Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические основы сверхпродукции инозина у BACILLUS SUBTILIS

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетические основы сверхпродукции инозина у BACILLUS SUBTILIS"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

МАЗНИЦА Иван Иванович

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СВЕРХПРОДУКЦИИ ИНОЗИНА

Y BACILLUS SUBTILIS

03.00.15 — Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

А. А. Нудлер

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Д. А. Перумов В. А. Лившиц

Ведущая организация — кафедра генетики биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится 10 февран 1992 г. в 14 час. на заседании Специализированного Совета Д. 098.12.01 при ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан « /•3 »

1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

, - i -: ОБШЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы, пуриновые нуклеозид-5'-фосфаты играют существенную- роль в метаболизме клеток В. subtllls. являясь субстратами для биосинтеза нуклеиновых кислот, NAD"1'. KADPH. FAD. Фолиевой кислоты, тиамина и вовлечены в регуляцию большого числа Ферментативных реакций. Модифицированные 3'.5'-диклическая-АНР. ppGpp принимают непосредственное участие в споруляции в. subtllls.

Исследование генетического механизма биосинтеза пуриновых нуклеоти-дов имеет важное теоретическое и практическое значение, что объясняется не только особой ролью пуринов в процессах жизнедеятельности клеток но и расширением их применения в медицине, пишевой и химической промышленности. а также в экспериментальной биологии. Пуриновые соединения,и в частности, инозин являются известными лекарственными средствами (Фармацевтические синонимы: инозие F - в Японии и рибоксин - в СССР) эффективно применяемыми в терапии сердечно-сосудистых и других заболеваниях. Кроме того, инозин является сырьем для синтеза инозиновой кислоты для пишевой промышленности и других препаратов.

Цель работы и задачи исследования: Имеющиеся на сегодняшний день сведения хотя и дают довольно полную картину биосинтеза пуринов и его регуляции у В. subtllls, однако имеются определенные неясности в отношении механизма сверхпродукции инозина. Цель работы - исследование генетических основ и механизма сверхпродукции инозина у В. subtllls путем выделения и исследования мутантов с регуляторными изменениями в биосинтезе пуринов de novo. В соответствии с этим задачами работы являлось: 1) конструирование штамма с дефектами Ферментов взаимопревращения пуринов, то есть, введение мутаций по Ad-дезаминазе (adeC) и GMP-редуктазе (guaC); 2) исследование бактериостатического действия естественных пуринов в условиях отсутствия их взаимопревращений в клетке; 3) получение мутантов с дерепрессированным синтезом Ферментов риг-оперона и вы-

- г -

яснение роли этих нутаций в накоплении инозина; 4) разработка методов селективного отбора мутантов В. subtil is. способных к сверхпродукции инозина и их физиолого-биохимическое исследование; 5) локализация на хромосоме В. subtil is мутаций, обуславливающих сверхпродукцию инозина.

Научная новизна работы. Показано, что введение мутации adec в геном в. subtilis (put guaC) приводит к возникнЪвению чувствительности к адениловын производным, бактериостатический эффект которых снимается только при добавлением в среду природных 6-оксипуринов. Последовательное введение мутаций, усиливающих биосинтез пуринов de novo, такхе приводит к устранению ингибирования роста адениловими производными.

Выделены и картированы на хромосоме В. subtilis мутация аденинрезис-тентности (Adr) с дерепрессированной экспрессией генов, кодирующих Ферменты биосинтеза пуринов, и мутация по Ad-дезаминазе. показано, что эти мутации несущественны для накопления инозина. Разработана система селективных Факторов для выделения класса мутантов - продуцентов инозина. Эта мутация, обозначенная ерш. локализована на хромосоме В. subti-1 is вне pur-оперона в районе spooa (215*).

Установлено, что мутация срш приводит к аденинзависимости, не обусловленной инактивацией sAMP-синтетазы (ген puta), а также к потребности в ароматических аминокислотах и другим плейотропным эффектам.

Научно-практическая значимость работы. В научной и патентной литературе в настоящее время существуют представления о механизме сверхпродукции и способах получения продуцентов пуринов, в том числе инозина. В основе этих представлений лежит, во-первых, получение нутации в гене контролирующем синтез sAHP-синтетазы (приводящей к ауксотрофности по аденину. ген puta). Во-вторых, последовательное введение мутаций: ауксотрофности по ароматическим аминокислотам и гуанину, увеличению 5'-нукпеотидазной активности и дефекту Ферментов катаболизма нуклеозидов. В-третьих, введение мутации устойчивости к аналогам пуринов, приводя-

шей к дерепрессии синтеза Ферментов pur-оперона.

В настояшей работе показано, что сверхпродукция инозина у В. subtl-1is находится под контролен гена срт. При конструировании штаммов-продуцентов пиримидинов у коринебактерий и бацилл (АС N923166, 1981; Nud-1ег А.. 1991) нутация срш и ей подобные имеют решающее значение при селекции продуцентов IMP. уридина, UMF, тимидина и других соединений нук-леотидной природы.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы. материалов и нетодов. результатов экспериментов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Рисунков 23, таблиц 16, библиография -261 литературный источник.

Апробация. Результаты работы докладывались на сенинарах лаборатории генетики и селекции продуцентов нуклеотидов. объединенной семинаре отдела прикладной генетики "ВНИИгенетика", V съезде ВОГиС им. Н. И. Вавилова (Носква, 1987), VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов", (Москва, 1990).

МАТЕР ИА/1Ы И НЕТОДЫ.

Бактериальные штаммы. В работе использовали штаммы, производные В. subtllls 168 и мутанты, полученные в ходе выполнения работы. Штамн QB944 (РИГА cysA) предоставлен проф. Прозоровым А. А. (Кн-т обшей генетики. Носква). маркированные транспозонон ТП917 (MLSr) штаммы получены от д-ра Zahler S.A. (Vandeyar M. et al.. 1986). Бактериофаг AR9 предоставлен проф. Азизбекяном P.P. (ВНИИгенетика. Москва). Бактериофаг PBS1 - проф. Прозоровын А. А.

Среды и условия культивирования, для выращивания бактерий использовали L-бульон (Ниллер Д.. 1976) и среду Спипайзена (Anaenostopoulos С. et. al.. 1961). Накопление пуринов определяли на сн-среде (Нудлер А.. 1978). Количество пуринов определяли по Randerath К. et al.'(1965). Интегральную активность Ферментов биосинтеза пуринов, ("пуринсинтетаза")

определяли по Hersiild H. et ai -976). Количество Рибозо-5-ФосФата определяли по Deschatelets L. et al. (1986).

Получение бесклеточных экстрактов проводили по Shllo I. et al. (1971). PRPP-амидотрансФеразу определяли по образованию глутамата из глутамина (Shllo I. et al.. 1969). sAMP-синтетазу (HlshlKawa H. et al., 1968). IMP-дегидрогеназу (Vyngaarden J. . 1976). Ad-дезаминазу (Smith J. et al.. 1986) и 5'-нуклеотидазу (Mollgaard H. , 1980) - по продуктам реакций. ПуриннуклеозидФосФорилазы (Hoffe P. et al.. 1978) и пиримидин-нуклеозидФосФорилазу - по образованию оснований (Beachman I. et al. . 1971) Активность ФосФорибозилтрансФераз - по образованию £,ц С]-нуклео-зиднонофосфатов из [ !1<С]-оснований (Нудлер А.. 1978). Транспорт адени-на определяли по поступлению с'11 С]-Ad в клетки (Нудлер А.. 1978). транспорт глюкозы и Фруктозы определяли по включению «l-нетилглюкозида и с'"1 С]-фруктозы в клетки (Sabater В. et al.. 1973). Получение фаголиза-тов АК9 проводили по Belyaeva N. et. al.. (1968). трансдукиионные скрещивания проводили по Love Е. et al.. (1976). Определение белка проводили по Лоури (Lowry о. et al.. 1951). Обогащение мутантами проводили с

s

помошью D-диклосерина и пенициллина (Миллер Д.. 1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Конструирование штамма В. subtil is с дефектом взаимопревращения

АИР -> imp <- GMP.

Известно, что мутация по GMP-редуктазе у В. subtilis (purH guaC)

приводит к возникновению чувствительности к гуанозину (GR). механизм

которой объяснили конкуренцией за транспорт или IR(GR)-ФосФорилазу

(Endo T. et. al.. 1983). Исходный штамм B2051 (pur guaC) требовал аде-

нозин (AR) или инозин (IR) (0,01-0,15 мМ) для роста и не утилизировал

s

гуанозин (гуанин). С частотой О, 5;10 клетки штамма B2051 ревертирова-лч к Фенотипу pur+.

+ -8 Частота реверсии к Фенотипу GuaC составляла 1,2-10 . По неспособ-

ности к росту на аденине (Ad) и аденозине в качестве единственных источников пуринов и азота из штамма В2051 (pur виаС) выделено 14 клонов содержащих мУтапию по Ad-дезаминазе. Типичный представитель этой группы мутантов штаим ВМ814 (pur adeC guaC) требовал для роста инозин (О. 10.15 мМ) или присутствия адениловых и гуаниловых производных в концентрациях 0,15-0.20 мМ. В бесклеточных экстрактах штамма ВМ814 (pur adeC

guaC) отсутствовала активность Фермента Ad7Дeзaиинaзы (Табл. 1). Часто-

+ -г

та реверсии к Фенотипу AdeC составляла 2.4-10 .

Таблица 1. Активность Ферментов утилизации экзогенного аденина (мкМ/мин/мг белка).

Ad- PRFP- Ad- СКОРОСТЬ

деза- амидо- ФосФо- поступле-

Птамм ниназа транс- рибозил- ния

Фераза*" транс-Фераза аденина*

В2051 (guaC) 3.54

ВМ814 (adeC) <0,1

ВМ815 (AdS) <0,1 . г.

1.15

1.05 - 1.25

-2 л

1.24 ( <0. 231 1.32 3.62-10 (0.72-10 1 1.39 (1.15! 1.04 1, 75-10~2(0. 54-10"''i

2. 63-10"2(l, 22-10"V)

ВМ816 (Ad ) <0,1

ВМ817 (cpml ) ( - см. Табл. б - ) * - в Фигурных скобках приведено значение активности и скорость поступления аденина в клетки, выращенные в присутствии 1,0 нН аденина.

2. Изучение бактериостатического действия пуринов на штамны

B.subtllls с дефектом взаимопревращения АНР -> IMP <- GHP.

Изучение влияния гуанозина или гуанина (Gn> на рост штаммов показа-

ло. что при добавлении в среду гуанозина или гуанина (2.5 нМ) рост клеток подавлялся (Рис.1), при добавлении адениловых производных (0.25 ни) ингибирование полностью снималось. Как и в штамме В2051 (pur guaC) наблюдалось угнетение роста гуанозином и повышеннная чувствительность к

аналогам пуринов, что дополните. . свидетельствова.:о о наличии мута-

Рис. 1. Угнетение роста штанмов В. subtilis гуанозином и снятие ингибирования аденозином (О.25 нН)1: 1 - В2051 (pur euaC) .+ GR;

2 - В2051 (put guaC) + gr + ar;

3 - BM814 (pur adeC guaC) + GR;

4 - BM814 (pur adeC guaC) ♦ GR + AR; 5 - B. SUbt. 168 (his trp) + GR; б - В. SUbt. 168 (his trp) ♦ GR + AR.

На Рис. 2 на примере штамма вм814 (pur adeC guaC) видно, что

введение мутации adeC в геном в2051 (put guaC) приводит к возникновению чувствительности к аденозину (2, 5 мШ в такой же степени, как и гу-анозину. в отличие от вм814 (pur adeC guaC) дикий штамн в. subtllis 168 (his trp) не угнетался аденозином.

Наибольший ингибируюший эффект гуанозин оказывал на штамм ВМ814 (put adeC guaC), в меньшей степени на В2051 (pur gùaC) и практически не обнаруживался у штамма В. subtllis 168 (his trp) (Рис.1). Угнетение роста ВН814 (pur adeC suae) аденозином снималось добавлением гуанозина или инозина (Рис. 1,2). Угнетение гуанозином снималось инозином или аденозином (0.25 мМ). Добавление пиринидинов. аминокислот или витаминов не приводило к устранению ингибирования в противоположность тому, что описано для Е. coll (ShlmosaKa м. et al., 1984) и в других публикациях.

Введение реверсии риг+в геном штамма ВМ814 (pur adec guaC) (часто-

ции по Ad-дезаминазе.

ODS40

2.5

о О,S 1,0 i,S 2,0 2,5

(GR, НН)

+

та реверсии к Фенотипу Риг составляла 1,3-10 ). привело к снижению ODtîbrt

Рис. 2. Угнетение роста BHS14 (риг adeC suaCl аденозином (2. 5 мИ) и снятие ингибирования гуанозинон (О.25 нН): 1 - В subtllls 168 (his trp) до и после добавления гу-анозина: 2 - ВМ814 (pur adeC euaC) до и после ( 1 ) добавления GR; 3 -ВН814 (pur adeC suae) в присутствии AR без добавления GR.

порога чувствительности, но не к полнону снятию ингибирования роста гуанозинон, как это описано у Endo T. et al. (1983).

Таблица 2. Накопление пуринов (нг/нл) в присутствии аденина или гуанина ("пуринсинтетаза"). Штамм аденин (нМ) гуанин (мМ)

0,15 0,75 1,50 0.15 0,75 1.50 QB944 (рига) О. 54 О. 83 0,43 0,74 О, 82 О, 53

ВМ815 (AdS) 2.41 0.55 0.35 2.53 0.85 0. 55

ВН816 (Adp) 5.52 5.71 4.53 2.45 1.41 0.42

Так. штамм БН814 (pur adeC suae) не рос в присутствии 1.0 мН гуано-зина. а у штамма ВМ815 (adec suae Pur*) заметное торнохение роста наступало при концентрациях более 1.5 мм. Кроме того, у штамма ВМ815 (adeC guaC Pur+) сохранилась чувствительность к аденину и дезоксиадено-зину, а также аналогам оснований, таких как 8-азаксантин. б-метшшурп-

ну и другим, поэтому исследуемый в дальнейшем итамм обозначен ВН815

з

(adeC suae Ad ). 275 проверенных ревертантов Pur из штамма ВМ814 ipv.г

(час)

айеС диаС) в абсолютной большинстве накапливали аденозин (О, 6'мМ). гуа-нозин (0.15 мМ). аденин и гуанин (0,5-0.7 мм), но заметного накопления инозина или гипоксантина (Нх) не обнаружено, штамм ВМ815 (adeC виас Ааг) накапливал аденозин (4,5 мн). гуанозин (3,5 мМ). а та[<же аденин и

гуанин (примерно по 0,5 мМ).

9

клеток/мл -10

1Е, нг/мл

Рис. 3. Динамика накопления

инозина клетками ВН817 (adec

диаС айг срш1) и количество

жизнеспособных клеток за раз-

ное время ферментации: 1 -накопление инозина; 2 - количество жизнеспособных клеток в мл культуральной жидкости за тоже время.

0 12 3^56*

(сутки)

Возникновение чувствительности к адениловым производным после введения мутации adeC могло быть обусловлено также структурной или генетической связью гена adeC с риг-опероном. Поэтому мы локализовали мутацию adec на хромосоме в. 811М11Н. с помощью трансдукиионных скрещиваний бактериофагом А1?9. используя в качестве доноров adeC+ штаммы ОВ944 (ригА субА) или С114147 игрС2 гаа-84::Тп917), на среде с аденином было отобрано 332 трансдуктанта pur~adeC+, из них 36. 2* наследовали маркер суэА из хромосомы ОВ944 (ригА субА). С Фаголизатом штамма си4147 проверено 127 трансдуктантов по устойчивости к антибиотикам (НЬЗР). из них 98 <77. 2И) имели Фенотип Pur-AdeCч". Таким образом, ген кодирующий Ad-

о

дезаминазу, ориентировочно локализован в районе 5 хромосомы и не сцеплен с риг-опероном.

3. Селекция мутантов с изнененной регуляцией биосинтеза пуринов.

Как известно, у В. subtil is аденин принимает участие в генетической регуляции риг-оперона. Поэтому токсичность аденина была использована для выделения мутантов с нарушением регуляции биосинтеза пуринов de novo.

OD

5 НО

а)

OD

540

б)

3,0 2.5 2.0 1,5 10 0,5

0,005 o.os as t.O (мкг/мл)

0.00S О,OS O.S 1.0 (мкг/мл)

Рис. 4. Чувствительность иследуемых штаммов к антибиотикам: а) эрит-ронидину; б) рифанпипину; 1 - ВН815 (adec suae AdS); 2 - ВМ816 (adeC guaC Adr); 3 - BH817 (adeC guaC Adr cpml).

На среде с аденином (2.5 мН) и гистидином (0.15 мН) из штамма

s г*

вне15 (adec guaC Ad ) выделен класс Ad-резистентных мутантов (Ad ). которые накапливали на 20-25И больше пуринов. Используемый в работе типичный представитель этого класса ВМ816 (adec guaC Adr) накапливал аде-нозин (О.5 мН), гуанозин (4 мН) и соответствующие основания в количестве 0,5-0,7 мН, однако занетного накопления инозина или гипоксантина. как и у нутантов Pur+adeC guaC. не обнаружено.

Известно, что устойчивость к аналогам аденина может быть обусловлена: а) снижением транспорта аденина или активности Ad-ФосФорибозилтран-

сферазы (Бахуы Н. ег а1. . 1987): б) десенсибилизацией РКРР-анияотранс-Феразы в отношении ингибирования активности АМР-том <1змю К. ег а1. , Таблица 3. Усвоение Сахаров исследуемыми штаммами ((Н^цд)• Штамм Глюкоза фруктоза Арабиноза Рибоза ксилоза

ВН815 (Ас15) 3,54 3, 92 3,15 3.71 3,65

ВН816 (АЙГ) 3.15 3.71 3,22 3,43 2.21

ВМ817 (срш1) 2,93 3. 34 2.83 0,55 0,35

1972); в) изменением регуляции риг-оперона на уровне инициации транскрипции ПэЫЮ К. е1 а1.. 1970; ЕЬЬо1е Б. ег а1.. 1989). Однако, как Таблица 4. Взаимосвязь реверсий к срт4" и накоплением инозина.

Селекти- Неселек- Частота Проверено продукция

руемый тируемый реверсий клонов инозина

Фенотип Фенотип

Ade+ Туг+ 0,7 •ю"* 13 -

Ade+ Туг+ - 0. 5 ■to"8 4 -

туг+ Ade~ 223 +

туг+ Ade4" 1,6 3 -

Emr Ade~Tyr— 104 +

Emr Ade+Trr+ 1.9 •10"? 8 -

Rfr Ade~Tyr~ ru ■10"f 96 •f

H1S+ Ade-Туг- 1.2' 10"' 11

видно из Табл. 1. значительных изменений в активности Ad-ФосФорибозил-трансферазы не наблюдалось, хотя скорость поступления [,ПС]-аденина в высокой концентрации у Ad-резистентного штамма ВН816 (adeC guac Adr) незначительно снижалась в сравнении с чувствительным к аденину штаммом ВН815 (adeC guac Ad5) (Табл. 1).

Активность PRFF-амидотрансФеразы в экстрактах клеток, выращенных в присутствии 1.0 нН аденина (Табл. 1), показала заметное снижение уровня репрессии синтеза PRPP-амидотранс'Феразы у штамма ВМ816 (adeC guaC Adr).

- и -

При этом измерение интегральной активности синтеза веек Ферментов, кодируемых генами риг-оперона ("пуринсинтетазы") показало (Табл.2), что мутация Adr практически полностью снимает влияние аденина на экспрессию генов риг-оперона (Табл.2). На основании этих данных сделан вывод, что у штамма ВМ816 (adeC suae Adr) мутация Adr связана с дерепрессиро-ванным синтезом генов риг-оперона.

Для выяснения структурной связи мутации Adrc генами риг-оперона проводили транедукционные скрещивания штамма ВМ814 (put adeC guaC) с

F Г

бактериофагом AR9. размноженном на Ad штамме ВМ816 (adeC. guaC Ad ) или диком штамме QB944 (ригА сузА), В транедукционнон скрещивании штамма ВМ816 (adec guaC Adr) с ВН814 (put adeC guaC) проверено 189 транс-дуктантов Риг+. Из них 187 (98.4Ю оказались способными расти в присутствии 2.5 мН аденина. В транедукпионнон скрещивании QB944 (ригА сузА) с ВН814 (pur adeC виаС) из 129 транедуктантов Риг+ ни один не наследовал признака Adr.

Таблица 5. Трансдукционное картирование мутации cpml.

Район Проверено Наследование Котранс-

Донор локализации транедук- HLS ерт дукпия

транспозона тантов г

ТП917 HLS

CU4120 ГРОВС (11° ) 359 3 0. 8

CU4121 PUT В (55°) 178 1 0. 6

CU4133 tYTA 1206° ) 127 36 28. 3

CU4135 lys (210°) 201 128 63, 5

CU4137 SPOOB (246°) 85 1 1, 2

CU4147 ригА виаА (0°) 273 2 0, 7

CU4158 SPOOA (216°) 126 116 92. 1

CU4158 SPO0A (216°) СРШ4" (47) cpm+" MLSr(43) 91. 5

На основании этого сделан вывод, что мутация Айг локализована в

рчг-опероне или тесно сцеплена с ним и имеет непосредственное отношение к изменению его регуляции. При использовании в качестве донора ал-леля Adr другого представителя Ad-резистентных клонов показало, что и у него Ad-резистентность также картируется в районе риг-оперона на 55° хромосомы. Ad-резистентные нутанты с дерепрессированным риг-опероном не накапливали заметных количеств инозина или гипоксантина. и мутация Adr приводила только к увеличению одновременного накопления адениловых и гуаниловых производных, из этого следует, что сверхпродукция инозина не связана непосредственно с дерепрессией риг-оперона.

4. Селекция сверхпродуцентов инозина с использованием природных иетаболитов и аналогов пуринов.

В связи с тем. что дерепрессия риг-оперона в штамме ВМ816 (adeC suae Adr) и Ad-зависимомость в штанме QB944 (ригА сузА) (Табл. 2) не приводила к продукции инозина, мы разработали систему селективных Факторов. учитывающую метаболиты на пути синтеза рерр, включая ароматические аминокислоты и витамины. Используя повышенную чувствительность штаммов adeC guaC к натуральным пуринам и их аналогам на среде Спицай-зена. содержащей ароматические аминокислоты (0.15 мМ). а также дезокси-аденозин (2.5 мМ) и в-азаксантин (1.5 мМ). выделено 33 клона, из которых 5 (15Я) мутантов накапливали инозин в концентрации более 5 г/л. При анализе более 1000 клонов, выделенных при исключении одного из селективных Факторов, не обнаружено ни одного, способного к сверхпродукции пуринов.

Рисунок 5. Карта хромосомы в. subtllls в несте локализации cpml.

aroEtrrAhlsHtrpA

cpml

spo0a

Phe82: : ТП917

aroBC::Tn9l7

205° 206°

1ys::Tn917

210

zfg::Tn9l7

_>—Г7~

215 216

246

Один из мутантов ВМ817 (adeC guac Adrcpm), накапливающий до 7-9 г/ л инозина, был взят для исследования, а мутация обозначена cpm (control of purine metabolism). Максимум накопления инозина клетками ВМ817 (adeC guaC Adr cpmi) наблюдался на 4-6 сутки Ферментации (Рис.3) на стандартной Ферментационной среде.

10 0,7 5 0,50 0,25

О

Рис. 6. Измерение пулов sAMP в экстрактах из клеток штаммов: 1 -

г*

QB944 (purA cysA); 2 - ВМ816 (adeC guac Ad ); 3 - ВМ817 (adeC guac Ad cpmi). а) в зависимости от концентрации белка; б) в зависимости от времени инкубирования.

5. Генетический и Физиолого-биохимический анализ мутации cpmi. —--.—.—-----.-----—■--

штамм ВМ817 (adeC guac Adr cpmi). в отличие от ВМ816 <adec guac Adr), приобрел потребность в аденине и тирозине и ряд свойств плейо-тропного характера, а именно: 1) изменилась морфология колоний: штамм ВМ816 (adeC guaC Adr) Формировал плоские, блестящие, с ровными краями, светло-коричневого двета колонии, а клетки ВМ817 (adeC guac Adrcpml) образовывали морсинистые выпуклые, ослизняюшиеся, с неровными краяни, молочно-белого цвета колонии диаметром 3-8 мм; 2) возникла сверхчувст-

йь210

а)

дЕ2го

б)

О,г 0,if 0,6 0,8 (мг)

О 3 10 15 20 25" 30 (мин)

вительность к эритромицину и рифампицину (Рис.4): клетки штамма BM816 (adeC guaC Adr) росли в присутствии 0.05 мкг/мл риФампшшна или эритромицина. тогда как клетки ВМ817 (adeC guaC Adr cpml) в этих условиях погибали; 3) понизилась способность к росту на D-рибозе и D-ксилозе в качестве единственного источника углерода (Табл. 3); 4) увеличилось внутриклеточное содержание рибозо-5-фосФата (R-5-P): так в клетках ВМ816

Г -2

(adeC guaC Ad ) содержание R-5-P составляло 1.3-10 мН. Таблица б. Активность ферментов биосинтеза пуринов в. subtills (мкн субстата/нин/мг белка). PRPP- SAHF- IHP- 5'-нуклеотдазная

Штамм амидо- синте- дегид- активность

транс- таза роге- _

Фераза наза 5'-AMP 5'-1НР 5'-GHP

QB944 (PUTA) 1.03 <0,1 41.32 <0.1 <0.1 <0.1

ВМ816 (AdP) i. 39 5. 73 49. 21 0, 39 0. 33 0. 1

ВН817 (cpml) 4. 36 14. 62 37. 74 1. 83 16. 92 3. 51

ВМ822 (cpm+) 1. 24 4. 35 - 0, 56 0. 45 0, 73

а у нутанта BM817 (adec guaC Ad1" cpml) - 5. 7-ю"2 мн на мг сырого веса клеток; 5) снизилась способность к спорообразованию: штамм ВМ816 fadeC

Г" ' £ Г

guaC Ad ) образовывал 1,4-10 спор/мл. мутант ВН817 (adeC guaC Ad

2.

cpml) - 0,5-Ю спор/мл. выросшие из состояния спор клетки BH817 (adeC euaC Ad^cpml) разделялись на три морфологические группы, одна из которых соответствовала Фенотипу исходного штамна: 6) снизилась подвижность клеток на 0.45К агаре: штамм ВН816 (adeC euaC Adr) образовывал зону роста 40-50 мм. а клетки ВН817 (adec guaC Adrcpml) - 6-8 мм; 7) снизилась способность к поддержанию размножения бактериофагов AR9 и PBS1.

В экспериментах по картированию мутации cpml штамм ВМ817 (adec guaC Adrcpmi) использовали как реципиент. В качестве доноров дикого

аллеля cpm+ использовали фаголизаты AR9. полученные на штаммах с ТП917 (flLSr). В результате трансдукционных скрещиваний обнаружено, что в 92Z случаев срт+ котрансдуцируется с транспозоном, интегрированным на 216° (штамм CU4158) в районе гена spoOA (Табл.5). При селекции трансдуктан-тов по Фенотипу срт+ транспозон наследовался в 91* случаев. При использовании в качестве реципиента другого представителя этого класса, ВН827 (adeC guac Adr cpm4) удалось показать, что и в этой штанме мутация срш4 локализуется в районе гена spooa. На основании данных Табл.5 построена предварительная карта с расположением мутации cpmi относительно генов spooa. lys и аговс (Рис.5), таким образом, судя по полученным данным, за сверхпродукцию инозина ответственна мутация ерш, локализованная вне риг-оперона в. subtills.

Таблица 7. Сравнительный анализ активности ряда Ферментов в связи с

плейотропным эффектом мутании cpml (мкМ/мин/мг белка).

Ad- нх- IR(GR)- TdR(UR)- Щелоч-

ФосФо- ФосФо- ФосФо- ФосФо- ная ¿-ами-

Штамм рибозил- рибозил- рилаза рилаза протеи- лаза

трансФе- трансФе- наза

раза раза •

ВН815 (AdS) 1. 32 7, 53 34. 25 92, 34 2. 81 10. И

ВН816 (AdP) 1. 04 7, 72 7. 91 101. 51 2. 63 10, 25

ВН817 (cpml) 0,45 3. 85 0. 83 0. 54 . 13. 45 940.37

man * (cpml)+Em - 9. 44 85. 73 - -

* - показана активность ферментов в экстрактах клеток инкубируемых в жидкой среде Спицайзена без аденина и тирозина в присутствии О, 025

мкг/мл эритромицина.

Плейотропный характер мутации cpml позволил провести реверсионный анализ по Фенотипам: Ade" -> Ade+, Туг~" -> Туг+. RfS -> Rfr, Ems -> Em (Табл.4). Ревертанты появлялись с.частотами 0.5-2.5-10 Среди 13 про-

веренных ревертантов Ade4" не оказалось ни одного, способного продуцировать инозин, при этом полностью восстанавливался Фенотип исходного штамма ВНв16 (adeC suae Adr).

Среди 226 проверенных клонов Туг+ 223 сохранили Фенотип Ade-. 3

1- + + —

клона приобрели Фенотип Ade Туг . Все ревертанты Туг (Ade ) сохранили

способность к накоплению инозина в пределах 25'/. от штамма ВМВ17 (adeC guaC Adrcpml). По чувствительности к рифампицину. из 223 клонов. 18 стали более устойчивыми, а у одного увеличилась чувствительность до 0,001 мкг/мл рифампшшна. V некоторых ревертантов Tyr+(Ade~) появилась чувствительность к присутствию гуанина в среде роста (0.5 мН).

На среде с рифампинином (0.5 мкг/мл) от штамма ВМ817 (adeC guac

г -t

Ad cpml) выделено 96 клонов (частота возникновения ю -10 кл./мл).

Все Rfr мутанты сохранили способность к накоплению инозина, и ни в одном случае не обнаружено достоверного превышения или снижения накопления инозина. Предполагается, что чувствительность к рифампицину является проявлением плейотропии мутации cpml и не связана с биосинтезом инозина.

На среде с эритромицином (О,25 мкг/мл) проверено 68 ревертантов. Из них 64 - сохранили Фенотип cpml. 3 приобрели срш+ и 1 клон с Фенотипом срш+. но с потребностью в Фенилаланине. Накопление инозина сохранили клоны cpml Emr, а у клонов срт+ Етг продукция инозина снижалась до

уровня родительского штамма вне16 (adeC guaC Adr). Поскольку среди му-

г +

тантов Em обнаружены ревертанты срш , предполагается, что чувствительность « эритромицину связана с природой мутации cpml. механизм действия которой возможно обуславливает репрессию трансляции некоторых генов (Marayanan С. et al. , 1987).

На основании того, что ревертанты к Фенотипу родительского штамма BM816 (adeC guac Adr) обнаруживались как при селекции на Ad-независи-мость (Ade4"), так и при селекции по фенотипам Туг+ и Ешг. из реверсион-

+

ного анализа сделан вывод, что истинными ревертантами срт . являются

о-

клоны с Фенотипом Ade Туг и мутация cpml в штамме БН817 (adec guac Adrcpml) - следствие одного мутационного события.

имп/мин-10 а) имп/мин-icr б)

Рис.7. Активность Ad-PRT (а) и Нк-PRT (б) в бесклеточных экстрактах штаммов: 1 - ВМ815 (adec guac AdS); 2 - ВМ816 (adeC guaC Adr); 3 -BH817 (adec guac Adr cpml).

6. Биохимический анализ мутации cpml. Принято считать, что Ad-ззвисимость - следствие генетического повреждения гена sAMP-синтгтазы (purA) и при этом является основным свойством, определяющим способность к накоплению инозина (Киптака А. . 1986). Ревертанты Ade+ действительно теряли способность накапливать

инозин (Табл.4). Однако из Табл.5 видно, что траксдукция дикого аллеля

+ г*

purA в хромосому ВМ817 (adeC guac Ad cpml) не приводит к восстановлению Ad-независимости и, следовательно, ген sAMP-синтетазы (purA) в этом штамме остается интактным. Из данных Табл. 6 видно, что активность

г*

sAHP-синтетазы у Ad-зависимого штамма БМ817 (adec suae Ad cpml) не только ч? снизилась, но повысилась в 2.6 раза в сравнении со штаммом

ЕМ816 íadec euac Adr), а уровень накопления sAMF в экстрактах из клеток ВНЕ 17 (adec guac Adrcpmi) также повышен (Рис.6). Плейотропнкй характер мутации cpml приводит также к значительному изменению активности 5'-нуклеотидазы. Ее активность в отношении 5'-IMP возросла в 50 раз в сравнении со штаммом вне 16 (adec guac Adr) и более чем в зоо раз в сравнении с диким штаммом QB944 (purA cysA). в отношении 5'-АИР и 5'-GMP. активность 5'-нуклеотидазы увеличилась в 5 и 30 раз соответственно (Табл. б).

Как известно, увеличению продукции инозина способствуют: снижение активности IR-ФосФорилазы и 1МР-дегидрогеназы. а также дерепрессирован-ный синтез PRPP-амидотрансФеразы. Мутация cpml снижает активность IR-ФосФорилазы в 5 раз по отношению к исходному штамму BM816 (adec guac

г*

Ad ) и более чем в 30 раз в отношении дикого штамма QB944 (purA cysA) (Табл.7). Поэтому предполагается, что Феномен Ad-зависиности и накопление инозина связано с более чем 50-кратным увеличением активности 5'-нуклеотидазы в отношении 5'-1МР и 5-кратным в отношении 5'-АМР, а также снижения активности iR-ФосФорилазы. вследствие чего в клетке, по-видимому, уменьшается пул АТР. что приводит к потребности в аденине. Следует отметить, что активность IR-ФосФорилазы восстанавливалась до уровня исходного штамма ВМ816 (adec guac Adr) после инкубации клеток ВМ817 (adec guac Adr cpml) в жидкой среде Спицайзена без аденина и тирозина в присутствии о.025 мкг/нл эритромицина, что. как предполагается, происходило в результате снятия ингибирования трансляции гена IR-Фосфори-лазы (Магауапап С. et al.. 1987).

Влияние мутации cpml сказывается и на активности Ферментов salvage пути, а именно Ad- и Нх-ФосФорибозилтрансФераз. почти вдвое снижая их активность по сравнению со штаммом ВМ816 (adec guac Adr ) (Рис. 7, Табл. 7). но при этом скорость поступления аденина в клетки ВМ817 (adec suae Ad cpml). более чем в 1.5 раза выше, чем у Ad-резистентного штамма

ВМ816 (adec guac Ad1"1 (Табл. 1). Мутация cpml влияет не только на гены, контролирующие метаболизм пуринов, но и на Ферменты метаболизма пирими-динов. Так, у штамма ВМ817 (adec guac Adr cprni) более чем в ico раз снижается активность пиримидиннуклеозидфосфорилазы. Активность Фермента восстанавливалась до уровня исходного итанма после инкубации клеток с эритромицином (Табл.7).

Плейотропный эффект cpml распространяется и на другие катаболичес-кие Ферменты, не связанные с метаболизмом пуринов, но в норме находящиеся под контролем spo генов (Hullert F. et al., 1988). Так, активность экзоферментов: щелочной протеиназы и ¿-амилазы возрастала более чем в 2 и 90 раз. соответственно, в сравнении со штаммом ВМ816 (adec guac Adr).

Определяли также скорость поступления глюкозы и Фруктозы, но существенного влияния на транспорт этих Сахаров мутация срш не оказывала.

Известно, что активность генов регулируется в основном на уровне инициации транскрипции и репрессии трансляции (Marayanan С. et al. , 1987). Нутация cpml по некоторым свойствам сходна со spo мутациями (LoslcK R. et al., 1986; Henner D. et al., 1988). Учитывая тесное сцепление гена cpml с геном spoOA, предполагается, что эта; мутация ножет быть проявлением одного из аллельных состояний гена spoOA. Это основано на том, что в норме ген spoOA контролирует регуляцию активности вегетативных генов, не связанных со споруляцией (Hullert F. et al., 1988; Borlan S. et. al. . 1988) и. кроме того, в отличие от QB944 (purA cysA) и ВН816 (adec guaC Adr), мутанты В. subtil is 1S9 (spoOA) накапливают незначительные количества инозина и гипоксантина.

В другом объяснении природы мутапии cpml предполагается, что ген срш может быть мутантной Формой одной из ó -субъединиц рнк-полимеразы. способствующей высокой частоте инициации транскрипции с промоторов одних генов и низкой с других, обеспечивая плейотропный характер мутации

cpm (Haznltsa I. et al., 1990).

выводы.

1. Сконструирован штамм на основе В. subtllis с деФектрм взаимопревращения пуринов (в геноме совмешены мутации pur adeC и guaC).

2. Показано, что в условиях отсутствия взаимопревращения пуринов аде-ниловые и гуаниловые производные угнетают рост бактерий. Рост восстанавливается при решшрокном добавлении, б-амино- или 6-оксипуринов.

3. Введение в геном штамма в. subtllis (pur adeC guaC) мутаций pur+ и регуляторной мутации резистентности к аденину (Adr) приводит к последовательном у увеличению резистентности к адениловым и гуаниловым производным и увеличению их накопления в среде, но не приводит к накоплению инозина.

4. Нутация по адениндезаминазе (adeC) локализована на 5е хромосомы в. subtllis. Нутация, приводящая к дерепрессии риг-оперона (Adr) локализована на 55° хромосомы в районе риг-оперона.

5. Разработана система селективных Факторов, позволившая выделить класс мутантов - сверхпродуцентов инозина (мутанты cpm).

6. Нутация cpm локализована вне риг-оперона в районе 215° хромосомы В. subtl1Is и характеризуется следующими свойствами: 1) изменением.морфологии клеток; 2) возникновением потребности в аденине и тирозине; 3) снижением подвижности клеток и неспособности поддерживать размножение бактериофагов AR9 и FBS1; 4) увеличению активности экзоФерментов щелочной протеиназы и ¿-амилазы; 5) сниженной способности к утилизации D-рибозы и D-ксилозы в качестве единственных источников углерода; б) более чем 3-кратным увеличением внутриклеточного пула рибозо-5-ФосФата; 7) более чем 4-кратным увеличением синтеза PRPP-амидотрансФеразы; 8) повышенной чувствительностью клеток к рифампицину и эритромицину; 9) репрессией активности пурин- и пиримидинуклеозидфосфорилаз. а также фосфорибозилтрансфераз оснований.

7. Ad-зависимость, вызванная мутацией cpml, не связана с дефектом Фермента sAMP-синтетазы (ген ригА).

Основное содержание диссертации отражено в следующих печатных работах:

1. Казнипа И. И. , Бурд Г. И. Нутации adeC suae - как генетический Фон для селекции мутантов в. subtil is по метаболизму пуринов.// V-й съезд ВОГиС им. Н.И.Вавилова, тезисы докладов, носква, 1?87. т. 5. стр. 50.

2. Мазница и. И. , Нудлвр А. А., Бурд г. И. Генетический механизм продукции инозина бактериями В. subtil is.// VIl-й Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов", Те'зисы докладов. Москва. 1990, СТР.240.

3. гарибян а. г.. нудлер а. а.. Мазница и. и., Бурд г. и. мутанты В. sub-tllls с дефектом по пиримидиннуклеозидФосФорилазе, продуцирующие пири-мидиновые нуклеозиды. // VII Всесоюзный симпозиум " Молекулярные механизмы генетических процессов", Тезисы докладов, Москва. 1990, стр. 206.

4. Maznitsa I. I., A.A. Nudler, G.I. Bourd. A pleiotropic mutation affecting purine metabolism in В. subtllls.// FEMS Hlcroblol. Letters, 1990, V. 72. P. 173-176.

5. Мазница И. И. . Нудлер А. А. . Бурд Г. И. Новая плейотропная мутация, влияющая на метаболизм пуринов, споруляпию и биосинтез экзоферментов В. subtllls.// Генетика, W91, т. 27, N»6, стр. 983-990.

6. Нудлер A.A. Мазница и. и. , Бурд г. и. Мутанты в. subtllls с дефектами в системе взаимопревращения 6-амино- и 6-оксипуринов. как модель для изучения токсичности пуринов.// Генетика, 1992, в печати.

7. Нудлер a.a.. Гарибян ал'., Мазница и. и. . бурд г. и. Штамм Bacillus subtllls - продуцент тимидина., Заявка на ас, 1991 г.