Метаболический контроль старения дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Самохвалов, Виктор Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метаболический контроль старения дрожжей Saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболический контроль старения дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

На правах рукописи

САМОХВАЛОВ Виктор Александрович

МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ СТАРЕНИЯ ДРОЖЖЕЙ 8ЛССИЛЖОМУСЕ8 СЕКЕУ181ЛЕ

Специальность 03.00.04 - биохимия

Саратов -2004

Работа выполнена в Саратовском государственном университете имени Н.Г. Чернышевского

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Игнатов В.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Попов Ю.А.

Ведущая организация: МГУ НИИ Физико-химической биологии имени. А.Н. Белозерского

Защита состоится «28» апреля 2004 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан «22» марта 2004 г.

доктор биологических наук, профессор Маевскнй ЕЛ.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Никитина В Ш.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Последние годы ознаменованы развитием нового направления в геронтологии - концепции метаболического контроля старения (Jazwinski, 1999). Основу этой концепции составляет исследование роли метаболических реакций в регуляции процессов старения. Были выявлены и охарактеризованы ряд генов, участвующих в регуляции процессов старения. Тот факт, что эти гены участвуют также в регуляции некоторых биохимических реакций, дает основание полагать важную роль метаболического контроля в регуляции процессов старения. Выяснение того, что реализация эффекта «ограничения калорий» в клетках высших эукариот и дрожжей является функционально сходным процессом, позволило рассматривать этот эффект как биологически универсальный в регуляции старения (Sinclair, 1999). Непосредственное участие митохондрий в проявлении эффекта «ограничения калорий» характерно для всех эукариотических клеток. На взаимосвязи функциональной активности митохондрий, интенсивности продукции ими активных форм кислорода и продолжительностью жизни клетки базируется свободнорадикальная теория старения (Hartman, 1999).

Важнейшим достижением последних лет является признание дрожжей Saccharomyces cerevisiae как универсальной модели, позволяющей исследовать основные закономерности старения клеток высших эукариот (Gershon and Gershon, 2002).

Вместе с тем негативной является тенденция исследования молекулярно генетических основ старения в полном отрыве от клеточной физиологии, в частности биоэнергетики.

Так, например, совершенно неисследованными остаются изменения при старении в цикле Кребса и гликолизе, хотя эти метаболические пути являются основными энергетическими путями во всех эукариотических клетках. Невыясненной остается роль запасных углеводов в метаболическом контроле старения эукариотических клеток.

Несмотря на то, что, благодаря работам Кулаева и Корнберга, в изучении биохимии и физиологии неорганических полифосфатов (полиР) был сделан существенный прогресс, позволивший обнаружить важные функции этих соединений в эукариотических клетках (Kulaev et ah, 1999; Kornberg et al., 2000), роль полиР в процессах старения остается невыясненной.

Целью настоящей работы было исследование изменений некоторых метаболических путей в хронологически стареющих клетках S. cerevisiae. В соответствии с этой целью в данной работе были сформулированы

1. Разработать экспериментальную модель для исследования хронологического старениядрожжей Б. cerevisiae.

2. Исследовать функциональные изменения стареющих клеток, а также обнаружить в них маркеры старения, такие, как размер клеток и аккумуляция в них внехромосомальной ДНК(ВХД).

3. Изучить роль ключевых ферментов гликолиза, а также гликогена и трегалозы в поддержании жизнеспособности дрожжей 3. сегеу181ае в процессе хронологического старения.

4. Изучить изменения в функциональной активности митохондрий, некоторых окислительных метаболических процессах (цикл Кребса, глиоксилатный цикл) в хронологически стареющихдрожжах Б. cerevisiae.

5. Изучить изменения в полифосфатном метаболизме хронологически стареющих дрожжей Б. cerevisiae.

Научная новизна работы. Впервые было проведено исследование изменений некоторых, метаболических путей дрожжей Б. cerevisia, как с аэробным, так и с анаэробным профилем метаболизма в условиях их хронологического старения. Было показано, что в условиях роста на глюкозе старение клеток приводит к снижению активности ключевых ферментов гликолиза, потребления глюкозы и неспособности аккумулировать гликоген и трегалозу. Исследование экспрессии гликогенсинтетазы (ГС) и > трегалозосинтетазы (ТС) в стареющих клетках показало, что именно снижение экспрессии этих ферментов являлось непосредственной причиной неспособности стареющих клеток аккумулировать запасные углеводы. В свою очередь, это приводило к резкому падению жизнеспособности клеток стареющей культуры.

Нами • было выяснено, что старение клеток в аэробных условиях приводит к снижению функциональной активности их митохондрий. На этом фоне для клеток стареющей культуры было характерно резкое усиление сукцинат-зависимых путей метаболизма.. Усиление окисления сукцината было возможно потому, что в клетках стареющей культуры происходило усиленное, образование этого метаболита в глиоксилатном цикле. Предполагается, что усиление этого метаболического пути является адаптационным процессом, направленным на поддержание жизнеспособности стареющих клеток. Вероятно, этот механизм развился в клетках в результате внутрипопуляционного отбора. Эксперименты, проведенные со старением клеток Б. cerevisiae в присутствии 1 мМ сукцината, позволили выявить геропротекторный потенциал этого метаболита.

Исследования полифосфатного обмена показали, что процесс старения клеток сопровождается усиленным потреблением третьей фракции, биогенез которой сопряжен с

синтезом ДНК, и аккумуляцией пятой, функция которой неизвестны до настоящего времени. На основании этих данных мы делаем вывод, что старение клеток приводит к переносу запасания макроэргических связей с АТФ на полиР.

Практическая значимость. Полученные в работе новые данные о механизмах метаболического контроля старения S. cerevisiae расширяют представления о развитии процессов старения, их связи с определенными метаболическими реакциями не только для этого организма, но и для клеток высших эукариот.

Данная работа является фундаментальным исследованием, однако, полученные результаты могут использоваться для метаболической коррекции старения эукариотических клеток и соотвественно, иметь практическое значение для клинической геронтологии и биотехнологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Запасным углеводам принадлежит основная роль в поддержании жизнеспособности хронологически стареющих клеток в анаэробных условиях.

2. В хронологически стареющих клетках в аэробных условиях происходит усиление сукцинатной ветви окисления. Экзогенный сукцинат в концентрации 1 мМ обладает геропротекторным потенциалом

3. Разработанная модель хронологического старения позволяет исследовать изменения в метаболизме, специфически сопряженные со старением.

Апробация работы. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 5-м Международном симпозиуме «Free radicals in biology and medicine» (Лодзь, Польша, 2000), конференции «Oxidative stress: biochemistry and pathophysiology» (Валенсия, Испания, 2000), I FEMS Congress (Любляна, Словения, 2003), 5-м симпозиуме испанских биохимиков (Мадрид, Испания, 2002), 12-м симпозиуме французских биохимиков (Париж, Франция, 2003).

Работа была представлена на заседании лаборатории метаболической биофизики ИТЭБ РАН, Пущино.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании кафедры биохимии и биофизики Саратовского госуниверситета 9 октября 2003 года.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 9 публикациях, включая 1 статью в рецензируемом журнале из списка ВАК и 2 статьи в зарубежных реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, полученные результаты и их обсуждение, заключения и выводов. Список цитируемой

литературы содержит 191 источников, в том числе 183 зарубежных. Работа изложена на 126 листах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 10 таблиц.

Работа выполнена на базе кафедры биохимии и биофизики Саратовского госуниверситета, лаборатории регуляции биохимических процессов ИБФМ РАН, лаборатории метаболической биофизики ИТЭБ РАН, лаборатории молекулярной микробиологии, Университет Комплутенсия, Мадрид, Испания, Центра молекулярной биологии, Тулуза, Франция. Работа поддержана грантом ФЕМО 23/2002 по итогам конкурса 2002 года, грантами ФЦП «Интеграция» № 3/329 и № д/504 по итогам конкурса 2002 года, грантом Министерства образования РФ Э02-2.0-3 по итогам конкурса 2003 года.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования

В работе использовали штамм Saccharomyces cerevisiae Y-1173, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов РАН, Пущино. Штамм ЮГ 1112, а также мутантные штаммы были любезно предоставлены профессором Ж. Франсуа (Центр молекулярной биологии, Тулуза, Франция).

Основная стратегия для решения задач, поставленных в данной работе, включала исследование изменений в метаболизме запасных углеводов, гликолиза, функциональных свойств митохондрий, а также полифосфатов в условиях хронологического старения дрожжей S. cerevisiae. Для этих целей была разработана экспериментальная модель, позволяющая исследовать хронологическое старение дрожжей без сопутствующего влияния факторов голодания по компонентам среды выращивания и воздействия токсических продуктов метаболизма (Samokhvalov et al, 2004).

В экспериментальной работе использовалась полная среда Ридер.

Необходимым предварительным этапом для моделирования системы хронологического старения является выяснение критической плотности популяции, при которой клетки не почкуются при наличии всех компонентов питательной среды. Для нашего штамма такая плотность соответствовала 22 ед. опт. пл. при 600 нм. При такой плотности популяции клетки переходят в постмитотическое состояние, обусловленное эффектом «crowd-sensing». Эти клетки из поздней экспоненциальной фазы концентрировали до определенной критической плотности популяции (22 ед. опт. пл. при 600 нм) в среде выращивания. После этого клетки инкубировались в течение 12 ч, и отбиралась первая проба. Этот момент принимался условно за старт эксперимента, т.е. за

время «О». В дальнейшем клетки дважды в неделю осаждались на дно колбы при S °С, при этом старую среду заменяли эквивалентным объемом свежей, сохраняя при этом изначальную плотность клеток. Мы не наблюдали дополнительного роста клеток после этой процедуры. Отбор проб производили один раз в неделю, для этого клетки собирали центрифугированием при 3000 g и дважды отмывали холодной бидистиллированной водой.

Определение гликогена и трегалозы проводили энзиматическим методом после предварительного щелочного гидролиза по протоколам, приведенным Parrou and Francois (1991).

Активность гликолитических ферментов определяли спектрофотометрически, методом сопряженных энзиматических реакций (Venturin et al., 1995).

Активность ферментов цикла Кребса и глиоксилатного цикла производили спектрофотометрически, как описано (Hirai et al., 1916).

Потребление кислорода целыми клетками регистрировали в полярографической ячейке объемом 2 мл со стационарным электродом типа «Кларк» при 21 °С. Использовался полярограф с аналогоцифровым преобразователем, сконструированным в ИБК РАН, Пущине В работе применяли среду дыхания по Кондрашовой. Состав среды: 125 тМ КС1,10тМ HEPES, 1,5 тМ К2НРО4. Дыхание также измеряли в присутствии 10 рм FCCP, 10 (ig олигомицина, 5 мМ малоната, где указано. Определяли скорость дыхания, стимуляцию окислительного фосфорилирования, чувствительность дыхания к действию FCCP, олигомицина, малоната. Регистрацию и обработку полученных данных проводили < на компьютере.

Для анализа накопления ТБК-активных продуктов использовали метод Steels (1994), основанный на их взаимодействии с тиобарбитуровой кислотой. Образующийся в результате этого окрашенный продукт спектрофотометрировали при 540 им.

Образование карбонильных групп белков анализировали по методу Jakubowski (2000).

Неорганические полифосфаты фракционировали, используя метод фракционирования по Лангену и Лису (Langen and Liss, 1958) в модификации Кулаева. Количественное определение полифосфатов проводили по образующемуся в результате их гидролиза неорганическому фосфату.

Анализ ВХД проводили, как описано Guarente (2000).

Субклеточное фракционирование проводилось по методу, описанному Longo

(1999).

Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry, 1954). Определение глюкозы проводили с использованием кита фирмы Sigma.

Статистическую обработку данных проводили на. компьютере с использованием программы Biostat. Для статистических измерений использовался t-критерий Стьюдента.

Запасные углеводы участвуют в поддержании жизнеспособности хронологически стареющих клеток

Гликоген и трегалоза являются важными метаболитами, участвующими во многих физиологических процессах дрожжевых клеток. В частности, была показана их роль в реализации стресс-адаптивных реакций (Parrou et al., 1997), регуляции клеточного цикла (Sillje, 1999). Особо значимой их роль является в условиях анаэробного профиля метаболизма дрожжей S. cerevisiae. Поскольку хронологическое старение представляет собой комплексный процесс, вовлекающий множество метаболических реакций (Maclean, 2000), было интересно исследовать изменения в метаболизме запасных углеводов и гликолиза в процессе хронологического старения дрожжей S. cerevisiae с анаэробным типом метаболизма. Из рис. 1 заметно, что старение культуры изначально сопровождается повышением уровня гликогена и трегалозы в клетках, сменяющимся резким падением их уровня.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

- Гликоген -о- Трмшмза

Время старения; модели

Рис. 1. Динамика содержания гликогена и трегалозы в клетках стареющей культуры £ сегеу(з1ае. Присутствие в среде старения дрожжей 2 % глюкозы определяло анаэробный тип их метаболизма

В конце четвертой недели старения мы не обнаружили в клетках стареющих дрожжей ни гликогена, ни трегалозы. Динамика содержания запасных углеводов в клетках стареющей культуры была сходной с динамикой их жизнеспособности.

Как видно из рис. 2, жизнеспособность клеток дрожжей также резко снижалась после второй недели старения.

1 1 Э 4 5

Вр*мя стярсммя, надеин

Рис. 2. Изменение жизнеспособности культуры 5". еегеугягае в процессе ее старения. Присутствие в среде старения дрожжей 2 % глюкозы определяло анаэробный тип их метаболизма

Это наблюдение дает основание предполагать, что неспособность клеток аккумулировать запасные углеводы являлась непосредственной причиной снижения их жизнеспособности. Неспособность стареющих клеток накапливать запасные углеводы может иметь несколько основных причин.

Во-первых, метаболизм гликогена и трегалозы тесно связан с интенсивностью гликолиза, в частности с гексокиназной реакцией. Исследование активности ключевых ферментов гликолиза в клетках стареющей культуры показало, что их активность действительно снижается в процессе старения культуры. Из данных, приведенных в табл. 1, видно, что активность ферментов гликолиза падала не более чем в два раза в процессе старения культуры, тогда как содержание запасных углеводов падало до нуля. Особенно это важно для гексокиназной реакции, продукт которой - глюкозо-6-фосфат - может непосредственно - участвовать в синтезе запасных углеводов. Оставшейся активности гексокиназной реакции вполне достаточно для того, чтобы поддерживать необходимый уровень запасных углеводов в. стареющих клетках. Таким образом, вероятность лимитирования накопления запасных углеводов в стареющих клетках со стороны гликолиза является маловероятной.

Таблица 1

Изменение активности гликолитических ферментов в процессе старения

дрожжевых клеток Б. cerevisiae

Ферменты Исходный уровень 1-я неделя старения 2-я неделя старения 3-я неделя старения 4-я неделя старения 5-я неделя старения

Гексокииаза 245*17 335*19* 324*16» 162*14* 158*12* 141*12*

Пируваткиназа 202*17 208*19 206*15 169*15* 165*14* 159*12*

Фосфофруктокиназа 16Х±9 219*12» 215*15* 132*8 128*7* 115*11*

Глицеральдегвд-фосфатдегидро-геназа 150±13 145,8*14 142*11 131*9 126*10 134*11

Примечание. В качестве источника углерода была использована 2 % глюкоза. Определение активности ферментов проводилось, как описано в главе «Материалы и методы». Активность ферментов выражали в нмоль /мин/иг белка. Данные являются средним арифметическим 5 независимых экспериментов. * - Различия достоверны по отношению к контролю, Р< 0,05.

Во-вторых, на функциональной связи усиления •. продукции активных форм кислорода и старения основывается свободнорадикальная теория старения (Наппап, 1998). Таким образом, существует вероятность, что неспособность стареющих клеток накапливать запасные углеводы связана с усилением генерации в них активных форм -кислорода, способных неспецифически повреждать многие клеточные биополимеры и инактивировать ферменты.

Анализ ТБК-активных продуктов, являющихся маркером интенсивности процессов свободнорадикального окисления в клетках (РпаиИ et al., 2000), показал, что их уровень не изменялся на всем протяжении старения культуры (табл. 2). Таким образом, это доказывает, что процессы свободнорадикального окисления не могут быть причиной неспособности стареющих клеток накапливать запасные углеводы.

Таблица 2

Уровень ТБК-активных продуктов в стареющих клетках Б. cerevisiae

Исходный уровень 1-я неделя старения! 2-я неделя старения 3-я неделя' старения 4-я неделя старения 5-я неделя старения

Уровень ТБК-активных продуктов 14*2 16*2 17*2 16*1 17±2 18*2

Примечание. В качестве источника углерода была использована 2% глюкоза. Уровень ТБК-активных продуктов выражали в нмоль/мг абс. сухой биомассы. Данные являются средним арифметическим 5 независимых экспериментов. * -Различия достоверны по отношению к контролю, Р< 0,05.

Остающейся • наиболее вероятной - причиной неспособности стареющих клеток накапливать запасные углеводы, могло явиться повреждение либо непосредственно ферментов, участвующих в их метаболизме, либо систем, участвующих в регуляции их экспрессии. Было показано, что регуляция экспрессии ферментов, участвующих в метаболизме гликогена и трегалозы, является комплексным процессом, вовлекающим, многие компоненты клеточной сигнализации (Bell et al, 1988; Clotet et al, 1995).

Для того, чтобы исследовать - возможные изменения, в экспрессии ферментов гликогенсинтетазы и трегалозосинтетазы в стареющих клетках, мы использовали штамм дрожжей, где опероны либо ГС, либо ТС были слиты с lacZ-опероном. Таким. образом, это дало нам возможность по уровню в-галактозидазной активности судить об изменении экспрессии этих ферментов в стареющих клетках.

Из рис. 3 видно, что уровень экспрессии ГС н ТС снижался на всем протяжении старения клеток. Более того, динамика снижения экспрессии этих ферментов была сходной с динамикой накопления клетками • запасных углеводов и уровнем их жизнеспособности.

Время старении, мдепи

Рис. 3. Изменение экспрессии ГС и ТС в клетках стареющей культуры 8. еегеугягае. Присутствие в среде старения дрожжей 2 % глюкозы определяло анаэробный тип их метаболизма. Закрытые символы - экспрессия ГС, открытые символы — экспрессия ТС

Таким образом, в данном эксперименте показано, что непосредственная причина потери способности клеток стареющей культуры накапливать запасные углеводы связана либо с повреждением ферментов ГС и ТС на уровне экспрессии, либо внутриклеточной системы, регулирующей их экспрессию. Неспособность стареющих клеток накапливать запасные углеводы привело, в свою очередь, к резкому падению их жизнеспособности.

Старение клеток приводят к активации сукцинат-зависимой ветви метаболизма

Известно, что в условиях аэробного роста митохондрии играют важную роль в регуляции биоэнергетических и биосинтетических процессов в дрожжевой клетке (Gancedo and Serrano, 1998). Для исследования изменений митохондриальных метаболических процессов в процессе старения дрожжей S. cerevisiae был смоделирован строго аэробный профиль их метаболизма, что достигалось использованием 2 % этанола в качестве основного источника углерода.

Практически неизвестно, какие именно метаболические изменения происходят в митохондриях стареющих клеток и как они функционально связаны со старением. В данной части работы изучено изменение основных окислительных путей митохондрий и их функциональная связь со старением. Результаты полученных экспериментов представлены в табл. 3.

Таблица 3

Изменение функциональных свойств митохондрий S. cerevisiae в процессе их старения

Скорость дыхания, нг/ат О/мии/мг.абс.биомассы Исходный уровень 1-Я неделя старения 2-я неделя старения 3-я неделя старения 4-я неделя старения 5-я неделя старения

Общее дыхание 380±23 362±22 327±21*' 210±15-* 189±15* 178±1б*

+ Олигомишш 180=tl9 172*13 16ШЛ4* 167±12* 159±14* 153±15*

Олипжицин-чувспвительное 200 190 167* 43» 30* 25*

Олигомицин-чувстоительное. % 53±4 52±4 51±3 21 ±2* 16±1* 14±1*

+ FCCPb 504±32 486±35* 443±35* 302±24* 260±21* 267*27*

(FCCP - олигомишш) / (общее - олигомишш) «100 152±15 155±14 165±16 600±54* 767±73* 968±92*

с + Малонат 304±21 271±19* 239±17* 68±5* 52±5* 43±4*

Малонат-чувстветтельное 76 91* 88» 142* 137* 135*

Малонат-чувствителыюе, % 20*1,5% 24*1,4% 27±2%* 68±5%* 73±7%* 75±7%*

Примечание. Скорость дыхания измерялась в присутствии: а - 10 (ig олигомицина; b - 10 цт FCCP; с - 5 мМ малоната. (FCCP-олигомицин ) / (общее-олигомицин) - степень сопряжения дыхания. В качестве источника углерода был использован 2 % этанол. Данные являются средним арифметическим 5 независимых экспериментов. * Различия достоверны по отношению к контролю, Р< 0,05.

Было выяснено, что старение культуры приводит к двукратному снижению общей дыхательной активности митохондрий стареющих клеток. Сопряженное дыхание,

ингибируемое олигомицином снижалось в 8 раз. Такая же ситуация, хотя и менее выраженная, наблюдалась для разобщающего действия БССР.

Использовав тест (РССР-олигомицин)/(общее-олигомицин), мы обнаружили, что старение клеток сопровождается. снижением сопряжения дыхания. Совершенно по-другому происходило изменение чувствительности клеток к специфическому ингибитору сукцинатдегидрогеназы - малонату. Так, доля малонат-чувствительного дыхания, составляя 20 % в начале эксперимента, увеличивалась до 75 % к концу пятой недели эксперимента. Исследование изменений в цикле Кребса и глиоксилатном цикле в клетках стареющей культуры показало нам нижеследующее (табл 4).

Таблица 4

Изменение активности ферментов цикла Кребса в процессе старения клеток 5". сгггу181аг

Исходный уровень 1-« неделя старения 2-я неделя старения- 3-я неделя старения. 4-я неделя старения 5-я неделя старения 5-я неделя/ исходный, %

ЦС 340± 25 267±17*- 258± 18* 156±9* 125± И* 108± 9* -68.8

НАД-ИЦДГ 47±4 36±3* 33±3* НО НО НО НО

НАДФ-ИЦДГ 180±12 154±12* 148±9* 65±5* 42±4* 39±3* •78,4

а-КДГ 16± 1 12±1* 104 0,9» 6±0,6* 6± 0,7* 5± 0,6* -67,8

СДГ 392±32 397±31 428± 37* 588± 49* 582± 53* 599± 57* +53

МДГ 860±43 740±54* 692± 57* 300±22* 290±18* 275± 19* -68,2

ицл 450±26 440±34 436±40* 405±33* 415±37* 408Д32* -9,4

млс 410±34 396±39* 390^26* 365±27* 370±30* 378±33* -83

АЛД 260± 19 270±18 295± 17 430±37 458±29 475± 25 +83

АЦДГ 340±27 360±32* 390±34* 489±43* 497±43* 520±49* +53

Примечание. Активность ферментов выражали в кмоль/мин/мг белка. НО - активность не определялась. * Различия достоверны по отношению к контролю, Р< 0,05.

Заметно, что активность НАД(Ф)-зависимых изоцитратдегидрогеназ, а-кетоглутарат-дегидрогеназы (а-КДГ), цитратсинтетазы (ЦС), а также малатдегидрогеназы (МДГ) значительно снижалась во время старения культуры.

Особенно это заметно на примере НАД-изоцитратдегидрогеназы (НАД-ИЦЦГ), активность которой не определялась уже после третьей недели старения. Именно на этом уровне в цикле Кребса реализовывалась «точка разлома». Резкое падение активности основных ферментов цикла Кребса вполне могло привести к снижению функциональной активности митохондрий.

На этом фоне было отмечено значительное увеличение активности алкогольдегидрогеназы (АДГ) и ацетальдегиддегидрогеназы (АЦДГ). В процессе старения клеток активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) увеличивалась в 1,5 раза. Увеличение активности этих ферментов является, вероятно, компенсаторным путем, обеспечивающим функционирование только укороченной версии цикла Кребса.

В этих условиях резко возрастает роль глиоксилатного цикла, который шунтирует цикл Кребса. Поскольку в процессе старения клеток происходило резкое снижение активности обоих изоцнтратдегидрогеназ, это дает преимущество для утилизации изоцитрата в глиоксилатном цикле. Определение активности ферментов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы (ИЦЛ) и малатсинтетазы (МЛС) показало, что их активность мало изменялась на всем протяжении старения клеток.

Глиоксилатный цикл характерен для клеток дрожжей, растущих на ацетате или этаноле (что и было в наших экспериментах). Его функции состоят в обеспечении анаплеротического образования оксалоацетата (Gancedo and Serrano, 1998). Помимо этого в глиоксалатном цикле происходит образование сукцината - метаболита, наиболее быстро и мощно окисляющегося - в дыхательной цепи митохондрий с образованием АТФ.

Образующийся оксалоацетат вступает в дальнейшем в разнообразные анаплеротические реакции, развитие которых необходимо для нормального роста дрожжей на этаноле. Интенсивное образование сукцината предполагает наличие не менее мощного механизма, окисляющего его.

Обнаруженное нами увеличение активности сукцинатдегидрогеназы и доли малонат-чувствительного дыхания в стареющих клетках подтверждает, что старение клеток сопровождается усилением окисления сукцината. По-видимому, этот метаболический путь становится основным в стареющих клетках. Преимущества окисления сукцината перед НАД-зависимыми субстратами были хорошо показаны МН- Кондрашовой (Kondrashova et al., 1982; Kondrashova and Grigorenko, 1984). Это быстрое и мощное образование АТФ, а также поддержание потенциала на внутренней мембране митохондрий. Эти преимущества окисления сукцината могут быть особенно важны для подержания жизнеспособности стареющих клеток (Samokhvalov et al., 2004).

Вероятной причиной гибели части популяции хронологически стареющих дрожжей S. cerevisiae может быть увеличение в них уровня ТБК-активных продуктов. Хорошо известно, что помимо общего окислительного повреждения клеточных биополимеров активные формы кислорода способны инактивировать такие ферменты

цикла Кребса, как аконитаза и а-кетоглутаратдегидрогеназа (Humphries and Szweda, 1998). Именно это мы и наблюдали в наших условиях. Из табл. 5 хорошо заметно, что уровень ТБК-активных продуктов увеличился более чем в 4 раза к концу эксперимента.

Таблица 5

Динамика аккумуляции ТБК-активных продуктов в клетках S. cerevisiae в процессе их старения -

Исходный уровень 1-я неделя старения 2-я неделя старения 3-я неделя старения 4-я неделя • старения 5-я неделя< старения'

Уровень ТБК-активных продуктов' 15±1 26±2 29*2* 67±6* 65±7* 69±5*

Примечание. В качестве источника углерода был использован 2 % этанол. Уровень ТБК-активных продуктов выражали в нмоль/мг абс. сухой биомассы. Данные являются средним арифметическим 5 независимых экспериментов. Различия достоверны по отношению к контролю, Р< 0,05.

Таким образом, в данной работе показано, что в клетках дрожжей, стареющих в аэробных условиях, происходит адаптационное усиление, как образования, так и окисления сукцината. Усиление функциональной значимости глиоксилатного цикла в стареющих клетках способствовало мощному образованию сукцината в обход цикла Кребса. Адаптационное усиление механизма образования-окисления сукцината участвовало в поддержании жизнеспособности клеток стареющей культуры.

Экзогенный сукцинат обладает потенциалом геропротектора

Как было показано выше, хронологическое старение дрожжей сегеутае в аэробных условиях сопровождается усилением сукцинат-зависимой ветви метаболизма в клетках. Было интересно выяснить, способен ли экзогенный сукцинат обеспечивать более высокий уровень жизнеспособности стареющих клеток.

На рис. 4 показано, что добавление экзогенного сукцината значительно увеличивало жизнеспособность стареющих клеток.

° 1 2 Э « 5

Время старения; недели

Рис. 4. Влияние сукцивата на жизнеспособность клеток стареющей культуры 8 cerevisiae

Этот факт дает основание предполагать наличие у сукцината геропротекторного потенциала. Дальнейшие эксперименты подтвердили справедливость этого предположения. Добавление сукцината к стареющей культуре способствовало более высокому уровню функциональной активности митохондрий (табл. б). Мы обнаружили, что общее дыхание было в два, а сопряженное - в три раза выше у клеток стареющих в присутствии экзогенного сукцината, чем без него. Присутствие экзогенного сукцината увеличивало стимуляцию окислительного фосфорилирования в стареющих клетках в три раза. Не менее интересным было влияние сукцината и на активность ферментов цикла Кребса (табл.7).

Так, активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ и ЦС были значительно выше в клетках, стареющих в присутствии сукцината, чем в его отсутствие. Активность НАД-ИЦДГ определялась вплоть до конца эксперимента. Вместе с тем, присутствие экзогенного сукцината значительно ингибировало малатдегидрогеназную активность стареющих клеток. Более высокой была активность ферментов окисления этанола, АДГ и АЦЦГ. Особенно выраженный. стимулирующий эффект экзогенного сукцивата проявлялся в отношении АДГ, активность которой увеличилась в 2 раза. Активность СДГ была в 1,3 раза выше в присутствии экзогенного сукцината, чем без него. Именно способностью экзогенного сукцината стимулировать окислительные процессы в митохондриях можно объяснить более высокий уровень жизнеспособности стареющих клеток в его присутствии. Таким образом, можно заключить, что сукцинат обладает потенциалом геропротектора.

Таблица 6

Изменение функциональной активности митохондрий клеток 5". сгггу181аг в процессе старения. Геропротекторный эффект сукцината

Скорость дыхания, нг/аг О/мил/мг абс. биочассы ИсходныИ уровень 1-я неделя старения 2-я неделя старения 3-я неделя старения 4-я неделя старения 5-я неделя старения

Контроль +суюшнат контроль +суихйнат контроль +сукшшат контроль +сукцинат Контроль +сукцинат

Общее дыхание 380*23 362112 390*13 327±11* 360±1б*# 21015* 304±15*# 18915* 258117** 17816 238117

■Юлигомицнн я 180117 172115 179117 160115* 164116* 167И5* 174117* 159115* 168114* 153115* 161114*

Олпгомипнн-чувствительное 200 190 211*# 167* 196» 43* 130** 308 90** 25* 77**

ОЛИГОМКЩШ-чувствительное, % 53*4 5214 5414 5115 4113 21±2* 4314*0 16±2* 35±3*# 1411* 32±2**

+ РССР ь 10АН2 486*45* 519*47 443145» 484142** 302129* 424133** 260121* 360134** 267125* 335133**

(ГССР-олнгомкцип) /(обшее-лигомицнн). и2±15 155±14 146±12 165±16 147±14 600±54* 226±20*# 767±73* 300425** 968192» 335±27*#

+ Мдлонат с 304128 271122* 285127** 239±21* 248119*« 6817* 89±7'# 5215* 6517** 4314* 1712**

Малоиат-чувствительиое 76 91» 105** 88* 112*0 142* 215*» 137* 193** 135* 221**

Малонат-чувствигельное, % 2011,5 24±1,4 2712 3!±4*# 6815* 7116* 7317* 7416* 75*7* 92А9*#

Примечание. Сукцинат добавляли в среду до конечной концентрации 1 мМ. Данные являются средним арифметическим 5 независимых экспериментов. * Различия достоверны по отношению к исходному уровню, # - к контролю, Р< 0,03. Скорость дыхания измерялась в присутствии: а - 10 олигомицина; Ь - 10 цш РССР; с - 5 мМ малоната. (РССР-олигомидин) / (общее-олигомицин) - степень сопряжения дыхания.

Таблица 7

Влияние экзогенно добавленного сукцината на активность ферментов цикла Кребса и глиоксилатного цикла

в клетках стареющей культуры 8 cerevisiae

Исходный уровень 1-я неделя старения 2-я неделя старения 3-я неделя старения 4-я неделя старения 5-я неделя старения

контроль + сукцинат контроль +сукцинат контроль +сукцинат контроль + сукцинат Контрол ь +сукцинат

цс 340±25 267±17* 297±19*# 258±18* 264±21* 156±9* 256±21*# 125±11* 223±18*# 108±9* 208±17*#

НАД-ИВДГ 47±2,3 3б±3* 38±3* 33±3* 25±2*# НО 15±1*# НО 15±1,5*# НО 14±2*#

НАДФ-ИЦЦГ 180±12,4 154±12* 169±14'# 148 ±9* 148±12* 65±5* 135±И*# 42±4* 138±12*# 39±4* 135±И*#

а-КДГ 16±0,65 12±0,87* 15±1,1*# 10±0,9* 13±1,2*# б,5±0,41* 12±1,1*# 5,9±0,32* И±0,84*# 5,4±0,4* 9,5±1*#

сдг 392±32 397±31 431±44*# 428±37* 518±42*# 588±49* 672±58*# 582±53* 658±55*# 599±57* 778±бЗ*#

мдг 860±78 740±77» 2б4±18*# 692±57* 243±19*# 300±22* 194±14*# 290±18* 190*18*# 275±19* 197±16*#

1ШД 450±2б 440±34 445±38 436±40 447±41 405*33* 425±37*# 415^37* 420±36* 408±32* 418±34*

млс 410±34 396±39 415±37* 390±26* 407±35*# 365±27* 380*32» 370±30* 384±32* 378±33* 380±32*

АДГ 260± 25 270*18* 680±27*# 295±17* 684±33*# 430,71= 45» 980±48*# 458±3 9* 957± 45*# 475±15* 987±48*#

АЦДГ 340±27 360±27 375±33*# 390±34* 410±38*# 489±43* 530±47*# 497±43* 547±48*# 520±49* 589±53*#

Примечание. Среда для старения содержала 2 % этанол как источник углерода. Сукцинат добавляли в среду до конечной концентрации 1 мМ. Данные являются средним арифметическим 3 независимых экспериментов. Активность ферментов выражали в нмоль/мин/мг белка * Различия достоверны по отношению к исходному уровню, # - к контролю, Р< 0,05.

Хронологическое старение дрожжей S. cerevisiae приводит к перераспределению фракций неорганических полифосфатов

Исследование динамики содержания полиР в стареющих клетках с использованием метода Langen and Liss в модификации Кулаева (Langen and Liss, 19S8) позволило выявить ряд интересных закономерностей в их содержании в стареющих клетках. Из рис. 5 видно, что уровень неорганического Р в дрожжах поддерживался на константном уровне на всем. протяжении их старения. Это свидетельствует о том, что старение клеток не индуцирует изменений в системе транспорта и утилизации - ортофосфата. Этот вывод является важным, поскольку он дает основания рассматривать изменения в динамике содержания полиР в стареющих клетках, как о процессах, специфических сопряженных со старением Мы обнаружили, что старение клеток сопровождается резким увеличением содержания в них первой кислоторастворимой фракции. Заметно, что старение приводит к снижению уровня третьей фракции полиР и одновременному увеличению пятой.

Рис.5. Динамика изменения фракций неорганических полифосфатов в стареющих клетках cerevisiae

Очевидно, можно констатировать факт переноса макроэргов с третьей на пятую фракцию. Именно пятая фракция, по всей видимости, наиболее тесно функционально связана с процессами клеточного старения. Поскольку в процессе старения максимальная гибель части стареющей популяции происходила в промежутке между второй и третьей неделями, а максимальная аккумуляция пятой фракции наблюдалось к третьей неделе эксперимента, мы можем сделать вывод о функциональной значимости пятой фракции именно для клеток-долгожителей.

Анализ содержания общих полиР в стареющих клетках показывает, что их содержание динамично менялось во времени. Распад сменялся синтезом и наоборот. Такая динамика дает возможность выработать стареющим клеткам наиболее подходящую

стратегию компенсаторных изменений в фосфорном метаболизме, позволяющим им наиболее эффективно приспособиться к условиям хронологического старения, выработать механизм, поддерживающий их жизнеспособность максимально возможное время.

Изменения в полиР обмене в клетках, стареющих в присутствии глюкозы как основного источника углерода, были очень схожи с клетками, стареющими в присутствии этанола. Хорошо известно, что рост на глюкозе обеспечивает выраженный анаэробный тип метаболизма, тогда как на этаноле, наоборот, аэробный. Отсутствие различий в динамике содержания полиР в клетках, стареющих как в анаэробных, так и аэробных условиях, позволяет сделать важный вывод. Метаболизм полиР в стареющих клетках является метаболическим путем, мало подверженным влиянию факторов окружающей среды. Это неудивительно, поскольку полиР являются эволюционно наиболее древним источником энергосохранения. С другой стороны, динамичный метаболизм полиР в стареющих клетках подтверждает, что старение является комплексным процессом, вовлекающим многие, в том числе эволюционно древние, пути. Это также подчеркивает, что механизмы старения были сформированы так же давно, как и наиболее консервативные механизмы, обеспечивающие жизнеспособность клеток.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что хронологическое старение дрожжей 5асскаготусех cerevisiae I сопровождается значительным перераспределением между фракциями полифосфатов. Наиболее важным является установление эффекта асинхронной

динамики между третьей и пятой фракциями. Это доказывает, что в стареющих клетках функциональная значимость пятой фракции увеличивается.

2. Разработана экспериментальная модель для исследования метаболических изменений в хронологически стареющих дрожжах 5. cerevisiae.

3. Установлено, что в условиях анаэробного роста снижение жизнеспособности стареющих клеток связано с потерей их способности накапливать запасные углеводы,

4. Доказано, что в условиях аэробного роста в стареющих клетках дрожжей происходит усиление сукцинатной ветви окисления. Увеличение образования сукцината в клетках стареющей культуры происходило за счет увеличения функциональной значимости глиоксилатного цикла. I

5. Впервые было показано, что сукцинат в концентрации 1 мМ обладает > геропротекторным эффектом. I

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Самохвалов ВА., Мусейкина Н.Ю., Мельников ГЛ., Игнатов В.В. Арсеяат как индуктор процессов ПОЛ в Saccharomyces cerevisiae ^/Микробиология. — 2003. — Т. 72, № 3.-С. 308-311.

2. Samokhvalov V.V., Ignatov V.V., Kondrashova M.N. Inhibition of Krebs cycle and activation of glyoxylate cycle in the course of chronological aging of Saccharomyces cerevisiae. Compensatory role ofsuccinate oxidation // Biochimie. - 2004. - Vol. 86. - P. 39-46.

3. Samokhvalov VA., Ignatov V.V., Kondrashova M.N. Reserve carbohydrates maintain the viability of Saccharomyces cerevisiae cells during chronological aging // Mech. Age Dev. -2004. - Vol. 125. - P. 229-235.

4. Samokhvalov VA., Kondrashova M.N. Reactions of transamination are essential for growth and survival of yeast Saccharomyces cerevisiae under aerobic metabolism // Abstr. 1st FEMS Congress, Ljubliana, Slovenia, 2003. - P. 71.

5. Samokhvalov VA~, Museykina N.YIL, Melnikov G.V., Ignatov V.V. Influence low doses ofbenzo-a-pyrene on aging population ofyeast Saccharomyces cerevisiae IIAbstr. 20* Intern. Conf. on Yeast Genetics and Molecular Biology, Prague, Czech Republic, 2001. - P. 72.

6. Samokhvalov VA, Ignatov V.V. Development of adaptation response in aging yeast population induced by reactive oxygen species // Physiology Yeast and Phylamentous Fungi. — HindsgavlCastle,Denmark, 2 0 01. - P. 4 5.

7. Samokhvalov VA, Fedotova O.V. The influence of dicetones, new synthetic anti- and prooxidants on respiratory activity aging yeast Saccharomyces cerevisiae II Abstr. 5th Symp. Tree Radicals in Biology and Medicine", Lodz, Poland, 2000. - P. 218.

8. Samokhvalov VA, Melnikov G.V., Ignatov V.V. Activity of phosphofructokmase is drastic decreased in aging yeast Saccharomyces cerevisiae II Oxidative Pathways in Health and Disease. - Sydney, Australia, 1999. - P. 79.

9. Samokhvalov VA, Fedotova O.V., Kapitonova E.P. Yeast S. cerevisiae stability to an oxidative stress // 2l"i Intern. Meeting on Oxidative Stress: Biochemistry and Pathology. -Valencia, Spain, 1999. - P. 90.

Изд. ляд. ИД № 00125, выдана 30.08.99 г. Подписано в печать № 03. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать ИБО/ Усл. печ. л. 4. Уч. - изд. л. . Тираж ЗОН Заказ Х»/¡4

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман ЮЛ, Свидетельство Л> 3117 410600, Сараточ, ул. Московская, д.152, офис 19

Hi- 58 68

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Самохвалов, Виктор Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. S. cerevisiae как возможная модель для исследования процессов старения на клеточном уровне.

1.2. Регуляция гликолиза и метаболизма запасных углеводов в дрожжах S. cerevisiae.

1.3. Регуляция ключевых ферментов цикла Кребса в клетках дрожжей S. cerevisiae.

1.4. Полифосфаты. Строение, локализация, функции в клетках дрожжей S. cerevisiae.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования и условия его культивирования.

2.2. Методы контроля роста и определение интенсивности дыхания.

2.3. Определение жизнеспособности клеток и моделирование хронологического старения.

2.4. Разрушение клеток и получение грубого гомогената.

2.5. Определение потребления глюкозы.

2.6. Определение активности ферментов.

2.7. Определение ТБК-активных продуктов.

2.8. Определение гликогена и трегалозы.

2.9. Определение полифосфатов.

2.9.1. Определение аккумуляции в клетках ВХКД.

2.9.2. Определение карбонильных групп белков.

2.9.3. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование влияния замены среды на исследуемые параметры.

3.2. Определение маркеров старения в клетках дрожжей S. cerevisiae.

3.3. Исследование метаболических изменений в стареющих дрожжах S. cerevisiae с анаэробным типом метаболизма.

3.4. Исследование метаболических изменений в стареющих дрожжах S. cerevisiae с аэробным типом метаболизма.

3.5. Динамика содержания неорганических полифосфатов в клетках стареющей культуры S. cerevisiae.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метаболический контроль старения дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

Актуальность проблемы

Стремительное развитие геронтологии в последнее время, привлекает к себе внимание все большего количества специалистов из разных областей науки. Долгое время геронтология была сугубо физиологической наукой, не использующей весь арсенал биохимических и молекулярно-биологических методов. Основным затруднением здесь является тот факт, что в большей части исследований эксперименты ставились, в основном, либо на животных, либо на культуре животных клеток in vitro (Adams, 1997). Использование животных и линии клеток создает ряд затруднений, поскольку жизненный цикл животных очень продолжителен, а для линии клеток млекопитающих также свойственны трудности в их культивировании и невозможности моделирования ряда физиологических ситуаций. Наиболее важным препятствием для использования в качестве модели животных и культуры клеток in vitro является крайне ограниченное применение методов молекулярной биологии, невозможность получения мутантов клеточных линий по определенному признаку.

В последнее время в качестве модели для исследования биохимических аспектов старения, экспериментаторы всего мира интенсивно используют дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Austriaco and Guarente, 1999). Было показано, что старение дрожжей S. cerevisiae на клеточном уровне очень сходно с таковым для клеток высших эукариот (Gershon and Gershon, 2000). Арсенал средств молекулярный биологии, применимый к исследованию дрожжей, очень обширен. Достаточно сказать, что весь геном этих дрожжей не только расшифрован, но и частично функционально охарактеризован (Austriaco and Guarente, 1999). Получены мутанты этих клеток, как долгожителей, так и наоборот, живущих ограниченное количество генераций (Bonhivers et al., 1989). Помимо этого, благодаря пластичности своего метаболизма, возможности четкого контроля условий культивирования, дрожжевые клетки являются удобным и функциональным объектом для решения многих задач биохимической геронтологии.

Последние годы ознаменовали собой развитие нового направления в геронтологии - концепции метаболического контроля старения (Jazwinski, 1999). Основу этой концепции составляет исследование роли метаболических реакций, их регуляции в развитии молекулярных основ старения. Был выявлен и охарактеризован ряд генов, принимающих участие в регуляции процессов старения. Тот факт, что эти гены также участвуют в регуляции некоторых биохимических реакций, дает основания полагать, что метаболический контроль старения является комплексным процессом, вовлекающим многие стороны клеточной физиологии. Вместе с тем негативной является тенденция исследования молекулярно-генетических основ старения в полном отрыве от клеточной физиологии, в частности биоэнергетики.

Немногочисленные физиологические исследования процессов старения на клеточном уровне позволили выявить некоторые интересные закономерности. Так, открытие эффекта «ограничения калорий», согласно которому продолжительность жизни индивидуума зависит от количества потребляемых им калорий, является важным экспериментальным подтверждением роли метаболического контроля в старении клеток (Black et al., 2001). Дальнейшие исследования в этой области позволили выявить, что эффект «ограничения калорий» характерен не только для клеток высших эукариот, но также для дрожжей (Jazwinski, 1999).

Было обнаружено, что продукция митохондриями эукариотических клеток активных форм кислорода является важным условием инициации старения клеток (Наппап, 1999). Усиленная экспрессия в клетках дрожжей ферментов, участвующих в антиоксидантной защите, позволила значительно продлить их жизнь (Jakubowski et al., 2000). Результатом продолжения этих работ является обнаружение важной роли АФК-зависимого апоптоза в регуляции старения клеток дрожжей. Было показано, что старение дрожжей сопровождается усилением образования в них АФК, которые, в свою очередь, активируют апоптические пути, приводящие к гибели старых клеток.

Вместе с этим полученные экспериментальные данные о роли метаболического контроля в реализации процессов старения являются ничтожно малыми по сравнению с еще невыясненными. Так, например, совершенно неисследованными остаются изменения в цикле Кребса и гликолизе, хотя эти метаболические пути являются основными энергетическими и биосинтетическими путями во всех эукариотических клетках. Нарушения в функционировании этих метаболических путей могут приводить к значительному изменению метаболического профиля клеток, в общем, и развитию многих клеточных болезней, в частности.

Благодаря работам Кулаева, была показана важнейшая роль неорганических полифосфатов в функционировании эукариотических клеток (Kulacv ct а/., 1999). Недавно обнаружена важная роль полифосфатов в поддержании жизнеспособности клеток S. cerevisiae в условиях стационарной фазы, что дает основание предполагать их участие в процессах старения (Kulaev and Vagabov, 1983). В связи с этим возникает необходимость разностороннего исследования изменений в метаболизме стареющих эукариотических клеток с использованием S. cerevisiae как модели.

Целью настоящей работы было выяснение роли некоторых метаболических путей в регуляции процессов хронологического старения дрожжей S. cerevisiae. В соответствии с этим в данной работе были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную модель для исследования хронологического старения дрожжей S. cerevisiae.

2. Исследовать функциональные изменения стареющих клеток, а также обнаружить в них маркеры старения, таких, как размер клеток и аккумуляция в них ВХД.

3. Изучить роль ключевых ферментов гликолиза, а также гликогена и трегалозы в поддержании жизнеспособности дрожжей S. cerevisiae в процессе хронологического старения.

4. Исследовать изменения в функциональной активности митохондрий, а также основных окислительных метаболических путей (цикл Кребса, глиоксалатный цикл) в хронологически стареющих дрожжах S. cerevisiae.

5. Изучить изменения в полифосфатном метаболизме хронологически стареющих дрожжей S. cerevisiae.

Научная новизна работы

Впервые проведено разностороннее исследование изменений в основных метаболических путях дрожжей S. cerevisiae в условиях их старения. Было показано, что в условиях роста на глюкозе старение клеток приводит к снижению активности ключевых ферментов гликолиза, потребления глюкозы и неспособности аккумулировать гликоген и трегалозу. Исследование экспрессии ГС и ТС в стареющих клетках показало, что именно снижение экспрессии этих ферментов и являлось непосредственной причиной неспособности стареющих клеток аккумулировать запасные углеводы. Потеря способности стареющих клеток накапливать запасные углеводы, приводило к снижению их жизнесопособности.

Нами впервые было выяснено, что старение клеток в аэробных условиях приводит к резкому снижению функциональной активности митохондрий и основных дегидрогеназ цикла Кребса. На этом фоне для клеток стареющей культуры было характерно резкое усиление сукцинат-зависимых путей метаболизма. Резкое усиление окисления сукцината было возможно, поскольку в клетках стареющей культуры происходило усиленное образование этого метаболита в ГЛЦ. Предполагается, что усиление функциональной значимости этого метаболического пути является адаптационной мерой, направленной на поддержание жизнеспособности стареющих клеток. Вероятно, этот механизм развился в клетках в результате внутрипопуляционного отбора. Эксперименты, проведенные на стареющих клетках S. cerevisiae в присутствии 1 мМ сукцината, позволили выявить мощный геропротекторный потенциал у этого метаболита.

Исследование полифосфатного обмена показало, что процесс старения клеток сопровождается усиленным потреблением третьей фракции полиР, биогенез которой сопряжен с синтезом ДНК и аккумуляцией пятой фракции, функции которой остаются неизвестными до настоящего времени. На основании этих данных можно предполагать, что старение клеток приводит к переходу запасания макроэргических связей с АТФ на полиР. Подобный механизм является эволюционно очень древним, и его активация характерна для продолжительного действия мощных стресс-факторов (Kulaev et al., 1999).

Научно-практическая значимость

Полученные в работе новые данные о механизмах метаболического контроля старения S. cerevisiae расширяют представления о развитии процессов старения, их связи с определенными метаболическими реакциями не только для этого организма, но и для клеток высших эукариот.

Апробация работы

Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 5-м симпозиуме «Свободные радикалы в биологии и медицине» (Лодзь, Польша, 2000), конференции «Окислительный стресс: биохимия и патофизиология» (Валенсия, Испания, 2000), 1-й Конгресс ФЕМО (Любляна,. Словения), 5-й съезд биохимиков Испании (Мадрид, Испания, 2002), 12-й съезд биохимиков Франции (Париж, Франция, 2003).

Диссертация представлялась и получила одобрение на заседании лаборатории метаболической биофизики Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ в зарубежных и отечественных изданиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики Саратовского государственного университета; лаборатории биохимии микроорганизмов Университета Комплутенсиа (Мадрид, Испания); лаборатории «Молекулярной биохимии» (Тулуза, Франция); лаборатории «Регуляции биохимических процессов» ИБФМ РАН (Пущино, Россия); лаборатории «Метаболической биофизики» (ИТЭБ РАН, Пущино, Россия).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, полученные результаты и их обсуждение, заключения и выводов. Список цитируемой литературы содержит 191 источников, в том числе 183 зарубежных. Работа изложена на 126 листах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 10 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Самохвалов, Виктор Александрович

ВЫВОДЫ

1. Показано, что хронологическое старение дрожжей Saccharomyces cerevisiae сопровождается значительным перераспределением между фракциями полифосфатов. Наиболее важным является установление эффекта асинхронной динамики между третьей и пятой фракциями. Это доказывает, что в стареющих клетках функциональная значимость пятой фракции увеличивается.

2. Разработана экспериментальная модель для исследования метаболических изменений в хронологически стареющих дрожжах S. cerevisiae.

3. Установлено, что в условиях анаэробного роста снижение жизнеспособности стареющих клеток связано с потерей их способности накапливать запасные углеводы.

5. Впервые было показано, что сукцинат в концентрации 1 мМ обладает геропротекторным эффектом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хронологическое старение представляет собой способность эукариотических клеток какое-то время поддерживать свою жизнеспособность в постмитотическом состоянии. Примером этого являются фибробласты в многоклеточном организме, находящиеся в постмитотическом состоянии. Для одноклеточных эукариотических организмов, например Saccharomyces cerevisiae, также характерно развитие хронологического старения, к примеру, в условиях достижения критической плотности популяции или при действии факторов окружающей среды. Интенсивное исследование механизмов хронологического старения началось с 1959 года с появлением работ (Mortimer and Jonhson, 1959). С этого времени сложилось представление, что хронологическое старение представляет собой комплексный процесс, вовлекающий множество метаболических процессов. Вместе с тем успех, достигнутый в установлении некоторых генов, ответственных за определение продолжительности клеточной жизни, с одной стороны, сопутствует значительному отставанию в понимании метаболических основ хронологического старения с другой стороны. Неясными остаются изменения в метаболическом профиле стареющих клеток, а также вклад отдельных метаболических реакций в развитие процессов старения.

Дрожжи S. cerevisiae представляют собой одноклеточный организм, чей геном является полностью расшифрованным, а метаболизм хорошо изученным. Многие гены S. cerevisiae имеют гомологи в клетках высших эукариот, например человека. Все это позволяет использовать эти дрожжи как удобный объект для исследования метаболического контроля хронологического старения.

Краеугольным камнем для адекватного исследования хронологического старения является грамотный выбор экспериментальной модели. В настоящее время в лаборатории Longo предложены две модели для исследования хронологического старения. Одна из них основана на выживаемости клеток в условиях постоянно истощающейся среды. Согласно другой, клетки, выросшие до середины экспоненциальной фазы, переносили в дистиллированную воду. Обе модели имеют ряд существенных недостатков: в первом случае клетки испытывают перекрестное влияние фактора истощения среды и воздействия токсическими продуктами метаболизма, во втором они переходят в покоящееся состояние, что не равноценно старению. В данной работе мы описали экспериментальную модель для исследования хронологического старения, впервые разработанную нами.

Хорошо известно, что дрожжи S. cerevisiae имеют два принципиально различных типа метаболизма - аэробный и анаэробный, которые зависят, прежде всего, от источника углерода в среде роста. Присутствие глюкозы обеспечивает типичный анаэробный обмен, тогда как этанол, напротив, аэробный.

Мы провели исследования метаболического контроля хронологически стареющих клеток S. cerevisiae в условиях как анаэробного, так и аэробного метаболизма.

Поскольку основным метаболическим путем в клетках, находящихся в анаэробных условиях, является гликолиз и метаболизм запасных углеводов -гликогена и трегалозы, необходимо было выяснить изменения в гликолизе и метаболизме запасных углеводов и то, каким образом они сопряжены со старением.

В ходе выполнения данной работы, используя метод ферментативного определения гликогена и трегалозы, нами было впервые показано, что старение клеток приводит к резкому падению в них уровня запасных углеводов и параллельно с этим их жизнеспособности. Используя штаммы, где опероны ГС иди ТС слиты с lacZ-опероном, мы выяснили, что именно нарушения в экспрессии этих ферментов являются основной причиной потери способности стареющих клеток накапливать гликоген и трегалозу.

Хорошо известно, что гликоген и трегалоза выполняют множество важных функций в клетках, в частности участвуют в поддержании жизнеспособности клеток в ответ на действие стресс-факторов. Таким образом, мы выяснили, что аккумуляция запасных углеводов является важным механизмом, поддерживающим жизнеспособность клеток в процессе их старения.

Исследован метаболизм хронологически стареющих клеток в аэробных условиях. Для выполнения этой серии экспериментов мы использовали в качестве источника углерода 2 % этанол.

Для определения дыхательной активности клеток и ингибиторного анализа использовали метод полярографии по Кондрашовой. Для определения активности ферментов цикла Кребса и глиоксилатного цикла были использованы спектрофотометрические методы, основанные на измерении экстинкции НАДН. Для определения СДГ нами был разработан метод, позволяющий определять ее активность в интактных клетках, после их предварительной пермеабилизации дигитонином.

Используя эти методы, мы выяснили, что хронологическое старение клеток, приводит к резкому снижению функциональной активности митохондрий. Так, используя специфический ингибитор FIFO АТФ-азы, мы обнаружили, что старение сопровождается значительным снижением потребления доли кислорода, сопряженного с синтезом АТФ, т.е. сопряженное дыхание снижается в процессе старения. Такая же картина наблюдалась для разобщающего действия FCCP. Вместе с тем чувствительность клеток к ингибирующему действию малоната -специфического ингибитора СДГ - росла на всем протяжении старения. Это прямо показывает на увеличение вклада окисления сукцината в энергообразование.

Поскольку мы обнаружили мощное увеличение окисления сукцината в стареющих клетках, необходимо выяснить пути его образования. В нормальных условиях сукцинат образуется преимущественно в цикле

Кребса. Определение активности ферментов цикла Кребса показало нам, что практически все ферменты цикла Кребса резко снижают свою активность в процессе старения. Это ставит под сомнение возможность образования сукцината в цикле Кребса. Нам представлялось интересным выяснить возможность образования сукцината через глиоксилатный цикл, который шунтирует цикл Кребса на уровне изоцитратдегидрогеназы.

Действительно, наша гипотеза подтвердилась. В стареющих клетках глиоксалатный цикл является основным экспортером сукцината, выполняя, таким образом, часть функций цикла Кребса. Увеличивающаяся на всем протяжении старения активность СДГ и доля малонат-чувствительного дыхания позволяют максимально эффективно использовать энергию сукцината.

Таким образом, мы впервые показали, что усиление метаболизма сукцината является метаболическим путем, характерным для стареющих клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Самохвалов, Виктор Александрович, Саратов

1. Вагабов В.М., Трилисенко Л.В., Щипанова И.Н. и др. Изменение длины цепи неорганических полифосфатов в зависимости от стадии роста

2. Saccharomyces cerevisiae II Микробиология. 1998. - № 2. - С. 188-193.

3. Герхард Ф. Методы общей бактериологии. Изд-во «Мир», Москва, 1983. с 512.

4. Котельникова А.В., Звягильская Р.А. Биохимия дрожжевых митохондрий. Изд-во «Наука», Москва, 1973. с.233.

5. Кулаев И.С., Вагабов В.М., Кулаковская Т.В. Развитие идей А.Н. Белозерского по биохимии полифосфатов // Биохимия. 2000. - №. 3. - С. 325-333.

6. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий // Биохимия. 2001. - № 5. - С. 592-609.

7. Оловников A.M. Принцип маргинотомии в синтезе полинуклеотидов// * Докл. Акад. Наук. СССР.-1971 .-№ 6. С. 1496-1499.

8. Самохвалов В.А., Мусейкина Н.Ю., Мельников Г.В., Игнатов В.В. Арсенит как индуктор процессов перекисного окисления липидов в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Микробиология. 2003. - Т. 72, № 3. - С. 308-311.

9. Чернышева Е.К., Крицкий М.С., Кулаев И.С. Определение степени полимерности различных фракций неорганических полифосфатов мицелия Neurospora crassall Биохимия. 1971. - № 1. - С. 138-146.

10. Adams A., Gottschling D.E., Kaiser С.A., Stearns Т. Methods in yeast genetics: A laboratory course manual. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997.

11. Afshar G., Murnane J.P. Characterization of a human gene with sequence homology to Saccharomyces cerevisiae SIR2 // Gene. 1999. - Vol. 234. - P. 161-168.

12. Akhmerov R.N. Qualitative difference in mitochondria of endothermic and ectothermic animals // FEBS Lett. 1986. - Vol. 198. - P. 251 -255.

13. Ashrafi K., Sinclair D., Gordon J.I., Guarente L. Passage through stationary phase advances replicative aging in Saccharomyces cerevisiae II PNAS. 1999. - Vol. 96. - P. 9100-9105.

14. Attfield P.V. Stress tolerance: the key to effective strains of industrial baker's yeast // Nature Biotechnol. 1997. - Vol. 15. - P. 1351 -1357.

15. Austriaco N.R., Guarente L.P. Changes of telomere length cause reciprocal changes in the lifespan of mother cells in Saccharomyces cerevisiae II PNAS. 1997. - Vol. 94. - P. 9768-9772.

16. Barker M.G., Walmsley R.M. Replicative aging in the fission yeast Schizosaccharomycespombe // Yeast. 1999. - Vol. 15. - P. 1511-1518.

17. Barnes L.D., McGuire J., Atkinson K. Yeast diphosphopyridine nucleotide specific isocitrate dehydrogenase. Regulation activity and unidirectional catalysis // Biochemistry. 1972. - Vol. 11. - P. 4322-4329.

18. Barnes L., Kuchn G., Atkinson D. Yeast diphosphopyridine nucleotide specific isocitrate dehydrogenase. Purification and some properties // Biochemistry. 1971.-Vol. 10. - P. 3939-3944.

19. Bartrons R., Van Schaftingen E., Vissers S., Hers H.-G. The stimulation of yeast phosphofructokinase by fructose-2,6- bisphosphate // FEBS Lett. 1982. -Vol. 143.-P. 137-140.

20. Bartels P.D., Jensen P.K. Role of AMP in regulation of the citric acid cycle in mitochondria from bakers yeast // Biochim. Biophys. Acta. 1954. - Vol. 582.-P. 246-259.

21. Bell W., Sun W., Hohmann S., Wera S., Reinders A., De Virgilio C., Wiemken A., Thevelein J.M. Composition and functional analysis of the Saccharomyces cerevisiae trehalose synthase complex // J. Biol. Chem. 1998. -Vol. 273.-P. 33311-33319.

22. Beauvoit В., Rigoulet M., Guerin B. Polyphosphates as a source of high energy phosphates in yeast mitochondria: a P-NMR study // FEBS Lett. 1989. -Vol. 252.-P. 17-22.

23. Blomberg A. Metabolic surprises in Saccharomyces cerevisiae during adaptation to saline conditions: questions, some answers and a model // FEMS Microbiol. Lett. 2000. - Vol. 182. - P. 1-8.

24. Boles E., Gohlmann H. W., Zimmermann F. K. Cloning of a second gene encoding 6-phosphofructo-2-kinase in yeast, and characterization of mutant strains without fructose-2,6-bisphosphate // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 20. - P. 65-76.

25. Bonhivers M., Carbrey J.M., Gould S.J., Agre P. Aquaporins in Saccharomyces cerevisiae. Genetic and functional distinctions between laboratory and wild-type strains // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 27565-27572.

26. Bowes I., Mattey M. The effect of manganese and magnesium ions on mitochondrial NADP dependent isocitrate dehydrogenase // Biochemie. 1979. -Vol. 6.-P. 219-227.

27. Bruinenberg P., Van Dijken A., Scheffers W. A theoretical analysis of NADPH production and consumption in yeast // J. Gen. Microbiol. 1093. - Vol. 129.-P. 953-964.

28. Busturia A., Lagunas R. Catabolite inactivation of the glucose transport system in Saccharomyces cerevisiae // J. Gen. Microbiol. 1986. - Vol. 132. - P. 379-385.

29. Cabib E., Leloir L.F. The biosynthesis of trehalose phosphate // J. Biol. Chem. 1958. - Vol. 231. - P. 259-275.

30. Camhi S. L., Lee P., Choi A.M. The oxidative stress response // New Horizons. 1995. - Vol. 3. - P. 170-182.

31. Castrillo J.I., Ugalde U.O. A general model of yeast energy metabolism in aerobic chemostat culture // Yeast. 1994. - Vol. 10. - P. 185-197.

32. Chan Y., Stachow C., Sanwal B. The allosteric nature of NAD-specific isocitrate dehydrogenase // Can. J. Biochem. 1985. - Vol. 43. - P. 111-118.

33. Chance В., Hollunger, G. The interaction of energy and electron transferreactions in mitochondria. I. General properties and nature of the products of succinate-linked reduction of pyridine nucleotide// J.Biol.Chem. 1961a. -Vol. 236. -P. 1534- 1543.

34. Chance В., Hollunger G. The interaction of energy and electron transfer reactions in mitochondria. II. Substrate requirements for pyridine nucleotide reduction in mitochondria. J. Biol. Chem.- 1961b. Vol. 236. -P. 15551561.

35. Cinti D., Moldeus P., Schenkman J. The role of the mitochondria in rat lover mixed function oxidation reactions // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1972.-Vol. 47.-P. 1028-1033.

36. Clark J.E., Wood H.G. Preparation of standards and determination of sizes of long-chain polyphosphates by gel electrophoresis // Anal. Biochem. 1987. -Vol. 161.-P. 280-290.

37. Cleland W., Johnson N. Tracer experiments on the mechanism of citric acid formation //J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 208. - P. 679-705.

38. Cristofalo V.J., Allen R.G., Pignolo R.J., Martin B.G., Beck J.C. Relationship between donor age and the replicative lifespan of human cells in culture: a reevaluation // PNAS. 1998. - Vol. 95. - P. 10614-10619.

39. Cupp J.R., McAlister-Henn L. Cloning and characterization of the gene encoding the IDH1 subunit of NAD-dependent isocitrate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 16417-16423.

40. Davies S., Brindle K.M. Effects of overexpression of phosphofructokinase on glycolys is in the yeast Saccharomyces cerevisiae И Biochemistry. — 1992. — Vol. 31.-P. 4729-4735.

41. Ernandes J.R., de Meirsman C., Rolland F. During the initiation of fermentation overexpression of hexokinase PII in yeast transiently causes a similar deregulation of glycolysis as deletion of Tpsl // Yeast. 1998. - Vol. 14. - P. 255-269.

42. Danielson, L., Ernster, L., 1963. Demonstration of a mitochondrial energy-dependent pyridine nucleotide transhydrogenase reaction. Biochem and Biophys. Res. Commun. 10, 91-96

43. Defossez P.A., Park P.U., Guarente L. Vicious circles: a mechanism for yeast aging // Curr. Opin. Microbiol. 1998. - Vol. 1. - P. 707-711.

44. Dejean L., Beauvoit В., Guerin В., Rigoulet M. Growth of yeast Saccharomyces cerevisiae on a non-fermentable substrate: control of energetic yield by the amount of mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1457.-P. 45-56.

45. Diesel W., Bohme H.J., Nissler C., Freyer R., Heilmann W. A new purification procedure for yeast phosphofructokinase minimizing proteolytic degradation./ Eur. J. Biochem., 1973.38. 479-488.

46. Duffy P.H., Feuers R.J., Leaky J.A., Nakamura K.D., Turturro A., Hart R.W. Effect of chronic caloric restriction on physiological variables related to energy metabolism in the male Fischer 344 rat // Mech. Ageing Dev. 1989. -Vol. 48.-P. 117-133.

47. Egilmez N.K., Jazwinski S.M. Evidence for the involvement of a cytoplasmic factor in the aging of the yeast Saccharomyces cerevisiae // J. Bactcriol. 1989. - Vol. 171. - P. 37-42.

48. Evans С., Scragg A., Ratedge C. Regulation of citrate efflux from mitochondria of oleaginous and non-oleaginous yeast by adenine nucleotides // Eur. J. Biochem. 1981. - Vol. 130. - P. 195-204.

49. Farkas I., Hardy Т., Goebl D. Two glycogen synthase isoforms in Saccharomyces cerevisiae are coded by distinct genes that are differentially controlled//J. Biol. Chem.- 1991.-Vol. 266.-P. 15602-15607.

50. Farkas I., Hardy T.A., DePaoli R.A., Roach, P.J. Isolation of the GSY1 gene encoding yeast glycogen synthase and evidence for the existence of a second gene // J. Biol. Chem. 1990. - Vol. 265. - P. 20879-20886.

51. Fedotcheva N.I., Sharyshev A.A., Mironova G.D, Kondrashova M.N. Inhibition of succinic acid oxidation and potassium ion transport in mitochondria under hybernation//Сотр. Biochem. Physiol. 1985.-Vol. 82.-P. 191-195.

52. Fell D. Understanding the control of metabolism. London: Portland Press, 1997.

53. Fraser A., James C. Fermenting debate: do yeast undergo apoptosis? // Trends Cell Biol. 1998. - Vol. 8. - P. 219-221.

54. Francois J., Van Schaftingen E., Hers H.-G. Characterization of phosphofructokinase 2 and of enzymes involved in the degradation of fructose-2,6-bisphosphate in yeast // Eur. J. Biochem. 1988. - Vol. 171. - P. 599-608.

55. Gadd G.M., Chalmers K., Reed R.H. The role of trehalose in dehydration resistance // FEMS Microbiol. Lett. 1987. - Vol. 48. - P. 249-254.

56. Gancedo C., Serrano R. Energy-yielding metabolism // The Yeasts / Rose A.H., Harrison J.S. (Eds). New York: Academic Press, 1989. - P. 206-259.

57. Gershon H., Gershon D. Paradigms in aging research: a critical review and assessment // Mech. Ageing Dev. 2000. - Vol. 117. - P. 21-28.

58. Glonek Т., Lundc M., Mudgett M. Studies of biological polyphosphate through the use of Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance // Arch. Biochem. Biophys.- 1971.-Vol. 142.-P. 508-513.

59. Godon C., Lagniel G., Lee J., Buhler J.-M., Kieffer S., Perrot M„ Bouchcrie H., Toledano M.B., Labarre J. The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae 11 J. Biol. Chem.- 1998. Vol. 273. - P. 22480- 22489.

60. Granot D., Snyder M. Glucose induces cAMP-independent growth-related changes in stationary- phase cells of Saccharomyces cerevisiae IIPNAS. 1991. -Vol. 88. - P. 5724-5728.

61. Griffits M., Bernofsky, C., 1972. Purification and properties of reduced diphosphopyridine nucleotide kinase from yeast mitochondria. J.Biol.Chem. 247, 1473-1478

62. Guarente L. Sir2 links chromatin silencing, metabolism, and aging // Genes Dev. 2000. - Vol. 14. - P. 1021-1026.

63. Hamel R., Appanna D. Modulation of TCA cycle enzymes and aluminum stress in Pseudomonas fluorescens И J. Inorg. Biochem. 2001. - Vol. 87. - P. 18.

64. Hardy T.A., Roach P.J. Control of yeast glycogen synthase-2 by COOH-terminal phosphorylation // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. - P. 23799-23805.

65. Hardy T.A., Huang D., Roach P.J. Interactions between cAMP-dependent and SNF1 protein kinases in the control of glycogen accumulation in Saccharomyces cerevisiae И J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 27907-27913.

66. Harman D. Aging and oxidative stress // J. Int. Fed. Clin. Chem. 1998. -Vol. 10.-P. 24-27.

67. Hartig A., Simon M.M., Schuster Т., Daugherty J.R., Yoo H.S., Cooper T.G. Differentially regulated malate synthase genes participate in carbon and nitrogen metabolism of S. cerevisiae 11 Nucl. Acids Res. 1992. - Vol. 20. - P. 5677-5686.

68. Hathway J., Atkinson D. The effect of adenylic acid on yeast nicotinamide dinucleotide isocitrate dehydrogehase, a possible metabolic control mechanism // J. Biol. Chem. 1963. - Vol. 238. - P. 2875-2881.

69. Hayflick L., Moorhead P. The serial cultivation of human diploid cell strains// Exp Cell Res. 1961.-Vol. 25.-P. 585-621.

70. Heinisch J., Boles E., Timpel C. A yeast phosphofructokinase insensitive to the allosteric activator fructose-2,6- bisphosphate // J. Biol. Chem. 1996. -Vol. 271.-P. 15928-15933.

71. Heinisch J. Isolation and characterization of the two structural genes coding for phosphofructokinase in yeast // Mol. Gen. Genet 1986. - Vol. 202. -P. 75-82.

72. Hers H., Van Schaftingen E. Fructose-2,6-biphisphate two years after its discovery// Biochem. J. 1982. - Vol. 206. - P. 1-12.

73. Hirai M., Shiotani Т., Tanaka A., Fukui S. Intracellular localization of several enzymes in Candida tropicalis grown on different carbon sources // Agr. Biol. Chem. 1976. - Vol. 40. - P. 1879-1985.

74. Hohmann S, Neves M.J., de Koning W. The growth and signalling defects of the ggsl (fdpl/bypl) deletion mutant on glucose are suppressed by a deletion of the gene encoding hexokinase PII // Curr. Genet. 1993. - Vol. 23. - P. 281-289.

75. Huang K.P., Cabib E. Yeast glycogen synthetase in the glucose-6-phosphate-dependent form. II. The effect of proteolysis // J. Biol. Chem. 1974. -Vol. 249.-P. 3858-3861.

76. Huang D., Wilson W.A., Roach P.J. Glucose-6-Р control of glycogen synthase phosphorylation in yeast // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 2249522501.

77. Humphries K., Szweda S. Selective inactivation of a-ketoglutarate dehydrogenas and pyruvate dehydrogenase: reaction of lipoic acid with 4-hydroxy-2-nonenal // Biochemistry. 1998. - Vol. 37. - P. 15835-15841.

78. Hunsley J. R., Suelter C.H. Yeast pyruvate kinase: kinetic properties // J. Biol. Chem. 1969. - Vol. 244. - P. 4819-4822.

79. Imai S., Armstrong C.M., Kaeberlein M., Guarente L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase // Nature. 2000. - Vol. 403. - P. 795-800.

80. Inge K.J. Polyphosphates of the yeast cell vacuole // J. Gen. Microbiol. -1968.-Vol. 51.-P. 447-455

81. Jakubowski W., Bilinski Т., Bartosz G. Oxidative stress during aging of stationary cultures of the yeast Saccharomyces cerevisiae II Free Radic. Biol. Med.- 2000. Vol. 28. - P. 659-664.

82. Jamieson D.J. Oxidative stress responses of the yeast Saccharomyces cerevisiae И Yeast. 1998. - Vol. 14. - P. 1511-1527.

83. Jazwinski S.M. An experimental system for the molecular analysis of the aging process: the budding yeast Saccharomyces cerevisiae II J. Gerontol. 1990.- Vol. 45. P. 68-74.

84. Jazwinski S.M. Longevity-assurance genes and mitochondrial DNA alterations: yeast and filamentous fungi: Handbook of the biology of aging / Schneider E.L., Rowe J.W. (Eds). San Diego, CA: Academic Press, 1996. - P. 39-54.

85. Jazwinski S.M. Molecular mechanisms of yeast longevity // Trends Microbiol. 1999. - Vol. 7. - P. 247- 52.

86. Jazwinski S.M. Coordination of metabolic activity and stress resistance in yeast longevity // The molecular genetics of aging / Ed Hekimi S. Berlin: Springer, 2000.-P. 21-44.

87. Jazwinski S.M. Metabolic control and aging // Trends in Genetics. 2000. -Vol. 16.-P. 506-511.

88. Johnson F.B., Sinclair D.A., Guarente L. Molecular biology of aging // Cell. 1999. - Vol. 96. - P. 291-302.

89. Jona G., Choder M., Gileadi O. Glucose starvation induces a drastic reduction in the rates of both transcription and degradation of mRNA in yeast // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1491. - P. 37-48.

90. Kaiser D., Losick R. How and why bacteria talk each other // Cell. 1993. -Vol. 79.-P. 873-885.

91. Kaeberlein M., McVey M., Guarente L. The SIR234 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms // Genes Dev. 1999. - Vol. 13. - P. 2570-2580.

92. Kemnitz J.W., Roecker E.B., Weindruch R., Olson D.F., Baum S.T., Bergman R.N. Dietary restriction increases insulin sensitivity and lowers blood glucose in rhesus monkeys // Amer. J. Physiol. 1994. - Vol. 266. - P. 540-547.

93. Kennedy B.K., Austriaco N.R., Guarente L. Daughter cells of Saccharomyces cerevisiae from old mothers display a reduced life span // J. Cell Biol. 1994.-Vol. 127.-P. 1985-1993.

94. Kennedy B.K., Austriaco N.R., Zhang J., Guarente L. Mutation in the silencing gene SIR4 can delay aging in S. cerevisiae H Cell. 1995. - Vol. 80. - P. 485-496.

95. Kim S., Kirchman P.A., Benguria A., Jazwinski S.M. Experimentation with the yeast model // Methods in aging research / Ed. Yu B.P. Boca Raton, FL: CRC Press, 1999.-P. 191-213.

96. Kim S., Benguria A., Lai C.Y., Jazwinski S.M. Modulation of life-span by histone deacetylase genes in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Biol. Cell. 1999. -Vol. 10.-P. 3125-3136.

97. Kispal G., Rosenkrantz M., Guarente L., Srere P.A. Metabolic changes in Saccharomyces cerevisiae strains lacking citrate synthases // J. Biol. Chem. -1988. Vol. 263. - P. 11145-11149.

98. Kondrashova M.N., Grigorenko E.V., Kosenko E.A. Rapid cycle of substrate oxidation under activation of energy metabolism // EBEC Reports V, Aberysthwyth, Ireland, 1988. P. 297.

99. Kondrashova M.N., Grigorenko E.V. Manifestation of stress at the level of mitochondria, their stimulation by hormones // J. Gen. Biol. (Moscow). 1984. -Vol. 46.-P. 516-526.

100. Kondrashova M.N. Biochemical cycle of excitation // Biological and biochemical oscillators / Ed. Chance B. New York; London: Academic Press, 1973.-P. 373-389.

101. Kondrashova M.N., Gogvadze V.G., Babsky A.M. Succinic acid oxidation as the only energy support of intensive Ca2+-uptake by mitochondria // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. - Vol. 109. - P. 376-381.

102. Kornberg A., Kornberg S., Simms E. Metaphosphate synthesis by an enzyme from Esherichia coli H Biochim. Biophys. Acta. 1956. - Vol. 20. - P. 215-221

103. Kuge S., Jones N. YAP1 dependent activation of TRX2 is essential for the response of Saccharomyces cerevisiae to oxidative stress // EMBO J. 1994. -Vol. 13.-P. 655-664.

104. Kulaev I.S., Vagabov V.M. Polyphosphate metabolism in microorganisms//Adv. Microbil. Physiol. 1983.-Vol. 24.-P. 83-171.

105. Kulaev I., Vagabov V., Kulakovskaya T. New aspects of polyphosphate metabolism and function // J. Bioassay Bioeng. 1999. - Vol. 88. - P. 111 -129.

106. Kulaev I.S., Vagabov V.M. Polyphosphate metabolism in microorganisms // Adv. Microbiol. Physiol. 1983. - Vol. 24. - P. 83-171.

107. Lagunas R., Dominguez C., Busturia A., Saez M.J. Mechanism of appearance of the Pasteur effect in Saccharomyces cerevisiae: inactivation of sugar transport systems//J. Bacteriol. 1982. - Vol. 152.-P. 19-25.

108. Langen P., Liss E. Uber bildung und um satz die polyphosphate der Hefe // Biochem. Z. 1958. - Vol. 330. - P. 455-466.

109. Larsson C., Pahlman I.-L., Gustafsson L. The importance of ATP as a regulator of glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae И Yeast. 2000. - Vol. 16.-P. 797-809.

110. Lemire В., Oyedotun К. The Saccharomyces cerevisiae mitochondrial succinate: ubiquinone oxidoreductase // Biochim. Biophys Acta. 2002. - Vol. 1553.-P. 102-116.

111. Li F., Flanary P.L., Altieri D.C., Dohlman H.G. Cell division regulation by BIR1, a member of the inhibitor of apoptosis family in yeast // J. Biol. Chem. -2000. Vol. 275. - P. 6707-6711.

112. Lillie S., Pringle J. Reserve carbohydrate metabolism in Saccharomyces cerevisiae: responses to nutrient limitation // J. Bacteriol. 1980. - Vol. 140. - P. 1384-1394.

113. Lin S., Kaeberlein M., Andalis A., Sturtz L., Defossez P., Culotta V., Fink G., Guarente L. Calorie restriction extends Saccharomyces cerevisiae lifespan by increasing respiration // Nature. 2002. - Vol. 418. - P. 344-348.

114. Lin S., Manchester K, Gordon J. Enhanced gluconeogenesis and increased energy storage as hallmarks of aging in Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 36000-36007.

115. Liou L.-L., Fabrizio P., Moy V.N., Vaupel J.W., Valentine J.S., Gralla E.B. The importance of ATP as a regulator of glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae I/ Yeast. 2000. - Vol. 16. - P. 797-809.

116. Longo V.D. Mutations in signal transduction proteins increase stress resistance and longevity in yeast, nematodes, fruit flies, and mammalian neuronal cells // Neurobiol. Aging. 1999. - Vol. 20. - P. 479-486.

117. Longo V.D., Ellerby L.M., Bredesen D.E., Valentine J.S., Gralla E.B. Human Bcl-2 reverses survival defects in yeast lacking superoxide dismutase and delays death of wild-type yeast // J. Cell. Biol. 1997. - Vol. 137. - P. 1581 -1588.

118. Longo V.D., Gralla E.B., Valentine J.S. Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem.-1996.-Vol. 271.-P. 12275-12280.

119. Laun P., Pichova A., Madeo F., Fuchs J., Ellinger A., Kohlwein S., Dawes I., Breitcnbach M. Aged mother cells of Saccharomyces cerevisiae showmarkers of oxidative stress and apoptosis // Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 1166-1173.

120. Londesborough J., Vuorio O. Trehalose-6-phosphate synthase /phosphotase complex from bakers' yeast: purification of a proteolytically activated form //J. Gen. Microbiol. 1991. Vol 237.- P. 323-330.

121. Lowry O.H., Rosebrough N.I., Farr A.L., Randell R.J Protein measurmentwith the Folin phenol reagent//J.Biol.Chem- 1951.-Vol.193.-P. 265-275.

122. Ma H., Kubicek C. Malate dehydrogenase isoenzymes in Saccharomyces cerevisia /I FEMS Lett. 1981. - Vol. 12. - P. 147-154.

123. Maevsky E.I, Guzar I.В., Rosenfeld A.S., Kondrashova M.N. Does not succinic acid mediate adrenaline stimulation in mitochondria? // EBEC Reports 2. Lyon: LBTM-CNRS, 1982. - P. 537-538.

124. Meixner-Minori В., Kubicek C., Habison A. Pyruvatkinase: a regulatory enzyme in glycolysis? // Can. J. Microbiol. 1984. - Vol. 30. - P. 16-22.

125. Mexiner-Minori В., Kubicek C., Habison A. Presence and regulation of the a- ketoglutaratedehydrogenase multyenzyme complex // J. Bacteriol. 1985. -Vol. 161.-P. 265-273.

126. McAlister-Henn L., Thompson L.M. Isolation and expression of the gene encoding yeast mitochondrial malate dehydrogenase // J. Bacteriol. 1987. - Vol. 169.-P. 5157-5166.

127. McCammon M.T., Veenhuis M., Trapp S.B., Goodman J.M. Association of glyoxylate and beta-oxidation enzymes with peroxisomes of Saccharomyces cerevisiae И J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172. - P. 5816-5827.

128. McCarter R., Masoro E.J., Yu B.P. Does food restriction retard metabolic rate? // Amer. J. Physiol. 1985. - Vol. 248. - P. 488-490.

129. Maclean M., Harris N., Piper P.W. Chronological lifespan of stationary phase yeast cells; a model for investigating the factors that might influence the aging of postmitotic tissues in higher organisms // Yeast. 2001. - Vol. 18. - P. 499-509.

130. Minard K.I., Jennings G.T., Loftus T.M., Xuan D., McAlister-Henn L. Sources of NADPH and expression of mammalian NADP-specific isocitrate dehydrogenases in Saccharomyces cerevisiae I I J. Biol. Chem, 1998. - Vol. 273. -P. 31486-31493.

131. Mortimer R.K., Johnston J.R. Life span of individual yeast cells // Nature. 1959.-Vol. 183.-P. 1751-1752.

132. Mortimer R.K., Johnston J.R. Genealogy of principal strains of the yeast genetic stock center // Genetics. 1986. - Vol. 113. - P. 35-43.

133. Mukamolova GV, Kormer SS, Kell DB, Kaprelyants AS. Stimulation of the multiplication of Micrococcus luteus by an autocrine growth factor // Arch Microbiol.-1999.-Vol.172.-P.9-14.

134. Neilson N. The presence of aconitase and aconitic hydratase in Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 1986. - Vol. 171. - P. 356-365.

135. Nichols D. Mitochondrial function and dysfunction in the cell: its relevance to aging and aging-related disease // J. Biochem. Cell Div. 2002. - Vol. 34.-P. 1372-1381.

136. Nilsson A., Larsson C., Gustafsson L. Catabolic capacity of Saccharomyces cerevisiae in relation to the physiological state and maintenance requirement // Thermochim. Acta. 1995. - Vol. 250. - P. 233-245.

137. Ogawa Y, Atkinson D. Interaction between citrate and nucleoside triphosphates in binding to phosphofructokinase // Biochemistry. 1985. - Vol. 24. - P. 954-958.

138. Paravicini G., Kretschmer M. The yeast FBP26 gene codes for a fructose-2,6-bisphosphatase // Biochemistry. 1992. - Vol. 31. - P. 7126-7133.

139. Park P.U., Defossez P.A., Guarente L. Effects of mutations in DNA repair genes on formation of ribosomal DNA circles and life span in Saccharomyces cerevisiae I/ Mol. Cell Biol. 1999. - Vol. 19. - P. 3848-3856.

140. Parrou J.L., Enjalbert В., Plourde L., Bauche A., Gonzalez В., Francois J. Dynamic response of reserve carbohydratemetabolism under carbon and nitrogen limitations in Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 1999. - Vol. 15. - P. 191-203.

141. Parrou J.L., Francois J.M. A simplified procedure for a rapid and reliable assay of both glycogen and trehalose in whole yeast cells //Anal. Biochem. 1997. -Vol. 248.-P. 186-188.

142. Pick U., Weiss M. Polyphosphate hydrolysis within acidic vacuoles in response to amino-induced alkaline stress in the galotolerant alga Dunaliella salina /I Plant Physiol. 1991. - Vol. 97. - P. 1234-1240.

143. Pilatus U., Mayer A., Hildebrandt A. Nuclear polyphosphate as a possible source of energy during the sporulation of Physarum polycephaliim II Arch. Biochem. Biophys. 1989. - Vol. 275. - P. 215-223.

144. Plourde-Owobi L., Durner S., Goma G., Francois J. Trehalose reserve in Saccharomyces cerevisiae: phenomenon of transport, accumulation and role in cell viability // Int. J. Food Microbiol. 2000. - Vol. 55. - P. 33-40.

145. Priault M., Bessoule J.J., Grelaud-Coq A., Camougrand C., Manon S. Bax-induced cell death in yeast depends on mitochondrial lipid oxidation // Eur. J. Biochem. 2002. - Vol. 269. - P. 5440-5450.

146. Rodriguez R.J. Polyphosphate present in DNA preparation from filamentous fungal species of Colletotrichum inhibits restriction endonucleases and other enzymes // Anal. Biochem. 1993. - Vol. 209. - P. 291 -297.

147. Rosenzweig R.F. Regulation of fitness in yeast overexpressing glycolytic enzymes: parameters of growth and viability // Genet. Res. Camb. 1992. - Vol. 59. - P. 35-48.

148. Rothman-Denes L.B., Cabib E. Two forms of yeast glycogen synthetase and their role in glycogen accumulation // PNAS. 1970. - Vol. 66. - P. 967-974.

149. Roy N., Runge K.W. Two paradox involved in transcriptional silcncing that antagonistically control yeast life span // Curr. Biol. 2000. - Vol. 10. - P. 111-114.

150. Salas M., Vinuela N. Citrate inhibition of phosphofructokinase and the Pasteur effect // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. - Vol. 19. - P. 371376.

151. Samokhvalov V.A., Ignatov V.V., Kondrashova M.N. Reserve 0 carbohydrates aintain the viability of Saccharomyces cerevisiae cells duringchronological aging// Mech. Ageing Dev. 2004. - Vol. 125. - P. 229-235.

152. Schaaff I., Heinisch J., Zimmermann F.K. Overproduction of glycolytic enzymes in yeast // Yeast. 1989. - Vol. 5. - P. 285-290.

153. Schatz, G., Racker, E., 1966. Stable phosphorylating submitochondrialparticles from baker's yeast. Biochem and Biophys. Res. Commun. 22, 579-584.

154. Schulze U., Elleskov N., Larssen M., Villadsen J. Determination of intracellular trehalose and glycogen in Saccharomyces cerevisiae И Anal. Biochem. 1995. - Vol. 228. - P. 143-149.

155. Shaham S., Shuman M.A., Herskowitz I. Death-defying yeast identify * novel apoptosis genes // Cell. 1998. - Vol. 92. - P. 425-427.

156. Shirahama K., Yazaki Y., Sakano K. Vacuolar function in the phosphate homeostasis of the yeast Saccharomyces cerevisiae II Plant Cell Physiol. 1996. -Vol. 37.-P. 1090-1093.

157. Semenza G.L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia // J. Appl. Physiol. 2000. - Vol. 88. - P. 1474-1480.

158. Sinclair D.A. Yeast aging research: recent advances and medical relevance // Cell Mol. Life Sci. 1999. - Vol. 56. - P. 807-816.

159. Sinclair D.A., Guarente L. Extrachromosomal rDNA circles a cause ofaging in yeast//Cell. 1997.-Vol. 91.-P. 1033-1042.

160. Sinclair D.A., Mills K., Guarente L. Molecular mechanisms of yeast aging//Trends Biochem. Sci. 1998. - Vol. 23. - P. 131-134.

161. Silje H., Paalman J, ter Schure E.G. Function of trehalose and glycogen in cell cycle progression and cell viability in Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 1999.-Vol. 181. P. 396-400.

162. Skorko R. Polyphosphate as a source of phosphoryl group in protein modification in archebacterium Sulfolohus acidocaldarius // Biochimie. 1989. -Vol. 71.-P. 9-10.

163. Srere P. Citrate enzymes: their structures, mechanisms and biological * functions // Curr.Topics Cell Regul. 1962. - Vol. 5. - P. 229-283.

164. Steels E.L, Lear-Month R.P., Watson K. Stress tolerance and membrane lipid unsaturation in Saccharomyces cerevisiae grown aerobically or anaerobically II Microbiology. 1994. - Vol. 140. - P. 569-576.

165. Supakar P.C., Roy A.K. Role of transcription factors in the age-dependent regulation of the androgen receptor gene in rat liver // Biol. Signals. -1996.-Vol. 5.-P. 170-179.

166. Teusink В., Passarge J., Reijenga CA. Can yeast glycolysis be understood in terms of in vitro kinetics of the constituent enzymes? Testing biochemistry II Eur. J. Biochem. 2000. - Vol. 267. - P. 5313-5329.

167. Thevelein J.M., Hohmann S. Trehalose synthase: guard to the gate of glycolysis in yeast // Trends Biochem. Sci. 1995. - Vol. 20. - P. 3-10.

168. Van Hoek P., van Dijken J.P., Pronk J.T. Regulation of fermentative capacity and levels of glycolytic enzymes in chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae II Enzyme Microbiol. Technol. 2000. - Vol. 26. - P. 724-736.

169. Van Dijck P., Colavizza D., Smet P., Thevclcin J.M. Differential importance of trehalose in stress resistance in fermenting and nonfermenting Saccharomyces cerevisiae cells // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - Vol. 61. -P. 109-115.

170. Van Hoek P, van Dijken J.P, Pronk J.T. Regulation of fermentative capacity and levels of glycolytic enzymes in chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae И Enzyme Microbiol. Technol. 2000. - Vol. 26. - P. 724-736.

171. Van Hoek P., van Dijken J.P., Pronk J.T. Effect of specific growth rate on fermentative capacity of bakers' yeast // Appl. Environ. Microbiol. 1998. -Vol. 64. - P. 4226-4233.

172. Vandercammen A., Francois J., Hers H.G. Characterization of trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6-phosphate phosphotase of Saccharomyces cerevisiae // Eur. J. Biochem. 1989. - Vol. 182. - P. 613-620.

173. Weitzman P., Danson M. Citrate synthase // Curr. Topics Cell Regul.-1976.-Vol. 10.-P. 161-205.

174. Werner-Washburne M., Braun E., Johnston G.C., Singer R.A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae 11 Microbiol. Rev. 1993. - Vol. 57. -P. 383-401.

175. Werner-Washburne M., Braun E.L., Crawford M.E., Peck V.M. Stationary phase in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 19.-P. 1159-1166.

176. Westenberg В., Boiler Th., Wiemken A. Lack of arginine and polyphosphate storage pools in a vacuole deficient mutant (end 1) of S. cerevisiae И FEBS Lett. - 1989. - Vol. 254. - P. 133-136.

177. Wiame J.M. Etude d'une substance polyphosphate basophile et metachromatique chez les levures // Biochim. Biophys. Acta. 1947. - Vol. 1. - P. 234-255.

178. Wiemken A., Durr, M. Characterization of amino asid pools in the vacuolar compartment of Saccharomyces cerevisiae II Arch. Microbiol. 1974. -Vol. 101.-P. 45-57.

179. Wiemken, A. Trehalose in yeast, stress protectant rather than reserve carbohydrate I I Antonie van Leeuwenhoek. 1990. - Vol. 58. - P. 209-217.

180. Wills C. Regulation of sugar and ethanol metabolism in Saccharomyces cerevisiae И Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1990. - Vol. 25. - P. 245-280.

181. Urech K., Durr M., Boiler Th. Localization of polyphosphate in vacuoles of Saccharomyces cerevisiae I I Arch. Microbiol. 1978. - Vol. 116. - P. 275-278.

182. Xie Y., Varshavsky A. The N-end rule pathway is required for import of histidine in yeast lacking the kinesin-like protein Cin // Curr. Genet. 1999. - Vol. 36.-P. 113-123.

183. Zhao W.N., McAlister-Henn L. Expression and gene disruption analysis of the isocitrate dehydrogenase family in yeast // Biochemistry. 1996. - Vol. 35. - P. 7873-7878.1. БЛАГОДАРНОСТИ

184. Автор искренне благодарен за помощь в проведении экспериментальных работ, а также в обсуждении полученных данных профессорам И.С. Кулаеву и В.М. Вагабову (ИБФМ РАН, Пущино).

Информация о работе

Самохвалов, Виктор Александрович
кандидата биологических наук
Саратов, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Метаболический контроль старения дрожжей Saccharomyces cerevisiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы