Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Неорганические полифосфаты при нарушениях функционирования протонных АТФаз у Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Неорганические полифосфаты при нарушениях функционирования протонных АТФаз у Saccharomyces cerevisiae"

на правах рукописи

Томашевский Александр Андреевич

НЕОРГАНИЧЕСКИЕ ПОЛИФОСФАТЫ ПРИ НАРУШЕНИЯХ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПРОТОННЫХ АТФаз У 8А ССНА К ОМУСЕ5 СЕЯЕНБЫЕ

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9 ИЮН 2011

Пущино-2011

4849614

Работа выполнена в лаборатории регуляции биохимических процессов Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН, г. Пущшю

член-корреспондент РАН, профессор Кулаев Игорь Степанович доктор биологических наук Кулаковская Татьяна Валентиновна

доктор биологических наук Калебина Татьяна Сергеевна доктор биологических наук Меденцев Александр Григорьевич

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха

Защита диссертации состоится «23» 1ЛУ4НА 2011г. В час. На заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат размещен на сайте: http://www.ibpm.ru Автореферат разослан «/4» МАЯ 2011г.

Учёный секретарь Диссертационного совета,

Доктор биологических наук Вагабов В.М.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Актуальность проблемы. Неорганические полифосфаты (полиР), представляющие собой линейные полимеры ортофосфата (P¡), выполняют в клетке многочисленные функции. Они участвуют в резервировании фосфата, связывании катионов, образовании мембранных каналов, в регуляции активности ферментов и экспрессии генов. У высших эукариот полиР участвуют в процессах свёртывания крови, пролиферации клеток, регуляции кальцификации и декальцификации в костной ткани [Кулаев и др., 2005; Rao et al., 2009; Caen and Wu, 2010].

Представление о том, что метаболизм полиР тесно связан с энергетическим обменом, является общепризнанным, поскольку энергия фосфоангидридных связей этих полимеров близка к таковой АТФ, основного переносчика энергии в клетке [Kornberg et al, 1999; Кулаев и др., 2005]. У бактерий вовлечение их в энергетический обмен обеспечивается полифосфаткиназой и полифосфат:АМР фосфотрансферазой, непосредственно связывающими полиР и АТФ в единых путях метаболизма. В эукариотических клетках участие полиР в энергетическом метаболизме исследовано в значительно меньшей степени. У Neurospora crassa обнаружена 1,3-дифосфоглицерат:полифосфат фосфотрансфераза [Бобык и Кулаев, 1971]; у дрожжей этот фермент не найден. Однако известно, что у дрожжей биосинтез этих полимеров зависит от источника углерода и тесно связан с основными путями обеспечения клеток энергией [Вагабов и др., 2008]. Вопрос о том, каким образом различные энергетические состояния клетки сказываются на обмене полиР, является актуальным, в особенности в связи с проблемой их участия в регуляции различных процессов в клетках эукариот.

Актуальность изучения обмена полиР у дрожжей определяется важностью понимания функций этих биополимеров в эукариотической клетке. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae благодаря доступности мутантов по генам, кодирующим большинство их ферментов, являются удобной моделью для исследования проблемы взаимосвязи энергетического обмена и обмена полиР у эукариот.

Одним из подходов к решению этой проблемы является изучение влияния мутаций, вызывающих нарушение функционирования основных ^Г-АТФаз дрожжевой клетки (митохондриальной АТФазы, Н+-АТФазы плазматической

мембраны, Н+-АТФазы вакуолей) на накопление и расходование неорганических полифосфатов. Такие мутанты в настоящее время получены в различных лабораториях и доступны для использования, однако метаболизм полиР у них не изучался.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение влияния мутаций, нарушающих функционирование митохондриальной, вакуолярной и плазматической рГ-АТФаз дрожжей на обмен полиР у 5. сегеушае.

Были поставлены следующие задачи:

1) Изучить влияние мутаций в гене АТР22 (кодирующем белок, участвующий в постгрансляционной сборке гидрофобной части Ра митохондриальной АТФ-синтетазы [Не^епЬет а! а1., 2003]), нарушающих синтетическую функцию АТФазы митохондрий, на особенности метаболизма полифосфатов на разных стадиях роста в целых клетках дрожжей, а также во фракции митохондрий.

2) Изучить влияние мутации в гене РМА1 (кодирующем ЬГ-АТФазу плазматической мембраны [Ре&оу е1 а!., 2000]), снижающей активность этой АТФазы, на особенности метаболизма полифосфатов на разных стадиях роста.

3) Изучить влияние мутации в гене УМА 2 (кодирующем белок Ь субъединицы \1 домена вакуолярной АТРазы {МП^ош а1 а!., 2007]), нарушающей функционирование ЬГ-АТФазы вакуолярной мембраны, на особенности метаболизма полифосфатов в условиях избытка и недостатка Р,.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое сравнение влияния мутаций, нарушающих функционирование основных ЬГ-АТФаз дрожжей Я. сегехШае на содержание и длину цепи неорганических полифосфатов различных фракций, характеризующихся неодинаковой степенью полимерности и зависимости от стадии роста и содержания фосфата в среде.

Установлено, что нарушение синтетазной функции митохондриальной АТФазы вызывает снижение накопления полифосфатов и их длины цепи на стационарной стадии роста в целых клетках, где основным источником энергии для дрожжевой клетки является окислительное фосфорилирование на уровне дыхательной цепи. В наибольшей степени у мутанта подавляется накопление кислоторастворимой фракции

полиР1 и щелочерастворимой фракции полиРЗ, что свидетельствует о значимости окислительного фосфорилирования для синтеза этих фракций. Обнаружено, что в отличие от общего содержания полиР в клетке, содержание полиР в митохондриях практически не изменяется при нарушении синтеза АТФ в этих органеллах.

Показано, что мутация, уменьшающая активность Н+-АТФазы плазматической мембраны вдвое, не оказывает существенного влияния на содержание и длину цепи нолифосфатов в клетках.

Установлено, что нарушение функционирования вакуоляриой Н1-АТФ азы за счет мутации в гене УМА2 приводит к тому, на мембране этих органелл не образуется электрохимический градиент ионов Н+. При этом наблюдается резкое уменьшение содержания полиР в клетках. Единственной фракцией полиР, способной к динамичному изменению в зависимости от стадии роста и содержания фосфата в среде, остается низкополимерная фракция полиР 1. По-видимому, часть этих полиР синтезируется независимо от электрохимического потенциала на вакуолярной мембране, и кроме известной вакуолярной полиР-синтетазы, в их накоплении принимают участие другие ферментные системы. Остальные, более высокополимерные фракции полиР при этой мутации остаются на очень низком уровне независимо от изменения условий среды.

Научно-практическое значение. Настоящая работа относится к разряду фундаментальных исследований, однако полученные данные позволяют расширить представление о фосфорном метаболизме и значении неорганических полифосфатов в клетках дрожжей, имеющих большое практическое значение и широко используемых в различных отраслях народного хозяйства. Полученные данные необходимо учитывать при исследованиях метаболизма полиР у других представителей эукариот.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит 15 таблиц и 11 рисунков. Библиографический указатель содержит 237 источников литературы.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были доложены на ряде

конференций: на 13ой и 14ой конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века» (Пущино, 2009; 2010) и 20М Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010). По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в журналах, входящих в список, рекомендованный ВАК.

Благодарности. Автор приносит благодарность своим научным руководителям чл.-корреспонденту РАН Игорю Степановичу Кулаеву, д.б.н. Татьяне Валентиновне Кулаковской за постоянное внимание к работе и обсуждение её результатов. Автор благодарит А. Цаголова (Columbia University, США), П. Кейн (SUNY Upstate Medical University, США) и B.B. Петрова (ИБФМ РАН) за предоставление мутантных штаммов S. cerevisiae, М.С. Христина (ИФПБ РАН) за помощь при флуориметрических измерениях, а также всех сотрудников лаборатории регуляции биохимических процессов ИБФМ РАН за содействие при выполнении работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами работы были следующие штаммы дрожжей S. cerevisiae: D273 (родительский штамм), N417 и Е232 (различные делеции в гене АТР22), предоставленные А. Tzagoloff (Columbia University, США), BY 4741 (родительский штамм) и BY 4741 Уша2Д (делеция в гене VMA2), предоставленные Patricia Капе (SUNY Upstate Medical University, США), NY13 (родительский штамм) и Т850А (замена в гене РМА1), предоставленные к.б.н. В.В.Петровым (ИБФМ РАН). Для культивирования использовали среды YPD (2% пептон, 1% дрожжевой экстракт, 2% глюкоза). В среду добавляли КН2РО4 до концентрации 10 мМ. Для выращивания в условиях фосфорного голодания использовали Pj-дефицитную среду согласно [Rubin, 1973]. Для опытов по гиперкомпенсации полиР в среду добавляли КН2РО4 до концентрации 20 мМ. Культивирование дрожжей вели в колбах при 29°С на качалке (-120 об/мин) с объемом среды 200 мл в 750 мл колбе. Для изучения содержания полиР в условиях гиперкомпенсации использовали краткосрочное культивирование при высокой плотности дрожжевой культуры [Кулаковская и др., 2005]. Митохондрии получали методом дифференциального центрифугирования [Zinzer and Daum, 1995].

Ферментативные активности изолированных митохондрий определяли следующим образом: экзополифосфатазную активность определяли по скорости образования Р| при 3 0"С в течение 30 мин в 1 мл реакционной смеси, содержавшей 50 мМ трис-HCI, pH 7,2, 2,5 мМ MgS04 и 1 мМ полиРш (по лабильному фосфору). За единицу активности (Б) принимали количество фермента, образующего 1 мкмоль Р, за 1 мин. АТФазную активность определяли по скорости образования Р, при 30°С в течение 30 мин в 1 мл реакционной смеси, содержавшей 50 мМ трис-HCI, pH 8,5, 1 мМ MgS04, 0,1% Тритон Х-100 и 1 мМ АТФ.

Для определение активности плазматической АТФазы in situ клетки осаждали, два раза промывали деионизованной водой. 1 г клеток ресуспендировали в 10 мл буфера (0,01 М MES-NaOH pH 6,5, 0,1 М KCl, 0,004 М MgS04 и 2% глюкозы в качестве осмотического стабилизатора), после чего добавляли 0,5 мл 1-%-ного раствора Тритона Х-100, разливали по 1 мл в пробирки и замораживали при -70 градусах Цельсия. Пробы клеток оттаивали во льду, осаждали и ресуспендировали в 200 мкл того же буфера без добавления Тритона Х-100. Аликвоты (0,05 мл) суспензии клеток добавляли к 0,95 мл того же буфера, содержащего 5 мМ MgS04i 5 мМ АТФ, 20 мМ KN03, 5 мМ NaN3, и инкубировали 30 мин в присутствии и отсутствие 100 мкМ Na3V04 при 30°С и 700 об/мин. Для остановки реакции добавляли 400 мкл 1 М НС104. Затем проводили осаждение при 13000 g в течение 3 мин. Из надосадочной жидкости отбирали пробы и определяли содержание Р;.

Экстракцию полифосфатов проводили по методу Лангена и Лисса в модификации Кулаева и др. [Liss and Langen, 1959; Кулаев и др., 1960; Kulaev, 1979] и получали пять фракций полифосфатов: низкополимерную кислоторастворимую полиР 1 (экстрагировали 0,5 н НСЮ4 при 0°С), более высокополимерпые -солерастворимую полиР2 (экстрагировали насыщенным раствором NaC104 при 0°С), первую и вторую щелочерастворимые фракции полиРЗ и полиР4 (экстрагировали раствором NaOH pH 9-10 и 0,05 н NaOH pH 12 соответственно, при 0°С), и фракцию полиР5, которая представляла собой горячий хлорнокислый экстракт. Фракцию полиР5 для электрофореза экстрагировали 30 мМ ЭДТА при комнатной температуре в течение 1 ч.

Определение длины цепи полиР проводили с помощью электрофореза в 20% полиакриламидном геле, приготовленном на 200 мМ Tris-боратном буфере, pH 8,3, с 7 М мочевиной. Пластину окрашивали толуидиновым голубым [Kumble and Kornberg, 1995]. Предварительно полиР всех фракций для концентрирования осаждали насыщенным раствором Ba(N03)2 и переводили в растворимую форму с помощью катионообменной смолы Dowex 50 WX 8 в N11/форме.

Pi определяли следующим образом: к 145 мкл пробы добавляли 100 мкл реагента, приготовленного перед использованием (0,5 г аскорбиновой кислоты растворяли в 30 мл воды, добавляли 5 мл 12% раствора (МН»)бМо7024 в ! н H2SO4 и 5 мл 10% SDS. Доводили объём водой до 50 мл). Реакцию проводили в планшетах для иммуноферментного анализа при 30°С в течение 10 мин на шейкере и затем измеряли оптическую плотность при 660 нм на фотометре "Эфос 9305" (Россия). Белок определяли по модифицированному методу Лоури [Bensadoun and Weinstein, 1976]. Определение образования ДрН на мембране изолированных вакуолей проводили с помощью гашения флуоресценции красителя 9-амино-6-хлор-2-метоксакридина на микрофлуориметре Hitachi (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние мутаций, нарушающих синтетазну» функцию митохондриальной

АТФазы, на особенности метаболизма полифосфатов в целых клетках и митохондриях S. cerevisiae

В работе были использованы штаммы S. cerevisiae D273 (родительский штамм), N417 и Е232 (различные делеции в гене АТР22). У обоих мутантов подавлен синтез АТФ в митохондриях, наблюдается частичный дефицит цитохромов а, а3 и Ь, понижена НАДН- и сукцинат-оксидазная активности, однако сохранена АТФазная активность [Helfenbein et al., 2003]. В отличие от родительского, мутантные штаммы не растут на среде с этанолом. В связи с этим культивирование проводили с использованием глюкозы как источника углерода. Штаммы с мутациями в гене АТР22

росли медленнее и давали меньший выход биомассы, чем родительский (рис. 1). В связи с неспособностью к окислительному фосфорилированию они не демонстрировали диауксического роста.

ю го

Время роста, час

Рис. 1. Кривые роста различных штаммов Я. сегешше при культивировании на среде УРБ

• -штамм Б273, о - штамм Е232, А - штамм N417

Для экстракции полиР использовали клетки конца логарифмической стадии роста -7ч для родительского штамма (рис. 1, точка А) и 12 ч для мутантных штаммов (рис. 1, точка В) и клетки стационарной стадии роста - 14 ч для родительского штамма (рис. 1, точка Б) и 17 ч для мутантных штаммов (рис. 1, точка Г)- Данные по содержанию полиР различных фракций в клетках родительского (0273) и мутантного (Е232) штаммов на двух стадиях роста на глюкозе представлены в таблице 1. В клетках, находящихся на логарифмической стадии роста, содержание полиР различных фракций у мутанта было почти таким же, как у родительского штамма. Этот результат явился ожидаемым, так как на этой стадии роста основным источником энергии для клеток дрожжей является гликолиз, а окислительное фосфорилирование на уровне дыхательной цепи подавлено посредством механизма катаболитной репрессии [Меуег ег а1., 1998]. На стационарной стадии роста у обоих штаммов наблюдается увеличение содержания полиР, что характерно и для других штаммов 5. сегеушае [Вагабов и др., 1998]. Однако, если у родительского штамма суммарное содержание полиР увеличилось почти в 4 раза, то у мутанта только в 1,8

раза. В результате на стационарной стадии роста родительский штамм содержал в 2,5 раза больше полиР, чем мутантный. Эта разница в наибольшей степени выражена во фракциях полиР 1, полиР2 и полиРЗ, которые наиболее динамичны и накапливаются в большем количестве, чем другие [Вагабов и др., 1998]. Таким" образом, подтверждается существенная зависимость содержания именно этих фракций от энергетического состояния клетки дрожжей [Вагабов и др., 2008; Уа§аЬоУ й а]., 2008]. Штамм N417 с другой делецией в том же гене демонстрировал аналогичный эффект.

Таблица 1. Содержание полиР в клетках дрожжей Я. сеге\'тае Ш1Ъ (родительский штамм) и Е232 (штамм с нарушенным синтезом АТФ в митохондриях) на логарифмической и стационарной стадиях роста (мкмоль Р/г сырой биомассы), среда УРБс 10 мМ Р;.

Фракции Штаммы дрожжей

полифосфат 0273, родительский штамм Е232, штамм с нарушенным синтезо

ов АТФ в митохондриях

Логарифмическа Стационарная Логарифмическая Стационарная

я стадия стадия стадия

стадия

Р1 32 ±2,0 18 ±3,3 29 ±3,4 32 ±6,0

полиР! 6,9 ±0,7 32 ±5,0 6,4 ±0,6 13 ±2,8

полиР2 1,2 ±0,1 7 ±2,0 1 ±0,03 2,6 ±1,0

полиРЗ 2,6 ±0,6 12 ±2,0 2,3 ±0,2 4,5 ±1,0

полиР4 0,27 ±0,04 0,94 ±0,2 0,23 ±0,03 0,54 ±0,2

полиР5 0,69 ±0,05 0,93 ±0,3 0,42 ±0,07 0,79 ±0,2

Е полиР 12,0 ±1,3 53,0 ±5,0 10,0 ±0,9 21,0 ±3,6

Содержание Р; на логарифмической стадии является практически одинаковым у щтаммов 0273 и Е232. На стационарной стадии содержание Р| у родительского штамма уменьшается, что можно объяснить увеличением его резервированием Р| в виде полиР, тогда как у мутанта оно сохраняется на прежнем уровне.

Электрофорез полиР, полученных из клеток, находящихся на стационарной стадии роста, показал, что средняя длина цепи полиР во фракциях полиР 1, полиР2 и полиРЗ у мутантного штамма меньше, чем у родительского. Для остальных фракций

различий в длине цепи между родительским штаммом и мутантом не обнаружено (рис. 2). Таким образом, у мутантного штамма наблюдается уменьшение длины цепи полиР тех фракций, для которых показано снижение их содержания по сравнению с родительским штаммом. Вероятно, уменьшение содержания и длины цепи полиР связано со снижением уровня их синтеза, из-за недостатка энергообеспечения клетки вследствие неспособности мутантов к окислительному фосфорилированию.

Известно, что при культивировании на глюкозе, митохондрии 5. cerevisiae, а также функционально незрелые промитохондрии содержат полиР [Пестов, 2004].

Чтобы ответить на вопрос, связано ли содержание полиР в митохондриях с активностью АТФсинтетазы этих органелл, получили фракцию митохондрий из клеток штаммов D273 и N417, выращенных до стационарной стадии роста.

Гидролазная активность АТФазы митохондрий (табл. 2) у мутанта сохранена, что согласуется с литературными данными [Heïfenbein et al, 2003]. У обоих штаммов азид натрия, известный ингибитор митохондриальной АТФазы, подавлял эту активность на 90%, что указывает на отсутствие примесей других органелл и мембран, содержащих АТФазы, в полученном препарате митохондрий. Экзополифосфатазная активность в изолированных митохондриях штаммов D273 и N417 сходна (табл. 2).

Рис. 2. Электрофорез полифосфатов различных фракций, полученных из клеток S. cerevisiae на стационарной стадии роста. 1 — родительский штамм D273. 2 - штамм Е232, мутантный по гену АТР22. 15,25,45,188 - полнфосфаты-метчики со средней длиной цепи 15, 25, 45 и 188

15 25 45 188 полиР! полиР2 полиРЗ полиР4 полиР5

В митохондриях мутанта выявлено лишь незначительное снижение содержания полиР (табл. 2), участие которых в метаболизме полиР в клетке требует дальнейших исследований. Таким образом, в отличие от целых клеток, во фракции митохондрий не найдено существенного влияния отсутствия АТФсинтазной активности на содержание полиР.

Таблица 2. Количество полиР и активность ферментов фосфорного метаболизма в изолированных митохондриях штаммов дрожжей Э273 и N417

Штамм АТФазная активность, Е/мг белка Экзополифосфатазн ая активность, Е/мг белка ПолиР, мкмоль Р/мг белка

тъ, родительский 0,45 ±0,03 0,16 ±0,01 0,102 ±0,006

N417, мутантный 0,36+0,017 0,14 ±0,008 0,077 ±0,01

По-видимому, синтез полиР в митохондриях не связан с АТФ-синтетазной активностью. Можно предположить, что на мембране этих дефектных митохондрий всё же образуется некоторый потенциал, который может быть использован для синтеза полиР [Пестов, 2004]. С другой стороны, не исключено, что полиР митохондрий синтезируются в других компартментах клетки и потом транспортируются в эти органеллы. В настоящий момент вопрос о механизмах биосинтеза полиР в митохондриях не решен и требует дальнейших исследований.

Таким образом, мутация в гене АТР22, которая нарушает синтез АТФ в митохондриях, вызывает снижение способности клеток дрожжей накапливать полиР в стационарной стадии роста, в первую очередь, за счет кислоторастворимой фракции полиР1 и щелочерастворимой фракции полиРЗ. Это указывает на тесную взаимосвязь накопления полиР и способности клеток дрожжей к окислительному фосфорилированию на уровне дыхательной цепи. Взаимосвязь синтеза полифосфатов и образования АТФ в клетках дрожжей, по-видимому, не является прямой. Однако, имеется ряд данных, указывающих на возможность синтеза этих полимеров за счет электрохимического градиента на мембранах [Кулаев и др., 2005], образование

и

которого на цитоплазматической и вакуолярной мембранах обеспечивается за счет энергии АТФ. Не исключено также существование дополнительных регуляторных механизмов, обеспечивающих зависимость синтеза полифосфатов от концентрации АТФ, поскольку для этого синтеза требуется большое количество энергии.

2. Влияние мутации в гене РМА1, снижающей активность Н+-АТФазы плазматической мембраны, на содержание u длину цепи полифосфатов различных фракций у S. cerevisiae

Н+-АТФаза плазматической мембраны - жизненно важный фермент дрожжей. Мутации, приводящие к значительному нарушению его функции, детальны. Поэтому в качестве объекта исследования был выбран мутант Т850А (по гену РК1А1, кодирующему эту АТФазу), у которого активность фермента снижена на 50%. Штамм с мутацией в гене РМА1 не демонстрировал существенных отличий от родительского штамма по скорости роста и выходу биомассы (рис. 3). В таблице 3 представлены данные по активности плазматической НГ-АТФазы у родительского и мутантного штаммов in situ. У мутантного штамма эта активность снижена на -50% как на стационарной, так и на логарифмической стадии роста. Снижение активности у обоих штаммов на стационарной стадии роста является характерным для данного фермента и связано с так называемым «глюкозным эффектом» [Petrov et al, 2000].

Рис. 3. Кривые роста различных штаммов 5. сегеушае при культивировании на среде УРБ.

• - родительский штамм N¥13. о - штамм Т850А

10 20 Время роста, час

Таблица 3. Активность АТФазы плазматической мембраны штаммов дрожжей N¥13 и Т850А на логарифмической и стационарной стадиях роста.

Штаммы дрожжей Активность АТФазы плазматической мембраны, Е/г сырой биомассы

Логарифмическая стадия роста Стационарная стадия роста

N¥13 46,6 33,4

Т850А 26,0 16,7

Для экстракции полиР использовали клетки конца логарифмической стадии роста -15 ч (рис. 3, точка А) и клетки стационарной стадии роста - 24 ч (рис. 3, точка Б). Данные по содержанию полиР в клетках родительского и мутантного штаммов представлены в таблице 4.

В клетках, находящихся на логарифмической стадии роста, содержание полиР различных фракций у мутанта было практически одинаковым с таковым у родительского штамма. На стационарной стадии общее содержание полиР также было одинаковым у обоих штаммов, однако произошло некоторое перераспределение между фракциями. Содержание полиР в кислоторастворимой фракции полиР 1 у мутанта оказалось меньшим, чем у родительского штамма, а фракций полиР2 и полиРЗ, соответственно, - большим (табл. 4). Вопрос о том, чем обусловлено это перераспределение доли отдельных фракций в общем пуле полифосфатов, наблюдаемое у мутанта, может представлять интерес для дальнейших исследований.

Электрофорез полиР, полученных из клеток, находящихся на стационарной стадии роста, не выязил различий в длине цепи полиР между мутантным и родительским штаммом, и средняя длина цепи фракций соответствовала литературным данным. Таким образом, у мутанта в стационарной стадии роста возросло содержание более длинноцепочечных фракций, и соответственно уменьшилось содержание короткоцепочечных.

Исходя из полученных данных, можно предположить, что функционирование Н^АТФазы плазматической мембраны мало вовлечено в метаболизм полиР, независимо от стадии роста. Общее содержание полиР у обоих штаммов практически одинаково как на логарифмической, так и на стационарной стадиях. Более того,

сопоставляя данные таблиц 3 и 4, можно видеть, что общее содержание полиР у обоих штаммов увеличивается на стационарной стадии роста по сравнению с логарифмической стадией, в то время как активность Н+-АТФазы плазматической мембраны, наоборот, снижается.

Таблица 4. Содержание полиР в клетках дрожжей 5. сегеу/'л'ае ЫУ13 и Т850А на логарифмической и стационарной стадиях роста (мкмоль Р/г сырой биомассы), среда УРБ с 10 мМ Р„

Фракции Штаммы дрожжей

полифосфатов N¥13, родительский штамм Т850А, штамм с нарушением функционирования плазматической АТФазы

Логарифмическая Стационарная Логарифмическая Стационарная

стадия стадия стадия стадия

Р1 26,5 ±2,8 14,7 ±0,8 26,7 ±2,5 14 ±2,0

полиР1 29,4 ±1,7 25,3 ±2,4 22,35 ±1,6 15,8 ±1,0

полиР2 26,3 ±3,0 34 ±2,8 26,9 ±3,1 39 ±4,0

полиРЗ 15,25+0,8 19 ±2,1 13.2 +0.6 24,9 ±2,5

полиР4 0,46 ±0,1 0.754 ±0,12 0,338 ±0,1 0,714 ±0,09

полиР5 1,6+0,2 2,5 ±0,21 1,54+0,18 2,6 ±0,3

ЕполиР2+полиРЗ 41,5 53 40,1 63.9

£ полиР 73,0 +6,0 82,0 +7,8 64,0 +5,2 83,0+8,1

Предположительно, М'-АТФаза плазматической мембраны могла бы быть вовлечена в обмен полиР на двух уровнях: во-первых, за счет энергообеспечения поглощения Р, из среды, а во-вторых, за счет использования потенциала на плазматической мембране для биосинтеза полиР. Данные таблицы 4 показывают, что содержание Р; у мутантного штамма не отличается от родительского. Следует учесть, что в данных экспериментах мы использовали высокую концентрацию ^ в среде, при которой наблюдается в основном его пассивный транспорт [Трилисенко и др., 2003]. Кроме того, вполне возможно, что 50% уровня активности АТФазы достаточно для обеспечения активного транспорта Р,.

3. Влияние мутации в гене VMA2, нарушающей протон-транслоцирующуго активность вакуолярной Н+-АТФазы, на особенности метаболизма полифосфатов у S. cerevisiae в условиях избытка и недостатка полиР

Особый интерес представляет изучение особенностей метаболизма полиР у мутантов с нарушенной энергизацией вакуолярной мембраны. Это связано с обнаружением способности белка этой мембраны Vtc4p к синтезу полиР [Hothom et al., 2009]. Мутанты по различным субъединицам V-АТРазы, фермента, обеспечивающего энергизацию вакуолярной мембраны, широко изучаются [Milgrom et al., 2007], однако влияние таких мутаций на метаболизм полиР ранее не исследовали.

В данной части исследования использованы штаммы BY 4741 (родительский штамм) и BY 4741 Ута2Д (мутант по гену УМА2, кодирующему белок b субъединицы vi домена вакуолярной АТРазы) [Капе, 2007]. Кривые роста штаммов S. cerevisiae приведены на рис. 4. Из клеток обоих штаммов были выделены вакуоли с помощью флотации в градиенте концентрации фиколла и установлено, что у мутантного штамма нарушена способность вакуолярной АТФазы к образованию градиента ионов водорода на мембране этих органелл (рис. 5).

Для экстракции полиР использовали клетки стационарной стадии роста - 24 ч (рис. 4, точка А) для обоих штаммов, клетки стадии активного роста в условиях гиперкомпенсации полиР (кривая роста не показана). А так же клетки конца логарифмической стадии роста -17 ч для родительского штамма (рис. 4, точка Б) и 19 ч для мутантного штамма (рис. 4, точка В).

Данные по содержанию P¡ и полиР в клетках родительского и мутантного штамма на стационарной стадии роста представлены в таблице 5. Родительский штамм содержал в 1,5 раза больше P¡ и в 5 раз больше полиР, чем мутантный. Таким образом, в отличие от предыдущих пар мутант-родитель, здесь наблюдается снижение содержания Р, в клетках мутанта. Содержание полиР 1 и полиРЗ у мутанта по сравнению с родительским штаммом оказалось меньше более чем в 5 раз, полиР2 - в 10 раз. Содержание фракции полиР4 у обоих штаммов было практически

одинаковым, что согласуется с представлением о том, что эта фракция локализована в клеточной оболочке и пути ее метаболизма отличаются от таковых для других фракций [Вагабов и др., 2000].

Рис. 4. Кривые роста различных штаммов 5. сегехчпае при культивировании на среде \ТО.

• - штамм В У 4741, о - штамм В У 4741 Уша2Д

Время роста. час

АТФ Мд

1 мин

Рис. 5. Образование АрН на мембране изолированных вакуолей различных штаммов 5. сетехчйае. Измерения проводили по гашению флуоресценции 9-амино-6-хлор-2-метоксакридина в 10 мМ \lES-NaOH, рН 7,2, содержавшем 2 мМ \lgS04. Реакцию начинали добавлением 2 мМ АТФ

1 - вакуоли из клеток родительского штамма,

2 - вакуоли из клеток штамма Ута2Д

Таким образом, содержание полир отдельных фракций сократилось при данной мутации в неодинаковой степени. Наиболее стабильными и независящими от функционирования вакуолярной Н+-АТФазы оказались фракции полиР 1 и полиР4, а также фракция полиР5, которая характеризуется низким уровнем в наших экспериментах.

Электрофорез показал что средняя длина цепи полиР 1 у мутантного и родительского штаммов составляла -15 фосфатных остатков, что сходно с другими

штаммами дрожжей [Vagabov et al., 2008]. Средняя длина цепи полиР2 также была ~15 фосфатных остаток у обоих штаммов. Средняя длина полиРЗ у родительского штамма составила 45-75, а у мутанта 15-30 фосфатных остатков.

Таблица 5. Содержание полиР в клетках дрожжей 5. сегеуйше ВУ 4741 и ВУ 4741 Ута2Д на стационарной стадии роста (мкмоль Р/г сырой биомассы), среда УРО с 10 мМ Р;.

Фракции полифосфатов Штаммы дрожжей

В Y 4741, родительский штамм ВУ 4741 Vma2A, штамм с нарушением функционирования вакуолярной АТРазы

P¡ 16,3 ±3,0 10,4 ±1,4

полиР1 76 ±10,0 14 ±1,5

полиР2 19 ±3,0 1,8 ±0,14

полиРЗ 19 ±3,0 3,6 ±0,4

полиР4 2,6 ±0,3 2,4 ±0,3

полиР5 0,77+0,1 0,51 ±0,02

£полиР 118,0 ±10,0 23,0 ±3,0

Учитывая, что содержание полиР у мутанта на логарифмической стадии роста оказалось весьма низким и неудобным для анализа, для изучения влияния мутации в гене УМЛ2 на содержание полиР на стадии активного роста мы выбрали условия гиперкомпенсации полиР, для которых характерно значительное увеличение содержания полиР. Мутация не препятствовала расходованию полиР при культивировании на среде с дефицитом Р|. (табл. 6). В результате и содержание Р; и содержание полиР стало близким у обоих штаммов.

После переноса клеток, голодавших по Рь на полноценную среду, накопление полиР происходило в клетках обоих штаммов. Суммарное накопление полиР в этих условиях у мутанта оказалось более чем в 3 раза меньшим, чем у родительского штамма. У мутанта, в отличие от родительского штамма, на стадии активного роста существенно накапливалась только фракция полиР 1, в то время как содержание полиР2 даже уменьшалось, а содержание остальных фракций возрастало незначительно.

Таблица 6. Содержание полиР в клетках дрожжей 5. сеге\>тае ВУ 4741 и В У 4741 Ута2Д при культивировании в условиях голодания по фосфору, гиперкомпенсации полиР в течение 1 ч (мкмоль Р/г сырой биомассы)

Фракции полифосфатов Штаммы дрожжей

ВУ 4741 ВУ 4741 Уша2Д

Дефицит Р| Гиперкомпенсация Дефицит Pi Гиперкомпенсация

А 9,63 ±1,0 25,4 ±2,7 9,06+0,8 18,6 ±2,0

полиР1 1,27 ±0,15 36,4 ±3,4 0,19 ±0,02 18,4 ±1,7

полиР2 7,51 ±0,8 40,8 ±3,7 5,28 ±0,48 3,65 ±0,4

полиРЗ 2,89 ±0,3 23,7 ±2,1 2,25 ±0,24 5,52 ±0,6

полиР4 1,56 ±0,17 5,12 ±0,55 1,61 ±0,18 3,24 ±0,34

полиР5 0,894 ±0,1 0,3 ±0,02 0,515 ±0,06 0,544 ±0,064

I полиР 14,1 ±1,5 106,3 ±9,7 9,84 ±1,0 31,3 ±0,28

Таким образом, мутация в гене УМЛ2, которая приводит к отсутствию электрохимического градиента ионов водорода на вахуолярной мембране, вызывает значительное снижение способности клеток дрожжей накапливать полиР как на стационарной стадии роста, так и на стадии активного роста. Это указывает на взаимосвязь синтеза этих полимеров и энергизации вакуоляркой мембраны. Полученные данные позволяют предположить, что в наибольшей степени с состоянием энергетики вакуолярной мембраны связано накопление полиР фракций полиРЗ и полиР2. Но в клетке, по-видимому, существует независимая от электрохимического градиента Н* на вакуолярной мембране система синтеза полиР, которая в первую очередь ответственна за накопление короткоцепочечных полиР 1. Для уточнения того, зависит ли синтез полиР 1 от электрохимических градиентов на других мембранах, было изучено влияние протонофора БССР на их накопление. В условиях гиперкомпенсации РССР (10 мкМ) подавлял накопление полиР1 у мутанта на 50%, а у родительского штамма на 30%. Можно предположить, что, по крайней мере часть полиР1 синтезируется независимо от электрохимического потенциала ионов Н* не только на вакуолярной, но и на других мембранах.

Заключение

В таблице 7 приведены сравнительные данные о влиянии мутаций, нарушающих функционирование основных протонных АТФаз дрожжей Я. сеге\'тае (митохондриальной АТФазы, ЬГ-АТФазы плазматической мембраны, Б^-АТФазы вакуолей) на суммарное содержание Р, и полиР в клетках 5. сггеушае. Можно заключить, что наблюдаемые изменения в содержании полиР не связаны с недостатком содержания Р| в клетках.

Наиболее значительные нарушения в обмене полиР обнаружены при мутации, приводящей к деэнергизации вакуолярной мембраны, что свидетельствует о значительной роли этих органелл в биосинтезе полиР у дрожжей. В то же время, полученные данные свидетельствуют о существовании у дрожжей систем синтеза полиР, не связанных с электрохимическим потенциалом как на вакуолярной, так и на других мембранах и ответственной в первую очередь за синтез низкомолекулярных полифосфатов.

Таблица 7. Общее содержание полифосфатов и ортофосфата мутантных штаммов в процентах от значения у соответствующего родительского штамма на логарифмической и стационарной стадиях роста.

Штаммы 2 полиР и Р1 мутантных штаммов в % от значения у соответствующего родительского штамма

Логарифмическая стадия роста Стационарная стадия роста

ЕполиР Р1 Е полиР

Е232 штамм с нарушенным синтезом АТФ в митохондриях 83% 91% 40% 170%

Т850А штамм с нарушением функционирования плазматической ЬГ-АТФазы 88% 100% 100% 100%

ВУ 4741 Уша2А штамм с нарушением функционирования вакуолярной ЬГ-АТФазы 30% 73% 20% 64%

Выводы

1. Нарушение синтетазной функции АТФазы митохондрий ЗассЬаготусея сеге\ч$'ше, вызванное мутацией в гене АТР22, приводит к снижению содержания и длины цепи неорганических полифосфатов в целых клетках на стационарной стадии роста по сравнению с родительским штаммом, в первую очередь за счет кислоторастворимой фракции и первой щелочерастворимой фракции, что указывает на возможную роль окислительного фосфорилирования на уровне дыхательной цепи в накоплении этих фракций.

2. Содержания полифосфатов в митохондриях 5ассУхаготусеь сеге\''шае мало зависит от мутаций, нарушающих функционирование митохондриальной АТФ-синтетазы.

3. Мутация в гене РМА1, вызывающая снижение активности Н+-АТФазы плазматической мембраны вдвое, не оказывает выраженного влияния на содержание и длину цепи полифосфатов различных фракции в клетках БассИаготусез сегеуШае.

4. Нарушение протон-транслоцирующей активности вакуолярной КГ-АТФазы, вызванное мутацией в гене УМА2, приводит к значительному снижению накопления и длины цепи полифосфатов в клетках БассЬаготусез сегеу/яюе независимо от стадии роста и содержания фосфата в среде, что свидетельствует о важной роли энергизации вакуолярной мембраны в накоплении этих полимеров.

5. Мутация, нарушающая знергизацию вакуолярной мембраны, по-разному влияет на содержание полифосфатов отдельных фракций: не сказывается на содержании щелочерастворимой фракции полиР4, локализованной в клеточной оболочке, приводит к уменьшению содержания солерастворимой фракции полиР2 и щелочерастворимой фракции полиРЗ до уровня, наблюдаемого при фосфорном голодании, а накопление фракции полиР 1 сохраняется, хотя в менъшей степени относительно родительского штаммеч.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. A.A. Томашевский, Л.П. Рязанова, Т.В. Кулаковская И.С. Кулаев.. Неорганические полифосфаты у дрожжей Saccharomyces cerevisiae при мутации, нарушающей функции АТРазы вакуолей. Биохимия, 2010, Т. 75, Х»8, С. 1052-1054

2. A.A. Томашевский, Л.П. Рязанова, Т.В. Кулаковская, И.С. Кулаев. Неорганические полифосфаты различных фракций у мутантов дрожжей Saccharomyces cerevisiae с нарушенным синтезом АТФ в митохондриях. Микробиология, 2010, Т. 79, №1, С. 30-33

3. Кулаковская Т.В., Вагабов В.М., Томашевский A.A., Бреус H.A., Кулаев И.С. Неорганические полифосфаты в регуляции фосфорного и энергетического метаболизма у дрожжей. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2010, №1, С. 24-25

4. Томашевский A.A. Неорганические полифосфаты различных фракций у мутантов дрожжей Saccharomuces cerevisiae, дефектных по АТФазам митохондрий и вакуолей. Биология-наука 21"™ века (Тезисы докладов. 13'" Пущинская конференция молодых ученых). Пущино. 2009. С. 84.

5. Томашевский A.A. Неорганические полифосфаты различных фракций у мутантов дрожжей Saccharomuces cerevisiae, дефектных по АТФазе вакуолей. Биология-наука 21"го века (Тезисы докладов. 14"* Пущинская конференция молодых ученых). Пущино. 2010. С. 63.

6. Alexander A. Tomashevsky, Valéry V. Petrov. Point mutation in M9-M10 loop of the yeast Pmal H^-ATPase affects both ATPase fijnctioning and polyphosphate (PolyP) distribution. Journal of biomolecular structure & dynamics. 2011, V. 28, P. 1025-1026.

Подписано в печать:

29.04.2011

Заказ № 5441 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Томашевский, Александр Андреевич

Введение

Часть 1. Обзор литературы

Глава 1. Метаболизм и функции полифосфатов у низших эукариот.

1.1. Полифосфаты у дрожжей 10 1.1.1. Ферменты метаболизма полифосфатов у дрожжей. 10 1.1.2 Полифосфаты как фосфорный резерв у дрожжей.

1.1.3. Роль полифосфатов в формировании и функционировании клеточной оболочки

1.1.4. Полифосфаты и биоэнергетические процессы в клетках дрожжей.

1.1.5. Роль полифосфатов в накоплении и детоксикации катионов

1.1.6. Влияние различных мутаций на полифосфаты у дрожжей.

1.2. Особенности метаболизма и функций неорганических полифосфатов у мицелиальных грибов.

1.3. Полифосфаты у слизевиков.

1.4. Полифосфаты у простейших.

1.5. Полифосфаты у водорослей.

Глава 2. Полифосфаты у животных и перспективы их изучения и использования в медицине.

2.1. Полифосфаты и апоптоз у животных.

2.2. Полифосфаты и мембранный транспорт у животных.

2.3. Влияние полифосфатов на активность ферментов у животных.

2.4. Полифосфаты в костной ткани.

2.5. Полифосфаты в крови. 44 Часть 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Состав среды и условия культивирования.

2.3. Условия гиперкомпенсации.

2.4. Получение сферопластов из дрожжевых клеток.

2.5. Выделение митохондрий.

2.6. Фракционирование клеток дрожжей.

2.7. Выделение вакуолей.

2.8. Определение ферментативных активностей

2.9. Определение активности АТФазы плазматической мембраны in situ.

2.10. Экстракция неорганических полифосфатов.

2.11. Осаждение неорганических полифосфатов в виде нерастворимых солей бария.

2.12. Электрофорез неорганических полифосфатов в ПААГ.

2.13. Определение ортофосфата.

2.13. Определение белка.

2.14. Определение образования АрН на мембране изолированных вакуолей. 60 Часть 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Неорганические полифосфаты у дрожжей при мутациях, нарушающих функционирование АТФсинтетазы митохондрий

3.1.1. Влияние мутаций в гене АТР22 на содержание полифосфатов различных фракций у S. cerevisiae

3.1.2. Влияние мутаций в гене АТР22 на длину цепи полифосфатов

3.1.3. Полифосфаты и ферментативные активности в изолированных митохондриях.

3.2. Полифосфаты у дрожжей с нарушением функционирования АТФазы плазматической мембраны.

3.2.1. Содержание Полифосфатов у дрожжей с нарушением функционирования АТФазы плазматической мембраны.

3.2.2. Влияние мутации в гене РМА1 на длину цепи полифосфатов.

3.3. Полифосфаты у дрожжей с нарушением функционирования вакуолярной АТФазы.

3.3.1. Особенности штамма S. cerevisiae с делецией в гене VMA2.

3.3.2. Снижение содержания полифосфатов у дрожжей с нарушением функционирования вакуолярной АТФазы.

3.3.3. Влияние мутации в гене VMA2 на длину цепи полифосфатов.

3.3.4. Полифосфаты у дрожжей с нарушением функционирования-вакуолярной АТФазы в условиях фосфорного голодания и гиперкомпенсации полифосфатов.

3.3.5. Влияние РССР на содержание полифосфаты у дрожжей с нарушением функционирования вакуолярной АТФазы.

3.3.6. Фракционирование дрожжевых клеток и оценка локализации полифосфатов. 87 Заключение 90 Выводы 94 Список литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Томашевский, Александр Андреевич

ВЫВОДЫ

1. Нарушение синтетазной функции АТФазы митохондрий Saccharomyces cerevisiae, вызванное мутацией в гене АТР22, приводит к снижению содержания и длины цепи неорганических полифосфатов в целых клетках на стационарной стадии роста по сравнению с родительским штаммом, в первую очередь за счет кислоторастворимой фракции и первой щелочерастворимой фракции, что указывает на возможную роль окислительного фосфорилирования на уровне дыхательной цепи в накоплении этих фракций.

2. Содержания полифосфатов в митохондриях Saccharomyces cerevisiae мало зависит от мутаций, нарушающих функционирование митохондриальной АТФ-синтетазы.

3. Мутация в гене РМА1, вызывающая снижение активности Нн-АТФазы плазматической мембраны вдвое, не оказывает выраженного влияния на содержание и длину цепи полифосфатов различных фракции в клетках Saccharomyces cerevisiae.

4. Нарушение протон-транслоцирующей активности вакуолярной H -АТФазы, вызванное мутацией в гене VMA2, приводит к значительному снижению накопления и длины цепи полифосфатов в клетках Saccharomyces cerevisiae независимо от стадии роста и содержания фосфата в среде, что свидетельствует о важной роли энергизации вакуолярной мембраны в накоплении этих полимеров.

5. Мутация, нарушающая энергизацию вакуолярной мембраны, по-разному влияет на содержание полифосфатов отдельных фракций: не сказывается на содержании щелочерастворимой фракции полиР4, локализованной в клеточной оболочке, приводит к уменьшению содержания солерастворимой фракции полиР2 и щелочерастворимой фракции полиРЗ до уровня, наблюдаемого при фосфорном голодании, а накопление фракции полиР 1 сохраняется, хотя в меньшей степени относительно родительского штамма.

95

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как уже отмечалось в обзоре литературы, в работе Ргетоэег е1 а1. (2006) было изучено влияние многих мутаций, в том числе и в генах вакуолярной АТФазы на метаболизм полиР у дрожжей. Однако полученные ими результаты дают лишь ориентировочную оценку, влияния тех или иных белков на обмен полиР. Для более полного понимания проблемы необходимы более детальные исследования.

В данной работе впервые проведено систематическое сравнение влияния мутаций, нарушающих функционирование основных протонных АТФаз дрожжей сегеутае (митохондриальной АТФазы, Н+-АТФазы плазматической мембраны, Н+-АТФазы вакуолей) на содержание и длину цепи неорганических полифосфатов различных фракций, характеризующихся неодинаковой степенью полимерности и зависимостью от стадии роста и содержания фосфата в среде.

Данные по общему содержанию полифосфатов и ортофосфата у мутантных штаммов в процентах от значения у соответствующих родительских штаммов представлены в таблице 14.

Из данных таблицы можно сделать вывод, что наблюдаемые изменения в содержании полиР не связаны с недостатком содержания Р,.

Были также проведены эксперименты по определению суммарной экзополифосфатазной активности в клетках всех исследованных штаммов. Оказалось, что у штаммов с мутациями в генах митохондриальной АТФазы и Н -АТФазы вакуолей экзополифосфатазная активность такая же как и у родительских штаммов, а у мутанта по Н -АТФазе плазматической мембраны она даже несколько снижена. Таким образом, нет оснований полагать, что наблюдаемые изменения в содержании полиР связаны с усилением гидролиза данных полимеров (табл. 15).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Томашевский, Александр Андреевич, Пущино

1. Андреева H.A., Окороков J1.A. (1990) Некоторые свойства высокоочищенной полифосфатазы клеточной оболочки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 55, 2286-2292.

2. Андреева H.A., Окороков Л.А., Кулаев И.С. (1990) Очистка и некоторые свойства полифосфатазы клеточной оболочки дрожжей Saccharomyces carlsbergensis. Биохимия, 55, 1094-1103.

3. Андреева H.A., Личко Л.П., Кулаковская Т.В., Окороков Л.А. (1993) Характеристика полифосфатазной активности вакуолей дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 58, 1053-1061.

4. Андреева H.A., Кулаковская Т.В., Кулаев И.С. (1996) Очистка и характеристика полифосфатазы из цитозоля S. cerevisiae. Биохимия, 61, 1714-1724.

5. Андреева Н. А., Кулаковская Т.В., Кулаев И.С. (2001). Две экзополифосфатазы цитозоля дрожжей S. cerevisiae-. сравнительная характеристика. Биохимия, 66, 187-194.

6. Андреева H.A., Кулаковская Т.В., Кулаев И.С. (2004). Очистка и свойства экзополифосфатазы цитозоля Saccharomyces cerevisiae, не кодируемой геном РРХ1. Биохимия, 69, 480-487.

7. Андреева H.A., Кулаковская Т.В., Кулаев И.С. (2006). Высокомолекулярная экзополифосфатаза цитозоля Saccharomyces cerevisiae кодируется геном PPN1. Биохимия, 71, 1198-1201.

8. Белозерский А.Н., Кулаев И.С. (1957) Полифосфаты и их значение для процессов развития Aspergillus niger. Биохимия, 22, 29-39.

9. Бирюкова Е.А., Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. (2006) Устойчивость дрожжей Yarrowia lipolyica к окислительному стрессу. Микробиология. 75, №3, 293-298

10. Бирюкова Е.А., Меденцев А.Г., Аринбасарова АЛО., Акименко В.К. (2007) Адаптация дрожжей Yarrowia lipolyica к тепловому стрессу. Микробиология. 76, №2, 184190

11. Бирюкова Е.А. (2007) Адаптация дрожжей Yarrowia lipolyica к стрессовым воздействиям. Дисс. канд. биол. наук., Пущино.

12. Бобык М.А., Кулаев И.С. (1971) Обнаружение у Neurospora crassa нового фермента -1,3-дифосфоглицерат:полифосфатфосфотрансферазы. Биохимия, 36, 426-429.

13. Бейли Н. (1959) Статистические методы в биологии. Мир. 26-34

14. Вагабов В.М., Серенков Г.П. (1963) Исследование полифосфатов вдвух видах зеленых водорослей. Вести. МГУ (Биол. Почв.) 4, 38-43.

15. Вагабов В.М., Кулаев И.С. (1964) Неорганические полифосфаты в корнях кукурузы. Докл. АН СССР, 158, 218-219.

16. Вагабов В.М., Циоменко А.Б., Шабалин Ю.А. (1973) Изучение взаимосвязи метаболизма полифосфатов и маннана у дрожжей. ОНТИ НЦБИ, Пущино, 144-155.

17. Вагабов В.М. (1988) Биосинтез углеводных компонентов клеточной стенки дрожжей. ОНТИ НЦБИ. Пущино.

18. Вагабов В.М., Чемоданова О.В., Кулаев И.С. (1990) Влияние неорганических полифосфатов на величину отрицательного заряда клеточной оболочки дрожжей. Докл. АН СССР, 313, 989-992.

19. Вагабов В.М., Трилисенко Л.В., Щипанова И.Н., Сибельдина Л.А., Кулаев И.С. (1998). Изменение длины цепи неорганических полифосфатов в зависимости от стадии роста <Saccharomyces cerevisiae. Микробиология. T. 67. С. 193-198.

20. Вагабов В.М., Трилисенко Л.В., Кулаев И.С. (2000). Зависимость длины цепи неорганических полифосфатов от содержания ортофосфата в среде у дрожжей. Биохимия, 65, 414-420.

21. Вагабов В.М., Трилисенко JI.B., Кулаковская Е.В., Кулаев И.С. (2008). Содержание неорганических полифосфатов при росте Saccharomyces cerevisiae на разных источниках углеродного питания и при разном содержании Ог в среде. Микробиология. 77. 611-616.

22. Игамназаров Р.П., Валиханов М.Н. (1980) Гидролиз конденсированных фосфатов внеклеточной фосфогидролазой корневой системы хлопчатника. Физиология растений, 227, 1947-1951.

23. Крицкий М.С., Белозерская Т.А., Кулаев И.С. (1968) О взаимоотношении обмена РНК и полифосфатов у некоторых грибов. Докл.АН СССР, 180, 746-748.

24. Крицкий М.С., Белозерская Т.А. (1968) Кислоторастворимые нуклеотиды и нуклеиновые кислоты в плодовых телах гриба Lentinus tigrinus с различными морфогенетическими особенностями. Биохимия, 33, 874-879.

25. Крицкий М.С., Чернышева Е.К., Кулаев И.С. (1972) Изучение полифосфат деполимеразной активности в клетках гриба Neurospora crassa. Биохимия, 37, 983-995.

26. Кулаев И.С. (1956) Полифосфаты и их роль в процессе развития некоторых плесневых грибов. Дисс. канд. бтл. наук, М

27. Кулаев, И.С., Белозерский А.Н. (1958) Электрофоретическое изучение полифосфатно-рибонуклеиновых комплексов из Aspergillus niger. Докл. АН СССР, 120, 1080-1083.

28. Кулаев И.С. Белозерский А.Н. Мансурова С.Э. (1959) Изучение обмена полифосфатов при глубинном культивировании Pénicillium chrysogenum Q-176. Биохимия, 24, 253-262.

29. Кулаев, И.С., Белозерский А.Н. (1962а) Конденсированные неорганические фосфаты в обмене веществ живых организмов. Ч. I. Изв. АН СССР, 3. 354-368

30. Кулаев, И.С., Белозерский А.Н. (19626) Конденсированные неорганические фосфаты в обмене веществ живых организмов. Ч. II. Изв. АН СССР, 3, 502-521

31. Крицкий М.С., Кулаев И.С. (1963) Кислоторастворимые нуклеотиды плодовых тел шампиньона Agaricus bisporus. Биохимия, 18, 694-698.

32. Крицкий М.С., Кулаев И.С., Клебанова Л.М., Белозерский А.Н. (1965) О двух путях транспорта фосфора в плодовых телах шампиньона двуспорового {Agaricus bisporus). Докл. АН СССР, 160, 949-951.

33. Кулаев И.С., Урысон С.О. (1965) Изучение свободных нуклеотидов и других фосфорных соединений в обмене веществ спорыньи Claviceps paspali. Биохимия, 30, 282290.

34. Кулаев И.С., Вагабов В.М. (1967) Влияние условий выращивания на обмен полифосфатов и некоторых других фосфорных соединений у Scenedesmus obliquus. Биохимия, 32, 253-264.

35. Кулаев И.С., Афанасьева Т.П. (1970) О физиологической роли неорганических полифосфатов у дрожжей Endomyces magnusii. Докл. АН СССР, 192, 668-671.

36. Кулаев И.С., Бобык М.А., Николаев Н.Н., Сергеев Н.С., Урысон С.О. (1971) О полифосфатсинтезирующих ферментах некоторых грибов и бактерий. Биохимия, 36, 943948.

37. Кулаев И.С. Коношенко Г. (1971) О локализации 1,3- дифосфоглицерат: поли-фосфатфосфотрансферазы в клетках Neurospora crassa. Докл. АН СССР, 200, 10-11.

38. Кулаев И.С., Вагабов В.М., Циоменко А.Б. (1972) О корреляции накопления полисахаридов клеточной стенки и некоторых фракций высокомолекулярных полифосфатов у дрожжей. Докл. АН СССР, 204, 734-736.

39. Кулаев И.С., Рожанец В.В.,Кобылянский А.Г.,Филиппович Ю.Б. (1974 ) Обнаружение пирофосфата и других полифосфатов у некоторых насекомых. Жури. Эвол. Биохгш. Физиол., 10, 147-152.

40. Кулаев И.С. (1975) Биохимия неорганических полифосфатов. Москва. Изд. МГУ.

41. Кулаев И.С., Рубцов П.М. Броммер Б. Языков A.A. (1975) Изучение высокомокулярных полифосфатов на разных стадиях развития Acetabularia crenulata. Физиология растений, 22, 537-543.

42. Кулаев И.С. (1986) Некоторые биоэнергетические аспекты антибиотикообразования. В сб. «Мехинизмы биосинтеза антибиотиков» (Ред. Г.К Скрябин, С.М. Навашин) М. Наука, с. 46-54.

43. Кулаев И.С., Вагабов В.М.,Кулаковская Т.В., Личко Л.П., Андреева H.A., Трилисенко Л.В. (2000) Развитие идей А.Н.Белозерского по биохимии полифосфатов. Биохимия, 65, 325-333.

44. Кулаев И.С., Вагабов В.М., Кулаковская Т.В. (2005). Высокомолекулярные неорганические полиР: биохимия, клеточная биология, биотехнология. М.: Научный мир, 216.

45. Кулаковская Т.В. (1985) Н+-АТФаза и транспорт ионов через вакуолярную мембрану дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Дисс. канд. биол. наук., Пущино.

46. Кулаковская Т.В., Андреева H.A., Кулаев И.С. (1997) Аденозин-5'-тетрафосфат и гуанозин-5'-тетрафосфат новые субстраты экзополифосфатазы цитозоля дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 62,1225-1227.

47. Кулаковская Т.В., Андреева H.A., Трилисенко Л.В., Суетин C.B., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (2005) Накопление полифосфатов и экспрессия высокомолекулярной экзополифосфатазы у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 70, 1186-1192.

48. Куликовская Т.В., Трилисенко JI.B., Личко Л.П., Вагабов В.М., Куласв И.С. (2006) Влияние инактивации генов экзополифосфатазы РРХ1 и PPN1 на содержание1.полифосфатов различных фракций у Saccharomyces cerevisiae. Микробиология, 75, № 1, 35i

49. Личко Л. П., Кулаковская Т. В.,Кулаев И. С. (2000) Очистка и характеристика растворимой полифосфатазы из митохондрий Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 65, 421427.

50. Личко Л. П., Пестов Н. А., Кулаковская Т. В., Кулаев И. С. (2003). Инактивация гена, кодирующего экзополифосфатазу РРХ1, приводит к изменению спектра экзополифосфатаз цитозоля и митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 68, 902-910.

51. Личко Л.П., Кулаковская Т.В., Пестов H.A., Кулаев И.С. (2006) Инактивация гена PPN1 по-разному влияет на метаболизм неорганических полифосфатов в цитозоле и вакуолях дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Микробиология, 75, № 3, 305-311.

52. Личко Л.П., Кулаковская Т.В., Кулаковская Е.В., Кулаев И.С. (2009). Обнаружение эндополифосфатазной активности у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия. 74, №8, 1037-1041.

53. Личко Л.П., Кулаковская Т.В., Кулаев И.С. (2010). Свойства частично очищенной эндополифосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохгшия. 75, №11, 1596-1600.

54. Мансурова С.Э. Шама А.М. Соколовский В.Ю. Кулаев И.С. (1975) Высокомолекулярные полифосфаты ядер печени крысы. Их поведение в процессе регенерации печени. Докл. АН СССР, 225, 717-720.

55. Наумов A.B., Шабалин В.М., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (1985) Два пути дефосфорилирования долихилдифосфата у дрожжей. Биохимия, 50, 652-658.

56. Пестов H.A. (2004). Полифосфаты и экзополифосфатазы митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Дисс. канд. биол. наук. Пущино

57. Рош P. (2000) Транспорт ионов через мембрану посредством полифосфат- поли-((3)-гидроксибутиратных комплексов. Биохимия, 65, 335-353.

58. Рубцов П.М., Кулаев И.С. (1977) Некоторые пути биосинтеза и деградации полифосфатов у зеленой водоросли Acetabularia mediterránea. Биохимия, 42, 1083-1089.

59. Соболев A.M. (1962) Распространение, формирование и утилизация фитина у высших растений. Усп. Биол. Хим., 4, 248-265.

60. Телеснина Г.Н., Крахмалева И.Н., Арушанян А.В., Сазыкин И.О., Бартошевич

61. Ю.Е. (1985) Особенности метаболизма полифосфатов и других макроэргических фосфорных соединений в зависимости от уровня продукции пенициллина и условий роста Pénicillium chrysogenum. Антибиот. Мед. Биотехпол., 30, 419-423.

62. Трилисенко JI.B. Вагабов В.М. Кулаев И.С. (1980) Выделение и некоторые особенности дефицитного по полифосфатфосфогидролазе мутанта гриба Neurospora crassa. Микробиология, 49, 82-87.

63. Трилисенко Л.В., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (1982) Изучение свойств полифосфатфосфогидролазы "leaky" мутанта Neurospora crassa по данному ферменту. Биохимия, 47, 1963-1969.

64. Трилисенко Л.В., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (2002) Содержание и длина цепи полифосфатов вакуолей дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКМ Y-1173. Биохимия. 67, 592-596.

65. Трилисенко Л.В., Андреева Н.А., Кулаковская Т.В., Вагабов В.М., Кулаев И.С.2003). Действие ингибиторов на полифосфатный метаболизм дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях гиперкомпенсации. Биохимия, 68, 577-581.

66. Трилисенко JI.B (2005). Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций неорганических полифосфатов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Дисс. канд. биол. наук. Пущино

67. Трилисенко JI.B., Кочеткова О.Ю., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (2010). Влияние циклогексимида, йодацетамида и антимицина А на синтез неорганических полифосфатов. Микробиология. 79, №1, 27-34.

68. Циоменко А.Б. Аугустин, Вагабов В.М., Кулаев И.С. (1974) О взаимосвязи обмена неорганических полифосфатов и маннанау дрожжей. Докл. АН СССР, 215, 478-480.

69. Шабалин Ю.А., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (1978) Биосинтез высокомолекулярных полифосфатов из ГДФ-(Р-32)-маннозы мембранной фракцией дрожжей Saccharomyces carlsbergensis. Докл АН СССР, 239, 490-492.

70. Шабалин Ю.А., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (1979) О механизме сопряжения биосинтеза высокомолекулярных полифосфатов и маннана у дрожжей Saccharomyces carlsbergensis. Докл. АН СССР , 249, 243-246.

71. Шабалин Ю.А., Наумов А.В., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (1984) Обнаружение активности нового фермента долихилдифосфат:полифосфатфосфотрансферазы у дрожжей. Докл. АН СССР, 278, 482-485.

72. Шабалин Ю.А. , Кулаев И.С. (1989) Солюбилизация и свойства долихилдифосфат: полифосфатфосфотрансферазы дрожжей. Биохимия, 54, 68-75.

73. Шредер Х.С., Курц Л., Мюллер В.Г.Е., Лоренц Б. (2000) Полифосфаты в костной ткани. Биохимия, 65, 3, 353-362.

74. Abramov A, Fraley С, Diao С, Winkfein R, Colicos М, Duchen М, French R, and Pavlov E. (2007). Targeted polyphosphatase expression alters mitochondrial metabolism and inhibits calcium-dependent cell death. PNAS. 104, No. 46, 18091-18096

75. Andreeva, N. A., and L. A. Okorokov (1993) Purification and characterization of highly active and stable polyphosphatase from Saccharomyces cerevisiae cell envelope. Yeast, 9, 127139.

76. Andreeva, N. A., T. V. Kulakovskaya, A. V. Karpov, I. A. Sidorov, and I. S. Kulaev1998) Purification and properties of polyphosphatase from Saccharomyces cerevisiae cytosol. Yeast 14, 383-390.

77. App, H., and H. Holzer (1985) Control of yeast neutral trehalase by distinct polyphosphates and ribonucleic acid. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 181, 276-82

78. Ashford, A E., P. A. Vesk, D. A. Orlovich, A. L. Markovina, and W. G. Allaway (1999) Dispersed polyphosphate in fungal vacuoles in Eucalyptus pilularis/Pisolithus tinctorius ectomycorrhizas. Fungal Genet. Biol. 28, 21-33.

79. Beauvoit, B., Rigonlet, M., Guerin, B., and Canioni, P. (1989). Polyphosphates as a source of high energy phosphates in yeast mitochondria: a P-NMR study. FEBS Lett. 252, 17-22.

80. Bensandoun, A., and Weinstein, D. (1976). Assay of proteins in the presence of interfering materials. Anal. Biochem.241-250.

81. Blum, J. J. (1989) Changes in orthophosphate, pyrophosphate and long-chain polyphosphate levels in Leishmania major promastigotes incubated with and without glucose. J. Protozool. 36, 254-257.

82. Bental, M., U. Pick, M. Avron, and H. Degani (1990) Metabolic studies with NRM spectroscopy of the alga Dunaliella salina trapped within agarose beads. Eur. J. Biochem. 188, 111-116.

83. Bajaj, V., S. P.Damle, and P. S. Krishnan (1954) Phosphate metabolism of mold spores. I. Phosphate uptake by the spores of Aspergillus niger. Arch. Biochem. Biophys. 50, 451-460.

84. Caen J., Wu Q. (2010). Hageman factor, platelets and polyphosphates: early history and recent connection. J Thromb Haemost. 8, 1-5.

85. Castaldi PA, Larrieu MJ, Caen J. (1965). Availability of platelet factor 3 and activation of factor XII in thrombasthenia. Nature. 207, 422-424.

86. Concar, D.W., D. Whitford, and R. J. Williams (1991) The location of the polyphosphate-binding sites on cytochrome c measured by NMR paramagnetic difference spectroscopy. Eur. J. Biochem. 199, 569-574.

87. Cowling, R. T., and H. C. Birnboim (1994) Incoroporation of 32P orthophosphate into inorganic polyphosphates by human granulocytes and other human cell types. J. Biol. Chem. 269, 9480-9485.

88. Castro, C. D., A. P. Koretsky, and M. M. Domach (1999) NMR-Observed phosphate trafficking and polyphosphate dynamics in wild-type and vphl-1 mutant Saccharomyces cerevisae in response to stresses. Biotechnol. Prog. 15, 65-73.

89. Cohen, A., Perzov, N., Nelson, H. & Nelson, N. (1999). A novel family of yeast chaperons involved in the distribution of V-ATPase and other membrane proteins. J. Biol. Chem. 274, 26885-26893.

90. De Venditis, E., R. Zahn, and O. Fasano (1986) Regeneration of GTP-bound from GDP-bound form of human and yeast ras proteins by nucleotide exchange, Stimulatory effect of organic and inorganic polyphosphates. Eur. J. Biochem. 161, 473-478.

91. Di Paolo, M.L., A. Corazza, M. Scarpa, R. Stevanato, and A. Rigo (1995) Effect of polyphosphates on the activity of amine oxidases. Biochim. Biophys. Acta 1247, 246-252.

92. Docampo, R., and S. N. Moreno (2001) The acidocalcisome. Mol. Biochem. Parasitol. 114, 151-159.

93. Docampo R, Ulrich P. and Moreno S. (2010). Evolution of acidocalcisomes and their role in polyphosphate storage and osmoregulation in eukaryotic microbes. Phil. Trans. R. Soc. B. 365, 775-784.

94. Durr M., K. Urech, T. Boiler, A. Wiemken, J. Schwencke, and M. Nagy (1979) Sequestration of arginine by polyphosphate in vacuoles of yeast Saccharomyces cerevisiae. Arch. Microbiol. 121, 169-175.

95. Den Hollander, J.,A., K. Ugurbil, T. R. Brown, and R. G. Shulman (1981) Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance studies on the effect of oxygen upon glycolysis in yeast. Biochemistry 20, 5871-5880.

96. Ebel, J. P., J. Colas, and S. Muller (1958) Recherches cytochimiques sur les polyphosphates inorganiques contenus dans les organismes vivants. III. Presence de polyphosphates chez divers organismes inferieurs. Exp. Cell. Res. 15, 36-42.

97. Eichinger L, Pachebat JA, Glockner G, Rajandream MA, Sucgang R, et al. (2005). The genome of the social amoeba Dictyostelium discoideum. Nature. 435, 43-57.

98. Florin I., and M. Thelestam (1984) Polyphosphate-mediated protection from cellular intoxication with Clostridium difficile toxin B. Biochim. Biophys. Acta 805, 131-136.

99. Freimoser F., Hurlimann H., Jakob C., Werner T., Amrhein N. (2006) Systematic screening of polyphosphate (poly P) levels in yeast mutant cells reveals strong interdependenceiwith primary metabolism. Genome Biology. 7, R109.

100. Gabel, N. W. (1971) Excitability, polyphosphates and precellular organization. In R. Buvet, and C. Ponnamperuma, eds. Molecular Evolution, Vol. 1, Chemical Evolution and the Origin oj Life, North-Holland, Amsterdam, p. 369.

101. Gabel, N.W., and V. Thomas (1971) Evidence for the occurence and distribution of inorganic polyphosphates in vertebrate tissues. J. Neurochem. 18, 1229-1242.

102. Gomez-Garcia, M.R., and A. Kornberg (2004) Formation of an actin-like filament concurrent with the enzymatic synthesis of inorganic polyphosphate. PNAS, 101, 15876-15880.

103. Hermann, E. C., and R. R. Schmidt (1965) Synthesis of phosphorus -containing macromoleculaes during synchronous growth of Chlorella pyrenoidosa. Biochem. Biophys. Acta 95, 63-75.

104. Herve, M., J. Wietzerbin, O. Lebourguais, and S. Tran-Dinh (1992) Effects of 2-deoxy-D-glucose on the glucose metabolism in Saccharomyces cerevisiae studied by multinuclear-NMR spectroscopy and biochemical methods. Biochimie 74, 1103-1115.

105. Holahan P.K., S. A. Knizner, C. M. Gabriel, and C. E. Swenberg (1988) Alterations in phosphate metabolism during cellular recovery of radiation damage in yeast. Int. J. Radiat. 54, 545-562.

106. HooJey, P., Whitehed, P. & Brown, M. R. (2008). Eukaryote polyphosphate kinases: is the 'Kornberg' complex ubiquitous? Trends Biochem. Sei. 33, 577-582.

107. Hernandez-Ruiz L, Gonzralez-Garcna I, Castro C, Bieva JA, Ruiz FA. (2006). Inorganic polyphosphate and specific induction of apoptosis in human plasma cells. Haematologica. 91, 1180-1186

108. Helfenbein K., Ellis T., Dieckmann C., Tzagoloff A. (2003). ATP22, a nuclear gene required for expression of the Fo sector of mitochondrial ATPase in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 278. 19751-19756.

109. Hürlimann H., Stadler-Waibel M., Werner T., Freimoser F. (2007) Pho91 is a vacuolar phosphate transporter that regulates phosphate and polyphosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 18, 4438-4445.

110. Iwamura, T., and S. Kuwashima (1964) Formation of adenosine-5'-triphosphate from polyphosphate by a cell-free extract from Chlorella. J. Gen. Appl. Microbiol. 10, 83-94.

111. Imsiecke, G., J. Münkner, B. Lorenz, N. Bachinski, W. G. E. Müller, and H. C. Schröder (1996) Inorganic polyphosphate in the developing of freshwater sponge Ephydatia muelleri: effect of stress by polluted waters. Envin. Toxicol. Chem. 15, 1329-1334.

112. Janakidevi, K., V. C. Dewey, and C. W. Kidder (1965) The nature of the inorganic polyphosphates in a flagellated protozoa. J. Biol. Chem. 240, 1754-1766.

113. Jen, C.M., and L. A. Shelef (1986) Factors affecting sensitivity of Staphylococcus aureus 196E to polyphosphates. Appl. Environ. Microbiol. 52, 842-846.

114. Kane P. (2007) The long physiologica reach of the vacuolar H+-ATPase. J. Bioenerg. Biomembr.

115. Kawazoe, Y., Shiba, T., Nakamura, R., Mizuno, A., Tsutsumi, K., Uematsu, T., Yamaoka, M., Sliindoli, M., Kohgo, T. (2004) Induction of calcification in MC3T3-E1 cells by inorganic polyphosphate. J. Dent. Res. 83, 613-618.

116. Kawazoe Y., Katohl S., Onodera Y., Kohgo T., Shindoh M. and Shiba T. (2008) Activation of the FGF signaling pathway and subsequent induction of mesenchymal stem cell differentiation by inorganic polyphosphate. Int. J. Biol. Sci. 4

117. Kasai, K., S. Usami, T. Yamada, Y. Endo, K. Ochi, and Y. Tozawa (2002) A RelA-SpoT homolog (Cr-RSH) identified in Chlamydomonas reinhardtii generates stringent factor in vivo and localizes to chloroplasts in vitro. Nucleic Acids Res. 30, 4985-4992.

118. Kornberg, A. (1995) Inorganic polyphosphate: toward making a forgotten polymer unforgottable. J. Bacteriol. 177, 491-496.

119. Kornberg A., Rao N.N., Ault-Riche D. (1999). Inorganic Polyphosphate: a molecule with many functions. Ann. Rev. Biochem. 68. 89-125.

120. Kornberg, A. (1999) Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. In H. C. Schroder and W. E. G. Muller, eds. Inorganic Polyphosphates. Biochemistry, Biology, Biotechnology, Springer, Prog. Mol. Cell. Biol. 23, 1-19.

121. Kulaev, I. S., and T. P.Afanas'eva (1969) Localization and physiological role of inorganic polyphosphates in the cells of yeasts. Antonie van Loeuwenhoek J. Microhiol. .Serol. Suppl. Yeasts Symposium 35, 13 19.

122. Kulaev I. S. (1973) The enzymes of polyphosphate metabolism in protoplasts and some subcellular structures of Neurospora crassa. In J. Villanueva, ed. Yeast Mould and Plant Protoplasts, Academic Press, London, p.259.

123. Kulaev, I. S. (1979). The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. Wiley. 1st Edition.

124. Kulaev,I. S, and V. M. Vagabov (1983) Polyphosphate metabolism in microorganisms. Adv. Microbiol. Physiol. 24, 83-171.

125. Kulaev I., V. Vagabov, and T. Kulakovskaya (1999) New aspects of polyphosphate metabolism and function. J. Biosci. Bioeng. 88, 111-129.

126. Kulaev, I. S., and T.V. Kulakovskaya (2000) Polyphosphate and phosphate pump Ann. Rev. Microbiol. 54, 709-735.

127. Kulaev I.S., Vagabov V.M., Kulakovskaya T.V. (2004). The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. N.Y.: Wiley.

128. Kulakovskaya, T. V., N. A. Andreeva, L. V. Trilisenko, V. M. Vagabov, and I. S. Kulaev2004) Two exopolyphosphatases in Saccharomyces cerevisiae cytosol at different culture conditions. Process Biochemistry 39, 1625-1630.

129. Kumble, K.D., and A. Kornberg (1995) Inorganic polyphosphate in mammalian cells and tissues. J. Biol. Chem. 270, 5818-5822.

130. Kumble, K. D., and A. Kornberg (1996) Endopolyphosphatases for long chain polyphosphate in yeast and mammals. J. Biol. Chem. 271, 27146-27151.

131. Langen, P., and Liss E.(1959) Zur Charakterisierung der Polyphosphate der Hefe. Naturwissenschaften 46, 151-152.

132. LeFurgey, A., P. Ingram, and J. J. Blum (1990) Elemental composition of polyphosphate-containing vacuoles and cytoplasm of Leishmania major. Mol. Biochem. Parasitol. 40, 77-86.

133. Leitao, J. M., B. Lorenz, N. Bachinsk!, C. Wilhelm, W. G. E. Müller, and H. C. Schröder1995) Osmotic-stress-induced synthesis and degradation of inorganic polyphosphates in the algae Phaerodactilum tricornutum. Mar. Ecol. Prog. Ser 121, 279-288.

134. Leon, G, C. Fiori, P. Das, M. Moreno, R. Tovar, J. L.Sanchez-Salas, and M. L. Munoz1997) Electron probe analysis and biochemical characterization of electron-dense granules secreted by Entamoeba histolytica. Mol. Biochem. Parasitol. 85, 233-242.

135. Leyhausen, G., B. Lorenz, H. Zhu, W. Geurtsen, R. Bohnensack, R., W. G. E. Müller, and H. C. Schröder (1998) Inorganic polyphosphate in human osteoblast-like cells J. Bone Miner. Res. 13, 803-812.

136. Lichko, L. P., N. A. Andreeva, T. V. Kulakovskaya, and I. S. Kulaev (2003) Exopolyphospahatases of the yeast Saccharomyces cerevisiae (Minirewiev) FEMS Yeast Research. 3, 233-238.

137. Lichko L.P., Kulakovskaya T.V., Kulaev I.S. (2006a) Inorganic polyphosphate and exopolyphosphatase in the nuclei of Saccharomyces cerevisiae: dependence on the growth phase and inactivation of the PPX1 and PPN1 genes. Yeast, 23, 735-40.

138. Lichko L., Pestov N., Kulakovskaya T., Kulaev I. (20066) Inorganic polyphosphates and exopolyphosphatases in cell compartments of the yeast Saccharomyces cerevisiae under inactivation of PPX1 and PPN1 genes. Bioscience Reports, 26, 45-54

139. Lieberman, L. (1888) Uber das Nuclein der Hefe und Kunstliche Darstellung eines Nucleus Eiweiss und Metaphosphatsaure. Ber. Chem-Ges. 21, 598-607.

140. Liss, E., and P. Langen (1962) Versuche zur Polyphosphat-Uberkompensation in Heffenzellen nach Phosphatverarmung. Arch. Microbiol. 41, 383-392.

141. Lorenz, B., J. Munkner, M. P.Oliveira, J. M. Leitao, W. G. E.Müller, and H. C. Schröeder (1997a) A novel method for determination of inorganic polyphosphates using the fluorescent dye Fura-2. J. Anal. Biochem. 246, 176-184.

142. Lorenz, B., J. Leuck, D. Kohl, W. E. G. Müller, and H. C. Schrüeder (1997c) Anti-HIV-1 activity of inorganic polyphosphates. J. Acquir. Immun. Deflc. Syndr. Hum. Retrovirol. 14, 110118.

143. Lohmeier-Vogel, E., K. Skoog, H. Vogel, and B. Hahn-Hagerdal (1989) 31P Nuclear magnetic resonance study of the effect of azide on xylose fermentation by Candida tropicalis. Appl. Envinron. Microbiol. 55, 1974-1980.

144. Lowry, O.H., Rosehrough, A., Ferr, A., Randall, J. (1951) Protein measyrement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, 265-275.

145. Lundberg, P., R. G. Weich, P. Jensen, and H. J. Vogel (1989) Phosphorus-31 and nitrogen-14 NMR studies of the uptake of phosphorus and nitrogen compounds in the marine macroalgae Ulva lactuca. Plant. Physiol. 89, 1380-1387.

146. Lusby, E. W., and C. S. McLaughlin (1980) The metabolic properties of acid soluble polyphosphates in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Gen. Genet. 178, 69-76.

147. Maier. S. K, S. Scherer, and M. J.Loessner (1999) Long-chain polyphosphate causes cell lysis and inhibits Bacillus cereus septum formation, which is dependent on divalent cations. Appl. Environ. Microbiol. 65(9), 3942-3949.

148. Mattenheimer, H. (1958) Polyphophate und Polyphosphatesen in Amoben Acta Biol. Med. Ger. 1. 405-413.

149. Merico F. Suo P., Piskur J., Compagno C. (2007). Fermentative lifestyle in yeasts belonging to the Saccharomyces complex. FEBS J. 2007. 274. №4. 976-989.

150. Meijer M.M.C., Boonstra J., Verkleij A., Verrips C.T. (1998). Glucose repression in Saccharomyces cerevisiae is related to the glucose concentration rather than the glucose flux. J. Biol. Chem. 273. 24102-24107.

151. Mellerharel, Y., A. Argaman, D. Benbashat G. Navon Y. Aharonowitz, and D. Gutnick (1997) Inhibition by polyphosphate of phytopathogenic polygalakturonases from Botrytis cinerea. Can.J. Microbiol. 43: 835-840.

152. Milgrom, E., Diab, H., Middleton, F., Kane, P.M. (2007) Loss of vacuolar proton-translocating ATPase activity in yeast results in chronic oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry, 282, 7125-7136.

153. Miyachi, S., R. Kanai, S. Mihara, S. Miyachi, and S. and Aoki (1964) Metabolic roles of inorganic polyphosphates in Chlorella cells. Biochim. Biophys. Acta, 93, 625-634.

154. Moon JH, Park JH, Lee JY. (2010). Characterization of Antibacterial Action of Polyphosphate on Porphyromonas gingivalis. Antimicrob Agents Chemother. Nov 22

155. Moreno B., J. A. Urbina, E. Oldfield, B. N. Bailey, C. O. Rodrigues, and R. Docampo (2000) 3IP NRM spectroscopy of Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, and Leishmania major. J. Biol. Chem. 275, 28356-28362.

156. Muller, O., Neumann, H., Bayer, M.J., Mayer, A. (2003). Role of the Vtc proteins in V-ATPase stability and membrane trafficking. Journal of Cell Science, 116, 1107-1115

157. Muller F, Mutch NJ, Schenk WA, Smith SA, Esterl L, Spronk IIM,

158. Schmidbauer S, Gahl WA, Morrissey JH, Renne T. (2009). Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell. 139, 1143-1156.

159. Nelson, N., Perzov, N., Cohen, A., Hagai, K., Padler, V. & Nelson, H. (2000) The cellular biology of proton-motive force generation by V-ATPases. J. Exp. Biol. 203, 89-95.

160. Nunez,C. G., and A. S. Callieri (1989) Studies on the polyphosphate cycle in Candida utilis. Effect of dilution rate and nitrogen source in continuous culture. Appl. Microbiol. Biotechnol. 31, 562-566.

161. Offenbacher,S., and H. Kline (1984) Evidence for polyphosphate in phosphorylated non histone nuclear proteins. Arch. Biochem. Biophys. 231, 114-123.

162. Ohsumi, Y., and Y. Anraku (1983) Calcium transport driven by a protonmotive force in vacuolar membrane vesicles of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 258, 5614-5617.

163. Ohtomo. R. and Saito M. (2005) Polyphosphate dynamics in mycorrhizal roots during colonization of an arbuscular mycorrhizal fungus. New Phytologist. 167, 571-578

164. Okorokov, L. A, L. P. Lichko, and I. S. Kulaev (1980) Vacuoles: the main compartment of potassium, magnesium and phosphate ions in Saccharomyces carlsbergensis cells. J. Bacteriol. 144, 661-665

165. Oshima, Y. (1997) The phosphatase system in Saccharomyces cerevisiae. Genes. Genet. Syst. 72, 323-334.

166. Pavlov E, Zakharian E, Bladen C, Diao CT, Grimbly C, Reusch RN, French RJ. (2005). A large, voltage-dependent channel, isolated from mitochondria by water-free chloroform extraction. Biophys J. 88,2614-2625.

167. Persson, B. L., J. O. Lagerstedt, J. R. Pratt, J. Pattison-Granberg, K. Lundh, S. Shokrollahzadeh, and F. Lundh (2003) Regulation of phosphate acquisition in Saccharomyces cerevisiae Curr. Genet. 43, 225-244.

168. Pestov, N. A., Kulakovskaya, T.V., Kulaev I.S. (2004) Inorganic polyphosphate in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae at phosphate limitation and phosphate excess. FEMS Yeast Research, 4, 643-648.

169. Petrov V.V., Padmanabha K.P., Nakamoto R.K., Allen K.E., Slayman C.W., (2000). Functional role of chaged residues in the transmembrane segments of the yeast plasma membrane H+-ATPase. J. Biol. Chem. 275, 15709-15716.

170. Pick U., M. Bental, E. Chitlaru, and M. Weiss (1990) Polyphosphate-hydrolysis- a protective mechanism against alkaline stress? FEBSLett., 274, 15-18.

171. Pick, U., and M. Weiss (1991) Polyphosphate hydrolysis within acidic vacuoles in response to amino-induced alkaline stress in the halotolerant alga Dunaliella salina. Plant. Physiol. 97, 1234-1240.

172. Pilatus, U., A. Mayer, and A. Hildebrandt (1989) Nuclear polyphosphate as a possible source of energy during the sporulation of Physarum polycephalum. Arch. Biochem. Biophys. 275, 215-223.

173. Pisoni, R.L., and E. R. Lindley (1992) Incorporation of 32-P. orthophosphate into long chain of inorganic polyphosphate within lysosomes of human fibroblasts. J. Biol. Chem. 267, 3626-3631.

174. Rao N., Gromez-Garcna M., and Kornberg A. (2009). Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annu. Rev. Biochem. 78, 605-647

175. Reidl, H. H., T. A. Grover, and J. Y. Takemoto (1989) 31P-NRM evidence for cytoplasmic acidification and phosphate extrusion in syringomycin-treated cells of Rhodotoriila pilimana . Biochem. Biophys. Acta 1010, 325-329.

176. Reusch, R. N. (1989). Poly-beta-hydroxybutirate/calcium polyphosphate complexes in eukaryotic membranes. Roc. Soc. Exper. Biol. Med. 191, 377-381.

177. Reusch, R. N., R. P.Huang, and D. Koskkosicka (1997) Novel components and enzymatic activities of the human erythrocyte plasma membrane calcium pump. FEBS Lett. 412, 592-596.

178. Reusch, R. N. (1999) Polyphosphate/ poly-(R)-3-hydroxybutyrate in channels ion cell membranes. In H. C. Schroder and W. E. G. Muller, eds. Inorganic Polyphosphates. Biochemistry, Biology, Biotechnology, Springer, Prog. Mol. Cell. Biol. 23, p. 151-183.

179. Rodrigues, C. O., F. A. Ruiz, M. Vieira, J. E. Hill, and R. Docampo R.(2002a) An acidocalcisomal exopolyphosphatase from Leishmania major with high affinity for short-chain polyphosphate. J Biol Chem. 277, 50899-50906.

180. Rodrigues C. O., F. A.Ruiz, P. Rohloff, D. A. Scott, and S. N. J. Moreno (2002b) Characterization of isolated acidocalcisomes from Toxoplasma gondii tachyzoites reveals a novel pool of hydrolysable polyphosphate. J. Biol. Chem. 277, 48650-48656.

181. Rodriguez, R. J. (1993) Polyphosphate present in DNA preparation from filamentous fungal species of Colleotrichum inhibits restriction endonucleases and other enzymes. Anal. Biochem. 209, 291-297.

182. Rosenberg, H. (1966) The isolation and identification of "volutin" granules from Tetrahymena. Exp. Cell. Res. 41, 397-403.

183. Rubin, G.M. (1973) The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae 5.8 S ribosomal ribonucleic acid. J. Biol. Chem. 11, 3860-3875.

184. Ruiz, F. A., C. O. Rodrogues, and R. Docampo (2001) Rapid changes in polyphosphate content within acidocalcisomes in response to cell growth, differentiation and environmental stress in Trypanosoma cruzi J. Biol. Chem. 276, 26114-26121.

185. Ruiz F, Lea C, Oldfield E, Docampo R. (2004). Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. JBiol Chem. 279,44250-44257.

186. Salhany J. M., T. Yamane, R. G. Schulman, and S. Ogawa (1975) High resolution 31P nuclear magnetic resonance studies of intact yeast cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 49664970.

187. Schuddemat, J., R. de Boo, C. C. M. Van Leeuwen, P. J. A. Van den Broek, and J. Van Steveninek (1989) Polyphosphate synthesis in yeast. Biochem. Biophys. Acta 100, 191-198.

188. Schatz G. J. (1967). Impaired binding of mitochondrial adenosine triphosphatase in the cytoplasmic petite mutants of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 243. 2192-2199.

189. Serrano R, Kielland-Brandt M&Fink G. (1986). Yeast plasma membrane ATPase is essential for growth and has homology with (Na+ + K+), K+- and Ca2+-ATPases. Nature, 319, 689-693

190. Shiba, T., D. Nishimura, Y. Kawazoe, Y. Onodera, K. Tsutsumi, R. Nakamura, and M. Ohshiro (2003) Modulation of mitogenic activity of fibroblast growth factors by inorganic polyphosphate. J. Biol. Chem. 278, 26788-26792.

191. Shiokawa , K., and Y. Yamana ( 1965) Demonstration of polyphosphate and its possible role in RNA synthesis during early development of rana japónica embryos. Exp. Cell. Res. 38, 180-192.

192. Shnyreva, A.V., and I. S. Kulaev (1994) Effect of Vesicular-Arbuscular Mycorrhiza on phosphorus metabolism in agricultural plants. Microbiol. Res. 149, 1-5.

193. Sidney Omelon S., Georgioul J., Henneman Z., Wise L., Sukhu B., Hunt T., Wynnyckyj C., Holmyard D., Bieleckil R., Grynpas M. (2009) Control of Vertebrate Skeletal Mineralization by

194. Polyphosphates. PLoS ONE. 4, e5634

195. Smith S., Mutch N., Baskar D, Rohloff P, Docampo R, Morrissey J. (2006). Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 903908.

196. Smith S., Morrissey J. (2008a). Polyphosphate as a general procoagulant agent. J Thromb Haemost. 6, 1750-1756.

197. Smith S., Morrissey J. (2008b). Polyphosphate enhances fibrin clot structure. Blood. 112, 2810-2816.

198. Smillie, R., and G. Krotokov (1960) Phosphorus-containing compounds in Euglena gracilis grown under difefrent conditions. Arch. Biochem. Biophys. 89, 83-89.

199. Tani C., Ohtomo R., Osaki M., Kuga Y., Ezawa T. (2009) Polyphosphate-synthesizing activity in extraradical hyphae of an arbuscular mycorrhizal fungus: ATP-dependent but proton gradient-independent synthesis. Appl Environ Microbiol. 75, 7044-7050.

200. Tijssen, J., H. W. Beekes, and J. Van Steveninck (1982) Localization of polyphosphate in Saccharomyces fragilis, as revealed by 4'6'-diamidino-2-phenylindole fluorescence. Biochem.Biophys. Acta 721, 394-398.

201. Tijssen, J. P. F., and J. Van Steveninck (1984) Detection of a yeast polyphosphate fraction localized outside the plasma membrane by the method of phosphorus-31 nuclear magnetic resonance. Biochem. Biophys. Res. Comm. 119, 447-451.

202. Trilisenko L. V., V. M. Vagabov, and I. S. Kulaev (1982) Comparative study of some properties of polyphosphatephosphohydrolase in Neurospora crassa strain ad-6 (28610) and a leaky derivative. Neurospora Lett. 29, 19-20.

203. Ullrich, W., and W. Simonis (1969) Die Bildung von Polyphosphaten bei Ankistrodesmus braunii durch Monophosphorylierung im Rotlicht von 683 und 712 nm unter Slickstoffatmosphare. Planta 84, 358-367.

204. Ullrich, W. (1970) Zur Wirkung von Sauerstoff auf die 32P-Markierung von Polyphosphaten und organischen Phosphaten bei Ankisrodesmus braunii im Licht. Planta, 90, 272-285.

205. Vagabov V.M., Trilisenko L.V., Kulakovskaya T. V., Kulaev I.S. (2008). Effect of carbon source on polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 8. 877-882.

206. Vorisek, J., A. Knotková, and A. Kotyk (1982) Fine cytochemical localization of polyphosphates in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Zbl. Mikrobiol. 137, 421-432.

207. Wang, L., C. D. Fraley, J. Faridi, A. Kornberg, and R. A. Roth RA (2003) Inorganic polyphosphate stimulates mammalian TOR, a kinase involved in the proliferation of mammary cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11249-11254

208. Werner T.P., Amrhein N., Freimoser F.M. (2005) Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Arch Microbiol, 184, 129-136.

209. Werner T., Amrhein N., Freimoser F. (2007). Inorganic polyphosphate occurs in the cell wall of Chlamydomonas reinhardtii and accumulates during cytokinesis. BMC Plant Biology. 1, 51

210. Wolska-Mitaszko, B. (1997). Trehalases from spores and vegetative cells of yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Basic Microbiol. 37, 295-303.

211. Wood, H. G., and J. E. Clark (1988) Biological aspects of inorganic polyphosphates. Ann. Rev. Biochem. 57: 235-260.

212. Wurst H, Kornberg A. (1994). A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. J Biol Chem. 269, 10996-11001.

213. Wurst, H., T. Shiba, and A. Kornberg (1995). The gene for a major exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol., 177, 898-906.

214. Yang, Y. C., M. Bestos, and K. J. Chen (1993) Effect of osmotyc stress and growth stage on cellular pH and polyphosphate metabolism in Neurospora crassa as studied by 31-P-nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta 1179, 141-147.

215. Yoshino, M., K. Murakami (1988) A kinetic study of the inhibition of yeast AMP deaminase by polyphosphate. Biochim. Biophys. Acta 954, 271-276.

216. Yu, T., A. Nassuth, and R. L. Peterson (2001) Characterization of the interaction between the dark septate fungus Phialocephala fortinii and Asparagus officinalis roots. Can. J. Microbiol. 47, 741-753.

217. Zakharian E, Thyagarajan B, French RJ, Pavlov E, Rohacs T. (2009). Inorganic Polyphosphate Modulates TRPM8 Channels. PLoS ONE. 4, e5404

218. Zinzer, E., Daum, G. (1995). Isolation and biochemical characterization of organelles from the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 11, 493-536.