatus II Infect.Immunol.- 1997.- V.65.- P.4718-4724.

123. Callewaert N., Laroy W., Cadirgi H. et al. Use of HDEL-tagged Trichoderma reesei mannosyl oligosaccharide 1,2 alpha-D-mannosidase for N-glycan engineering in Pichiapastoris IIFEBS Lett.- 2001.- V.503.- P. 173-178.

124. Cassland P., Jonsson L.J. Characterization of a gene encoding Trametes versicolor laccase A and improved heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae by decreased cultivation temperature // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1999.-V.52.- P.393-400.

125. Cereghino G.P.L., Cregg J.M. Application of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis // Curr. Opin. Biotechnol.- 1999,- V.10.- P.422-427.

126. Cereghino J.L., Cregg J.M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris II FEMS Microbiol.Rev- 2000.- V.24.-P.45-66.

127. Cerretti D.P., McKereghan K., Larsen A. et al. Cloning, sequence, and expression of bovine interferon-gamma // J. Immunol.- 1986.- V.136.- P.4561-4564.

128. Chambers A. Phosphoglycerate kinase. // In: Yeast Sugar Metabolism. Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Application. Eds.: Zimmermann F.K., Entian K.D. Tehnomic, Lancaster.- 1997.- P.141-156.

129. Chambers A., Tsang J.S.H., Stanway C. et al. Transcriptional control of the Saccharomyces cerevisiae PGK gene by RAP1 // Mol. Cell. Biol.- 1989.- V.9.-P.5516-5524.

130. Chen C.M., Cheng W.T., Chang Y.C. et al. Growth enhancement of fowls by dietary administration of recombinant yeast cultures containing enriched growth hormone // Life Sci.-2000.- V.67.- P.2103-2115.

131. Chen C.Y., Hitzeman R.A. Human, yeast and hybrid 3-phosphoglycerate kinase gene expression in yeast//Nucl. Acids Res.- 1987.- V.15.- P.643-660.

132. Chen D.C., Chuang L.T., Chen W.P. et al. Abnormal growth induced by expression of HBsAg in the secretory pathway of S. cerevisiae pep4 mutants // Curr. Genet.- 1995.- V.27.- P.201-206.

133. Cho K.M., Cha H.J., Yoo Y.J. et al. Enhancement of recombinant glucoamylase expression by introducing yeast GAL7 mRNA termination sequence // J. Biotechnol.- 1997.- V.55.- P.9-20.

134. Choi S.K., Lee J.H., Zoll W.C. et al. Promotion of Met-tRNA. binding to ribosomes by yIF2, a bacterial IF2 homolog in yeast // Science.- 1998.- V.280.-P.1757-1760.

135. Chuang R.-Y., Weaver P.L., Liu Z. et al. Requirement of the DEAD-box protein Dedlp for messenger RNA translation // Science.- 1997.- V.275.- P. 14691471.

136. Ciechanover A., Schwartz A. L. The ubiquitin-proteasome pathway: The complexity and myriad functions of proteins death // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1998.- V.95.- P.2727-2730.

137. Cigan A.M., Donahue T.F. Sequence and structural features associated with translational initiator regions in yeast a review // Gene.- 1987.- V.59.- P. 1-18.

138. Cigan A.M., Pabich E.K., Donahue T.F. Mutational analysis of the HIS4 translational initiation region in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell Biol.-1988.- V.8.- P.2964-2975.

139. Cinatl J., Morgenstern В., Bauer G. et al. Treatment of SARS with human interferons // Lancet.- 2003.- V.362.- P.293-294.

140. Cipollo J.F., Trimble R.B. Letter to the Glyco-Forum: Hypoglycosylation in the algl2delta yeast mutant destabilizes protease A and causes proteolytic loss of external invertase // Glycobiology.- 2002.- V.12.- P.30G-33G.

141. Clare J., Scorer C., Buckholz R. et al. Expression of EGF and HIV envelope glycoprotein//Meth. Mol. Biol.- 1998.- V.103.- P.209-225.

142. Clare J.J., Romanos M.A., Rayment F.B. et al. Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies // Gene.- 1991a.- V.105.- P.205-212.

143. Clare J.J., Rayment F.B., Ballantine S.P. et al. High level expression of tetanus toxin fragment С in Pichia pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene // Bio/Technol.- 1991b.- V.9.- P.455-460.

144. Clarke L., Carbon J. Isolation of a yeast centromere and construction of functional small circular chromosomes //Nature.- 1980.- V.257.- P.504-509.

145. Cleland J.L., Hedgepeth C., Wang D.I. Polyethylene glycol enhanced refolding of bovine carbonic anhydrase B. Reaction stoichiometry and refolding model // J. Biol. Chem.- 1992.- V.267.- P.13327-13334.

146. Clements J.M., Catlin G.H., Price M.J. et al. Secretion of human epidermal growth factor from Saccharomyces cerevisiae using synthetic leader sequences // Gene.-1991.- V.106.- P.267-272.

147. Clements J.M., O'Connell L.I., Tsunasawa S. et al. Expression and activity of a gene encoding rat cytochrome с in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Gene.-1989.- V.83.- P.l-14.

148. Coates N.J, McColl S.R. Production of chemokines in vivo in response to microbial stimulation // J. Immunol.- 2001.- V.166.- P 5176-5182.

149. Coche Т., Prozzi D., Legrain M. et al. Nucleotide sequence of the PH081 gene involved in the regulation of the repressible acid phosphatase gene in yeast Saccharomyces cerevisiae //Nucl. Acids Res.- 1990.- V.18.- P.2176.

150. Coffman J.A., Cooper T.G. Nitrogen GATA factors participate in transcriptional regulation of vacuolar protease genes in Saccharomyces cerevisiae //J. Bacteriol.- 1997.- V.179.- P.5609-5613.

151. Conrad N.K., Wilson S.M., Steinmetz E.J. et al. A yeast heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex associated with RNA polymerase II // Genetics.-2000,- V.154.- P.557-571.

152. Conradt H.S., Egge H., Peter-Katalinic J. et al. Structure of the carbohydrate moiety of human interferon-beta secreted by a recombinant Chinese hamster ovary cell lines//J. Biol. Chem.- 1987.- V.262.- P.14600-14605.

153. Cormack B.P., Strubin M., Ponticelli A.S. et al. Functional differences between yeast and human TFIID are localized to the highly conserved region // Cell.-1991.- V.65.- P.341-348.

154. Cosano I., Alvarez P., Molina M. et al. Cloning and sequence analysis of the Pichia pastoris TRP1, IPP1 andHIS3 genes // Yeast.- 1998.- V.14.- P.861-867.

155. Couderc R., Baratti J. Oxidation of methanol by the yeast Pichia pastoris. Purification and properties of alcohol oxidase // Agric. Biol. Chem.- 1980.-V.44.- P.2279-2289.

156. Cousens L.S., Shuster J.R., Gallegos C. et al. High level expression of proinsulin in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Gene.- 1987.- V.61.- P.265-275.

157. Craig A.W.B., Haghighat A., Yu A.T.K. et al. Interaction of polyadenylate-binding protein with the eIF4G homologue PAIP enhances translation // Nature.-1998,- V.392.- P.520-523.

158. Craig E.A., Gambill B.D., Nelson R.J. Heast shock proteins: molecular chaperones of protein biogenesis // Microbiol. Rev.- 1993.- V.57.- P.402-414.

159. Cregg J.M., Barringer K.J., Hessler A.Y. et al. Pichia pastoris as a host sytem for transformation // Mol. Cell Biol.- 1985.- V.5.- P.3376-3385.

160. Cregg J.M., Madden K.R. Development of the methylotrophic yeast, Pichia pastoris, as a host system for the production of foreign proteins // Dev. Ind. Microbiol. (J. Ind. Microbiol.- Suppl.3).- 1988,- V.29.- P.33-41.

161. Cregg J.M., Tschop J.F., Stillman C. et al. High level expression and efficient assembly of hepatitis В surface antigen in the methylotrophic yeast Pichia pastoris II Bio/Technol.- 1987.- V.5.- P.479-485.

162. Cregg J.M., Vedvick T.S., Raschke W.C. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris II Bio/Technol.- 1993.- V.l 1.- P.905-910.

163. Cregg R.C., Liang H., Grella D. et al. Disruption of methylotrophic yeast Pichia pastoris PMR1 gene causes an increase in secretion of the human anti-angiogenic protein Endostatin // Yeast.- 2001.- V.l8.- S.253.

164. Csermely P., Schaider Т., Soti C. et al. The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function, and clinical application. A comprehensive review // Pharmacol. Ther.-1998.-V.79.- P.129-168.

165. D'Anjou M.C., Daugulis A.J. A rational approach to improving productivity in recombinant Pichia pastoris fermentation // Biotechnol. Bioeng.- 2001.- V.72.-P.l-11.

166. Daignan-Fornier В., Fink G.R. Coregulation of purine and histidine biosynthesis by the transcriptional activators BAS1 and BAS2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992.- V.89.- P.6746-6750.

167. Dane D., Cameron C.H., Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis // Lancet.- 1970.- V.l.- P.695-698.

168. Darnell J.E., Jr., Kerr I.M., Stark G.R. Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins // Science.- 1994.- V.264.- P.1415-1421.

169. Davidson R.C., Choi B.K., Hamilton S.R. et al. Functional analysis of the ALG3 gene encoding the Dol-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-Dol mannosyltransferase enzyme of P. pastoris II Glycobiology.- 2004.- V. 14.-P.399-407.

170. Davis R., Schooley K., Rasmussen B. et al. Effect of PDI overexpression on recombinant protein secretion in CHO cells // Biotechnol. Prog.- 2000.- V.l 6.-P.73 6-743.

171. De Banzie J.S., Sinclair L., Lis J.T. Expression of the major heat shock gene of Drosophila melanogaster in Saccharomyces cerevisiae II Nucl. Acid Res.- 1986.-V.14.- P.3587-3601.

172. De Marco A., Volrath S., Bruyere T. et al. Recombinant maize protoporphyrinogen IX oxidase expressed in Escherichia coli forms complexes with GroEL and DnaK chaperones I I Protein Expres. Purif.- 2000.- V.20.- P.81-86.

173. De Roubin M.-R., Cailas M.D., Shen S.-H. et al. Influence of pH, nitrogen and phosphorus sources on the production of hepatitis В virus pre-S2 antigen by Hansenulapolymorpha II Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1992.- V.38.- P.158-164.

174. Degelmann A., Muller F., Sieber H. et al. Strain and process development for the production of human cytokines in Hansenula polymorpha // FEMS Yeast Res.- 2002.- V.2.- P.349-361.

175. Dehoux P., Ribes V., Sobczak E. et al. Expression of the hepatitis В virus large envelope protein in Saccharomyces cerevisiae II Gene.- 1986.- V.48.- P.155-163.

176. Del Tito В J., Ward J.M., Hogson J. et al. Effects of a minor isoleucyl tRNA on heterologous protein translation in Escherichia coli II J. Bacterid.- 1995.-V.177.- P.7086-7091.

177. Denis C.I., Ferguson J., Young E.T. mRNA level for fermentative alcohol dehydrogenase of Saccharomyces cerevisiae decrease upon growth on nonfermentable carbon source // J. Biol. Chem.- 1983.- V.258.- P. 1165-1171.

178. Denis C.L., Ciriacy M., Young E.T. A positive regulatory gene is required for accumulation of functional messenger RNA for the glucose-repressible alcohol dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae // J. Mol. Biol.- 1981.- V.148.-P.355-368.

179. Despreaux C.W., Manning R.F. The dacA gene of Bacillus stearothermophilus coding for D-alanine carboxypeptidase: cloning, structure and expression in Escherichia coli and Pichia pastoris II Gene.- 1993.- V.131.- P.35-41.

180. Di Mauro E, Kendrew S.G., Caserta M. Two distinct nucleosome alterations characterize chromatin remodeling at the Saccharomyces cerevisiae ADH2 promoter//J. Biol. Chem.- 2000.- V.275.- P.7612-7618.

181. Digan M.E., Lair S.V., Brierley R.A. et al. Continuous production of a novel lysozyme via secretion from the yeast, Pichia pastoris II Bio/Technol.- 1989.-V.7.- P.160-164.

182. Donoviel M.S., Kacherovsky N., Young E.T. Synergistic activation of ADH2 expression is sensitive to upstream activation sequence 2 (UAS2) orientation, copy number, and UAS1-UAS2 helical phasing // Mol. Cell. Biol.- 1995.- V.15.-P.3442-3449.

183. Donoviel M.S., Young E.T. Isolation and identification of genes activating UAS2-dependent ADH2 expression in Saccharomyces cerevisiae II Genetics.-1996.- V.l43,- P.l 137-1148.

184. Draeger N.M., Chase H.A. Liquid fluidized bed adsorption of protein in the presence of cells // Bioseparation.- 1991.- V.2.- P.67-80.

185. Drexler H.C.A. Programmed cell death and the proteasome // Apoptosis.-1998.- V.3.- P. 1-7.

186. Duman J.G., Miele R.G., Liang H. et al. O-mannosylation of Pichia pastoris cellular and recombinant proteins // Biotechnol. Appl. Biochem.- 1998.- V.28.-P.39-45.

187. Dumont J., Legrain M., Portetelle D. et al. High yield synthesis of the bovine leukemia virus (BLV) p24 major internal protein in Saccharomyces cerevisiae II Gene.- 1989.- V.79.- P.219-226.

188. Ealick S.E., Cook W.J., Vijay-Kumar S. et al. Three-dimentional structure of recombinant human interferon-y // Science.- 1991.- V.252.- P.698-702.

189. Eaton L.C. Host cell contaminant protein assay development for recombinant biopharmaceuticals // J. Chromatogr.- 1995.- V.705.- P. 105-114.

190. Egel-Mitani M., Andersen A.S., Diers I. et al. Yield improvement of heterologous peptides expressed in ypsl-disrupted Saccharomyces cerevisiae strains I I Enzyme Microb. Technol.- 2000.- V.26.- P.671-677.

191. Eggers D.K., Welch W.J., Hansen W.J. Complexes between nascent polypetides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells // Mol. Cell Biol.- 1997.- V.8.- P.1559-1573.

192. Eisen A., Taylor W.E., Blumberg H. et al. The yeast regulatory protein ADR1 binds in zinc-dependent manner to the upstream activating sequences of ADH2 II Mol. Cell. Biol.- 1988.- V.8.- P.4552-4556.

193. Elliott S., Bartley Т., Delorme E. et al. Structural requirements for addition of O-linked carbohydrate to recombinant erythropoietin // Biochemistry.- 1994.-V.33.- P.l 1237-11245.

194. Elliott S., Giffin J., Suggs S. et al. Secretion of glycosylated human erythropoietin from yeast directed by the a-factor leader region // Gene.- 1989.-V.79.- P.167-180.

195. Erhart E., Hollenberg C.P. The presence of a defective LEU2 gene in 2 p.m DNA recombinant plasmids of Saccharomyces cerevisiae is responsible for curing and high copy number//J.Bacteriol.- 1983.- V.156.- P.625-635.

196. Ernst J.F. Improved secretion of heterologous proteins by Saccharomyces cerevisiae: effects of promoter substitution in alpha-factor fusions // DNA.-1986.- V.5.- P.483-491.

197. Estem D., Acar Y., Kotiloglu К et al. High-dose interferon results in high HBsAg seroclearance in children with chronic hepatitis В infection // Turk. J. Pediatr.- 2003.- V.45.- P.123-128.

198. Estruch F. Stress-controlled transcription factors, stress-induced genes and stress tolerance in budding yeast // FEMS Microbiol. Rev.- 2000.- V.24.- P.469-486.

199. Faber K.N. Harder W., Ab G. et al. Review: methylotrophic yeast as factories for the production of foreign proteins //Yeast.- 1995.- V.l 1.- P.1331-1344.

200. Fantino E., Marguet D., Lauquin G.J. Downstream activating sequence within the coding region of a yeast gene: specific binding in vitro of RAP1 protein // Mol. Gen. Genet.- 1992.- V.236.- P.65-75.

201. Farazi T.A., Waksman G., Gordon J.I. The biology and enzymology of protein N-myristoylation // J. Biol. Chem.- 2001.- V.276.- P.39501-39504.

202. Farh L., Mitchell D.A., Deschenes R.J. Farnesylation and proteolysis are sequential, but distinct steps in the CaaX box modification pathway // Arch. Biochem. Biophys.- 1995.- V.318.- P.l 13-121.

203. Feldman D.E., Frydman J. Protein folding in vivo: the importance of molecular chaperones // Curr. Opin. Str. Biol.- 2000.- V.10.- P.26-33.

204. Fieschko J.S., Egan K.M., Ritch T. et al. Controlled expression and purification of human immune interferon from high cell density fermentation of Saccharomyces cerevisia. II Biotechnol. Bioeng.-1987.- V.29.- P.l 113-1121.

205. Fink A. Chaperone-mediated protein folding // Physiol. Rev.- 1999.- V.79.-P.425-449.

206. Fischer J.S., Priore R.L., Jacobs L.D. et al. Neuropsychological effects of interferon beta-la in relapsing multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Collaborative Research Group // Ann. Neurol.- 2000.-V.48.-P.885-892.

207. Fischer R., Emans N. Molecular farming of pharmaceutical proteins // Transgenic Res.- 2000.- V.9.- P.279-299.

208. Flores C.-L., Rodriguez C., Petit T. et al. Carbohydrate and enrgy-yielding metabolism in non-conventional yeasts // FEMS Microbiol. Rev.- 2000.- V.24.-P.507-529.

209. Frand A.R., Kaiser C.A. Erolp oxidizes protein disulfide isomerase in a pathway for disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum // Mol. Cell.-1999.- V.4.- P.469-477.

210. Fraser R.A., Rossignol M., Heard D.J. et al. SUG1, a putative transcriptional mediator and subunit of the PA700 proteasome regulatory complex, is a DNA helicase // J. Biol. Chem.- 1997.- V.272.- P.7122-7126.

211. Frolova L., Golf X.L., Rasmussen H.H. et al. A highly conserved eukaryotic protein family possessing properties of polypeptide chain release factor // Nature.- 1994.- V.372.- P.701-703.

212. Frolova L., Golf X.L., Zhouravleva G. et al. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependent guanisine triphosphatase // RNA.- 1996.- V.2.- P.334-341.

213. Frydman J., Erdjument-Bromage H., Tempst P. et al. Co-translational domain folding as the structural basis for the rapid de novo folding of firely luciferase // Nat. Struct. Biol.- 1999.- V.6.- P.697-705.

214. Fujimura H., Sakuma Y. Simplified isolation of chromosomal and plasmid DNA from yeasts // Biotechniques.- 1993.- V.14.- P.538-540

215. Fujita Т., Takaoka C., Matsui H. et al. Structure of the human interleukin 2 gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1983.- V.80.- P.7437-7441.

216. Fuller R.S., Sterne R.E., Thorner J. Enzymes required for yeast prohormone processing // Ann. Rev. Physiol.- 1988.- V.50.- P.345-362.

217. Furlan R., Bergami A., Lang R. et al. Interferon-beta treatment in multiple sclerosis patients decreases the number of circulating T cells producing interferon-gamma and interleukin-4 // J. Neuroimmunol.- 2000.- V.l 11,- P.86-92.

218. Gabashvili I.S., Gregory S.T., Valle M. et al. The polypeptide tunnel system in the ribosome and its gating in erythromycin resistance mutants of L4 and L22 // Mol. Cell.- 2001.-V.8.- P.181-188.

219. Galan J.M., Volland C., Urban-Grimal D. et al. The yeast plasma membrane uracil permease is stabilized against stress induced degradation by a point mutation in a cyclin-like "destruction box" // Biochem. Biophys. Res. Com.-1994.- V.201.- P.769-775.

220. Galliciotti G., Schneider H., Wyder L. et al. Signal-sequence trap in mammalian and yeast cells: a comparison // J. Membr. Biol.- 2001.- V.l 83.-P.175-182.

221. Gallie D.R. A tale of two termini: a functional interaction between the termini of an mRNA is a prerequisite for efficient translation initiation // Gene.- 1998.-V.216.- P.l-11.

222. Gancedo J.M. Yeast carbon catabolute repression // Microbiol. Mol. Biol. Rev.-1998.- V.62.- P.334-361.

223. Gautschi M., Lilie H., Funfschilling U. et al. RAC, a stable ribosome-associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs Sszl and zuotin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2001.- V.98.- P.3762-3767.

224. Gearing A.J.H., Thorpe R. The international standart for human interleukin-2 calibration by international collaborative study // J.Immunol. Meth.- 1988.-V.114.- P.3-9.

225. Gemmill T.R., Trimble R.B. Overview of N- and O-linked oligosaccharide structures found in various yeast species // Biochim. Biophys. Acta.- 1999.-V.1426.- P.227-237.

226. Gillece P., Luz J.M., Lennarz W.J. et al. Export of a cysteine-free misfolded secretory protein from the endoplasmic reticukum for degradation requires interaction with protein disulfide isomerase // J. Cell Biol.- 1999.- V.147.-P.1443-1456.

227. Gillis S., Ferm M.M., Ou W. et al. T cell growth factor: parameters of production and a quantitative microassay for activity // J. Immunol.- 1978.-V.120.- P.2027-2032.

228. Gilon Т., Chomsky O., Kulka R.G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae IIEMBO J.- 1998.- V.17.- P.2759-2766.

229. Gilon Т., Chomsky O., Kulka R.G. Degradation signals recognized by the Ubc6p-Ubc7p ubiquitin-cojugating enzyme pair // Mol. Cell Biol.- 2000.- V.20.-P.7214-7219.

230. Glickman M.H., Rubin D.M., Fried V.A. et al. The regulatory particle of the Saccharomyces cerevisiae proteasome // Mol. Cell Biol.- 1998.- V.18.- P.3149-3162.

231. Goda S., Takano K., Yamagata Y. et al. Effect of extra N-terminal residues on the stability and folding of human lysozyme expressed in Pichia pastoris II Protein Eng.- 2000.- V.13.- P.299-307.

232. Godon С., Lagniel G., Lee J. et al. The H202 stimulon in Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem.- 1998.- V.273.- P.22480-22489.

233. Goeddel D.V., Shepard H.M., Yelverton E. et al. Synthesis of human fibroblast interferon by E. coli И Nucl. Acids Res.- 1980.- V.8.- P.4057-4074.

234. Golf X.L., Philippe M., Jean-Jean O. Overexpression of human release factor 1 alone has an antisuppressor effect in human cells // Mol. Cell. Biol.- 1997.-V.17.- P.3164-3172.

235. Goossen В., Hentze M.W. Position is the critical determinant for function of iron-responsive elements as translational regulators // Mol. Cell. Biol.- 1992.-V.12.- P.1959-1966.

236. Gragerov A., Nudler E., Komissarova G.A. et al. Cooperation of GroEL/GroES and DnaK/DnaJ heat shock proteins in preventing protein misfolding in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992.- V.89.-P.10341-10344.

237. Gray P.W., Goeddel D.V. Structure of the human immune interferon gene // Nature.- 1982.- V.298.- P.859-563.

238. Gren E., Berzin V.M., Jansone I. et al. Novel human leukocyte interferon subtype and structural comparison of alpha interferon genes // J. Interferon Res.-1984.- V.4.- P.609-617.

239. Grinna L.S., Tschopp J.F. Size distribution and general structural features of N-linked oligosaccharides from the methylotrophic yeast, Pichia pastoris II Yeast. -1989.- V.5.- P.107-115.

240. Guo R.T., Chou L.J., Chen Y.C. et al. Expression in Pichia pastoirs and characterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin // Proteins.-2001a.- V.43.- P.499-508.

241. Guo J.T., Bichko V.V., Seeger C. Effect of alpha interferon on the hepatitis С virus replicon //J. Virol.- 2001b.- V.75.- P.8516-8523.

242. Guo W., Grant A., Novick P. Exo84p is an exocyst protein essential for secretion // J. Biol. Chem.- 1999.- V.274.- P.23558-23564.

243. Guo Z., Sherman F. З'-end forming signals of yeast mRNA // Mol. Cell. Biol.-1995.- V.15.- P.5983-5990.

244. Hagenson M.J., Holden K.A., Parker K.A. et al. Expression of streptokinase in Pichia pastoris yeast // Enzyme Microb. Technol.- 1989.- V.l 1.- P.650-656.

245. Hall B.G. Selection-induced mutations occur in yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992.- V.89.- P.4300-4303.

246. Hallewell R.A., Mill R., Tekamp-Olson P. et al. Amino-terminal acetylation of authentic human Cu, Zn superoxide dismutase produced in yeast // Bio/Technol.-1987.- V.5.- P.363-366.

247. Halliwell B. Free radicals and antioxidants: a personal view // Nutr. Rev.-1994.- V.52.- P.253-265.

248. Hampsey M. Molecular genetics of the RNA polymerase II general transcriptional machinary // Microbiol. Mol. Biol. Rev.- 1998.- V.62.- P.465-503.

249. Hanein D., Matlack K.E., Jungnickel B. et al. Oligomeric rings of the Sec61p complex induced by ligands required for protein translocation // Cell.- 1996.-V.87.- P.721-732.

250. Hansson M., Stahl S., Hjorth R. et al. Single-step recovery of a secreted recombinant protein by expanded bed adsorption // Bio/Technology.- 1994.-V.12.- P.1994.

251. Hardesty В., Kramer G. Folding of nascent peptide on the ribosome // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol.- 2001.- V.66.- P.41-66.

252. Hardesty В., Tsalkova Т., Kramer G. Co-Translational folding // Curr. Opin. Struct. Biol.- 1999.- V.9.- P.l 11-114.

253. Hard F.U., Hayer-Hartl M. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. // Science.- 2002.- V.295.- P.1852-1858.

254. Hartzog G.A., Wada Т., Handa H. et al. Evidence that Spt4, Spt5 and Spt6 control transcription elongation by RNA polymerase II in Saccharomyces cerevisiae II Genes Dev.- 1998.- V.12.- P.357-369.

255. Hayakawa Т., Toibana A., Marumoto R. et al. Expression of human lysozyme in an insoluble form in yeast // Gene.- 1987.- V.56.- P.53-59.

256. Hayano Т., Hirose M., Kikuchi M. Protein disulphide isomerase mutant lacking its isomerase activity accelerates protein folding in the cell // FEBS Lett.- 1995.-V.377.- P.505-511.

257. Heaton В., Decker C., Muhlrad D. et al. Analysis of chimeric mRNA identifies two regions within the STE3 mRNA which promote rapid mRNA decay // Nucl. Acids Res.- 1992.- V.20.- P.5365-5373.

258. Heidmann S., Schindewolf C., Stumpf G. et al. Flexibility and interchangeability of polyadenylation signals in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol.- 1994.- V.14.- P.4633-4642.

259. Heim J., Takabayashi K., Meyhack B. et al. C-terminal proteolytic degradation of recombinant desulfato-hirudin and its mutants in the yeast Saccharomyces cerevisiae И Eur. J. Biochem.- 1994.- V.226.- P.341-353.

260. Henco K., Brosius J., Fujisawa A. et al. Structural relationship of human interferon alpha genes and pseudogenes // J. Mol. Biol.- 1985.- V.185.- P.227-269.

261. Henderson R.C.A., Cox B.S., Tubb R. The transformation of brewing yeasts with a plasmid containing the gene for copper resistance // Curr. Genet.- 1985.-V.9.- P.133-138.

262. Henikoff S., Cohen E.H. Sequences responsible for transcription termination on a gene segment in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol.- 1984.- V.4.-P.1515-1520.

263. Hennigan A.N., Jacobson A.J. Functional mapping of the translation-dependent instability element of yeast MATal mRNA // Mol. Cell. Biol.- 1996.- V.16.-P.3833-3843.

264. Henry A., Masters C.L., Beyreuther K. et al. Expression of human amyloid precursor protein ectodomains in Pichia pastoris: analysis of culture conditions, purification, and characterization // Protein Expres. Purif.- 1997.- V.10.- P.283-291

265. Henry Y.A., Lopez M.C., Gibbs J.M. et al. The yeast protein Gcrlp binds to the PGK UAS and contributes to the activation of transcription of the PGK gene // Mol. Gen. Genet.- 1994.- V. 245.- P.506-511

266. Herrick D., Parker R., Jacobson A. Identification and comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol.- 1990.- V.10.-P.2269-2284.

267. Hershko A., Ciechanover A. The ubiquitin system // Ann. Rev. Biochem.-1998.- V.67.- P.425-479.

268. Hesterkamp Т., Hauser S., Lutcke H. et al. Escherichia coli trigger factor is a prolyl isomerase that associates with nascent polypeptide chains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996.- V.93.- P.4437-4441.

269. Heyrovska N., Frydman J., Hohfeld J et al. Directionality of polypeptide transfer in the mitochondrial pathway of chaperone-mediated protein folding // Biol. Chem.- 1998.- V.379.- P.301-309.

270. Hickey D.A., Benkel K.I., Fong Y. et al. A Drosophila gene promoter is subject to glucose repression in yeast cells I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994.- V.91.-P.l 1109-11112.

271. Hiep T.T., Kulikov V.N., Noskov V.N et al. The 5-aminoimidazole ribonucleotide-carboxylase structural gene of the methylotrophic yeast Pichia methanolica: cloning, sequencing and homology analysis // Yeast.- 1993a.- V.9.-P.1251-1258.

272. Hiep T.T., Noskov V.N., Pavlov Y.I. Transformation in the methylotrophic yeast Pichia methanolica utilizing homologous ADE1 and heterologous Saccharomyces cerevisiae ADE2 and LEU2 genes as genetic markers // Yeast.-1993b.- V.9.- P.l 189-1197.

273. Hinnen A., Hicks J.B., Fink G.R. Transformation of yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1978.- V.75.- P.1929-1933.

274. Hirst K., Fisher F., McAndrew P.C. et al. The transcription factor, the cdk, its cyclin and their regulator: directing the transcriptional response to a nutritional signal //EMBO J.- 1994.- V.13.- P.5410-5420.

275. Hiscott J., Ryals J., Dierks P. et al. The expression of human interferon alpha genes //Philos. Trans. R. Soc. (Biol. Sci). -1984,- V.307.- P.217-226.

276. Hitzeman R.A., Chen C.Y., Hagie F.E. et al. Expression of hepatitis В virus surface antigen in yeast // Nucl. Acid Res.- 1983.- V.l 1.- P.2746-2763.

277. Hitzeman R.A., Hagie F.E., Levine H.L. et al. Expression of a human gene for interferon in yeast//Nature.- 1981.- V.293.- P.717-722.

278. Hitzeman R.A., Hagie F.F., Hayflick J.S. et al. The primary structure of the Saccharomyces cerevisiae gene for 3-phosphoglycerate kinase // Nucl. Acid Res.-1982.- V.10.- P.7791-7808.

279. Hochstrasser M. Ubiquitin-dependent protein degradation // Ann. Rev. Genet.-1996.- V.30.- P.405-439.

280. Hoekema A., Kastelein R.A., Vasser M. et al. Codon replacement in the PGK1 gene of Saccharomyces cerevisiae: experimental approach to study the role ofbiased codon usage in gene expression // Mol. Cell. Biol.- 1987.- V.7.- P.2914-2924.

281. Hohenblum H., Gasser В., Maurer M. et al. Effects of gene dosage, promoters, and substrates on unfolded protein stress of recombinant Pichia pastoris II Biotech. Bioeng.- 2004.- V.85.- P.367-375.

282. Hohfeld J., Cyr D.M., Patterson C. From the cradle to the grave: molecular chaperones that may choose between folding and degradation // EMBO Reports.-2001.- V.21.- P.885-890.

283. Holland M.J., Yokoi Т., Holland J.P. et al. The GCR1 gene encodes a positive transcriptional regulator of the enolase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene families in Saccharomyces cerevisiae. II Mol. Cell. Biol.-1987.- V.7.- P.813-820.

284. Horton L.E., James P., Craig E.A. et al. The yeast hsp70 homologue Ssa is required for translation and interacts with Sisl and Pabl on translating ribosomes //J. Biol. Chem.- 2001.- V.276.- P. 144261-4433.

285. Horwich A.L., Weber-Ban E.U., Finley D. Chaperone rings in protein folding and degradation//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1999.- V.96.- P. 11033-11040.

286. Houghton M., Stewart A.G., Doel S.M. et al. The amino-terminal sequence of human fibroblast interferon as deduced from reverse transcripts obtained using synthetic oligonucleotide primers //Nucl. Acids Res.- 1980.- V.8.- P. 1913-1931.

287. Huang S., Elliott R.C., Liu P.S. et al. Specificity of cotranslational amino-terminal processing of proteins in yeast // Biochemistry.- 1987.- V.26.- P.8242-8246.

288. Huber S., Spycher M., Lechner-Scott J. et al. Multiple sclerosis: therapy with recombinant beta-lb interferon: initial results with 30 multiple sclerosis patients in northwest Switzerland // Schweiz. Med. Wochenschr.- 1996.- V.126.- P. 14751481.

289. Hussain M., Gill D.S., Liao MJ. Both variant forms of interferon-alpha4 gene (IFNA4a and IFNA4b) are present in the human population // J. Interferon Cytokine Res.- 1997.- V.17.- P.559-566.

290. Hussain M., Ni D., Gill D. et al. IFN-alpha-la gene is the major variant in the North American population // J. Interferon Cytokine Res.- 2000,- V.20.- P.763-768.

291. Imperiali В., O'Connor S. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure // Curr. Opin. Chem. Biol.- 1999.- V.3.- P.643-649.

292. Inoue K., Wada Y., Nishimura M. et al. Heterologous expression and subcellular localization of pumpkin seed tonoplast intrinsic proteins (TIP) in yeast cells // Plant Cell Physiol.- 1997.- V.38.- P.366-370.

293. Issaly N., Solsona O., Joudrier P. et al. Optimization of the wheat puroindoline-a production in Pichia pastoris II J. Appl. Microbiol.- 2001.- V.90.- P.397-406.

294. Iyer V., Struhl K. Poly(dA-dT), a ubiquitous promoter element that stimulates transcription via its intrinsic DNA structure // EMBO J.- 1995a.- V.14.- P.2570-2579.

295. Iyer V., Struhl K. Mechanism of differential utilization of the his3 T-R and T-C TATA elements // Mol. Cell. Biol.-1995b.- V. 15.- P.7059-7066.

296. Jacobs E., Rutgers Т., Voet P. et al. Simultaneous synthesis and assembly of various hepatitis В surface proteins in Saccharomyces cerevisiae II Gene.-1989a.- V.80.- P.279-291.

297. Jacobs E., Gheysen D., Thines D. et al. The HIV Gag precursor Pr55sag synthesized in yeast is myristoylated and targeted to the plasma membrane // Gene.- 1989b.-V.79.-P.71-81.

298. Jahic M., Gustavsson M., Jansen A.K. et al. Analysis and control of proteolysis of a fusion protein in Pichia pastoris fed-batch processes // J. Biotechnol.- 2003.-V.102.- P.45-53.

299. Jahn T.P., Schulz A., Taipalensuu J. et al. Post-translational modification of plant plasma membrane H(+)-ATP-ase as a requirement for functional complementation of a yeast transport mutant // J. Biol. Chem.- 2002.- V.277.-P.6353-6358.

300. Jamieson A.A., Rahe В., Beggs J.D. A suppressor of a yeast splicing mutation (prp8-l) encodes a putative ATP-dependent RNA helicase // Nature.- 1991.-V.349.- P.715-717.

301. Jimenez A., Davies J. Expression of a transposable antibiotic resistance element in Saccharomyces //Nature.- 1980.- V.287.- P.869-871.

302. Jimenez R.E., Sanchez K., Roca H. et al. Different methanol feeding strategies to recombinant Pichia pastoris cultures producing high level of dextranase // Biotechnol. Techniq.- 1997.- V.l 1.- P.461-466.

303. Johnston M, Carlson M. Regulation of carbon and phosphate utilization // In: The Molecular and Cell Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae: Gene Expression.- CSHL Press.- 1992.- P. 193-280.

304. Jonsson L.J., Saloheimo M., Penttila M. Laccase from the white-rot fungus Trametes versicolor: cDNA cloning of led and expression in Pichia pastoris II Curr. Genet.- 1997.- V.32.- P.425-430.

305. Joseph-Horne Т., Hollomon D.W., Wood P.M. Fungal respiration: a fusion of standart and alternative components // Biochim. Biophys. Acta.- 2001.- V.1504.-P.179-195.

306. Juge N., Andersen J.S., Tull D. et al. Overexpression, purification, and characterization of recombinant barley alpha-amylases 1 and 2 secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris II Protein Expres. Purif.- 1996.- V.8.-P.204-214.

307. Julius D., Brake A., Blair L. et al. Isolation of the putative structural gene for the lysine-arginine endopeptidase required for processing of yeast prepro-a-factor // Cell.- 1984.- V.37.- P.1057-1083.

308. Jungmann J., Munro S. Multi-protein complexes in the cis Golgi of Saccharomyces cerevisiae with al,6-mannosyltransferase activity // EMBO J.-1998.- V.17.- P.423-434.

309. Jurgen В., Lin H.Y., Riemschneider S. et al. Monitoring of genes that respond to overproduction of an insoluble recombinant protein in Escherichia coli glucose-limited fed-batch fermentations // Biotechnol. Bioeng.- 2000.- V.70.-P.217-224.

310. Justice M.C., Hogan B.P., Vershon A.K. Homeodomain-DNA interactions of the Pho2 protein are promoter-dependent // Nucl. Acids Res.- 1997.- V.25.-P.4730-4739.

311. Kaffman A., Herskowitz I., Tjian R. et al. Phosphorilation of the transcription factor PH04 by cyclin-cdk complex, PH080-PH085 // Science.- 1994.- V.263.-P.l 153-1156.

312. Kaffman A., Rank N.M., O'Neil E.M. et al. The receptor Msn5 exports the phosphorylated transcription factor Pho4 out of the nucleus // Nature.- 1998a.-V.396.- P.482-486.

313. Kaffman A., Rank N.M., O'Shea E.K. Phosphorylation regulates association of the transcription factor Pho4 with its import receptorPsel/Kapl21 // Genes Dev.-1998b.- V.12.- P.2673-2683.

314. Kanaya E., Higashizaki Т., Ozawa F. et al. Synthesis and secretion of human growth factor by Saccharomyces cerevisiae II Gene.- 1989.- V.83.- P.65-74.

315. Kane J.F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli II Curr. Opin. Biotechnol.- 1995.- V.6.-P.494-500.

316. Kang H.A., Kim S.J., Choi E.S. et al. Efficient production of intact human parathyroid hormone in a Saccharomyces cerevisiae mutant deficient in yeast aspartic protease 3 (YAP3) I I Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1998.- V.50.- P.187-192.

317. Karpusas M., Nolte M., Benton C.B. et al. The crystal structure of human interferon p at 2.2-A resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997.- V.94.-P.l 1813-11818.

318. Kashima Т., Morishita A., Iwata H. et al. Expression of bovine cytokines in Escherichia coli Hi. Vet. Med. Sci.- 1999.- V.61.- P. 171-173.

319. Katakura Y., Ametani A., Totsuka M. et al. Accelerated secretion of mutant beta-lactoglobulin in Saccharomyces cerevisiae resulting from a single amino acid substitution // Biochem. Biophys. Acta.- 1999.- V.1432.- P.302-312.

320. Kawai R., Yoshida M., Tani T. et al. Production and characterization of recombinant Phanerochaete chrysosporium P-glucosidase in the methylotrophic yeast Pichia pastoris I I Biosci. Biotechnol. Biochem.- 2003.- V.67.- P. 1-7.

321. Kendall R.I., Yamada R., Bradshaw R.A. Cotranslational amino-terminal processing // Meth.Enzymol.- 1990.- V.185.- P.398-407.

322. Kerry-Williams S.M., Gilbert S.C., Evans L.R. et al. Disruption of the Saccharomyces cerevisiae YAP3 gene reduces the proteolytic degradation of secreted recombinant human albumin // Yeast.- 1998.- V.14.- P.161-169.

323. Khan N., Guarnieri M., Ahn S.H. et al. Modulation of hepatitis В virus secretion by naturally occurring mutations in the S gene // J. Virol.- 2004.- V.78.-P.3262-3270.

324. Kim M.D., Han K.C., Kang H.A. et al. Coexpression of BiP increased antithrombotic hirudin production in recombinant Saccharomyces cerevisiae II J. Biotechnol.- 2003.- V.101.- P.81-87.

325. Kim M.D., Rhee S.K., Seo J.H. Enhanced production of anticoagulant hirudin in recombinant Saccharomyces cerevisiae by chromosomal delta-integration // J. Biotechnol.- 2001.- V.85.- P.41-48.

326. Kim S., Schilke В., Craig E.A. et al. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998.- V.95.- P.12860-12865.

327. Kingsman S.M., Kingsman A.J., Dobson M.J. et al. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae II Biotechnol. Genet. Eng. Revs.- 1985.-V.3.- P.377-416.

328. Kinzy T.G., Woolford J.L.J. Increased expression of Saccharomyces cerevisiae translation elongation factor la bypasses the lethality of a TEF5 null allele encoding EF-ip // Genetics.-1995.- V.140.- P.481-489.

329. Kishko I.H., Vasilenko M.I. Properties of natural animal gamma-interferons and peculiarity of their action // Mikrobiol. Z.- 1998,- V.60.- P.65-70.

330. Kitano K., Nakao M., Itoh Y. et al. Recombinant hepatitis В virus surface antigen рЗ 1 accumulates as particles in Saccharomyces cerevisiae II BioTechnology.- 1987.-V.5.-P.281 -283.

331. Kjeldsen T. Yeast secretory expression of insulin precursors // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2000.- V.54.- P.277-286.

332. Kjeldsen Т., Pettersson A.F., Hach M. Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris // Biotechnol. Appl. Biochem.-1999.- V.29.- P.79-86.

333. Knauer R., Lehle L. The oligosaccharyltransferase complex from Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem.- 1999.- V.274.- P. 17249-17256.

334. Kniskern P.J., Hagopian A., Hofmann KJ. et al. Unusually high-level expression of a foreigh gene (hepatitis В virus core antigen) in Saccharomyces cerevisiae I I Gene.- 1986.- V.46.- P.135-141.

335. Knust В., von Wettstein D. Expression and secretion of pea-seed lipoxygenase isoenzymes in Saccharomyces cerevisiae II Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1992.-V.37.- P.342-351.

336. Ко J.H., Hahm M.S., Kang H.A et al. Secretory expression and purification of Aspergillus niger glucose oxidase in Saccharomyces cerevisiae II Protein Expres. Purif.- 2002.- V.25.- P.488-493.

337. Koch K.A., Thiele D.J. Functional analysis of a homopolymeric (dA-dT) element that provides nucleosomal access to yeast and mammalian transcription factors //J. Biol. Chem.- 1999.- V.274.- P.23752-23760.

338. Kolb V.A., Makeyev E.V., Spirin A.S. Co-translational folding of an eukaryotic multidomain protein in a prokaryotic transslation system // J. Biol. Chem.- 2000.-V.275.- P.16597-16601.

339. Koller A., Valesco J., Subramani S. The CUP1 promoter of Saccharomyces cerevisiae is inducible by copper in Pichia pastoris II Yeast.- 2000.-V.16.- P.651-656.

340. Komano H., Fuller R.S. Shared functions in vivo of a glycosyl-phosphatidylinositol-linked aspartyl protease, Mkc7, and the proprotein processing protease Kex2 in yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995.- V.92.-P.10752-10756.

341. Koren R., LeVitre J., Bostian K.A. Isolation of the positive-acting regulatory gene PH04 from Saccharomyces cerevisiae II Gene.- 1986.- V.41.- P.271-275.

342. Koth C.M., Botuyan M.V., Moreland R.J. et al. Elongin from Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem.- 2000.- V.275.- P.l 1174-11180.

343. Kowalski J.M., Parekh R.N., Wittrup K.D. Secretion efficiency in Saccharomyces cerevisiae of bovine pancreatic trypsin inhibitor mutants lacking disulfide bonds is correlated with thermodynamic stability // Biochemistry.-1998.- V.37.- P. 1264-1273.

344. Kozak M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs //Nucl. Acids Res.- 1987.- V.l5.- P.8125-8148.

345. Kozak M. Circumstances and mechanisms of inhibition of translation by secondary structure in eukaryotic mRNAs // Mol. Cell. Biol.- 1989.- V.9.-P.5134-5142.

346. Kramer G., Ramachandiran V., Hardesty B. Cotranslational folding omni mea mecum porto? // Int. J. Biochem. Cell Biol.- 2001a.- V.33.- P.541-553.

347. Kramer G., Steiner G.E., Sokol P. et al. Local intratumoral tumor necrosis factor-alpha and systemic IFN-alpha 2b in patients with locally advanced prostate cancer // J. Interferon Cytokine Res. -2001b.- V.21.- P.475-484.

348. Kramer R.A., Andersen N. Isolation of yeast genes with mRNA level controlled by phosphate concentration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1980.-V.77.- P.6541-6545.

349. Krecic A.M., Swanson M.S. hnRNP complexes: composition, structure, and function // Curr. Opin. Cell Biol.- 1999.- V.l 1.- P.372-377

350. Krugman S., Holley H.R., Davidson M. Immunogenic effect of inactivated hepatitis В vaccine: comparison of 20 microgram and 40 microgram doses // J. Med. Virol.- 1981.- V.8.- P.l 19-121.

351. Kudlicki W., Coffman A., Kramer G. et al. Ribosomes and ribosomal RNA as chaperones for folding of proteins // Fold. Des.- 1997.- V.2.- P.101-108.

352. Kukuruzinska M.A., Lennon K. Diminished activity of the first N-glycosylation enzyme, dolichol-P-dependent N-acetylglucosamine-l-P transferase (GPT), gives rise to mutant phenotypes in yeast // Biochim. Biophys. Acta.- 1995.- V.1247.-P.51-59.

353. Kulkarni M.S., Sherman F. NAT2, an esssential gene encoding methionine N alpha-acetyltransferase in the yeast Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem.-1994.- V.269.- P.13141-13147.

354. Kuo G., Choo Q.-L., Alter H.J. et al. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A, non-B hepatitis // Science.- 1989.- V. 244.- P.362-364.

355. Kurland C., Gallant J. Errors of heterologous protein expression // Curr. Opin. Biotechnol.- 1996.- V.7.- P.489-493.

356. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature.- 1970.- V.227.- P.680-685.

357. LaMarche A.E.P., Abate M.I., Chan S.H.P. et al. Isolation and characterization of COX12, the nuclear gene for a previously unrecognized subunit of Saccharomyces cerevisiae cytochrome с oxidase // J. Biol. Chem.-1992.-V.267.-P.22473-22480.

358. Langford C., Nellen W., Niessing J et al. Yeast is unable to excise foreign intervening sequences from hybrid gene transcripts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1983.- V.80.- P.1496-1500.

359. Langley K.E., Egan K.M., Barendt J.M. et al. Characterization of purified hepatitis В surfase antigen containing pre-S(2) epitopes expressed in Saccharomyces cerevisiae I I Gene.- 1988.- V.67.- P.229-245.

360. Laughon A., Gesteland R.F. Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae GAL4 gene // Mol. Cell. Biol.- 1984.- V.4.- P.260-267.

361. Le H., Tanguay R.L., Balasta M.L. et al. The translation initiation factors eIFiso4G and eIF4B interact with poly(A)-binding protein to increase its RNA binding affinity//J. Biol. Chem.- 1997.- V.272.- P. 16247-16255.

362. Lee F.W., Silva N.A. Application of Tyl for cloned gene insertion: amplification of large regulated expression cassette in Saccharomyces cerevisiae //Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1996.- V.44.- P.620-623.

363. Legrain M., De-Wilde M., Hilger F. Isolation, physical characterization and expression anlysis of the Saccharomyces cerevisiae positive regulatory gene PH04 //Nucl. Acids Res.- 1986.- V.14.- P.3059-3073.

364. Legrain M., Portetelle D., Dumont J. et al. Biochemical and immunological characterization of the bovine leukemia virus (BLV) envelope glycoprotein (gp51) produced in Saccharomyces cerevisiae II Gene.- 1989.- V.79.- P.227-237.

365. Lehrman M.A. Oligosaccharide-based information in endoplasmic reticulum quality control and other biological systems // J. Biol. Chem.- 2001.- V.276.-P.8623-8626.

366. Lemire J.M., Willcocks Т., Halvorson H.O. Regulation of repressible acid phosphatase gene transcription in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol.-1985.- V.5.- P.2131-2141.

367. Letourneur F., Cosson P. Targeting to the endoplasmic reticulum in yeast cells by determinants present in transmembrane domains // J. Biol. Chem.- 1998.-V.273.- P.33273-33278.

368. Letourneur O., Gervasi G., Gaia S. et al. Characterization of Toxoplasma gondii surface antigen I (SAG I) secreted from Pichia pastoris: evidence of hyper O-glycosylation//Biotechnol. Appl. Biochem.- 2001.- V.33.- P.35-45.

369. Levy F., Johnsson N., Rumenapf T et. al. Using ubiquitin to follow the metabolic fate of a protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996.- V.93.- P.4907-4912.

370. Lewis J.A., Huq A., Najarro P. Inhibition of mitochondrial function by interferon // J.Biol. Chem.- 1996.- V.271.- P. 13184-13190.

371. Li W.Z., Sherman F. Two types of TATA elements for the CYC1 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol.- 1991.- V.l 1.- P.666-676.

372. Li X., Chang Y.-H. Amino-terminal protein processing in Saccharomyces cerevisiae is an essential function that requires distinct methionine aminopeptidases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995.- V.92.- P. 12357-12361.

373. Li Z., Xiong F., Lin Q. et al. Low-temperature increases the yield of biologically active herring antifreeze protein in Pichia pastoris II Protein Expres. Purif.- 2001.- V.21.- P.438-445.

374. Ligr M., Madeo F., Frohlich E. et al. Mammalian Bax triggers apoptotic chages in yeast // FEBS Lett.- 1998.- V.438.- P.61-65.

375. Lim H.-K., Choi S.-J., Kim K.-Y. et al. Dissolved-oxygen-stat controlling two variables for methanol induction of rGuamerin in Pichia pastoris and its application to repeated fed-batch // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2003.- V.62.-P.342-348.

376. Lin P., Sherman F. The unique hetero-oligomeric nature of the subunits in the catalytic coooperativity of the yeast Cct chaperonin complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997.- V.94.- P.10780-110785.

377. Liu H., Tan X., Russell K.A. et al. PER3, a gene required for peroxisome biogenesis in Pichia pastoris, encodes a peroxisomal membrane protein involved in protein import//J. Biol. Chem.- 1995.- V.270.- P. 10940-10951.

378. Liu P.T., Та T.V., Villarete L.H. High-yield expression and purification of human interferon a-1 in Pichia pastoris II Protein Expres. Purif.- 2001.- V.22.-P.381-387.

379. Lohr D. Nucleosome transactions on the promoters of the yeast GAL and PHO genes // J. Biol. Chem.- 1997.- V.272.- P.26795-26798.

380. Lopes T.S., Klootwijk J., Veenstra A.E. et al. High-copy-number integration into the ribosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae: a new vector for high-level expression// Gene.- 1989.- V.79.- P. 199-206.

381. Lopez N., Halladay J., Walter W. et al. SSB, encoding a ribosome-associated chaperone, is coordinately regulated with ribosomal protein genes // J. Bacteriol.-1999.- V.181.- P.3136-3143.

382. Lotti M., Porro D., Martegani E. et al. Physiological and genetic modulation of inducible expression of Escherichia coli P-galactosidase in Saccharomyces cerevisiae II Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1988.- V.28.- P.160-165.

383. Lou J., Gasche Y., Zheng L. et al. Interferon-beta inhibits activated leukocyte migration through human brain microvascular endothelial cell monolayer // Lab. Invest.- 1999.- V.79.- P.1015-1025.

384. Lowenthal J.W., O'Neil Т.Е., David A. et al. Cytokine therapy: a natural alternative for disease control // Vet. Immun. Immunopathol.- 1999.- V.72.-P.183-188.

385. Lu H., Zhang H., Wang Q. et al. Purification, refolding of hybrid hlFNgamma-kringle S expressed in Escherichia coli // Curr. Microbiol.- 2001.- V.42.- P.211-216.

386. Lue N.F., Flanagan P.M., Sugimoto K. et al. Initiation by yeast RNA polymerase II at adenoviral major late promoter in vitro II Science.- 1989.-V.246.- P.661-664.

387. Lussier M., Sdicu A.M., Bussereau F. et al. The Ktrlp, Ktr3p and Kre2p/Mntlp mannosyltransferases participate in the elaboration of yeast O- and N-linked carbohydrate chains // J. Biol. Chem.- 1997.- V.272.- P.15527-15531.

388. Lussier M., Sdicu A.M., Bussereau F. The KTR and MNN1 mannosyltransferase families of Saccharomyces cerevisiae II Biochim. Biophys. Acta.- 1999.- V.1426.- P.323-334.

389. Lutstorf U., Megnet R. Multiple forms of alcohol dehydrogenase in Saccharomyces cerevisiae. I. Physiological control of ADH-2 and properties of ADH-2 and ADH-4И Arch. Biochem. Biophys.- 1968.- V.l26.- P.933-939.

390. Luttik M.A.H., Overkamp K.M., Kotter P. et al. The Saccharomyces cerevisiae NDE1 and NDE2 genes encode separate mitochondrial NADH dehydrogenases catalyzing the oxidation of cytosolic NADH // J. Biol. Chem.- 1998.- V.273.-P.24529-24534.

391. Lux S.E., John K.M., Bennett V. Analysis of cDNA for human erythrocyte ankyrin indicates a repeated structure with homology to tissue-differentiation and cell-cycle control proteins // Nature.- 1990.- V.344.- P.36-42.

392. Lyman S.K., Schekman R. Interaction between BiP and Sec63p is required for the completion of protein translocation into ER of Saccharomyces cerevisiae II J.Cell Biol.- 1995V. 131.- P. 1163-1171.

393. Ma J., Ptashne M. Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptional activating segments // Cell.- 1987a.- V.48.- P.847-853.

394. Ma J., Ptashne M. The carboxy-terminal 30 amino acids of GAL4 are recognized by GAL80 И Cell.- 1987b.- V.50.- P.137-140.

395. MacKay V.L., Weich S.K., Insley M.Y. et al. The Saccharomyces cerevisiae BAR1 gene encodes an exported protein with homology to pepsin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1988.- V. 85.- P.55-59.

396. Magnius L.O., Norder H. Subtypes, genotypes and molecular epidemiology of the hepatitis В virus as reflected by sequence variability of the S-gene // Intervirology.- 1995,- V.38.- P.24-34.

397. Mandrup S., Jepsen R., Skott H. et al. Effect of heterologous expression of acyl-CoA-binding protein on acyl-CoA level and composition in yeast // Biochem. J.- 1993.- V.290.- P.369-374.

398. Maris A.F., Kern A.L., Picada J.N. et al. Glutathione, but not transcription factor Yaplp, is required for carbon source-dependent resistance to oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet.- 2000.- V.37.- P. 175-182.

399. Mark D.F., Lu S.D., Creasey A.A. et al. Site-specific mutagenesis of the human fibroblast interferon gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1984.- V.81.- P.5662-5666.

400. Markaryan A., Beall C.J., Kolattukudy P.E. Inhibition of Aspergillus serine proteinase by Streptomyces subtilisin inhibitor and high level expression of this inhibitor in Pichia pastoris II Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1996.- V.220.-P.372-3 76.

401. Marmorstein R., Carey M., Ptashne M. et al. DNA recognition by GAL4: structure of a protein-DNA complex // Nature.- 1992.- V.356.- P.408-414.

402. Martegani E., Brambilla L., Porro D. et al. Alteration of cell population structure due to cell lysis in Saccharomyces cerevisiae cells overexpressing the GAL4 gene // Yeast.- 1993.- V.9.- P.575-582.

403. Mason N., Ciufo L.F., Brown J.D. Elongation arrest is a physiologically important function of signal recognition particle // EMBO J.- 2000.- V.l 9.-P.4164-4174.

404. Masure S., Paemen L., van Aelst I. et al. Production and characterization of recombinant active mouse gelatinase В from eukaryotic cells and in vivo effects after intravenous administration // Eur. J. Biochem.- 1997.- V.244.- P.21-30.

405. Matlack K.E., Mothes W., Rapoport T.A. Protein translocation: tunnel version //Cell.- 1998.- V.92.- P.381-390.

406. May L.T., Seghal P.B. On the relationship between human interferon alpha 1 and beta 1 genes // J. Interferon Res.- 1985.- V.5.- P.521-526.

407. McAlister L., Holland M.J. Differential expression of the three yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases genes // J. Biol. Chem.- 1985.-V.260.- P.l 5019-15027.

408. McBride H.J., Brazas R.M., Yu Y. et al. Long-range interaction at the HO promoter // Mol. Cell. Biol.- 1997.- V.l7.- P.2669-2678.

409. McCarthy J.E.G. Posttranscriptional control of gene expression in yeast // Microbiol. Mol. Biol. Rev.- 1998.- V.62.- P. 1492-1553.

410. McDonald S., Chang A.Y., Rubin P. et al. Combined Betaseron R (recombinant human interferon beta) and radiation for inoperable non-small cell lung cancer // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.- 1993.- V.27.- P.613-619.

411. Melcher K., Johnston S.A. GAL4 interacts with TATA-binding protein and coactivators // Mol. Cell. Biol.- 1995.- V.15.- P.2839-2848.

412. Melian E.B., Plosker G.L. Interferon alfacon-1: a review of its pharmacology and therapeutic efficacy in the treatment of chronic hepatitis С // Drugs.- 2001.-V.61.- P.I661-1691.

413. Mellor J., Dobson M.J., Kingsman A.J. et al. A transcriptional activator is located in the coding region of the yeast PGK gene // Nucl. Acids Res.- 1987.-V.15.- P.6243-6259.

414. Menendez J., Valdes I., Cabrera N. The ICLl gene of Pichia pastoris, transcriptional regulation and use of its promoter // Yeast.- 2003.- V.20.- P. 10971108.

415. Mickisch G.H., Garin A., van Poppel H. et al. Radical nephrectomy plus interferon-alfa-based immunotherapy compared with interferoh alfa alone in metastatic renal-cell carcinoma: a randomised trial // Lancet.- 2001.- V.358.-P.966-970.

416. Milek R.L., Stunnenberg H.G., Konings R.N. Assembly and expression of a synthetic gene encoding the antigen Pfs48/45 of the human malaria parasite Plasmodium falciparum in yeast// Vaccine.- 2000.- V.18.- P.1402-1411.

417. Minvielle-Sebastia L., Beyer K., Krecic A.M. et al. Control of cleavage site selection during mRNA 3' end formation by a yeast hnRNP // EMBO J.- 1998.-V.17.- P.7454-7468.

418. Miura M., Hirose M., Miwa Т. et al. Cloning and characterization in Pichia pastoris of PNOl gene required for the phosphomannosylation of N-linked oligosaccharides // Gene.- 2004.- V.324,- P. 129-137.

419. Miyanohara A., Toh-e A., Nozaki C. et al. Expression of hepatitis В surface antigen in yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1983.- V.80.- P.l-5.

420. Mogelsvang S., Gomez-Ospina N., Soderholm J. et al. Tomographic evidence for continuous turnover of Golgi cisternae in Pichia pastoris II Mol. Biol. Cell.-2003.- V.14.- P.2277-2291.

421. Moir D.T., Dumais D.R. Glycosylation and secretion of human a-1-antitrypsin by yeast // Gene.- 1987.- V.56.- P.209-217.

422. Moller I., Jung M., Beatrix B. et al. A general mechanism for regulation of access to the translocon: competition for a membrane attachment site on ribosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998.- V.95.- P. 13425-13430.

423. Monod M., Silve S., Haguenauer-Tsapis R. et al. In vivo and in vitro Studies of PH05 mutants at the signal peptidase cleavage site // Proc. Alko Symp. on Industr. Yeast Genet.- Helsinki.- 1987.- V.5.- P.149-154.

424. Montesino R., Garcia R., Quintero O. et al. Variation in N-linked oligosaccharide structures on heterologous proteins secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris I I Protein Expres. Purif.- 1998.- V.14.-P. 197-207.

425. Monttagui-Tabar S., Tuite M.F., Isaksson L.A. The influence of 5' codon context on translation termination in Saccharomyces cerevisiae II Eur. J. Biochem.- 1998.- V.257.- P.249-254.

426. Morgan D.A., Ruscetti F.W., Gallo R. Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows // Science.- 1976,- V.193.-P.1007-1008.

427. Muhlrad D., Decker C.J., Parker R. Deadenylation of the unstable mRNA encoded by the yeast MFA2 gene leads to decapping followed by 5'-3' digestion of the transcript // Genes Dev.- 1994.- V.8.- P.855-866.

428. Muhlrad D., Decker C.J., Parker R. Mutations affecting stability and deadenylation of the yeast MAF2 transcript. // Genes Dev.- 1992.- V.6.- P.2000-2111.

429. Murasugi A., Asami Y., Mera-Kikuchi Y. Production of recombinant human bile salt-stimulated lipase in Pichia pastoris II Protein Expres. Purif.- 2001.-V.23.- P.282-288.

430. Murasugi A., Tohma-Aiba Y. Comparison of three signals for secretory expression of recombinant human midkine in Pichia pastoris II Biosci. Biotechnol. Biochem.- 2001.- V.65.- P.2291-2293.

431. Murray K., Bruce S.A., Hinnen A. et al. Hepatitis В virus antigens made in microbial cells immunise against viral infection // EMBO J.- 1984.- V.3.- P.645-650.

432. Nagashima Т., Yamamoto Y., Gomi K. et al. A novel culture method for high level production of heterologous protein in Saccharomyces cerevisiae II Biosci. Biotechnol. Biochem.- 1994.- V.58.-P. 1292-1296.

433. Nagatani Т., Okazawa H., Kambara T. et al. Effect of natural interferon-beta on the growth of melanoma cell lines // Melanoma Res.- 1998.- V.8.- P.295-299.

434. Naik R.R., Nebes V., Jones E.W. Regulation of the proteinase В structural gene PRB1 in Saccharomyces cerevisiae //J.Bacteriol.- 1997.- V.179.- P. 1469-1474.

435. Nakamura Y., Gojobori Т., Ikemura T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000 // Nucl. Acids Res.- 2000.- V.28.- P.292.

436. Nakamura Y., Sato Т., Emi M. et al. Expression of human salivary alpha-amylase gene in Saccharomyces cerevisiae and its secretion using the mammalian signal sequence // Gene.- 1986.- V.50.- P.239-245.

437. Navarro L, David M. p38-dependent activation of interferon regulatory factors by lipopolysaccharide // J. Biol. Chem.- 1999.- V.274.- P.35535-35538.

438. Naylor D.J., Hartl F.U. Contribution of molecular chaperones to protein folding in the cytoplasm of prokaryotic and eukaryotic cells // Biochem. Soc. Symp.-2001.- V.68.- P.45-68.

439. Neilley L.K., Goodin D.S., Goodkin D.E. et al. Side effect profile of interferon beta-lb in MS: results of an open label trial // Neurology.- 1996.- V.46.- P.552-554.

440. Nelson R.J., Ziegelhoffer Т., Nicolet C. et al. The translation machinary and 70 kD heat shock protein cooperate in protein synthesis // Cell.- 1992.- V.71.- P.97-105.

441. Ng D.T., Brown J.D., Walter P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane //J. Cell Biol.-1996.- V.134.- P.269-278.

442. Ng D.T.W., Spear E.D., Walter P. The unfolded protein response regulates multiple aspects of secretory and membrane protein biogenesis and endoplasmic reticulum quality control // J. Cell Biol.-2000.- V.l50.- P.77-88.

443. Nierhaus K.H. Solution of the ribosome riddle: how the ribosome selects the correct aminoacyl-tRNA out of 41 similar contestants // Mol. Microbiol.- 1993.-V.9.- P.661-669.

444. Nilsson J., Stahl S., Ludeberg J. et al. Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of recombinant proteins // Protein Expres. Purif.- 1997.- V. 11.-P. 1-16.

445. Nishikawa S.I., Fewell S.W., Kato Y. et al. Molecular chaperones in the yeast endoplasmic reticulum maintain the solubility of proteins for retrotranslocation and degradation//!. Cell Biol.- 2000.- V.153.- P. 1061-1070.

446. Nishizawa M., Kawasumi M., Fujino M. et al. Phosphorylation of sicl, a cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitor, by Cdk including Pho85 kinase is required for its prompt degradation // Mol. Biol. Cell.- 1998.- V.9.- P.2393-2405.

447. Nishizawa M., Tanabe M., Yabuki N. et al. Pho 85 kinase, a yeast cyclin-dependent kinase, regulates the expression of UGP1 encoding UDP-glucose pyrophosphatase // Yeast.- 2001.- V.18.- P.239-249.

448. Nollen E.A., Kabakov A.E., Brunsting J.F. et al. Modulation of in vivo HSP70 chaperone activity by Hip and Bag-1 // J. Biol. Chem.- 2001.- V.276.- P.4677-4682.

449. Nonaka G., Ishikawa Т., Liu T.T. et al. Genetic analysis of growth inhibition of yeast cells caused by expression of Aspergillus oryzae RNAse T1 // Biosci. Biotechnol. Biochem.- 2000.- V.64.- P.2152-2158.

450. Norder H., Hammas В., Lee S.D. et al. Genetic relatedness of hepatitis В viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the primary structure of the surface antigen // J. Gen. Virol.- 1993.- V.74.- P.1341-1348.

451. Nyman T.A., Tolo H., Parkkinen J. et al. Identification of nine interferon-alpha subtypes produced by Sendai virus induced human peripheral blood leucocytes // Biochem. J.- 1998.- V.329.- P.295-302.

452. O'Neill E.M., Kaffman A., Jolly E.R. et al. Regulation of Pho4 nuclear localization by the Pho80-Pho85 cyclin-CDK complex // Science.- 1996.- V.271.-P.209-212.

453. Ogata K., Nishikawa H., Ohsugi M. A yeast capable of utilizing methanol // Agric. Biol. Chem.- 1969.- V.33.- P.1519-1520.

454. Ogawa N., DeRisi J., Brown P.O. New components of a system for phosphate accumulation and polyphosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiaerevealed by genomic expression analysis // Mol. Biol. Cell.- 2000.- V.l 1.-P.4309-4321.

455. Ogawa N., Noguchi K., Sawai H. et al. Functional domains of Pho81p, an inhibitor of Pho85p protein kinase, in the transduction pathway of Pi signals in Saccharomyces cerevisiae //Mol. Cell. Biol.- 1995.- V.15.- P.997-1004.

456. Ogawa N., Noguchi K., Yamashita Y. et al. Promoter analysis of the PH081 gene encoding a 134 kDa protein bearing ankyrin repeats in the phosphatase regulon of Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genet.- 1993.- V.238.- P.444-454.

457. Ogawa N., Oshima Y. Functional domains of a positive regulatory protein, PH04, for transcriptional control of the phosphatase regulon in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol.- 1990.- V.10.- P.2224-2236.

458. Ohi H., Miura M., Hiramatsu R. et al. The positive and negative cis-acting elements for methanol regulation in the Pichia pastoris AOX2 gene // Mol. Gen. Genet.- 1994.- V.243.- P.489-499.

459. Ohi H., Ohtani W., Okazaki N. et al. Cloning and characterization of the Pichia pastoris PRC1 gene encoding carboxypeptidase Y // Yeast.- 1996.- V.l2.- P.31-40.

460. Ohi H., Okazaki N., Uno S. et al. Chromosomal DNA patterns and gene stability of Pichia pastoris // Yeast.- 1998.- V.14.- P.895-903.

461. Ohtani W., Nawa Y., Takeshima K. et al. Physicochemical and immunochemical properties of recombinant human serum albumin from Pichia pastoris II Anal. Biochem.- 1998.- V.256.- P.56-62.

462. Okamoto H., Imai M., Tsuda F. et al. Point mutation in the S gene of hepatitis В virus for a d/y or w/r subtypic change in two blood donors carrying a surface antigen of compound subtype adyr or adwr // J. Virol.- 1987,- V.61.- P.3030-3034.

463. Okamura К., Kimata Y., Higashio H. et al. Dissociation of Kar2p/BiP from an ER sensory molecule, Irelp, triggers the unfolded protein response in yeast // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2000.- V.279.- P.445-450.

464. Oliveira C.C., Goossen В., Zanchin N.L.T. et al. Translational repression by the human iron-regulatory factor (IRF) in Saccharomyces cerevisiae II Nucl. Acids Res.- 1993.- V.21.-P.5316-5322.

465. Padkina M.V., Karsten S.L., Sambuk E.V. PH02 and PH04 proteins are involved in the regulation of CIT1 gene transcription in yeast // Abstr. of the yeast genetics and mol. biology meeting of GSA.- Madison.- USA.- 1996.-P.241A.

466. Paifer E., Margolles E., Cremata J. et al. Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences // Yeast.- 1994.- V.10.- P.1415-1419.

467. Pain V.M. Initiation of protein synthesis in eukaryotic cells // Eur. J. Biochem.-1996.- V.236.- P.747-771.

468. Pan Т., Coleman J.E. Structure and function of the Zn(II) binding site within the DNA-binding domain of the GAL4 transcription factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1989.- V.86.-P.3145-3149.

469. Parekh R., Forrester K., Wittrup D. Multicopy overexpression of bovine panreatic trypsin inhibitor saturates the protein folding secretory capacity of Saccharomyces cerevisiae II Protein Expres. Purif.- 1995.- V.6.- P.537-545.

470. Parent S.A., Fenimore C.M., Bostian K.A. Vector systems for the expression, analysis and cloning of DNA sequences in Saccharomyces cerevisiae II Yeast.-1985.- V.I.- P.83-138.

471. Parfenova L., Padkina M. The expression of human fibroblast IFN in Saccharomyces cerevisiae adversely effects on yeast cytochrome с oxidase activity // Yeast.- 2001.- V.18.- S.286.

472. Parodi A.J. Role of N-oligosaccharide endoplasmic reticulum processing reactions in glycoprotein folding and degradation // Biochem. J.-2000.- V.348.-P.l-13.

473. Paty D.W., Li D.K.B. Interferon beta-lb is effective in relapsing-remitting multiple sclerosis. II MRI analysis results of multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial //Neurology.- 1993.- V.43.- P.662-667.

474. Payne W.E., Gannon P.M., Kaiser C.A. An inducible acid phosphatase from the yeast Pichia pastoris: characterization of the gene and its product // Gene.- 1995.-V.163.- P. 19-26.

475. Payne W.E., Kaiser C.A., Bevis B.J. et al. Isolation of Pichia pastoris genes involved in ER-to-Golgi transport // Yeast.- 2000.- V.16.- P.979-993.

476. Penton E., Muzio V., Griego-Gonzalez M. The hepatitis В virus (HBV) infection and its prevention by a recombinant-DNA viral surface antigen (rec-HBsAg) vaccine // Biotecnologia Aplicada.- 1994,- V.l 1.- P.l-11.

477. Perlman D., Halvorson H.O., Cannon L.E. Presecretory and cytoplasmic invertase polypeptides encoded by distinct mRNAs derived from the same structural gene differ by a signal sequence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1982.-V.79.- P.781-785.

478. Pestka S. The human interferon alpha species and receptors // Biopolymers.-2000.- V.55.- P.254-287.

479. Pestka S., Baron S. Definition and classification of the interferons // Meth. Enzymol.- 1981.- V.78 (Pt.A).- P.3-14.

480. Pestka S., Langer J.A., Zoon K.C. et al. Interferons and their actions // Ann. Rev. Biochem.- 1987.- V.56.- P.727-777.

481. Peterson D.L. Isolation and characterization of the major protein and glycoprotein of hepatitis В surface antigen // J. Biol. Chem.- 1981.- V.256.-P.6975-6983.

482. Pfund C., Huang P., Lopez-Hoyo N. et al. Divergent functional properties of the ribosome-associated molecular chaperones Ssb compared with other Hsp70s //Mol. Biol. Cell.- 2001.- V.12.- P.3773-3782.

483. Pfund C., Lopez-Hoyo N., Ziegelhoffer T. et al. The molecular chaperone Ssb from Saccharomyces cerevisiae is a component of the ribosome-nascent chain complex // EMBO J.- 1998.- V.17.- P.3981-3989.

484. Pichuantes S., Nguyen A.T., Franzusoff A. Expression of heterologous gene products in yeast // In: Protein Engineering Principles and Practice. / Eds.: Cleland J.L., Craik C.S.- N.-Y.: Wiley Liss.- 1996.- P.129-161.

485. Pierrat В., Lacroute F., Losson R. The 5' untranslated region of the PPR1 regulatory gene dictates rapid mRNA decay in yeast // Gene.- 1993.- V.l31.-P.43-51.

486. Plath К., Rapoport T.A. Spontaneous release of cytosolic proteins from posttranslational substrates before their transport into the endoplasmic reticulum // J Cell Biol.- 2000.- V.l51P.l67-178.

487. Polevoda В., Norbeck J., Takakura H. et al. Identification and specificities of N-terminal acetyltransferases from Saccharomyces cerevisiae IIEMBO J.- 1999.-V.18.- P.6155-6168.

488. Porro D., Lotti M., Martegani E. et al. Enhanced expression of heterologous proteins by the use of a superinducible vector in budding yeast // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1992.- V.36.- P.655-658.

489. Preiss Т., Muckenthaler M., Hentze M.W. Poly(A)-tail-promoted translation in yeast: implications for translational control // RNA.- 1998.- V.4.- P.1321-1331.

490. Price V.L, Taylor W.E., Clevenger W.M. et al. Expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae using ADH2 promoter // Meth. Enzymol.-1990.- V.185.- P.308-318.

491. Primrose S.B. The application of genetically engineering microorganisms in the production of drug// J. Appl. Bacterid.- 1986.-V.61.- P.99-116.

492. Pringle J.R. Methods for avoiding proteolytic artefacts in studies of enzymes and other proteins from yeast // Meth. Cell Biol.- 1975.- V.12.-, P. 149-184.

493. Proudfoot A.E., Goffin L., Payton M.A. et al. In vivo and in vitro folding of a recombinant metalloenzyme, phosphomannose isomerase // Biochem. J.- 1996.-V.318.- P.437-442.

494. Radhakrishnan R., Walter L.J., Hruza A. et al. Zinc mediated dimmer of human interferon-alpha 2b revealed by X-ray crystallography // Structure.- 1996,- V.4.-P.1453-1463.

495. Rathore A.S., Sobacke S.E., Kocot T.J. et al. Analysis for residual host cell proteins and DNA in process streams of a recombinant protein product expressed in Escherichia coli cells // J. Pharm. Biomed. Anal.- 2003.- V.32.- P. 1199-1211.

496. Raue H.A. Metabolic stability of mRNA in yeast a potential target for modulating productivity // TIBTECH.- 1994.- V.12.- P.444-449.

497. Reimann В., Bradsher J., Franke J. et al. Initial characterization of the nascent polypeptide-associated complex in yeast // Yeast.- 1999.- V.15.- P.397-407.

498. Rein A., McClure M.R., Rice N.R. et al. Myristylation site in Pr65gag is essential for virus particle formation by Moloney murine leukemia virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1986.- V.83.- P.7246-7250.

499. Remaut E., Stanssens P., Fiers W. Inducible high level synthesis of mature human fibroblast interferon in E. coli II Nucl. Acids Res.- 1983.- V.l 1.- P.4677-4688.

500. Riesenberg D., Guthke R. High-cell-density cultivation of microorganisms // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1999.- V.51.- P.422-430.

501. Rinderknecht E., O'Conner B.H., Rodriguez H. Natural human interferon-gamma. Complete amino acid sequence and determination of sites of glycosylation // J. Biol. Chem.- 1984.- V.259.- P.6790-6797.

502. Rivkina M.B., Lunin V.G., Mahov A.M. et al. Nucleotide sequence of integrated hepatitis В virus DNA and human flanking regions in the genome of the PLC/PRF/5 cell line // Gene.- 1988.- V.64.- P.285-296.

503. Robb R.J., Kutny R.M., Panico M. et al. Amino acid sequence and post-translational modification of human interleukin 2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1984.-V.81.-P.6486-6490.

504. Robb R.J., Smith K.A. Heterogeneity of human T-cell growth factor(s) due to variable glycosylation // Mol. Immunol.- 1981.- V. 18.- P. 1087-1094.

505. Robinson A.S., Bockhaus J.A., Voegler A.C. et al. Reduction of BiP levels decreases heterologous protein secretion in Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem.- 1996.-V.271.-P. 10017-10022.

506. Robinson A.S., Hines V., Wittrup K.D. Protein disulfide isomerase overexpression increases secretion of foreign proteins in Saccharomyces cerevisiae И Bio/Technol.- 1994.- V.12.- P.381-384.

507. Robinson A.S., Wittrup K.D. Constitutive overexpression of secreted heterologous proteins decreases extractable BiP and protein disulfide isomerase levels in Saccharomyces cerevisiae II Biotechnol. Prog.- 1995.- V.ll.- P. 171177.

508. Rodriguez M., Martinez V., Alazo K. et al. The bovine IFN-col is biologically active and secreted at high levels in the yeast Pichia pastoris II J. Biotechnol.-1998.- V.60.- P.3-14.

509. Rodriguez M., Rubiera R., Penichet M. et al. High level expression of the B.microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle // J. Biotechnol.- 1994.- V.33.- P.135-146.

510. Rogers D.T., Lemire J.M., Bostian K. Acid phosphatase polypeptides in Saccharomyces cerevisiae are encoded by a differentially regulated multigene family//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1982.- V.79.- P.2157-2161.

511. Rohde J.R., Trinh J., Sadowski I. Multiple signals regulate GAL transcription in yeast // Mol. Cell. Biol.- 2000.- V.20.- P.3880-3886.

512. Rolfes R.J., Zhang F., Hinnebusch A.G. The transcriptional activators Basl, Bas2 and Abfl bind positive regulatory sites as the critical elements for adenine regulation of ADE5,7 // J. Biol. Chem.- 1997.- V.272.-P.13343-13354.

513. Romanos M.A., Makoff A.J., Fairwether N.F. et al. Expression of tetanus toxin fragment С in yeast: gene synthesis is required to eliminate fortuitous polyadenylation sites in AT-rich DNA //Nucl. Acids Res.- 1991a.-V.19.- P. 14611467.

514. Romanos M.A., Clare J.J., Beesley K.M. et al. Recombinant Bordetella pertussis pertactin (P69) from the yeast Pichia pastoris: high level production and immunological properties // Vaccine.- 1991b.- V.9.- P.901-906.

515. Romanos M.A., Scorer C.A., Clare J.J. Foreign gene expression in yeast // Yeast.- 1992.-V.8.- P.423-488.

516. Rossanese O.W., Soderholm J., Bevis B.J. et al. Golgi structure correlates with transitional endoplasmic reticulum organization in Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisiae II J. Cell Biol.- 1999.- V.145.- P.69-81.

517. Rourke I.J., Johnsen A.H., Din N. et al. Heterologous expression of human cholecystokinin in Saccharomyces cerevisiae. Evidence for a lysine-specific endopeptidase in the yeast secretory pathway // J. Biol. Chem.- 1997.- V.272.-P.9720-9727.

518. Rudick R.A., Simonian N.A. Alam J.A. et al. Incidence and significance of neutralizing antibodies to interferon beta-la in multiple sclerosis // Neurology. -1998.- V.50.- P.266-272.

519. Rudolph H.K., Antebi A., Fink G.R. et al. The yeast secretory pathway is perturbed by mutations in PMR1, a member of a Ca2+-ATPase family // Cell.-1989.- V.58.- P.133-145.

520. Ruiz-Moreno M., Fernandez P., Leal A. et al. Pilot interferon-beta trial in children with chronic hepatitis В who had previously not responded to interferon-alpha therapy // Pediatrics.- 1997.- V.99.- P.222-225.

521. Runkel L., deDios C., Karpusas M. et al. Systematic mutational mapping of sites on human interferon -p-la that are important for receptor binding and functional activity // Biochemistry.- 2000.- V.39.- P.2538-2551.

522. Runkel L., Meier W., Pepinsky R.B.et al. Structural and functional differences between glycosylated and non-glycosylated forms of human interferon-beta (IFN-beta) // Pharm. Res.- 1998.- V.15.- P.641-649.

523. Ruohonen L., Toikkanen J., Tieaho V. et al. Enhancement of protein secretion in Saccharomyces cerevisiae by overproduction of Sso protein, a late-acting component of the secretory machinery I I Yeast.- 1997.- V.13.- P.337-351.

524. Rusconi S., Agarossi A., Ravasi L. et al. Serum 2'5'-oligoadenylate synthase levels and clinical response to interferon-beta therapy in women with genital human papillomavirus infection // J. Infect. Dis.- 1994.- V.169.- P.l 112-1115.

525. Russel S.J, Sathyanarayana U.G., Johnston S.A. Isolation and characterization of SUG2. A novel ATPase family component of the yeast 26 S proteasome // J. Biol. Chem.- 1996.- V.271.- P.32810-32817.

526. Russell S.J., Steger K.A., Johnston S.A. Subcellular localization, stoichiometry, and protein levels of 26S proteasome subunits in yeast // J. Biol. Chem.- 1999.-V.274.- P.21943-21952.

527. Russo P. Saccharomyces cerevisiae mRNA 3' end forming signals are also involved in transcription termination- Yeast.- 1995.- V.l 1.- P.447-453.

528. Russo P., Li W.Z., Hampsey D.M. et al. Distinct cis-acting signals enhance 3' endpoint formation of CYC1 mRNA in yeast Saccharomyces cerevisiae IIEMBO J.- 1991.- V.10.- P.563-571.

529. Ryan M.T., Naylor D.J., Hoj P.B. et al. The role of molecular chaperones in mitochondrial protein import and folding // Int. Rev. Cytol.- 1997.- V.174.-P.127-193.

530. Sabin E.A., Lee-Ng C.T., Shuster J. et al. High-level expression and in vivo processing of chimeric ubiquitin fusion proteins in Saccharomyces cerevisiae II Bio/Technol.- 1989.- V.7.- P.705-709.

531. Sadhukhan R., Sen G.C., Sen I. Synthesis and cleavage-secretion of enzymatically active rabbit angiotensin-converting enzyme in Pichia pastoris II J. Biol. Chem.- 1996.- V.271.- P.l8310-18313.

532. Saelens X., Vanlandschoot P., Martinet W. et al. Protection of mice against a lethal influenza virus challenge after immunization with yeast-derived secreted influenza virus hemagglutinin // Eur.J.Biochem.- 1999.- V.260.- P.166-175.

533. Sagt C.M., Kleizen В., Verwaal R. et al. Introduction of an N-glycosylation site increases secretion of heterologous proteins in yeasts // Appl. Environ. Microbiol.- 2000.- V.66.- P.4940-4944.

534. Sakahira H., Nagata S. Co-translational folding of caspase-activated Dnase with Hsp70, Hsp40, and inhibitor of caspase-activated DNAse // J. Biol. Chem.-2002.- V.277.- P.33 64-33 70.

535. Sakai A., Ozawa F., Higashizaki T. et al. Enhanced secretion of human nerve growth factor from Saccharomyces cerevisiae using an advanced delta-integration system // Biotechnology.- 1991.- V.9.- P. 1382-1385.

536. Salama S.R., Hendricks K.B., Thorner J. G1 cyclin degradation: the PEST motif of yeast Cln2 is necessary, but not sufficient, for rapid protein turnover // Mol. Cell Biol.- 1994.- V.14.- P.7953-7966.

537. Sambucetti L.C., Schaber M., Kramer R. et al. The fos gene product undergoes extensive post-translational modification in eukaryotic but not prokaryotic cells // Gene.- 1986.- V.43.- P.69-77.

538. Santangelo G.M., Tornow J. Efficient transcription of the glycolytic gene ADH1 and three translational component genes requires the GCR1 product,which can act through TUF/GRF/RAP binding sites // Mol. Cell. Biol.- 1990.-V.10.- P.859-862.

539. Sareneva Т., Pirhonen J., Cantell K.et al. N-glycosylation of human interferon-gamma: glycans at Asn-25 are critical for protease resistance // Biochem. J.-1995.- V.308.- P9-14.

540. Sarramegna V., Demange P., Milon A. et al. Optimizing functional versus total expression of the human mu-opioid receptor in Pichia pastoris II Protein Expres. Purif.- 2002.- V.24.- P.212-220.

541. Sato S., Ward C.L., Kopito R.R. Cotranslational ubiquitination of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in vitro II J. Biol. Chem.- 1998.- V.273.-P.7189-7192.

542. Schaber M.D., De Chiara T.M., Kramer R.A. Yeast vector for production of interferon // Meth. Enzymol.- 1986.- V.l 19.- P.416-423.

543. Schafer W.R., Trueblood C.E., Yang C.-C. et al. Enzymatic coupling of cholesterol intermediates to a mating pheromone precursor and to the ras protein // Science.- 1990.- V.249.- P.l 133-1139.

544. Schein C.H., Noteborn M.H.M. Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coli is favored by lower growth temperature // Bio/Technol.- 1988.-V.6.- P.291-294.

545. Schekman R., Orci L. Coat proteins and vesicle budding // Science.- 1996.-V.271.- P.1526-1533.

546. Schneider K.R., Smith R.L., O'Shea E.K. Phosphate-regulated inactivation of the kinase. PH080-PH085 by the cdk inhibitor PH081 // Science.- 1994.-V.266.- P. 122-126.

547. Scholz C., Stoller G., Zarnt T. et.al. Cooperation of enzymatic and chaperone function of trigger factor in the catalysis of protein folding // EMBO J.- 1997.-V.16.- P.54-58.

548. Schroder M., Chang J.S., Kaufman R.J. The unfolded protein response represses nitrogen-starvation developmental differentiation in yeast // Genes Dev.- 2000.- V.14.- P.2962-2975.

549. Schultz L.D., Hofmann K.J., Mylin L.M. et al. Regulated overproduction of the GAL4 gene product greatly increases expression from galactose-inducible promoters on multi-copy expression vectors in yeast.// Gene.- 1987a.- V.61.-P.123-133.

550. Schultz L.D., Tanner J., Hoffmann K.J. et al. Expression and secretion in yeast of a 400 kDa envelope glycoprotein derived from Epstein-Barr virus // Gene.-1987b.- V.54.- P.l 13-123.

551. Scorer C.A., Buckholz R.G., Clare J.J. et al. The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris II Gene.- 1993.-V.136- P.l 1-119.

552. Sears I.B., O'Connor J., Rossanese O.W. et al. A versatile set of vectors for constitutive and regulated gene expression in Pichia pastoris II Yeast.- 1998.-V.14.- P.783-790.

553. Seddigh-Tonekaboni S., Waters J.A., Jeffers S. et al. Effect of variation in the common «а» determinant on the antigenicity of hepatitis В surface antigen // J. Med. Virol.- 2000.- V.60.- P.l 13-121.

554. Sefton B.M., Buss J.E. The covalent modification of eukaryotic proteins with lipid // J. Cell Biol.- 1987.- V.104.- P.1449-1453.

555. Sengstag C., Hinnen A. A 28-bp segment of the Saccharomyces cerevisiae PH05 upstream activator sequence confers phosphate control to the CYCl-lacZ gene fusion // Gene.- 1988.- V.67.- P.223-228.

556. Sengstag C., Hinnen A. The sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene PH02 codes for regulatory protein with unusual amino acid composition // Nucl. Acids Res.- 1987.-V. 15.- P.233-240.

557. Sentsui H., Murakami К., Inoshima Y. et al. Anti-viral effect of recombinant bovine interferon gamma on bovine leukaemia virus // Cytokine.- 2001,- V.l 6.-P.227-231

558. Serrano M., Hannon G.J., Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4 // Nature.- 1993.- V.366.-P.704-710.

559. Shao D., Creasy C.L., Bergman L.W. A cysteine residue in helix II of the bHLH domain is essential for homodimerization of the yesat transcription factor Pho4p // Nucl. Acids Res.- 1998.- V.26.- P.710-714.

560. Shao D., Creasy C.L., Bergman L.W. Interaction of Saccharomyces cerevisiae Pho2 with Pho4 increases the accessibility of the activation domain of Pho4 // Mol. Gen. Genet.- 1996.- V.251.- P.358-364.

561. Shapiro R.I., Wen D., Levesque M. et al. Expression of Sonic hedgehog-Fc fusion protein in Pichia pastoris. Identification and control of post-translational, chemical, and proteolytic modifications // Protein Expres. Purif.- 2003.- V.29.-P.272-283.

562. Sharp P.M., Tuohy T.M., Mosurski K.R. Codon usage in yeast: cluster analysis clearly differentiates highly and lowly expressed genes // Nucl. Acids Res.-1986.- V.14.- P.5125-5143.

563. Shaw S.P., Wingfield J., Dorsey M.J. et al. Identifying a species-specific region of yeast TFIIB in vivo //Mol. Cell. Biol.- 1996.- V.16.- P.3651-3657.

564. Shen E.C., Stage-Zimmermann Т., Chui P. et al. The yeast mRNA-binding protein Npl3p interacts with the cap-binding complex // J. Biol. Chem.- 2000.-V.275.- P.23718-23724.

565. Shen S., Suiter G., Jeffries T.W. et al. A strong nitrogen source-regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris 11 Gene.- 1998.-V.216.- P.93-102.

566. Shepard H.M., Leung D., Stebbing N. et al. A single amino acid change in IFN-betal abolishes its antiviral activity // Nature.- 1981.- V.294.- P.563-565.

567. Shepard S.R., Boyd G.A., Schrimsher J.L. Routine manufacture of recombinant proteins using expanded bed adsorption chromatography // Bioseparation.- 2001.-V.10.- P.51-56.

568. Sherman M.Y., Goldberg A.L. Involvement of molecular chaperones in intracellular protein breakdown // EXS (Experientia).- 1996.- V.77.- P.57-78.

569. Shimasaki N.B., Kane C.M. Structural basis for the species-specific activity of TFIIS //J. Biol. Chem.- 2000.- V.275.- P.36541-36549.

570. Shinde U., Li Y., Chatterjee S. et al. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1993.- V.90.- P.6924-6928.

571. Siegers K., Waldmann Т., Leroux M.R. et al. Compartmentation of protein folding in vivo: sequestration of non-native polypeptide by the chaperonin-GimC system // EMBO J.- 1999.- V.18.- P.75-84.

572. Sikorski, R.S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae H Genetics.-1989.-V. 122.-P. 19-27.

573. Sil A.K., Alam S., Xin P. et al. The Gal3p-Gal80p-Gal4p transcription switch of yeast: Gal3p destabilizes the Gal80p-Gal4p complex in response to galactose and ATP // Mol. Cell. Biol.- 1999.- V.19.- P.7828-7840.

574. Silberstein S., Schlenstedt G., Silver P.A. et al. A role for the DnaJ homologue Scjlp in protein folding in the yeast endoplasmic reticulum // J.Cell Biol.- 1998.-V.143.- P.921-933.

575. Silve S., Volland C., Hinnen A. et al. In vivo translocation of the cell wall acid phosphatase across the yeast endoplasmic reticulum membrane: are there multiple signals for the targeting process // Biochimie.- 1990.- V.72.- P. 103-114.

576. Silver J.M., Eaton N.R. Functional blocks of the ad-1 and ad-2 mutants of Saccharomyces cerevisiae II Biochem. Biophys. Res. Com.- 1969.- V.34.- P.301-305.

577. Silver P.A., Keegan L.P., Ptashne M. Amino terminus of the yeast GAL4 gene product is sufficient for nuclear localization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1984.-V.81.- P.5951-5955.

578. Simon S.M., Blobel G. A protein-conducting channel in the endoplasmic reticulum // Cell.- 1991.- V.65.- P.371-380.

579. Sinclair D.A., Kornfeld G.D., Dawes I.W. Yeast intragenic transcriptional control: activation and repression sites within the coding region of the Saccharomyces cerevisiae LPD1 gene // Mol. Cell. Biol.- 1994.- V.14.- P.214-225.

580. Skelly J., Howard C.R., Zuckerman A.J. Hepatite В polypeptide vaccine preparation in micelle form//Nature.- 1981.- V.290.- P.51-54.

581. Skogerson L., Wakatama E. A ribosome-dependent GTPase from yeast distinct from elongation factor 2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1976,- V.73.- P.73-76.

582. Skoko N., Argamante В., Grujicic N.K. et al. Expression and characterization of human interferon-beta 1 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris II Biotechnol. Appl. Biochem.- 2003.- V.38.- P.257-265.

583. Sleeman J.E., Lamond A.I. Nuclear organization of pre-mRNA splicing factors // Curr. Opin. Cell Biol.- 1999.- V.l 1.- P.363-371.

584. Smirnova Т., Laroche S., Errington M. L. et al. Transsynaptic expression of a presynaptic glutamate receptor during hippocampal long-term potentiation // Science.- 1993a.- V.262.- P.433-436.

585. Smirnova Т., Stinnakre J., Mallet J. Characterization of a presynaptic glutamate receptor// Science.- 1993b.- V.262.- P.430-433.

586. Smith J.D., Tang B.C., Robinson A.S. Protein disulfide isomerase, but not binding protein, overexpression enhances secretion of a non-disulfide-bonded protein in yeast // Biotechnol. Bioeng.- 2004.- V.85.- P.340-350.

587. Smith K.A. Interleukin-2: inception, impact, and implications // Science.-1988.- V.240.- P.l 169-1176.

588. Song Y., Azakami H., Hamasu M. et al. In vivo glycosylation suppresses the aggregation of amyloidogenic hen egg white lysozymes expressed in yeast // FEBS Lett.- 2001a.- V.491.- P.63-66.

589. Song Y., Sata J., Saito A. et al. Effects of calnexin deletion in Saccharomyces cerevisiae on the secretion of glycosylated lysozymes // J. Biochem.- 2001b.-V.130.- P.757-764.

590. Spencer J.F.T., Spencer D.M. Genetic improvement of industrial yeasts // Annu. Rev. Microb.- 1983.- V.37.- P.121-142.

591. Sreekrishna K., Brankamp R.G., Kropp K.F. et al. Strategies for optimal synthesis and secretion of heterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris II Gene.- 1997.- V.190.- P.55-62.

592. Sreekrishna K., Nelles L., Potenz R.H.B. et al. High level expression, purification, and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized in the methylotrophic yeast Pichia pastoris II Biochemistry.- 1989.-V.28.- P.4117-4125.

593. Sreekrishna K., Potenz R.H.B., Cruze J.A. et al. High level expression of heterologous proteins in methylotrophic yeast Pichia pastoris II J. Basic. Microbiol.- 1988.- V.28.- P.265-278.

594. Sreekrishna K., Tschopp J.F., Fuke M. Invertase gene (SUC2) of Saccharomyces cerevisiae as a dominant marker for transformation of Pichia pastoris II Gene.- 1987.- V.59.- P.l 15-125.

595. Stanway C.A., Chambers A., Kingsman A.J. et al. Characterization of the transcriptional potency of sub-elements of the UAS of the PGK gene in a PGK mini-promoter//Nucl. Acid Res.- 1989.- V.l7.- P.9205-9218.

596. Stephenne J. Development and production aspects of a recombinant yeast-derived hepatitis В vaccine // Vaccine.- 1990.- V.8 (Suppl.).- P.69-73.

597. Stephenne J. Recombinant versus plasma derived hepatitis В vaccines: issues of safety, immunogenecity and cost-effectiveness // Vaccine.- 1988.- V.6.- P.299-303.

598. Stirling C.J. Protein targeting to the endoplasmic reticulum in yeast // Microbiology.- 1999.- V.145.- P.991-998.

599. Stockmann C., Maier U., Anderlei T. et al. The oxygen transfer rate as key parameter for the characterization of Hansenula polymorpha screening cultures // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.- 2003.- V.30.- P.613-622.

600. Storrie В., Madden A. Isolation of subcellular organelles // Meth. Enzymol.-1990.- V.182.- P.203-225.

601. Stratford M. Another brick in the wall? Recent developments concerning the yeast cell envelope // Yeast.- 1994.- V. 10.- P. 1741 -1752.

602. Struhl K. Yeast transcriptional regulatory mechanisms // Annu. Rev. Genet.-1995.- V.29.- P.651-674.

603. Su W., Huber S.C., Crawford N.M. Identification in vitro of a post-translational regulatory site in the hinge 1 region of Arabidopsis nitrate reductase // Plant Cell.- 1996.- V.8.-P.519-527.

604. Sudbery P.E. The expression of recombinant proteins in yeast // Curr. Opin. Biotechnol.- 1996.- V.7.- P.517-524.

605. Suh J.-K., Poulsen L.L., Ziegler D.M. et al. Yeast flavin-containing monooxygenase generates oxidizing equivalents that control protein folding in the endoplasmic reticulum // Biochemistry.- 1999.- V.96.- P.2687-2691.

606. Sumi A., Okuyama K., Kobayashi K. et al. Purification of recombinant human serum albumin: efficient purification using STREAMLINE // Bioseparation.-1999.-V.8.- P. 195-200.

607. Superati-Furga G., Jonsson K., Courtneidge S.A. A functional screen in yeast for regulators and antagonizers of heterologous protein tyrosine kinase II Nat. Biotechnol.- 1996.- V.l 4.- P.600-605.

608. Suzuki Т., Varshavsky A. Degradation signals in the lysine-asparagine sequence space//EMBO J.- 1999.- V.l8.- P.6017-6026.

609. Svaren J, Horz W. Transcription factor vs nucleosomes: regulation of the PH05 promoter in yeast// Trends Biochem. Sci.- 1997.- V.22.- P.93-97.

610. Svaren J., Schmitz J., Horz W. The transactivation domain of Pho4 is required for nucleosome disruption at the PH05 promoter // EMBO J.- 1994.- V.13.-P.4856-4862.

611. Szent-Gyorgyi, C. A bipartite operator interacts with a heat shock element to mediate early meiotic induction of Saccharomyces cerevisiae HSP82 II Mol. Cell Biol.-1995.-V.15.-P.6754-6769.

612. Tabor E., Howard C.R., Skelly J. et al. Immunogenicity in chimpanzees of experimental hepatitis В vaccines prepared from intact hepatitis В virus, purified polypeptides, or polypeptide micelles //J. Med. Virol.- 1982.- V.10.- P.65-74.

613. Tachikawa H., Takeuchi Y., Funahashi W et al. Isolation and characterization of a yeast gene, MPD1, the expression of which supresses inviability caused by protein disulfide isomerase depletion // FEBS Lett.- 1995.- V.369.- P.212-216.

614. Tacke R., Chen Y., Manley J.L. Sequence-specific RNA binding by an SR protein requires RS domain phosphorylation: creation of an SRp40-specific splicing enhancer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997.- V.94.- P.l 148-1153.

615. Так P.P., Hart B.A., Kraan M.C. et al. The effects of interferon beta treatment on arthritis //Rheumatology.- 1999.- V.38.- P.362-369.

616. Talmont F., Sidobre S., Demange P. et al. Expression and pharmacological characterization of the human mu-opioid receptor in the methylotrophic yeast Pichia pastoris I I FEBS Lett.- 1996.- V.394.- P.268-272.

617. Taniguchi Т., Matsui H., Fujita T. et al. Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2 //Nature.- 1983.- V.302.- P.305-310.

618. Taniguchi Т., Ohno S., Fujii-Kuriyama Y Construction and identification of a bacterial plasmid containing the human fibroblast interferon gene sequence // Proc. Japan Acad.- 1979.- V.55.- P.464-469.

619. Tarun S.Z., Sachs A.B. Association of the yeast poly(A) tail binding protein with translation initiation factor eIF4G // EMBO J.- 1996.- V.l5.- P.7168-7177.

620. Tarun S.Z., Wells S.E., Deardorff J.A. et al. Translation initiation factor eIF4G mediates in vitro poly(A)tail-dependent translation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997.- V.94.- P.9046-9051.

621. Teter S.A., Houry W.A., Ang D. et al. Polypeptide flux through bacterial Hsp70:DnaK cooperates with trigger factor in chaperoning nascent chains // Cell.- 1999.- V.97.- P.755-765.

622. Tharun S., He W., Mayes A.E. et al. Yeast Sm-like proteins function in mRNA decapping and decay // Nature.- 2000.- V.404.- P.515-518.

623. Thomas J.G., Ayling A., Baneyx F. Molecular chaperones, folding catalysts, and the recovery of active recombinant proteins from E. coli. To fold or to refold //Appl. Biochem. Biotechnol.- 1997.- V.66.- P. 197-238.

624. Thompson C.C., Brown T.A., McNight S.L. Convergence of Est- and Notch -related structural motif in heteromeric binding complex // Science.- 1991.-V.253.- P.762-768.

625. Thomson L.M., Bates S., Yamazaki S. et al. Functional characterization of the Candida albicans MNT1 mannosyltransferase expressed heterologously in Pichia pastoris // J. Biol. Chem.- 2000.- V.275.- P. 18933-18938.

626. Thulasiraman V., Yang C.-F., Frydman J. In vivo newly translated polypeptides are sequestered in protected folding environment // EMBO J.- 1999.- V.l8.- P.85-95.

627. Tilg H. New insights into the mechanisms of interferon alfa: an immunoregulatory and anti-inflammatory cytokine // Gastroenterology.- 1997.-V.12.-P 1017-1021.

628. Ting J.T., Balsamo R.A., Ratnayake C. et al. Oleosin of plant seed oil bodies is correctly targted to the lipid bodies in transformed yeast // J. Biol. Chem.- 1997,-V.272.- P.3699-3706.

629. Tiollais P., Pourcel C., Dejean A. The hepatitis В virus // Nature.- 1985.-V.317.- P.489-495.

630. Tleugabulova D., Falcon V., Sewer M. et al. Aggregation of recombinant hepatitis В surface antigen in Pichia pastoris II J. Chromatogr. В.- 1998.- V.716.-P.209-219.

631. Todorow Z., Spang A., Carmack E et al. Active recycling of yeast Golgi mannosyltransferase complexes through the endoplasmic reticulum // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2000.- V.97.- P.13643-13648.

632. Toh-e A., Kakimoto S., Oshima Y. Genes coding for the structure of the acid phosphatase in Saccharomyces cerevisiae //Mol. Gen. Genet.- 1975.- V.143.-P.65-70.

633. Toh-e A., Tanaka K., Uesono Y. et al. PH085, a negative regulator of the PHO system, is a homolog of the protein kinase gene, CDC28, of Saccharomyces cerevisiae И Mol. Gen. Genet.- 1988.- V.214.- P.162-164.

634. Tovey M.G., Bandu M.T., Begon-Lours J. et al. Antiviral activity of bovine interferons on primate cells // J. Gen. Virol.- 1977.- V.36.- P.341-344.

635. Towler D.A., Eubanks S.R., Towery D.S. et al. Amino-terminal processing of proteins by N-myristoylation: substrate specificity of N-myristoyltranaferase // J. Biol. Chem.- 1987a.- V.262.- P.1030-1036.

636. Towler D.A., Adams S.P., Eubanks S.R. et al. Purification and characterization of yeast myristoyl CoA: protein N- myristoyltranaferase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1987b.- V.84.- P.2708-2712.

637. Trachtulec Z., Forejt J. Transcription and RNA processing of mammalian genes in Saccharomyces cerevisiae II Nucl. Acid Res.- 1999.- V.27.- P.526-531.

638. Tremblay L.O., Herscovics A. Characterization of a cDNA encoding a novel human al,2-mannosidase (1С) involved in N-glycan biosynthesis // J. Biol. Chem.- 2000.- V.275.- P.31655-31660.

639. Tremblay L.O., Herscovics A. Cloning and expression of a specific human alpha 1,2-mannosidase that trims Man9GlcNAc2 to Man8GlcNAc2 isomer В during N-glycan biosynthesis // Glycobiology.- 1999.- V.9.- P. 1073-1078.

640. Trent J.M., Olson S., Lawn R.M. Chromosomal localization of human leukocyte, fibroblast, and immune interferon genes by means of in situ hybridization //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1982.- V.79.- P.7809-7813.

641. Trimble R.B., Atkinson P.H., Tschopp J.F. et al. Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris II J. Biol. Chem.- 1991.- V.266.- P.22807-22817.

642. Tsang W.K., Cao B.J., Wang J. Sequence analysis of Candida albicans phosphoribosyl-aminoimidazole carboxylase (ADE2) gene // Yeast.- 1997.-V.13.- P.673-676.

643. Tschopp J.F., Brust P.F., Cregg J.M. et al. Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris II Nucl. Acid Res.- 1987a.-V.15.- P.3859-3876.

644. Tschopp J.F., Harpold M.M., Cregg J.M. et al. Yeast production of hepatitis В surface antigen // US Patent 4,895,800.- 1990.

645. Tschopp J.F., Sverlow G., Kosson R. et al. High level secretion of glycosylated invertase in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris II Bio/Technol.- 1987b.-V.5.- P.1305-1308.

646. Tsumoto K., Ejima D., Kumagai I. et al. Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies // Protein Expr. Purif.- 2003.- V.28.- P. 1-8.

647. Tyedmers J., Kruse M., Lerner M. et al. Assembly of heterodimericluciferase after de novo synthesis of subunits in rabbit reticulocyte lysate involves hsc70and hsp40 at a post-translational stage // Eur. J. Biochem.- 2000,- V.267.-P.3575-3582.

648. Ueda Y., Toh-e A., Oshima Y. Isolation and characterization of recessive, constitutive mutations for repressible acid phosphatase synthesis in Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol.- 1975,- V.122.- P.911-920.

649. Uesono Y., Tokai M., Tanaka K. et al. Negative regulators of PHO system in Saccharomyces cerevisiae: characterization of PH080 and PH085 // Mol. Gen. Genet.- 1992.- V.231.- P.426-432.

650. Valentini S.R., Weiss V.H., Silver P.A. Arginine methylation and binding of Hrplp to the efficiency element for mRNA З'-end formation // RNA.- 1999.-V.5.- P.272-280.

651. Valenzuela P. Medina A., Rutter W.J. et al. Synthesis and assembly of hepatitis В virus surface antigen particles in yeast // Nature.- 1982.- V.298.- P.347-360.

652. Valenzuela P., Coit D., Medina-Selby M.A. et al. Antigen engineering in yeast: synthesis and assembly of hybrid hepatitis В surface antigen-herpes simplex 1 gD particles // Bio/Technology.- 1985.- V.3.- P. 141 -144.

653. Vallee F., Lipari F., Yip P. et al. Crystal structure of a class I al,2-mannosidase involved in N-glycan processing and endoplasmic reticulum quality control // EMBO J.- 2000.- V.19.- P.581-588.

654. Van den Heuvel J.J., Bergkamp R.J.M., Planta R.J. et al. Effect of deletions in the 5'-noncoding region on the translational efficiency of phosphoglycerate kinase mRNA in yeast // Gene.- 1989.- V.79.- P.83-95.

655. Van den Steen P., Rudd P.M., Dwek R.A. et al. Concepts and principles of O-linked glycosylation // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.- 1998a.- V.33.- P. 151-208.

656. Van den Steen P., Rudd P.M., Proost P. et al. Oligosaccharides of recombinant mouse gelatinase В variants // Biochim. Biophys. Acta.- 1998b.- V.1425.- P.587-598.

657. Vandenbroeck K., Billiau A. Interferon-gamma is a target for binding and folding by both Escherichia coli chaperone model systems GroEL/GroES and DnaK/DnaJ/GrpE // Biochimie.- 1998.- V.80.- P.729-737.

658. Vandenbroeck K., Martens E., Billiau A. Gro EL/ES chaperonins protect interferon-gamma against physicochemical stress-study of tertiary structure formation by alpha-caseinquenching and ELISA // Eur. J. Biochem.-1998.-V.251.- P.181-188.

659. Varshavsky A. N-end rule: functions, mysteries, uses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996.- V.93.- P.12142-12149.

660. Vassileva A., Chugh D.A., Swaminathan S. et al. Expression of hepatitis В surface antigen in the methylotrophic yeast Pichia pastoris using the GAP promoter// J. Biotechnol.- 2001a.-V.88,- P.21-35.

661. Vassileva A., Chugh D.A., Swaminathan S. et al. Effect of copy number on the expression level of hepatitis В surface antigen in the methylotrophic yeast Pichia pastoris II Protein Expres. Purif.- 2001b.- V.21.- P.71-80.

662. Veenhuis M., van Dijken J.P., Harder W. The significance of peroxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeasts // Adv. Microbiol. Physiol.-1983.- V.24.- P.l-82.

663. Vega Laso M.R., Zhu D., Sagliocco F. et al. Inhibition of translational initiation in the yeast Saccharomyces cerevisiae as a function of the stability and position of hairpin structures in the mRNA leader // J. Biol. Chem.- 1993.- V.268.-P.6453-6462.

664. Verdone L., Cesari F., Denis C.L. et al. Factors affecting Saccharomyces cerevisiae ADH1 chromatin remodeling and transcription // J. Biol. Chem.-1997.- V.272.- P.30828-30834.

665. Verostek M.F., Trimble R.B. Mannosyltransferase activity in membranes from various yeast strains // Glycobiology.- 1995.- V.5.- P.671-681.

666. Vilela C., Ramirez C.V., Linz B. et al. Post-termination ribosome interactions with the 5'UTR modulate yeast mRNA stability // EMBO J.- 1999.- V.l 8.-P.3139-3152.

667. Vogel K., Horz W., Hinnen A. The two positively acting regulatory proteins PH02 and PH04 physically interact with PH05 upstream activation regions // Mol. Cell. Biol.- 1989.- V.9.- P.2050-2057.

668. Wada Т., Takagi Т., Yamaguchi Y. et al. DSIF, a novel transcription elongation factor that regulates RNA polymerase II processivity, is composed of human Spt4 and Spt5 homologs // Genes Dev.- 1998.- V.12.- P.343-356.

669. Wagner S.L., Siegel R.S., Vedvick et al. High level expression, purification and characterization of the Kunitz-type protease inhibitor domain of protease nexin-2/amyloid р-protein precursor // Biochem. Biophys. Res. Com.- 1992.- V.l86.-P.l 138-1145.

670. Wahle E., Keller W. The biochemistry of 3'-end cleavage and polyadenylation of messager RNA precursors // Annu. Rev. Biochem.- 1992.- V.61.- P.419-440.

671. Walker K.W., Bradshaw R.A. Yeast methionine aminopeptidase I. Alteration of substrate specificity by site-directed mutagenesis // J. Biol. Chem.- 1999.-V.274.- P.13403-13409.

672. Wang C.C., Tsou C.L. Enzymes as chaperones and chaperones as enzymes // FEBS Lett.- 1998.- V.425.- P.382-384.

673. Wang M., Lee L.S., Nepomich A. et al. Single-chain Fv with manifold N-glycans as bifiinctional scaffolds for immunomolecules // Protein Eng.- 1998.-V.ll.- P. 1277-1283.

674. Wang P., Zhang J., Sun Z. et al. Glycosylation of prourokinase produced by Pichia pastoris impairs enzymatic activity but not secretion // Protein Expres. Purif.- 2000.- V.20.- P.179-185.

675. Wang S., Sakai H., Wiedmann M. NAC covers ribosome-associated nascent chains thereby forming a protective environment for regions of nascent chains just emerging from the peptidyl transferase center // J.Cell Biol.- 1995b.- V.l 30.-P.519-528.

676. Warsame A., Vad R., Kristensen T. et al. Characterization of a gene encoding a Pichia pastoris protein disulfide isomerase // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2001,- V.281.-P.1176-1182.

677. Waterham H.R., Digan M.E., Koutz P.J. et al. Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter// Gene.- 1997.- V.l86.- P.37-44.

678. Watts F., Castle C., Beggs J. Aberrant splicing of Drosophila alcohol dehydrogenase transcripts in Saccharomyces cerevisiae // EMBO J.- 1983.- V.2.-P.2085-2091.

679. Wei C.C., Balasta M.L., Ren J.H. et al. Wheat germ poly(A) binding protein enhances the binding ability of eukaryotic initiation factor 4F and (iso)4F for cap analogues // Biochemistry.- 1998.- V.37.- P.l910-1916.

680. Weiss H.M., Haase W., Michel H. et al. Expression of functional mouse 5-HT5A serotonin receptor in the methylotrophic yeast Pichia pastoris'. pharmacological characterization and localization // FEBS Lett.- 1995.- V.377.- P.451-456.

681. Welihinda A.A., Kaufman R.J. The unfolded protein response pathway in Saccharomyces cerevisiae. Oligomerization and trans-phosphorylation of Irelp (Ernlp) are required for kinase activation // J. Biol. Chem.- 1996.- V.271.-P.18181-18187.

682. Wenz P., Schwank S., Hoja U. et al. A downstream regulatory element located within the coding sequence mediates autoregulated expression of the yeast fatty acid synthase gene FAS2 by the FAS1 gene product // Nucl. Acids Res.- 2001.-V.29.- P.4625-4632.

683. Werner-Washburne M., Braun E., Johnston G.C. et al. Stationary phase in yeast Saccharomyces cerevisiae II Microbiol. Rev.- 1993.- V.57.- P.383-401.

684. Werten M.W., van den Bosch T.J., Wind R.D. et al. High-yield secretion of recombinant gelatins by Pichia pastoris II Yeast.- 1999.- V.15.- P. 1087-1096.

685. Wetzel R. Assignment of the disulphide bonds of leukocyte interferon // Nature.-1981.- V.289.-P.606-607.

686. Whiteway M.S., Ahmed A. Recombinational instability of a chimeric plasmid in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol.- 1984.- V.4.- P. 195-198.

687. Wicker S., Maurizi M.R., Gottesman S. Posttranslational quality control: folding, and degrading proteins // Science.- 1999.- V.286.- P.1888-1893.

688. Wingfield P.T, Graber P., Payton M.A. Biochemical estimation of hepatitis В surface antigen in recombinant yeast // Yeast.- 1987.- V.3.- P.43-49.

689. Withers-Martinez С., Carpenter E.P., Hackett F. et al. PCR-based gene synthesis as an efficient approach for expression of the A+T-rich malaria genome // Protein Eng.- 1999.- V.12.- P.l 113-1120.

690. Wittke S., Dunnwald M., Johnsson N. Sec62p, a component of the endoplasmic reticulum protein translocation machinary, contains multiple binding sites for the Sec-complex //Mol. Biol. Cell.- 2000.- V.l 1.- P.3859-3871.

691. Wobbe C.R., Struhl K. Yeast and human TATA-binding proteins have nearly identical DNA sequence requirements for transcription in vitro II Mol. Cell. Biol.- 1990.- V.10.- P.3859-3867.

692. Wood M.J., Komives E.A. Production of large quantities of isotopically labeled protein in Pichia pastoris by fermentation // J. Biomol. NMR.- 1999.- V.13.-P. 149-159.

693. Woolford C.A., Daniels L.B., Park F.J. et al. The PEP4 gene encodes an aspartyl protease implicated in the posttranslational regulation of Saccharomyces cerevisiae vacuolar hydrolases // Mol. Cell Biol.- 1986.- V.6.- P.2500-2510.

694. Xie J., Zhang L., Ye Q. et al. Angiostatin production in cultivation of recombinant Pichia pastoris fed with mixed carbon sources // Biotechnol. Lett.-2003.- V.25.- P.173-177.

695. Xie Y., Varshavsky A. Physical association of ubiquitin ligases and the 26S proteasome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2000.- V.97.- P.2497-2502.

696. Xu В., Sellos D., Janson J.-C. Cloning and expression in Pichia pastoris of a blue mussel (Mytilis edulis) (3-mannanase gene // Eur. J. Biochem- 2002.- V.269.-P. 1753-1760.

697. YaDeau J.T., Klein C., Blobel G. Yeast signal peptidase contains a glycoprotein and the Secll gene product // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.- V.88.- P.517-521.

698. Yamada K., Wang J.C., Osawa H. et al. Efficient large-scale transformation of yeast // Biotechniques.- 1998.- V.24.- P.596-598.

699. Yan W., Schilke R., Pfund C. et al. Zuotin, a ribosome-associated DnaJ molecular chaperone // EMBO J.- 1998.- V.17.- P.4809-4817.

700. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors // Gene.- 1985.- V.33.- P.103-19.

701. Yoon H., Donahue T.F. Control of translation initiation in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Microbiol.- 1992.- V.6.- P.1413-1419.

702. Yoon H., Miller S.P., Pabich E.K. et al. SSL1, a suppressor of a HIS4 5'-UTR stem-loop mutation, is essential for translation initiation and affects UV resistance in yeast // Genes Dev.- 1992.- V.6.- P.2463-2477.

703. Yoshida K., Ogawa N., Oshima Y. Function of the PHO regulatory genes for repressible acid phosphatase synthesis in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genet.- 1989.- V.217.- P.40-46.

704. Young E.T., Saario J., Kacherovsky N. et al. Characterization of a p53-related activation domain in Adrlp that is sufficient for ADR1-dependent gene expression // J. Biol. Chem.- 1998.- V.273.- P.32080-32087.

705. Yu J., Donoviel M.S., Young E.T. Adjacent upstream activation sequence elements synergitically regulate transcription of ADH2 in Saccharomyces cerevisiae И Mol. Cell. Biol.- 1989.- V.9.- P.34-42.

706. Yun D.F., Laz T.M., Clements J.M. et al. mRNA sequences influencing translation and the selection of AUG initiator codon in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol. Microbiol.- 1996.- V.l9.- P. 1225-1239.

707. Zabriskie D.W., Arcuri E.J. Factors influencing productivity of fermentations employing recombinant microorganisms // Enzyme Microb. Technol.- 1986.-V.8.- P.706-717.

708. Zapun A., Jakob C.A., Thomas D.Y. et al. Protein folding in specialized compartment: the endoplasmic reticulum // Structure.- 1999.- V.7.- P. 173-182.

709. Zdanov A., Schalk-Hihi C., Gustchina A. et al. Crystal structure of interleukin-10 reveals the functional dimer with an unexpected topological similarity to interferon gamma // Structure.- 1995.- V.3.- P.591-601.

710. Zhang F., Kirouac M., Zhu N. et al. Evidence that complex formation by Baslp and Bas2p(Pho2p) unmasks the activation function of Baslp in an adenine-repressible step of ADE gene transcription // Mol. Cell. Biol.- 1997.- V.l 7.-P.3272-3283.

711. Zhang Y.J., Jin N.Y., Jiang W.Z. et al. Cloning and expression of the external-glycoprotein gene mutant from HIV-2 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and identification of the glycoprotein // Biotechnol. Appl. Biochem.- 2001,-V.34.- P. 1-4.

712. Zhang Z.D., Hutching G., Kitching P. et al. The effects of gamma interferon on replication of foot-and-mouth disease virus in persistently infected bovine cells // Arch. Virol.- 2002.- V.147.- P.2157-2167.

713. Zhou R., Kroczynska В., Miernyk J.A. Expression of the Arabidopsisi thaliana AtJ2 cochaperone protein in Pichia pastoris II Protein Expres. Purif.- 2000.-V.19.- P.253-258.

714. Zhu A., Wang Z.K., Beavis R. Structural studies of alpha-N-acetylgalactosaminidase: effect of glycosylation on the level of expression, secretion efficiency, and enzyme activity // Arch. Biochem. Biophys.- 1998.-V.352.- P.l-8.

715. Zimmermann R., Sagstetter M., Lewis M.J. et al. Seventy-kilodalton heat-shock proteins and an additional component from reticulocyte lysate stimulate import of M13 precoat into microsomes // EMBO J.- 1988.- V.7.- P.2875-2880.

716. Zinser E., Daum G. Isolation and biochemical characterization of organelles from yeast Saccharomyces cerevisiae II Yeast.- 1995.- V.l 1.- P.348-361.

717. Zurbriggen В., Bohlen E., Sanglad D. et al. Controlled expression of heterologous cytochrome P450e cDNA in Saccharomyces cerevisiae. I. Construction and expression of a complete rat cytochrome P450e cDNA // J. Biotechnol.- 1989b.- V.9.- P.255-272.

718. Zwart K., Veenhuis M., van Dijken J.P. et al. Development of amine oxidase-containing peroxisomes in yeast during growth on glucose in the presence of methylamine as the sole source of nitrogen // Arch. Microbiol.- 1980.- V.l 26.-P.l 17-126.

719. В заключение считаю своим приятным долгом выразить искреннюю признательность заведующему лабораторией биохимической генетики БиНИИ СПбГУ Смирнову Михаилу Николаевичу за предоставленную мне возможность заниматься любимым делом в прекрасной лаборатории.

720. Благодарю моего мужа Крецера Юрия Львовича за терпение и постоянную поддержку, без которых эта работа не была бы завершена. Хочу также поблагодарить моих дочерей Наташу и Иру за помощь при оформлении диссертации и подготовке ее к защите.

Информация о работе

Падкина, Марина Владимировна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2005
ВАК 03.00.15

Диссертация

Сравнительный анализ экспрессии гетерологичных генов в дрожжах Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris и изучение условий повышения продукции рекомбинантных белков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы