Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Координация экспрессии генов, контролирующих метаболизм пуринов и аминокислот у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Координация экспрессии генов, контролирующих метаболизм пуринов и аминокислот у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

г: ОД

ГЕЦОВА " О 7иГ1

Мария Леоиндовна

КООРДИНАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ МЕТАБОЛИЗМ ПУРИНОВ И АМИНОКИСЛОТ У ДРОЖЖЕЙ

хл ссиляомуа.я селеушае.

Специальность 03.00.15 - генетика.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Биологическом научно-исследовательском институте СПбГУ, Санкт-Петербург, университете Paris-Sud г. Париж (Франция) и Институте клеточной биохимии и генетики г. Бордо (Франция).

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

кандидат химических наук,

доцент

В.В.Аленин.

доктор биологических наук Т.Р. Сойдла

доктор биологических наук А.П. Перевозчиков

Петербургский институт

ядерной физики

им. Б.П. Константинова РАН

Защита диссертации состоится " б> " (_( ЫЭ ^ ^ 2000 г. в__ч

на заседании Диссертационного совета Д.063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, кафедра генетики и селекции, ауд. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан " 2000 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.063.57.21

кандидат биологических наук Л.А. Мамон

£ т. w, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поиск ответа на вопрос, как клетка воспринимает сигналы, поступающие из окружающей среды, и отвечает на них модуляцией экспрессии своего генома является одной из важных задач, стоящих перед молекулярной биологией. Решение указанной задачи требует комплексного исследования целого ряда проблем: идентификации внешнего индуктора и сигнальной сети, посредством которой сигнал об индукторе передается в ядро клетки; выявления генов-мишеней, в результате изменения активности которых формируется ответ клетки на внешнее воздействие; исследования молекулярных механизмов, обеспечивающих изменение экспрессии отдельных генов и координацию экспрессии «сего генома в ответ на изменение внешних условий.

В настоящее время единственным эукариотическим организмом, для которого удалось получить информацию об интегральном ответе генома на некоторые внешние воздействия, являются дрожжи Saccharomyces cerevixiae. Это стало возможным благодаря секвепнрованию дрожжевого генома и разработке "biochip-техпологии" (DeRisi et al., 1997), позволяющей количественно оценивать транскрипционную активность практически всего генома дрожжей (6400 геиов) при заданных условиях культивирования. Использование указанной технологии показало, что при метаболическом стрессе, индуцированном уменьшением концентрации экзогенной глюкозы в процессе культивирования дрожжей, происходит глобальное изменение транскрипционной активности генома (активация 710 генои и репрессия 1030 генов). При этом наблюдается координированная регуляция экспрессии сотен генов: например, однотипный характер репрессии для генов, кодирующих белки аппарата трансляции (112 рибосомных белков, 25 факторов, участвующих в инициации и элонгации трансляции и 17 тРНК-синтетаз). Молекулярные механизмы такой координированной регуляции в настоящее время не установлены.

У дрожжей S. cerevisiae известны и другие регуляторные системы, обеспечивающие координацию экспрессии генов, кодирующих ферменты различных биосинтетических цепей в условиях метаболического стресса. Одна из таких систем, лолучншная название системы базальиого коптроли, обеспечивает базальный уровень транскрипции генов, контролирующих метаболизм аминокислот, пуринов, фолатов и фосфата. Одновременно с этим эта система обеспечивает ответ клеток на изменение концентрации экзогенного аденина. Известно, что увеличение концентрации аденина в среде культивирования приводит к снижению экспрессии целого ряда генов, кодирующих ферменты метаболизма пуринов (Mantsala and Zalkin, 1984; Аленин и др., 1987; Daignan-Fornier and Fink, 1992), аминокислот (Tice-Bakkvin et al., 19S9) и фолатов (Denis, Daignan-Fornier, 1998). Это явление получило название "аденнпоной fcnpecciiu". За изменение

транскрипционной активности в этом случае отвечают ДНК-связывающие белки Baslp и Bas2p. Белок Baslp имеет гомологию с вирусным онкобелком v-myb и его клеточным гомологом c-myb животных и человека. Белок Bas2p содержит гомеодомен, обнаруженный у многих транскрипционных факторов высших эукариот. Механизм, с помощью которого осуществляется репрессия генов белками Baslp и Bas2p, 11 эндогенный индуктор репрессии до настоящего времени не установлены.

В природных условиях для клеток дрожжей более опасен недостаток аминокислот и пуринов, чем их избыток. В условиях аминокислотного или пуринового голодания наблюдается координированная активация экспрессии десятков генов, кодирующих ферменты метаболизма аминокислот, пуринов и фолиевой кислоты. За такую активацию отвечает ДНК-связывающий белок Gcn4p, принадлежащий к АР 1-семейству регуляторных белков и имеющий гомологию с онкобелком v-jun в области ДНК-связывающего домена. Указанная регуляторная система получила название системы общего контроля биосинтеза аминокислот (Fink, 1982).

Исследование механизмов координации экспрессии генов в условиях метаболического стресса актуально как в плане получения фундаментальных знаний о сигнальных сетях и механизмах регуляции экспрессии генома эукариот, так и в практическом аспекте. Хорошо известно, что ряд тяжелейших наследственных заболеваний человека связан с нарушением нормального функционирования пуринового (синдром Леша-Найхана, гиперурикемия, подагра, некоторые формы иммунной недостаточности) и аминокислотного (фенилкетонурия, гомоцистинурия) метаболизма. Исследование механизмов метаболического стресса представляет несомненный интерес и для частной генетики дрожжей. Это обусловлено тем, что большинство лабораторных штаммов маркировано мутациями в генах аминокислотного и пуринового метаболизма. Поэтому очень часто в условиях эксперимента клетки дрожжей находятся в состоянии метаболического стресса. Стресс может быть обусловлен как недостатком определенных компонентов (голодание), так и их избытком или дисбалансом, что может существенно влиять на физиологическое состояние клеток.

Настоящая работа посвящена изучению механизмов, обеспечивающих координацию экспрессии генов, контролирующих пуриновый и аминокислотный метаболизм у дрожжей S. cerevisiae, в условиях адениновой репрессии и пуринового и аминокислотного голодания.

Пели н задачи исслелоплпип. Настоящее исследования было предпринято с целыо идентификации сигнальных сетей и изучения регуляции экспрессии генов, обеспечивающих координацию аминокислотного и пуринового метаболизма дрожжей в условиях адениновой репрессии и аминокислотного и пуринового голодания.

Основные задачи диссертационной работы:

1. Выявление природных пуринов, способных индуцировать адениноную репрессию.

2. Идентификация генов, кодирующих белки сигнальной сети адениновой репрессии.

3. Изучение механизмов координации экспрессии генов пуринового (ADEI и ADE2) и аминокислотного (HIS4 и LYS2) метаболизма в условиях метаболического стресса, индуцированного экзогенными пуринами и аминокислотным и пуриновым голоданием.

4. Изучение влияния мутаций adel и acle2 (индуцирующих пуршювое голодание) на экспрессию генов пуринового и гистидинового метаболизма.

5. Картирование промоторной области гена ADE2 с целью выявления цис-элементов, отвечающих за базальную экспрессию и регуляцию в условиях метаболического стресса.

Научная нотпнп исследовании. Обнаружены не описанные ранее экзогенные индукторы, вызывающие пуриновую репрессию у дрожжей S. cerevisiae. Помимо идентифицированного ранее аденина, такими индукторами являются гипоксантин, гуанин и S-аденозилметионин.

Идентифицированы гены, кодирующие белки сигнальной сети пуриновой репрессии, основными компонентами которой являются ферменты утилизации и взаимопревращений пуринов и Транскрипционные факторы Baslp н Bas2p .

На основании полученных данных высказана гипотеза о том, что эндогенный сигнал, вызывающий пуриновую репрессию, а также индукцию системы общего контроля, формируется и результате изменения пула ADP и ДТР.

Установлено, что п условиях аминокислотного голодания экспрессия генов пуринового биосинтеза (ADE1 и Л1>Е2) и генов аминокислотного биосинтеза (LYS2 и HIS4) координируется белком Gca4p (ССЫ4-'!аписпмая активация генов). Обнаружена ОСЖ-незаписимая активация гена HIS4 в условиях пуринового голодания.

При пуриновой репрессии наблюдается координация экспрессии генов ADEI, ADE2 и HIS4, которая опосредована белками Baslp и Bas2p.

Полученные данные об экспрессии генов в условиях пуринового и аминокислотного голодания позволили разработать метод прямой селекции красных мутантов adel и adel. Метод дает возможность количественно оценивать уровень спонтанного и индуцированного мутагенеза для генов ADE1 и ADE2.

Практическая ченноеп, рпботм. Разработанная система селекции красных аденинзависнмых мутантов может быть пспользована для изучения спонтанного и индуцированного мутагенеза у дрожжей S. cerevisiae, а также для выявления мутагенов в окружающей среде.

Поскольку целый ряд тяжелейших наследственных заболеваний связан с нарушением нормального функционирования пуринового и аминокислотного метаболизма, изучение механизмов регуляции этих метаболических цепей у модельных эукариотнческих организмов представляет очевидный практический интерес и может оказаться полезным при разработке методов диагностики и лечения заболеваний человека.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы были доложены на следующих научных конференциях и семинарах: XV Международный специализированный симпозиум по дрожжам. Рига, 1991; XI и XII Всероссийская конференция "Структура и функции клеточного ядра", С-Петербург, 1993 и 1996; I Съезд ВОГиС, Саратов, 1994; Международная школа-семинар по искусственному интеллекту, Браслав, 1997; II Съезд ВОГиС, Санкт-Петербург, 2000.

Структура и объем работы Диссертация изложена на страницах, состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы, включающего наименований. Работа

содержит таблиц и рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы. В работе использовали гаплоидные гетероталличные штаммы дрожжей S. cerevisiac. Генотипы основных штаммов представлены в табл. 1.

Плазмнды. Для измерения уровня экспрессии слитых генов ADEl::hcZ, ADE2::lacZ, HIS4::lacZ, LYS2::lacZ штаммы трансформировали, соответственно, шмзмидами, р115, р2, рАВ177 и pLZ026. Для получения штаммов, несущих в разной комбинации гены GC.N4, BAS1 и BAS2, использовали плазмиды YCp50-GCN4, YCp50-BASl, YCp50-BAS2 (Tice-Baldwin et al., 1989). Для картирования промоториой области гена ADE2 использовали плазмиды pDM6-A7, pDM6-Al-4 и рБМ6-Д50, сконструированные на основе вектора pDM6, который содержит репортерный ген lacZ, "слитый" с участком (-504 - +12) гена ADE2 и несущие делеции различной длины в промоториой области гена ADE2 (Gedvilaite, Sasnauskas, 1994).

Методы. В работе использованы стандартные методы классической генетики дрожжей (Захаров и др., 1984). Для работы с ДНК и белками использовали стандартные методы генной инженерии (Маниатис и др., 1984). Блот-гибрндизацию по Саузерну проводили по стандартной методике. Для секвенирования ДНК использовали модифицированную методику секвенирования Сэнджера (Sanger et al., 1977). Измерение активности галактозидазы проводили по методу, описанному в литературе (Ruby et al, 1983) и выражали в условных единицах (у. е.). Химический, УФ- и ПЦР-мутагенез проводились по стандартным методикам. Измерение активностей

Таблица 1. Генотипы штаммов, использованных в работе

Штамм Генотип

9995-D8 МАТос 1еи2-3,112 ura3-52 gcn4-l

CY931 МАТа Ien2-3,U2 ura3-52 gcn4-2 basl-2

CY544 МАТа 1еи2-3,И2 tira3-52 gcn4-2 basl-2 bas2-2

1Г1-544 МАТа 1еи2-3,112 urn3-52 i>cn4-l

L3079 МАТа игаЗ-52 %cn4-2

PLY121 МАТа 1еи2-3,112 ura3-52 Iys2-A201 his3-A200

PLY122 MATa leu2-3,112 ura3-52 Ш-А201

Y508 MATa 1еи2-3,112 игаЗ-52 h>s2-A20l hptl::URA3

Y511 MATa Ieu2-3,112 ura3-52 Iys2-A201 aptl::URA3

Y520 MATa Ieu2-3,112 urai-52 Iys2-A201 aahI::URA3

Y550 MATa Icu2-3,112 itra3-52 Iys2-d201 aptl::URA3 aahl::URA3

Y815 MATa Ieu2-3,1I2 um3-52 Iys2-A201 his3-A2Q0 adc2 hptl::URA3

Y810 МАТа 1еи2-3,112 ura3-52Iys2-A201 his3-A200 trplr.hisG apl2::IIIS3

Y745 MATa lea2-3,112 ura3-52 Ivs2-A201 his3-A200 trplr.hisG pnpl::URA3

Y652 MATa leu2-3, /12 ura3-52 Iys2-A201 his3-A200 trplr.hisG xptl::HIS3

Y759 MATa leu2-3,l 12 ura3-52 Iys2-A201 his3-A200 ade2 adol::LFM2

ферментов ггуринового биосинтеза осуществляли по оригинальной методике (Аленин В.В. и др., 1989). Оригинальные и редко применяемые методы приведены в диссертационной работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Приролиые пурины, способные иилупнровать пуриновую репрессию. В результате изучения действия экзогенного аденина на клетки дрожжей S. cerevisiae было установлено, что уже через 15 минут после добавления аденина (в концентрации 0,15 мМ) в среду культивирования дрожжей наблюдается репрессия репортерного гена ADEI ::IacZ, содержащего бактериальный ген lacZ под контролем промотора гена ADEL После переноса клеток на среду без аденина примерно через 30 минут наблюдается дерепрессия репортерного гена. Является ли аденин единственным индуктором пуриновой репрессии? Для ответа на этот вопрос мы трансформировали штамм PLY122 плазмидами р 115 и р2, несущими соответственно гены ADEI:;lacZ и ADE2::lacZ. Трансформанты выращивали в жидких селективных средах, не содержащих и содержащих различные

природные пурины. Уровень экспрессии репортерных генов оценивали но активности р-галактозидазы.

Как следует из данных, представленных в табл. 2, наличие в среде культивирования одного из таких соединений как аденин, гипоксангин, гуанин или й-аденозилметионин приводит к снижению в несколько раз экспрессии репортерных генов АОЕ1::1ас2 и АИЕ2::1ас7., содержащих бактериальный ген 1ас2 под контролем промоторов генов АйЕ1 и АОЕ2. Следовательно все эти соединения являются индукторами репрессии. В связи с этим мы использовали более общий термин «пуриновая репрессия» вместо «адениновая репрессия».

Таблица 2. Экспрессия генов и АОЕ2::1ас2 при культивировании

дрожжей на среде без пуринов (БП) и средах, содержащих аденин (81Э+Ас1е), гуанин (БО+Оиа), гипоксантин (ЯСИ-Нур), ксантнн (ЗШ-Хап) и й-

Штамм Активность (i-галактозидазы (у. е.)

SD SD+Ade SD+Gua SD+Hyp SDfXan SD+SAM

PLY122/pl 15 98±11 16+2 40±6 16+2 90±12 18±2

PLY122/p2 51+5 23+2 37+5 26+4 48±4 25±5

ИяентшЬиканпп сигнальной сети, по которой перелается информация о наличии экзогенных пуринов и поиск потенциальных эндогенных индукторов.

Для идентификации сигнальной сети, которая отвечает за передачу информации о наличии экзогенных пуринов, был использован генетический подход: в лаборатории В. Daignan-Fornier во Франции удалось получить мутанты, названные bra {bypass of repression by adenine), у которых экспрессия пуриновых генов не регулировалась экзогенным аденнном или уровень репрессии отличался от такового у штаммов дикого типа. В результате проведенных совместных исследований указанные мутанты были разделены на три фенотипических класса, которые различались по характеру пуриновой репрессии репортерных генов ADEJ::kicZ, ADE2::lacZ и ADE5,7::lacZ. Среди ¿га-мутанты были обнаружены мутанты, чувствительные к действию пониженной температуры и устойчивые к действию токсичных аналогов пуринов • (табл. 2). Последний фенотип характерен для штаммов дрожжей, несущих мутации в генах, кодирующих ферменты, участвующие в утилизации и взаимопревращении пуринов.

В результате проведенных исследований ¿га-мутантов было выявлено более 7 групп комплементации и идентифицировано 4 гена. Установлено, что

Таблица 2. Характеристика ¿га-мутантов

Мутант Фенотн-пичсскни класс Активность ß-галактозндачы (ADF.lv.hcZ) Фактор репрессии Дополнительные фенотипы *

-Ade 4 Ade

PLY122 (исходный штамм) 17±3 182+12 10.7

bra1-1 Alle"

bra\-2 3 109+12 299+19 2.7

bra]-3 3 109+13 410134 3.8

bra2-\ 3 5617 291128 5.2 es, 8AA1(

bra2-2 3 172+13 408+42 2.4 es, 8AA"

br, (2-3 3 197+23 413128 2.1 8AAK

bra 3-1 1 6117 171114 2.8 8AAr, 8AGk

bra3-2 1 114+13 186121 1.6 8AAK, 8AGr

brai-3 1 245+21 2081-18 0.8 8AAK, 8AGR

bra3-4 1 102±16 162120 1.6 8AAr, 8AGu

braAA 2 68+7 560131 8.2 es, 8AAK

brtA-2 3 195+20 537153 2.8 . es, 8AAR

braS-1 1 26±4 153119 5.9

bra5-2 3 278±18 479126J 1.7 es, 8AA"

br,i5-3 3 253+31 .471149 1.9 es, 8AAK

bru6-2 1 14219 139117 1.0 sag"

hralA 1 89±9 143118 1.6 5FCr, 8AAr, 8AGk

hral-2 1 142+12 204131 1.4 5FCR, 8AAr, 8AGr

*cs - чувствительность к пониженной температуре;, 8ЛЛ , 5FC и 8AG - устойчивость к 8-азаадепину, 5-фторцптознпу н 8-азагуашшу, соответственно.

¿га-мутации затрагивают гены, отвечающие за утилизацию и взаимопревращение пуринов: это гены FCY2, НРТ1, ADEI2 и ADE13 (рис.1). Кроме того оказалось, что на пуриновую регуляцию влияют мутации в генах ЛРТ1 и ААШ, также отвечающих за утилизацию пуринов. Двойная мутация aptlaahl приводит к полной дерепрессни пуриновых генов. При увеличении дозы гена ЛРТ1 путем введения его на мультикопийной плазмнде в мутант hptl наблюдается практически полное восстановление адениновой регуляции. Данные о влиянии мутаций в перечисленных генах на экспрессию регюртерпого гена ADElr.lucZ представлены на рнс.2. Аналогичные результаты получены нами и для реиортерпого гена HlS4::lacZ: мутации в генах FCY2, Ш'Т1 и ADEI3 приводят к исчезновению адениновой регуляции (рис. 3). Следовательно, сигнал о пуриноной репрессии передается к генам гнстиднпового биосинтеза через ту же регулягорную сеть, что и для пуриновых генов: аденни транспортируется в

Биосинтез метиоаина

SAM i

SAI1

I"

Адепозин \

ADO>

dAMP (dMMP)

1IAMI?\ dATP (dllTP)

t

ATP

dADP (dHDP)

KNR2

PRPP

I

i

AIR

^ ADE2 CA1R

' ADE1 SAICAR

ADE13

A1CAR

ADP (HDP)

adk(\

AMP ADEI3 ADE12 (HMP)<— SAMP<- IMP

ADEI 6 ADEI 7

FA1CAR

A DEI6

GDP

APT!

t

Пл. мембрана

Адешш (ПАР)

A A lit

i лиг.ю А

\ADE17 трм CVAl [ GVKI

> ХМР -> GMP

II/>71 f ХРт/\' ИРГ1 f

Ксанчин

Гнпоксантин

____А__

ИРГ! Гуанин

FCY2

FCY2

Адепнн (НАР)

----/ FCY2 ,----

Гиноксантнн

Ксантип Гуанин

Рис. 1. Схема пути биосинтеза, утилизации к взаимопревращений пуринов и eco генетический контроль Приведены сокращенные названия промежуточных продуктов реакций и генов (выделены курсизом), контролирующих соответствующие С'адим. Указан потенциальный путь метаболизма б-Н-гидрокснламииопурина (НАР), обладающего сильным мутагенным эффектом (сокращенные названия метаболитов приведены в скобках).

клетки пермеазой Fcy2p и затем превращается в AMP как непосредственно ф лфорибозилтрансферазой Apt)р, так и в результате дезаминнров.шия ^дешш-аминогндролазой Ла'л. р с последующими превращениями, катализируемыми продукгечь i епоз JÍJ'Ti, A DI:'12 и aD'01 3 (рис.')

Дояол'.г.ггеакдаг чар.и.тврис.'ла ¿ra-мутпнтов бы у лопучсне ¡или (н (.•■оа^горсчсг. с !О.Ч Ийз/юиь.м и С.Г. Кузьминым) up i использовании аналога пуриновых оснований 6-Л/-гидроксиламинопурчна (НАР), обладающего

сильным мутагенным эффектом. Оказалось, что мутагенное действие НАР, практически не проявляется при использовании штаммов с мутациями fcy2 и aptl, но значительно усиливается в штамме с мутацией aahl. Это означает, что основным путем взаимопревращений НАР является путь утилизации

PLY122 Y 508 4511 Y520 Y550

Рис.2. Влияние ¿га-мутаций на экспрессию репортерного гена АОЕ1::1ас2 Приведены средние значения активности р-галактозидазы (в условных единицах) у штамма РЬУ122, который не содержит 6га-мутаций и ¿га-мутантов ЪрП (У508), арИ (У511), аак1 (У520) и арПааЫ (У550), выращенных на среде С без пуринов и средах, содержащих аденин (Ас1е), гуанин (Сиа) н гипоксантин (Нур).

Рис. 3. Влияние ¿га-мутаций на экспрессию репортерного гена HlS4::lacZ. Приведены средние значения активности ß-галактозидазы (в условных единицах) у штамма, который не содержит ¿га-мутаций (и>/), и ¿га-мутантов adel3, hptl и fcyl, выращенных на среде SC без аденина (-Ade) и с аденином (+Ade).

аденина, и амнногидролаза, кодируемая геном ААИ1, является основным ферментом детоксикации этого мутагена (рис. 1).

Кроме того установлено, что ни аденин, ни гипоксантин, ни гуанин не являются эндогенными индукторами пуриновой репрессии, так как мутации hptl и aptlaahl приводят к снятию пуриновой репрессии (рис.2). Аналогичное заключение можно сделать и относительно инозинмонофосфага (IMP) и аденозинмопофосфата (AMP), поскольку мутации в генах ADE12, ADE13 и ADK1 проявляют ¿»га-фенопш. Таким образом можно сделать заключение, что AMP должен превратиться в ADP для передачи сигнала о репрессии. И, наконец, было установлено, что превращение ADP n dADP, катализируемое рибонуклеотид-редуктазой (кодируемой геном RNR2) не требуется для осуществления адениновой репрессии. На основании полученных данных нами предложена гипотеза о том, что эндогенный сигнал, вызывающий пуриновую репрессию, формируется в результате изменения пула эндогенных ADP и АТР. Это, в свою очередь, приводит к изменению регуляции транскрипции генов пурииового и гистидинового метаболизма белками Basl р и Bas2p.

В результате работы по идентификации сигнальной сети, по которой передается информация о наличии экзогенных иуринов, были охарактеризованы три фосфорнбознлтрансферазы (кодируемые у дрожжей S. cerevisiae генами APT], HPTI и ХРТ1), обеспечивающие синтез пуриновых нуклеозидмонофосфатов из соответствующих пуриновых оснований. Кроме того, клонированы два новых гена ADOj и PNP1: ген AD01 кодирует фермент аденозинкиназу, который превращает аденозин, являющийся побочным продуктом биосинтеза метионина, в AMP (рис. 1); ген PNP1 кодирует потенциальную нуринпуклеозид-фосфорилазу. Подробные данные о клонировании и идентификации генов ХРТ1, ADO! и PN PI представлены в диссертационной работе.

Координация экспрессии гепоп пурииового и гнстнлинопого биосинтезов при пурииопой репрессии. Для исследования механизма координации экспрессии генов ADE1, ADE2 и I11S4 в условиях пуриновой репрессии были получены серии изогенных штаммов, несущие в различных сочетаниях делении в генах GCN4, BAS1 и BAS2. Штаммы CY544 (МАТа leu2-3,112 игаЗ-52 gai4 bas 1-2 bus2-2) и СТО/ {МАГа 1еи2-3,112 игаЗ-52 gcn4 bas 1-2) трансформировали плазмидами YCp50-GCN4, YCp50-BASl и YCp50-BAS2, несущими, соответственно, гены GCN4, BAS1 и BAS2 под контролем собственных промоторов, а также плазмидой . YCpHH-DED1::GCN4, несущей структурную область гена GCN4 иод контролем конститутивного дрожжевого промотора DED1 (Struhl et al., 1985). В качестве штамма, имеющего гены BAS1 и BAS2 "дикого" типа в хромосомах, использовали штамм 9995-DS (МАТа Ien2-3,112 ttru3-52 gcn4-l), несущий делецию только в гене GCN4. Уровень экспрессии генов ADE2 и ADEI

оценивали по активности ферментов АИР-карбокснлазы и САИКАР-синтетазы, кодируемых этими генами. Ранее было установлено, что уменьшение концентрации мРНК для генов ЛИЕ! и АИЕ2 в условиях репрессии экзогенным адешшом пропорционально уменьшению активности указанных ферментов, то есть по активности ферментов можно судить о транскрипционной активности генов АОЕ1 и ЛБЕ2 (Аленин и др., 1987).

Как следует из данных, представленных в табл. 3, только в случае штаммов 9995-08 и СУ931/УСр50-ВАБI, в клетках которых отсутствует белок Ссп4р, но синтезируются оба базальных фактора ВаБ1р и Ваз2р, активности АИР-карбоксилазы и САИКАР-синтетазы, соответственно в 2 и 3 раза выше в условиях дерепрессии, чем в условиях репрессии. Во всех остальных случаях активности ферментов снижены и достоверно не отличаются и условиях репрессии и дерепрессии. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что белок Ссп4р не участвует в репрессии генов АОЕ1 и АОЕ2, опосредованной экзогенным аденином; в то же время оба продукта генов ВА51 и ВАБ2 необходимы для осуществления адениновой репрессии и поддержания базального уровня экспрессии указанных генов.

Аналогичный результат получен и для штаммов, представленных в табл. 3, трансформированных плазмидами, несущими репортерные гены

Таблица 3. Результаты определения активностей ферментов САИКАР-синтетазы и АИР-карбоксилазы в условиях репрессии и дерепрессии экзогенным аденином.___

Штамм Айе * (мг/л) Активность САИКАР-синтетазы ** (мкмоль/мин мг) *103 Активность АИР-карбоксилазы ** (мкмоль/мин мг) *103

9995-08 (МАТа ки2-3,112 игиЗ-52 цс/Ы-П 100 0 5,1+0,7 (3,6) 18,4±2,3 1.510.2 (1,8) 2.710.3

СУ544 (МАТа 1ен2-3,112 игаЗ-52 %сп4-2 ba.il-2 1>ах2-2) 100 0 4,7+0,7 (0,9) 4,5+0,8 <0,5*** <0,5

СУ544/УСр50-ВЛ5Г 100 0 5,3±0,7 (1,1) 5,9+0,8 2,2+0,3 (0,9) 2,110,3

СУ544/УСр50-вСЛМ 100 0 4,5±0,6 (0,7) 3,1±0,5 2,5+0,3 (0,9) 2,210,2

СУ931 (МАТа 1сн2-3,Л2 игаЗ-52 цсп-1-2 Ьаз}-2) 100 0 5,510,7 (0,8) 4,6±0,6 1,3±0,2 (1,4) 1,910,2

СУ931/УСр50-ВА51 100 0 4,510,6 (2,3) 10,51.1,3 1,3±0,2 (2,0) 2,610,3

* Ас1е - концентрация аденнпа и среде ** В скобках приведен индекс репрессии адешшом для каждого штамма ***Лкгшшост|, фермента ниже, чем шгшолясг определись данный спектрофотометрнчсский метод.

ADE1:: lacZ, ADE2:: lacZ и HIS4:: lacZ (уровень экспрессии в этом случае оценивался по активности ß-галактозидазы). Было также установлено, что экспрессия репортерного гена LYS2 не регуируется экзогенным аденином и не зависит от наличия в клетках дрожжей белков Baslp н Bas2p (более подробные данные об экспрессии репортерных генов представлены в диссертационной работе).

На основании полученных данных можно заключить, что оба белка Baslp и Bas2p отвечают за базальный уровень экспрессии генов ADE1, ADE2 и H1S4 и необходимы для осуществления пуриновой регуляции. Таким образом, при пуриновой репрессии наблюдается координация экспрессии генов ADEI, ADE2 и HIS4, опосредованная белками Baslp и Bas2p. Белок Gcn4p не принимает участия в пуриновой репрессии указанных генов. Однако, повышение внутриклеточной концентрации этого белка (при аминокислотном голодании, индуцированном добавлением в среду 3-аминотриазола, или в результате конститутивной экспрессии гена DED1 ::GCN4) приводит к активации в несколько раз экспресси генов ADEI, LYS2 и IIJS4 и слабой активации гена ADE2, то есть экспрессия указанных генов пуринового и аминокислотного биосинтеза в условиях аминокислотного голодания координируется белком Gcn4p.

Влияние мутаций aitel и aitc2 на экспрессию генов иурниопого и гистндинового метаболизма. С целью изучения влияния пуринового голодания на экспрессию генов пуринового и гистндинового метаболизма па основе штаммов L3079 и 9995-D8, несущих делецию в гене GCN4, получена серия нечетких мутантов add и adi;2, медленно растущих на среде без оленина. В клетках таких мутантов в результате частичного блока пуринового биосинтеза индуцируется пуриновое голодание. Исходные штаммы и полученные штаммы P52-L3079 (adel leaky), P19-L3079 (adc2 leaky) и P20-9995D8 (adel leaky) трансформировали плазмидами pi 15, pi07 и pAB177, несущими, соответственно, репортерные гены ADEI::hicZ, ADE2::lcicZ и HlS4\\kwZ. Клетки выращивали в жидких селективных средах, не содержащих аденин. Уровень экспрессии репортерных генов у траисформантов оценивали по активности ß-галактозидазы (табл.5). Из полученных данных следует, что нечеткие мутации в генах ADEI и ADE2 приводят к активации экспрессии гена HIS4\\lacZ и влияют на экспрессию генов ADEI::tacZ и ADE2::!acZ: у мутантов add наблюдается активация экспрессии гена ADE2\\lacZ, а у мутантов ade2 - снижение уровня экспрессии гена ADElwkwZ.

Таким -образом, мутации в генах ADEI и ADE2 обладают плейотропным эффектом. Помимо уменьшения скорости роста и накопления красного пигмента, эти мутации вызывают (7С7У</-независимые изменения транскрипционной активности генов пуринового и гистндинового

Таблица 5. Влияние мутаций adel и аск>2 на экспрессию репортерных генов ADElv.lacZ, ADE2::lacZи HlS4::lacZ.___

Штамм My ация Репортерный ген Активность |î-i алактозидазы

P52-L3079/p115 adel A DE l:\lacZ 16.712.1

P52-L3079/p107 adel ADR2v.lacZ 132.5111.6

P52-L3079/ pAB177 adel Il!S4-.-.hicZ 12.3+2.0

P19-L3079/p115 ade2 ADElv.lacZ 10.8+1.8

P19-L3079/p107 ada2 ADE2:\lacZ 78.4110.1

P19-L3079/ pAB177 ade2 HIS4::iacZ 14.5±0.8

L3079/p115 ADElv.lacZ 35.7±3.2

L3079/p107 ADE.2v.lacZ. 70.119.4

L3079/ pAB177 ! 1IS4 : :lacZ 6.8.1-1.1

P20-9995D8/ pAB177 adel HlSiv.lacZ 7.511.4

9995D8/ pAB177 HIS4::lacZ 2.110.3

биосинтезов. Такой эффект, вероятно, опосредован изменением концентрации эндогенных нуклеогидэв. Уменьшение пула пуриновых нуклеотидов в условиях пуринового голодания приводит к О С N4-иезависимой активации гнстидипового биосинтеза. Для такой активации, по-видимому, необходимы активаторы транскрипции Ваз1р и ВаэЗр.

Каптированис промоторпон области гена АРЕ2. На оснонагии данных, полученных при изучении промотора гена АИЕ2 с помощью делеционного картирования и мутагенеза (экспериментаиыше чанные и их подробное обсуждение приведены в диссертационной работе), сделан вывод о расположении цис-регуляторных элементов, необходимых для связывания РНК-полимеразного комплекса и белков-рггуляторов Ссп4р, Пая1 р и Вав^р (Рис.4). В области -94 расположена последовательность для ТАТА-слязываюших белков, облг стн -151 и -194 с одержат последовательность

Baslp

----TGACTC.

-194

Гчс. Л, Схема пром' горной лЧгмзстп vcvzAlj:'?..

Пргдсгнилены » яй^ь: для связывания 7АТ>*. ,!M':H>:vovtfro ксмл..гкск (ТВР) и белков Baslp и Bas 2р, а также потенциальный сайг для связывания белка Reblp.

Reblp

Bas2p )

?j jBasIp j (ты>) p*"

. AACCGGG----TGACTC----ГАТААА--ATG

-172 -1'*1 -94 +1

TGACTC, необходимую для связывания белков Gcn4p и Bas 1р. Мутации в области -172 приводят к снижению экспрессии гена ADE2, что дает основание предполагать, что с этой областью связывается другой активатор транскрипции. Таким регуляторным белком может являться Reblp, принадлежащий к семейству ДНК-связывающих белков, влияющих на структуру хроматина.

При картирование промоторной области гена ADE2 не удалось выявить каких-либо негативных цис-элементои, отвечающих за пури новую репрессию. Таким образом, по-видимому, иуриновая регуляция гена ADE2 осуществляется только посредством транскрипционных факторов Baslp и Bas2p. По полученным данным структура промоторной области гена ADE2 является типичной для большинства пуриновых генов дрожжей, описанных в литературе.

Метод селекции красных адеиннзнвиснмых мутантов. У дрожжей S. cerevisiac известны красные мутанты, колонии которых можно легко идентифицировать визуально. Окраска колоний таких мутантов обусловлена мутациями в генах ADF.1 и ADE2, которые приводят к ауксотрофности по аденину и накоплению в клетках красного пигмента. Несмотря на то, что индуцированные различными мутагенами мутанты adel и ade2 широко и интенсивно используются в различного рода генетических и биохимических исследованиях, до настоящего времени не удавалось получить значительного количества спонтанных красных мутантов из-за низкой частоты их образования.

На основании полученных нами данных о (/СЛ^-независимой активации генов гистидинового биосинтеза у мутантов adel и ade2 было высказано предположение, что такие мутанты должны обладать устойчивостью к ингибитору биосинтеза гнстидина 3-аминогриазолу (3-АТ). Для проверки этого предположения клетки дрожжей, несущие делецию в гене GCN4, инкубировали на твердых селективных средах, содержащих 3-амниотриазол. Обнаружено, что длительная инкубация приводит к образованию отдельных красных колоний на штрихах нерастущих штаммов. Установлено, что красные колонии являются мутантами add и adel. Частота выявления этих мутантов равна примерно 3 10"' (Табл. 6). Соотношение количества мутантов adel к adc2 смещено в сторону ade2. Показано, что частота выявления красных мутантов возрастала примерно на порядок при использовании таких мутагенов как УФ-излучение и N-6-гидроксиламинопурин (НАР) (табл. 7). В случае мутагенеза, индуцированного НАР, увеличивалась также доля ade2 мутантов.

Таким образом, разработанная методика отбора adel и ade2 мутантов позволяет (наряду с хорошо известными системами селекции мутантов fys2 и игаЗ) осуществлять прямую селекцию ауксотрофных мутантов и проводить сравнительное изучение спонтанного и индуцированного мутагенеза у

Таблица 6. Селекция спонтанных красных аск2 и aclel мутантов на ЗАТ-содержащих средах.

Штамм Среда для Кол-во Число мутантов Частота

(генотип) селекции мутантов проанализированных колонии (N) Всего (М) [ude2:adel] Из них нечетких \ade2:udel 1 выявления мутантов (R х ЮУ *

9995-D8 SD/3AT+ura+leu 600 23 [18:5] 9 [8:1] 2.5

(МАТа 1еи2 3,112 чгаЗ-5 gcn-t-1) SD/3AT+ura+lcu-t ade(0.0001%) S D/3 AT+ura+1 eu+ ade(0.0005%) 51 100 2 [2:0] 0 2 [2:0] 2.6

9995-D8/YCp88 (МАТа 1еи2- 3,112 ura3-52 gcnJ-1 ЦЖАЗ]) SD/3AT+lcu 498 24 [19:5] 11 [10:1] 3.2

К544 (МАТа/ен2-3,112 urai- 52 исп4-1) S D/3 AT+ura+1 eu 256 6 [4:2] 1 [1:01 1.6

L3079 (МАТа ига}-52 gcn-l-2) SD/3AT+ura 716 28117:7] 9[4:5] 2.6

щ

* Среднее число клеток в колонии равно 1,5 х 10 ** Частота выявления мутантов R = M/N х 1,5 х 107

Таблица 7. Селекция красных ade2 и adeI мутантов, индуцированных мутагенами, на ЗАТ-содержащих средах.

Кол-во Число мутантов Частота

Штамм Тип мутагенеза проанализированных колонии(N)* Всего (М) \ade2\adel\ Из них нечетких \ude2\adel] выявления мутантов (Их юУ*

9995-1)8 УФ 155 34 [20:14] 14[6:8] 14.8

ГАП 300 164 [147:17] 108 [105:31 36.4

L3079 УФ 150 28 [15:131 13 [9:4] 12.4

* Среднее число клеток в колонии равно 1,5 х 10 ** Частота выявления мутантов R - M/N х 1,5 х 107

дрожжей. По-видимому, ЗАТ-устойчивость мутантов adel и ade2 обусловлена активацией генов гистидинового биосинтеза в ответ на пуриновое голодание, вызванное генетическими блоками ade2 или adel биосинтеза пуринов. Для такой активации, по-видимому, необходимы активаторы транскрипции Baslp и Bas2p.

ВЫВОДЫ

1. Идентифицированы экзогенные индукторы, вызывающие пуриновую репрессию генов аминокислотного и пуринового биосинтезов. Наряду с охарактеризованным ранее адешшом, такими индукторами являются гипоксантин, гуанин и S-аденозилметионин.

2. Идентифицированы гены, кодирующие белки сигнальной сети передачи информации об экзогенных пуринах, основными компонентами которой являются ферменты утилизации и взаимопревращений пуринов и транскрипционные факторы Baslp и Bas2p. Клонированы гены HPTÎ, ХРТ1, ADOl и охарактеризованы кодируемые ими ферменты утилизации пуринов.

3. Генетический анализ мутантов по генам пути взаимопревращений пуриновых нуклеотидов дает основание предполагать, что эндогенный сигнал, вызывающий пуриновую репрессию, формируется в результате изменения пула ADP и АТР.

4. Установлено, что экспрессия генов ADE1, ADE2 пуринового биосинтеза и генов LYS2 и H1S4 аминокислотного биосинтеза координируется белком Gcn4p в условиях аминокислотного голодания. При пуриновой репрессии наблюдается координация экспрессии генов ADE1, ADE2 и HIS4, опосредованная белками Baslp и Bas2p.

5. В условиях пуринового голодания, индуцированного мутациями в генах ADE1 и ADE2, наблюдается Осп4-независимое изменение активности генов пуринового (ADEJ и ADE2) и гистидинового (HIS4) биосинтезов.

6. Картированы цис-регуляторные участки промоторной области гена ADE2, ответственные за базальную экспрессию и адениновую регуляцию.

7. На основании полученных данных о регуляции генов пуринового и гистидинового биосинтезов разработан метод селекции спонтанных adel и ade2 мутантов для штаммов дрожжей, несущих делецию в гене GCN4. Появление красных аденинзависимых мутантов на средах с 3-аминотриазолом обусловлено активацией биосинтеза гистидина » условиях пурипового й аминокислотного голодания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Alenin V.V., Z.K.Nikolaeva, A.A.Kovalyova, D.E.Kapitonov, M.L.Guetsova. The regulation of yeast metabolism by the general amino acid control system // XV Int. Spec.Symp. on Yeasts. Riga. -1991. -P.9.

2. Алешш B.B., М.Л.Гецова, А.В.Кондрашов, М.Ф_Яковлева. Изучение молекулярных механизмов адешшовой репрессии пуриновых генов у низших и высших эукариот // Цитология. -1993. -Т. 35, -С. 52-53.

3. Гецова М.Л., А.Е.Костюк. Изучение молекулярных механизмов пуриновой репрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика. -1994. -Т. 30, прмл. С. 30.

4. Г'ецова МЛ. Регуляция экспрессии метаболитных генов дрожжей транскрипционным!! факторами общего и базалыюго контроля // Вестник СПбГУ. -1995.-N 10, -С. 121.

5. Алешш В.В., М.Л.Гецова. Простой метод селекции красных мутантов adeI и ade2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae Н Цитология. -1997. -Т. 39., -С. 30-31.

6. Алешш В.В., М.Л.Гецова, Простой метод селекции мутантов adel и ade2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae.il Генетика. -1997. -Т. 33, -С. 858-861.

7. Алешш В.В., М.Л.Гецова, М.Г.Самсонова. Принципы представления знаний о молекулярных механизмах стресса у эукариотических организмов: база данных SSE.// Сб.Тр. междунар.школы-семинара по искусственному интеллекту, Браслав, 1997. Мн., БГУИР, -1997, -С. 258-261.

8. Guetsova, M.L., K.Lecoq, B.Daignan-Fornier,. The isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae mutants that constitutively express purine biosynthetic genes.// Genetics. 1997. -V. 147. -P. 383-397.

9. Kozmin, S.G., R.M.Shaaper, P.V.Shcherbakova, V.N.KuIikov, V.N.Noskov, M.L.Guetsova, , V.V.Alenin, I.B.Rogozin, K.S.Makarova and Y.I.Pavlov. Multiple antimutagenesis mechanisms affect mutagenic activity and specificity of the base analog 6-N-liydroxylaminopurme in bacteria and yeastJl Mutation Research.-1998.-V. 402.-P. 4150.

10. Alenin V.V., M.L.Guetsova , M.G.Samsonova, V.N.Serov, LS.Yudenitch. The SSE database (stress signalling in eukaryotes) // Abst. Int. School, Theoretical Biophysics, 23. Moscow, June 15-20,-1998.

11. Alfonzo J.D., T.R.Crother, M.L.Guetsova, B.Daignan-Fornier., M.W.Taylor. APT I, but not APT2, codes for a functional adenine phosphoribosyltransferase in Saccharomyces cerevisiae И J. Bacteriol.-1999. -V. 181, N 1. -P. 347-352.

12. Guetsova M.L., T.R.Crother, M.W.Taylor, B.Daignan-Fornier. Isolation and characterization of the Saccharomyces cerevisiae XPT1 gene encoding xanthine phosphoribosyl transferase //. J. Bacteriol. 1999. -V. 181, N 9. -P. 2984-2986.

13. Гецова М.Л., B.B. Аленин. Ответ трансляционного и транскрипционного аппарата дрожжей Saccharomyces cerevisiae на изменение пула аминокислот и пуринов // Тезисы докл. II съезда ВОГнС. - Саикт-Петербург, 2000. -С. 76.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гецова, Мария Леонидовна

СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Метаболический стресс, опосредованный изменением концентрации эндо- и экзогенных аминокислот и пуринов у дрожжей БассЬаготусез сегеу'мае-».Ю

1.1. Дрожжи Э. сеге^мае как модель для изучения метаболического стресса.

1.2. Регуляция экспрессии метаболитных генов дрожжей белками Ваэ1р и Ваэ2р (система базального контроля).

1.2.1. Общая характеристика системы базального контроля.

1.2.2. Характеристика белков Ваз1р и Ваз2р.

1.2.3. Адениновая репрессия.

1.3. Система общего контроля биосинтеза аминокислот.

1.3.1. Характеристика системы общего контроля.

1.3.2. Индукторы вС-системы и СС-активируемые гены, непосредственно не связанные с биосинтезом аминокислот.

1.3.3. Регуляция экспрессии гена GCN4 на уровне трансляции.

1.3.4. Пуриновое голодание.

1.3.5. Характеристика белка Осп4р.

1.3.6. Регуляторные белки эукариот, эволюционно родственные белку всп4р.

1.4. Другие ДНК-связывающие белки, участвующие в регуляции экспрессии генов пуринового и гистидинового биосинтеза.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Основные обозначения.

2.2. Материалы.

2.2.1. Штаммы.

2.2.2. Плазмиды.

2.2.3. Реактивы.

2.3. Методы.

2.3.1. Условия культивирования штаммов.

2.3.2. Гибридизация, микроманипулирование и тетрадный анализ.

2.3.3. Работа с ДНК in vitro и трансформация Е. coli и дрожжей.

2.3.4. Инактивация (дизрупция) генов.

2.3.5. Мутагенез.

2.3.6. Секвенирование мутантных вариантов промоторной области гена ADE2.-.

2.3.7. Получение дрожжевого белкового экстракта.

2.3.8. Определение активностей САИКАР-синтетазы и АИР-карбоксилазы.

2.3.9. Определение активности ß -галактозидазы.

2.3.10. Методы статистической обработки.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Природные пурины, способные индуцировать пуриновую репрессию.

3.2. Идентификация сигнальной сети, по которой передается информация о наличии экзогенных пуринов и поиск потенциальных эндогенных индукторов.

3.3. Координация экспрессии генов пуринового и аминокислотного метаболизма в условиях пуриновой репрессии и аминокислотного голодания.

3.3.1. Изучение влияния транскрипционных факторов Gcn4p, Baslp и Bas2p на экспрессию генов ADE1 и ADE2 в условиях репрессии и дерепрессии экзогенным аденином.

3.3.2. Изучение влияния экзогенного аденина и белков Bas1, Bas2 и Gcn4p на экспрессию репортерных генов.

3.4. Влияние мутаций adel и ade2 на экспрессию генов пуринового и гистидинового метаболизма.

3.5. Картирование промоторной области гена ADE2.

3.5.1. Делеционное картирование.

3.5.2. Мутагенез промоторной области гена ADE2 при помощи ПЦР.

3.6. Метод селекции красных аденинзависимых мутантов.

3.7. База данных SSE.

СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

АИКАР - 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-аминоимидазол риботид

АИР - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол риботид ак - аминокислота

ЗАТ - З-амино-1,2,4-триазол

ГАП - 6-М-гидроксиламинопурин

ДМСО - диметилсульфоксид

ДТТ - дитиотреитол

КАИР - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол-4-карбоксилат ОРС - открытая рамка считывания ПЕП - среда с пептоном без неорганического фосфата ПЕПФО - среда с пептоном и неорганическим фосфатом ПЦР - полимеразная цепная реакция

САИКАР - 5'-фосфорибозил-4-(Л/-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол

Трис - 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол

УФ - ультрафиолетовое излучение

ФРА - фактор репрессии аденином

ЭДТА - этилендиаминтетраэтановая кислота

АА - 8-азааденин

ААН - аденинаминогидролаза

Ade - аденин

AG - 8-азагуанин

АХ - 8-азаксантин

AICAR - 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-аминоимидазол риботид

AIR - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол риботид

AmpR - устойчивость к ампициллину

ASL - аденилосукцинатлиаза

ASS - аденилосукцинатсинтетаза

APRT - аденинфосфорибозилтрансфераза

CAIR - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол-4-карбоксилат

CP - 6-хлорпурин

DMSO - диметилсульфоксид

FAICAR - 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-формамидоимидазол FC - 5-фторцитозин

FGAR - 5'-фосфорибозил-Л/-формилглицинамид FO - фтороротовая кислота

GC-система - система общего контроля биосинтеза аминокислот Gua - гуанин

H(G)PRT - гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза

HOL - гистидинол

HOLP - гистидинол-фосфат

Hyp - гипоксантин

HPRT - гипоксантинфосфорибозилтрансфераза

IAP - имидазол ацетол-фосфат

IGP - имидазол глицерол-фосфат

IMP - инозинмонофосфат

LB - полная среда «Luria Broth»

MD - среда минимальная с глюкозой

PRAMP - М'-5'-фосфорибозил-АМР

PRATP - М'-5'-фосфорибозил-АТР

PRFAR - М'-5'-фосфорибозил-формимино-5-аминоимидазол-4-карбоксамид рибонуклеотид

PRPP - 5-фосфо-а-0-рибозил-1-пирофосфат

SAICAR - 5'-фосфорибозил-4-(Л/-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол

SAM - S-аденозилметионин

SAMP - сукцинил-АМФ

TetR - устойчивость к тетрациклину

Хап - ксантин

ХМР - ксантозинмонофосфат YAPD, YEPD - полные среды

Введение Диссертация по биологии, на тему "Координация экспрессии генов, контролирующих метаболизм пуринов и аминокислот у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

Поиск ответа на вопрос, как клетка воспринимает сигналы, поступающие из окружающей среды, и отвечает на них модуляцией экспрессии своего генома является одной из важных задач, стоящих перед молекулярной биологией. Решение указанной задачи требует комплексного исследования целого ряда проблем: идентификации внешнего индуктора и сигнальной сети, посредством которой сигнал об индукторе передается в ядро клетки; выявления генов-мишеней, в результате изменения активности которых формируется ответ клетки на внешнее воздействие; исследования молекулярных механизмов, обеспечивающих изменение экспрессии отдельных генов и координацию экспрессии всего генома в ответ на изменение внешних условий.

В настоящее время единственным эукариотическим организмом, для которого удалось получить информацию об интегральном ответе генома на г некоторые внешние воздействия, являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Это стало возможным благодаря секвенированию дрожжевого генома и разработке "biochip-технологии" (DeRisi et al., 1997), позволяющей количествённо оценивать транскрипционную активность практически всего генома дрожжей (6400 генов) при заданных условиях культивирования. Использование указанной технологии показало, что, например, при глюкозной репрессии происходит глобальное изменение транскрипционной активности генома. При этом наблюдается координированная регуляция экспрессии сотен генов. Молекулярные механизмы такой координированной регуляции в настоящее время не установлены.

У дрожжей S. cerevisiae известны и другие регуляторные системы, обеспечивающие координацию экспрессии генов, кодирующих ферменты различных биосинтетических цепей в условиях метаболического стресса. Одна из таких систем, получившая название системы базального контроля (Arndt et al., 1987), обеспечивает базальный уровень транскрипции генов, контролирующих метаболизм аминокислот, пуринов, фолатов и фосфата. Одновременно с этим эта система обеспечивает снижение экспрессии целого ряда генов в ответ на увеличение концентрации экзогенного аденина адениновая репрессия"). В условиях аминокислотного или пуринового голодания наблюдается координированная активация экспрессии десятков генов, кодирующих ферменты метаболизма аминокислот и пуринов. За такую активацию отвечает ДНК-связывающий белок Gcn4p. Указанная регуляторная система получила название системы общего контроля биосинтеза аминокислот (Fink, 1982).

Следует отметить, что в настоящее время сигнальные сети, отвечающие за индукцию перечисленных регуляторных систем, и молекулярные механизмы координации экспрессии генов интенсивно изучаются. Это обусловлено тем, что исследования механизмов координации экспрессии генов в условиях метаболического стресса являются актуальными как в плане получения фундаментальных знаний о сигнальных сетях и механизмах регуляции экспрессии генома эукариот, так и в практическом аспекте. Хорошо известно, что ряд тяжелейших наследственных заболеваний человека связан с нарушением нормального функционирования пуринового (синдром Леша-Найхана, гиперурикемия, подагра, некоторые формы иммунной недостаточности) и аминокислотного (фенилкетонурия, гомоцистинурия) метаболизма. Существенно отметить, что питание человека в значительной мере определяет его здоровье, работоспособность и продолжительность жизни: как неполноценное, так и избыточное питание приводит к снижению сопротивляемости различным заболеваниям и целому ряду патологий. Исследование механизмов метаболического стресса представляет несомненный интерес и для частной генетики дрожжей. Это обусловлено тем, что большинство лабораторных штаммов маркировано мутациями в генах аминокислотного и пуринового метаболизма. Поэтому очень часто в условиях эксперимента клетки дрожжей находятся в состоянии метаболического стресса.

Настоящее исследование было предпринято с целью идентификации сигнальных сетей и механизмов, обеспечивающих координацию экспрессии генов, контролирующих пуриновый и аминокислотный метаболизм у дрожжей S. cerevisiae, в условиях адениновой репрессии и пуринового и аминокислотного голодания. В соответствии с этим работа предусматривала решение следующих основных задач: 9

1. Выявление природных пуринов, способных индуцировать адениновую репрессию.

2. Идентификация генов, кодирующих белки сигнальной сети адениновой репрессии.

3. Изучение механизмов координации экспрессии генов пуринового (АйЕ1 и ЛОЕ2) и аминокислотного (Н/Э4 и /У52) метаболизма в условиях метаболического стресса, индуцированного экзогенными пуринами и аминокислотным и пуриновым голоданием.

4. Изучение влияния мутаций аа(е7 и ас/е2 (индуцирующих пуриновое голодание) на экспрессию генов пуринового и гистидинового метаболизма.

5'. Картирование промоторной области гена АОЕ2 с целью выявления цис-элементов, отвечающих за базальную экспрессию и регуляцию в условиях метаболического стресса.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Гецова, Мария Леонидовна

ВЫВОДЫ

1. Идентифицированы экзогенные индукторы, вызывающие пуриновую репрессию генов аминокислотного и пуринового биосинтезов. Наряду с охарактеризованным ранее аденином, такими индукторами являются гипоксантин, гуанин и S-аденозилметионин.

2. Идентифицированы гены, кодирующие белки сигнальной сети передачи информации об экзогенных пуринах, основными компонентами которой являются ферменты утилизации и взаимопревращений пуринов и транскрипционные факторы Baslp и Bas2p. Клонированы гены НРТ1, ХРТ1, AD01 и охарактеризованы кодируемые ими ферменты утилизации пуринов.

3. Генетический анализ мутантов по генам пути взаимопревращений пуриновых нуклеотидов дает основание предполагать, что эндогенный сигнал, вызывающий пуриновую репрессию, формируется в результате изменения пула ADP и АТР.

4. Установлено, что экспрессия генов ADE1, ADE2 пуринового биосинтеза и генов LYS2 и HIS4 аминокислотного биосинтеза координируется белком Gcn4p в условиях аминокислотного голодания. При пуриновой репрессии наблюдается координация экспрессии генов ADE1, ADE2 и HIS4, опосредованная белками Baslp и Bas2p.

5. В условиях пуринового голодания, индуцированного мутациями в генах ADE1 и ADE2, наблюдается Осп4-независимое изменение активности генов пуринового (ADE1, ADE2) и гистидинового (HIS4) биосинтезов.

6. Картированы цис-регуляторные участки промоторной области гена ADE2, ответственные за базальную экспрессию и адениновую регуляцию.

7. На основании полученных данных по координированной регуляции генов пуринового и гистидинового биосинтезов разработан метод селекции спонтанных adel и ade2 мутантов для штаммов дрожжей, несущих делецию в гене GCN4. Появление красных аденинзависимых мутантов на средах с 3-аминотриазолом обусловлено активацией биосинтеза гистидина в условиях пуринового и аминокислотного голодания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гецова, Мария Леонидовна, Санкт-Петербург

1. Аленин В.В. Регуляция экспрессии генов ADE1 и ADE2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях аминокислотного голодания // Микробиол. журн. -1988. -Т. 50, N 2.-С. 84-85.

2. Аленин В.В., Домкин В.Д., Ковалева A.A., Смирнов М.Н. Регуляция экзогенным аденином экспрессии генов ADE1 и ADE2, кодирующих структуру двух ферментов пуринового биосинтеза у дрожжей S. cerevisiae II Биополимеры и клетка.-1987.-Т. 3. N 6.-С. 325-326.

3. Аленин В.В., Останин К.В., Домкин В.Д. О методе биохимической идентификации мутаций у красных аденин-зависимых штаммов дрожжей// Прикладная биохимия и микробиология.-1989. -Т. 25. Вып. 1.-С. 135-141.

4. Белова И.В., Самбук Е.В., Падкина М.В., Смирнов М.Н. Активаторы транскрипции РН02 и GCN4 в регуляции синтеза кислых фосфатаз дрожжей S. cerevisiae/l Генетика.-1992.-Т. 28, N 5.-С. 11-18.

5. Беккер М.Л., Лучкина Л.А., Смолина B.C. Действие экзогенных пуринов на биосинтез и взаимопревращение пуриновых нуклеотидов в дрожжевых клетках// Биохимия. -1971.-Т. 3. N 6.-С. 898-907.

6. Гловер Д. (под редакцией) Клонирование ДНК. Методы. М.:Мир. 1988.

7. Глотов Н.В., Животовский Л.А., Хованов Н.В., Хромов-Борисов H.H. Биометрия. ЛГУ. 1982. 262 с.

8. Гядвилайте A.A. Исследование экспрессии гена ADE2 Saccharomyces cerevisiae. Автореферат канд. дисс. Вильнюс. 1992.

9. Дрейлиня Д.Э. Изучение активности АИР-карбоксилазы и ФРПФ-амидотрансферазы у штаммов дрожжей, несущих мутации, затрагивающие биосинтез пуринов de novo. Автореферат канд. дисс. Ленинград. 1984.

10. Дрейлиня Д.Э., Фундули А.Х., Тюлякова Т.С., Домкин В.Д., Сойдла Т.Р., Смирнов М.Н. Изучение регуляции биосинтеза пуринов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Вестник ЛГУ. -1981 .-N 9. -С. 93-97.

11. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука, 1984.

12. Инге-Вечтомов С.Г., Карпова Т.С. Частная генетика дрожжей-сахаромицетов. -СПб: Изд-во СП6ГУ.-1993.-252 с.

13. Инге-Вечтомов С.Г., Кожин С.А. Сравнение специфичности действия ультрафиолетовых и рентгеновских лучей на мутабильность дрожжей.// Исследования по генетике. -Л., 1964. -Сб. 2. -С. 77-85

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

15. Мантсала П. Клонирование гена ADE4 Saccharomyces cerevisiae, кодирующего глютаминфосфорибозилпирофосфатамидотрансферазу.// В.сб.: XVI конференция ФЕБО. Тез. докл. М., 1984.-С. 382.

16. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике: Пер. с англ.-М.: Мир.-1976.-436 с.

17. Саснаускас К.В., Гядвилайте A.A., Янулайтис A.A. Клонирование гена ADE2 Saccharomyces cerevisiae и локализация АР-1 последовательности//Генетика.-1987.-Т. 23, N 7.-С. 1141-1147.

18. Холлендер М., Вулф Д. Непараметрические методы статистики. М.: Финансы и статистика, 1983. -518 с.

19. Abastado J.-P., Miller P.F., Jackson В.М., Hinnebusch A.G. Supression of ribosomal reinitiation at upstream open reading frames in amino acid-starved cells forms the basis for GCN4 translational control// Mol. Cell. Biol.-1991.-V. 11, N 1.-P. 486-496.

20. Adams A., Gottschling D.E., Kaiser C., Steams T. Methods in Yeast Genetics. A laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor, NY. Cold Spring Harbor Lab., 1998.-177 p.

21. Affolter M., Schier A., Gehring M.J. Homeodomain proteins and the regulation of gene expression// Curr. Genet.-1990.-V. 2. -P. 485-495.

22. Alenin V.V., Nikolaeva Z.K., Kovaliova A.A., Kapitonov D.E., Hetzova M.L. The regulation of yeast metabolism by the general control system// Thesis of the 15th Int. Spec. Symp. on yeasts. Riga: 1991 .-P. 15.

23. Alexandraki D., Thireos G. Isolation of a new gene (TAR1) involved in the translation of the HIS3 mRNA in S. cerevisiaeИ Yeast.-1988.-V. 4 (spec.issue) -P. 507.

24. Alfonzo, J.D., Sahota A., Deeley M.C., Ranjekar P., Taylor M.W. Cloning and characterization of the adenine phosphoribosyl transferase-encoding gene {APT1) from Saccharomyces cerevisiae!I Gene.-1995.-V. 161 .-P. 81-85.

25. Appling D.R., Rabinowitz J.C. Regulation of expression of the ADE3 gene for yeast C1-tetrahydrofolate synthase, a trifunctional enzyme involved in one-carbon metabolism//J. Biol. Chem. -1985.-V. 260, N 2.-P. 1248-1256.

26. Arndt K., Fink G.R. GCN4 protein, a positive transcriptional factor in yeast, binds general control promoter at all 5TGACTC3' // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1986.-V. 83.-P. 8516-8520.

27. Arndt K.T., Styles C., Fink G.R. Multiple global regulators control HIS4 transcription in yeast// Science.-1987.-V. 237. -P. 874- 880.

28. Barclay B.J., Huang Т., Nagel M.J., Misener V.L., Came J.C., Wahl G.M. Mapping and sequencing of the dihydrofolate reductase gene (DFR1) of S. cerevisiae// Gene.-1988.-V. 63, N 2.-P. 175-185.

29. Barnes D.A., Thorner J. Genetic manipulation of S.cerevisiae by use LYS2 gene// Mol. Cell. Biol.-1986.-V. 6, N 8.-P. 2828-2838.

30. Berben G., Dumont J., Gilliquet V., Bolle P.A., Hilger F. The YDp plasmids: a uniform set of vectors bearing versatile gene disruption cassettes for Saccharomyces cerevisiaell Yeast.-1991.-V. 7.-P. 475-477.

31. Bisson L.F. High-affinity glucose transport in Saccharomyces cerevisiae is under general glucose repression control // J. Bacteriol.-1988.-V. 170.-P. 48384845.

32. Boeke J.D., Lacroute F., Fink G.R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance// Mol. Gen. Genetics.-1984.-V. 197.-P. 345-346.

33. Brandl C.J., Struhl K. Yeast GCN4 transcriptional activator protein interact with RNA polymerase 11 in vitro// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1989.-V. 86. -P. 2652-2656.

34. Braus G., Mosch H.H., Vogel K., Hinnen A., Hutter R. Interpathway regulation of the TRP4 gene of yeast// EMBO J.-1989.-V. 8, N 3.-P. 939945.

35. Brazas R.M., Stillman D.J. Identification and purification of a protein that binds DNA cooperatively with the yeast SWI5 protein // Mol. Cell. Biol.-1993.-V. 13.-P. 5524-5537.

36. Burridge B.W., Woods R.A., Henderson J.F. Purine metabolism in Saccharomyces cerevisiae// Can. J. Biochem.-1977.-V. 55.-P. 935-941.

37. Busch S.J., Sassone-Corsi P. Dimers, leucine zippers and DNA-binding domains//Trends in Genet.-1990.-V. 6, N 2.-P. 36-40.

38. Carlson M. Regulation of sugar utilization in Saccharomyces cerevisiae.//J. Bacterid.-1987.-V. 169.-P. 4873-4877.

39. Chevallier M R., Jund R., Lacroute F. Characterization of cytosine permeation in Saccharomyces cerevisiae // J. Bacterid.-1975.-V. 122, №2.-P. 629-641.

40. Daignan-Fornier B., Fink G.R. Coregulation of purine and histidine biosynthesis by the transcriptional activators BAS1 and BAS2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992.-V. 89.-P. 6746-6750.

41. Daignan-Fornier B., Reisdorf P., Nguyen C.C., Lemeignan B., Bolotin-Fukuhara M. MBR1 and MBR3, two related yeast genes that can supress the growth defect of hap2, hap3 and hap4 mutants // Mol. Gen. Genetics.-1994.-V. 243.-P. 575-583.

42. Dang V.-D., Valens M., Bolotin-Fukuhara M., Daignan-Fornier B. A genetic screen to isolate genes regulated by the yeast CCAAT-box protein Hap2p // Yeast.-1994.-V. 10.-P. 1273-1283.

43. De Winde J.H., Grivell L.A. Global regulation of mitochondrial biogenesis in yeast Saccharomyces cerevisiae II Nucl. Acid. Res. -1993.-V. 46.-P. 51-91.

44. Deeley M.C. Adenine deaminase and adenine utilization in Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol.- 1992.-V. 174, №10.-P. 3102-311.0.

45. Denis V., Daignan-Fornier B. Synthesis of glutamine, glycine and 10-formyltetrahydrofolate is coregulated with purine biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genetics.-1998. -V. 259, №3.-P. 246-255.

46. Denis V., Boucherie H., Monribot C., Daignan-Fornier B. Role of the myb-like protein Baslp in Saccharomyces cerevisiae: a proteome analysis //Molecular Microbiol.-1998.-V. 30,- №3.-P. 557-566.

47. DeRisi J.L., Iyer V.R., Brown P.O. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale // Science.- 1997.-V. 278.-P. 680-686.

48. Dever T.E., Feng L., Wek R.C., Cigan A.M., Donahue T., Hinnebusch A.G. Phosphorylation of initiation factor 2 by protein kinase GCN2 mediates gene-specific translational control of GCN4 in yeast// Cell.-1992.-V. 68.-P. 585-596.

49. Devlin C., Tice-Baldwin K., Shore D., Arndt K.T. RAP1 is required for BAS1/BAS2 and GCA/4-dependent transcription of the yeast gene HIS4II Mol. Cell. Biol.-1991 .-V. 11, N 7. P. 3642-3651.

50. Donahue T.F., Daves R:, Lucchini G., Fink G.R. A short nucleotide sequence required for regulation of HIS4 by the general control system of yeast// Cell.-1983.-V. 32.-P. 89-98.

51. Dorfman B. The isolation of adenylosuccinate synthetase mutants in the yeast by the selection for constitutive behavior in pigmented strains // Genetics.-1969.-V. 61.-P. 377-389.

52. Engelberg D., Klein C.,artinetto H., Struhl K., Karin M. The UV response involving the Ras signaling pathway and AP-1 transcriptional factors is conserved between yeast and mammals // Cell.-1994.-V. 77.-P. 381-390.

53. Erickson J.R., Johnston M. Genetic and molecular characterization of GAL83: Its interaction and similarities with other genes involved in glucose repression in Saccharomyces cerevisiae II Genetics.-1993.-V. 136.-P. 1271-1278.

54. Fantino E., Marguet D., Lauquin G.J.-M. Downstream activating sequence within the coding region of a yeast gene: specific binding in vitro of RAP1 protein// Mol. Gen. Genetics.-1992.- V. 236.-P. 65-75.

55. Fernandes L., Rodrigues-Pousada C., Struhl K. Yap, a novel family of eight bZIP proteins in Saccharomyces cerevisiae with Distinct biological functions // Mol. Cell. Biol. -1997.-V. 17, N 2.-P. 6982-6993.

56. Fling M.E., Kopf J., Richards C.A. Nucleotide sequence of the dihydrofolate reductase gene of S. cerevisiae// Gene.-1988.-V. 63, N 2.-P. 165-174.

57. Foley J.M., Giles N.H., Roberts C.F. Complementation at the adenylosuccinase locus in Aspergillus nidulans II Genetics.-1965.-V. 52.-P. 1247-1263.

58. Fox I.H., Kelley W.N. Human phosphoribosylpyrophosphate synthetase: kinetic mechanism and end-product inhibition // J. Biol. Chem.-1972.-V. 247.-P. 21262131.

59. Gallert K.C., Ohanjan T., Daidnan-Fornier B., Lottspeich F., Krauss G. Enzymatic properties and inhibition by single-stranded ARS sequences of adenylosuccinate synthetase from Saccharomyces cerevisiae II Eur. J. Biochem. -1996.-V. 239.-P. 487-493.

60. Gedvilaite A., Sasnauskas K. Control of the expression of the ADE2 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet.-1994.-V. 25.-P. 475-479.

61. Gietz R.D., Sugino A. New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites // Gene.-1988.-V. 74.-P. 527-534.

62. Gill G., Tjian R. Eukaryotic coactivators associated with the TATA-box binding protein // Curr. Opin. Genet. Dev.-1992.-N 2.- P. 236-242.

63. Gots J.S., Benson C.E., Jochimsen B., Koduri K.R. Microbial models and regulatory elements in the control of purine metabolism. In: Ciba foundation Symposium «Purine and pyrimidine metabolism». Elsevier, 1977.-P. 23-41.

64. Gross T.S., Woods R.A. Identification of mutants defective in the first and second steps of de novo purine synthesis in Saccharomyces cerevisiae II Biochem. Biophys. Acta.-1971.-V.273.-P.13-18.

65. Gross T.S., Woods R.A. Regulation of de novo purine nucleotide synthesis by enzyme repression in Saccharomyces cerevisiae // Heredity.-1972.-V. 28.-P. 275.

66. Guarente L., Bermingham-McDonogh O. Conservation and evolution of transcriptional mechanisms in eukaryotes // Trends in Genet.- 1992.-V. 8,-N 1.-P. 27-31.

67. Hahn S. Efficiency in activation // Nature.-1993.-V. 363. N 6431.- P .672-673.

68. Harashima S., Hinnebusch A.G. Multiple GCD genes required for repression of GCN4, a transcriptional activator of amino-acid biosynthetic genes in S. cerevisiaell Mol. Cell. Biol.-1986.-V. 6, N 11.-P. 3990-3998.

69. Hawker K.L., Pintzas A., Hennigan R.F., Gillespie D.F., Ozanne B. Transformation by the fos or jun oncogene does not increase AP-1 DNA-binding activity// J. Virol.-1993.-V. 67, N 9.-P. 5487-5495.

70. Hershey H.V., Taylor M.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Escherichia coli adenine phosphoribosyl-transferase and comparison with other analogous enzymes // Gene.-1986.-V. 43.-P. 287-293.

71. Hinnebusch A.G. Novel mechanisms of translational control in Saccharomyces cerevisiae// Trends in Genet.-1988.-V. 4, N 6. P. 169-174.

72. Hinnebusch A.G. Transcriptional and translational regulation of gene expression in S. cerevisiae.// Progress in Nucleic Acids Res. and Mol. Biol.-1990.-V. 38.-P. 195-240.

73. Hope I.A., Struhl K. GCN4 protein,synthesized in vitro, binds HIS3 regulatory sequences: implications for General Control of amino acid biosynthetic genes in yeast// Cell.-1985.-V. 43. P. 177-188.

74. Hope I.A., Struhl K. Functional dissection of a eukaryotic transcriptional activator protein GCN4 in yeast// Cell.-1986.-V. 46. -P. 885-894.

75. Johnson P.F., McKnight S.L. Eukaryotic transcriptional regulatory proteins// Annu. Rev. Biochem.-1989.-V. 58.-P. 799-839.

76. Kammann M., Laufs J., Schell J., Gronenborn B. Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR) // Nucleic Acids Res.-1989.-V. 17.-P. 5404.

77. Kanasawa S. et al. ATR1, a S. cerevisiae gene, encoding a transmembrane protein required for the 3-aminotriasole resistance// Mol. Cell. Biol.-1988.-V. 8, N 2.-P. 664-673.

78. Kelley W.N., Rosenbloom F.M., Henderson J.F., Seegmiller J.E. A specific enzyme defect in gout associated with overproduction of uric acid. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1967.-V. 57.-P. 1735-1739.

79. Khromov-Borisov N.N. Chemical names: Galateas of mutation research (exemplified with mutagenic nucleic acid bases analogs) // Mutation Res.-1997.-V. 379.-P. 95-103.

80. Kilberg M.S., Hutson R.G., Laine R.O. Amino acid-regulated gene expression in eukaryotic cells// FASEB J.-1994.-V. 8,- P. 13-19.

81. Kippert F. A rapid permeabilization procedure for accurate quantitative determination of b-galactosidase activity in yeast cells.// FEMS Microbiol. Lett. -1995.-V. 128.-P. 201-206.

82. Konig P., Richmond T.J. The X-ray structure of the GCN4-bZIP bound to ATF/CREB site DNA shows the complex depends on DNA flexibility// J. Mol. Biol.-1993.-V. 233. N 1.-P. 139-154.

83. Konrad M. Cloning an expression of the essential gene for guanylate kinase from yeast.//J. Biol. Chem. -1992.-V. 267.-P. 25652-25655.

84. Kornberg A., Lieberman I., Simms E.S. Enzymatic synthesis and properties of 5-phosphoryt>osylpyrophosphate // J. Biol. Chem.-1955.-V. 215.-P. 389-420.

85. Lesch M., Nyhan W.L. A familial disorder of uric acid metabolism and central nervous system function //Am. J. Med.-V. 36.-P. 561-570.

86. Lomax C.A., Woods R.A. Prototrophic regulatory mutants of adenylosuccinate synthetase in yeast// Nature.-1970.-V. 229, №4.-P. 116.

87. MantsalaP., Zalkin H. Nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae

88. ADE4 encoding glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase II J. Biol. Chem.-1984.-V. 259.-P. 8478-8484.

89. Messenguy F., Scherens B. Induction of «General Control» and thermotolerance in cdc mutants of Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genet.-1990.-V. 224, N 2.-P. 257-263.

90. Miller P.F., Hinnebusch A.G. Cis-acting sequences involved in the translational control of GCN4 expression// Biochimica et Biophysica Acta.-1990.-V. 1050.-P. 151-154.

91. Mirande M., Martinez R., Cirakoglu B., Latreille M.-T., Waller J.P. The yeast lysyl-tRNA synthetase gene: evidence for general amino acid control of its expression and domain structure of the encoded protein// Yeast.-1988.-V. 4 (spec.issue) -P. 346.

92. Moehle C.M., Hinnebusch A.G. Association of RAP1 binding sites with stringent control of ribosomal protein gene transcription in S. cerevisiae/l Mol. Cell. Biol.-1991 .-V. 11, N 5.-P. 2723-2735.

93. Momose H., Nishikawa H., Shiio I. Regulation of purine nucleotide synthesis in Bacillus subtilis. 1. Enzyme repression by purine derivatives.// J. Biochem.-1966.-V. 187.-P. 373-379.

94. Moscatelli F., Gariboldi M., Panzeri L. The transcriptional factor PH02 binds in vitro to the centromeric region CDE11H Abstracts of 15th Int. Conf. on yeast genetics and molecular biology. Yeast.-1990.-V. 6 (spec.issue).-P. 60.

95. Mosch H.-H., Graf R., Schidheini T., Braus G. Three GCN4 responsive elements act synergistically as upstream and as TATA-like elements in the yeast TRP4 promoter// EMBO J.-1990. V. 9, N 9.-P. 2951-2957.

96. Mosch H.-H., Scheier B., Lahti R., Mantsala P., Braus G.H. Transcriptional activation of yeast nucleotide biosynthetic gene ADE4 by GCN4H J. Biol. Chem.-1991.-V. 266, N 30.-P. 20453- 20456.

97. Myasnikov A.N., Sasnauskas K.V., Janulaitis A.A., Smirnov M.N. // The Saccharomyces cerevisiae ADE1 gene: structure, overexpression and possible regulation by general amino acid control//Gene.-1991. -V. 109, N 1.-P. 143-147.

98. Myasnikov A.N., Smirnov M.N. General amino-acid control system may be involved in regulation of purine biosynthesis in yeast// Yeast.-1988.-V.4 (spec.issue)-P. 412.

99. Myers A.M., Tzagoloff A., Kinney D.M., Lusty C.J. Yeast shuttle and integrative vectors with multople cloning sites suitable for construction of LacZ fusions//Gene.-1986.-V. 45.-P. 299-310.

100. Neuhard J., Nygaard P. Purines and pyrimidines. In: Escherichia coli and Salmonella, cellular and molecular biology. Edited by Neidhardt F.C.-ASM press, Washington DC.-1987.-P. 445- 473.

101. Oakley M.G., Dervan P.B. Structural motif of the GCN4 DNA binding domain characterized by affinity cleaving// Science.-1990. -V. 248.-P. 847-850.

102. Oliviero S., Robinson G.S., Struhl K., Spiegelman B.M. Yeast GCN4 as probe for oncogenesis by AP-1 transcription factors: transcriptional activation through AP-1 sites is not sufficient for cellular transformation// Genes " Dev.-1992.-P. 1799-1809.

103. Paravicini G., Mosch H.-H., Schmidheini T., Braus G. The general control activator protein GCN4 is essential for a basal level of AR03 gene expression in Saccharomyces cerevisiae/l Mol. Cell. Biol.-1989.-V. 1.-P. 144-151.

104. Pellman D., McLaughlin M.E., Fink G.R. Function of the TATA element at HIS4II Nature.-1990.-V. 348.-P. 82-86.

105. Pinson B., Sagot I., Borne F., Gabrielsen O.S., Daignan-Fornier B. Mutations in the yeast Myb-like protein Baslp resulting in discrimination between promoters in vivo but not in vitro II Nucleic Acids Res.-1998.-V. 26, №17.-P. 3977-3985.

106. Ptashne M. How eukaryotic transcription activators work // Nature.-1988.-V 335.-N 6192.-P. 683-689.

107. Reichert U., Winter M. Gene dosage effects in polyploid strains of Saccharomyces cerevisiae containing gua-1 wild type and mutant alleles // J. Bacterid.-1975.-V. 124.-P. 1041-1045.

108. Roberts S. et al. Interaction between an acidic activator and transcriptional activation // Nature.-1993.- V. 363.-N 6430. P. 741-744.

109. Rolfes R.J., Hinnebusch A.G. Translation of the yeast transcriptional activator GCN4 is stimulated by purine limitation: implication for activation of the protein kinase GCN2/I Mol. Cell. Biol.-1993.-V. 13, N 8.-P. 5099-5111.

110. Rolfes R.J., Zalkin H. Purification of the Escherichia coli purine regulon repressor and identificatio of compressors.//J. Bacteriol.-1990.-V. 172.-P. 56375642.

111. Ruby S.W., Szostak J.M., Murray A.W. Cloning regulated yeast genes from a pool of lacZ fusions.// Methods Enzymol.-1983.-V. 101.-P. 235-269.

112. Ruis H., Schuller C. Stress signaling in yeast// BioEssays.-1995.-Vol. 17, № 11.-P. 959-965

113. Sambrook J., Fritschand E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manuel, 2nd edn.Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, New York.

114. Sanger F., Niklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1977.-V. 74.-P. 5463-5467.

115. Sahota A., Ranjekar P.K., Alfonzo J., Lewin A.S., Taylor M.W. Mutants of Saccharomyces cerevisiae deficient in adenine phosphoribosyltransferase // Mutation Res.-1987.-V. 180.-P. 81-87.

116. Sellers J.W., Vincent A.C., Struhl K. Mutations that define the optimal half-site for binding yeast GCN4 activator protein and identify an ATF/CREB-like repressor that recognizes similar DNA sites// Mol. Cell. Biol.-1990.-V. 10, N 10. -P. 5077-5086.

117. Schnell N. Krems B„ Entian K.D. The PARI (YAP1/SNQ3) gene of Saccharomyces cerevisiae, a c-jun homologue, is involved in oxygen metabolism// Curr. Genetics.-1992.-V. 21 .-P. 269-273.

118. Schuldiner O., Yanover C., Benvenisty N. Computer analysis of the entire budding yeast genome for putative targets of the GCN4 transcription factor // Curr. Genet. -1998.-V. 33.-P. 16-20.

119. Shattoo B.B., Sherman F. Selection of Iys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of a-aminoadipate. // Genetics.-1979. -V. 93. -P. 51-65

120. Silver, J. M., Eaton N. R. Functional blocks of the AD1 and AD2 mutants of Saccharomyces cerevisiae. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. V. 34. P. 301-305

121. Skvirsky R.C., Greenberg M.L., Myers P.L., Greer H. A new negative control gene for amino acid biosynthesis in S. cerevisiae II Curr. Genet.-1986.-V. 10.-P. 495-501.

122. Sorger P.K., Pelham H.R.B. Yeast heat shock factor is an essential DNA-binding protein that exhibits temperature-dependent phosphorylation // Cell.-1988.-V. 54.-P. 855-864.

123. Springer C., Kunzler M., Balmelli T., Braus G.H. Amino acid and adenine cross-pathway regulation act throught the same 5'-TGACTC-3' motif in the yeast HIS7 promoter II J. Biol. Chem.-1997.-V. 271.-P. 29637-29643.

124. Stone R.L., Aimi J., Barshop B.A., Jaeken J., Van den Berghe G. et al. A mutation in adenylosuccinate lyase associated with mental retardation and autistic features // Nature Genetics.-1992.-V. 1.-P. 59-63.

125. Stotz A., Linder P. The ADE2 gene from Saccharomyces cerevisiae: sequence and new vectors.//Gene.-1992.-V. 95.-P. 91-98.

126. Struhl K. Molecular mechanisms of transcriptional regulation in yeast //Annu. Rev. Biochem. 1989.-N 58.- P. 1051-1077.

127. Struhl K Yeast GCN4 transcriptional activator protein// Transcriptional regulation. Cold Spring Harbor Lab Press.-1993. P. 833-859.

128. Sze J.-Y., Wootner M., Jaehning J.A., Kohlhaw G.B. In vitro transcriptional activation by a metabolic intermediate:Activation by Leu3 depends on isopropylmalate // Science.-1992.-V. 258.-P. 1143-1145.

129. Takeuchi T., Miyahara K., Hirata D., Miyakawa T. Mutational analysis of Yaplp protein, an AP-1like transcriptional activator of Saccharomyces cerevisiae // FEBS lett.-1997.-V. 416.-P. 339-343.

130. Tavernakis M., Thireos G. Transcriptional interference caused by GCN4 overexpression reveals multiple interactions mediating transcriptional activation // Mol. Gen. Genet. -1995.-V. 247.-P. 571-578.

131. Tavernakis M., Thireos G. The DNA target sequence influences the dependence of the yeast transcriptional activator Gcn4 on co-factors II Mol. Cell. Biol. -1997.-V. 253.-P. 766-769.

132. Tibbetts A.S., Appling D.R. Saccharomyces cerevisiae expresses two genes encoding isozymes of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide transformylase // Arch. Biochem. Biophys. -1997.-V. 340, №2.-P. 195-200.

133. Tice-Baldwin K., Fink G.R., Arndt K.T. BAS1 has a Myb motif and activates HIS4 transcription only in combination with BAS2II Science.-1989.-V. 246, N 4932.-P. 931-935.

134. Ugolini S., Bruschi C.V. The red/white colony color assay in the yeast Saccharomyces cerevisiae: epistatic growth advantage of white ade8-18, ADE2 cells over red ADE2 cells II Curr. Genet. -1996.-V. 30.-P. 485-492.

135. Verdier J.-M. Regulatory DNA-binding proteins in yeast: An overview// Yeast.-1990.-V. 6, N 4.-P. 271-297.

136. Vogel K., Horz W., Hinnen A. The two positively acting regulatory proteins PH02 and PH04 physically interact with PH05 upstream activation region // Mol. Cell. Biol. -1989.-V. 9.-P. 2050-2057.

137. Vogt P.K., Bos T.J. Jun: oncogene and transcription factor// Advances in cancer research.-1990.-V. 55.-P. 1-35.

138. Vogt P.K., Bos T.J., Doolittle R.F. Homology between the DNA-binding domain of the GCN4 regulatory protein in yeast and the carboxyl-terminalregion of protein coded for by oncogene JUN II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1986.-V. 84, N 10.-P. 3316-3319.

139. White M.A., Dominska M., Petes T.D. Transcription factors are required for the meiotic recombination hotspot at the HIS4 locus in Saccharomyces cerevisiaeII Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1993.-V. 90. P. 6621-6625.

140. Woods R.A., Roberts D.G., Freidman T., Jolly D., Filpula D. Hypoxanthine: Guanine phosphoribosyltransferase mutants in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genet.-1983.—P. 407-412.

141. Woods R.A., Roberts D.G., Stein D.S., Filpula D. Adenine phosphoribosyltransferase mutants in Saccharomyces cerevisiae // J. Gen. Microbiol.-1984.-V. 130.-P. 2629-2637.

142. Wyngaarden J.B., Holmes E.W. Molecular nature of enzyme regulation in purine biosynthesis II In: Ciba Foundation Symposium 48 «Purine and pirimidine metabolism». Elsevier, 1977.- P. 43-64.

143. Yoshida K., Kuromitsu Z., Ogawa N., Oshima Y. Mode of expression of the positive regulatory genes PH02 and PH04 of the phosphatase regulon in S. cerevisiae.il Mol. Gen. Genet.-1989.-V. 217. N 1.-P. 31-39

144. Yuryev A., Corden J.L. A Saccharomyces cerevisiae gene encoding a potential adenine phosphoribosyltransferase//Yeast.-1994.-V. 10, №5.-P. 659662.

145. Zalkin H., Dixon J.E. De novo purine nucleotide biosynthesis // Progress in Nucleic Acids Res. and Mol. Biol.-1992,- V. 42,-P. 259-287.

146. Zhang L., Guarente L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins // EMBO J.-1995.-V. 164.-P. 313-320.

147. PvuII .Nsil .Clal !.NcoI .AccI1.Г-1-1-г1 I Ml1 I «, I '1. T I I I I г1. EcoRV Ncol EcoRI .Hpal1. JJ1. HPT1500 1000 1500 2000 2500 i ' ' ' I I 1 IIIII1I 1II IIIII1IIL1. К 1 2 3 4 51500 1200

148. Рис. 34. Схема инактивации гена НРТ1.

149. Рис. 35. Схема инактивации гена АРТ1.

150. Фрагмент ДНК 1500 п.н. соответствует нормальной аллели гена АРТ1. 2 фрагмента 1090 и 1050 п.н. соответствует дизрупции.

151. Dral .Kpnl ! -Bgiii j iXhoII1. URA31. Nsil1. Clal1. I I1. EcoRI1. Hpal1. SphI .StuI1. Xbal PstI .Dral I I I1. Dral .Dral1. Clal i .AsuII JLL1. EcoRI Aval Spel1. Kpnl .Hindlll1. AAH11000200030001. T—=——---—;--—-—------1. К 1 2 3 ;3000 "21¥I