Исследование генетических механизмов корегуляции метаболизма азота и фосфора у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Савинов, Владимир Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование генетических механизмов корегуляции метаболизма азота и фосфора у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование генетических механизмов корегуляции метаболизма азота и фосфора у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

На правах рукописи

САВИНОВ Владимир Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ КОРЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА АЗОТА И ФОСФОРА У ДРОЖЖЕЙ БА ССНА1ЮМУСЕБ СЕЯЕУШАЕ

специальность: 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 НОЯ 2012

Санкт-Петербург 2012

005055954

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете, в лаборатории биохимической генетики кафедры генетики и биотехнологии.

Научный руководитель: доцент, доктор биологических наук

Елена Викторовна Самбук кафедра генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук

Владимир Геннадьевич Королев отделение молекулярной и радиационной биофизики ФГБУ Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова, Гатчина

профессор, доктор биологических наук Тыну Рихович Сойдла Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Московский государственный

университет им. М.В. Ломоносова, Москва

Защита состоится 2012 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д.212.232.12^ по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан " " 2012 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.212.232.12 доктор биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Физиология микроорганизмов в значительной степени зависит от условий изменчивой окружающей среды. Адаптивный ответ клетки заключается в коррекции метаболических процессов, изменении скорости роста и деления, переходе к мицелиальному росту или споруляции. Дефицит в среде одного из макроэлементов, углерода, азота или фосфора, в короткий срок приводит к истощению его внутриклеточных резервов и одновременно меняет уровень экспрессии целых групп генов: некоторые активируются, другие репрессируются. На изменение состава среды клетки отвечают перестройкой метаболизма. Мишенями для сигнальных молекул являются как регуляторные белки, так и гены, кодирующие ключевые ферменты метаболизма. Определенный транскрипционный фактор способен влиять на уровень экспрессии целого ряда генов, кодирующих ферменты какого-либо метаболического пути, за счет наличия в их промоторах сходных последовательностей. Известно, что у дрожжей более 30% генома составляют гены, промоторные области которых распознаются несколькими транскрипционными факторами, это является характерной особенностью эукариот (Lee et al., 2002). Некоторые гены располагают в промоторах сайтами связывания для активаторов или репрессоров разных метаболических путей и могут воспринимать сигналы об изменении качества и количества разных биогенных элементов. Кроме того, одни и те же регуляторные белки могут быть активаторами одних путей и репрессорами других (Попова и др., 2000; Pina et al., 2003). Таким образом, отдельный внешний стимул может усиливаться при передаче по внутриклеточным каскадам и вызывать глобальные изменения экспрессии всего генома. У дрожжей изучена экспрессия более 6000 генов в ответ на недостаток в среде отдельных биогенных элементов, таких как азот, углерод или фосфор. Предложены модели интегрального ответа клетки на дефицит того или иного компонента среды (Самбук, 2005; Bradley et al., 2009; Ogawa et al., 2000; Staschke et al., 2010). Несмотря на широкое применение современных технологий, особенности регуляции отдельных генов в ответ на различные сигналы среды часто изучены недостаточно. Можно предположить, что в дрожжевой клетке существует гораздо более разветвленная сеть регуляторных каскадов, чем известно сейчас. Для поиска новых точек пересечения таких каскадов необходимо использовать удобные генетические модели. В настоящей работе в качестве модели для изучения механизмов координированной регуляции был выбран ген РНОЗ, кодирующий конститутивную кислую фосфатазу дрожжей (кКФ).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлся поиск общих путей регуляции метаболизма азота и фосфора на примере гена РНОЗ у дрожжей S. cerevisiae. В задачи исследования входило:

1) изучить зависимость уровня экспрессии гена РНОЗ от качества источника азота в среде;

2) получить и охарактеризовать регуляторные мутации, влияющие на экспрессию гена РНОЗ в ответ на изменение источника азота в среде;

3) клонировать гены, мутации в которых влияют на экспрессию гена РНОЗ при изменении источника азота в среде;

4) предложить модели регуляции экспрессии гена РНОЗ в зависимости от типа источника азота.

Научная новизна работы. В ходе работы показано, что экспрессия гена РНОЗ регулируется в зависимости от типа источника азота в среде. Ген РНОЗ не является объектом азотной катаболитной репрессии. Впервые показано, что экспрессия этого гена существенно возрастает на средах с глутаматом в качестве единственного источника азота. Предложенная в работе селективная система позволила расширить спектр мутаций, влияющих на экспрессию гена РНОЗ в зависимости от источника азота. Были выявлены возможные механизмы регуляции экспрессии гена РНОЗ: на уровне транскрипции при участии репрессора генов азотного метаболизма Gzßp и на посттранскрипционном уровне - с помощью убиквитин-лигазы Rsp5p.

Практическая ценность. Изучение регуляции промотора гена РНОЗ различными факторами среды представляет теоретический и практический интерес. Экспрессия гена РНОЗ имеет достаточно высокий уровень, но в отличие от гена РН05, не зависит от изменений концентрации фосфата в среде. Промотор РНОЗ может быть использован в биотехнологии, однако, в отличие от промотора РН05, его практически не используют, так как в некоторых случаях конститутивная экспрессия гетерологичного гена может быть токсична для клеток дрожжей. Исследование генетического контроля экспрессии гена РНОЗ в ответ на изменение характера азотного питания позволит выявить новые регуляторные механизмы и может существенно расширить возможности его применения в биотехнологии для гетерологичного синтеза.

Штаммы и плазмиды, полученные в данной работе, используются при выполнении исследовательских работ в лаборатории биохимической генетики биолого-почвенного факультета СПбГУ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на конференциях, по результатам которых вошли в сборники тезисов: 1) ВОГиС III. Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития. Москва, Россия. 2004; 2) 22-я Международная конференция по генетике дрожжей и молекулярной биологии. Братислава, Словакия. 2005; 3) Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва, Пущино, Россия. 2006; 4) Международная конференция по генетике дрожжей и молекулярной биологии. Торонто, Канада. 2008; 5) ВОГиС V. Москва, Россия. 2009; 6) 24-я Международная конференция по генетике дрожжей и молекулярной биологии. Манчестер, Англия. 2009; 7) Experimental Approaches to Evolution and Ecology using Yeast. EMBL Heidelberg, Germany. 2012.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ (2 статьи, 2 обзора, 7 тезисов).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 155 источников. Работа изложена на 128 страницах и содержит 26 рисунков и 5 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы дрожжей и бактерий. Генотипы штаммов дрожжей S. cerevisiae, используемых в данной работе, приведены в таблице 1. Штамм YM954 (Vignols et al., 2005) был использован в качестве исходного для трансформации плазмидами, содержащими ген ADE2 под контролем промотора гена РНОЗ, а также для получения мутантов 1,4,5,6,7-YM954 и для выделения геномной ДНК с целью

проведения ПЦР. Штамм 57-D579 был использован для анализа доминантности или рецессивности и выяснения моногенности полученных мутаций. Штамм 9Г-Б580, полученный в споровом потомстве диплоида D580 от скрещивания гаплоидных штаммов 5-YM954 и 57-D579, использовали в тесте на аллелизм. Штамм 203-D579 был использован для картирования мутаций с помощью гаплоидизации. Для амплификации плазмид использовали бактериальный штамм Escherichia coli DH-5a (Meselson & Yuan, 1968).

Табл. 1. Штаммы дрожжей S. cerevisiae, использованные в работе.

Штамм Генотип

YM 954 MATa ade2-101 ura3-52 his3-2001еи2-3,112 lys2-801 trpl-901 gal4-542

1,4,5,6-YM954 MATa ade2-101 ura3-52 his3-200 Ieu2-3,I12 Iys2-80I trpl-901 gal4-542 gubl

7-YM954 MATa ade2-101 ura3-52 his3-200 Ieu2-3,U2 lys2-801 trpl-901 gal4-542 %ub7

57-D579 MATa ade2-101 leu2-3.112 argö pho3-l

203-D579 MATa his7-l argöpho3-l

9r-D580 MATa ade2-101 ura3-52 his3-200 lys2-801 trpl-901 arg6gub5

Плазмиды. Для изучения влияния источников азота на экспрессию гена РНОЗ использовали мультикопийную плазмиду pTLl [PH03p-ADE2 2ц LEU2], содержащую промоторную область гена РНОЗ от -17 до -370 н., считая от кодона ATG (Останин и др., 1988). Выбор данного вектора для изучения экспрессии гена ADE2 обусловлен его высокой стабильностью и мультикопийностью. Плазмида pFL36 [СEN LEU2] (Vector NTI, Invitrogen Corporation), была использована для конструирования центромерной плазмиды pSF28 [PH03p-ADE2 CEN LEU2], несущей ген ADE2 под контролем промотора гена РНОЗ. Для клонирования мутаций использовали библиотеку генов YSC4613 дрожжей S. cerevisiae, созданную на основе вектора pGP564 \2ц LEU2] (Yeast Genomic Tiling Collection, Open biosystems), предоставленную лабораторией физиологической генетики кафедры генетики и биотехнологии биолого-почвенного факультета СПбГУ. Для клонирования мутации gubl использовали библиотеку генов S. cerevisiae на основе мультикопийного вектора pFL44L \2ц URA3], любезно предоставленную доктором J.M. Thevelein (Institute of Botany and Microbiology, Katholieke Universiteit Leuven, Belgium), и библиотеку на основе центромерного вектора pRS200 [CEN TRP1], Плазмида pRSP321, содержащая геномную последовательность гена RSP5 с промотором и терминатором, была создана на основе вектора pRS316 [CEN URA3], Плазмида pGZF316, содержащая геномную последовательность гена GZF3 с промотором и терминатором, была сконструирована также на основе вектора pRS316 [CEN URA3]. Геномные копии генов RSP5 и GZF3, содержащие промоторную и терминаторную области, были синтезированы методом ПЦР по матрице хромосомной ДНК штамма YM954 дрожжей S.cerevisiae. Праймеры M13-pUC-F и M13-pUC-R использовали для выделения методом ПЦР и секвенирования участка геномной ДНК, комплементирующего мутацию gubl, в составе плазмид из библиотек генов дрожжей S. cerevisiae. Праймеры Con-RSP5-F, Con-RSP5-R, содержащие на 5'-концах сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции Xbal (TCTAgA) и EcoRI (gAATTC) соответственно, использовали для синтеза последовательности гена RSP5 по матрице хромосомной ДНК, выделенной из штамма YM954, при конструировании новой плазмиды pRSP321. Праймеры sRSP5-Fl, sRSP5-F2, sRSP5-F3, sRSP5-Rl, sRSP5-R2 и sRSP5-R3 использовали для секвенирования гена RSP5 у исходного штамма YM954 и

мутантов %иЫ 1,4,5,6-УМ954. Праймеры вгРЗ-Р и ОгРЗ-Я, содержащие на 5'-концах сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции ВашН1 ^АТСС), использовали для синтеза последовательности гена ОХРЗ по матрице хромосомной ДНК, выделенной из штамма УМ954, при конструировании новой плазмиды рС7РЗ 16. Для анализа активности промотора гена РНОЗ в зависимости от состава среды методом ПЦР в реальном времени использовали праймеры для гена актина АСТ1 - ЭСАСП-Р и БСАСЛ -Я, для гена РНОЗ - РНОЗ-Р и РНОЗ-Ы, а также зонды БСАСТЬР и РНОЗ-Р.

Праймеры. Все праймеры, использованные в данной работе, и их нуклеотидные последовательности указаны в таблице 2.

Табл. 2. Праймеры, использованные в работе. Полужирным шрифтом выделены сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции в последовательностях праймеров (пояснения см. в тексте). Буквы К и Я в

Праймер Последовательность T„ °C

M13-pUC-F 5' CCCAgTCACgACgTTgTAAAACg 34

M13-pUC-R 5' AgCggATAACAATTTCACACAgg

Con-RSP5-F 5' gCTCTAgAgCAgTgATCTTCATggT 42

Con-RSP5-R 5' CgAATTCCTTTACTATTgTTAgCTgA

sRSP5-F-l 5' AgTTggACCTACCgAATATAgTg 50

SRSP5-F-2 5' CgTTTgAAgAgCAgTATggTCgT

sRSP5-F-3 5' TAgATTACggTTgTgTTTCCAgAg

sRSP5-R-l 5' CTTCTgTTTgATTgAgCgTTggAC

sRSP5-R-2 5' AATgTTCggggTTgATgCCACTg

SRSP5-R-3 5' CAAgATgATTgAggCAgAAAgAATg

GZF3-F 5' gggATCCgTCATCgCTgAgTTATTg 40

GZF3-R 5' gggATCCATTCCATTTCTTCggCAA

SCACT1-F 5' TCCTTCTgTTTTgggTTTgg 60

SCACT1-R 5' TTTCTTTCTggAggAgCAATg

РНОЗ-F 5' TggTgAgATggATgCTAAgAgAC 60

РНОЗ-R 5' AgCATCTTCATCCCATCCTg

SCACT1-P 5' gCAAAAggAAATCACCgCTTTg 60

РНОЗ-Р 5' gCCgCTAgTTCTgAAAgggTTC

Среды и условия культивирования штаммов. Среды MD, YPD, LB, ПЕП имеют стандартные составы (Захаров и др., 1984; Guthrie & Fink, 1991). В отличие от среды ПЕП, ПЕПФО содержит 1 г КН2Р04 на 1 л среды. Для определения активности КФ у штаммов S.cerevisae использовали среду МФО, которая содержит на 1л дистиллированной воды: КН2РО4 - 1 г, MgSO^HjO - 1 г, 200 мл 0,1 М цитратного буфера, витамины (b-аланин - 500 мкг, биотин - 2 мкг), глюкозу - 20 г. Аминокислоты, необходимые для роста ауксотрофных штаммов, добавляли в концентрации 40 мг/л (аденин, лейцин, урацил) и 20 мг/л (лизин, триптофан, гистидин) среды. Минимальная среда без азота (MD_N) содержит в 1 л те же компоненты, что и MD, за исключением сульфата аммония. В качестве источника азота использовали сульфат аммония, мочевину и аминокислоты: пролин, глутамин и глутамат, которые добавляли в среду в конечной концентрации 0,46 % (Magasanik & Kaiser, 2002). Среда MD стандартного состава содержит 0,2 мкг/мл тиамина. Для изучения активности кКФ и экспрессии гена РНОЗ использовали среду MD без добавления тиамина. Для отбора бактериальных трансформантов по признаку устойчивости к антибиотику в среду LB добавляли ампициллин или канамицин в концентрации 50 мкг/мл. Среда для споруляции (с NaAc)

содержит на 1 л дистиллированной воды: NaAc - 10 г, KCl - 5 г. В среду добавляли стандартные количества витаминов и необходимых аминокислот. Для работы на чашках Петри в среды добавляли агар до 2% концентрации. Все дрожжевые штаммы культивировали при 30°С, а бактериальные - при 37°С.

Методы. В работе были использованы стандартные генетические методики работы со штаммами дрожжей: индукция мутантов, метод гибридизации, комплементационный тест на аллелизм, тетрадный анализ и анализ расщепления в случайной выборке аскоспор (Захаров и др., 1984). Выделение ДНК из клеток, генетическую трансформацию клеток, выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей и гель-электрофорез проводили в стандартных условиях (Guthrie & Fink, 1991; Sambrook, 2001; Остерман, 2002). Гидролиз эндонуклеазами рестрикции, дефософорилирование векторов, амлификацию ДНК методом ПЦР, очистку ДНК из агарозного геля и лигирование проводили в растворах и при условиях, предложенных фирмой-изготовителем ферментов (Fermentas, г. Вильнюс).

Мутагенез. Для получения мутантов S. cerevisiae с восстановлением роста на среде с мочевиной колонии клеток трансформантов YM954[pTLl] и YM954[pSF28] облучали УФ (70 мВт/м2) в течение 1 минуты и инкубировали в течение недели в темноте при 30°С.

Индукция гаплоидизации и отбор клеток Ura". Для индукции гаплоидизации диплоидные клетки дрожжей, гетерозиготные по маркерным мутациям, высевали на среду с беномилом (30 мкл/мл среды), затем переносили на селективные среды, в том числе на среду с фтороротовой кислотой (1 г 5-FOA на 1 л среды) для отбора клонов с фенотипом Ura". Выросшие анеуплоидные ауксотрофные колонии переносили методом реплик на чашки со средой, содержащей глутамат в' качестве источника азота, и анализировали рост колоний (Guthrie & Fink, 1991).

Качественное определение активности КФ (Самсонова и др., 1975). На поверхность среды с выросшими колониями дрожжей накладываются бумажные фильтры, смоченные раствором а-нафтилфосфата и красителя синего прочного Б в концентрациях 2 мг/мл в 0,1 М цитратном буфере pH 4,6 (для рКФ) и pH 3,7 (для кКФ). Через 10-15 минут учитывали активность фермента. Интенсивность окраски коррелирует с активностью КФ.

Измерение активности кКФ (Падкина, 1978). На стационарной фазе роста культуры дрожжей измеряли оптическую плотность культуры при длине волны 550 нм и поглощение света пНФ в реакционной смеси при длине волны 410 нм. Реакционная смесь включает на 1 пробу (1 мл): 800 мкл 0,1 М цитратного буфера pH 3,7; 100 мкл 0,15 М пНФФ; 100 мкл культуры клеток дрожжей. Реакционную смесь инкубировали при 30°С в течение 20 минут, после чего реакцию останавливали добавлением 500 мкл 1н NaOH и затем измеряли поглощение света с длиной волны 410 нм молекулами пНФ, образованного при расщеплении пНФФ с участием кКФ РЬоЗр. В контрольные пробы 100 мкл культуры добавляли только после остановки реакции щелочью. Для построения гистограммы использовали значения удельной активности кКФ, выраженной соотношением активности кКФ в культуре клеток и оптической плотности культуры дрожжей.

Метод ПЦР в режиме реального времени. Клетки штамма дрожжей выращивали до ранней логарифмической фазы в среде, содержащей разные источники азота. Суммарную РНК выделяли из равного количества клеток для каждой культуры. РНК обрабатывали ДНКазой, после чего синтезировали кДНК методом обратной транскрипции. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР в режиме реального времени. Реакцию проводили при помощи амплификатора нуклеиновых кислот АНК-32 («Синтол», Россия), используя технологию TaqMan по следующей схеме: 3 минуты 95°С, затем 50 циклов, включающих 30 секунд при 95°С и 30 секунд при 60°С. Температура отжига всех праймеров составляла 60°С. Праймеры для ПЦР в реальном времени подбирались с использованием программы «Primer 3» (сайт программы: http://primer3.sourceforge.net).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние источника азота на экспрессию гена РНОЗ и активность фермента КФ РЬоЗр в зависимости от источника азота. Уровень экспрессии генов РНОЗ и РН05, кодирующих основные фракции КФ дрожжей 5. cerevisiae, зависит от доступности азота в среде, а именно уменьшается при азотном голодании (Gasch et al., 2000; Bradley et al., 2009). В нашей работе мы изучали зависимость экспрессии гена РНОЗ от типа источника азота в среде. На первом этапе мы определяли, какое влияние могут оказывать разные типы источника азота в среде на активность кКФ дрожжей. Для этого штамм YM954 (Табл. 1) культивировали в средах, содержащих пять источников азота -от более предпочтительного к менее: глутамин, сульфат аммония, глутамат, пролин и мочевину. Активность кКФ Pho3p определяли количественно. Результаты измерений активности кКФ после 60 часов культивирования штамма YM954 представлены в виде гистограммы на рисунке 1. Было показано, что активность кКФ изменяется в зависимости от типа источника азота в среде. Так, например, наибольшая активность КФ РЬоЗр наблюдается при росте дрожжей в среде с глутаматом в качестве единственного источника азота. Активность при росте в среде с глутамином, сульфатом аммония или мочевиной сопоставимы и почти в 2 раза ниже, чем при использовании глутамата. Наименьшую активность кКФ показывает при росте с пролином._

Рис. 1. Влияние различных источников азота в среде на активность КФ РЬоЗр штамма УМ954 5. сегеушае после 60 часов культивирования в среде МФО при 20°С. Источники азота добавлялись в среду в концентрации 0,46%. Опыт проводили в трех

повторностях. При расчете ошибок использовали

значения р = 0,95; / = 2; = 4,302.

Чтобы показать, что изменение активности КФ РЬоЗр обусловлено изменением уровня экспрессии гена РНОЗ в зависимости от источника азота в среде, был использован метод ПЦР в режиме реального времени, позволяющий проводить

! 9

{

] количественный анализ уровней экспрессии генов. В качестве источников азота для анализа были выбраны сульфат аммония, глутамат и мочевина. Оказалось, что уровень ; экспрессии гена РНОЗ изменяется в зависимости от типа источника азота в среде аналогично изменению активности кКФ: транскрипция гена происходит интенсивнее в клетках, растущих в среде с глутаматом в качестве единственного источника азота, а \ при использовании сульфата аммония и мочевины уровни транскрипции ниже и примерно равны (Рис. 2). Таким образом, нами показано соответствие между уровнями активности кКФ РЬоЗр и экспрессии гена РНОЗ дрожжей cerevisiae. Тот факт, что I наибольшую активность кКФ имеет при росте дрожжей в среде с глутаматом, позволяет ; говорить о возможности использования среды данного состава для усиления экспрессии генов в гетерологичной конструкции под контролем промотора гена РНОЗ.

Рис. 2. Влияние различных источников азота в среде на уровень экспрессии гена РНОЗ КФ штамма УМ954 5. сегеушае. Клетки культивировали в среде МФО при 20°С. Источники азота добавляли в среду в концентрации 0,46%. Опыт проводился в восьми повторностях. При расчете ошибок использовали значения р = 0,95;/= 7; = 2,3646. В качестве контроля анализировали уровень экспрессии генаЛС7У.

2. Разработка системы селективного отбора мутантов с нарушенной регуляцией гена РНОЗ. Для изучения механизмов регуляции гена РНОЗ в ответ на изменение источника азота в среде и селекции регуляторных мутантов гораздо удобнее ! использовать не сам ген РНОЗ, который не даёт селективного преимущества, а репортерный ген АОЕ2, кодирующий фермент биосинтеза пуринов, ! фосфорибозиламиноимидазолкарбоксилазу, под контролем промотора гена РНОЗ. При этом об уровне экспрессии гена РНОЗ будет свидетельствовать не только рост или ! отсутствие роста на среде без аденина, но и цвет колонии: красный или белый. Рост трансформантов на селективных средах разного состава, в том числе с разными источниками азота, отражает активность промотора гена РНОЗ. Поскольку копийность плазмиды может влиять на уровень синтеза белка, необходимо учитывать количество белков-регуляторов. В работе мы использовали два типа плазмид: мультикопийную плазмиду рТЫ, созданную ранее и содержащую репортерный ген АБЕ2 под контролем промотора гена РНОЗ (Останин и др., 1988); а также центромерную плазмиду р8Р28, полученную в ходе работы. Схема конструирования плазмиды р8Р28 представлена на | рисунке 3-А. Для создания новой плазмиды был получен фрагмент ДНК «промотор РНОЗ - ген АОЕ2 - терминатор РН05» размером 2700 п.о. после обработки плазмиды рТЫ эндонуклеазой рестрикции Рв^, который затем был встроен в вектор рРЬЗб, обработанный этой же эндонуклеазой. Плазмида р8Р28 имеет размер 9099 п.о. и содержит ген АОЕ2 под контролем промотора гена РНОЗ. На рисунке 3-Б представлены электрофореграммы (а) вектора и вставки после обработки эндонуклеазой рестрикции Рей, а также (б) плазмиды рБР28.

Рис. 3-А. Схема конструирования плазмиды pSF28 [PH03p-ADE2 CEN LEU2], Арг, Тс - гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину соответственно; ori — область начала репликации; 2/л - сайт инициации репликации 2-микронной плазмиды; ADE2, LEU2 — гены дрожжей S. cerevisiae-, РНОЗр, PH05t - промотор и терминатор генов КФ дрожжей S. cerevisiae; MCS — полилинкерная область; РМВ1 - область начала репликации; CEN6 — центромера. Участок плазмиды pTLl длиной 2730 п.о., содержащий промотор гена РНОЗ, кодирующую область гена ADE2 и терминатор гена PHOS, вырезали по сайту клонирования Pstl и встроили в вектор pFL36 по такому же сайту (Савинов и др., 2011).

Рис. 3-Б. Электрофореграмма разделения продуктов гидролиза плазмиды pSF28: (а) дорожка 1 - ДНК-маркер MassRuler Mix фирмы Fermentas; дорожка 2 - вектор pFL36 размером 6369 п.о.; дорожка 3 - фрагмент ДНК «промотор РНОЗ - ген ADE2 - терминатор PHOS» размером 2730 п.о. (б) дорожка 1 — нативная плазмида pSF28; дорожка 2 — ДНК-маркер MassRuler Mix фирмы Fermentas; дорожка 3 -плазмида pSF28, обработанная рестриктазой Pstl по двум сайтам клонирования; дорожка 4 - плазмида pSF28, обработанная рестриктазой BamHI по уникальному сайту клонирования.

Штамм YM954 (фенотип Leu"Ade") трансформировали плазмидами pTLl и pSF28 и отбирали трансформанты на среде без лейцина. Суспензии трансформантов в исходной концентрации примерно 1x104 клеток/мл и в 10-кратном разведении (1х103 клеток/мл) высевали на твёрдые минеральные среды без аденина и лейцина и с разными источниками азота: глутамином, сульфатом аммония, глутаматом, пролином и мочевиной, - для качественной оценки уровня экспрессии репортерного гена ADE2 под контролем промотора гена РНОЗ на среде без аденина. В качестве контроля использовали исходный штамм YM954, который высевали на среды с добавлением аденина и лейцина. Оказалось (Рис. 4), что рост всех типов трансформантов замедляется на среде с мочевиной, в то время как рост дрожжей на средах с хорошими источниками азота (глутамин, аммоний), а также с глутаматом, не отличался от роста штамма YM954. При росте на среде с пролином (Рис. 4), плохим источником азота,

трансформанты, содержащие мультикопийную плазмиду, и трансформанты, содержащие центромерную плазмиду, демонстрировали нормальный рост, сравнимый с исходным штаммом YM954. Однако колонии трансформантов с центромерной плазмидой pSF28 были окрашены в розовый цвет вследствие накопления аминоимидазолрибозида. По-видимому, рост дрожжей на среде с пролином и без аденина может обеспечиваться небольшим количеством фермента АИР-карбоксилазы, продукта гена ADE2. Таким образом, на среде с пролином мы видим зависимость i активности АИР-карбоксилазы от дозы гена. Трансформанты с плазмидой pTLl не окрашены вследствие большого числа копий гена ADE2 в клетке. К сожалению, нам не удалось обнаружить существенную разницу в росте трансформантов на всех типах сред. По-видимому, для роста дрожжей достаточно минимального уровня экспрессии гена ADE2. Однако ослабленный рост на среде с мочевиной в качестве единственного источника азота предоставляет возможность использовать эту среду для поиска I регуляторных мутантов.

Таким образом, видно, что экспрессия гена РНОЗ зависит от типа источника азота. При этом ген РНОЗ не подвержен азотной катаболитной репрессии. В последнем случае на бедных источниках азота происходит активация соответствующих генов (Magasanik & Kaiser, 2002). Для гена РНОЗ показана специфическая регуляция: усиление экспрессии на среде с глутаматом и снижение уровня транскрипции на середе с пролином и мочевиной.

Источники азота в среде

Глутамин Сульфат Глутамат Пролин Мочевина

аммония

YM954 | [pTLl]

■ YM954

[pSF28]

YM954

Рис. 4. Влияние различных источников азота на рост штамма YM954 S. cerevisiae, трансформированного плазмидами pTLl и pSF28. Суспензии клеток, трансформированных плазмидой pTLl [PH03p-ADE2 2ц LEU2] или pSF28 [PH03p-ADE2 CEN LEU2], в концентрации 1x104 и 1х103 клеток/мл высевали на минеральную среду MD без аденина и лейцина с разными источниками азота (глутамином, сульфатом аммония, глутаматом, пролином, мочевиной) в концентрации 0,46% и инкубировали при температуре 30°С в течение 5 дней. В качестве контроля использовали исходный штамм YM954.

3. Получение и анализ мутантов Ure+ у трансформантов УМ954ГрТ1Л1 и fpSF281. Мутантов, растущих на среде с мочевиной (фенотип Ure^, индуцировали при помощи УФ. Отбор мутантов проводили на среде без аденина и лейцина с мочевиной в качестве источника азота. В результате трех экспериментов были отобраны пять мутантов Ure+: четыре (1, 4, 5, 6-YM954) - у трансформанта YM954[pTLl] и один (7-YM954) - у YM954[pSF28]. Для изучения собственного фенотипического проявления мутаций, восстанавливающих рост трансформантов на среде с мочевиной, мутанты : культивировали в полной среде, затем рассевали на чашки и отбирали клоны Leu",

потерявшие плазмиды с геном ADE2 под контролем промотора гена РНОЗ. Анализ роста таких клонов показал, что все мутанты не растут как на средах с мочевиной, так и с глутаматом в качестве источника азота (Glu"). При этом рост мутантов на средах с глутамином и сульфатом аммония не отличается от роста исходного штамма YM954 (Рис. 5). Полученные мутации мы условно обозначили gubl,4,5,6,7 (glutamate utilization blockage), соответственно отобранным мутантам. Фенотип мутантов Glu'Ure" свидетельствует о нарушении регуляции генов метаболизма азота.

Для выяснения доминантности или рецессивности мутаций штаммы 1, 4, 5, 6, 7-YM954 скрестили со штаммом 57-D579 (Glu+) (Табл. 1) и анализировали рост диплоидов на среде с глутаматом. Диплоиды росли, что свидетельствует о рецессивности мутаций gubl,4,5,6,7.

Для выяснения моногенности наследования признака Glu проводили тетрадный анализ гибрида D580 (5-YM954 х 57-D579). Были проанализированы 19 тетрад гибрида D580, из которых 10 оказались полными. Расщепление в тетрадах по признаку Glu"/Glu+ соответствовало 2:2. Следовательно, мутация gub5 наследуется моногенно. В связи с тем, что гибриды с мутантными штаммами 1, 4, 6, 7-YM954 демонстрировали низкий уровень споруляции, их анализ не проводили.

Сегрегант 9Г-0580 (МАТа ade2-101 ura3-52 his3-200 lys2-801 trp 1-901 arg6 gub5), характеризующийся фенотипом Glu", использовали для проведения теста на аллелизм с мутациями gubl,4,6,7. В результате мутанты распределились на две группы комплементации. В первую группу, обозначенную gubl, попали мутанты 1, 4, 5, 6-YM954; а во вторую группу - только мутант 7-YM954. Эту группу обозначили gub7.

Рис. 5. Влияние различных источников азота на рост мутантов 1, 4, 5, 6, 7-УМ954. Суспензии клеток мутантных штаммов 1, 4, 5, 6, 7-УМ954 в концентрации 1x104 клеток/мл высевали на минеральную среду с разными источниками азота (глутамином, сульфатом аммония, глутаматом, мочевиной) в концентрации 0,46% и инкубировали при температуре 30°С в течение 5 дней. В качестве контроля использовали исходный штамм УМ954.

Поскольку при нарушении метаболизма азота могут происходить остановка клеточного цикла на стадии Оь блок трансляции, ошибочная сборка цитоскелета, деградация белков и автофагия (НагсЬлчск й а1., 1999; Сох е1 а1., 2004), мы проанализировали морфологию клеток у мутантных штаммов 5, 7-УМ954 по сравнению с исходным штаммом УМ954 (Рис. 6). Микроскопический анализ выявил нехарактерные для дрожжей-сахаромицетов формы клеток, выпячивания и удлинения (Рис. 6-Б, В). Вероятно, появление данных структур связано с нарушениями при сборке цитоскелета и, следовательно, процессов почкования. Результаты анализа согласуются с

Источники азота в среде

сульфат

аммония

глутамат мочевина

1-YM954

(диЫ)

4-YM954 (циЫ)

5-YM954 (9«Ь5)

6-YM954 (диЬб)

7-YM954 (диЬТ)

нашим предположением о том, что мутации gubl и gub7 могут затрагивать ключевые

гены метаболизма азота, А Б

YM954

Г ' * ,

5-YM954

7-YM954

' КЗ

Рис. 6. Морфология клеток исходного штамма УМ954

(A) и мутантных штаммов 5-УМ954 (Б) и 7-УМ954

(B). У клеток мутантных штаммов заметны нарушения в морфологии (отмечены стрелками).

Таким образом, с использованием промотора гена РНОЗ в качестве мишени и гена ADE2 в качестве репортерного гена нам удалось получить мутации в генах, которые, по-видимому, участвуют как в регуляции генов метаболизма азота, так и в регуляции гена РНОЗ на средах с мочевиной и глутаматом. Мутации рецессивны и имеют собственное фенотипическое проявление - неспособны расти на среде с глутаматом и мочевиной в качестве источника азота.

4. Анализ последовательности промотора гена РНОЗ. Регуляция генов метаболизма азота у дрожжей S. cerevisiae осуществляется в результате совместной работы четырех транскрипционных факторов GATA-семейства: активаторов Gln3p и Gatlp, репрессоров Dal80p и Gzf3p, которые специфически распознают последовательности GATA в промоторах генов-мишеней. Эти факторы связаны сложной системой взаимоконтроля и авторегуляции. Активность этих белков напрямую зависит от типа источника азота в ■ среде и от внутриклеточной концентрации глутамина, необходимого метаболита для 1 запуска азотной катаболитной репрессии. Когда клеткам доступны хорошие источники азота, GATA-регуляторы не активны, и NCR-чувствительные гены выключены или экспрессируются на базальном уровне. После истощения запасов репрессирующих источников азота NCR снимается, и транскрипция генов азотного метаболизма активируется факторами Gln3p или Gatlp, или обоими факторами. Как показали наши исследования, экспрессия гена РНОЗ подвержена азотной регуляции и возрастает при росте дрожжей на среде с глутаматом в качестве источника азота. В связи с этим мы стали изучать возможность регуляции гена РНОЗ транскрипционными факторами GATA-семейства. Известно, что активатор Gln3p распознаёт сайты GAT(A/T)A(G), которые могут располагаться в обеих цепях ДНК и в разной ориентации (Coffman et al., 1995; Cooper et al., 1990; Scherens et al., 2006; Stanbrough et al., 1995), a также сайты GAT(A/T)(G/A). Кроме того, известны вспомогательные сайты активации TTG(G/T)T. Активатор Gatlp связывается с сайтами (A)GATAA(G), CTTATCG. Репрессор DaI80p -с (T/C)GATAA(G). Репрессор GzDp распознает последовательности C(T/C)GATAAG, GATAAG, (A/T)GATAA(G/C).

Мы проанализировали последовательность промотора гена РНОЗ от -370 до -17 нуклеотида, использованную при конструировании плазмид pTLl и pSF28 (Останин и др., 1988; Савинов и др., 2011). Анализ последовательности выявил сайты в обеих цепях ДНК и в обеих ориентациях, с которыми, предположительно, могли бы связываться GATA-факторы: 2 сайта GATAA, 3 сайта GATTA, 1 сайт GATTG (Рис. 7). Таким образом, в промоторе гена РНОЗ содержатся последовательности, с которыми

теоретически возможно связывание GATA-факторов транскрипции дрожжей S.

cerevisiae, а сам ген РНОЗ может быть мишенью для регуляторов азотного метаболизма. -370

5' tctgcagagatatccgaaacaggtaaatggatgitteaatccctgtagtcaglcaggaacccatauatat 3' agacgtctctataggclttgtccatttacelacaaagttagggacatcagtcagtecttgggtataatataa

tacagtatlagicgccgcttaggcacgcciltaattagcaaaalcaaaccttaagtgcatatgccgtalaa atgtcataatcagcggcgaatccgtgcggaaaitaatcgttitagtttggaattcacgtatacggcatatt

gggaaactcaaagaactggeatcgcaaaaatgaaaaaaaggaagaglgaaaaaaaaaaaatteaaaagaaa cccmgagtttcttgaccgtagegUtttacittttitccttctcacttmttttmaagtlttctti

tttactaaataataccagtttgggaaataglaaacagctttgagtagtectatgcaacatatataagtgct aaatgatttatiatggtcaaaccctttateatttgtegaaactcatcaggataegttgtatatattcacga

iaaatttgetggatggaagtcaattaigccttgattateataaaaaaaatactacagtaaagaaaggg afttaaacgacclaccttcagttaatacggaactaatagtatutttttatgatgtcatttctttccc

___Л_

Рис. 7. GATA-сайты в нуклеотидной последовательности промоторной области гена РНОЗ (от -370 до -17). Полужирным шрифтом выделены последовательности GATAA, GATTA и GATTG, с которыми, предположительно, способны связываться транскрипционные факторы азотной регуляции, в кодирующей и матричной цепях ДНК в прямой и обратной ориентации.

5. Поиск генов, компенсирующих эффект мутаций znbl и gub7. На первом этапе поиска генов, соответствующих группам комплементации gubl и gub7, проверили, могли ли мутации затронуть гены GLN3, GAT1, DAL80 или GZF3, кодирующие структуру транскрипционных факторов азотной регуляции. Для этого трансформировали штаммы 5-YM954 и 7-YM954 плазмидами №№ 414, 470, 783, 924 из библиотеки генов «Yeast Genomic Tiling Collection» дрожжей S. cerevisiae, содержащими фрагменты генома с каждым из вышеперечисленных генов. | Трансформанты отбирали на селективных средах и анализировали восстановление фенотипа Glu+ на минеральной среде с глутаматом в качестве единственного источника азота. Было показано, что восстановление роста в этих условиях происходит только у трансформанта 7-YM954 с плазмидой № 783, содержащей ген GZF3. Возможно, это является следствием увеличения количества белка-репрессора из-за мультикопийности вектора pGP564. Известно, что фактор Gzßp обладает наибольшей активностью при росте дрожжей в среде с глутаматом, когда подавлен главный конкурент, активатор Gatlp (Deed et al., 2011).

Кроме гена GZF3, в плазмиде № 783 расположены гены MDV1 и ССТ7. Первый кодирует белок внешней мембраны митохондрий, необходимый для их деления. Второй - субъединицу комплекса шаперонинов, необходимую для сборки актина и тубулина. Эти белки не являются факторами транскрипции и не связаны с регуляцией азотного метаболизма (Saccharomyces Genome Database, URL: http://www.yeastgenome.org). Таким образом, мутация gub7, приводящая к дерепрессии промотора гена РНОЗ у трансформантов при росте на среде с мочевиной в качестве единственного источника азота и к отсутствию роста дрожжей на среде с глутаматом, по всей видимости, возникла в гене GZF3, кодирующем белок-репрессор из семейства GATA-факторов. Для доказательства этого предположения ген GZF3 был клонирован в вектор pRS316, была создана плазмида pGZF316 [GZF3 CEN URA3], которой была проведена трансформация мутанта 7-УМ954 и для сравнения мутанта 5-YM954. Схема конструирования плазмиды

рС7РЗ 16 представлена на рисунке 8-А. На рисунке 8-Б представлена электрофореграмма плазмиды pGZFЗ16 после обработки эндонуклеазами рестрикции.

Рис. 8-Б. Электрофореграмма разделения продуктов гидролиза плазмиды pGZF316: дорожка 1 — ДНК-маркер MassRuler High Range фирмы Fermentas; дорожка 2 -плазмида pGZF316 после обработки эндонуклеазой BamHI (фрагменты 4887 + 2390 п.о.); дорожка 3 — плазмида pGZF316 после обработки эндонуклеазой Sali по уникальному сайту (фрагмент 7275 п.о.); дорожка 4 -нативная плазмида pGZF316.

Рис. 8-А. Схема конструирования плазмиды рСгР316 [вгРЗ СШ иЯЛЗ]. Геномная копия гена аРЗ размером 2390 п.о. была получена методом ПЦР по матрице хромосомной ДНК штамма УМ954 дрожжей 5. сегеугя'ое с использованием праймеров,

содержащих на 5'-концах сайты клонирования ВатШ (Табл. 2). Обработанная эндонуклеазой

рестрикции ВатШ копия гена GZFЗ была встроена в вектор рКЭЗ 16 по сайту ВатШ.

GZF3

2390 п.о. 1856 по

BamHI

\ GZF3I

V !

(2030) *

Трансформанты 7-yM954[pGZF316] и 5-YM954[pGZF316] отбирали на среде без урацила с сульфатом аммония в качестве источника азота и отпечатывали для проверки восстановления фенотипа Glu+ на среду с глутаматом и для сравнения на среду с сульфатом аммония. Было показано, что присутствие в клетках штамма 7-УМ954 плазмиды pGZF316 с дополнительной копией гена GZF3 приводит к восстановлению способности роста на среде с глутаматом у штамма с мутацией gub7 (Рис. 9), тогда как у трансформанта 5-YM954[pGZF316] рост на среде с глутаматом не восстанавливается.

Поскольку среди мутантов 7-YM954 (Glu") мы наблюдали частое появление ревертантов Glu+, для того, чтобы убедиться, что восстановление роста трансформантов 7-YM954[pGZF316] на среде с глутаматом обусловлено введением плазмиды с копией гена GZF3, а не реверсией мутации gub7, отобранные трансформанты Ura+Glu+ были проверены с помощью метода изгнания плазмиды из клеток. После культивирования в полной среде и проверки фенотипа трансформантов на селективных средах проводили учёт появления фенотипов Ura+Glu+, Ura Glu", Ura+Glu" и Ura"Glu+. Было показано, что

способности синтезировать урацил и усваивать глутамат в качестве источника азота теряются у трансформантов 7-УМ954[р07РЗ 16] совместно. Следовательно, появление у трансформантов признака в1и+ обеспечено только наличием в клетках плазмиды с дополнительной копией гена арЗ.

YM954

7-YM954

5-YM954[pGZF316] Сgubl)

7-YM954[pGZF316] (gub7)

Источники азота в среде

Сульфат аммония

Глутамат

Рис. 9. Рост трансформантов 5-УМ954 [рС2Р316] и 7-УМ954[рОгР316] на средах с разными источниками азота. Суспензии клеток штаммов 5-УМ954 и 7-УМ954, трансформированных

плазмидой р07Р316, в концентрации 1x104 клеток/мл высевали на минеральную среду без урацила с сульфатом аммония или глутаматом в качестве источника азота в концентрации 0,46% и инкубировали при температуре 30°С в течение 5 дней. В качестве контроля использовали исходные штаммы УМ954 и 7-УМ954.

Таким образом, мутация gub7, приводящая к дерепрессии промотора гена РНОЗ у трансформантов при росте на среде с мочевиной в качестве единственного источника азота и к отсутствию роста дрожжей на среде с глутаматом, вероятнее всего, затрагивает ген GZF3 белка-репрессора из семейства GATA-факторов. Для подтверждения этой гипотезы необходимо определить нуклеотидную последовательность хромосомной копии гена GZF3 у мутантного штамма 7-YM954.

6. Идентификация гена, компенсирующего эффект мутации gubl. Мутанты группы gubl не растут на среде с глутаматом, это нарушение роста не компенсируется введением в клетки дополнительных копий генов транскрипционных факторов азотного метаболизма. Для локализации мутации gubl в геноме дрожжей был использован метод гаплоидизации. Штамм YM954 несет ряд мутаций, которые являются удобными селективными маркерами разных хромосом. Мутации ade2 и his3 расположены в хромосоме XV, игаЗ - в хромосоме V, 1еи2 — в хромосоме III, lys2 - в хромосоме II, trpl - в хромосоме IV. Для выяснения возможной локализации мутации gubl в данных хромосомах провели скрещивание мутантов 1,4, 5, 6-YM954 (Glu") со штаммом 203-D579 (Glu+). Генотип штамма представлен в таблице 1. У диплоидов, гетерозиготных по мутации gubl и мутациям ade2, игаЗ, his3, Ieu2, lys2, trpl, индуцировали гаплоидизацию с помощью беномила, и высевали их на селективные среды, чтобы отобрать ауксотрофные клоны, потерявшие какую-либо одну хромосому или весь гаплоидный набор хромосом. Анеуплоидные колонии отпечатывали на среду с глутаматом в качестве источника азота и анализировали частоту появления у анеуплоидов признака Glu" на фоне ауксотрофностей. Колонии отбирали также на среде с фтороротовой кислотой (Ura~), а также по красному цвету колоний (Ade").

Высокая частота совместного появления клонов Ura'Glu" (0,904±0,067; р = 0,95;/= 3; ts, - 3,182) свидетельствует о том, что мутация gubl локализована в хромосоме V (Рис. 10). Напротив, частота появления клонов Ade'Glu" ничтожно мала: из 124

отобранных клонов Ade" ни один не оказался Glu", что указывает на отсутствие сцепления gubl и маркера ADE2 (в хромосоме XV).

Для идентификации мутации gubl штамм 5-YM954 трансформировали плазмидами генной библиотеки «Yeast Genomic Tiling Collection», покрывающими всю последовательность хромосомы V дрожжей S1, cerevisiae. Были использованы 59 плазмид библиотеки: №№ 385, 387-391, 393-398, 401-412, 415, 418-420, 422-438, 440446, 449, 452-457. Трансформанты отбирали на селективной среде без лейцина и анализировали восстановление фенотипа Glu+ на минеральной среде с глутаматом в качестве единственного источника азота. Было показано, что восстановление роста на среде с глутаматом у штамма 5-YM954 происходило при трансформации плазмидой № 434. Эта плазмида содержит фрагмент хромосомы V с генами: YCK3, DSE1, RSP5, NSA2, LCP5, YER128W, РАК1.

Glu-

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

В1 ade-

94,7

И YM954 ura-

92,5

□ 1 ura-

89,5

0 4 ura-

Рис. 10.

Гистограмма частот совместного появления фенотипов Ura" Glu" и Ade Glu" после индукции гаплоидизации у диплоидов 1, 4, 5, 6-YM954 х 203-D579.

Ген YCK3 кодирует мембранную протеинкиназу, участвующую в регуляции слияния вакуолей. Ген DSE1 кодирует белок, специфичный для дочерних клеток, делеция которого приводит к нарушениям цитокинеза после деления. Ген NSA2 кодирует белок, участвующий в созревании молекул 27S пре-рРНК. Ген LCP5 кодирует белок, необходимый для созревания 18S рРНК. Рамка считывания YER128 W кодирует белок неизвестной функции. Ген РАК1, представленный на плазмиде без З'-области, кодирует серин-треониновую протеинкиназу, участвующую в регуляции метаболизма углерода. (Saccharomyces Genome Database, URL: http://www.yeastgenome.org).

Ген RSP5 кодирует убиквитин-лигазу ЕЗ, участвующую в большом количестве внутриклеточных процессов: от модификации гистонов до убиквитин-опосредованного эндоцитоза и деградации белков. В этом ряду генов RSP5 представляет для нас особый интерес, поскольку известно, что фактор Rsp5p вовлечен в передачу сигнала о типе источника азота транскрипционному GATA-фактору Gln3p (Tate et al., 2006). Rsp5p регулирует уровень мембранных пермеаз аммония и аминокислот в зависимости от типа источника азота в среде. Лишние белки убиквитинируются и удаляются из мембраны эндоцитозом. Известно, что убиквитин-лигазный комплекс Rsp5/Bull/Bul2 участвует в активации белка Gln3p при его ядерной локализации (Crespo et al.,2004).

Кроме того, мутации в гене ЯЗР5 приводят к нарушению морфологии клеток дрожжей (Нагё-тск й а1., 1999; Сох с! а1., 2004). Поэтому из всех перечисленных генов плазмиды № 434 наиболее вероятным местом локализации мутации gubl является ген Я8Р5, кодирующий убиквитин-лигазу дрожжей 5. cere.vi.siae. Для доказательства этой гипотезы мы клонировали ген-кандидат ЯЗР5 в центромерный вектор рЯБЗ 16 и создали новую плазмиду рК8Р321 [Я$Р5 СЕМ СКАЗ]. Схема конструирования плазмиды р]18Р321 представлена на рисунке 11-А. На рисунке 11-Б представлена электрофореграмма плазмиды после обработки эндонуклеазами рестрикции.

Рис. 11-А. Схема конструирования плазмиды р1«Р321 [ДХР5 СЕК [/&43]. Геномная копия гена размером 3113 п.о. была получена методом ПЦР по матрице хромосомной ДНК штамма УМ954 дрожжей X. сегеумше сетадше с использованием праймеров,

содержащих сайты клонирования ХЬа1 и ЕсоШ на 5'-концах прямого и обратного праймеров соответственно (Табл. 2). Обработанная

эндонуклеазами рестрикции ХЬа1 и ЕсоЮ копия гена Д5Р5 была встроена в вектор рЯ8316 по сайтам ХЬа! и ЕсоШ.

Плазмидой рЯ8Р321 трансформировали штамм 5-УМ954 с мутацией gubl. Трансформанты 5-УМ954[р!18Р321] отбирали на среде без урацила с сульфатом аммония в качестве источника азота и отпечатывали для проверки восстановления фенотипа 01и+ на среду с глутаматом. Одновременно высевали на твёрдую минеральную среду без урацила с глутаматом суспензии трансформантов в исходной концентрации примерно 1х104 клеток/мл и в 10-кратном разведении (1х103 клеток/мл). Было показано, что присутствие в клетках штамма 5-УМ954 плазмиды рЯ8Р321 с дополнительной копией гена Я8Р5 приводит к восстановлению способности роста на середе с глутаматом у штамма с мутацией guЫ (Рис. 12). Таким образом, мы подтвердили, что ген Я8Р5 компенсирует мутацию guЫ и, возможно, мутация затрагивает последовательность гена Н8Р5 убиквитин-лигазы ЕЗ дрожжей-сахаромицетов.

ЕсоЫ 3113 п.о. ХЬаI

| | 2429 п.о.

Г 7

л,у , р!ЧЗР321 7970 п.о.

1 2 3

Среда MD с глутаматом

Штаммы YM954 (Glu+)

5-YM954 (Glu)

5-YM954[pRSP321 ] (Glu+)

Рис. 11-Б. Электрофореграмма: дорожка 1 - вектор pRS316 после обработки эндонуклеазой

рестрикции Xbal; дорожка 2 -плазмида pRSP321 после обработки эндонуклеазами Xbal и EcoRI (фрагменты 4857 + 3113 п.о.); дорожка 3 - ДНК-маркер MassRuler High Range фирмы Fermentas.

Рис. 12. Рост штаммов 5-УМ954 и 5-УМ954ДОБР321] на среде с глутаматом. Штаммы дрожжей переносили на минеральную среду с глутаматом в качестве источника азота в концентрации 0,46% методом отпечатывай™ и в виде суспензии клеток (объем — 5 мкл, концентрации — 1х104 клеток/мл, 1х103 клеток/мл) и инкубировали при температуре 30°С в течение 5 дней. В качестве контроля использовали исходный штамм УМ954.

7. Определение нуклеотидной последовательности гена RSP5 у мутантных штаммов 1. 4. 5, 6-YM954. Для картирования мутаций внутри гена RSP5 проводили секвенирование кодирующей области хромосомной копии гена RSP5 у мутанта 5-YM954 и исходного штамма YM954. Кодирующая область гена RSP5 имеет размер 2426 п.о., синтезируемый полипептид - 809 ак. Белок убиквитин-лигазы Rsp5p содержит 3 функциональные области (Табл. 5): (1) N-концевой домен С2, отвечающий за взаимодействие с мембраной; (2) три домена WW1-3, содержащие по два консервативных триптофановых остатка, разделенных друг от друга 20-22 ак, и отвечающие за белок-белковое взаимодействие с белками-мишенями для убиквитинирования; (3) С-концевой катализирующий домен НЕСТ, характерный для данного семейства убиквитин-лигаз ЕЗ, осуществляющих убиквитинирование по лизиновым остаткам (Horak, 2003).

В результате анализа нуклеотидной последовательности гена RSP5 обнаружили, что штамм 5-YM954 содержит точковые мутации в гене RSP5: замены нуклеотидов дезоксицитидина на дезоксигуанозин (C-^G) в положении +680 и дезоксигуанозина на дезокситимидин (G~>T) в положении +1552. Это приводит к замене аминокислотных остатков при трансляции: в первом случае вместо глутамина включается аргинин, во втором случае - вместо лейцина подставлятся фенилаланин. Мутация в положении +680 расположена между доменами С2 и WW1 и, возможно, не оказывает сильного влияния на активность убикивитин-лигазы. Замена нуклеотида в положении +1552 затрагивает важный каталитический домен НЕСТ и, вероятно, может влиять на активность фермента.

8. Выделение плазмид, содержащих фрагменты ДНК, компенсирующих эффект мутации subi, из генных библиотек дрожжей. Для того чтобы выяснить природу мутации gubl и определить участок генома дрожжей, который может

комплементировать мутацию, одновременно с генной библиотекой «Yeast Genomic Tiling Collection», покрывающей последовательность хромосомы V дрожжей, мы использовали генные библиотеки на основе мультикопийного вектора pFL44L, содержащего маркерный ген URA3, и центромерного вектора pRS207, содержащего ген TRP1. Ими трансформировали штамм 5-YM954 с мутацией gubl (rspS).

После анализа 5742 трансформантов с мультикопийными плазмидами и 8140 трансформантов с центромерными плазмидами были отобраны по одному трансформанту из каждой библиотеки, №1 и №2 с фенотипами Ura+Glu+ и Trp+Glu+ соответственно, которые несли в клетках плазмиды с фрагментами хромосомной ДНК, комплементирующей эффект мутации gubl. С целью проверки того, что признак Glu+ появился за счет плазмиды, а не реверсии, отобранные трансформанты №№ 1 и 2 анализировали на предмет совместной потери признака Glu+ и признаков Тгр+ и Glu+ соответственно. Для этого культивировали трансформанты в полной среде до потери плазмиды и, следовательно, признака Тгр+ или Glu+. Было показано, что способности синтезировать урацил или триптофан и усваивать глутамат в качестве источника азота теряются у трансформантов совместно. Следовательно, появление у трансформантов признака Glu+ обеспечено только наличием в клетках плазмид.

Выделенные из трансформантов №№ 1 и 2 плазмиды использовали для амплификации содержащихся в них геномных последовательностей с помощью стандартных праймеров M13-pUC-F и M13-pUC-R (Табл. 2). Были определены нуклеотидные последовательности участков плазмид, обеспечивающих восстановление роста у мутантов на среде с глутаматом в качестве источника азота. Оказалось, что плазмиды из мультикопийной и центромерной библиотеки содержат небольшие перекрывающиеся фрагменты ДНК длиной 680 п.о. и 668 п.о. соответственно, идентичные на 95-96 % внутренней области гена PHOS с +606 до +1152 и встроенные в вектор в обратной ориентации.

Поскольку известно, что короткие некодирующие РНК, в том числе антисмысловые, могут участвовать в регуляции РНО-генов (Camblong et al., 2007; Uhler et al., 2007; Nishizawa et al., 2008), существует также возможность супрессии фрагментом антисмысловой РНК, синтезированной по матрице гена PHOS, мутации gubl, локализованной в гене RSP5, кодирующем структуру убиквитин-лигазы. Некодирующая РНК может компенсировать эффект мутации опосредованно влияя на способность к росту на среде с глутаматом и мочевиной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Дрожжи S. cerevisiae являются удобным модельным объектом для изучения наследственности, изменчивости и, следовательно, эволюционных процессов. Этому способствуют короткий клеточный цикл, способность использовать широкий спектр химических соединений в среде для роста и развития, а также простота изучения генома. Накопленные знания свидетельствуют о том, что на молекулярном уровне эволюция происходит за счет фенотипического многообразия, обеспечиваемого в первую очередь изменениями механизмов генной регуляции, а не изменением функций отдельных генов и их продуктов. Исследования генома дрожжей показывают, что регуляторные связи быстро эволюционируют за счет взаимодействия консервативных транскрипционных факторов с различными группами генов и за счет накопления

изменений одновременно в регуляторных последовательностях генов и связвающих доменах регуляторов (Hahn & Young, 2011).

Гены PHOS и PHOS изозимов КФ являются частным примером эволюции за счет изменения механизма регуляции. Эти гены произошли в результате дупликации общего предкового гена, тесно сцеплены в хромосоме II, обладают высокой степенью сходства на нуклеотидном (82%) и аминокислотном (87%) уровне. В сторону фланкирующих некодирующих последовательностей эта степень уменьшается до 65%. И совсем низкая степень сходства наблюдается в области промоторов этих генов (Bajwa et al., 1984). Модификация и дивергенция промоторных участков дуплицированных генов КФ привели к возникновению разных систем регуляции экспрессии близкородственных генов. Ген репрессибельной КФ PHOS регулируется количеством фосфата в среде (Johnston & Carlson, 1992). Экспрессия гена конститутивной КФ РНОЗ не зависит от фосфата, однако репрессируется тиамином (Singleton, 1997). Уровень экспрессии генов РНОЗ и РН05 также снижается при азотном голодании (Hardwick et al., 1999; Gasch et al., 2000; Bradley et al., 2009).

В результате проделанной работы с использованием селективного маркера для изучения регуляции гена РНОЗ нам удалось обнаружить общие элементы в регуляции генов метаболизма азота и фосфора. Были выявлены гены, продукты которых действуют на транскрипционном и посттранскрипционном уровне. Это ген, кодирующий структуру регулятора азотного метаболизма Gzf3p, который подавляет экспрессию гена РНОЗ при росте дрожжей в среде с мочевиной. Кроме того, были обнаружены мутанты по гену RSP5, кодирующему структуру убиквитин-лигазы. Эта группа мутантов выявила роль эпигенетического контроля в регуляции гена РНОЗ в зависимости от источника азота. Тот факт, что мутации в генах GZF3 и RSPS приводят не только к усилению экспрессии РНОЗ, но и одновременно ведут к отсутствию роста на глутамате, свидетельствует о том, что мы выявили общие регуляторные белки и для генов РНО, и для генов, отвечающих за утилизацию глутамата. На основании наших данных могут быть предложены несколько моделей регуляции гена РНОЗ в зависимости от источника азота в среде. На среде с мочевиной и глюкозой фактор GzDp связывается с промоторной областью гена РНОЗ и блокирует его транскрипцию, координируя уровень экспрессии этого гена с потребностями клетки. Таким образом, не только фактор Gln3p (Staschke et al., 2010), но и фактор GzDp участвует в репрессии гена РНОЗ. Особенно интересно, что для генов азотного метаболизма фактор Gln3p -это активатор транскрипции, тогда как фактор Gzf3p - репрессор, а для гена РНОЗ оба фактора выступают в роли репрессоров. По всей видимости, убиквитин-лигаза Rsp5p способна регулировать активность белка Gzßp, поскольку в настоящее время показано, что Gzf3p имеет сайты убиквитинирования (Peng et al., 2003), а между генами GZF3 и RSPS установлена регуляторная связь (Costanzo et al., 2010). Транкрипционный фактор Gzßp, в свою очередь, может воздействовать на промотор гена РНОЗ напрямую или, как минимум, опосредованно через изменение количества тиаминпирофосфата в клетке.

THI4. Ген THI4 и другие THl-гвны полностью репрессируются с увеличением концентрации тиамина в среде, но в среде без тиамина уровень их экспрессии очень высок. В клетках тиамин становится функционально активным после фосфорилирования до тиаминпирофосфата и тиаминтрифосфата, которые являются кофакторами ферментов, например а-кетоглутаратдегидрогеназы, транскетолазы и других, участвующих в метаболизме аминокислот и углеводов (Singleton, 1997; Li et al., 2010). Фермент а-кетоглутаратдегидрогеназа при участии тиамина обеспечивает декарбоксилирование а-кетоглутарата, участника цикла трикарбоновых кислот, и образование глутамата, который является важным элементом метаболизма азота. С другой стороны, метаболизм тиамина тесно связан с обменом НАД+ и НАМ. Кроме того, НАД+ является кофактором дегидрогеназ, например Gdh2p, контролирующей образование а-кетоглутарата из глутамата (Magasanik & Kaiser, 2002; Li et al., 2010). Перенос фосфатных групп на тиамин катализирует тиаминпирофосфокиназа, продукт гена THI80. Экспрессия THI80 регулируется внутриклеточным количеством тиаминпирофосфата по механизму обратной связи и также требует позитивных регуляторов, продуктов генов THI2 и THI3. Экспрессия THI80 существенна для роста клеток, а тиаминпирофосфокиназа является единственным ферментом у дрожжей, способным синтезировать тиаминпирофосфаты (Nosaka, 1990). В отличие от кКФ, тиаминпирофосфокиназа постоянно синтезируется хотя бы в малом количестве и её ген THI80 не репрессируется полностью при добавлении тиамина в среду (Nosaka et al., 1993). Добавление тиамина подавляет активность кКФ РЬоЗр и ферментов биосинтеза тиамина. Этот эффект обусловлен фактором негативной регуляции, продуктом гена THI81 (Nishimura et al., 1997).

Было показано, что фактор Gzf3p может связываться с промотором гена THI80 тиаминпирофосфокиназы, обеспечивающей активацию тиамина в клетке (Chua et al., 2006). В промоторе гена THI80 обнаружена последовательность GATAAG. Другой возможной мишенью фактора GzDp является тиазол-синтаза, кодируемая геном THI4, необходимая для биосинтеза тиамина. В промоторе этого гена в комплементарной цепи выявлены два сайта GATAAG (http://www.yeastract.com/). Таким образом, ген РНОЗ, как и гены THI80 и THI4, регулируются фактором Gzftp.

Кроме этого, мутации rsp5 могут приводить к нарушению транспорта аминокислот в клетку и влиять на активность фактора Gln3p (Tate et al., 2006) и, следовательно, Gzf3p. Убиквитин-лигаза Rsp5p также участвует в убиквитинировании РНК-полимеразы II и, таким образом, может опосредованно влиять на уровень базальной транскрипции гена РНОЗ (Harreman et al., 2009).

Таким образом, мы показали, что экспрессия гена РНОЗ зависит от качества источника азота, и выявили участников регуляторнош каскада, координирующих метаболизм азота и фосфата у дрожжей S. cerevisiae.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена зависимость экспрессии гена РНОЗ, кодирующего конститутивную кислую фосфатазу дрожжей Saccharomyces cerevisiae, от источника азота. Уровень экспрессии гена РНОЗ увеличивается на среде с глутаматом и снижается на среде с пролином.

2. Использование селективной системы гена ADE2 под контролем промотора гена РНОЗ позволило обнаружить регуляторные мутации, влияющие на экспрессию гена РНОЗ при росте дрожжей на среде с мочевиной. Мутации распределены по двум группам комплементации.

3. Генетический анализ мутантов 1,4,5,6-YM954 и секвенирование показали, что мутации gub/,4,5,6 картируются в хромосоме V дрожжей и произошли в гене RSP5, кодирующем структуру убиквитин-лигазы.

4. Генетический анализ мутанта 7-YM954 показал, что мутация gub7 соответствует гену GZF3, кодирующему структуру белка-репрессора азотного метаболизма.

5. Выявлены общие механизмы регуляции метаболизма азота и фосфора на транскрипционном и посттранскрипционном уровне.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Савинов В. А.. Природные и рекомбинантные фитазы микроорганизмов// Вестн. С.-Петерб. Ун-та. - 2007. - Сер.З, Вып.2. - С.66-75.

2. Савинов В.А.. Румянцев А.Р., Самбук Е.В., Падкина М.В. Создание тест-системы для изучения генетического контроля регуляции гена алкогольоксидазы 1 дрожжей Pichia pcistorisH Вестн. С.-Петерб. Ун-та. - 2009. - Сер.З, Вып.4. - С.114-119.

3. Савинов В.А.. Физикова А.Ю., Румянцев A.M., Самбук Е.В. Изучение механизмов регуляции гена РНОЗ в зависимости от источника азота в среде у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. II Экологическая генетика. 2011. Т. 9, № 4. С. 70-78.

4. Sambuk E.V., Fizikova A.Yu., Savinov V.A., Padkina M.V. Acid Phosphatases of Budding Yeast as a Model of Choice for Transcription Regulation Research// Enzyme Research. 2011. V. 2011. Article ID 356093. PP.16, doi: 10.4061/2011/356093.

Подписано в печать 30.10.2012г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,1. Тираж 100 экз. Заказ № 2858.

Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_Iema@niail.ru http://www.lemaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савинов, Владимир Александрович

Список использованных сокращений

Введение

1. Регуляция экспрессии генов у дрожжей БасскаготусеБ сегеу'1$'ше в ответ на изменение состава среды (Обзор литературы)

1.1. Регуляция транскрипции у дрожжей

1.1.1. Семейство транскрипционных факторов GATA

1.1.2. Регуляторные некодирующие РНК у дрожжей

1.2. Генетический контроль метаболизма азота и фосфора у дрожжей

1.2.1. Регуляция метаболизма азота у дрожжей

1.2.2. Регуляция метаболизма фосфора у дрожжей

1.2.3. Взаимодействия метаболических путей в клетке дрожжей

2. Материалы и методы

2.1. Основные обозначения

2.2. Штаммы дрожжей и бактерий

2.3. Плазмиды

2.4. Праймеры

2.5. Среды и условия культивирования штаммов

2.6. Методы

3. Результаты и обсуждение

3.1. Влияние источника азота на экспрессию гена PHOS и активность фермента КФ Pho3p

3.2. Разработка системы селективного отбора мутантов с нарушенной регуляцией гена PHOS

3.3. Получение и анализ мутантов Ure+ у трансформантов

YM954[pTLl] и [pSF28]

3.4. Анализ последовательности промотора гена PHOS

3.5. Поиск генов, компенсирующих эффект мутаций giibl и giib

3.6. Идентификация гена, компенсирующего эффект мутации

3.7. Определение нуклеотидной последовательности гена RSP5 у мутантного штамма 5-YM

3.8. Выделение плазмид, содержащих фрагменты ДЬЖ, компенсирующих эффект мутации gubl, из генных библиотек дрожжей

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование генетических механизмов корегуляции метаболизма азота и фосфора у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

Актуальность проблемы. Физиология микроорганизмов, от бактерий Escherichia coli до дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в значительной степени зависит от условий изменчивой окружающей среды. Адаптивный ответ клетки заключается в коррекции метаболических процессов, изменении скорости роста и деления, переходе к споруляции, мицелиальному росту и так далее. Дефицит в среде одного из макроэлементов, углерода, азота или фосфора, в короткий срок приводит к истощению его внутриклеточных резервов и одновременно меняет уровень экспрессии целых групп генов: некоторые активируются, другие репрессируются.

В бактериальных клетках координирование экспрессии генов достигается за счет оперонной организации генома: группа тесно сцепленных структурных генов, кодирующих ферменты и транспортные белки одного метаболического пути, находится под контролем общего промотора и оператора, с которым связывается фактор транскрипции, продукт регуляторного гена. Часто этот транскрипционный регулятор является одновременно внутриклеточным рецептором для молекул, которые синтезируются или расщепляются в ходе работы закодированных в данном опероне ферментов, как, например, в случае триптофанового и лактозного оперонов, соответственно (Jacob & Monod, 1961; Morse et al., 1969). Таким образом, в клетках бактерий сигнальный каскад, оповещающий о колебаниях состава среды, максимально компактизован и обеспечивает мгновенную передачу сигнала, изменение метаболизма и адаптивную реакцию клетки.

В эукариотических клетках и у дрожжей, в частности, опероны отсутствуют, сигнальные каскады многоэтапные, а регуляция экспрессии значительно усложнена. Тем не менее, на изменение состава среды клетки стремительно отвечают перестройкой метаболизма. Мишенями для сигнальных молекул являются как регуляторные белки, так и гены, кодирующие ключевые ферменты метаболизма. Определенный транскрипционный фактор способен влиять на уровень экспрессии целого ряда генов, кодирующих ферменты какого-либо метаболического пути, за счет наличия в их промоторах сходных последовательностей. Несмотря на физическую разобщенность таких генов, они регулируются координировано, аналогично бактериальному оперону, что позволяет говорить о наличии так называемых «регулонов» в геноме дрожжей. Другие регуляторные белки могут влиять на экспрессию генов, кодирующих третьи регуляторы, которые могут контролировать работу генов того же метаболизма или взаимодействовать с генами, обеспечивающими иные процессы в клетке. Известно, что у дрожжей более 30% генома составляют гены, промоторные области которых распознаются несколькими транскрипционными факторами, что это является характерной чертой эукариот (Lee et al., 2002). Некоторые гены располагают в промоторах сайтами связывания для активаторов или репрессоров разных метаболических путей и могут воспринимать сигналы об изменении качества и количества разных биогенных элементов. Кроме того, одни и те же регуляторные белки могут быть активаторами одних путей и репрессорами других (Попова и др., 2000; Pina et al., 2003). Таким образом, отдельный внешний стимул может усиливаться при передаче по внутриклеточным каскадам и вызывать глобальные изменения экспрессии всего генома. У дрожжей изучена экспрессия более 6000 генов в ответ на недостаток в среде отдельных биогенных элементов, таких как азот, углерод или фосфор. Предложены модели интегрального ответа клетки на дефицит того или иного компонента среды (Самбук, 2005; Bradley et al., 2009; Ogawa et al., 2000; Staschke et al., 2010).

Несмотря на широкое применение современных технологий, особенности регуляции отдельных генов в ответ на различные сигналы среды часто изучены недостаточно. Можно предположить, что в дрожжевой клетке существует гораздо более разветвленная сеть регуляторных каскадов, чем известно сейчас. Для поиска новых точек пересечения таких каскадов необходимо использовать удобные генетические модели. В настоящей работе в качестве модели для изучения механизмов координированной регуляции был выбран ген РНОЗ, кодирующий кКФ дрожжей.

Азот - важнейший компонент макромолекул, выполняющих центральные функции в живых системах. В связи с этим прокариотические и эукариотические организмы выработали сложные механизмы для обеспечения клеток азотом. В 2006 году был проведён анализ транскриптома дрожжей с помощью ДНК-биочипов. Были выявлены 392 гена, уровень экспрессии которых каким-либо образом реагировал на изменение источника азота в среде и обработку клеток рапамицином, антибиотиком, вызывающим у дрожжей состояние азотного голодания. Авторы распределили эти гены на четыре группы. В первую группу были объединены гены, экспрессия которых была значительно индуцирована и после переноса клеток на среду с пролином, менее удобным источником азота, и после обработки рапамицином. Эти гены кодируют ферменты катаболизма азотистых соединений, транскрипционные регуляторы генов азотного метаболизма, белки-переносчики, белки протеолиза и другие. Вторая группа включает гены, индуцируемые при азотном голодании, но степень их дерепрессии на пролине меньше. В этой группе - гены ответа на стресс. Третья группа объединяет гены, экспрессия которых снижается в ответ на азотное голодание. В основном, сюда относятся гены аминокислотного и нуклеотидного метаболизма, белкового синтеза и транспорта. Четвертая группа состоит из генов, также репрессируемых во время роста на среде с бедным источником азота. Большая часть генов кодирует компоненты белок-синтезирующего аппарата, факторов сборки рибосом. В этой же группе идентифицированы гены изозима репрессибельной кислой фосфатазы PHOll (Scherens et al., 2006). Уровень экспрессии генов РНОЗ и PHÖ5, кодирующих основные фракции КФ дрожжей, отвечающих за утилизацию всевозможных фосфорсодержащих соединений, также уменьшается при азотном голодании

Hardwick et al., 1999; Gasch et al., 2000; Bradley et al., 2009). Таким образом, очевидно, что регуляторы метаболизма азота играют ключевую роль в координации клеточных процессов. Однако генетический контроль азотной регуляции экспрессии генов РНО не изучен. Особый интерес представляет ген PHOS. Экспрессия этого гена не регулируется в зависимости от концентрации фосфата в среде, однако строго репрессируется тиаминпирофосфатом.

Целью данной работы являлся поиск общих путей регуляции метаболизма азота и фосфора на примере гена РНОЗ у дрожжей S. cerevisiae. В задачи исследования входило:

1) изучить зависимость уровня экспрессии гена РНОЗ от качества источника азота в среде;

3) клонировать гены, мутации в которых влияют на экспрессию гена РНОЗ при изменении источника азота в среде;

4) предложить модели регуляции экспрессии гена РНОЗ в зависимости от типа источника азота.

Научная новизна исследования. В ходе работы показано, что экспрессия гена РНОЗ регулируется в зависимости от типа источника азота в среде. Ген РНОЗ не является объектом азотной катаболитной репрессии. Впервые показано, что экспрессия этого гена существенно возрастает на средах с глутаматом в качестве единственного источника азота. Предложенная в работе селективная система позволила расширить спектр мутаций, влияющих на экспрессию гена РНОЗ в зависимости от источника азота. Были выявлены возможные механизмы регуляции экспрессии гена РНОЗ: на уровне транскрипции при участии репрессора генов азотного метаболизма Gzßp и на посттранскрипционном уровне - с помощью убиквитин-лигазы Rsp5p.

Практическая ценность. Изучение регуляции промотора гена РНОЗ различными факторами среды представляет теоретический и практический интерес. Экспрессия гена РНОЗ имеет достаточно высокий уровень, но в отличие от гена РН05, не зависит от изменений концентрации фосфата в среде. Промотор РНОЗ может быть использован в биотехнологии (Okabayashi et al., 1990), однако, в отличие от промотора PHÖ5, его практически не используют, так как в некоторых случаях конститутивная экспрессия гетерологичного гена может быть токсична для клеток дрожжей (Парфенова и др., 2002; Matsuyama et al., 2008). Исследование генетического контроля экспрессии гена РНОЗ в ответ на изменение характера азотного питания позволит выявить новые регуляторные механизмы и может существенно расширить возможности его применения в биотехнологии для гетерологичного синтеза.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Савинов, Владимир Александрович

Выводы

3. Генетический анализ мутантов 1,4,5,6-YM954 и секвенирование показали, что мутации gub 1,4,5,6 картируются в хромосоме V дрожжей и произошли в гене RSP5, кодирующему структуру убиквитин-лигазы.

4. Заключение

Гены РН05 и PHOS изозимов КФ являются частным примером эволюции за счет изменения механизма регуляции. Эти гены произошли в результате дупликации общего предкового гена, тесно сцеплены в хромосоме И, обладают высокой степенью сходства на нуклеотидном (82%) и аминокислотном (87%) уровне. В сторону фланкирующих некодирующих последовательностей эта степень уменьшается до 65%. И совсем низкая степень сходства наблюдается в области промоторов этих генов (Bajwa et al., 1984). Модификация и дивергенция промоторных участков дуплицированных генов КФ привели к возникновению разных систем регуляции экспрессии близкородственных генов. Ген репрессибельной КФ РН05 регулируется количеством фосфата в среде (Johnston & Carlson, 1992). Экспрессия гена конститутивной КФ PHOS не зависит от фосфата, однако репрессируется тиамином (Singleton, 1997). Уровень экспрессии генов PHOS и РН05 также снижается при азотном голодании (Hardwick et al., 1999; Gasch et al., 2000; Bradley et al., 2009).

На среде с мочевиной и глюкозой фактор Gzf3p связывается с промоторной областью гена РНОЗ и блокирует его транскрипцию, координируя уровень экспрессии этого гена с потребностями клетки. Таким образом, не только фактор Gln3p (Staschke et al., 2010), но и фактор Gzf3p участвует в репрессии гена РНОЗ. Особенно интересно, что для генов азотного метаболизма фактор Gln3p - это активатор транскрипции, тогда как фактор Gzf3p - репрессор, а для гена РНОЗ оба фактора выступают в роли репрессоров. По всей видимости, убиквитин-лигаза Rsp5p способна регулировать активность белка Gzf3p, поскольку в настоящее время показано, что Gzfip имеет сайты убиквитинирования (Peng et al., 2003), а между генами GZF3 и RSP5 установлена регуляторная связь (Costanzo et al., 2010). Транкрипционный фактор Gzf3p, в свою очередь, может воздействовать на промотор гена РНОЗ напрямую или, как минимум, опосредованно через изменение количества тиаминпирофосфата в клетке.

Тиамин (витамин В1) необходим клетке для реакций цикла трикарбоновых кислот и пентозофосфатного пути окисления углеводов. Тиамин поступает в клетки дрожжей с помощью специфического мембранного белка-транспортера, продукта гена THI7. Кроме того, дрожжи могут синтезировать тиамин с помощью фермента, продукта гена THI4. Ген THI4 и другие THI-теяы полностью репрессируются с увеличением концентрации тиамина в среде, но в среде без тиамина уровень их экспрессии очень высок. В клетках тиамин становится функционально активным после фосфорилирования до тиаминпирофосфата и тиаминтрифосфата, которые являются кофакторами ферментов, например а-кетоглутаратдегидрогеназы, транскетолазы и других, участвующих в метаболизме аминокислот и углеводов (Singleton, 1997; Li et al., 2010). Фермент a-кетоглутаратдегидрогеназа при участии тиамина обеспечивает декарбоксилирование a-кетоглутарата, участника цикла трикарбоновых кислот, и образование глутамата, который является важным элементом метаболизма азота. С другой стороны, метаболизм тиамина тесно связан с обменом НАД1" и НАМ. Кроме того, НАД* является кофактором дегидрогеназ, например Gdh2p, контролирующей образование а-кетоглутарата из глутамата (Magasanik & Kaiser, 2002; Li et al., 2010). Перенос фосфатных групп на тиамин катализирует тиаминпирофосфокиназа, продукт гена THI80. Экспрессия THI80 регулируется внутриклеточным количеством тиаминпирофосфата по механизму обратной связи и также требует позитивных регуляторов, продуктов генов THI2 и THI3. Экспрессия THI80 существенна для роста клеток, а тиаминпирофосфокиназа является единственным ферментом у дрожжей, способным синтезировать тиаминпирофосфаты (Nosaka, 1990). В отличие от кКФ, тиаминпирофосфокиназа постоянно синтезируется хотя бы в малом количестве и её ген THI80 не репрессируется полностью при добавлении тиамина в среду (Nosaka et al., 1993). Добавление тиамина подавляет активность кКФ РЬоЗр и ферментов биосинтеза тиамина. Этот эффект обусловлен фактором негативной регуляции, продуктом гена THI81 (Nishimura et al., 1997).

Было показано, что фактор Gzf3p может связываться с промотором гена THI80 тиаминпирофосфокиназы, обеспечивающей активацию тиамина в клетке (Chua et al., 2006). В промоторе гена THI80 обнаружена последовательность GATAAG. Другой возможной мишенью фактора Gzf3p является тиазол-синтаза, кодируемая геном THI4, необходимая для биосинтеза тиамина. В промоторе этого гена в комплементарной цепи выявлены два сайта GATAAG (http://www.yeastract.com/). Таким образом, ген РНОЗ, как и гены THI80 и THI4, регулируются фактором Gzf3p.

Таким образом, мы показали, что экспрессия гена РНОЗ зависит от качества источника азота, и выявили участников регуляторного каскада, координирующих метаболизм азота и фосфата у дрожжей S. cerevisiae.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савинов, Владимир Александрович, Санкт-Петербург

1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 460 с.

2. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н. и др. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука, 1984.

3. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002. 248 с.

4. Падкина М.В. Изучение функции генов, контролирующих активность кислой фосфатазы I у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Автореферат дисс. на соискание уч. ст. к. б. н. Л., 1978. 24 с.

5. Парфенова Л.В., Смирнов М.Н., Самбук Е.В., Падкина М.В. Продукция ß-интерферона человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae ведет к снижению активности цитохром-С-оксидазы // Биотехнология. 2002. № 6. С. 23-30.

6. Попова Ю.Г., Падкина М.В., Самбук Е.В. Влияние мутаций в генах РН085 и РН04 на утилизацию пролина у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика. 2000. Т. 36, N 12. С. 1622-1628.

7. Савинов В. А., А. М. Румянцев, Е. В. Самбук, М. В. Падкина. Создание тест-системы для изучения генетического контроля регуляции гена алкогольоксидазы 1 дрожжей Pichia pastoris // Вестн. С.-Петерб. Ун-та. 2009. Сер.З, Вып.4. С. 114-119.

8. Савинов В. А., Самбук Е. В., Падкина М. В. Природные и рекомбинантные фитазы микроорганизмов // Вестн. С.-Петерб. Ун-та. 2007. Сер.З, Вып.2. С. 66-75.

9. Савинов В.А., Физикова А.Ю., Румянцев A.M., Самбук Е.В. Изучение механизмов регуляции гена РНОЗ в зависимости от источника азота в среде у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Экологическая генетика. 2011. Т. 9, N4. С. 70-78.

10. Самбук Е.В. Генетические механизмы реализации закона лимитирующего фактора у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Жур. общ. биол. 2005. Т. 66. № 4. С. 310-325.

11. Самбук Е.В., Попова Ю.Г., Физикова А.Ю. и др. Генетический анализ плейотропных эффектов мутаций pho85 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae I/ Генетика. 2003. Т. 39, N 8. С. 1039-1045.

12. Самсонова М.Г., Падкина М.В., Краснопевцева Н.Г. и др. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика. 1975. Т. 11, N 9. С. 104-115.

13. Тер-Аванесян М.Д. Генетический контроль активности экзогенной кислой фосфатазы I у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Дисс. на соискание уч. ст. к. б. н. Д., 1974. 169 с.

14. Adkins M.W., Tyler J.K. Transcriptional activators are dispensable for transcription in the absence of Spt6-mediated chromatin reassembly of promoter regions // Mol Cell. 2006. V. 21. P. 405-416.

15. Almeida R., Allshire R.C. RNA silencing and genome regulation // Trends in cell biol. 2005. V. 15, N 5. P. 251-258.

16. Aimer A., Rudolph H., Hinnen A., Horz W. Removal of positioned nucleosomes from the yeast PH05 promoter upon PH05 induction releases additional upstream activating DNA elements // EMBO J. 1986. V. 5. P. 2689-2696.

17. Andlid T.A., Veide J., Sandberg A. Metabolism of extracellular inositol hexaphosphate (phytate) by Saccharomyces cerevisiae II Int. J. of Food

18. Microb. 2004. N 97. P. 157-169.

19. Bajwa W., Meyhack B., Rudolph H. et al. Structural of two tandemly repeated acid phosphatase genes in yeast // Nucleic Acids Res. 1984. V. 12, N 20. P. 7721-7739.

20. Belova I.V., Sambuk E.V, Padkina M.V., Smirnov M.N. PH02 and GCN4 transcription activators in the regulation of Saccharomyces cerevisiae acid phosphatase synthesis // Genetika. 1992. V. 5, N 28. P. 11-18.

21. Berretta J., Pinskaya M., Morillon A. A cryptic unstable transcript mediates transcriptional trans-silencing of the Tyl retrotransposon in S. cerevisiae II Genes Dev. 2008. V. 22, N 5. P. 615-626.

22. Bertram P.G., Choi J.H., Carvalho J. et al. Convergence of TOR-nitrogen and Snfl-glucose signaling pathways onto Gln3 // Mol.Cell.Biol. 2002. V.22, N 4. P. 1246-1252.

23. Bhoite L.T., Allen J.M., Garcia E. et al. Mutations in the Pho2 (Bas2) transcription factor that differentially affect activation with its partner proteins Basl, Pho4, and Swi5 // J. Biol. Chem. 2002. V. 277, N 40. P. 37612-37618.

24. Bird A .J., Gordon M., Eide D.J., Winge D.R. Repression of ADH1 and ADH3 during zinc deficiency by Zap 1-induced intergenic RNA transcripts // EMBO J. 2006. V. 25, N 24. P. 5726-5734.

25. Bousquet-Antonelli C., Presutti C., Tollervey D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover // Cell. 2000. V. 102, N 6. P. 765775.

26. Bun-Ya M., Harashima S., Oshima Y. Putative GTP-binding protein, Gtrl, associated with the function of the Pho84 inorganic phosphate transporter in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol. 1992. V. 12. P. 2958-2966.

27. Bradley P.H., Brauer M.J., Rabinowitz J.D., Troyanskaya O.G. Coordinatedconcentration changes of transcripts and metabolites in Saccharomyces cerevisiae II PLoS ComputBiol. 2009. V. 5, N 1. P. 1-15.

28. Bun-Ya M., Nishimura M., Harashima S., Oshima Y. The PH084 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes an inorganic phosphate transporter // Mol. Cell. Biol. 1991. V. 11, N 6. P. 3229-3238.

29. Camblong J., Beyrouthy N., Guffanti E. et al. Trans-acting antisense RNAs mediate transcriptional gene cosuppression in S. cerevisiae // Genes & development. 2009. N 23. P. 1534-1545.

30. Camblong J., Iglesias N., Fickentscher C. et al. Antisense RNA stabilization induces transcriptional gene silencing via histone deacetylation in S. cerevisiae II Cell. 2007. N 131. P. 706-717.

31. Cardenas M.E., Cutler N.S., Lorenz M.C et al. The TOR signaling cascade regulates gene expression in response to nutrients // Genes Dev. 1999. V. 13, N24. P. 3271-3279.

32. Cardillo S.B., Moretti M.B., Garcia S.C. Uga3 and Uga35/Dal81 transcription factors regulate UGA4 transcription in response to y-aminobutric acid and leucine//Eucar. Cell. 2010. V. 9, N 8. P. 1262-1271.

33. Carvalho J., Zheng X.F.S. Domains of Gln3p interacting with karyopherins, Ure2p, and the Target of Rapamycin Protein // J. of Biol. chem. 2003. V. 278, N19. P. 16878-16886.

34. Chua G., Morris Q.D., Sopko R. et al. Identifying transcription factor functions and targets by phenotypic activation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V.103, N 32. P. 12045-12050.

35. Clark D. W., Tkacz J. S., Lampen J. O. Asparagine-linked carbohydrate does not determine the cellular location of yeast vacuolar nonspecific alkaline phosphatase //J. Bacteriol. 1982. V. 152. P. 865-873.

36. Coffrnan J.A., Rai R., Cooper T.G. et al. Genetic evidence for Gln3p-independent, nitrogen catabolite repression-sensitive gene expression in Saccharomyces cerevisiae II J. of Bacteriol. 1995. V. 177, N 23. P. 69106918.

37. Coffman J.A., Rai R., Loprete D.M. et al. Cross regulation of four GATA factors that control nitrogen catabolic gene expression in Saccharomyces cerevisiae // J. of Bacteriol. 1997. V. 179, N 11. P. 3416-3429.

38. Cooper T.G., Ferguson D., Rai R. et al. The GLN3 gene product is required for transcriptional activation of allantoin system gene expression in Saccharomyces cerevisiae 111. of Bacteriol. 1990. V. 172, N 2. P. 1014-1018.

39. Cooper T.G., Lam C., Turoscy V. Structural analysis of the dur loci in S. cerevisiae: two domains of a single multifunctional gene // Genetics. 1980. V. 94, N3. P. 555-580.

40. Costanzo M., Baryshnikova A., Bellay J. et al. The genetic landscape of a cell // Science. 2010. V 327, N5964. P. 425-431.

41. Crespo J.L., Daicho K., Ushimaru T. et al. The GATA transcription factors GLN3 and GAT1 link TOR to salt stress in Saccharomyces cerevisiae I I J. Biol. Chem. 2001. V. 276, N 37. P. 34441-34444.

42. Crespo J.L., Helliwell S.B., Wiederkehr C. et al. NPR1 kinase and RSP5-BUL1/2 ubiquitin ligase control GLN3-dependent transcription in Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 2004. V. 279, N 36. P. 3751237517.

43. David L., Huber W., Granovskaia M. et al. A high-resolution map of transcription in the yeast genome // PNAS. 2006. V 103, N 14. P. 5320-5325.

44. Deed N.K., van Vuuren H.J.J., Gardner R.C. Effect of nitrogen catabolite repression and di-ammonium phosphate addition during wine fermentation by a commercial strain of S. Cerevisiae II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. V. 89. P. 1537-1549.

45. Doi S., Watanabe M., Tanabe K. et al. Induction of repressible acid phosphatase by unsaturated fatty acid in Saccharomyces cerevisiae II J. Cell Sci. 1989. N94. P. 511-516.

46. Forsberg H., Gilstring C.F., Zargari A. et al. The role of the yeast plasma membrane SPS nutrient sensor in the metabolic response to extracellular amino acids //Mol. Microbiol. 2001. V. 42(1). P. 215-228.

47. Gancedo J.M. Yeast carbon catabolite repression // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V.62,N2. P. 334-361.

48. Gasch A.P., Spellman P.T., Kao C.M. et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes // Mol. Biol, of Cell. 2000. V. 11. P.'4241-4257.

49. Georis I., Feller A., Vierendeels F., Dubois E. The yeast GATA factor Gatl occupies a central position in nitrogen catabolite repression-sensitive gene activation // Mol. And Cell. Biol. 2009. V. 29, N 13. P. 3803-3815.

50. Godard P., Urrestarazu A., Yissers S. et al. Effect of 21 different nitrogensources on global gene expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol. And Cell. Biol. 2007. V. 27, N 8. P. 3065-3086.

51. Gottesman S., Morris N.R. Cell regulation variations on every theme // Cur. Op. in Microb. 2000. N 3. P. 115-117.

52. Guthrie C., Fink G.R. Guide to yeast genetics and molecular biology. Academic Press. 1991. V. 194. 933 p.

53. Hahn S., Young E.T. Transcriptional regulation in Saccharomyces cerevisiae: transcription factor regulation and function, mechanisms of initiation, and roles of activators and coactivators // Genetics. 2011. V. 189. P. 705-736.

54. Hardwick J.S., Kuruvilla F.G., Tong J.K. et al. Rapamycin-modulated transcription defines the subset of nutrient-sensitive signaling pathways directly controlled by the Tor proteins // PNAS. 1999. V. 96. P. 14866-14870.

55. Harreman M., Taschner M., Sigurdsson S. et al. Distinct ubiquitin ligases act sequentially for RNA polymerase II polyubiquitylation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 06, N 49. P. 20705-20710.

56. Harrison B.R., Yazgan O., Krebs J.E. Life without RNAi: noncoding RNAs and their functions in Saccharomyces cerevisiae II Biochem. Cell. Biol. 2009. N 87. P. 767-779.

57. Hirota K., Miyoshi T., Kugou K. et al. Stepwise chromatin remodelling by a cascade of transcription initiation of non-coding RNAs // Nature. 2008. V. 456, N7218. P. 130-134.

58. Hofman-Bang J. Nitrogen catabolite repression in Saccharomyces cerevisiae //Mol. Biotechnol. 1999. V. 12. P. 35-73.

59. Hongay C.F., Grisafi P.L., Galitski T. et al. Antisense transcription controls cell fate in Saccharomyces cerevisiae I I Cell. 2006. N 127. P. 735-745.

60. Horak J. The role of ubiquitin in down-regulation and intracellular sorting of membrane proteins: insights from yeast // Biochimica et Biophysica Acta. 2003. V.1614,N2. P. 139-155.

61. Houseley J., Rubbi L., Grunstein M., et al. A ncRNA modulates histone modification and mRNA induction in the yeast GAL gene cluster // Mol Cell. 2008. V. 32, N5. P. 685-695.

62. Huang H.L., Brandriss M.C. The regulator of the yeast proline utilization pathway is differentially phosphorylated in response to the quality of the nitrogen source // Mol. Cell. Biol. 2000. V.20, N 3. P. 892-899.

63. Huang K., Ferrin-O'Connell I., Zhang W. et al. Structure of the Pho85-Pho80 CDK-cyclin complex of the phosphate-responsive signal transduction pathway // Mol Cell. 2007. V. 28, N 4. P. 614-623.

64. Jacob F., Monod J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins // J. Mol. Biol. 1961. V. 3. P. 318-356.

65. Jensen L.T., Ajua-Alemanji M., Culotta V.C. The Saccharomyces cerevisiae high affinity phosphate transporter encoded by PH084 also functions in manganese homeostasis // J Biol Chem. 2003. V. 278, N 43. P. 42036^12040.

66. Johnston M., Carlson M. Regulation of carbon and phosphate utilization // Mol. Cell. Biol, of the Y. Sacch.: Gene Expression. 1992. V. 2. P. 193-255.

67. Kaffman A., Herskowitz I., Tajian R. et al. Phosphorylation of the transcription factor PH04 by a cyclin-CDK complex, PH080-PH085 II Science. 1994. N263. P. 1153-1156.

68. Kaneko Y., Tamai Y., Toh-e A., Oshima Y. Transcriptional and post-transcriptional control of PH08 expression by PHO regulatory genes in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol. 1985. V. 5. P. 248-252.

69. Kim V.N., Nam J.-W. Genomics of microRNA // Trends in Genetics. 2006. V. 22, N3.

70. Kodama Y., Omura F., Takahashi K. et al. Genome-wide expression analysis of genes affected by amino acid sensor Ssylp in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Microbiol. 2001. V. 42(1). P. 215-228.

71. Komeili A., O'Shea E.K. Nuclear transport and transcription // Curr. Opin. Cell. Biol. 2000. V.12, N 1. P. 355-360.

72. Komeili A., Wedaman K.P., O'Shea E.K. et al. Mechanism of metaboliccontrol. Target of rapamycin signaling links nitrogen quality to the activity of the Rtgl and Rtg3 transcription factors // J. Cell.Biol. 2000. V.151, N 4. P. 863-878.

73. Kulkarni A.A., Abul-Hamd A.T., Rai R. et al. Gln3p nuclear localization and interaction with Ure2p in Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 2001. V. 276, N34. P. 32136-32144.

74. Lazard M., Blanquet S., Fisicaro P. et al. Uptake of selenite by Saccharomyces cerevisiae involves the high and low affinity orthophosphate transporters//J. Biol. Chem. 2010. V. 285, N. 42. P. 32029-32037.

75. Lee J., Colwill K., Aneliunas V. et al. Interaction of yeast Rvsl67p and Pho85 cyclin-dependent kinase complexes may link the cell-cycle to the actin cytoskeleton // Curr. Biol. 1998. V. 8. P. 1310-1321.

76. Lee M., O'Regan S., Moreau J.L. et al. Regulation of the Pcl7-Pho85 cyclin-cdk complex by pho81 // Mol. Microbiol. 2000. V. 38. P. 411^22.

77. Lee T.I., Rinaldi N.J., Robert F. et al. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae // Science. 2002. V. 298, N 5594. P. 799-804.

78. Li M., Petteys B.J., McClure J.M. et al. Thiamine biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae is regulated by the NAD+-dependent histone deacetylase Hstl II Mol. and Cell. Biol. 2010. V. 30, N 13. P. 3329-3341.

79. Liu Z., Butow R.A. A transcriptional switch in the expression of yeast tricarboxylic acid cycle genes in response to a reduction or loss of respiratory function // Mol.Cell.Biol. 1999. V.19, N 10. P.6720-6728.

80. Magasanik B. Regulation of nitrogen utilization // Mol. and Cel. Biol, of the yeast Sacch.\ Gene expression. NY: Cold Spring Harbor, 1992. P.283-317.

81. Magasanik B., Kaiser C.A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae //Gene. 2002. N290. P. 1-18.

82. Martens J.A., Laprade L., Winston F. Intergenic transcription is required to repress the Saccharomyces cerevisiae SER3 gene // Nature. 2004. V 429. P. 571-574.

83. Martin O., Brandriss M.C., Schneider G. et al. Improved anaerobic use of arginine by Saccharomyces cerevisiae II App. and Env. Microbiol. 2003. V. 69, N3. P. 1623-1628.

84. Martinez P., Persson B.L. Identification, cloning and characterization of a derepressible Na+-coupled phosphate transporter in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genet. 1998. V. 258. P. 628-638.

85. Marzluf G.A. Genetic regulation of nitrogen metabolism in the fungi // Microb. and Mol. Biol. Rev. 1997. V. 61, N 1. P. 17-32.

86. Matsuyama A., Shirai A., Yoshida M. A series of promoters for constitutive expression of heterologous genes in fission yeast // Yeast. 2008. V. 25, N 5. P. 371-376.

87. Maxon M.E., Herskowitz I. Ashlp is a site-specific DNA-binding protein that actively represses transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. V. 98(4). P. 1495-1500.

88. Measday V., Moore L., Retnakaran R., Lee J. et al. A family of cyclin-like proteins that interact with the PH085 cyclin-dependent kinase // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 1212-1223.

89. Meselson M., Yuan Y. DNA restriction enzyme from E. coli // Nature. 1968. V. 217. P. 1110-1114.

90. Messenguy F., Andre B., Dubois E. Diversity of nitrogen metabolism among yeast species: regulatory and evolutionary aspects // Rosa C.A., Peter G. Biodiversity and ecophysiology of yeasts / Springer. 2006. P. 123-153.

91. Meyhack B., Bajwa W., Rudolph H. et al. Two yeast acid phosphatase structural genes are the result of a tandem duplication and show different degrees of homology in their promoter and coding sequences // EMBO J. 1982. V. 1,N6.P. 675-680.

92. Monod M., Sive S., Haguenauer-Tsapis R. et al. In vivo and in vitro studies of

93. PH05 mutants at the signal peptidase cleavage site // Proc. Alko Symp. on Industr. Yeast Genet. Helsinki. 1987. V.5. P. 149-154.

94. Morse D.E., Mosteller R.D., Yanofsky C. Dynamics of synthesis, translation, and degradation of trp operon messenger RNA in E. coli II Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1969. V. 34. P. 725-740.

95. Mullaney E.J., Ullah A.H. The term phytase comprises several different classes of enzymes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 312, N 1. P. 179-184.

96. Natarajan K., Meyer M.R., Jackson B.M. et al. Transcriptional profiling shows that Gcn4p is a master regulator of gene expression during amino acid starvation in yeast//Mol. And Cell. Biol. 2001. V. 21, N 13. P. 4347-4368.

97. Nishimura H., Kawasaki Y., Nosaka K et al. Mutation thi81 causing a deficiency in the signal transduction of thiamine pyrophosphate in Saccharomyces cerevisiae IIFEMS Microbiol. Lett. 1997. N 156. P. 245-249.

98. Nishizawa M., Komai T., Katou Y. et al. Nutrient-regulated antisense and intragenic RNAs modulate a signal transduction pathway in yeast // PLoS Biol. 2008. V. 6, N 12. P. 2817-2830.

99. Nosaka K. High affinity of acid phosphatase encoded by PH03 gene in Saccharomyces cerevisiae for thiamin phosphates // Biochim. Biophys. Acta. 1990. N 1037. P. 147-154.

100. Nosaka K., Kaneko Y., Nishimura H. et al. A possible role for acid phosphatase with thiamin-binding activity encoded by PH03 in yeast // FEMS Microbiol Lett. 1989. N 51. P. 55-59.

101. Nosaka K., Kaneko Y., Nishimura H. et al. Isolation and characterization of a thiamin pyrophosphokinase gene, THI80, from Saccharomyces cerevisiae II J. of Biol. Chem. 1993. V. 268, N23. P. 17440-17447.

102. O'Donnell A.F., Apffel A., Gardner R.G., Cyert M.S. Alpha-arrestins Alyl and Aly2 regulate intracellular trafficking in response to nutrient signaling // Mol. Biol. Cell. 2010. V. 21(20). P. 3552-3566.

103. O'Neill E.M., Kaffman A., Jolly E.R, O'Shea E.K. Regulation of PH04 nuclear localization by the PH080-PH085 cyclin-CDK complex // Science. 1996. V. 271. P. 209-212.

104. Ogawa N., De Risi J., Brown P.O. New components of system for phosphate accumulation and polyphosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae revealed by genomic expression analysis // Mol. Biol. Cell. 2000. V. 11, N 12. P. 4309-4321.

105. Okabayashi K., Oi H., Hirabayashi K. et al. Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin // Green Cross. 1990. EP0399455.

106. Oshima Y. The phosphatase system in Saccharomyces cerevisiae II Genes Genet. Syst. 1997. V. 72. P. 323-334.

107. Padkina M.V. Nonspecific acid phosphatases of yeast Saccharomyces cerevisiae'. regulation of biosynthesis // Vestnik of Saint-Petersburg State University. 1998. V. 3, N 4. P. 52-57.

108. Padkina M.V., Krasnopevtceva N.G., Petrashen M.G., Kozhin S.A., Smirnov M.N. Genetical and biochemical research of acid phosphatases in yeast Saccharomyces cerevisiae. I. Acid phosphatases characteristics // Genetika. 1974. V. 10. P. 100-110.

109. Peng J., Schwartz D., Elias J.E. et al. A proteomic approach to understanding protein ubiquitination//Nat. Biotechnol. 2003. V. 21, N 8. P. 921-926.

110. Persson B.L., Petersson J., Fristedt U. et al. Phosphate permeases of Saccharomyces cerevisiae: structure, function and regulation // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1422. P. 255-272.

111. Pina B., Fernandez-Larrea J., Garcia-Reyro N., et al. The different (sur)faces ofRaplp //Mol. Gen. Genomics. 2003. N268. P. 791-798.

112. Plankert U., Purwin C., Holzer H. Yeast fructose-2,6-bisphosphate 6-phosphatase is encoded by PH08, the gene for nonspecific repressible alkaline phosphatase // Eur. J. Biochem. 1991. Y. 196. P. 191-196.

113. Praekelt U.M., Byrne K.L., Meacock P.A. Regulation of THI4 (MOL1), a thiamine-biosynthetic gene of Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 1994. N 10. P. 481-490.

114. Proudfoot N., Gullerova M. Gene silencing CUTs both ways // Cell. 2007. V. 131. P. 649-651.

115. Rouxel T., Danchin A., Henaut A. METALGEN.DB: metabolism linked to the genome of Escherichia coli, a graphics-oriented database // Comput. Appl. Biosci. 1993. V. 9. P. 315-324.

116. Sambrook J., Russell D. W. Molecular cloning. A laboratory manual. NY.: Cold Spring Harbor Laboratory Press., 2001. 2222 p.

117. Sambuk E.V., Fizikova A.Yu., Savinov V.A., Padkina M.V. Acid Phosphatases of Budding Yeast as a Model of Choice for Transcription Regulation Research // Enzyme Research. 2011.16 pp.

118. Scazzocchio C. The fungal GATA factors // Cur. Op. in Microb. 2000. N 3. P. 126-131.

119. Schneider K.R., Smith R.L., O'Shea E.K. Phosphate-regulated inactivation of the kinase PH080-PH085 by CDK inhibitor PH081 // Science. 1994. Y. 266. P. 122-126.

120. Sekito T., Liu Z., Thornton J. et al. i?rG-dependent mitochondria-to-nucleus signaling is regulated by MKS1 and is linked to formation of yeast prion URE3. // Mol.Biol.Cell. 2002. V. 13, N 3. P. 795-804.

121. Sekito T., Thornton J., Butow R.A. Mitochondria-to-nuclear signaling is regulated by the subcellular localization of the transcription factors Rtglp and Rtg3p // Mol.Biol.Cell. 2000. V. 11, N 6. P. 2103-2115.

122. Singleton C.K. Identification and characterization of the thiamine transporter gene of Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1997. N 199. P. 111-121.

123. Spellman P.T., Sherlock G., Zhang M.Q. et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization // Mol Biol Cell. 1998. V. 9, N 12. P. 3273-3297.

124. Springael J.Y., Penninckx MJ. Nitrogen-source regulation of yeast gamma-glutamyl transpeptidase synthesis involves the regulatory network including the GATA zinc-finger factors Gln3, Nill/Gatl and Gzf3 // Biochem. J. 2003. V. 371. P. 589-595.

125. Stanbrough M., Rowen D.W., Magasanik B. Role of the GATA factors Gln3p and Nillp of Saccharomyces cerevisiae in the expression of nitrogen-regulated genes // Biochem. 1995. V. 92. P. 9450-9454.

126. Staschke K.A., Dey S., Zaborske J.M. et al. Integration of general amino acid control and target of rapamycin (TOR) regulatory pathways in nitrogen assimilation in yeast//J. Biol. Chem. 2010. V. 285, N22. P. 16893-16911.

127. Svaren J., Horz W. Transcription factors vs nucleosomes: regulation of the PH05 promoter in yeast // Trends Biochem. Sci. 1997. V. 22. P. 93-97.

128. Tait-Kamradt A.G., Turner K.J., Kramer R.A. et al. Reciprocal regulation of the tandemly duplicated PH05/PH03 gene cluster within the acid phosphatase multigene family of Saccharomyces cerevisiae II Mol. And Cel. Biol. 1986. V.6, N 6. P. 1855-1865.

129. Tan Y.S., Morcos P.A., Cannon J.F. Pho85 phosphorylates the Glc7 protein phosphatase regulator Glc8 in vivo IIJ Biol Chem. 2003. V. 278, N 1. P. 147153.

130. Tate J.J., Cooper T.G. Stress-responsive Gln3 localization in S. cerevisiae is separable from and can overwhelm nitrogen source regulation // JBC Papers in Press. 2007. P. 1-13.

131. Tate J.J., Rai R., Cooper T.G. Ammonia-specific regulation of Gln3 localization in Saccharomyces cerevisiae by protein kinase Nprl // J. Biol. Chem. 2006. V.281, N 38. P. 28460-28469.

132. Toh-E A., Nakamura H., Oshima Y. A gene controlling the synthesis of non specific alkaline phosphatase in Saccharomyces cerevisiae II Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 428. P. 182-192.

133. Toh-E A., Tanaka K., Uesono Y., Wickner R.B. PH085, a negative regulator of the PHO system, is a homolog of the protein kinase gene, CDC28, of Saccharomyces cerevisiae II Mol Gen Genet. 1988. V. 214. P. 162-164.

134. Uhler J.P., Hertel C., Svejstrup J.Q. A role for noncoding transcription in activation of the yeast PH05 gene // PNAS. 2007. V. 104, N 19. P. 80118016.

135. Vats P., Banerjee U.C. Production studies and catalytic properties of phytases (wyo-inositolhexakisphosphate phosphohydrolases): an overview // Enz. and Microb. Tech. 2004. N 35. P. 3-14.

136. Veide J., Andlid T. Improved extracellular phytase activity in Saccharomyces cerevisiae by modifications in the PHO system // Int. J. of Food Microb. 2006. P. 1-8

137. Venter U., Horz W. The acid phosphatase genes PHO 10 and PHO 11 in S. cerevisiae are located at the telomeres of chromosomes VIII and I // Nucleic

138. Acids Res. 1989. V. 17, N4. P. 1353-1369.

139. Vignols F., Brehelin C., Surdin-Kerjan Y. et al. A yeast two-hybrid knockout strain to explore thioredoxin-interacting proteins in vivo // PNAS. 2005. V. 102, N46. P. 16729-16734.

140. Vogel K., Horz W., Hinnen A. The two positively acting regulatory proteins PH02 and PH04 physically interact with PH05 upstream activation regions //Mol. Cell. Biol. 1989. V. 9. P. 2050-2057.

141. Wang H., Wang X., Jiang Y. Interaction with Tap42 is required for the essential function of Sit4 and type 2A phosphatases // Mol. Biol. Cell. 2003. V.14, N 11. P. 4342-51.

142. Wodzinski R.J., Ullah A.H. Phytase // Adv. Appl. Microbiol. 1996. N 42. P. 263-302

143. Wykoff D.D., O'Shea E.K. Phosphate transport and sensing in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 2001. V. 159, N 4. P. 1491-1499.

144. Xu Z., Wei W., Gagneur J. et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast // Nature. 2009. V 457, N 7232. P. 1033-1037.

145. Yang J.W., Schweingruber M.E. The structural gene coding for thiamin-repressible acid phosphatase in Schizosaccharomyces pombe II Curr. Genet. 1990. N 18. P. 269-272.

Информация о работе

Савинов, Владимир Александрович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Исследование генетических механизмов корегуляции метаболизма азота и фосфора у дрожжей Saccharomyces cerevisiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы