Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование модельных систем для селекции генноинженерных штаммов Bacillus subtilis - продуцентов рибофлавина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ракитин, Андрей Львович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. Оперон биосинтеза рибофлавина

Bacillus subtilis.

1.1 Свойства рибофлавина и его роль в метаболизме организмов.

1.2. Биосинтез рибофлавина у бактерий.

1.3. Структура, организация и регуляция рибо-флавинового оперона Bacillus subtilis.

I.4 Клонирование рибофлавинового оперона Bacillus subtilis в составе рекомбинантных плазмид.

ГЛАВА II. Клонирование ДНК в клетках Bacillus subtilis.

II. 1 Векторы для клонирования ДНК в клетках

Bacillus subtilis.;

II. 2. Стабильность плазмид.

11.2.1. Структурная нестабильность.

11.2.2. Сегрегационная нестабильность.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА TV. Конструирование гибридных плазмид.

IV. 1.Минимизация фрагмента хромосомы Bacillus subtilis, содержащего в своем составе оперон биосинтеза рибофлавина.

IV.2.Создание нового поколения векторов для клонирования в клетках Bacillus subtilis.

IV.2.1.Конструирование векторов на основе низкокопийной плазмиды рМХЗО.

IV.2.2.Конструирование векторов на основе высококопийной плазмиды рСВ20.

IV.3.Клонирование "оптимизированного" оперона биосинтеза рибофлавина в составе векторов pAR13, pAR21, рСВ20 и pARl.

ГЛАВА V. Исследование свойств полученных плазмид в клетках модельного штамма Bacillus subtilis.

V.l. Определение уровня биосинтеза рибофлавина

V.2. Определение уровня стабильности плазмид

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование модельных систем для селекции генноинженерных штаммов Bacillus subtilis - продуцентов рибофлавина"

Витамин В2 (рибофлавин) в виде ФМН и ФАД включается в окислительно-восстановительные ферменты - флавопротеиды, которые являются переносчиками водорода. Рибофлавин является незаменимым витамином, поскольку не синтезируется организмом человека и животных, которые получают витамин либо с пищей, либо в результате деятельности микроорганизмов желудочно -кишечного тракта. Недостаток витамина В2 у животных и человека проявляется в виде поражения кожи, глаз й снижения жизнеспособности. В связи с этим, витамин В2 нашел широкое применение в медицине, сельском хозяйстве, пищевой и фармацевтической промышленности.

Вид Bacillus subtilis хорошо изучен и охарактеризован как биохимически, так и генетически. В настоящее время полностью расшифрована первичная нуклеотидная последовательность хромосомы В. subtilis. Для В.subtilis разработаны и широко применяются методы современной генетической инженерии. Клетки В. subtilis способны к эффективной секреции различных биологически активных веществ (БАВ). Генноинженерные штаммы признаны безопасными в экологическом отношении. Клетки B.subtilis бысто растут, нетребовательны к составу питательной среды, имеются хорошо развитые технологии ферментации и извлечения конечных продуктов. Поэтому многие штаммы B.subtilis успешно применяются в микробиологической промышленности в качестве продуцентов различных БАВ: ферментов, антибиотиков, аминокислот, пуриновых нуклеозидов, витаминов.

Традиционно первый этап создания промышленного штамма -продуцента заключался в прямом отборе более продуктивных вариантов после воздействия мутагенов различной природы. Такой способ получения продуцентов достаточно трудоемок. Кроме того, отбор новых штаммов происходит эмпирически,- неизвестна причина, приведшая к повышению уровня синтеза.

Установление биохимических путей биосинтеза того или иного метаболита и генетической регуляции его синтеза позволило проводить направленный отбор штаммов с заданными свойствами. Для этого отбирают штаммы устойчивые к аналогам целевого и промежуточных продуктов, получают направленные мутации ауксотрофности и т.д.

Успешное развитие генетической инженерии позволило многократно увеличивать дозу необходимого генетического материала в клетках штамма-продуцента, что достигается за счет амплификации искомой ДНК в автономном состоянии в составе плазмидных векторов, или интеграции генетического материала в хромосому реципиентного штамма.

Для создания современных штаммов - продуцентов применяют комбинацию вышеизложенных способов. В настоящее время на основе клеток B.subtilis сконструирован ряд штаммов - продуцентов витамина В2- Эти штаммы созданы путем соединения традиционных методов селекции с методами современной генетической инженерии. Многие продуценты рибофлавина содержат; низкопийную плазмиду рМХ45, представляющую собой вектор рМХЗО, несущий рибофлавиновый оперон.

Для клонирования ДНК в клетках B.subtilis применяют как многокопийные,. так и низкокопийные векторы. Преимуществом низкОкопийных векторов является то обстоятельство, что они, как правило, обеспечивают стабильное наследование клонированного генетического материала. Доза генов, клонированных с помощью таких векторов, составляет 1-3 на геном клетки. Для достижения сверхэкспрессии целевого продукта, теоретически, более предпочтительно использовать многокопийные векторы, т.к. в этом случае доза клонированного генетического материала может превышать 10 копий на клетку. Но, как правило, в этом случае возникает ряд проблем связанных с различными видами нестабильности гибридных плазмид и отсутствием корреляции между дозой генов и уровнем их экспрессии (37,58,97).

В нашей работе планировали создать модель для изучения влияния копийности плазмид; участка вектора в который j/ клонирован рибофлавиновый оперон; ориентации целевых генов, встроенных в тот или иной участок вектора; дозы целевых генов, т.е. наличие в составе плазмиды двух копий оперона биосинтеза витамина В2; размера клонированного фрагмента на стабильность штаммов - продуцентов и уровень биосинтеза витамина В2

Поскольку уровень синтеза рибофлавина промышленными штаммами высок, не всегда удается уловить незначительные колебания активности штаммов, содержащих различные плазмиды относительно исходного штамма. Поэтому изучение влияния вышеперечисленных характеристик гибридных плазмид на стабильность штаммов и уровень биосинтеза рибофлавина проводили в модельном штамме B.subtilis.

Целью настоящей работы является конструирование модельных систем, включающих в себя ряд многокопийных плазмид, содержащих оперон биосинтеза витамина В2 и изучение возможности использования информации полученной при V \ исследовании модели для создания нового поколения штаммов - v продуцентов рибофлавина на основе клеток B.subtilis. Исходя из поставленой цели, решали следующие задачи: минимизация фрагмента хромосомы B.subtilis, содержащего в своем составе оперон биосинтеза рибофлавина. создание нового поколения многокопийных векторов, ведущих свое происхождение от низкокопийного вектора рМХЗО. клонирование минимизированного фрагмента хромосомы B.subtilis, содержащего рибофдавиновый оперон в составе полученых плазмидных векторов. И тем самым завершение создания искомой модели. изучение уровня биосинтеза рибофлавина и стабильности полученных рекомбинантных молекул в клетках модельного штамма B.subtilis.

В результате работы по минимизации фрагмента хромосомы B.subtilis, размером около Ют.п.о., несушего рибофлавиновый оперон, получена многокопийная плазмида pOR, несущая фрагмент хромосомы B.subtilis размером около 4.4т.п.о., содержащий в своем составе оперон биосинеза рибофлавина.

На основе низкокопийного вектора рМХЗО созданы многокопийные векторы pAR8, pAR13, pAR21. Показан высокий уровень стабильности полученных векторов в клетках модельного штамма B.subtilis.

Получены плазмиды pAR131, pAR211, pAR212, pOR, pSR, pLR, pOR15, pARE, pARBI, pARBD, pARBIE, pARBDE, несущие оперон биосинтеза рибофлавина, клонированный по различным сайтам в различной ориентации. Тем самым создана модель для изучения влияния копийности плазмид; участка по которому клонированы целевые гены; ориентации рибофлавинового оперона, встроенного в тот или иной участок вектора; дозы целевых генов, т.е. наличие в составе плазмиды двух копий оперона биосинтеза рибофлавина; размера клонированного фрагмента на стабильность штаммов B.subtilis и уровень биосинтеза целевого продукта.

Установлено, что при селекции генноинженерных штаммов продуцентов рибофлавина необходимо учитывать важность числа копий гибридных плазмид, местоположения оперона и его ориентации для достижения максимального уровня биосинтеза 7 6 витамина В2. Для предложенной модели введение инвертированных повторов рибофлавинового оперона является неперспективным.

При изучении уровня биосинтеза рибофлавина в клетках модельного штамма B.subtilisD107 показано, что многокопийная плазмида pARBD как в селективных, так и в неселективных условиях детерминирует биосинтез рибофлавина в 4-4.5 раза больший, чем низкокопийная плазмида рМХ45, которая составляет основу современных продуцентов рибофлавина.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ракитин, Андрей Львович

ВЫВОДЫ.

1. Фрагмент ДНК хромосомы B.subtilis размером около Ют.п.о., содержащий оперон бисинтеза рибофлавина размером 4.4т.п.о., с помощью ПЦР, минимизирован до размеров оперона биосинтеза рибофлавина.

2.На основе стабильной низкокопийной плазмиды рМХЗО сконструирована серия новых многокопийных векторов для клонирования ДНК в клетках B.subtilis. Векторы pAR13 и pAR21 имеют высокий уровень стабильности, характерный для родительской плазмиды.

3. Создана модель для изучения влияния различных характеристик гибридных плазмид, а именно: копийности плазмид; участка по которому клонирован рибофлавиновый оперон; ориентации оперона, встроенного в тот или иной участок вектора; наличия в составе плазмид обратных повторов оперона; размера клонированного фрагмента на стабильность штаммов B.subtilis и уровень биосинтеза рибофлавина.

4.Установлено, что при селекции генноинженерных штаммов - / продуцентов рибофлавина необходимо учитывать важность числа копий гибридных плазмид, местоположения оперона и его ориентации для достижения максимального уровня биосинтеза > витамина В2- Для предложенной модели, введение инвертированных повторов рибофлавинового оперона является неперспективным.

5. Из результатов анализа стабильности плазмид и детерминируемого ими уровня синтеза рибофлавина в штамме B.subtilisD107 следует, что наиболее перспективными для создания промышленных штаммов - продуцентов витамина В2 являются плазмиды pOR15 и pARBDE, несущие "оптимизированный" оперон биосинтеза рибофлавина, встроенный по сайту BamHI в "прямой" ориентации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ракитин, Андрей Львович, Москва

1. Антипова Н.И. Биосинтез витамина В2 у свиней и эффективность подкорма синтетическим рибофлавиномв. Сб. под ред. Томмэ М.Ф. Витаминное питание сельскохозяйственных животных. Москва, Колос, 1973, С.162-174.

2. Бандрин С.В., Бебуров М.Ю., Рабинович П.М., СтепановА.И. Рибофлавиновые ауксотрофы Escherichia coli. Генетика, 1979, Т.15, N11, С.2063-2065.

3. Бандрин С.В., Рабинович П.М., Степанов А.И. Три группы сцепления генов биосинтеза рибофлалвина Escherichia coli. Генетика, 1983, Т.19, N9, С.1419-1425.

4. Башкиров В.И., Милыпина Н.В., Прозоров А.А. Нуклеотидная последовательность и функциональная карта канамицин-резистентной плазмиды pUBHO из Staphylococcus aureus . Генетика, 1986, Т.22, N7, С.1081-1092.

5. Березовский В.М. Химия витаминов. Пищевая промышленность. Москва, 1973, С.507-576.

6. Бойко М.И. Потребность в рибофлавине при мясном откорме свиней Сб. под ред. Томмэ М. Ф. Витаминное питание сельскохозяйственных животных. Москва, Колос, 1973, С.174-183.

7. Борецкий Ю.Р. Локализация структурного гена и исследование свойств ГТФ-циклогидролазы B.subtilis. Диссертация к.б.н. Москва, ВНИИ Генетика, 1992.

8. Бергвист П.Л. Несовместимость. Сб. под ред. Харди К. Плазмиды, методы. Москва, Мир, 1990, С.90-94.

9. Бреслер С.Е., Калинин В.Л., Кривитский А.С., Перумов Д.А., Черник Т.П. Мутант Bacillus subtilis синтезирующий значительные количества рибофлавина. Генетика, 1969, Т.5, N2, С.133-138.

10. Бреслер С.Е., Черпенко Е.И., Черник Т.П., Калинин В.Д., Перумов Д. А. Исследование оперона биосинтеза рибофлавина у Bacillus subtilis. Сообщение I. Генетическое картирование группы сцепления. Генетика, 1970, Т.6, N5, С.116-124.

11. Бреслер С.Е., Глазунов Е.А., Горинчук Г.Ф., Черник Т.П., Перумов Д.А. Исследование оперона биосинтеза рибофлавина у Bacillus subtilis. Сообщение XIV. Изучение оператор-конститутивных мутантов. Генетика, 1978, Т.14, N9, С.1530-1538.

12. Гусаров И.И., Кренева Р.А. Первичная структура и функциональная активность гена ribC Bacillus subtilis. Мол. биология, 1997, Т.31, N5, С. 820-825.

13. Гусаров И.И., Соловьева И.М., Йомантас Ю. А.-В., и др. Анализ первичной структуры дополнительной регуляторной областирибофлавинового оперона Bacillus subtilis. Генетика, 1997, Т.33, N8, С. 1173-1176.

14. Гусаров И.И. Структура, организация и регуляция генов биосинтеза рибофлавина у Bacillus amiloliqefaciens и Bacillus subtilis. Диссертации к.б.н., Москва, ГНИИ генетика, 1997.

15. Данилевич В.Н., Дужий Д.Е., Брага Э.А. Конструирование рекомбинантных плазмид для эффективной экспресии гена пируватдекарбоксилазы (pdk) из Zymomonas mobilis в клетках Bacillus subtilis. Молекулярная биология, 1994, Т.28, вып.1, С.158-166.

16. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Москва, Мир, 1966, С.356-361.

17. Емелина Н.Т., Крылова B.C., Петухова Е.А. Витамины в кормлении сельскохозяйственных животных и птиц. Москва, Колос, 1970, С.225-231.

18. Йомантас Ю.В., Рабинович П.М., Бандрин С.В., Козлов Ю.И., Степанов А.И. Двурешшконные векторные молекулы для бактериальных систем Escerichia coli-Bacillus subtilis. ДАН СССР, 1979, Т.224, N.6, С.993-996.

19. Йомантас Ю.В., Рабинович П.М., Ребентиш Б.А., Степанов А.И. Эксперименты по генной инженерии бацилл. ДАН СССР, 1980, Т.254, N.2, С.493-495.

20. Йомантас Ю.В., Рабинович П.М., Степанов А.И. Способ последовательного клонирования сцепленных участков хромосомы бацилл. ДАН СССР, 1982, Т.264, N.2, С.482-484.

21. Йомантас Ю.В. Клонирование рибофлавинового оперона Bacillus subtilis в клетках бацилл. Автореферат дис., к.б.н. Москва, ВНИИгенетика, 1983.

22. Каравашенко В.Ф., Карявец В.В., Жук Р.К. Влияние добавок витамина А, В2, D3 и Е на продуктивность и инкубационные качества яиц. Сб. под ред. Томмэ М. Ф. Витаминное питаниесельскохозяйственных животных. Москва, Колос, 1973, С.313-322.

23. Куканова А. Я.,Жданов В. Г.,Степанов А. И. и др. Патент СССР N 908082 ,октябрь ,1981.

24. Куканова А. Я.,Жданов В. Г.,Степанов А. И. Генетика, 1982, XVIII, N2 ,С. 319-321.

25. Куканова А.Я., Конструирование штаммов Bacillus subtilis со сверхсинтезом рибофлавина. Диссертация к.б.н., Москва, ВНИИгенетика, 1988.

26. Кренева Р.А., Перумов Д.А. Биосинтез рибофлавина у Bacillus subtilis: исследование антивитаминной активности аналогов с модифицированным рибитилом. Биотехнология, 1994, N3, С. 610.

27. Кренева Р.А., Перумов Д.А. Генетическое картирование структурных и регуляторных мутаций в области 147° хромосомной карты Bacillus subtilis. Биотехнология, 1994, N7, С.12-14.

28. Кренева Р.А., Киль Ю.В., Василаки А.В. Перумов Д.А. Использование 7,8- диметил-Ю-(О-метилацетоксим)-изоаллоксазйна для клонирования гена- регулятора рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. Биотехнология, 1995, N9-10, С. 3-7.

29. Кренева Р.А., Перумов Д.А. Генетическое картирование дополнительного регуляторного локуса рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. Генетика, 1996, том 32, N12, С. 16231628.

30. Льюин Б. Гены. ред. Георгиев Г.П. Москва, Мир, 1987, С. 459472.

31. Леутский К.М. Витамины комплекса В2 1949. Львовский госуд. университет. С. 11-43.

32. Маниатис Т.,Э. Фрич, Дж. Сэмбук. Молекулярное клонирование. Москва, Мир, 1984, 479 с.

33. Маслиева О.И. Нормирование и соотношение витаминных препаратов в комбикормах для с.х. птицы. Сб. под ред. Томмэ М.Ф. Витаминное питание сельскохозяйственных животных. Москва, Колос, 1973, С.266-277.

34. Маунтин Э. Системы экспрессии генов для Bacillus subtilis в сб. под. ред. Харвуда К. Бациллы генетика и биотехнология. Москва, Мир, 1992, С.113-122.

35. Мецлер Д. Биохимия. Москва, Мир, 1980, Т.З, С.173-175.

36. Миронов В.Н. Гены биосинтеза рибофлавина Bacillus subtilis, полная нуклеотидная последовательность и оперонная организация. Авториферат диссертации к.б.н. Москва, ИМБ АН СССР, 1989.

37. Миронов В.Н., Перумов Д.А., Краев А.С., Степанов А.И., Скрябин К.Г. Необычная структура регуляторной зоны оперона биосинтеза рибофлавина Bacillus subtilis. Молекулярная биология, 1990, Т.24, Вып. 1, С.256-260.

38. Миронов В.Н., Чикиндас M.JL, Краев А.С., Степанов А.И., Скрябин К.Г. Оперонная организация генов биосинтеза рибофлавина Bacillus subtilis. ДАН СССР, 1990, Т.312, N1, С.237-240.

39. Морозов Г.И., Рабинович П.М., Бандрин С.В., Степанов А.И. Организация рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. Мол. генет. микробиол. и вир., 1984, N7, С.42-46.

40. Морозов Г.И., Рабинович П.М., Степанов А. И. Положение оператора в группе сцепления структурных генов рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. Мол. Генет. ген. микр. и вирусл., 1984, 11, С. 11-16.

41. Морозов Г.И. Молекулярно-генетическая характеристика оперона биосинтеза рибофлавина Bacillus subtilis. Автореферат дисс. к.б.н., Москва, ВНИИгенетика, 1985.

42. Ньюджет М. Репликация и стабильность плазмид в сб. под. ред. Харвуда К. Бациллы генетика и биотехнология. Москва, Мир, 1992, С. 224-230.

43. Перумов Д.А. Генетический контроль биосинтеза рибофлавина и его регуляция у Bacillus subtilis. Диссертация, д.б.н., Москва, ВНИИгенетика, 1980.

44. Почерняева Г. М. Потребность поросят отъемышей в витаминах В2, В3, В5 и эффективность обогащения ими рационов в сб. под ред. Томмэ М.Ф. Витаминное питание сельскохозяйственных животных. Москва, Колос, 1973, С.174-183.

45. Прозоров А.А. Трансформация у бактерий. Москва, Наука, 1988, С.116-130.

46. Рабинович П.М., Бебуров М.Ю., Линевич З.К., Степанов А.И. Амплификация генов рибофлавинового оперона Bacillus subtilis вклетка* Escerichia coli. Генетика, 1978, Т.14, N10, С.1697-1705.

47. Рабинович П.М., Бебуров М.Ю., Линевич З.К., Бандрин С.В., Степанов А.И. Выражение рибофлавинового оперона Bacillus subtilis в клетках Escerichia coli в составе гибридных плазмид pPRl и pPR2. ДАН СССР, 1978, Т.238, N6, С.1459-1461.

48. Рабинович П.М., Йомантас Ю.В., Хайкинсон М.Я., Степанов А.И. Клонирование генетического материала в бациллах. Молекулярная биология, 1984, Т.18, Вып. 1, С.189-196.

49. Рабинович П.М. Теоретические и прикладные аспекты генной инженерии бацилл. Диссертация д.б.н., М. ВНИИгенетика, 1986:

50. Соловьева И.М., Йомантас Ю. А.-В. и др. Клонирование дополнительного регуляторного гена ribR рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. Генетика, 1997, N6, С. 739-743.

51. Соловьева И.М, Кренева Ю.И., Полануэр Б.М., и др. Субклонирование и биохимическая идентификация гена ribR Bacillus subtilis. Генетика, 1998, том 34, N4, С.1-3.

52. Соловьева И.М. Анализ первичной структуры гена ribR Bacillus subtilis и основные характеристики соответствующего полипептида. Автореферат диссертации к.б.н., Санкт-Петербург, 1999.

53. Сорокин А.В., Хазак В.Э. Экспрессионная единица в области инициации репликации плазмиды pSM19035 стрептококов. Молекулярная биология, 1990, Т.24, вып.4, С.993-999.

54. Степанов А.И., Рабинович П.М., и др. Генетическая инженерия бацилл, как основа создания новых биотехнологических процессов. Биотехнология, 1985, N1, С. 14-30.

55. Степанов А.И. Генетика и генетическая инженерия продуцента рибофлавина на основе бацилл. Биотехнология, 1985, N2, С.14-17.

56. Тесляр Г.Е., Струговщикова Л.П., Борецкий Ю.Р. Биохимическое и генетическое изучение рибофлавинзависимых мутантов E.coli К-12. Тез. докл. VI съезда Украинского Микробиологического общества, Донецк, 1984, С. 33-34.

57. Хайкинсон М.Я., Рабинович П.М., Степанов А.И. Роль прямых и инвертированных повторов в трансформации Bacillus subtilis плазмидной ДНК. ДАН СССР, 1982, Т.265, N4, С.975-978.

58. Хайкинсон М.Я., Рабинович П.М., Степанов А.И. Принципы клонирования генетического материала у бацилл. Сб.

59. Функционирование генома в онтогенезе", Вильнюс, 1984,С.260-268.

60. Харди К.Г., Методы клонирования в бациллах, Клонирование ДНК, методы под редакцией Гловера Д.М.,- М.: Мир.- 1988.- С. 233-237.

61. Чикиндас M.JI., Миронов В.Н., Лукъянов Е.В., Борецкий Ю.Р., Арутюнова JI.C., Рабинович П.М., Степанов А.И. Установление границ рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. Молекулярная генетика и вирусология, 1987, N4, С.22-26.

62. Чэнь Сюнь, Новые подходы к конструированию рекомбинантных штаммов-продуцентов рибофлавина, автореферат к.б.н., Москва ГНИИгенетика, 1997.

63. Шавловский Г.М., Тесляр Г.Е., Струговщикова Л.П. Изучение регуляции флавиногенеза у рибофлавинзавасимых мутантов E.coli. Микробиология, 1982, Т.56, В.6, С. 986-992.

64. Шарт Р., Скавен М. Ферментация бацилл и выделение белковых продуктов, в сб. под. ред. Харвуда К. Бациллы генетика и биотехнология. М. Мир. 1992. С. 330-350.

65. Ali S.N., Al-Khalidi U.A.S. The precursors of the xylene ring in riboflavin. Biochem. J., 1966, V.98, N.l, P.182-188.

66. Anagnostopoulos C., Spizizen J. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. J.Bacteriol., 1961, 81, P.741-746.

67. Bacher A., R. Baur, U. Egger, H.D. Harders, M.K. Otto, H. Schnepple. Riboflavinsynthases of Bacillus subtilis. J. Biol. Chem., 1980, V.255, N.2, P.632-637.

68. Bacher A. Heavy ribofiavinsynthase from Bacillus subtilis. Meth. in Enzymol., 1986, V.122, N.l, P.192-199.

69. Behnke D., Gilmor M.S. Location of antibiotic resistance determinants, copy control, and replication functions on the double-selective streptococcal cloning vector pGB301. Mol. and Gen. Genet., 1981, 184, P.115-120.

70. Behnke D., Klaus S. Double or triple sets of replication functions as inverted and direct repids on in vitro reconstructed streptococcal MLS resistance plasmids. Z. Allg. Microbiol, 1983, 23, P.539-547.

71. Bernard K., Scheible P., Goebel W. Bacteriocin and antibiotic resistance plasmids in Bacillus cereus and Bacillus subtilis. J.Bacterid., 1978, 133, N.2, P.897-903.

72. Brand C., Erlich S.D., Janniere L. Unidirectional theta replication of the structurally stablye Enterococus faecalis plasmid pAMpi. EMBO J., 10, P.2171-2177.

73. Brantl S., Nowak A., Behnke D., Alonso J.C. Revision of the nucleotide sequense of the Streptococcus pyogenes plasmid pSM19035 repS gene. Nucleic Acids Res., 1989, N.17, P.101-110.

74. Brantl S., Behnke D., Alonso J.C. Molecular analusis of the replication region of the conjugative Streptococcus agalactiae plasmid pIP501 in Bacillus subtilis. Comparison with plasmids pAMpi. Nucleic Acids Res., 1990, N.18, P.4783-4789.

75. Brantl S., Behnke D. Copy number control of; the streptococcal plasmid pIP501 occurs at there livels. Nucleic Acids Res., 1991, N.20, P.395-400.

76. Bron.S and Luxen E. Segregational instability of pUBHO derived recombinant plasmids in Bacillis subtilis. Plasmid, 1985, N14, P.235-244.

77. Bron S., Holsappel S., Venema G., Peeters., Plasmid deletion formation betwin short, direct repiats in Bacillus subtilis is stimulated bu single-strandet rolling-circle replication intermidiates. Mol. and Gen. Genet., 1991, V226, P.88-96.

78. Burrows R.B., G.M. Brown. Presence in Escherrichia coli of a deaminase and reductase involved in biosynthesis of riboflavin. J. Bact., 1978, V.136, N.2, P.657-667.

79. Canosi U., Morelli G., Trautner T.A. The reationship betwin molecular structure and transformation effeciency of some S.aureus plasmids isolated from B.subtilis. Mol. Gen. Genet., 1978, V.166, N.3, P.259-267.

80. Chang S., Cohen S. High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA. Mol. and Gen. Genet., 1979; 168, N1, P.111-115.

81. Clewell D.B., Yagi Y., Dunny G.M., Schultz S.K. Characterezation of three plasmid deoxyribocleic acid molecules in a strein of Streptococcus faecalis: identificacion of a plasmid determining erytromycin resistance. J.Bacteriol., 1974, V.117, P.283-289.

82. Contente S., Dubnau D. Marker rescue transformation bu linear plasmid DNA in Bacillus subtilis. Plasmid, 1979, N.2, P.555-571.

83. Darabi A., Forough R., Bhardwaj G., Warabi M., Goodarazi G., Gross S.C. and K. Watabe. Identification and nucleotide sequence of the minimal replicon of the low-copy-number plasmid pBS2. Plasmid, 1989, N.22, P.281-286.

84. Ehrlich S.D. Replication and expression of plasmids from Stafilococus aureus in Bacillus subtilis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, V.74, N4, P.1680-1682.

85. Gruss A., and Erlich S.D. The family of highly intererrelated single-strandet deoxyribonucleic acid plasmids. J. Microbiol. Rev., 1989, N.53, P.231-241.

86. Gryczan T.J., Contente S., Dubnau D. Characterization of Staphilococcal aureus plasmids introduced bu transformation into Bacillus subtilis. J.Bacteriol., 1978, V.134, P.318-329.

87. Horinouchi S., Wisblum B. Nucleotide sequence and funcional map of pE194, a plasmid that specifies inducible resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin tupe antibiotics. J.Bacteriol., 1982, V.150, P.804-814.

88. Horinouchi S., Wisblum B. Nucleotide sequence and funcional map of pC194, a plasmid that specifies inducible cloramphenicol resistance. J.Bacteriol., 1982, V.150, P.815-825.

89. Horodniceanu Т., Bouanchaud D.H., Bieth G., Chabbert Y.A. R plasmids in Streptococcus agalactiale (group B). Antimicrob. Agents Chemother, 1976, N.10, 795-801.

90. Iceda H., Aoki K., Naito A. Illegitimate recombination mediated in vitro by bNA gyrase of Escherichia coli: structure of recombinant DNA molecules. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1982, V.79, N.4, P.3724-3728.

91. Iordanescu S., Recombinant plasmid obtained from differnt compatible Staphilococcal plasmids. J.Bacteriol., 1975, V.124, P.597-601.

92. Janniere L., Erlich S.D. Recombination betwin short repiat sequenses is more frequent in plasmids than in the chromosome. Mol. and Gen. Genet., 1987, Y.210, P.116-121.

93. Janniere L., Braund C., Erlich S.D. Structurale stable Bacillus subtilis cloning vectors. Gene, 1990, V.87, P.53-61.

94. Janniere L., Gguss A., Ehrlich S.D. Plasmids. In Bacillus subtilis and other Gramm-positive bacteria. Eds. Sonenshein A.L., Hoch J.A., Losick R. American Soc. Microbiol. Washington. 1993. P.625-644.

95. Kreneva P.A., Perumov D.A. Genetic mapping of regulatory mutations of Bacillus subtilis riboflavin operon. Mol. Gen. Genet.,1990, V.222, P.467-469.

96. Le Chatelier E., Brand C., Erlich S.D., Janniere L. Biochemical and genetic analysis of the unidirectional theta replication of the S. agalactiale plasmid pIP501. Plasmid, 1993, N29, P.50-56.

97. Le Hegart J.C., Anagnostopoulos C. Detection and characterisation of naturalli occuring plasmids in Bacillus subtilis. Mol. and Gen. Genet., 1977, Y.157, N2, P.167-174.

98. Leblanc D.J., Lee L.N. Physical and genetic analysis of streptococcal plasmid pAMfH and cloning of its replication region. J.Bacteriol., 1984, V157, P.445-453.

99. Lopez P. and all. Generation of deletion inpneumococal mal genes cloned in Bacillus subtilis. Proc. Natl.Acad. Sci. USA., 1984, N.81, P.6189-5193.

100. Lovett P.S., Bramucci M.G. Plasmid deoxyribonucleic acid in Bacillus subtilis and Bacillus pymilis. J.Bacteriol., 1975, V.125, N2, P.484-746.

101. Ludwig H.C., F. Lottspech, A. Ladenstein, A. Bacher. Heavy riboflavinsynthase of Bacillus subtilis. Primary structure of the P "subunit. J. Biol. Chem., 1987, V.262, P.1016-1021.

102. Machler B.I., Halvorson H.O. Two erythromycin-resistance plasmids of diverse origin and ther effect on sporulation in Bacillus subtilis. J. of Gen. Microbiol. 1980, N120, P.259-263.

103. Maciang I.E., Viret J.F., Alonso J.C. Replicotion and incompatibiliti properties of plasmid pUBHO in Bacillus subtilis. Mol. and Gen. Genet., 1988, V.212, P.232-240.

104. Mac Laren J.A. The effect of centain purines and pyrimidines upon the production of riboflavin by Eremothecium aschbyi. J. Bacterid, 1952, V.63, N.2, P.233-241.

105. Malke H. Genetics of resistance to macrolide antibiotics and lincomycin in naturural isolates of Streptococcus pyogenes. Mol. and Gen. Genet., 1974, V.135, P.349-367.

106. Michel В., Palla E., Niaudet В., Erlich S.D. DNA cloning in Bacillus subtilis. III. Efficiency of random-segment cloning and insertional inactivation vectors. Gene, 1980, N.12, P.147-154.

107. Michel В., Niaudet В., Erlich S.D. Intermolecular recombination during transformation of Bacillus subtilis competent eels by monomeric and dimeric plasmids. Plasmid, 1983, N.10, P.1-10.

108. Mitsuda M., Nakajama., Yamada Y., Formation of 4-ribitylamino-5-amino-2,6-dihydrooxypyrimedine in an adenine-riboflavin doubles mutant of Bacillus subtilis. J. Nutr. Sci. Vitaminology, 1977, N.23, P.161

109. Molttes M., Grandi G., Sgaramella V., Diferent specific activities of the monomeric and oligomeric forms of plasmid DNA in transformation of B.subtilis and E.coli. Mol. and Gen. Genet., 1979, V.174, P.281-286.

110. Neuberger G. and A. Bacher. Biosynthesis of riboflavin.Enzymatic formation of 6,7- dimethyl-8-ribityllumazine by heavy ribo-flavinsynthase from Bacillus subtilis. Biochem. Biohys. Res. Commun., 1986, V.139, N.3, P.1111-1116.

111. Niaudet В., Janniere L., Erlich S.D. Recombination betwin repiat DNA sequenses ocurs more often in plasmids than in the chromosome. Mol. and Gen. Genet., 1984, V.197, P.46-54.

112. Nielsen P. and A. Bacher. Biosynthesis of riboflavin. A simple synthesis of the substrate and product of the pyrimidine deaminase and of structural analogs. Zeitschrift fur Naturforschung, 1988, V.43, N.10, P.-1358-1365.

113. Palva I., Molecular cloning of amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens and its expression in Bacillus subtilis. Gene, 1982, N19, P.81-87.

114. Projan S.G., Novic R.P. Comparative analusisof five related Staphilococcus plasmid. Plasmid, 1988, N19, P.203-221.

115. Rabinovich P.M., Yomantas Yu.V., Haykinson M.Ya., Stepanov A.I. Cloning of genetic material in bacilli. In Genetics and Biotechnology of Bacilli, Eds: Ganesan A.T., Hoch J. A., Acad.Press, USA, 1984, P.297-308.

116. Saunders C.W., Schmiolt and all. Use of chromosomal interationtor the establishment of heterogous genes in Bacillus subtilis in: Protein Transport and Secretion. New York, 1984, P.329-339.

117. Schott K., J. Kellermann, F. Lottspeich, A. Bacher. Riboflavinsynthase of Bacillus subtilis. Purification and aminoacid sequence of the a-subunit. J. Biol. Chem. 1990. V.265, N.8, P.4204-4210.

118. Tanaca Т., Kuroda M., Sakaguchi K. Isolation and characterization of four plasmids from Bacillus subtilis. J.Bacterid., 1977, V.129, N3, P.1487-1494.103

119. Tanaca Т. rec E4 independed recombination between homologous DNA segments of Bacillus subtilis plasmids, J. Bacterid, 1979, V.139, P.775-782.

120. Trian Bews and D.H.G. Crout. Biosynthesis of riboflavin and the role of acetoin (3-hydroxybutan-2-one) in the formation of the o-xylene ring. J. Am. Chem. Soc., 1986, N.8, P.1459-1465.

121. Volk R., A. Bacher. Biosynthesis of riboflavin, the structure of the four^carbon precursor. J. Am. Chem. Soc., 1988, V.110, N.ll, P.3651-3653.