Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль чувствительности про- и эукариотических микроорганизмов к мутагенным аналогам пуринов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль чувствительности про- и эукариотических микроорганизмов к мутагенным аналогам пуринов"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Степченкова Елена Игоревна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПРО- И ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ К МУТАГЕННЫМ АНАЛОГАМ ПУРИНОВ

специальность: 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ ' диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики

Биологического научно-исследовательского института Санкт-Петербургского государствен-ного университета и в Национальном институте здоровья окружающей среды, Северная Каролина, США.

Научный руководитель: доцент, кандидат химических наук

Аленин Владимир Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Совдла Тыну Рихович

кандидат биологических наук Хромов-Борисов Никита Николаевич

Ведущее учреждение:

Петербургский институт

ядерной физики

им. Б. П. Константинова

Защита состоится 2006 г. в /г часов на заседании

Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СГ16ГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан «/г- и^СиЛ 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

JULV6& ffffî

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Точность и эффективность синтеза ДИК во

многом зависит от количественного и качественного состава предшественников ДНК - пуриновых и пиримидиновых дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (дНТФ). Отклонение соотношения предшественников ДНК от оптимального приводит к нарушениям репликации и остановке клеточного деления, а модифицированные дНТФ могут служить источником возникновения мутаций. Причина мутагенного действия многих природных и синтетических аналогов оснований заключается в их способности превращаться в соответствующие дНТФ в результате клеточного метаболизма и в этой форме участвовать в процессе репликации. При репликации ДНК-полимеразы ошибочно включают аналоги в ДНК или совершают ошибки при синтезе ДНК на матрице, содержащей аналог. Мутагенные аналоги могут поступать в клетку из окружающей среды, а также генерироваться эндогенно как промежуточные продукты клеточного метаболизма, например, дНТФ урацила и гипоксантина, или при окислительном стрессе, например, дНТФ 8-оксогуанина и 2-оксоаденина (Kamiya, 2003).

Данная работа посвящена изучению генетического контроля мута1енною действия 6-гидроксиламинопурина (ГАП) и его производных у модельных микроорганизмов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и бактерий Escherichia coli. Синтетический аналог аденина ГАП является сильным мутагеном для широкого Kpyia живых организмов - вирусов, бактерий, дрожжей и млекопитающих (Freese, 1968; Pavlov et al., 1991). ГАП индуцирует мутации по репликативному механизму как классический аналог оснований. Мутагенные свойства ГАП проявляются только в активно делящихся клетках, при этом ГАП вызывает мутации типа замен пар оснований АТ-^ГЦ и ГЦ—>АТ (Pavlov et al., 1991; Shcherbakova and Pavlov. 1993). Про- и эукариотические ДНК-полимеразы способны включать ГАП в ДНК при репликации (Abdul-Mabih and Bessman, 1986; Shcherbakova et al., 1996).

У бактерий Е coli и дрожжей S. cerevisiae был идентифицирован ряд генов, инактивация которых приводит к повышению чувствительности клеюк к ГАГ1. Бьпо показано, что у бактерий сверхчувствительностью к ГАП обладают штаммы с дефектом биосинтеза молибденового кофактора, необходимого для ряда оксидоредуктаз (Kozmin et al., 2000). У дрожжей к ГАП чувс1вигельны мутанты по гену HAMI (Noskov et al., 1996), кодирующему нуклеотидпирофосфорилазу (Hwang et al., 1999). Функция этого фермента заключается в удалении дНТФ мутагенных пуринов (гипоксантина и ГАП) из пула предшественников ДНК. Однако, систематический поиск генов, контролирующих чувствительность к ГАП у микроорганизмов, не проводился Поэтому остается открытым вопрос об универсальности механизмов активации и детоксикации ГАП у преде гавителей различных систематических групп организмов.

Генетический подход к изучению механизмов действия мутагенов основан на -оискс му I антов, чувствительных или устойчивых к этим мутагенам. В последние годы возможности этого метода неизмеримо возросли

РОС. ff '.ЦМОНЛ^ЬМЛЯ Г.МЗ'ШОТГД \ С.-П^тгг-Зут

ОЯ '>!'

секвенирования геномов мнотих организмов и появлению новых высокопроизводительных технологий исследования геномов. Обособилась новая область молекулярной генетики - функциональная геномика, основанная на создании и применении глобальных экспериментальных подходов, направленных на выяснение функции систем генов. После определения последовательности геномов F. coli и S. cerevisiae появилась возможность создания библиотек, содержащих мутантов по всем генам этих микроорганизмов В течение последних нескольких лет с использованием таких библиотек удалось выявить функции сотен ранее неизвестных генов и найти новые функции для хорошо изученных генов. Развитие современных методов функциональной геномики открывает новые возможности для масштабного поиска генов, контролирующих чувствительность модельных микроорганизмов к мутагенным аналогам оснований.

Цель и задачи исследования. Цель нашего исследования заключалась в сравнительном изучении механизмов детоксикации и активации мутагенных аналогов пуринов в клетках модельных микроорганизмов низших эукариот S cerevisiae и прокариот Е coli. Были поставлены следующие задачи:

1. Получить геномную библиотеку инсерционных мутантов Е. coli.

2. Осуществить скрининг полученной геномной библиотеки мутантов Е. coli и коммерческой геномной библиотеки мутантов S. cerevisiae для выявления генов, контролирующих чувствительность модельных микроорганизмов к мутагенным аналогам пуринов.

3. Оценить вклад отдельных генов в формирование чувствительности клеток к ГАП и его производным.

4. Провести сравнительный анализ систем детоксикации и активации мутагенных аналогов пуринов у исследуемых микроорганизмов.

Научная новизна работы. Впервые для поиска генов, контролирующих чувствительность к мутагенным аналогам пуринов, был применен современный метод геномного скрининга у двух модельных микроорганизмов - бактерий Е. coli и дрожжей S. cerevisiae. С использованием этого мнтода проведен анализ влияния инактивации практически всех генов, не определяющих жизненно важные функции у этих организмов, на чувствительность клетки к ГАП. Примененный метод геномного скрининга позволил нам идентифицировать десятки генов, участвующих в активации и детоксикации аналога. Некоторые из этих генов участвуют в контроле чувствительности к другим аналогам пуринов, таким как 2-амино-ГАП (АГАП) и гипоксантин. Среди обнаруженных нами ГАП-чувствительных мутантов были как новые, так и известные ранее, что указывает на адекватность использованного подхода. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, чго у бакгерий и дрожжей существуют развитые, но отличные друг от друга системы детоксикации мутагенных аналогов. Это указывает на возможности реализации в эволюции разных подходов дня осуществления одной биологической функции. У человека обнаружены ортологи

генов обеих систем, что может повышать надежность загцигы генома человека сгг мутагенных аналогов По результатам проведенного нами геномного скрининга и анализа доступных баз данных были сделаны предположения о возможном участии дополнительных генов, не выявленных при геномном скрининге, в контроле чувствительности Е coli и 5. cere vi sine к ГАП. В случае reí ron ADEI3, ADE4 дрожжей и гена C'ys.! бактерий, чувствительность соответствующих мутантов к ГАП подтверждена экспериментально.

Практическая ценность. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, имеют значение для более полного понимания механизмов мутагенеза и канцерогенеза. Данные, представленные в работе, могут бьль полезны при создании новых тест-систем для выявления факторов, нарушающих пул предшественников ДНК и служащих источником спонтанных и индуцированных мутаций. У человека известны наследственные заболевания, вызванные мутациями в генах, гомологичных некоторым из идентифицированных нами в этой работе. Штаммы бактерий и дрожжей, несущие мутации в соответствующих тенах, могли бы стать моделями для изучения этих заболеваний. Результаты, представленные в диссертационной работе, могут быть включены в план учебных курсов «Мутационный процесс», «Молекулярная генетика» и других, читаемых на кафедре генетики и селекции СПбГУ.

Апробация работы. По результатам работы сделаны сообщения на следующих конференциях и семинарах' II съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиГ), Санкт-Петербург, 1-5 февраля 2000; ХХГ' International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. Sweden, Goteberg, July 6-12, 7-th Annual Midwest DNA repair symposium. Detroit, Michigan, IJSA, May 21-22, 2005; The second International Conference "Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution", Yerevan, Armenia, September 8-12, 2005; семинар лаборатории «Репликация и репарация ДНК эукриог». Медицинский центр университета штата Небраска, г. Омаха, США; семинары лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГУ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, состоящего из 161 источника и приложения Работа изложена на 147 страницах и содержит 24 рисунка и 13 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы бактерий. Для получения геномных библиотек мутантов Е coli с помощью инсерции транспозона EZ-Tn5™ <oriV/KAN-2> («Epicentre», США) в работе были использованы три бактериальных тчтамма: MG1655 (F-)- ilvG- rß-50 "ph-1), NR10836 (ara thiA(pro-Iac) F'CCIOó) и NR 15627 (yckX ara thiA(pro-lac) F'CC/06). На основе этих трех штаммов также были получены мутанты по Сиосинтезу молибденового кофактора с помощью транедукции фагом PI.

Штаммы дрожжей. В работе была использована коллекция 4830 делеционных мучантов 5. ссге\'1.^1ае, полученная на основе штамма ВУ4742 (МАТа ИиЗА 1еи2Л 1уа2А игаЗА) (\Vinzeler й а1., 1999). В работе также были использованы некоторые другие штаммы, перечисленные в таблице 1.

Таблица 1. Штаммы дрожжей, использованные в работе.

Штамм Генотии

BY4742 MATahis3A 1еи2А lys2A игаЗА

4-13-BY4743 МАТа 1еи2А lys2A игаЗЛ his3A ade4 ade!3 A

16-17-BY4742 MATa Ieu2A lys2A игаЗА his ЗА adelóA ctdel7A

PLY 122 МАТа 1еи2-3,122, Ivs2-A201 ura3-52

PLY122-HLAM MATa leu2-3,l 12 Iys2-A201 ura3-52 haml -:LEU2

Y511 MA Та leu2-3,112 Iys2-A201 ura3-52 aptl ■ ■ URA3

Y511-HLAM MATa leu2-3,112 1ys2-A201 ura3-52 aptl-URA3 haml ■:LEU2

Y520 MATa leu2-3,112 Iys2-A201 ura3-52 aahl: URA3

Y550 MATa leu2-3,112 Iys2-A201 ura3-52 aptl::URA3 aahl::URA3

Y508 MATa leu2-3,l 12 Iys2-A201 ura3-52 hptl::URA3

Y513 MATa leu2-3,l 12 Iys2-A201 ura3-52 fcy2::URA3

Плазмиды. Для получения мутантов haml ::LEU2 использовали фрагмент плазмиды HLAM (Noskov et al., 1996), содержащей ген НАМ1, промотор которого и 78 п.о. структурной части замещены на фрагмент ДНК размером 2,2 т.п.о., несущий дрожжевой ген LEU2.

Молекуляино-биологические методы. В работе использовали стандартные методы генной инженерии (Маниатис и др., 1984). Полимеразные цепные реакции проводили на термоциклере «Applied Biosystems» с использованием полимеразы T. aquaticus. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК на автоматическом секвенаторе «ABI 377 Prizm» проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Генетические и микробиологические методы. В работе использованы стандартные методы генетики бактерий (Миллер, 1976) и дрожжей (Захаров и др., 1984; Rose et al., 1990). Оценку частоты мутирования у микроорганизмов проводили как описано ранее (Shcherbakova and Pavlov, 1996). Оригинальные и редко применяемые методы описаны в диссертационной работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Гены, контролирующие чувствительность к ГАП у бактерий Е. coli. В

рамках данной работы нами были получены три случайные геномные библиотеки инсерционньгх мутантов Е coli с использованием транспозона EZ-Tn51M <oriV/KAN-2>. Две из этих библиотек были получены на основе штаммов дикого типа MG1655 и NR10836, третья библиотека получена на основе бактериального

штамма NR15627, несущего мутацию усЬХи изогенного штамму NR10836. По данным С. Г. Козьмина, инактивация гена YcbX, функция которого неизвестна, приводит к значительному увеличению чувствительности бактерий к ГАП. Анализ мутантов с измененной чувствительностью к ГАГ1 на фоне мутации усЬХ мог способствовать выявлению мутантов, которые не имеют фенотилического проявления у штаммов дикого типа, а также помочь выяснению функции 1ена YcbX. Объем каждой библиотеки составил 10000 независимых инсерционных мутантов.

Нами разработаны методы скрининга библиотек му1антов, которые отличались для трех исходных штаммов (в зависимости от генотипа) и подробно описаны в диссертационной работе. Геномные библиотеки, полученные на основе трех указанных штаммов, были использованы дня поиска мутантов, обладающих повышенной чувствительностью к ГАП (ГАП8). Мы также осуществили поиск мутантов, устойчивых к ГАП (ГАПК), с использованием геномной библиотеки на основе штамма NR15627 (усЬХ). У тех ГАГ!8 и ГАП11 мутантов, фенотип которых был подтвержден в повторных тестах, место инсерции определяли секвенированием участков бактериальной хромосомы, прилежащих к транспозону. Полученные последовательности находили в геноме Е coli (база данных http://ecocyc.org).

Гены, инактивация которых приводш к повышению чувствительности Е. rol/ к ГАП, перечислены в таблице 2. Все ГАП5 мутанты, идентифицированные нами в ходе геномного скрининга, мы разделили по проявляемому ими фенотипу на три класса. В первый класс вошли мутанты, наиболее чувствительные к ГАП. Большинство из них имеют дефект биосинтеза молибденового кофактора (МоКо), контролируемого генами Mol. Об участии некоторых генов Mo! в контроле чувствительности к ГАП было известно ранее (Kozmm et al., 2000). Поскольку мутанты mol не способны превращать хлорат в токсичный хлорит в анаэробных условиях, устойчивость к хлорату является фено типическим проявлением мутантов по биосинтезу МоКо. В первый класс также входит ген YhhP, кодирующий небольшой белок (81 а.к.), осуществляющий перенос серы в процессе тиомодификации тРНТС Мутанты yhhP, также как и мутанты mol. устойчивы к хлорату, что указывает на вошожное участие ' ена YhhP в биосинтезе молибденового кофактора. Нам не удалось идентифицировать молибдофермент, использующий МоКо в реакции детоксикации ГАП. Возможно, 1ен, кодирующий искомый молибдофермент, жизненно важен или у бактерий есть несколько различных, дублирующих друг друга, молибдоферментов.

Мутанты второго фенотипического класса обладают средним уровнем чувствительности к ГАП: мутант dam, чья чувствительность к аналогам была известна ранее (Radinan et al., 1979; Wagner et al, ! 984), a также впервые идентифицированные нами мутанты dksAJre, мутанты по генам рекомбинацион-иой репарации и некоторым другим генам. Ген Dam кодирует ДНК-метилазу, коюрая вносит сигнал о том, какая in двух цепей ДНК является вновь ^•.тгезиро ванной. Этот сигнал необходим для направления репарации

неспаренных оснований в новой цепи по матрице старой. Видимо, из-за отсутствия метилирования у мутантов dam репарация неспаренных оснований при включении ГАП инициируется в обеих цепях ДНК, что приводит к двунитевым разрывам ДНК. Именно этим объясняется токсичный эффект ГАП у мутантов dam. Ген DksA кодирует регулятор транскрипции, который, видимо, необходим для координации репликации и транскрипции в быстро делящейся бактериальной клетке. Мутант fre, обладающий повышенной чувствительностью к мутагеннному действию ГАП, был изучен нами в качественном и количественном тестах.

Таблица 2. Гены, инактивация которых приводит к повышению чувствительности к ГАП._________

Уровень Ген Биологическая роль

чувствительности мутанта к ГАП

Высокий МоаА, МоаС, MoaD, Биосинтез молибдогггерина -

МоеВ, МоеА, MogA, ModA, ModC незаменимого кофактора для ряда оксидоредуктаз

ПНР Неизвестна

Средний Dam* Репарация неправильно спаренных оснований

DksA* Репарация двойных разрывов ДНК; ответ клетки на стресс

RecB* RecC*, Гомологичная рекомбинация;

RuvA *, RecG* репарация двойных разрывов ДНК

SeqA* Регуляция транскрипции

TrmH* Неизвестна

Rph* Рибонуклеаза

Fre Активация рибонуклеотидредуктазы

YdzK Неизвестна

RelA Регуляция транскрипции

ArgD Биосинтез аргинина и лизина

Низкий MutL Репарация неправильно спаренных оснований

Add, DeoD Регуляция пула пуринов

Cca тРНК нуклеотидилтрансфераза

GroL Ответ на сгресс, укладка белков

RpoS о- субъединица РНК-полимеразы

1 Ilvl Биосинтез лейцина и валина

* - мутанты, чувствительные только к токсичному, но не мутагеннному действию ГАП.

Оказалось, что этот мутант более чем на порядок чувствительнее к ГАП, чем штамм дикого гипа (рис. 1а). Проведенные нами генетические и биохимические

эксперименты показали, что ген Fre не принадлежит МоКо-зависимому пути детоксикации ГАП. Так, штаммы, несущие мутацию fre, чувствительны к хлорату. Кроме того, частота ГАП-индуцированного мутагенеза у двойного муганта fre тоеА приблизительно в три раза выше, чем у одиночного мутанта тоеА (рис. 16). Таким образом, повышенный мутагенез у двойного мутанта fre тоеА, по сравнению с одиночным мутантом тоеА, указывает на то, что гены МоеА и Fre контролируют независимые пути детоксикации ГАП. Ген Fre кодирует НАДФН-зависимую фл ав ино ксидо-реду кт азу, которая необходима для активации нуклеотидредуктазы, фермента, осуществляющего синтез дезоксинуклеотидов. Мы предполагаем, что чувствительность мутантов fre к ГАП может быть связана либо с нарушением функции нуклеотидредуктазы, контролирующей пул предшественников ДНК, либо с нарушением функции белка Fre, как НАДФН-оксидоредуктазы, которая может поставлять электроны для реакции детоксикации ГАП.

одиночного мутанта fre в сравнении со циаммом дикою шпа (а) и у двойного мутанта fre тоеА в сравнении с одиночным мутантом тоеА (б). Частоту мутирования оценивали в тесте на индукцию рифампицин-усгойчивых клонов (Rif*).

Группа наименее чувствительных к ГАП мутантов включает мутанты по генам метаболизма пуриновых нуклеотидов (add и deoD), биосинтеза аминокислот (UvT) и некоторым другим генам. Инактивация генов, входящих в третий класс, приводит к повышению чувствительности лишь к мушсшюму, но не токсичному действию ГАП.

Каждая из полученных нами геномных библиотек содержала около 2% ауксотрофных мутантов, которые не попали в общий скрининг, так как тестирование чувствительности к ГАП проводили на минимальной среде. Мы предположили, что среди ауксотрофных мупашов могут оказался ГЛП5 штаммы. С наибольшей вероятностью мы ожидали обнаружить данный фенотип у пуриновых ауксотрофов (риг), так как нами было показано, что у дрожжей vyiaHTbi по генам, контролирующим биосинтез пуринов dc novo, проявляют

повышенную чувствительность к ГАП (см. табл. 4). Кроме того, по данным С. Г. Козьмина и Р. Шаапера, бактериальный ген CisJ (один из генов биосингеза цистеина), по-видимому, принимает участие в процессе биосинтеза МоКо и поэтому его инактивация может приводить к ГАП8 фенотипу. Для проверки указанных предположений из 642 полученных нами акусотрофов мы отобрали штаммы, нуждающиеся для роста в аденине или цистеине. Остальные ауксотрофные мутанты в дальнейшем не изучали. Гены, несущие инсерцию транспозона, которая приводила к ауксотрофности по аденину или цистеину были идентифицированы секвенированием. В качественном тесте ни один из мутантов риг не показал повышенной чувствительности к ГАП. Возможно, это связано с высокой эффективностью работы МоКо-зависимой системы детоксикации ГАП. Мутант cysJ был более чувствителен к ГАП по сравнению со штаммом дикого типа и другими мутантами cys, что подтвердило предположение о возможном участии гена CysJ в контроле чувствительности Е. coli к ГАП.

Таблица 3. Гены, инактивация которых приводит к супрессии мутации усЬХ.

Фенотип Ген Функция продукта гена

мутанта

супрессия АспВ 2- м ет ил и зо цитрат де гидротаза

мутаген- АгоВ Биосинтез ароматических аминокислот

ного GalU УТФ-глюкоза-1 -фосфатуридилтрансфераза

эффекта MeÜ Репрессор транскрипции

ГАП NudB дАТФ-пирофосфорилаза

PstA,B,S ABC транспортер фосфата

RecN Рекомбинация и репарация

RfaG Структура клеточной стенки

RfaH Транскрипционный фактор

RhsA Неизвестна, повторяющаяся последовательность, горячая точка рекомбинации

Устой- DeoB Фосфопентомутаза

чивость к PepP Пролинаминопептидаза

токсичному YjcD Мембранный белок

действию YieL Предполагаемая ксиланаза

ГАП Nfi Эндонуклеаза V

Проведенный нами поиск супрессоров мутации усЬХ, позволил идентифицировать 17 различных генов, инактивация которых приводит к повышению устойчивости клеток бактерий к ГАП (табл. 3). Все идентифицированные в этом скрининге гены не проявляют специфичности по отношению к мутации усЬХ. Инактивация генов, перечисленных в таблице 3,

ГАП

Рисунок 2. Генетический контроль мутагенного и токсичного действия ГАП у Е. coli.

Пояснения: посредством активного или пассивного транспорта экзогенный ГАП попадает в клетку. Некоторые из обнаруженных нами генов (PstA,B,S и YjcD) кодируют мембранные белки, которые, видимо, изменяют проницаемость бактериальной клетки и отвечают за активный или пассивный транспорт ГАП в клетку. Далее неизвестный молибдофермент или несколько молибдоферментов превращают ГАП в нетоксичное азотистое основание, возможно, аденин. Молибденовый фермент(ы) вносит наибольший вклад в детоксикацию ГАП у бактерий. Под действием различных ферментов утилизации и взаимопревращения пуринов (кодируемых генами Apt, Hpt, Gpt, DeoD, Add), ГАП попадает в пул предшественников ДНК. Пирофосфорилаза, кодируемая геном RdgB, ортологом дрожжевого гена НАМ1, «очищает пул» предшественников ДНК от дГАПТФ, превращая его в дГАПМФ. дГАПТФ встраивается в ДНК при репликации и вызывает транзиции в следующем раунде репликации. ГАП в ДНК может узнаваться ферментами репарации неспаренных оснований (гены MutL, Dam). Также, ГАП, находящийся в матрице ДНК, инициирует появление двунитевых разрывов, репарируемых системой рекомбинационной репарации (гены: RecA,B,C, RuvA,B,C). Причиной двунитевых разрывов служит разрушение вилки репликации из-за присутствия на матричной цепи однонитевых брешей, вносимых эндонуклеазой V (Nfi) К разрушению вилки репликации также может приводить ее «столкновение» с транскрипционным комплексом. В регуляции транскрипции в стрессовых условиях и в ее координации с репликацией участвуют ген DksA и ген RelA, контролирующий биосинтез сигнальной молекулы 3'-пирофосфат-гуанозин-5'-пирофосфат (ффГфф).

приводит к повышению устойчивости к ГАП не только мутантов ychX, но и штамма дикого типа. По фенотипическому проявлению все идентифицированные мутанты можно разделить на два класса (табл. 3). Первый класс включает мутантов, супрессирующих мутагенный эффект ГАП. Во второй класс входят мутанты с повышенной устойчивостью к токсичному действию ГАП. В данном скрининге мы обнаружили мутант nfi, который был более устойчив к токсичному действию ГАП, чем мутант усЬХ или штамм дикого типа, что согласуется с литературными данными. Известно, что инактивация гена Nfi, кодирующего эндонуклеазу V, приводит к снижению частоты рекомбинации и повышению частоты мутирования у двойных мутантов mol rdgB (Burgís et al., 2003). Эндонуклеаза V «узнает» ГАП в ДНК и вносит однонитевой разрыв вблизи повреждения, инициируя таким образом репарацию.

Таким образом, нами было идентифицировано более 40 генов бактерий, участвующих в контроле чувствительности клетки к ГАП. Мутации в этих генах приводят к повышению чувствительности или устойчивости к мутагенному и токсичному действию ГАП. Общая схема генетического контроля действия ГАП у бактерий представлена на рисунке 2. Не все из идентифицированных нами генов нашли свое место на этой схеме. Мы лишь обозначили некоюрые наиболее вероятные гипотетические или доказанные этапы метаболизма ГАП в бактериальной клетке.

Гены, контролирующие чувствительность к ГАП у дрожжей S. cerevisiae. Для поиска мутантов, чувствительных к мутагенному и/или токсичному действию ГАП, мы осуществили скрининг дрожжевой делеционной библиотеки, соддержащей 4830 гаплоидных делеционных мутантов (в этом случае из анализа исключены те гены, делеции которых летальны). В результате проведенного скрининга было идентифицировно 16 FAIIS мутантов. В дальнейшем мы количественно оценили уровень индуцированного мутагенеза и выживаемость в присутствие ГАП у изолированных нами мутантов (табл. 4). На основании качественного и количественного тестов мы разделили FAns мутантов на три фенотипических класса. К первому классу, кроме ранее известных мутантов haml и aahl, относятся также мутанты adel2 и ade2. Эти штаммы были очень чувствительны как к мутагенному, так и к токсичному действию ГАП (табл. 4) Наиболее чувствительны к ГАП мутанты haml и adel2.

Во второй фе нот и п и ческ и й класс вошло 11 мутантов. Мугашы этого класса, были чувствительны к мутагенному действию ГАП, но ГАП в концентрации 25 мг/мл не вызывал значительного снижения выживаемости у этих штаммов (табл. 4). Мутанты, входящие во второй класс отличаются по урошио чувствительности к ГАП. Наиболее чувствительны к ГАП 8 мутантов из 11 • vipl, vid27, adel, ade5,7, adeñ, ade8, ¡pkl и rimlOl (табл. 4). Мутанты yjl055w, ygr035c, и adc3 несколько менее чувствительны к ГАП, чем остальные мутанты из второш класса.

Третий фенотипический класс включает три мутанта: \he4, trp2, н \т/013с-а, которые чувствительны к токсичному, но не мутагенному действию ГАП.

Таблица 4. Гены дрожжей, инактивация которых приводит к повышению чувствительности клеток к ГАП._______

Фено-типический класс Ген Чувствительность к ГАП* Биологическая функция

Частота мутирования (хЮ"5)*** Выживаемость

Дикий тип Класс I: мутанты, чу вствительные к токсичному и мутагенному действию ГАП 4 [2,3-5,41 100%

НАМ1 130 Г100-1501 17% Нуклеотидпирофосфорилаза

ADEI2** 100 Г80-1301 30% Биосинтез АМФ de novo

ADE2 44 [23-601 70%

А АН}** 55 [40-70] 30% Утилизация и взаимопревращение пуринов, адениндезаминаза

Класс II мутанты, чувствительные к мутагенному действию ГАП VIP1 8,4 [6-10] 76% Неизвестна, участвует в организации цитоскелета

VID27 6 [5,5-7,5] 82% Неизвестна, вовлечен в вакуолярный транспорт и деградацию

IPK1 14 [13-15,5] 100% Метаболизм мио-инозитола; деталь с biml, tofl и chsl

ADE5.7 19[16-211 100% Биосинтез АМФ de novo

ADE8 15 Г13,5-171 100%

ADE6 11Г Ю-131 100%

ADE3 9,4 [8-10,61 100%

ADE1 8,6 [7-101 100%

RJM10I 11 [9,7-12] 100% неизвестна

YGR035c 5 [3,8-6,51 100% неизвестна

YJL055W** 5 [3,5-71 100% неизвестна

Класс III мутанты, чувствительные к токсичному действию ГАП YML013c-a 23П-31 60% неизвестна, леталь с cdc73

SHE4 6 [5-8] 30% Поляризация актинового цитоскелета, ассиметричная локализация мРНК

TRP2 2,5 [1,8-4] 60% Биосинтез триптофана

* - концентрация ГАП 25 мг/л. ** - мутанты по этим генам также чувствительны к АГАП. *** - представлены медиана и доверительный интервал. Частоту мутирования определяли в количественном тесте на индукцию прямых мутаций устойчивости к канаванину. Достоверность отличий ГАП-индуцированной частоты мутирования у тестируемых штаммов в отличие от таковой у штамма дикого типа оценивали по непараметрическому критерию Вилкоксона.

В количественном тесте мутанты утЮ13с-а и &р2 были даже менее чувствительны к мутагенному действию ГАП, чем штамм дикого типа (табл. 4). У мутанта хЬе4 повышеный уровень мутагенеза по сравнению со штаммом дикого

типа был заметен только в количественном тесте из-за высокой токсичности ГАП. Существование такого типа мутантов указывает на то, что причина токсичного действия ГАП заключается не только в индукции летальных мутаций, но также может быть связана с подавлением клеточно! о метаболизма.

Г АП4 мутанты дрожжей были проверены нами также на чувствительность к ряду других мутагенов, таких как ультрафиолетовый свет (УФ), этилметансульфонат (ЭМС) и 2-амино-ГАП (АГАП). Также мы изучили спонтанный уровень мутагенеза у идентифицированных нами мутантов на фоне делеции гена OGG1. Инактивация гена OGG1 приводит к повышению внутриклеточной генерации 8-оксогуанина (ОГ) - мутагенного аналога оснований. Ни один из перечисленных в таблице 4 мутантов не проявил повышенной чувствительности к УФ, ЭМС или ОГ. Три из идентифицированных нами ГАП5 мутантов оказались чувствительными к АГАП. Мутанты aahl и yjl055w сверхчувствительны к мутагенному, а мутант ade12 - к токсичному действию АГАП. Ранее при проведении скрининга для поиска мутантов, чувствительных к УФ и метилметансульфонату (ММС), были идентифицированы десятки генов, участвующих в защите клетки от этих агентов В основном это гены, контролирующие репликацию, репарацию и клеточный цикл. Множества генов, идентифицированных при скрининге на чувствительность к УФ и ММС и найденных в данной работе не перекрываются. Таким образом, можно заключить, что гены, идентифицированные нами у дрожжей, специфичны для ГАП-индуцированного мутагенеза, который не зависит от общих систем репарации и не блокирует репликацию. Однако нельзя забывать, что в наш скрининг были включены лишь гены, не существенные для вегетативного pocia. Было бы интересно изучить влияние точковых мутаций в жизненно важных генах на ГАП-индуцированный мутагенез. Ранее было показано, что точковые мутанты по экзо-доменам ДНК-полимераз обладают TAns фенотипом (Shcherbakova et al., 1996).

Гены, контролирующие метаболизм предшественников ДНК, играют важную роль в проявлении мутагенных свойств аналогов. Так, из 18 идентифицированных при скрининге генов, 2 гена контролируют взаимопревращения пуринов и 7 генов - биосинтез АМФ de novo (табл. 4, рис. 3). Использованный при геномном скрининге подход не позволил нам изучить влияние инактивации остальных генов биосинтеза АМФ - ADE4, ADE13, ADEI6 и ADE17 - на чувствительность дрожжей к аналогам Роль этих генов в контроле чувствительности к ГАП и АГАП была исследована специально. Мы показали в количественном тесте, что мутанты ade4 в два раза чувствительнее к ГАП, чем штамм дикого типа и не проявляют повышенной чувствительности к АГАП, как и большинство мутантов ade.

Ген ADE/3 контролирует два этапа биосинтеза АМФ (рис. За). Мутанты adel3 не растут на полной среде с глюкозой, но растут на среде с глицерином. Дополнительные мутации на более ранних этапах биосинтеза пуринов снимают условно-летальный фенотип ade 13 (Зехнов и др., 1995). Для проверки влияния adel3 на чувствительность клеток дрожжей к ГАП и АГАП мы использовала

двойной мутант ade4 adel3. В данной работе мы показали, что двойной мутант ade4 ade!3 гораздо более чувствителен к ГАП и АГАП, чем штамм дикого типа или одиночный мутант ade4 (аналогично ведет себя мутант adelZ). Мы обнаружили, что гипоксантин, который является нормальным клеточным метаболитом, токсичен для штаммов дрожжей, несущих мутацию ade 12 или adel3.

Гены ADE16 и ADE17, кодирующие изозимы, контролируют девятую и десятую стадии биосинтеза пуринов de novo (рис. За). Мы показали, что эти гены не существенны для проявления мутагенных свойств ГАП (рис. 36). Таким образом, инактивация любого гена, контролирующего биосинтез АМФ, за исключением генов ADE16 и ADE17, повышает чувствительность клеток дрожжей к мутагенному действию ГАП. Причем, чувствительность различных мутантов ade к ГАП сильно отличается. Возможно, это объясняется наличием у генов A DE дополнительных функций. Известно, что мутации на разных этапах биосинтеза АМФ de novo по-разному влияют на экспрессию генов ADE. Сигналом при этом служит накопление промежуточных продуктов биосинтеза АМФ (Guetsova et al., 1997).

а)

{ АРЕ J

ДНК

датф илт

(дГАПТФ>-~",~ДГА11МФ

б)

ДНК

I NDK1 ДГДФ

KNK1 КРПЦ

ADEUJ7 ОИГ»

ЯМ/J. и®-—КМФ —-пи»

г "ГО

«о

| 300

| 10» 1

к г kH2Strtl АГАП, «и

В)

1Г

- Г ЯП

К«.СИМ ГУ,

--t'^f

№0

7(1»

о

X

4CU

L X»

20>

100

ГЛД25И/Л J.Ai [ КО и'и

Клсгочим мсыбдом ГСУ2 | __|

АДЦГлП) :>Л КС Гу«

Рисунок 3. Влияние генов метаболизма пуринов на чувствительность клеток дрожжей к мутагенным аналогам ГАП и АГАП. а) Схема метаболизма пуринов у дрожжей, б) чувствительность двойного мутанта adel6 adel7 к мутагенному действию ГАП и АГАП. в) Влияние мутаций по генам ЕСУ2, АРТ1, НРТ1 и ХРТ1 на чувствтельность к ГАП и АГАП.

Нельзя исключать того, что этот сигнал может влиять на экспрессию других генов метаболизма пуринов, модифицируя, таким образом, чувствительность клеток дрожжей к пуриновым аналогам.

Активация мутагенных аналогов ГАП и АГАП осуществляется посредством их включения в клеточный метаболизм ферментами утилизации и взаимопревращения пуринов С целью идентификации генов, отвечаюнщх за активацию аналогов у дрожжей, мы тестировали чувствительность к ГАП и АГАП у штаммов S. cerevisiae, несущих мутации в генах системы утилизации и взаимопревращения пуринов (FCY2, АРТ1, НРТ1 и ХРТ1). Как следует из данных, представленных на рисунке Зв, пурин-цитозиновая пермеаза не существенна для транспорта аналогов в клетку, так как мутация jcy2 не приводит к изменению чувствительности к ГАП и АГАП. Следующим этапом активации аналогов является их превращение в нуклеозидмонофосфаты (рис. За). Результаты наших экспериментов показали, что фосфорибозилирование ГАП и АГАП, катализируемое аденин-фосфорибозилтрансферазой, кодируемой геном АРТ1, является необходимым условием для активации и проявления мутагенных свойств этих соединений в клетках дрожжей. Мутация apt/ приводит к устойчивости клеток дрожжей к мутагенному действию ГАП и АГАП. Инактивация генов НРТ] и XPTI, кодирующих гуанин-гипоксантин- и ксантин-фосфорибозилтрансферазы. соответственно, не оказывает существенного влияния на уровень индуцированного мутагенеза (рис. Зв).

Сравнительная характеристика генетического контроля ГАП-индуцированного мутагенеза у бактерий Е. coli и дрожжей S. cerevisiae. В данной работе мы обнаружили, что у Е coli и S. cerevisiae имеются значительные отличия в системах детоксикации и активации ГАП. Основная роль в процессе детоксикации ГАП у бактерий принадлежит МоКо-зависимой системе, в то время как у дрожжей - гену НАМ!. Об участии бактериальных генов Mol и дрожжевого гена НАМ1 в контроле чувствительности к ГАП было известно ранее Проведенный нами геномный скрининг показал, что бактериальные мутанты mol и мутант haml дрожжей обладают наибольшей чувствительностью к ГАП rio сравнению со всеми идентифицированными в этой работе и известными ранее TAns мутантами. Здесь следует отметить, что у дрожжей отсутствуют гены биосинтеза МоКо и не обнаружены какие-либо молибдоферменты. Бактериальный гомолог гена НАМ1, ген RdgB, вносит лишь незначительный вклад в контроль детоксикации ГАП (Burgis et al., 2003), что, по-видимому, объясняется наличием у бактерий высокоэффективной МоКо-зависимой системы

Второе важное отличие состоит в том, что у дрожжей отсутствует эндонуклеаза V, которая эффективно узнает ГАП в ДНК Е. coli и инициирует появление однонитевых разрывов, индуцирующих рекомбинацию (Burgis et al., 2003). Отсутствие эндонуклеазы V у дрожжей является одной из причин того, что ГАП-индуцированный мутагенез у 5 cerevisiae не зависит ни от одной из общих систем репарации ДНК, в отличие от бактерий. У бактерий, вносимые эндонуклеазой V однонитевые разрывы вблизи ГАП, служат причиной возникновения двойных разрывов, которые репарирутотся белками системы рекомбинационной репарации. Также у бактерий некоторый вклад в ГАП-индуцированный мутагенез вносит система репарации неспаренных оснований.

У дрожжей мутанты по всем генам A DE, кроме ade 16 и ade 17 обладают rAns фенотипом. У бактерий ни у одного из полученных нами пуриновых ауксотрофов не был увеличен ГАП-индуцированный мутагенез по сравнению со штаммом дикого типа. Общей чертой Е. coli и S. cerevisiae является то, что у обоих организмов в процессах активации и детоксикации ГАП принимают участие ферменты утилизации и взаимопревращения пуринов.

Мы полагаем, что данные системы сформировались в эволюции для защиты от промежуточных продуктов метаболизма пуринов, таких как гипоксантин, потенциально способного вызывать мутации. ГАТТ в этом случае, являясь аналогом гипоксантина, служит удобным инструментом для исследования механизмов поддержания стабильности ДНК, а также изучения других клеточных процессов, в которых используются пуриновые нуклеотиды.

Известно, что разные виды живых организмов, обладают неодинаковой чувствительностью к аналогам оснований. Например, ГАП - более сильный мутаген для дрожжей, чем для Е. coli, в то же время бактерии более чувствительны к действию АГАП (Pavlov et al., 1991). Результаты нашей работы позволяют заключить, что видовая специфичность действия различных аналогов оснований связана с характерным для каждого вида набором белков, способных метаболизировать ГАП.

ВЫВОДЫ

1. С использованием методов функциональной геномики идентифицировано 20 генов дрожжей S. cerevisiae и более 40 генов бактерий Е. coli, инактивация которых приводит к изменению чувствительности этих микроорганизмов к действию 6-гидроксиламинопурина (ГАП).

2. Установлено, что наряду с повышенной чувствительностью к мутагенному действию ГАП, мутанты дрожжей aahl и yjl055w также чувствительны к мутагенному действию АГАП, а мутанты adel2 и ade!3 обладают повышенной чувствительностью к токсичному действию АГАП и гипоксантина.

3. У бактерий и дрожжей детоксикация ГАП осуществляется посредством различных механизмов: в случае бактерий основной вклад в детоксикацию ГАП вносит система, зависимая от молибденового кофактора, а у дрожжей главная роль в этом процессе принадлежит ферментам метаболизма пуринов, кодируемых генами НАМ!, ADE12 и ADE13. В отличие от бактерий, инактивация генов, контролирующих биосинтез АМФ de novo, приводит к повышению чувствительности клеток дрожжей к мутагенному действию ГАП .

4. Инактивация генов общих систем репарации дрожжей не влияет на уровень чувствительности к ГАП, в то время как у бактерий штаммы с дефектами системы репарации двойных разрывов и неспаренных оснований чувствительны к ГАП.

5. Общей чертой для бактерий и дрожжей является участие в процессе детоксикации ГАП некоторых (различных у каждого вида) ферментов утилизации и взаимопревращения пуринов.

6. Для активации ГАП как мутагена у обоих исследованных модельных микроорганизмов необходимо фосфорибозилирование аналога, причем у бактерий в этом процессе участвуют все 3 известных фосфорибозилтрансферазы, тогда как у дрожжей главная роль в этом процессе принадлежит аденин-фосфорибозилтрансферазе.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор благодарит доктора биологических наук, профессора университета

штата Небраска (США) Ю. И. Павлова за неоценимую помощь и поддержку на

всех этапах работы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Stepchenkova Е. Т., Kozmin S. G., Alenin V. V., Pavlov Y. I. Genome-wide screening for genes whose deletions confer sensitivity to mutagenic purine base analogs in yeast // BMC Genetics. 2005. V. 6. № 31. P. 1-6.

2 Степченкова E. И., Козмин С. Г., Метаболизм мутагенных аналогов пуринов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Материалы II Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), (Санкт-Петербург, I -5 февраля 2000 г.), Т. 2, С. 208-209.

3 Stepchenkova Е. I., Alenin V. V., Pavlov Y. I., Genome-wide screen for genes controlling sensitivity to mutagenic base analogs in yeast // In- XXIst Internationa] conference on yeast genetics and molecular biology. Sweden, Goteberg, July 6-12. 2003. V. 6. № SI. P. 90 (Abstract).

4 Stepchenkova E. ]., Kozmin S. G., Alenin V. V., Pavlov Y. I. Mutagenic pathway of base Analogs 6-hydroxylaminopunne and 2-amino-6-hydroxylaminopurine in yeaat Saccharomyces cerevisiae // In: 7-th Annual Midwest DNA repair symposium, USA, Michigan, Detroit, May 21-22, 2005, P. 46. (Abstract).

5 Stepchenkova E. I., Kozmin S. G., Dunn R. L., Schaaper R. M. A novel pathway controlling 6-hydroxylaminopurine induced mutagenesis in Escherichia coli // In: The second International Conference dedicated to 105-th anniversary of birth of N. W. Timofeeff-Ressovsky and 70-th anniversary of the paper "On the nature of gene mutations and gene structure" by N. W. Timofeeff-Ressovsky, K. G. Zimmer and M. Delbrück "Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution", Armenia, Yerevan, September 8-12, 2005, P. 93. (Abstract).

Подписано в печать .04.2006. Формат бумаги 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 3765.

Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ. 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр.26

»1147 9

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степченкова, Елена Игоревна

СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Предшественники ДНК и их мутагенные аналоги.

1.1.1. Метаболизм пуринов. Сравнительная характеристика метаболизма пуринов у Е. coli и S. cerevisiae.

1.1.1.1.Биосинтез пуриновых нуклеотидов de novo.

1.1.1.2.Утилизация и взаимопревращение пуринов.

1.1.2. Мутагенные аналоги пуринов. Механизм действия мутагенных предшественников ДНК.

1.1.3. 6-гидроксиламинопурин.

1.2. Использование функциональной геномики для масштабного поиска генов, контролирующих чувствительность модельных микроорганизмов

Е. coli и S. cerevisiae к различным мутагенам.

1.3.Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы и плазмиды, использованные в работе.

2.1.1. Штаммы бактерий.

2.1.2. Штаммы дрожжей.

2.1.3. Плазмиды.

2.2. Среды и условия культивирования. ф 2.3. Реактивы.

2.4. Методы генетики микроорганизмов.

2.4.1. Бактерии.

2.4.1.1. Стандартные генетические методы.

2.4.1.2. Качественный тест на токсичное и мутагенное действие аналогов.

2.4.1.3. Количественный тест на индукцию прямых мутаций в гене Rif.

2.4.1.4. Тестирование штаммов на чувствительность к хлорату калия.

2.4.1.5. Создание геномной библиотеки инсерционных мутантов

Е. coli.

2.4.1.6. Анализ бактериальных геномных библиотек с целью выявления генов, контролирующих чувствительность к ГАП.

2.4.2. Дрожжи.

2.4.2.1. Стандартные генетические методы.

2.4.2.2. Получение штаммов дрожжей.

2.4.2.3. Тестирование мутагенной активности аналогов оснований.

2.4.2.4. Тестирование чувствительности клеток дрожжей к токсичному действию ЭМС и УФ-света.

2.4.2.5. Геномный скрининг с использованием дрожжевой библиотеки делеционных мутантов для поиска штаммов, чувствительных к ГАП.

2.5. Молекулярно-генетические методы.

2.5.1. Стандартные молекулярно-генетические методы.

2.5.2. Идентификация места инсерции транспозона EZ-Tn5™ <oriV/KAN-2> в хромосоме Е. coli.

2.6. Статистические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Поиск генов, контролирующих чувствительность к ГАП у бактерий

Е. coli.

3.1.1. Создание и анализ случайных геномных библиотек инсерционных мутантов Е. coli.

3.1.2. Результаты скрининга геномных библиотек случайных инсерционных мутантов у бактерий.

3.1.2.1. Гены, инактивация которых приводит к повышению чувствиельности клеток к ГАП.

3.1.2.2. Ген YhhP принадлежит МоКо-зависимому пути детоксикации ГАП.

3.1.2.3. Ген Fre контролирует новый МоКо-независимый путь детоксиеации ГАП.

3.1.2.4. Анализ ауксотрофов.

Ф 3.1.2.5. Гены, инактивация которых приводит к супрессии ГАП5-фенотипа у мутантов усЬХ.

3.2. Геномный скрининг с целью выявления генов, контролирующих чувствительность дрожжей S. cerevisiae к ГАП.

3.2.1. Подбор условий для скрининга дрожжевой делеционной библиотеки.

3.2.2. Результаты скрининга дрожжевой библиотеки делеционных мутантов.

3.2.3. Проверка чувствительности ГАП , мутантов идентифицированных в геномном скрининге, к действию других мутагенов.

Ф 3.3. Изучение влияния мутаций в генах ade4, adel6, adel7w. adelS на чувствительность клеток дрожжей к ГАП.

3.4. Идентификация генов, отвечающих за активацию ГАП у дрожжей.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Генетический контроль чувствительности Е. coli к мутагенному и токсичному действию ГАП.

4. 2. Генетический контроль чувствительности дрожжей S. cerevisiae к мутагенному и токсичному действию ГАП.

4. 3. Сравнение генетического контроля ГАП-индуцированного мутагенеза у бактерий Е. coli и дрожжей S. cerevisiae.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический контроль чувствительности про- и эукариотических микроорганизмов к мутагенным аналогам пуринов"

Среди химических мутагенов особое положение занимают аналоги природных азотистых оснований, мутагенные свойства которых обусловлены способностью включаться в ДНК и провоцировать ошибки ДНК-полимераз в последующих раундах репликации. Впервые репликативный механизм действия аналогов оснований был предложен Фризом в 1959 году (Freese, 1959). В более поздних работах данная модель получила экспериментальное подтверждение, а отдельные этапы мутагенеза, индуцированного аналогами, были детально исследованы. Так, была показана возможность эндогенной генерации ряда аналогов, что является существенным источником спонтанных мутаций. Для некоторых аналогов были идентифицированы ферменты, контролирующие превращение этих соединений в их истинную мутагенную форму - соответствующие дезоксирибонуклеозид-трифосфаты (дНТФ), и участвующие таким образом в активации аналога как мутагена. Репликативные ДНК-полимеразы в значительной мере определяют степень мутагенной активности аналогов оснований. Повреждения ДНК, вызванные включением аналогов, могут быть репарированы как общими, так и специфичными для каждого аналога системами репарации (Negishi et al., 1994).

Аналог аденина 6-гидроксиламинопурин (ГАП), впервые синтезированный как потенциальный противоопухолевый агент (Giner-Sorolla and Bendich, 1958), оказался сильным мутагеном для широкого круга живых организмов - вирусов, бактерий, грибов и млекопитающих. Современные данные указывают на то, что ГАП действует по репликативному механизму, как классический аналог оснований. Включаясь в клеточный метаболизм ферментами утилизации пуринов, ГАП превращается в соответствующий дНТФ и участвует в репликации.

ДНК-полимеразы могут ошибочно встраивать ГАП напротив цитозина, что приводит к возникновению транзиций в последующих раундах репликации.

Наиболее хорошо генетический контроль ГАП-индуцированного мутагенеза изучен у бактерий Escherichia coli и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Показано, что у бактерий к сверхчувствительности клеток к ГАП приводит нарушение биосинтеза молибденового кофактора (МоКо) (Kozmin et al., 2000). Однако молибдофермент, переводящий ГАП в нетоксичную форму, пока не обнаружен. У дрожжей повышенной чувствительностью к ГАП обладают штаммы, несущие мутации в гене НАМ1. Ген НАМ1 кодирует фермент нуклеотидпирофосфорилазу, который удаляет ГАП из пула предшественников ДНК. Гомологи гена НАМ1 обнаружены практически у всех организмов (Noskov et al., 1996). Однако бактериальный гомолог гена НАМ1, ген RdgB не оказывает существенного влияния на чувствительность клеток Е. coli к ГАП (Burgis et al., 2003).

Для того чтобы понять, насколько универсальны механизмы мутагенного действия ГАП у разных представителей про- и эукариотических организмов мы предприняли глобальный поиск генов, контролирующих чувствительность к этому аналогу у бактерий Е. coli и дрожжей S. cerevisiae. Для этого использовали созданную нами геномную библиотеку инсерционных мутантов Е. coli и делеционную библиотеку дрожжей. В результате проведенного геномного скрининга были идентифицированы десятки генов, инактивация которых приводит к изменению чувствительности клеток дрожжей и бактерий к ГАП. Мы показали, что как бактерии, так и дрожжи имеют развитые системы защиты от мутагенного и токсичного действия ГАП, но эти системы значительно отличаются. У бактерий основной вклад в детоксикацию ГАП вносит МоКо-зависимая система, в то время как у дрожжей ключевая роль в этом процессе принадлежит ферментам метаболизма пуринов. У дрожжей мы не обнаружили влияния общих систем репарации на уровень ГАП-индуцированного мутагенеза. У бактерий ГАП узнается специфической эндонуклеазой, что индуцирует возникновение двойных разрывов при репликации, которые репарируются системой рекомбинационной репарации. Общей чертой у исследованных микроорганизмов является способность ГАП включаться в клеточный метаболизм ферментами утилизации пуринов и участвовать в реакциях, характерных для аденина.

Результаты, полученные в ходе выполнения работы, имеют значение для более полного понимания механизмов мутагенеза и канцерогенеза. Данные, представленные в работе, могут быть полезны при создании новых тест-систем для выявления факторов, нарушающих пул предшественников ДНК и являющихся источником спонтанных и индуцированных мутаций. У человека известны наследственные заболевания, вызванные мутациями в генах, гомологичных некоторым из идентифицированных нами в этой работе. Штаммы бактерий и дрожжей, несущие мутации соответствующих генов, могли бы стать моделями для изучения этих заболеваний.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Степченкова, Елена Игоревна

выводы.

1. С использованием методов функциональной геномики идентифицировано 20 генов дрожжей S. cerevisiae и более 40 генов бактерий Е. coli, инактивация которых приводит к изменению чувствительности этих микроорганизмов к действию 6-гидроксиламинопурина (ГАП).

2. Установлено, что наряду с повышенной чувствительностью к мутагенному действию ГАП, мутанты дрожжей aahl и yjl055w также чувствительны к мутагенному действию АГАП, а мутанты adel2 и ade!3 обладают повышенной чувствительностью к токсичному действию АГАП и гипоксантина.

3. У бактерий и дрожжей детоксикация ГАП осуществляется посредством различных механизмов: в случае бактерий основной вклад в детоксикацию ГАП вносит система, зависимая от молибденового кофактора, а у дрожжей главная роль в этом процессе принадлежит ферментам метаболизма пуринов, кодируемых генами НАМ1, ADE12 и ADE13. В отличие от бактерий, инактивация генов, контролирующих биосинтез АМФ de novo, приводит к повышению чувствительности клеток дрожжей к мутагенному действию ГАП.

4. Инактивация генов общих систем репарации дрожжей не влияет на уровень чувствительности к ГАП, в то время как у бактерий штаммы с дефектами системы репарации двойных разрывов и неспаренных оснований чувствительны к ГАП.

5. Общей чертой для бактерий и дрожжей является участие в процессе детоксикации ГАП некоторых (различных у каждого вида) ферментов утилизации и взаимопревращения пуринов.

6. Для активации ГАП как мутагена у обоих исследованных модельных микроорганизмов необходимо фосфорибозилирование аналога, причем у бактерий в этом процессе участвуют все 3 известных фосфорибозилтрансферазы, тогда как у дрожжей главная роль в этом процессе принадлежит аденин-фосфорибозилтрансферазе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степченкова, Елена Игоревна, Санкт-Петербург

1. Аленин В. В., Костикова Т. Р., Домкин В. Д. Обнаружение продуктов N-карбоксилирования N1-замещенных 5-аминоимидазолов в водных растворах бикарбоната калия // Журнал общей химии. 1987. Т. 57, вып. 3. С. 692-701.

2. Глотов Н. В., Животовский JI. А., Хованов Н. В., Хромов-Борисов Н. Н. Биометрия. Учебное пособие. JL: Изд. ЛГУ. 1982. 264 с.

3. Дрейлиня Д. Э., Фундули А. X., Тюлякова Т. С., Домкин В. Д., Сойдла Т. Р., Смирнов М. Н. Изучение регуляции биосинтеза пуринов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Вестник ленинградского университета. 1981. № 9. С. 93-97.

4. Захаров И. А., Кожин С. А., Кожина Т. Н. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука. 1984. 144 с.

5. Зехнов А. М., Андрейчук Ю. В., Домкин В. Д. Новое фенотипическое проявление мутаций ade2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae -неспособность расти на синтетической среде с глицерином и гипоксантином // Генетика. 1998. Т. 34, № 2. С. 190-197.

6. Инге-Вечтомов С. Г. Идентификация некоторых групп сцепления у Петергофских генетических линий дрожжей // Генетика. 1971. Т. 7, № 9. С. 113-123.

7. Инге-Вечтомов С. Г., Карпова Т. С. Частная генетика дрожжей сахаромицетов. СПб.: Издательство СПбГУ. 1993. 252 С.

8. Козьмин С. Г. Генетический контроль метаболизма 6-гидроксиламинопурина у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и бактерий Escherichia coli. Дисс. канд. биол. наук. СПб. 1999.

9. Ю.Козьмин С. Г.^Домкин В. Д. 7Зехнов А. Павлов Ю. И. Изучение генетического контроля метаболизма мутагенного аналога оснований 6-N-гидроксиламинопурина у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика. 1997. Т. 33. №5. С. 591-598.

10. П.Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Методы генетической инженирии. М.: Мир. 1984. 480 с.

11. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике: Пер. с англ. М.: Мир. 1976. 436с.

12. З.Павлов Ю. И. Мутанты дрожжей Saccharomyces cerevisiae, сверхчувствительные к мутагенному действию 6-N-гидроксиламинопурина // Генетика. 1986. Т. 22. № 9. С. 2235-2243.

13. Павлов Ю. И.^Хромов-Борисов Н. Н. Генетическая активность аналогов оснований у бактерий Salmonella typhimurium, Escherichia coli и дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика. 1984. Т. 20. № 8. С. 12701278.

14. Смолина В. С. Особенности регуляции биосинтеза пуриновых нуклеотидов у Saccharomyces cerevisiae, связанные со свойствами фермента 5-фосфорибозил-1-пирофосфатамидотрансферазы. Автореф. дисс. канд. биол. наук. JI. 1982.

15. Трибунских И. А., Аленин В. В., Селиванов С. И., Шавва А. Г., Инге-Вечтомов С. Г. Дивергенция биосинтеза инозин-5'-фосфата // Докл. АН/РАН. 2005. Т. 400. № 4. С. 65-68.1. Сл/П А 1

16. Abdul-Masih М. T.^Bessman М. J. Biochemical studies on the mutagen 6-N-hydroxylaminopurine. Synthesis of the deoxynucleoside triphosphate and its incorporation into DNA in vitro //J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 2020-2026.

17. Anderson J. M. and Roth R. Adenosine utilization in cordycepine-sensitive mutants of Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 1976. V. 128. № 2. P. 689-691.

18. Au K. G., Clark S., Miller J. H. Modrich P. Escherichia coli mutY gene encodes an adenine glycosylase active on G-A mispairs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 8877-8881.

19. Barrett J. C. Induction of gene mutation in and cell transformation of mammalian cells by modified purine: 2-aminopurine and 6-N-hydroxylaminopurine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 56855689.

20. Begley T. J., Rosenbach A. S., Ideker Т., Samson L. D. Damage recovery pathways in Saccharomyces cerevisiae revealed by genomic phenotyping and interactome mapping // Molecular Cancer Research. 2002. V. 1. P. 103-112.

21. Bennett С. В., Lewis L. K., Karthikeyan G., Lobachev K. S., Jin Y. H., Sterling J. F., Snipe J. R., Resnick M. A. Genes required for ionizing radiation resistance in yeast // Nature Genetics. 2001. V. 29 № 4. P. 426-434.

22. Beranek D. Т. Distribution of methyl and ethyl adducts following alkylation with monofunctional alkylating agents // Mutat. Res. 1990. V. 231. P. 11-30.

23. Birnboum H. C., Doly Y. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA//Nucl. Acids Res. 1979. V. 7. P. 1513-1524.

24. Birrell G. W., Giaever G., Chu A. M., Davis R. W., Brown J. M. A genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae for genes affecting UV radiation sensitivity// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98 № 22. P. 12608-12613.

25. Bisson L. F. and Thorner J. Exogenous dTMP utilization by a novel tup mutant of Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 1982. V. 152. № 1. P. 111-119.

26. Bohr V. A. Repair of oxidative DNA damage in nuclear and mitochondrial DNA, and some changes with aging in mammalian cells // Free radical biology and medicine. 2002. V. 32. № 9. P. 804-812.

27. Boiteux S., Huisman O., Laval J. 3-Methyladenine residues in DNA induce the SOS function sfiA in Escherichia coli II EMBO J. 1984. V. 3. P. 25692573.

28. Booker S., Licht S., Broderick J., Stubbe J., Coenzyme B12-dependent ribonucleotide reductase: evidence for the participation of five cysteine residues in ribonucleotide reduction // Biochemistry. 1994. V. 33. № 42. P. 12676-12685.

29. Bradsaw J. S. and Kuzminov A. V. RdgB acts to avoid chromosome fragmentation in Escherichia coli II Mol. Microbiol. 2003. V. 48. P. 17111725.

30. Budd M. E., Tong A. H., Polaczek P., Peng X., Boone C., Campbell J. L. A network of multi-tasking proteins at the DNA replication fork preserves genome stability // PloSGenet. 2005. V. 1. № 6. P. 0634-0650.

31. Burgis N. E., Brucker J. J., Cunningham R. P. Repair system for noncanonical purines in Escherichia coli II J. Bacteriol. 2003. V. 185. № 10. P. 3101-3110.

32. Burridge P. W., Woods R. A. Henderson J. F. Purine metabolism in Saccharomyces cerevisiae И Can. J. Biochem. 1977. V. 55. P. 935-941.

33. Burton K. Transport of nucleic acid bases into Escherichia coli И J. Gen. Microbiol. 1983. V. 129. P. 3505-3513.

34. Caetano-Anolles, G. Amplifying DNA with arbitrary oligonucleotide primers // PCRMethods Appl. 1993. V. 3. № 2. P. 85-94.

35. Chio К. Y. and Zalkin H. Structural characterization and corepressor binding of Escherichia coli purine repressor // J. Bacteriol. 1992. V. 174. № 19. P. 6207-6214.

36. Clement B. and Kunze T. Hepatic microsomal N-hydroxylation of adenine to 6-N-hydroxylaminopurine // Biochem. Pharmacol. 1990. V. 39. P. 925-933.

37. Clement B. and Kunze T. The reduction of 6-N-hydroxylaminopurine to adenine by ^antine oxidase // Biochem. Pharm. 1992. V. 44. № 8. P. 15011509. .)

38. Clyman J. and Cunnigham R. P. Escherichia coli K-12 mutants in which viability is dependent on recA function // J. Bacteriol. 1991. V. 169. P. 42034210.

39. Clyman J. and Cunnigham R. P. Supression of the defects in rdgB mutants of Escherichia coli K-12 by the cloned pur A gene // J. Bacteriol. 1987. V. 173. P. 1360-1362.

40. Cooper T. G. Transport in Saccharomyces cerevisiae. In: The molecular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Metabolism and gene expression. Edited by Strathern J. N., Jones E. W., Broach J. R. CSHL Press. 1982. P. 399-481.

41. Coulondre C., Miller J. H. Genetic studies of the lac repressor. IV. Mutagenic specificity in the lacl gene of Escherichia coli II J. Mol. Biol. 1977. V. 117. № 3. P. 577-606.

42. Cupples C. G. and Miller J. H. A set of lacZ mutations in Escherichia coli that allow rapid detection of each of the six base substitutions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 5345-5349.

43. Daignan-Fornier В., Fink G. R. Coregulation of purine and histidine biosynthesis by the transcriptional activators В AS 1 and В AS2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 6746-6750.

44. Davis-Kaplan S. R., Ward D. M., Shiflett S. L., Kaplan J. Genome-wide analysis of iron-dependent growth reveals a novel yeast gene required for vacuolar acidification // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 6. P. 4322-4329.

45. Deeley M. C. Adenine deaminase and adenine utilization in Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 1992. V. 174. № 10. P. 3102-3110.

46. DeRisi J. L., Lyer V. R., Brown P. O. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale // Science. 1997. V. 278. P.

47. Dorfman B.-Z. Allelic variability in comparative complementation confirming that the adel2-specified protein of yeast is bifunctional // J. Bacteriol. 1971. V. 107. P. 646-654.

48. Dorfman B.-Z. The isolation of ader succinate synthetase mutants in the yeast by the selection for constitutive behavior in pigmented strains // Genetics. 1969. V. 61. P. 377-389.

49. Earhart C. Uptake and methabolism of iron and molybdenum. In:

50. Escherichia coli and Slmonella, cellular and molecular biology. Edited by F.

51. C. Neidhardt. ASM press, Washington DC. 1996. P.1075-1090.

52. Elledge S. J. and Davis R. W. Two genes differentially regulated in the cell cycle and by DNA-damaging agents encode alternative regulatory subunits of ribonucleotide reductase // Genes Dev. 1990. V. 4. № 5. P. 740-751.

53. Fieshi F., Niviere V., Frier C., Decount J.L., Fontecave M. The Mechanism and Substrate Specificity of the NADPH:Flavin Oxidoreductase from Escherichia coli II J. Biol Chem. 1995. V. 270. № 51. P. 30392-30400.

54. Fontecave M., Eliasson R., Reichard P. Enzymatic regulation of the radical content of the small subunit of Escherichia coli ribonucleotide reductase680.686.involving reduction of its redox centers //J. Biol. Chem. 1989. V. 264. № 16. P. 9164-9170.

55. Fontecave M., Eliasson R., Reichard P. NAD(P)H: flavin oxidoreductase of E. coli: a ferric iron reductase participating in the generation of the free radical of ribonucleotide reductase // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. №25. P. 12325-12331.

56. Fortini P., Pascucci В., Parlanti E., D'Errico M., Simonelli V., Dogliotti E. 8-oxoguanine DNA damage: at the crossroads of alternative repair pathways // Mutat. Res. 2003. V. 531(1-2). P. 127-139.

57. Freese E. B. The mutagenic effect of hydroxylaminopurine derivatives on phage T4 // Mutat. Res. 1968. V. 5. P. 299-301.

58. Freese E.B. The specific mutagenic effect of base analogues on phage T4 // J. Mol. Biol. 1959. V. 1. P. 87-105.

59. Friedman A., Perrimon N. Genome-wide high-throughput screens in functional genomics // Current Opinion in Genetics & Development. 2004. V. 14. P. 470-476.

60. Giaever G. et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisisae genome I I Nature. 2002. V. 418. P. 387-391.

61. Giner-Sorolla A., Bendich A. Synthesis and properties of some 6-substituted purines // J. Am. Chem. Soc. 1958. V.80. P. 3932-3937.

62. Glickman В., van den Elsen P., Radman P. Induced mutagenesis in dam mutants of Escherichia coli: a role for 6-methyladenine residues in mutation avoidance // Mol. Gen. Genet. 1978. V. 163. P. 307-312.

63. Gots J. S., Benson С. E., Jochimsen В., Koduri K. R. Microbial models and regulatory elements in the control of purine metabolism. In: Ciba foundation Symposium "Purine and pyrimidine metabolism". Elsevier, 1977. P. 23-41.

64. Guetsova M. L., Lecoq K., Daignan-Fornier B. The isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae mutants that constitutively express purine biosynthetic genes // Genetics. 1997. V. 147. P. 383-397.

65. Hanway D., Chin J. K., Xia G., Oshiro G., Winzeler E. A., Romesberg F. Previously uncharacterized genes in the UV- and MMS-induced DNA damage response in yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 16. P. 10605-10610.

66. Haracska L., Yu S.-L., Johnson R. E. Prakash L., Prakash S. Efficient and accurate replication in the presence of 7,8-dihydro-8-oxoguanine by DNA polymerase rj //Nat. Genetics. 2000. V. 25. P. 458461.

67. Hieter P. and Boguski M. Functional genomics: it's all how you read it // Science. 1997. V. 278. № 5338. P. 601-602.

68. Huang M. E., Rio A. G., Nicolas A., Kolodner R. D. A genomewide screen in Saccharomyces cerevisiae for genes that suppress the accumulation of mutations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100 №20. P. 11529-11534.

69. Huang M., Elledge S. J., Identification of RNR4, encoding a second essential small subunit of ribonucleotide reductase in Saccharomyces cerevisiae II Mol.Cell Biol. 1997. V. 17. № 10. P. 6105-6113.

70. Ishii Y., Yamada H., Yamashino Т., Ohashi K., Katon E., Shindo H., Yamazaki Т., Mizuno T. Deletion of theyhhP gene results in filamentous cell morphology in Escherichia coli II Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. V. 64. № 4. P. 799-807.

71. Janion C: The synthesis and properties of N6-substituted 2-amino-purine derivatives. Acta Biochim. Pol. 1976. V. 23. № 1. P. 57-68.

72. Jones E. W., Fink G. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. In: Molecular biology of the yeast Saccharomyces. Metabolism and gene expression. Edited by Strathern J. N., Jones E. W., Broach J. R. 1982. CSHL Press. P. 181-299.

73. Kamiya H. Mutagenic potentials of damaged nucleic acids produced by reactive oxygen/nitrogen species: approaches using synthetic oligonucleotides and nucleotides: survey and summary // Nucleic Acids Res. 2003. V. 15. № 31(2). P. 517-531.

74. Katoh E., Hatta Т., Shindo H., Ishii Y., Yamada H., Mizuno Т., Yamazaki T. High precision NMR Structure of YhhP, a novel Escherichia coli protein implicated in cell division // J. Mol. Biol. 2000. V. 304. P. 219-229.

75. Khromov-Borisov N. N., SaffW^JoaoJHIenriques J. A. P. Perfect order plating: principle and applications // Technical tips online. 2002. http://research.bmn.com/tto. Ю2205.

76. Knaap A. G., Glickman B. W., Simson J. W. Effects of ethionine on the replicational fidelity in V79 Chinese hamster cells // Mutat. Res. 1981. V. 82. №2. P. 355-363.

77. Kornberg A., Baker T. A. DNA replication. W. H. Freeman and Company, New York. 1992. 931 p.

78. Kouzminova E. A. and Kuzminov A. V. Fragmentation of Replicating Chromosomes Triggered by Uracil in DNA // J. Mol. Biol. 2006. V. 355. P. 20-33.

79. Kouzminova E. A., Rotman E., Makomber L., Zhang J. A. Kuzminov A. V. RecA-dependent mutants in E. coli reveal strategies to avoid replication fork failure // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 16262-16267.

80. Kow Y. W. Repair of deaminated bases in DNA // Free radical biology and Medicine. 2002. V. 33. № 7. P. 886-893.

81. Kunkel Т. A. and Bebenek K. DNA replication fidelity // Annu. Rev. Biochem. 2000. V. 69. P. 497-529.

82. Kunz B. A. and Kohalmi S. E. Modulation of mutagenesis by deoxyribonucleotide levels // Annu. Rev. Genet. 1991. V. 25. P.339-359.

83. Li G., Laturnus C., Ewers C., Wieler L. Identification of Genes Required for Avian Escherichia coli Septicemiaby Signature-Tagged Mutagenesis // Infection and Immunity. 2005. V. 73. № 5. P. 2818-2827.

84. Lomax C. A., Woods R. A. Prototrophic regulatory mutants ofУadenilosuccinate synthetase in yeast // Nat. New Biol. 1971. V. 229. № 4. P. 116.

85. Maki H. and Sekiguchi M. MutT protein specifically hydrolyses a potent mutagenic substrate for DNA synthesis // Nature. 1992. V. 355. № 6357. P. 273-275.

86. McGlynn P., Lloyd R. G. Modulation of RNA polymerase by (p)ppGpp reveals a RecG-dependent mechanismjfor replication fork progression // Cell. 2000. V. 101. P. 35-45.

87. Meddows T. R., Savory A. P., Grove J. I. Moore T. Lloyd R. G. RecN protein and transcription factor DksA combine to promote faithful recombinational repair of DNA double-strand breaks // Mol. Microbiol. 2005. V. 57. №2. P. 97-110.

88. Michaels M. L., Cruz C., Grollman A. P. Miller J. H. Evidence that MutY and MutM combine to prevent mutations by an oxidatively damaged form of guanine in DNA // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 7022-7025.

89. Moriya M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanine in DNA induces targeted G:C—>T:Atransversions in simian kidney cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 1122-1126.

90. Nagy A., Perrimon N., Sandmeyer S., Plasterk R. Tailoring the genome: the power of genetic approaches // Nat. Genet. 2003. V. 33 (Supplement). P. 276-284.

91. Negishi K., Bessho Т., Hayatsu H. Nucleoside and nucleobase analog mutagenesis // Mutat. Res. 1994. V. 318. P. 227-238.

92. Negishi K., Takahashi M., Yamashita Y., Nishizawa M., Hayatsu H.05 V

93. Mutagenesis by 4-N-mninicitidine^nductio of AT to GC transition and its molecular mechanism // Biochemistry. 1985. V. 24. P. 7273-7278.

94. Negishi K., Tamanoi K., Ishii M., Kawakami M., Yamashita Y., Hayatsu H. Mutagenic nucleoside analog 4-N-aminicitidine: methabolism, incorporation into DNA and mutagenesis in Escerichia coli II J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 5257-5262.

95. Neuhard J. and Nygaard P. Puries and pyrimidines. In: Escherichia coli and Salmonella, cellular and molecular biology. Edited by Neidhardt F. C. ASM press, Washington DC. 1987. P. 445-473.

96. Nghiem Y., Cabrera M., Cupples C. G., Miller J. H. The mutY gene: AJmutator locus in Escherichia coli that generates G-C—>T-A transversions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 2709-2713.

97. Noskov V., Negishi K., Ono A., Matsuda A., Ono В., Hayatsu H. Mutagenicity of 5-bromouracil and N6-hydroxyadenine studied by yeast oligonucleotide transformation assay// Mutat. Res. 1994. V. 308. P. 43-51.

98. Nygaard P. Utilisation of performed purine base and nucleosides. In: Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganisms. Edited by Munch-Peterson A. Academic Press, Inc., London. 1983. P. 27-93.

99. Nyhan W. L. Disorders of purine and Pyrimidine metabolism // Mol. Genet. Metab. 2005. V. 86. P. 25-33.

100. Palmer, B. R. & Marinus, M. G. The dam and dcm strains of Escherichia coli // Gene. 1994. V. 143. № 1. P. 1-12.

101. Pan X., Ye P., Yuan D. S., Wang X., Bader J. S., Boeke J. D. A DNA Integrity Network in the Yeast Saccharomyces cerevisiae // Cell. 2006. V. 124. P. 1-13.

102. Parent S. A., Fenimore С. M., Bostian K. A. Vector systems for the expression, analysis and cloning of DNA sequences in S. cerevisiae // Yeast. 1985. V. l.P. 83-138.

103. Paul B. J. Berkmen M. В., Gourse R. L. DksA potentiates direct activation of amino acid promoters by ppGpp // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. №22. P. 7823-7828.

104. Pavlov Y. I., Suslov V. V., Shcherbakova P. V., Kunkel T. A., Ono A., Matsuda A., Schaaper R. M., Base analog N6-hydroxylaminopurine mutagenesis in Escherichia coli: genetic control and molecular specificity // Mutat. Res. 1996. V. 357 (1-2). P. 1-15.

105. Pitsikas P., Patapas J. M., Cupples C. G. Mechanism of 2-aminopurine-stimulated mutagenesis in Escherichia coli // Mutat. Res. 2004. V. 550 (1-2). P. 25-32.

106. Radman M., Villani G., Boiteux S., Kinsella A. R., Glickman B. W., Spadari S. Replicational fidelity: mechanisms of mutation avoidance and mutation fixation // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1979. V. 43 (2) P. 937-946.

107. Rajagopalan К. V. Biosynthesis of the molybdenum cofactor. In: Escherichia coli and Salmonella, cellular and molecular biology. Edited by Neidhardt F. C. ASM press, Washington DC. 1996. P. 674-679.

108. Rodwell V. W. Structure, function and replication of informational macromolecules. Nucleotides. In: Harper's Biochemistry. Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut// Sun Mateo, California. 1988. P. 335-361.

109. Rose M. D., Winston F., Hieter P. Methods in yeast genetics. CSHL Press.-1990.-198 p.

110. Ross L. S., Landman O., Little J. G. Base analogue mutagenesis in yeast and its modulation by pyrimidine deoxynucleotide pool imbalances: incorporation of bromodeoxyuridylate and iododeoxyuridylate // Curr. Genet. 1987. V. 11. P. 421-427.

111. Roush A. H., Saeed M. Adenine metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Adenase from bakers yeast // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1960. V. 2. P. 43-47.

112. Rydberg B. Bromuracil mutagenesis in Escherichia coli. Evidence for involvement of mismatch repair// Mol. Gen. Genet. 1977. V. 152. P. 19-28.

113. Saparbaev M., Laval J. Excision of hypoxanthine from DNA containing dIMP residues by the Escherichia coli, yeast, rat, and human alkylpurine DNA glycosylases // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 5873-5877.

114. Sekiguchi M., Tsuzuki T. Oxidative nucleotide damage: consequences and prevention // Oncogene. 2002. V. 16. № 21(58). P. 8895-8904.

115. Serres M. H., Gopal S., Nahum L. A., Liang P., Gaasterland Т., Riley M. A functional update of the Escherichia coli K-12 genome // Genome Biology. 2001. V. 2. № 9. research 0035.1-0035.7

116. Shannon P., Markiel A., Ozier O., Baliga N. S., Wang J. Т., Ramage D., Amin N., Schwikowski В., Ideker T. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks // Genome Research. 2003. V. 13. P. 2498-2504./

117. Shcherbakova P. V., and Pavlov Y. I. 3 —>5 „exonucleases of DNA polymerases e and 8 correct base analog induced DNA replication errors on opposite DNA strands in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1996. V. 142. P. 717-726.

118. Shcherbakova P. V., Noskov V. N., Pshenichnov M. R., Pavlov Y. I. Base analog 6-N-hydroxylaminopurine mutagenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae is controlled by replicative DNA polymerases // Mutat. Res. 1996. V. 369. P. 33-44.

119. Shcherbakova P. V., Pavlov Y. I., Mutagenic specificity of the base analog 6-N-hydroxylaminopurine in the URA3 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae И Mutagenesis. 1993. V. 8. P. 417-421.

120. Simandan Т., Sun J., Dix T. A. Oxydation of DNA bases, deoxyribonucleosides and homopolymers by peroxyl radicals // Biochem. J. 1998. V. 335 (Pt 2). P. 233-240.

121. Speiser D. M., Ortiz D. F., Kreppel L., Scheel G., McDonald G., Ow D. Purine biosynthetic genes are required for cadmium tolerance in Schizosaccharomyces pombe II Mol. Cell. Biol. 1992. V.12. № 12. P. 53015310.

122. Stotz A., Muller P. P., binder P. Regulation of the ADE2 gene from Saccharomyses cerevisiae // Curr. Genet. 1993. V. 24. P. 472-480.

123. Tibbetts A. S., Appling D. R. Characterization of two 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide transformflase/inosine monophosphate cyclohydrolase isozymes from Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 27. P. 20920-20927.

124. Tibbetts A. S., Appling D. R. Saccharomyces cerevisiae expresses two genes encoding isozymes of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide transformylase // Arch. Biochem. Biophys. 1997. V. 340. P. 195-200.

125. Trautinger B. W., Jaktaji R. P., Rusakova E., Lloyd R. G. RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription // Mol. Cell. 2005. V. 19. P. 247-258.

126. Tsuchiyama H., Atsumi G., Matsuda A., Negishi K., Hayatsu H. Analysis of 2-amino-6-N-hydroxyadenine-induced mutagenesis in phage M13mp2 // Mutat. Res. 1991. V. 253. P. 47-54.

127. Vogel H. J., Bonner D. M. Acetylornithinase of Escherichia coli: partial purification and some properties // J. Biol. Chem. 1956. V. 218. P. 97-106.

128. Wach A, Brachat A, Pohlmann R, Philippsen P: New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 1994, V. 10. № 13. P. 1793-1808.

129. Wagner R., Dohet C., Jones M., Doutriaux M. P., Hutchinson F., Radman M. Involvement of Escherichia coli mismatch repair in DNA replication andrecombination // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1984. V. 49. P. 611615.

130. Wang, T.-C. V. & Smith, К. C. Inviability of dam recA and dam recB cells of Escherichia coli is correlated with their inability to repair DNA double-strand breaks produced by mismatch repair // J. Bacteriol. 1986. V. 165. №3. P. 1023-1025.

131. Weber E., Rodriguez C., Chevallier M. R., Jund R. The purine cytosine permease of Saccharomyces cerevisiae: primary structure and deduced protein sequence of the FCY2 gene product // Mol. Microbiol. 1990. V. 4. P. 585-596.

132. Winzeler E. A. et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis // Science. 1999. V. 258. P. 901-906.

133. Woods R. A., Roberts D. G. Stein D. S. Filpula D. Adenine phosphoribosyltransferase mutants in Saccharomyces cerevisiae II J. Gen. Microbiol. 1984. V. 130. P. 2629-2637.

134. Yamashino Т., Isomura M., Ueguchi C., Mizuno T. The YhhP gene encoding a small ubicuitos^protein is fundamental for normal cell growth of Vy Escherichia coli III. Bacteriol. 1998. V.180. № 8. P. 2257-2261.

135. Yao M., Hatahet Z., Melamede R. J., Kow Y. W. Purification and characterization of a novel deoxyinosine-specific enzyme, deoxyinosine 3'endonuclease from Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 1626016268.

136. Zalkin H., Dixon J. E. De novo purine nucleotide biosynthesis // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1992. V. 42. P. 259-287.

137. Zalkin H., Nygaard P. Biosynthesis of purine nucleotides. In: Escherichia coli and Salmonella, cellular and molecular biology. Edited by Neidhardt F. C. ASM press, Washington DC. 1996. P. 561-579.

138. Zhang F., Kirouac M., Zhu N., Hinnebusch A. G., Rolfes R. J. Evidence that complex formation by Baslp and Bas2p (Pho2) unmasks the activation function of Baslp in an adenine-repressible step of ADE gene transcription //1. A^v.

139. Mol. and Cell. Biology. 1997. V. 17, № 6. P. 3272-3283.