Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетические свойства и структура плазмид природных штаммов Bacillus subtilis
ВАК РФ 03.02.07, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Генетические свойства и структура плазмид природных штаммов Bacillus subtilis"
На правах рукописи
ПОЛУЭКТОВА ЕЛЕНА УЛЬРИХОВНА
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И СТРУКТУРА ПЛАЗМИД ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ BACILLUS SUBTILIS
03.02.07-генетика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва
2010
2 0 f/Arj ?0:0
004602306
Работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор
Александр Александрович Прозоров
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Элеонора Суреновна Пирузян
доктор биологических наук, профессор Юлия Михайловна Романова
доктор биологических наук Ирина Владимировна Еланская
Ведущая организация : Федеральное государственное ■ унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (г.Москва)
Защита диссертации состоится «^¿£2» -¿fr^g 2010 года в_час. мин.
на заседании диссертационного Совета (Д 002.214.01) при Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул.Губкина, 3, факс (499)132-89-62, E-mail: aspirantura@vigg.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН
Автореферат разослан » ( 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук
Т.А.Синелыцикова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Bacillus subtilis является вторым по значимости (после E.coli) объектом бактериальной генетики и физиологии и наиболее изученным видом грам-положительных бактерий. Ряд свойств В. subtilis делают ее перспективным объектом генетической инженерии. B.subtilis экологически безопасна: она исходно непатогенна, и организм человека не является для нее постоянным хозяином. B.subtilis не требовательна к условиям роста. Как и другие бациллы, B.subtilis секретирует белки в культуральную среду и служит важным промышленным объектом для получения различных ферментов. Одной из старейших областей применения B.subtilis является использование ее для ферментация соевых бобов; получаемые пищевые продукты широко распространены в странах юго-восточной Азии. Штаммы B.subtilis используются и в качестве хозяев для экспрессии рекомбинантных ДНК и продукции в их клетках чужеродных белков. В сельском хозяйстве используется также способность штаммов B.subtilis подавлять рост патогенов растений.
Для лабораторного штамма B.subtilis 168 была определена полная нуклеотидная последовательность генома (Kunst et al., 1997). Дальнейшее изучение генетики этой бактерии требует определения нуклеотидных последовательностей и исследования функциональной активности внехромосомных компонентов генома - плазмид и фагов, а также изучения особенностей строения геномов других штаммов B.subtilis, используемых в промышленном производстве и выделяемых из природных источников.
Лабораторный штамм B.subtilis 168 не содержит плазмид. Долгое время в качестве векторов для клеток B.subtilis использовались плазмиды других грам-положительных микроорганизмов - стафилококков и стрептококков. Позже плазмиды были обнаружены в клетках некоторых природных и промышленных штаммов B.subtilis; подавляющее их большинство не влияет на проявление каких-либо заметных свойств бактериальной клетки, т.е. плазмиды являются криптическими.
Многие крупные плазмиды различных микроорганизмов несут гены, определяющие способность бактериальных клеток к конъюгации. До недавнего времени считалось, что основными способами горизонтального переноса генов у B.subtilis являются трансформация и трансдукция. К началу нашей работы была описана лишь одна конъюгативная плазмида из штамма B.subtilis {natío); конъюгация происходила с низкой частотой и осталась практически неисследованной. Таким образом, существовало несоответствие между изученностью и востребованностью B.subtilis и отсутствием сведений о плазмидах этого микроорганизма, а также их участия в процессе конъюгации.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение структуры и функций криптических плазмид из коллекций природных штаммов В. sublilis, выделенных из почв Москвы, Московской области и различных районов Белоруссии. Особое внимание было уделено поиску и изучению конъюгативных плазмид B.subtilis.
В задачи исследования входило: 1.Поиск и характеристика криптических плазмид из природных штаммов B.subtilis, относящихся к московской и белорусской коллекциям. 2.Определение нуклеотидной последовательности некоторых мелких плазмид и их фрагментов.
3.Рестрикционный и гибридологический анализ мелких плазмид, позволяющий установить степень их родства и наличие у них тех или иных генов.
4.Поиск в природных штаммах B.subtilis крупных плазмид, способных осуществлять конъюгативный перенос ДНК.
5.Характеристика процесса конъюгации, осуществляемого плазмидами из природных штаммов B.subtilis.
6.Определение нуклеотидной последовательности и изучение строения генов ira-района конъюгативных плазмид из природных штаммов B.subtilis.
Научная новизна. С использованием методов рестрикционного анализа, гибридизации, секвенирования впервые проведено широкомасштабное исследование большого числа мелких криптических плазмид из природных
штаммов B.subtilis; охарактеризованы гены плазмид и относительные частоты их встречаемости. У плазмид B.subtilis впервые идентифицированы новые ген (hsp, ген белка теплового шока) и IS-элемент (ISÄsm2 семейства IS256).
В природных штаммах B.subtilis обнаружены две плазмиды, способные к конъюгативному переносу ДНК. Одна из обнаруженных конъюгативных плазмид, р19, осуществляет с высокой частотой как мобилизацию мелких плазмид, так и самоперенос в клетки различных видов бацилл; эти особенности плазмиды являются уникальными и делают ее удобным инструментом для дальнейших исследований в области генетики B.subtilis и других бацилл.
Впервые у B.subtilis определена нуклеотидная последовательность части (33,5 тпн из 95 тпн) крупной конъюгативной плазмиды (р19), в том числе значительная часть ira-района (19,9 тпн). Оказалось, что /га-район плазмиды р19 имеет сходство с ^я-районами различных грам-положительных микроорганизмов {Clostridium, Bacillus, Listeria, Exiguobacterium), однако отличается от них.
Благодаря полученным в работе данным удалось впервые показать, что конъюгация играет существенную роль в горизонтальном переносе генов у штаммов B.subtilis.
Научно-практическая значимость. Полученные в работе данные о распространении и строении плазмид, содержащихся в штаммах бацилл, могут быть рекомендованы к использованию в работах по генетике, экологии и эволюции микроорганизмов, а также генной инженерии. Данные о распространении \SBsu2 среди штаммов бацилл могут быть использованы для маркирования природных и промышленных штаммов этого микроорганизма. Обнаруженная и исследованная в работе высокоэффективная система конъюгации, определяемая плазмидой р19, может быть использована а лабораторной практике и биотехнологических работах для осуществления переноса плазмидных и хромосомных генов.
Положения, выносимые на защиту.
1.Значительное количество природных штаммов B.subülis содержит плазмиды, преимущественно мелкие. Мелкие плазмиды имеют генетические модули mob, hsp, rap-, частота распространения модулей различна. Мелкие плазмиды, выделенные из различных штаммов, достаточно однородны.
2.В геноме ряда природных штаммов B.subtilis присутствует новый IS-элемент \SBsu2 (семейства IS256).
3.Крупная плазмида р19 из почвенного штамма B.subtilis обусловливает конъюгативный перенос мелких плазмид и самоперенос с высокой частотой в клетки различных видов бацилл.
4лга-район плазмиды р19 имеет сходство с /га-районами грам-положительных бактерий различных видов, однако отличается от них.
5.Конъюгация играет значительную роль в процессах горизонтального переноса генов у B.subülis и близких к ней видов бацилл .
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на 12-ом европейском совещании по переносу и экспрессии бактериальных генов (Сиена, Италия, 1996); международном конференции по бациллам (Осака, Япония, 1998); 13-ом европейском совещании по трансформации (Кайзерслаутерн, Германия, 1999); международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва, 2001); III Съезде ВОГИС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004); международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И.Алиханяна (Москва-Пущино, 2006); международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2008); съезде генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Ч.Дарвина, и V съезде ВОГиС (Москва, 2009); научном семинаре отдела генетических основ биотехнологии ИОГен РАН (2009).
По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ.
Благодарности. Я приношу свою искреннюю благодарность сотрудникам и аспирантам лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН, заведующему лабораторией д.б.н., профессору В.Н.Даниленко, моему научному консультанту д.б.н., профессору А.А.Прозорову за помощь и плодотворное сотрудничество; П.Б.Торстеду (Университет г.Бирмингема, Великобритания), С.Брону и С.Хольсаппелю (Университет г.Гронингена, Нидерланды) за совместную работу по определению нуклеотидной последовательности мелких плазмид; сотрудникам ИППИ РАН М.С.Гельфанду и С.А.Родионовой за помощь в анализе нуклеотидных последовательностей. Работа была поддержана грантами ШТАБ (№ 97-1464); РФФИ (01-04-49497а; 04-04-48078а; 07-04-00911а); РФФИ-БелРФФИ (04-04-81021-Бел2004).
Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в разработке плана экспериментов, их осуществлении, анализе и обобщении полученных результатов. Суммарный личный вклад автора в данном исследовании составляет около 80%.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 219 страницах, содержит 43 рисунка и 31 таблицу и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка использованной литературы (включающего 331 источник) и двух приложений.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1.Использованные в работе коллекции природных штаммов В.эиЬНИз.
В нашем распоряжении были две коллекции природных штаммов Дя/Шю. В лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН Ю.Е.Козловским были выделены из почв Москвы и Московской области 129 штаммов почвенных бацилл, близких к типовому лабораторному штамму В.эиЫШз 168 (Козловский, Прозоров, 1981). Эти штаммы составили т.н.
московскую коллекцию штаммов В.аиЫШв. 32 штамма коллекции были ранее проверены на наличие плазмидной ДНК; в 19 штаммах были обнаружены мелкие плазмиды. Все исследованные штаммы были чувствительны к 6 антибиотикам (Ар, Ст, Ет, Кт, Ил Г, Тс); вероятно, обнаруженные плазмиды являются криптическими (Незаметдинова и др., 1992). Детальное изучение этих плазмид из 19 штаммов московской коллекции составляет предмет данной работы.
Нами были проверены еще 42 штамма московской коллекции. В лизатах клеток 24 штаммов с помощью электрофореза в агарозном геле также были обнаружены 19 мелких и 9 крупных плазмид. Они составили еще одну группу изученных в работе плазмид.
В образцах почв, собранных в разных районах Белоруссии, М.А.Титок (Белорусский Государственный Университет) нашла 55 штаммов природных бацилл, близких к В. В 11-ти штаммах были обнаружены криптические
плазмиды (ТНок й а1., 2003). 10 штаммов из белорусской коллекции, содержащие 10 мелких и 8 крупных плазмид, также были исследованы в данной работе.
Штаммы с плазмидами составляют 20% исследованных штаммов для белорусской коллекции и 58% для московской коллекции. Всего в нашем распоряжении было 51 мелкая и 18 тяжелых плазмид. Столь широкий анализ плазмид из природных штаммов В.яиЬШк был осуществлен впервые. Анализ мелких и крупных плазмид был проведен раздельно.
2.Изучение структуры мелких плазмид.
2.1.Рестрикциониый анализ и классификация мелких плазмид.
Для характеристики плазмид мы использовали число ВатЖ и ШпейП сайтов рестрикции, а также размер плазмид и их рестрикционных фрагментов (судя по подвижности при электрофорезе нативной и рестрицированной плазмидной ДНК).
Результаты анализа мелких плазмид из 19 штаммов московской
Таблица 1. Классификация мелких плазмид из природных штаммов В.зиЫИ'ч.
по данным сиквенса; ** фрагмент, возможно, дуплицирован. М - московская коллекция, Б - белорусская коллекция.
Номер Штамм, Кол- Число сайтов Размер Размер
груп- содержа- лек- Плазмнда ВатШ Нт&II Я/лЛИ-фрагментов, плазмиды,
пы щим ция тпн тпн
плазмиды
1 1315 М р1315 0 5 3.7, 1.6, 1.5, 1.1, 8.43
0.53
2 1385 м р1385 1 6 1.6,1.5, 1.2,1.1, 6.58
0.65,0.53
3 1414 м р1414 1 6 1.8, 1.6, 1.5, 1.4, 7.26/7.95'
1434 м р1434 0.65, 0.48
1801 м р1801
4 1387 м р1387-1 1 5 2.1, 1.6, 1.5, 0.65, 6.28
1410 м р1410 0.43
1437 м р1437
1570 м р1570
1668 м р1668
1674 м р1674
1698 м р1698
1776 м р1776
1870 м р1870
1878 м р1878
В8Чк31 Б рЧк31
5 1516 м р1516Б 1 >6 1.8,1.6, 1.5, 1.4", 9.4/9.88'
1525 м р1525 1.1,0.53
1553 м р1553
6 1546 м р 1546-1 1 5 3.0, 1.8, 1.2, 0.65, 7.08
0.43
7 1546 м р 1546-2 0 4 2.6,2.1, 1.4, 1.0 7.10
$ 1387 м р1387-2 1 >9 2.8, 1.65, 1.37, 0.9, 8.5
0.73.....
9 В88 Б Р8 1 7 2.3,1.6, 1.5,1.2, 8.11
ВБ57 Б р57 0.65,0.56,0.3
В82 Б Р2
В81 Б Р1
В515 Б р15
19 Б рУ
В54 Б р4
ВЗЬМ Б рЫ-1
10 В821г Б р21г 1 5 2.3, 1.6, 1.5, 0.65, 6.61
0.56
коллекции и 10 штаммов белорусской коллекции представлены в таблЛ. 17 штаммов содержали по одной плазмиде. Величина плазмид колебалась от 6,3 до 9,9 тпн. По выбранным нами критериям плазмиды были разделены на 10
групп. Плазмиды разных групп проявляли сходство друг с другом. Наиболее сходны плазмиды групп 3 и 5, а также 9 и 10 - они имеют 4-5 одинаковых ///Will-фрагмента. Плазмиды из московской коллекции принадлежали к группам 1-8. Большая часть плазмид белорусской коллекции принадлежала группам 9-10; одна плазмида, рЧк31, принадлежала группе 4. Эта группа была самой обширной. Плазмиды этой группы по использованным нами критериям были идентичны плазмиде рТА1020, выделенной японскими авторами из промышленного штамма B.subtilis {natío) (Uozumi et al, 1980). Возникал вопрос, не являются ли плазмиды каждой группы идентичными уже потому, что они находятся в одних и тех же штаммах почвенных бацилл, ошибочно получивших при выделении разные номера (т.е. в «сибсах»). По-видимому, это не так, поскольку бациллы выделялись из географически удаленных образцов почвы и, кроме того, штаммы московской коллекции и по другим признакам (способность к генетической трансформации; разные системы рестрикции-модификации; продукция а-амилазы; различия в изозимном спектре ферментов) отличались друг от друга (Козловский, Прозоров, 1983; Стукалин и др., 1984; Чан Кам Ван и др., 1985; Лукин и др., 1994).
Два штамма - 1387 и 1546 - содержали больше одной плазмиды. В штамме 1387 мы обнаружили три плазмиды (р1387-1, р1387-2, р1387-3, величиной 6,28 тпн; 8,5 тпн; 36 тпн соответственно). Плазмиды р1387-1 и р 1387-2 были гомологичны друг другу по данным ДНК-ДНК гибридизации на фильтрах. В штамме 1546 мы обнаружили две плазмиды (р1546-1 и р1546-2, величиной 7,08 тпн и 7,1 тпн соответственно), не гомологичные друг другу. Клетки штамма 1516 несли либо S (small), либо L (large) варианты плазмиды р 1516; величина этих вариантов плазмид 9,4 тпн и 10,7 тпн соответственно. Рестриктные карты плазмид pl516S и pl516L были идентичны, плазмиды отличались только величиной одного из ЕсоШ-HindWl - фрагментов. В этом EcoRl-HindWl - фрагменте pl516L была локализована инсерция величиной 1,3 тпн. Как оказалось, эта инсерция содержит IS-элемент (см.раздел 2.4).
2.2.Определение нуклеотидной последовательности мелких плазмид.
Все имевшиеся в нашем распоряжении плазмиды являлись криптическими. Поэтому единственным способом изучения строения этих плазмид могло быть определение их нуклеотидной последовательности. Для этой цели были выбраны две плазмиды, принадлежащие, по нашей классификации, к разным группам: р1414 (группа 3) и pl516S (группа 5). Кроме того, была определена нуклеотидная последовательность вставки, отличавшей плазмиду pl516L от р1516S.
Нуклеотидная последовательность плазмиды р1414 была определена в университете г.Бирмингема (Великобритания). Плазмида р1414 была кольцевой, имела размер 7949 пн и ГЦ-состав 38,3%. Плазмида была депонирована в GenBank (AF091592). На плазмиде были идентифицированы 10 ORF и специфические функционально активные участки ДНК - dso и sso (ориджины вегативной репликации типа «катящегося кольца»), опТ (ориджин конъюгативного переноса) (рис.1 ). Гипотетические продукты двух ORF были гомологичны известным ранее белкам мелких плазмид B.subtilis-. Rep (инициатор репликации) и Mob (необходим для мобилизационного переноса плазмиды). Рядом с геном mob находилась небольшая ORF, считываемая в противоположном направлении. Было высказано предположение, что белки, гомологичные продукту данной ORF, репрессируют действие Mob-белков (Meijer et al., 1998). Мы предложили для этих генов название ptr -putative regulatory gene. Белки Rep, Mob, Ptr имеют много гомологов в базах данных.
Белки, соответствующие ORF2, ORF3, ORF4, ORF6, ORF9 имеют гомологи в базе данных, однако функции их неизвестны. Белок, соответствующий ORF 10, гомологов в GenBank не имеет. Нужно отметить, что ORF2 окружена дуплицированными участками ДНК (156 пн); один из них расположен в конце ORF1, другой - между ORF2 и ORF3.
Наиболее интересной оказалась ORF5. Соответствующий ей белок имел 145 аминокислотных остатков и альфа-кристаллический домен. Перед геном
7949
н 0 нн
-im
wiim
ORF) ORH 0RF3 0RF4 ORP5 0RT6 0RF7 ORTS 0RF9 ORflO
В > »■-<■ »-"■>»------------------> * ---------
rep hsp mob ptr
Г
dsn orfT sso clso
dT--------_--------------------------1----------------In_________________________________________________n__________a
Дуплицированные
pBS608 участки д ----------
pLS30 E -
рТАЮбО
Ж -
Рисунок 1. Генетическая карта р1414 и гомология р1414 с другими плазмидами. А -величина карты в пн. Б - Рестриктная карта. Е - EcoRl, Н - HindiII сайты рестрикции. Цифрами обозначены Hindlll фрагменты р1414. Жирной линией выделены фрагменты р1414, использованные в гибридизации в качестве зондов. В - ORF. Г - функционально активные районы ДНК. Столбиком с утолщением на конце обозначены промоторы. Д, Е, Ж - участки р1414, гомологичные ДНК плазмид pBS608 (Д), pLS30 (Е), рТАЮбО (Ж).
находился промотор оА-типа; скорее всего, ген являлся функционально активным. В 1999г., когда была определена нуклеотидная последовательность р 1414, гомологов этого белка у бацилл известно не было, однако они были обнаружены у других организмов - бактерий, дрожжей, растений; это были гомологи белков стрессового ответа на тепловой шок. Они составляли целое семейство. По аналогии с соответствующими генами других организмов, ген был назван hsp - heat shock protein. В настоящее время подобные белки и соответствующие им гены обнаружены у многих бацилл - как на плазмидах, так и в составе хромосомы.
Функционально активные участки ДНК р1414 были в значительной степени гомологичны соответствующим участкам плазмид рТА1015 и
рТАЮбО. Вероятно, sso р1414 принадлежит sso Т1 типа (Meijer et al„ 1995; 1998).
В то время, когда была определена нуклеотидная последовательность р1414 и р1516, была известна нуклеотидная последовательность только шести RCR-плазмид B.subtilis. В настоящее время известна полная нуклеотидная последовательность для 17 мелких плазмид B.subtilis и близких ей бацилл; для 20 подобных плазмид известна часть нуклеотидной последовательности. Плазмида р1414 является одной из типовых плазмид при описании RCR-плазмид B.subtilis (Sakayaet al., 2006; Guglielmetti et al., 2007). В целом pl414 в значительной степени гомологична плазмидам B.subtilis pBS608 (гомологию имеет 75% ДНК р1414), pLS30 (74%), pPLl (64%) (нуклеотидная последовательность этих плазмид была определена позже, чем у р1414) и, в меньшей степени, плазмидам рТА1015 и рТАЮбО (52-53%).
Нуклеотидная последовательность плазмиды pl516S, как и EcoRl-HindUl фрагмента pl516L, была определена в лаборатории молекулярной генетики университета г. Гронингена (Нидерланды). Удалось получить почти полную картину нуклеотидной последовательности этой плазмиды. Не секвенированными остались 3 участка общим размером около 750 пн, находящиеся внутри областей, гомологичных нуклеотидным
последовательностям плазмид р1414 и рТАЮбО. Поэтому мы смогли охарактеризовать нуклеотидную последовательность р1516 целиком, считая непрочитанные нуклеотидные последовательности идентичными соответствующим участкам рТАЮбО и р1414. Однако из-за неполного определения нуклеотидной последовательности р1516 она не была депонирована в GenBank. Исходя из указанного допущения, полная нуклеотидная последовательность кольцевой плазмиды pl516S составляет 9881 пн. GC-состав плазмиды - 38,1%. На плазмиде были найдены ori'T, dso, sso сайты, а также 13 ORF (рис.2). Значительная часть плазмиды (72%) оказалась гомологична плазмиде р1414 (92-98% идентичности нуклеотидов). Как и р1414, pl516S содержала гены rep, hsp, mob, ptr, функционально
012345 6 789 9881
A I_
EH H На На ЕР Н К ВНЕ Н НаН Н Н На
g > > > 11 ■ ■ ' " X ' Iii it I
EVX
< - '" » Вставка у pl516L ORFI ORF2 ORF3 ORF4 ORF5 ORF6 ORF7 ORF8 ORF9 ORFIO ORFII ORF12 ORF13
В »■»<>»» >< >_■» t »
ге/> fop mob ptr rap phr
dso orfT sso
Г of__________________________________________I-................ To..................................................л_______
Дуплициро ванные участки
р 1414
Д--
рТАЮбО
Е--------------------------
Рнсунок 2. Генетическая карта pl516S и гомология pl516S с другими плазмидами. А -величина карты в пн. Б - рестриктная карта. Е - EcoRX, Н - Hind\\\, На - НаеIII, Р - Pvul, К -Крп\, EV - EcoKV, В - BamHl сайты рестрикции. В - ORF. Г - функционально активные районы ДНК. Столбиком с утолщением на конце обозначены промоторы. Д, Е - участки pl516S, гомологичные ДНК плазмидр1414 (Д) и рТАЮбО (Е).
активные участки dso, sso, or/T, а также гены-гомологи ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 и ORF9 р1414. Как и у р1414, у1516 ген ORF2 был окружен дуплицированными участками ДНК по 156 пн. В отличие от р1414, р1516 содержала rap-модупь (гены rap и phr), гомологичный г яр-модулю плазмиды рТАЮбО (Meijer et al., 1998). Белок Rap - аспартатфосфатаза регуляторного ответа, Phr - его антагонист, регулятор фосфатазы. Эти белки являются компонентами регуляторной системы, контролирующей реакцию клетки на различные изменения внешней среды.
2.3.Поиск гомологов плазмидиых генов среди плазмид из штаммов бактериальных коллекций
Далее мы хотели выяснить, насколько широко распространены идентифицированные нами гены мелких плазмид в ДНК плазмид различных природных штаммов B.subtilis. Для этого мы использовали метод блот-гибридизации в жестких условиях с зондами - фрагментами плазмидных генов.
Известно, что гер-тсни RCR-плазмид B.subtilis составляют достаточно однородную группу (Meijer et al., 1998). Поэтому мы использовали в качестве зондов фрагменты других генов плазмид р1414 (hsp, mob, ptr) (рис.1Б), рТА1040 {rap), рТА1050 (rap, par). Модуль par состоит из трех генов и предположительно является системой токсин-антитоксин, обусловливающей стабильное наследование плазмид (Gleave et al., 1990).
В этой части работы мы использовали для гибридизации как плазмиды 1ОИ-10ОИ групп, описанные ранее, так и 19 мелких плазмид из московской коллекции, обнаруженные нами и не разделенные на группы. Результаты гибридизации представлены в табл.2, mob- и fir-зонды гибридизовались со всеми исследованными плазмидами, кроме одной; тоЬ-модулъ необходим для горизонтального переноса плазмид посредством конъюгации (остальные гены конъюгативного переноса обычно локализованы на крупных конъюгативных плазмидах). Частая встречаемость этого модуля является косвенным подтверждением наличия конъюгативного переноса у B.subtilis. Asp-зонд гибридизовался с подавляющим большинством исследованных плазмид; rap- и par-зонды гибридизации не давали. Определение нуклеотидной последовательности плазмид не обнаружило в них par- и гар-локусов, но плазмида р1516 несла rap-модуль по данным сиквенса (см.выше). Однако гомология между ДНК-зондами гар-рТА1040, гар-рТА1050 и rap-геном р1516 составляла соответственно 63-45%, что значительно ниже порога обнаружения сигнала (80-85%) в жестких условиях гибридизации. Из проверенных плазмид только одна, р1516-2, не проявляла гомологии ни с
Таблица 2. Результаты гибридизации плазмид с зондами - фрагментами генов. + - наличие сигнала гибридизации; - отсутствие сигнала гибридизации.
Зонд hsp mob ptr par rcrpl050 rapl040
Число проверенных плазмид 20+, 8- 27+, 1- 27+, 1- 29- 6- 21-
одним из зондов.Таким образом, мелкие плазмиды штаммов B.subtilis из московской и белорусской коллеций частично гомологичны друг другу. Подавляющее большинство исследованных плазмид содержат высокогомологичные (>80%) модули mob и hsp.
2.4.Определение нуклеотидной последовательности ЕсоШ-НтЛИ фрагмента плазмиды pl516L.
Как уже упоминалось выше, в штамме 1516 было обнаружено две плазмиды, pi516S и pl516L, отличавшиеся друг от друга лишь величиной одного £соШ-Я/ийЯН-фрагмента (рис.2Б). Нам показалось интересным сравнить нуклеотидные последовательности этих фрагментов. EcoRl-HindlU-фрагмент pl516S был секвенирован в составе плазмиды р1516S. EcoRl-HindlU-фрагмент pl516L был получен с помощью ПЦР, а затем определена его нуклеотидная последовательность.
EcoRl-Hindlll - фрагменты pl516L и pl516S отличались друг от друга наличием у плазмиды pl516L участка ДНК величиной 1383 пн. GC-состав этого участка ДНК - 38,7%, что незначительно отличается от GC-состава плазмиды pl516S (38,1%). Вставка располагалась внутри mob-гена, на расстоянии 18 пн от его З'-конца (после нуклеотида 5932) (рис.2Б).На концах вставки были найдены: 1) прямые повторы, причем первый прямой повтор находился на последовательности вставки, а другой - на последовательности собственно плазмиды, непосредственно на границе ДНК плазмиды и вставки; 2) два совершенных инвертированных 10-членных повтора.
По данным на 2002г., нуклеотидная последовательность вставки имела большое сходство (70% гомологии) с фрагментами геномов Enterococcus faecalis (TlGR_1351/gef_11370) и Enteroroccus faecium (DOE_1352/Contig 7190). Аминокислотная последовательность, соответствующая нуклеотидной последовательности вставки, имела, по данным программы BlastX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), значительное сходство с белками многих микроорганизмов; это были либо транспозазы, либо предполагаемые
транспозазы. Размер этих белков - около 400 аминокислотных остатков. Однако участки гомологии располагались на различных рамках считывания и не совпадали с какой-либо одной из возможных ORP. Создавалось впечатление, что на последовательности вставки произошел сдвиг(и) рамки считывания, что нарушило нормальное строение гена.
Наличие прямых и инвертированных повторов по краям вставки и гомология центральной части вставки с транспозазами различных микроорганизмов позволила предположить, что вставка в pl516L является IS-элементом. Вероятно, ген описываемой нами транспозазы являлся дефектным, т.е. псевдогеном. Наличие в клетках штамма B.subtilis 1516 плазмид как с IS-элементом, так и без него, являлось косвенным свидетельством транслокации элемента. Возможно, функционально активные его копии находились на хромосоме. Мы назвали обнаруженную нами IS-последовательность \SBsu2. Судя по характеру гомологии транспозазы \SBsu2 с транспозазами известных IS-элементов, IS А™ 2 принадлежит к семейству IS256. Некоторые представители этого семейства имеют не одну пару инвертированных повторов, как подавляющее большинство IS-элементов, а две (Mahillon, Chandler, 1998). Эту же особенность мы отметили для \SBsu2. \SBsu2 была депонирована в 2003г. в GenBank (№ AY099458).
Возникал вопрос, присутствует ли мобильный элемент lSBsu2 в хромосоме штамма 1516, несущего соответствующую плазмиду, а также в хромосомах других штаммов B.subtilis и некоторых других бацилл. Для проверки этого предположения мы попытались обнаружить данную последовательность в хромосомной ДНК различных бацилл с помощью блот-гибридизации. Последовательность \SBsu2 была амплифицирована на плазмиде pl516L посредством ПЦР с использованием специфических праймеров, помечена 32Р-дАТФ и использована в качестве зонда в блот-гибридизации по Саузерну с хромосомной ДНК бацилл. Хромосомная ДНК при этом обрабатывалась рестриктазой EcoKV. Мобильный элемент IS&w2 имеет один
сайт узнавания для ЕсоКУ, расположенный приблизительно в его средней части; на ДНК собственно плазмиды р!516 сайтов узнавания для ЕсоКУ нет.
При гибридизации с хромосомной ДНК штамма, несущего плазмиду р 1516Б, обнаружилось 18-20 полос гибридизации разной интенсивности (рис.3). Плазмида р15168 не содержит \SBsu2, поэтому возможная примесь плазмидной ДНК не могла повлиять на результат гибридизации. Поскольку рестриктаза ЕсоЯ'У разрезает \SBsu2 на две части, любая нуклеотидная последовательность на хромосоме, гомологичная ей, также разрезается при соответствующей обработке и должна дать две полосы гибридизации. Таким образом, число участков гомологии с \SBsu2 на хромосоме (т.е.копий \SBsu2) должно быть в два раза меньше числа полос гибридизации - в данном случае 9-10. При гибридизации с хромосомной ДНК штаммов В.зиЫШз, содержавших плазмиды Га) (б)
/ 13 4 5 6 7 Я 9 10 12 3 4 5 б 7 Я 9 10
Рисунок 3. Результаты блот-гибридизации хромосомной ДНК из различных штаммов В.тЫШз с меченной иР-дАТФ ДНК \SBsu2.
а - электрофореграмма £соЯУ фрагментов хромосомной и плазмидной ДНК и ЕсоШ-НтЛII фрагментов ДНК фага X; б - результаты блот-гибридизации этих фрагментов с радиоактивным зондом. 1 - р1516Ь; 5 - ДНК фага X, рестрицированная EcoRl-Hincn.ll; остальные пробы - хромосомная ДНК из штаммов В.зиЬШм , рестрицированная £соЮ/: 2 -1516 (р15168); 3 - 1516 (р1516Ь); 4 - 1414 (р1414); 6- 168; 7 - №03022 (рТАЮбО); 8 - 1315 (р!315); 9 - 1385 (р1385); 10- 1513. Цифры слева - величина ЕсоЕХ-НШП фрагментов ДНК фага X в тпн.
р1414, р1315, р1385 и рТАЮбО, для которых была определена полная нуклеотидная последовательность и было известно, что ни одна из них не содержит IS-элементов (Mejer et al., 1998; Вгоп, личное сообщение), также обнаружились полосы гибридизации, от двух до шестнадцати. Много полос гибридизации обнаруживалось и при гибридизации с хромосомной ДНК штамма pl516L (возможно, что одна из полос соответствовала примеси ДНК плазмиды pl516L). Мы провели также гибридизацию с хромосомной ДНК штамма B.subtilis 19, несущего крупную конъюгативную плазмиду р19 и мелкую криптическую плазмиду pV; с ДНК типового лабораторного бесплазмидного штамма B.subtilis 168; с ДНК почвенных штаммов B.subtilis 604, 1356, 1431, 1513, не несущих плазмид, и с ДНК других бацилл, близких к B.subtilis 168 (B.subtilis W23, B.aterrimus ВКМВ-922, B.licheniformis В-993, B.pumilus ВКМВ-508,). Была взята также ДНК E.coli DH5a. Ни в одном случае, кроме ДНК штамма 1513, мы не обнаружили полос гибридизации. На рисунке не приведены многочисленные «пустые» дорожки с ДНК штаммов, не давших полос гибридизации (кроме ДНК B.subtilis 168).
У B.subtilis известно крайне мало IS-элементов. lSBsu2 была вторым IS-элементом, обнаруженным у B.subtilis [первый lS-элемент, обнаруженный у B.subtilis (natto), -IS4Aral - негомологичен \SBsu2 и принадлежит семейству IS4 - Nagai et al., 2000] и первым, локализованным на плазмиде. В 2007г. была опубликована в GenBank нуклеотидная последовательность еще одного, третьего, IS-элемента, IS256Ay«l из штамма B.subtilis (natto)-, величина последовательности составляла 1369 пн. IS256&ul содержала ген транспозазы (1248 пн), окруженный парой инвертированных 26-членных повторов. IS256ñ«/l и ее ген транспозазы на 97% оказались идентичными \SBsu2 и ее предполагаемому гену транспозазы (Kimura, Itoh, 2007). Таким образом, гомологи 1SBsu2 присутствуют в различном количестве копий в хромосомной и плазмидной ДНК ряда почвенных и промышленных штаммов B.subtilis.
З.Анализ крупных плазмид.
3.1.Поиск крупных плазмид в штаммах B.subtilis и определение их способности к конъюгации
Имевшаяся в нашем распоряжении коллекция природных штаммов B.subtilis, выделенных из почв Москвы и Московской области, была использована также для поиска крупных плазмид. Было проверено 42 штамма коллекции, в 9 из них были обнаружены плазмиды размером более 36 тпн. Пять штаммов содержали только крупную плазмиду, другие, кроме крупной, несли также мелкие плазмиды. Еще одна крупная плазмида, р1387-3, была обнаружена ранее (см.выше). По сумме длин рестриктных фрагментов был определен размер крупных плазмид из штаммов 1899 (данные В.З.Незаметдиновой), 544 и 1387. Он составил 60 тпн, 65,1 тпн и 36 тпн соответственно.
Изучение генетики крупных плазмид бацилл мы решили начать с поиска у них способности к конъюгативному переносу. Как было сказано выше, гены mob, необходимые для переноса мелких плазмид с помощью конъюгативного аппарата крупных плазмид, широко распространены среди RCR-плазмид B.subtilis. Однако способность к конъюгации была показана до сих пор только для одной плазмиды B.subtilis (natío) - pLS20 (Koehler, Torne, 1987). При этом ни особенности самого процесса конъюгации, ни участвующие в нем гены описаны не были.
Ни один из штаммов B.subtilis московской коллекции не проявлял какой-либо устойчивости к антибиотикам. Плазмиды не имели заметных фенотипических проявлений, т.е. были криптическими. Следовательно, мы не могли наблюдать непосредственно перенос крупных плазмид. Мы ввели посредством трансформации протопластов в четыре штамма B.subtilis, имевших крупные плазмиды (1387, 1420, 1440, 1899), мелкую плазмиду pUBllO, несущую маркер устойчивости к канамицину и определяющую KmR фенотип клеток. Тот факт, что данные штаммы получили pUBllO, был подтвержден результатами электрофореза. В наших опытах к мобилизации pUBl 10 оказалась
способной лишь плазмида р1387-3 из штамма В.яиЫШз 1387. Мобилизация шла только на поверхности фильтров и при условии, что реципиентом был штамм В.БиЬиИз ЯМ125 с нарушенной системой рестрикции-модификации. Частота конъюгативного переноса для р1387-3 была низкой (10"7). Конъюгация с р1387-3 шла нерегулярно. Были опыты, в которых на чашках вырастало лишь несколько колоний конъюгантов или их не было вовсе.
Таким образом, проверенные крупные плазмиды из московской коллекции были неспособны к мобилизации, или она шла у них с предельно низкой частотой. В поисках удобной модели конъюгативного переноса для ДяиМ/« мы обратились к белорусской коллекции природных штаммов В.зиЬШ'м. Наши коллеги из Белорусского Государственного Университета обнаружили в этой коллекции штаммы с крупными плазмидами (ТКок е! а1., 2003). Мы использовали для поиска конъюгативного переноса штамм В.зиЫШя 19, несущий крупную плазмиду р19. Плазмида р19 оказалась способной к мобилизации мелких плазмид и к самопереносу с высокой частотой. Как оказалось позже, другие крупные плазмиды этой коллекции очень схожи друг с другом по способности к конъюгации. Изучению закономерности этих процессов посвящен следующий раздел работы.
Штамм В.яиЫШз 19 был выделен из лесной почвы Белоруссии. Он содержит две плазмиды: крупную р19 с тета-типом репликации (Ткок е1 а!., 2003) и мелкую, рУ, реплицирующуюся по сигма- (ЛС-) типу. Размер р19 был определен В.З.Незаметдиновой по сумме фрагментов рестрикции ЕсоШ и Крп\ и составил около 97 тпн. Размер рУ был определен нами также по сумме фрагментов рестрикции и составил 8,5 тпн (табл.1). Обе плазмиды были криптическими. В клетки штамма В.зиЬйШ 19 посредством трансформации лизоцимных протопластов была введена плазмида риВПО. Были получены производные штамма ДгаШй 19, лишенные рУ (они возникали спонтанно) или р19 [при выращивании штамма 19 (р19 рУ риВПО) на средах, содержащих высокие концентрации канамицина] (Лотарева и др., 2002). Получить производные штамма 19, полностью лишенные плазмид, нам не удалось.
3.2.Изучение мобилизационного переноса, осуществляемого плазмидой р19 из почвенного штамма ВлиЫШз.
Изучение особенностей конъюгативной мобилизации проводилось с использованием в качестве донора штамма 19 (р19 рУ рИВПО). В качестве реципиента был взят хорошо изученный лабораторный штамм 5.лиА//7и 168 с хромосомным геном устойчивости к хлорамфениколу (ВО 170 Стк). В скрещиваниях В.зиЫШя 19 (р19 рУ риВПО) х ВЭ170 Стк трансконъюганты, устойчивые к канамицину, стабильно появлялись с частотой около 10~3 на клетку реципиента (в отдельных опытах частота достигала 10"2) (табл.3). Конъюгация шла с одинаковой частотой на твердой и в жидкой средах. При электрофорезе плазмидной ДНК, выделенной из клонов трансконъюгантов, были видны полосы, соответствующие ДНК риВПО. Однако необходимо было исключить возможность получения реципиентом мелкой плазмиды за счет спонтанной трансформации ДНК, к которой способны клетки В^иЬИШ. Для этого в среду со смешанной культурой клеток штаммов-партнеров добавлялась ДНКаза I до конечной концентрации 100 мкг/мл. На количество возникающих трансконъюгантов обработка ДНКазой I не влияла. Чтобы исключить возможность переноса риВПО за счет трансдукции, вместо культуры донора в скрещиваниях использовался ее фильтрат (фильтр ММНрог 0,22рт). Трансконъюгантов и в этом случае обнаружено не было. Конъюгативный перенос, осуществляемый некоторыми крупными плазмидами, чувствителен к действию протеиназы (Апс1гир й а1.,1993). Мы проверили, влияет ли обработка протеиназой К на частоту мобилизационного переноса, осуществляемого р19. Результаты опытов показали, что частота мобилизации рШ110 при обработке клеток штаммов-партнеров протеиназой К (1 мг/мл; 30 мин.) снижалась не менее чем в 2 раза.
Выше упоминалось, что при выращивании на средах с высокой концентрацией канамицина бактерии теряли плазмидцу р19; при этом они утрачивали способность к мобилизационному переносу. Чтобы окончательно доказать, что способность к мобилизации риВПО связана с наличием в клетке
крупной конъюгативной плазмиды, была проведена блот-гибридизация плазмидной ДНК, выделенной из разных производных штамма 19,
полученных в ходе работы, как способных, так и неспособных к конъюгации. В качестве зонда был использован минирепликон р19 из плазмиды рМТЬВЭ19. И в этих опытах способность к конъюгативному переносу риВПО коррелировала с наличием в клонах крупной плазмиды р19. Потеря плазмиды рУ не влияла на способность к мобилизационному переносу мелких плазмид (табл.3, скрещивания 2, 3). Таким образом, для конъюгативного переноса мелкой плазмиды из штамма-донора В.яиЬШ'и 19 требуется наличие в штамме именно крупной плазмиды р19.
Способность р19 осуществлять мобилизацию в жидкой среде позволила определить такие параметры мобилизации, как кинетика переноса плазмид и ее зависимость от температуры. Было показано, что нарастание числа трансконюгантов в зависимости от времени контакта клеток было одинаковым
Таблица 3. Конъюгативный (мобилизационный) перенос мелких плазмид из клеток штаммов, несущих крупную плазмиду р19
№ Штаммы-доноры Штаммы-реципиенты Частота мобилизации на клетку-реципиент
1 В.5иЫШз 19 (р19 рУ риВ110) В.зиЫШз 19 (рУ) Бй* 2,0±1,21 х Ю'3
2 В.тЬШи 19 (р 19 рУ рВС16) В.тЬНШ 19 (рУ) БЦ* 1,03±0,50х 10"'
3 В.зиЬШи 19 (р19 рВС16) В.зиЫШз 19 (рУ) БИ* 4,25±3,75х Ю"'
4 В^иЬНШ 19 (р19 рВ СШтЕсоШ) В.зиЬПШ 19 (рУ) Эй* 1,05±0,05 х 10'7
5 В.тЫШз 19 (р19 рУ рВСШтЕсоШ) В.зиЫШз 19 (рУ) Бй* 0,88±0,21 х 10"5
6 ВлиЫШз 19 (р19 рУ рС194) В.зиЫШз 19 (рУ) Бй* < 10"'
7 ВжЬЧШ 19 (р19 рС194) В.аиЫИи 19 (рУ) Бй* < 10"'
8 В.тЫШз 19 (р19 рСВ20) В.зиЪШи 19 (рУ) Эй* 3,55±0,15х 10"'
9 В.тЬиШ 19 (р19 рСВ20) В.хиЬШй ВО 170 Бй* 3,37±1,21 х 10"'
при температуре 30° и 37°С; через 80 мин. оно замедлялось, и кривые выходили на плато. Конъюгация была возможна и при комнатной температуре (21 °С). Трансконъюганты в этом случае обнаруживались значительно позже; к 180 мин. количество их было максимальным, но все же примерно в 50 раз меньшим, чем при 30° и 37°С.
Мы использовали в качестве доноров и реципиентов производные штаммов B.subtilis 19 и 168, в том числе штамм 168 RM125 R' M ', лишенный системы рестрикции-модификации RI (см.далее табл.5, скрещивания 2-6). Во всех случаях частота мобилизационной передачи pUBllO оставалась постоянной и составляла 10"3. Исключением является скрещивание 5, где и донором, и реципиентом были штаммы B.subtilis 168. В этом случае частота передачи pUBl 10 падала более чем на два порядка и составляла 6,8х10"6.
Нас интересовало, способны ли в данной конъюгационной системе передаваться другие мелкие плазмиды. С этой целью в штамм B.subtilis 19 вводились разные плазмиды с сигма-типом репликации: природная плазмида B.cereus рВС16 (4630 пн;Тск), ее вариант с инверсией крупного участка гена mob рВС16invEcoRl и плазмида S.aureus рС194 (2910 пн; CmR), у которой отсутствует ген mob. Все они способны реплицироваться в клетках B.subtilis.
Было показано, что рВС16 передавалась клеткам-реципиентам примерно с той же частотой, что и pUBllO - около 10"3. В тех случаях, когда донор нес производную рВС16 с инверсией части гена mob, частота мобилизации падала на четыре порядка. Однако, если в клетках донора, помимо р19 и pBC16/«v£coRI, содержалась мелкая природная плазмида pV, также имеющая ген mob, частота переноса плазмиды с поврежденным геном снижалась лишь на два порядка (табл.3, скрещивания 4,5). Плазмида рС194, лишенная и гена mob, и участка ortY, была абсолютна неспособна к мобилизационному переносу (табл.3, скрещивания 6, 7). Таким образом, для переноса необходимо наличие на мобилизуемой плазмиде огГГ и неповрежденного гена mob. Мобилизация мелких плазмид у B.subtilis в описанной системе, вероятно, осуществляется по механизму донации. Изменений молекулярной массы плазмид, как мелких, так
и крупных, выделенных из клеток трансконъюгантов (что характерно для процесса кондукции), никогда не наблюдалось.
Мы проверили, существует ли возможность конъюгативной мобилизации pUBllO из клеток B.subtilis 19 (р19 pV pUBllO) в клетки реципиентов, принадлежащих к другим видам. При изучении межвидового конъюгативного переноса pUBllO (гетероконъюгации) в качестве реципиентов были использованы штаммы грам-положительных микроорганизмов: 12 разных видов рода Bacillus, а также штамм Staphylococcus aureus. Для всех штаммов-реципиентов предварительно были получены спонтанные мутанты, устойчивые к стрептомицину. Результаты представлены в табл. 4. Мобилизация шла с разной частотой. В опытах, где реципиентами были штаммы B.subtilis (natto), В. megaterium, В. polymixa, перенос мелкой плазмиды шел с достаточно большой эффективностью. В то же время клетки других видов бацилл при скрещиваниях получали pUBllO с заметно меньшей частотой: 10"4 в случае реципиента В. licheniformis ; Ю-6 в случае реципиентов В. sphaericus, В. pumilus, В. niger, В. globigii и В thuringiensis. В скрещиваниях B.subtilis 19 со штаммами В. mesentericus и S. aureus трансконъюгантов не возникало.
Таблица 4. Частота мобилизации pUBllO при скрещиваниях
B.subtilis 19 (р19 pV pUBllO) с другими видами бактерий.
Бактерии-реципиенты Частота возникновения трансконъюгантов
B.subtilis BD 170 Str* 6,2±1,24 x 10"J
[¡.megatherium Str14 1,7±1,21 x 10-1
В.mesentericus MB74 Str* <10"'
B.aterrimus BKMB-922 Str* 1,24±0,92 x lO"3
B.sphaericus 2362-F Str* 8,7±1,0 x 10"°
B.licheniformis RUB 503-1 StrK 2,4±0,48 x 104
B.subtilis (natto) B3364 Str* 1,0±0,46 x Ю-'
B.amyloliquefaciens SK52 Str* 3,0±0,70 x 10-J
B.pumilus BD2002 Str* 1,0±0,43 x 10'"
B.polymixa BKMB-514 Str* l,0±0,30x 10''
B.niger PB3264 Str* ^ШиЗОхЮ41
B.globigii PB512 Str* l,68±l,05x 10""
B.thuringiensis40 Str* 7,4±0,31 x Ю-0
Staphylococcus aureus Wood 46 Str* <io-'
Возможность мобилизации плазмид при температуре 21°С, обычной для летних месяцев в средней полосе России, способность к межвидовому переносу, наличие у большинства изученных мелких бациллярных плазмид природных штаммов генов mob и ptr, необходимых для конъюгативной мобилизации, - все это позволяет предполагать, что конъюгативный перенос плазмид с участием р19 активно происходит в природных условиях и может играть значительную роль в процессах генетического обмена между штаммами D.subtilis и даже между представителями разных видов бацилл.
3.3.Изучение конъюгативного переноса собственно крупной плазмиды
р19
Все описанные выше эксперименты были поставлены с целью изучения мобилизации мелких плазмид. Между тем, очень важно было исследовать особенности переноса собственно крупной конъюгативной плазмиды. Плазмида р19 является криптической, что затрудняет исследование ее собственного переноса при конъюгации. Зафиксировать передачу р19 можно было, лишь проверяя на способность к мобилизации трансконъюганты, получившие мелкую плазмиду, а также по данным гибридизации, используя клонированный репликон р19 в качестве зонда. И то, и другое - процедура достаточно трудоемкая и дает возможность проверить лишь несколько десятков клонов. Поэтому для изучения закономерностей «самопереноса» р19 в данную плазмиду с помощью инсерционного мутагенеза был введен ген хлорамфениколацетилтрансферазы (cat), определяющий устойчивость к хлорамфениколу. В качестве источника гена cat была использована плазмида рЗ (рис.4). рЗ представляет собой плазмиду E.coli pUC19 с встроенным в полилинкер геном cat из плазмиды рС194; рЗ не способна реплицироваться в клетках B.subtilis. На плазмиде р19 имеется более 20 сайтов рестрикции ЕсоШ\ рЗ несет только один сайт узнавания этой рестриктазы. ДНК плазмид рЗ и р19 была обработана рестриктазой EcoRI, а затем смесь фрагментов дотировали. Полученной лигированной смесью трансформировали клетки штамма B.subtilis
19 (pi9). Отбирались клоны, устойчивые к хлорамфениколу, которые несли р 19 со встроившимся за счет гомологичной рекомбинации геном cat. Интеграция рЗ могла сопровождаться делецией части генов р 19. Было получено несколько десятков клонов B.subtilis 19 (р19::рЗ) CmR, которые были проверены на способность к конъюгативному переносу р19::рЗ. Около половины из них (31 клон) оказалась неспособной к конъюгации (эти клоны были в дальнейшем использованы для клонирования учатков ¿га-района р19); другие клоны передавали р19::рЗ с различной частотой. Был отобран клон, обозначенный как B.subtilis 19 (р19саг), способный передавать р19::рЗ в ходе конъюгации с максимальной частотой и стабильно сохранявший Стк-фенотип при росте в
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
Clal
Clal
Рестрикция EcoRI, лигирование, трансформация клеток B.subtilis 19 (pi9), селекция no CmR
Рестрикция Clal, лигирование
EcoRI
рЗ
I 6-21 inn jl
Ж. Я
EcoRI
Трансформация клеток E.coli, селекция no ApR CmR
Clal
Clal
Clal
Рисунок 4. Маркирование плазмиды р19 с помощью плазмиды рЗ и клонирование фрагментов ДНК р19, прилегающих к вставке рЗ.
неселективных условиях. При скрещивании этого штамма с реципиентом B.subtilis 19 (pV pUBl 10), был получен штамм B.subtilis 19 (pl9cai pV pUBl 10) CmR KmR, используя который в качестве донора при конъюгации, можно было проследить как передачу реципиенту крупной плазмиды р19са/, так и мобилизацию pUBl 10. Этот клон был использован в дальнейшей работе.
Чтобы определить частоту и параметры конъюгативного переноса р19, был проведен ряд скрещиваний (табл.5). Как и при изучении мобилизационного переноса pUBllO, для предотвращения возможной спонтанной трансформации в конъюгационные пробы добавлялась ДНКаза I до концентрации 100 мкг/мл. Чтобы исключить возможность переноса маркера за счет трансдукции, были проведены скрещивания с использованием вместо культуры донора ее фильтрата (фильтр Millipore 0,22pm). Трансконъюгантов в этом случае обнаружено не было. Плазмидный состав клонов трансконъюгантов был подтвержден результатами электрофореза плазмидной ДНК, выделенной из клеток донорного штамма и трансконъюгантов.
Как показали результаты, крупная плазмида передавалась с очень высокой частотой при использовании в качестве партнеров штаммов B.subtilis 19 (pl9cai pV pUBllO) и 19 (pV) StrR-около 70% клеток реципиента получали р19са/ (в некоторых опытах частота конъюгации достигала 1). Когда же в качестве реципиента использовался лабораторный штамм B.subtilis 168 39-22 StrR, частота переноса р19cat была более чем на два порядка ниже (табл.5, скрещивание 3). Возможно, у штаммов B.subtilis 19 и 168 имелись различные системы рестрикции-модификации. Чтобы проверить это предположение, были поставлены опыты, где реципиентом был штамм 168 RM 125, лишенный системы рестрикции-модификации RI. Частота конъюгативного переноса р 19cat в таких скрещиваниях достигала 2,5x10"' (табл.5, скрещивание 4). Штамм B.subtilis 168, получивший р19са/, также оказался способен быть донором (табл.5, скрещивание 5), хотя и со сниженной эффективностью. В скрещиваниях, где в качестве реципиента был взят вариант лабораторного штамма B.subtilis\6b AMT EmR, р19ся/ передавалась клеткам с частотой
Таблица 5. Коиъюгативиый перенос плазмид при использовании в качестве партнеров при конъюгации различных штаммов Дя/Ши.
№ скре щива ния Штаммы-доноры Штаммы-реципиенты Частота переноса pl9cat Частота мобилизации pUBllO
1 B.subtilis 19 (р19са/) B.subtilis 19 (pV) Str* 7,7 ±0,5x10-' -
2 B.subtilis 19 (pl9cat pV pUBllO) B.subtilis 19 (pV) Str* 6,2 ±0,9x10"' 1,5 ±0,7xl0"3
3 B.subtilis 19 (pl9ca/pV pUBllO) B.subtilis 168 39-22 Str* 3,3 ±2,3xl0'3 4,3 ±3,4xl0"3
4 B.subtilis 19 (pl9co< pV pUBllO) B.subtilis 168 RM125 StrR 2,5 ±0,5x10"' 1,4 ±0,7x10'3
5 B.subtilis 168 39-22 (pl9ca/pUB110) B.subtilis 168 AMT Em" 3,2 ±2,0x10"2 6,8 ±4,0xl0"6
6 B.subtilis 19 (p\9catpV pUBllO) B.subtilis 19 (pi9) Str" 3,0 ±0,lxl0"2 2,5 ±0,4xl0'3
7 B.subtilis 19 (pV pUBllO) B.subtilis 19 (pV) Str* - <10"7
около 3x10"2. Таким образом, кроме предполагаемого действия систем рестрикции-модификации, на частоту переноса, безусловно, влияют и другие, еще неизвестные факторы. Возможно, причинами снижения частоты конъюгации и, особенно, мобилизации (почти на 3 порядка) в случае, если и донором, и реципиентом являются производные лабораторного штамма B.subtilis 168, могут быть меньшая частота образования пар клеток донора и реципиента или недостаточно эффективный перенос плазмидной ДНК между конъюгирующими клетками из-за каких-то особенностей строения клеточной стенки.
Присутствие плазмиды р19 в штамме-реципиенте B.subtilis 19 приводило к снижению частоты переноса крупной плазмиды в 20 раз по сравнению с опытами, в которых использовался утративший такую плазмиду реципиент (табл.5, скрещивания 2,6). Снижение эффективности конъюгативного переноса, если клетка-реципиент уже несет родственную плазмиду, описано для различных конъюгативных плазмид. Этот так называемый феномен поверхностного исключения (surface exclusion) хорошо изучен у E.coli и других
27
бактерий кишечной группы (Garcillan-Barcia, de la Cruz, 2008). Однако частота мобилизации pUBllO в подобных опытах не изменялась; вероятно, на частоту переноса в случае р19 влияли скорее другие факторы, например, несовместимость плазмид, связанная с репликацией.
Было изучено влияние соотношения клеток донора и реципиента на частоту переноса р 19cat в скрещиваниях B.subtilis 19 (р19са/ pV pUBllO) х B.subtilis 19 (pV) StrR. Перенос происходил с одинаково большой частотой (10'1) в широком диапазоне соотношений клеток донора и реципиента (от 103 клеток донора на 1 клетку реципиента до 1 клетки донора на 102 клеток реципиента). Частота переноса снижалась лишь если на клетку донора приходилось 103 и более клеток реципиента.
Чтобы выяснить, через какое время после контакта клеток донора и реципиента начинается перенос р19, мы определяли число трансконъюгантов в скрещивании B.subtilis 19 (р19са/ pV pUBllO) х B.subtilis 19 (pV) Str* в опытах с последовательным прерыванием конъюгации. Чтобы свести к минимуму конъюгацию на твердой среде, начальное соотношение числа клеток донора и реципиента было взято как 1: 10000. Для этого в момент времени "0"смешивали 0,8 мл среды LB, 0,1мл культуры реципиента (107клеток) и 0,1мл культуры донора (103 клеток). Результаты представлены на графике (рис.5). Передача р19cat начиналась непосредственно сразу после смешивания клеток штаммов-партнеров и достигала максимума через 3 часа. Перенос мелкой плазмиды начинался лишь через 60 минут после начала контакта клеток донора и реципиента.
Была изучена возможность конъюгативной передачи р19 из клеток B.subtilis в клетки других видов бацилл. Для определения частоты переноса р19 в качестве донора мы использовали штамм B.subtilis 19 (р19са/ pV pUBllO). Реципиентами служили штаммы 6 других видов рода Bacillus. Передача р19 шла с различной частотой (табл. 6). Наиболее эффективно р19 передавалась в клетки B.subtilis 19. Менее эффективно передача р19 происходила в клетки других видов (B.amiloliquefaciens, B.megaterium, B.pumilus, B.polymyxa); частота
/
о
60
120 180 240
время контакта клеток, мин
—-р19 —рЦВ110
Рисунок 5. Динамика конъюгативной передачи плазмид р19са( и риВ110 в зависимости от продолжительности контакта клеток. В скрещиваниях использовали штамм В^иЬи!^ 19 (р19са/ рУ риВ110) в качестве донора и штамм В.виЫШ! 19 (рУ) Зи^ в качестве реципиента.
Таблица 6. Эффективность конъюгативного переноса р19ся/в клетки других видов бацилл. В качестве донора был использован штамм В.йиЬНШ 19 (р19са/ рУ рУВ110).
Штаммы-реципиенты Частота конъюгативной передачи р19с<з/
В.зиЬИ/и 19 Эй7 8,0±2,0х10"'
В.атИоИдие/ааепз 5К-52 Зй7 1,9±1,0х10"'
B.megaterium Бй* 2^1,0x10""
В.ритИш ВО 2002 БЬ1 ^(Ш.ОхЮ-1
В.ро1утуха ВКМВ 514 Бй1 3,7± 1,5x10°
В.зиЫШз (паПо) В3364 51/ <10"'
В.Шегптиз ВКМВ-922 <10-/
переноса в этих скрещиваниях была снижена на 1 - 4 порядка. В клетки В.яиЫШз (паио) и В.Меггипив р19см не передавалась. Таким образом, плазмида р19 определяет способность к конъюгативному переносу как мелких плазмид, так и самой себя в клетки различных видов бацилл.
3.4.Клонирование, определение нуклеотидной последовательности и анализ секвенированных фрагментов ДНК плазмиды р19.
Как было указано выше, конъюгативный перенос у грам-положительных микроорганизмов мало изучен; это полностью относится и к В.ииЫШй. Не известна и нуклеотидная последовательность ни одной из конъюгативных плазмид В.йиЫШз. На следующем этапе работы мы попытались клонировать фрагменты /га-района плазмиды р19 В.йиЫШя и определить их нуклеотидную последовательность. Секвенирование фрагментов плазмиды р19 было проведено в центре ДНК-диагностики ИОГен РАН.
Как уже упоминалось, мы получили 31 клон В.БиЬИШ 19 (р19::рЗ) Стк Тга\ в которых плазмида р19 была помечена геном сМ; эти клоны были не способны служить донорами при конъюгации. Мы использовали эти производные р19 для клонирования и последующего секвенирования фрагментов /га-района плазмиды (рис.4). Для этого плазмидная ДНК клонов обрабатывалась рестриктазой С1а\ с последующим лигированием и трансформацией клеток Е.соИ ОН5(а). Селекция велась по маркерам Ст и Арк. На плазмиде рЗ нет сайтов узнавания для рестриктазы С 1а]; на р19 их около 20. Мы ожидали получить гибридные плазмиды рЗ-19, состоящие из вектора рЗ и двух ЕсоШ-С1а\ фрагментов ДНК р19; в исходной плазмиде р19 эти два фрагмента, скорее всего, не граничили друг с другом. Предполагалось, что клонированные фрагменты р19 должны содержать ген(ы), повреждение которых приводит к неспособности плазмид р19::рЗ осуществлять конъюгацию.
Для 11 плазмид серии рЗ-19 были построены рестриктные карты и определены нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК, непосредственно прилегающих к рЗ, с помощью стандартного праймера риС/М13Р и праймера са?, синтезированного по известной нуклеотидной
зо
последовательности гена cat. Это позволило определить, что четыре плазмиды идентичны; для дальнейшей работы была использована одна из них. Остальные плазмиды отличались друг от друга, хотя некоторые из них несли как разные, так и одинаковые фрагменты ДНК р19. Эти 8 плазмид были использованы для определения нуклеотидных последовательностей клонированных на них фрагментов ДНК р19. Кроме того, для определения нуклеотидной последовательности была использована плазмида pBIuescript-6 из библиотеки фрагментов ДНК р19, клонированных по ЕсоШ сайту в клетках E.coliXLI Blue. Она была обнаружена при гибридизации библиотеки клонов с зондом -фрагментом ДНК одной из плазмид серии рЗ-19.
Для определения нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК р19 мы, во-первых, секвенировали плазмиды серии рЗ-19 со стандартных праймеров (pUC/M13F и cat), что позволило определить нуклеотидные последовательности концевых участков клонированных фрагментов р19. Во-вторых, проводили субклонирование плазмид серии рЗ-19. Всего было получено 22 плазмидных субклона, строение которых подтверждено рестриктным анализом. Все они были секвенированы с использованием стандартных праймеров (pUC/M13F, pUC/M13R, cat), что позволило определить нуклеотидные последовательности концевых участков. Затем на основе полученных нуклеотидных последовательностей создавали специфические праймеры. Всего их было синтезировано 87. Определение нуклеотидной последовательности ДНК со специфическими праймерами проводили на матрицах плазмид рЗ-19 и плазмидных субклонах.
Клонированные на данных плазмидах фрагменты ДНК р19 соответствовали пяти контигам (рис.6). Эти контиги депонированы в GenBank : 2021 пн (№ FJ434455), 4518 пн (EF506609), 22728 пн (№ FJ434456), 739 пн (№ FJ434457), 2932 пн (EF506610). Идентификация ORP на секвенированных фрагментах, поиск в базах данных гомологов белковых продуктов, соответствующих этим ORF, и сравнение с белками /га-районов других плазмид грам-положительных бактерий (см.далее) позволили предположить,
tra-район ( \
ЕСС ЕС ССЕЕ Е
2021 27814 739 2932
Рисунок 6. Расположение ссквенированных контигов на плазмиде р19. Цифрами указаны величины фрагментов в пн. Буквами обозначены сайты рестрикции ферментов С1а\ (С) и £coRI (Е). Положение фрагментов 739 пн и 2932 пн относительно других контигов неизвестно.
что фрагменты ДНК р19 величиной 2021 пн, 4518 пн и 22728 пн находятся в исходной плазмиде именно в таком порядке, как они изображены на рис.6, и близко друг от друга. Используя праймеры, синтезированные по конечному участку ДНК фрагмента 4518 пн и начальному - фрагмента 22728 пн, мы получили посредством реакции ПЦР фрагмент ДНК. После определения нуклеотидной последовательности его размер оказался равен 568 пн. Таким образом, нам удалось соединить контиги 4518 пн и 22728 пн. Это позволило уточнить величины ORF5 и ORF 10 по сравнению с определенными ранее (GenBank № EF506609 и № JF434456). В конечном счете, мы определили нуклеотидную последовательность четырех контигов р19: 2021 пн; 27814 пн; 739 пн; 2932 пн; их суммарный размер - 33506 пн (рис.6).
На секвенированных фрагментах ДНК плазмиды р19 идентифицировано 39 ORF. Из них 33 соответствуют целым ORF, четыре (ORF1, ORF 9, ORF35, ORF38) - З'-концу генов, две (ORF34, ORF39) - 5'-концу генов. Подавляющее большинство ORF транскрибировалось в одном направлении, кроме двух ORF из контига 2932 пн. Это может быть косвенным свидетельством однонаправленной репликации плазмидной ДНК. 89,6% нуклеотидной последовательности было занято собственно ORF, таким образом некодирующие участки занимают малую часть секвенированной последовательности. Расстояния между концом одной ORF и началом следующей ORF в основном были невелики (0-50 пн); в некоторых случаях
начало одной ORF и конец другой накладывались друг на друга. Вероятно, гены плазмиды организованы в опероны. В нескольких случаях межгенное расстояние составляло несколько сот пн. В таких участках были идентифицированы промоторы и ориджины - как репликации, так и конъюгативного переноса. Величина гипотетических белков, соответствующих ORF, колебалась от 50 аа (меньшие белки не идентифицировали) до 843 аа. ГЦ состав фрагментов ДНК составлял 30-34%; для отдельных ORF он колебался от 29% до 39%. Перед всеми ORF, имеющими 5'-конец, идентифицированы сайты связывания с рибосомами. Перед ORF2, ORF7, ORF8, ORF11, ORF22, ORF31, ORF34 идентифицированы -35 и -10 районы промоторов. Белковые продукты, соответствующие 26 ORF, имеют гомологи в базах данных. Продуктам десяти ORF на основании этой гомологии можно приписать определенные функции (рис.7).
Чтобы подтвердить конъюгативные функции обнаруженных ORF, мы проводили их инактивацию посредством инсерционного мутагенеза. Для этого клонировали фрагменты генов (расположенные не на концах, а в середине генов) величиной от 0,23 до 0,9 тпн на векторных плазмидах pMTL21C и рЗ. Эти плазмиды не способны реплицироваться в клетках В. subtilis, но несут экспрессирующийся в них селективный маркер, ген caí (обусловливающий CmR фенотип). Чтобы удостовериться в том, что клонированные фрагменты действительно соответствуют нужным ORF, определяли их нуклеотидные последовательности в соответствующей гибридной плазмиде со стандартных праймеров pUC/M13F, pUC/M13R и caí. Полученными гибридными плазмидами проводили трансформацию клеток штамма B.subíilis 19 (р19). Отбор трансформантов осуществляли по Стя-фенотипу. Гибридные плазмиды, вероятно, встраивались в участки тех ORF, фрагменты которых были на них клонированы, посредством гомологичной рекомбинации, тем самым нарушая функциональную целостность соответствующих ORF. Полученные трансформанты В. subiilis 19 (pl9::pMTL21C)CmR и В. subtilis 19 (pl9::p3)CmR были проверены на способность к конъюгативной передаче р19 в скрещиваниях
+
35 36 37
, '-'-' 202.
+ + +
+ + 10 1 2 3 4 (VirD4) 5 (VirBU) * 11
+ 12
I_I_I-1_I_I_I-1-1_I_I
I 10000
15 17 ОПТ (релаксаза)
13 14 (VirB4) 16
(лизоцим) 18 4 19 20 21 • 22 23 24
*-»-*■ -*■-►-► I -»•-»•-
,„„ I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I
10001 20000
(ДНК-топоизомераза)
31 ~ 33. .
► Т->-*->1-
I_I_I_I_I_I_I-1_I
20001 27814
oriV
6 - 7
(гер)
I_I_I_I
1 2932
Рисунок 7. Генетическая карта четырех секвенированных коитигов плазмиды р19.
Горизонтальные стрелки обозначают ORF, направление стрелок - направление транскрипции ORF, цифры над стрелками соответствуют номерам ORF. Вертикальные стрелки обозначают ориджины конъюгационного переноса (опТ) и вегетативной репликации (oriV). Вертикальными линиями с утолщениями обозначены идентифицированные промоторы. + и - отмечают ORF, инактивация которых, соответственно, приводит к снижению способности р19 к конъюгативному переносу или не влияет на него. Заштрихованный участок ДНК принадлежит /га-району р!9.
с реципиентами В. subtilis 19 (pV)StrR и В. subtilis\9 (pV)TetR. В качестве положительного контроля использовался штамм-донор В. subtilis 19 (pl9oz/) CmRTra+, частота конъюгации которого составляла до 1 на клетку реципиента. Таким образом нами было проверено 10 ORF. Как оказалось, инактивация ORF1, 4, 10, 12, 17 и 35 приводит к снижению частоты передачи р19 на 3-5 порядков в сравнении с контролем, что указывает на участие продуктов данных ORF в конъюгативном переносе плазмиды. Нарушение структуры ORF 6, 24, 25 и 32 не влияло на конъюгативные свойства плазмиды, и частота конъюгации не отличалась от контроля (рис.7). Вероятно, продукты данных ORF не участвуют в процессе конъюгативного переноса р19. Мы не выясняли, почему повреждение ORF вызывает значительное снижение, но не полное подавление конъюгации. Скорее всего, это связано с тем, что число копий плазмиды р19 может быть больше 1 на клетку, и наряду с мутантными, в клетках могла присутствовать нормальная плазмида.
Большая часть контига 2932 пн оказалась полностью гомологичной гер-району плазмиды pBS72. Эта крупная плазмида, как и р19, выделена в Белоруссии из природного штамма B.subtilis (Titok et al., 2003). Район гомологии содержит две целые ORF р19 (ORF8, соответствующую герА гену, и ORF7), конец ORF9, а также ориджин репликации (or/'V) (рис.8). Для того, чтобы подтвердить наличие на данном фрагменте функционально активных генов, необходимых для репликации, мы сконструировали гибридную
orf6
ORF7 —►
ORF8
ORF9
pBlueskript-6
£coRl figfll
h-
orN \
£coRI
EcoRl
ORF1 - RepA
ORF3
Bgtll
-4
ORF4
pMTLBS72
Рисунок 8. Сопоставление £соЯ1-фрагмснта pl9 (2932 пн), клонированного на pBluescript-б, и гомологичного ему Д?Л1-фрагмента pBS72 (3081 пн), клонированного на pMTLBS72.
плазмиду рбcat. Она состояла из фрагмента ДНК р19 величиной 2932 пн, вектора E.coli pBluescript и кассеты с геном cat. Полученная плазмида рб cat была способна трансформировать клетки B.subtilis и реплицироваться в них. Вероятно, фрагмент ДНК р19 величиной 2932 пн действительно несет функционально активный rep-район р19. На контиге 2932 пн слева от гер-района на участке ДНК, который не был секвенирован у pBS72, располагалась еще одна ORF - ORF 6. Она соответствует небольшому белку (129 аа), содержащему НТН (helix-turn-helix) мотив, свойственный ДНК-связывающим белкам. Инактивация этой ORF не влияла на способность р19 к конъюгативному переносу. Таким образом, ORF б не является необходимым геном конъюгации, однако нельзя исключить какого-то (необязательного) участия продукта этого гена в конъюгативном процессе.
Контиги 2021 пн и 27814 пн содержали ORF, белковые продукты которых были гомологичны белкам конъюгации различных грам-положительных микроорганизмов. Характеризуя предполагаемые функции белковых продуктов ORF р19, которые могут быть вовлечены в процесс конъюгации, мы старались сравнивать их с компонентами VirB-VirD системы A. tumefaciens, являющейся модельной для описания системы секреции 4 типа (T4SS) и ее частного случая - mating pair formation (mpf) комплекса конъюгации (Christie, 2001; Schroder, Lanka, 2005). Ниже приведен перечень белковых продуктов идентифицированных ORF контигов 2021 пн и 27814 пн, для которых можно предположить определенные функции.
1. Продукты ORF4, ORFIO, ORF15 - гомологи VirD4-, VirBll-, VirB4-подобных белков. Это крупные белки, имеющие АТФ-связывающий и АТФ-азный домены. Они функционируют в виде гомомультимеров и являются «энергетическими моторами» конъюгации (Atmakiri et al., 2004). Эти белки являются универсальными для различных систем конъюгации - они обнаружены и у грам-отрицательных, и у грам-положительных микроорганизмов, хотя в некоторых системах конъюгации у грам-положительных бактерий VirBll-подобные белки могут отсутствовать
(Grohman et al., 2003). Инактивация ORF4 и ORFIO подавляет способность р19 к конъюгации, что подтверждает необходимость соответствующих белков для этого процесса.
2.Продукт ORF26 также имеет гомологию с Ун04-подобными белками. Однако его величина (200 аа вместо обычных для гомологов этого белка 700-800 аа), отсутствие свойственных Уп04-подобным белкам консервативных доменов и гомология с УЮ4-подобными белками не только продукта самой ORF26, но и аминокислотной последовательности, которая может быть транслирована с ДНК межгенного района ORF26 - ORF27, позволяют предположить, что ORF26 является псевдогеном. Возможно, ORF26 является продуктом дупликации ORF4 и последующих делеций и других перестроек гена.
3. По нашим данным, ORF1 необходима для процесса конъюгации. Продукт ORF1 имеет небольшую гомологию (около 30% идентичных аминокислот) с несколькими белками грам-положительных микроорганизмов, содержащими TOPRIM-домен, характерный, в том числе, для DnaG-праймаз и топоизомераз. Однако сам белок, соответствующий ORF1, такого домена не имеет - возможно потому, что мы определили лишь часть нуклеотидной последовательность гена, без его начала. Нельзя исключить возможности того, что данный белок имеет топоизомеразную активность.
4.Продукт ORF 12 - крупный белок, также необходимый для конъюгации р19; на N-конце он имеет множественные трансмембранные домены (5 по данным программы ТМНММ2.0 и 7 - по данным программы InterProScan). Эта особенность белка позволяет предполагать, что он, возможно, является функциональным аналогом конъюгативного белка ТсрН плазмиды pCW3 C.perfringens, который, в свою очередь, содержит VirB6-подобный домен (Teng et al., 2008). Белок VirB6 является образующим белком конъюгативного канала и взаимодействует как с передаваемой нитью ДНК, так и с другими VirB-белками (Schroder, Lanka, 2005).
5.Продукт ORF 17 - лизоцим-подобный белок, имеющий траисгликозилазиый и NLP/P60 домены. Вероятно, он является функциональным аналогом VirBl-подобных белков и вызывает частичное разрушение клеточной стенки.
6.Продукт ORF21 - гомолог продукта ORF34 плазмиды pHTbeta E.faecium, который, вероятно, является релаксазой (Tomita, Ike, 2005). Релаксаза - важнейший и универсальный компонент различных систем конъюгации; этот фермент осуществляет одноцепочечный разрыв в передаваемой нити ДНК в специфическом участке, т.н. nie-сайте oríY, и ковалетно связывается с 5'-концом ДНК. Это событие инициирует процесс конъюгативного переноса ДНК. Как и продукт ORF34 pHTbeta, белок, соответствующий ORF21 р19, имеет свойственные релаксазам-никазам четыре аминокислотных мотива. Он может рассматриваться как функциональный аналог VirD2 белка плазмиды Ti. Белки, гомологичные продукту ORF21 р19, встречаются у различных грам-положительных микроорганизмов, в том числе у плазмид pAW63 и pFR55 B.thuringiensis, рХ02 B.anthracis, и, вероятно, составляет новую группу релаксаз, отличную от описанных (Francia et al., 2005; Garcillan-Barcia et al., 2009).
7.Продукт ORF32 является ДНК-топоизомеразой I/III типа. Активность этого гена не является необходимой для осуществления конъюгативного переноса. Однако, ДНК-топоизомеразы являются компонентами многих конъюгативных систем (Zehner et al., 2000).
Белковые продукты ORF13, ORF14, ORF18, ORF20 имеют много гомологов в базах данных среди грам-положительных микроорганизмов, хотя их функции неизвестны
Вблизи от гена релаксазы (ORF 21), между ORF18 и ORF19, расположен протяженный некодирующий район (271 пн), содержащий прямые и инвертированные повторы; в одном из плечей инвертированного повтора можно выделить последовательность нуклеотидов, характерную для nie-сайта
oríY мобилизуемых плазмид суперсемейства pMV158 (ANNNTG) (Francia et al., 2005). Мы полагаем, что в данном районе находится oriT плазмиды р19.
Исходя из результатов инактивации различных ORF р19 и сведений о гомологии белковых продуктов этих ORF с белками баз данных, мы полагаем, что к /га-району плазмиды р19 могут быть отнесены контиг 2021пн и часть (17893 пн; ORF1 - ORF21) контига 27814пн. Это составляет 19914 пн и соответствует 20 ORF (рис.7). Правомерность такого разделения контига 27814 пн на две части подтверждает тот факт, что между ORF21 и ORF22 находится промотор. Особенностью белков fra-района является то, что они часто имеют трансмембранные районы: 12 из 18 белков /га-района р19 имеют сигнальные последовательности или трансмембранные участки; подобные участки имеют только 4 из 17 белков, не отнесенных нами к tra-району (здесь учтены белки, для которых известен N-конец).
По данным анализа нуклеотидных последовательностей конъюгативных плазмид, ira-район составляет несколько меньше половины величины плазмиды (Grohmann et el., 2003; Van der Auwera et al., 2005). Так как величина р19 составляет около 97 тпн, то можно предположить, что /га-район р19 имеет величину около 45 тпн. Следовательно, мы определили нуклеотидную последовательность ДНК примерно половины /га-района р19. Таким образом, использованный нами метод (маркирование плазмиды р19 с помощью гена cat, отбор CmRTra" вариантов штамма B.subtilis 19 и клонирование прилежащих к гену cat фрагментов ДНК р19) позволил определить нуклеотидную последовательность значительной части /га-района р19.
3.5.Поиск у других микроорганизмов систем конъюгации, гомологичных системе конъюгации р19.
Представляло интерес выяснить, существуют ли гомологи не только отдельных генов конъюгации р 19, а всей их совокупности, т.е. существует ли какая-либо система конъюгации, родственная таковой р19. Результаты поиска в GenBank представлены в табл. 7. По числу гомологичных белковых
продуктов, соответствующих ORF /га-района р19 (16 из 20), наиболее близка р19 система конъюгации штамма B.thuringiensis IBL200. Однако порядок расположения генов в /га-районах р19 и штамма IBL200 различен. Возможно, отчасти это связано с тем, что определение нуклеотидной последовательности ДНК штамма IBL200 не закончено и находится в стадии draft assembly. Кроме того, еще 10 организмов - все они грам-положительные - имеют каждый от 9
Таблица 7. Результаты поиска в GenBank систем конъюгации, гомологичных системе
конъюгации плазмиды р19.
Микроорганизм. Плазмида Количество гипотетических белковых продуктов, гомологичных белковым продуктам 20 ORF /га-района р19
B.thuringiensis IBL200 - 16
B.pseudomycoides DSM 12442 - 12
В. thuringiensis INTA-FR7-4 pRF55 11
L. monocytogenes str. 4b H7858 pLM80 11
C. perfringens D str. JGS 1721 - 11
C. perfringens E str. JGS 1987 - 11
C. perfringens В str. ATCC 3626 - 10
C. botulinum В str. Eklund 1713 pCLL 10
C. perfringens С str. JGS 1495 - 10
C. perfringens str. 13 pCP13 10
Exiguobacterium arabatum pEspB 9
B. thuringiensis s. israelensis ATCC 35646 - 8
B.thuringiensis s.konkukian 97-27 pBT9727 8
E.faecium pHTbeta 8
B.thuringiensis s.kurstaki HD73 pAW63 6
B.anthracis str. Pasteur pX02 6
до 12 белков, гомологичных гипотетическим белкам ira-района р19. Меньшее число белков-гомологов tra-района р19 есть и у других грам-положительных микроорганизмов, в том числе у плазмиды рХ02 B.anthracis. При этом и расположение генов, кодирующих гомологичные /га-белки, очень сходно с таковыми у р19; особенно это относится к расположению соответствующих генов у плазмид pFR55 B.thuringiensis, рСР13 C.perfringens, pCLL С.botulinum В и штамма JGS 1495 C.perfringens С. Это позволило расположить фрагменты 2021 пн, 4518 пн и 22728 пн на карте р19 в определенном порядке (рис. 6). Для некоторых микроорганизмов, фигурирующих в табл.7, показано, что гены tra-района расположены на плазмидах (pRF55, pCLL, рСР13, pEspB, pLM80); в остальных случаях они, возможно, расположены на хромосомах и являются частью либо интегрированных в хромосомы плазмид, либо конъюгативных элементов (ICE). Гомологи комплекса белков /га-района р19 встречаются среди грам-положительных микроорганизмов различных видов и родов, это свидетельствует о наличии межвидового и межродового горизонтального переноса подобных генов. Однако ни один из указанных микроорганизмов не имеет гомологов всех белков /га-района р19; идентичность аминокислотных остатков в сравниваемых белках максимально составляет 61%, а для подавляющего большинства белков не превышает 40%. Различная степень гомологии белков позволяет предположить мозаичное строение /га-района р19. Следовательно, система конъюгации, определяемая плазмидой р19 имеет существенные отличия от уже описанных систем, хотя и сходна с некоторыми из них. Нужно отметить, что для белков ни одного микроорганизма из табл 7 не обнаружена гомология с белками, кодируемыми rep-районом р19. Видимо, trail rep-районы р19 имеют различное происхождение, что еще раз подтверждает модульное строение плазмид.
Мы проверили, способны ли к мобилизационному переносу другие крупные плазмиды из белорусской коллекции. Для этого в клетки семи штаммов из белорусской коллекции, содержащих крупные плазмиды, была
41
введена путем трансформации мелкая неконъюгативная плазмида рЦВИО, несущая маркер устойчивости к канамицину. Эти штаммы были использованы в качестве доноров; реципиентом служил штамм 19 (рУ) Все
проверенные штаммы из белорусской коллекции были способны к мобилизационному переносу риВ110. Частота переноса была довольно высока и колебалась от 10'3 (что равно частоте переноса риВПО, осуществляемого плазмидой р19)до 10'5.
Мы хотели также проверить наличие на других крупных плазмидах из природных штаммов В.зиЫШх генов, гомологичных генам конъюгации плазмиды р19. Для этого использовали реакцию ПЦР с праймерами, созданными для генов конъюгации р19 О ИР 15 (гомолог уг>В4) и О ИР 10 (гомолог у/УВП). Были проверены девять штаммов Дл/6</7« из московской коллекции, несущие крупные плазмиды, и один такой штамм из белорусской коллекции. Только один из проверенных штаммов - ВБ15 из белорусской коллекции - дал результаты ПЦР, идентичные таковым для штамма В.яиЫШз 19. Таким образом, судя по нашим данным, из проверенных крупных плазмид только рВ815 несет гены у;>54 и \irBW, гомологичные генам плазмиды р19. Эти данные подтверждают предположение о том, что крупные плазмиды, выделенные из почвенных штаммов В.зиЬИШ в разных местах Белоруссии, несут гомологичные системы конъюгации, существенно отличающиеся от таковых у других крупных плазмид грам-положительных микроорганизмов. Кроме того, уникальны и гер-районы этих плазмид. Таким образом, крупные плазмиды из белорусской коллекции, выделенные из разных штаммов в разных местах Белоруссии, очень сходны друг с другом. Это весьма необычный факт. Возможно, он может быть объяснен именно способностью плазмид к эффективному конъюгативному самопереносу.
ВЫВОДЫ
1. Проведен анализ плазмид из природных штаммов В.зиЬШк, выделенных в Москве и Московской области (московская коллекция) и различных районах
Белоруссии (белорусская коллекция). В 24 из 42 штаммов московской коллекции обнаружены плазмиды. Охарактеризованы 32 мелкие плазмиды из 29 штаммов обеих коллекций. Определена нуклеотидная последовательность двух плазмид: р1414 (7949 пн) и pl516S (9881 пн). По величине, характеру рестрикции и гомологии ДНК исследованные мелкие плазмиды составляют однородную группу.
2. На основании данных сиквенса и гибридизации установлено, что у изученных мелких плазмид имеются следующие модули и входящие в них гены: mob (гомологичные гены, присутствуют у всех проверенных плазмид, кроме одной); hsp (гомологичные гены, встречаются у большинства плазмид), rap (имеются у некоторых плазмид и обладают не столь выраженной гомологией). Гены модуля par не обнаружены ни у одной плазмиды. Ген hsp, кодирующий белок - гомолог белков теплового шока, обнаружен нами в составе мелких плазмид впервые.
3. В клетках B.subtilis впервые обнаружен и полностью секвенирован IS-элемент - \SBsu2 (1383 пн), находящийся на плазмиде. Установлено, что гомологи данного IS-элемента присутствуют в геноме различных штаммов B.subtilis.
4. Обнаружено, что плазмида р19 (97 тпн) из штамма B.subtilis 19 белорусской коллекции способна эффективно осуществлять конъюгативный перенос ДНК. Эффективность переноса значительно превосходит таковую для единственной известной конъюгативной плазмиды B.subtilis (natto) - pLS20. С помощью инсерционного мутагенеза плазмида р19 была маркирована геном устойчивости к хлорамфениколу, что позволило изучать различные виды и свойства конъюгативного переноса.
5. Изучены параметры самопереноса р19 и мобилизационного переноса pUBllO. Перенос идет как на твердой, так и в жидкой средах и может осуществляться в клетки других видов бацилл. Частота самопереноса достигает 1, частота мобилизационного переноса на два порядка ниже. Перенос р19 начинается сразу после контакта клеток-партнеров;
мобилизационный перенос начинается лишь через 60 минут. Частота самопереноса мало зависит от изменения количественного соотношения клеток донора и реципиента и существенно зависит от того, какие штаммы используются в качестве партнеров. Мобилизационный перенос происходит в широком диапазоне температур (21°-37°С). Мобилизация осуществляется, вероятно, по механизму донации.
6. Впервые для крупных плазмид B.subtilis определена нуклеотидная последовательность ДНК значительной части конъюгативной плазмиды р19 (33506 пн). На этой последовательности идентифицировано 39 открытых рамок считывания (ORF). Идентифицирован гер-район плазмиды р19, обусловливающий репликацию плазмиды и состоящий из гена rep (ORF8) и ориджина репликации. 20 ORF (19914 пн) могут быть отнесены к /га-району, обусловливающему конъюгативный перенос ДНК. Идентифицированы ORF, кодирующие белки-гомологи релаксазы, лизоцим-подобного белка, VirD4-, VirB4-, VirB 11-подобных белков плазмиды pTi A. tumefaciens\ идентифицирован ориджин конъюгативного переноса.
7. Крупные плазмиды из штаммов белорусской коллекции составляют однородную группу, отличающуюся от других известных крупных плазмид грам-положительных микроорганизмов по строению rep- и /га-районов.
8. Судя по результатам компьютерного анализа предполагаемых продуктов ORF, принадлежащих к /га-району р19, конъюгативная система этой плазмиды имеет частичное сходство с конъюгативными системами ряда грам-положительных микроорганизмов (роды Bacillus, Clostridium, Exiguobacterium, Listeria), хотя и отличается от них.
9. Конъюгативный перенос ДНК достаточно широко распространен у природных штаммов B.subtilis и может играть существенную роль в горизонтальном распространении генов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи
1. Полуэктова Е.У., Карандашова И.В., Сапогова Е.Ю., Прозоров A.A. Изучение гомологии природных криптических плазмид Bacillus subtilis. Генетика. 1996. Т.32. №11. С.1498-1503.
2. Полуэктова Е.У., Незаметдинова В.З., Гагарина Е.Ю., Прозоров A.A. Одновременное присутствие трех криптических плазмид разной величины в почвенном штамме Bacillus subtilis. Генетика. 1999. Т.35. № 1. С.46-49.
3. Thorsted Р.В., Thomas С.М., Poluektova E.U., Prozorov A.A. Complete sequence of Bacillus subtilis plasmid pl414 and comparison with seven other plasmid types found in Russian soil isolates of Bacillus subtilis. Plasmid. 1999. V.41. P.274-281.
4. Полуэктова Е.У., Незаметдинова B.3., Прозоров A.A. Крупная конъюгативная плазмида из почвенного штамма Bacillus subtilis. Генетика. 2000. Т.36. № 7. С.1000-1002.
5. Лотарева О.В., Полуэктова Е.У., Титок М.А., Прозоров A.A. Крупная плазмида из почвенного штамма Bacillus subtilis, осуществляющая конъюгативную мобилизацию с высокой частотой. ДАН. 2001. Т.379. № 1. С.130-131.
6. Лотарева О.В., Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Полуэктова Е.У., Титок М.А., Прозоров A.A. Конъюгативная мобилизация, осуществляемая с высокой частотой природным штаммом Bacillus subtilis, несущим крупную плазмиду. Генетика. 2002. Т.37. № 12. С.1598-1603.
7. Полуэктова Е.У., Хольсаппель С., Гагарина Е.Ю., Гельфанд М.С., Брон С., Прозоров A.A. Наличие генетического мобильного элемента ISfis«2 из криптической плазмиды в хромосоме ряда штаммов Bacillus subtilis. ДАН. 2002. Т.386. № 4. С.552-554.
8. Полуэктова Е.У., Хольсаппель С., Гагарина Е.Ю., Брон С., Прозоров A.A. Присутствие мобильного генетического элемента \SBsu2 в плазмиде
почвенного штамма Bacillus subtilis и в хромосомах ряда штаммов этой бактерии. Генетика. 2002. Т.38. № 12. С.1719-1722.
9. Лотарева О.В., Полуэктова Е.У., Титок М.А., Прозоров A.A. Почвенный штамм Bacillus subtilis с крупной плазмидой, осуществляющей с высокой частотой конъюгативную мобилизацию. Микробиология. 2002. Т.71. № 2. С.254-257.
Ю.Лотарева О.В., Полуэктова Е.У., Федорина Е.А., Незаметдинова В.З., Прозоров A.A. Межвидовой и внутривидовой конъюгативный перенос различных плазмид у бацилл. Генетика. 2003. Т.39. № 8. С.1141-1144.
П.Хольсаппель С., Гагарина Е.Ю., Полуэктова Е.У., Незаметдинова В.З., Гельфанд М.С., Прозоров A.A., Брон С. Структура мобильного генетического элемнта \SBsu2 из критической плазмиды р1516 почвенного штамма Bacillus subtilis и наличие гомологов этого элемента в хромосомах различных штаммов Bacillus subtilis. Микробиология. 2003. Т.72. № 1. С.70-75.
12.PoIuektova E.U., Fedorina Е.А., Lotareva O.V., Prozorov A.A. Plasmid transfer in bacilli by a self-transmissible plasmid pl9 from a Bacillus subtilis soil strain. Plasmid. 2004. V.52. 212-217.
13.Полуэктова Е.У., Федорина E.A., Прозоров A.A. Конъюгативный перенос крупной плазмиды р19 у различных штаммов Bacillus subtilis. Генетика. 2005. Т.41. № 5. С.601-606.
14.Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Полуэктова Е.У., Титок М.А., Прозоров A.A. Способность к конъюгации и сравнительная характеристика крупных плазмид, содержащихся в природных штаммах Bacillus subtilis из разных регионов Восточно-Европейской равнины. Микробиология. 2007. Т.77. № 2. С.219-224.
15.Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Шиловский И.П., Федорина Е.А., Незаметдинова В.З., Родионова С.А., Прозоров A.A. Молекулярный анализ некоторых генов плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19, участвующих в процессе конъюгации. Генетика. 2008. Т.44. № 5. С.623-630.
16.Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Незаметдинова В.З., Шиловский И.П., Родионова С.А., Прозоров А.А. Характеристика определяющего конъюгативный перенос /га-района плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis. Генетика. Т.45. 2010. № 1.
Тезисы
1. Nezametdinova V., Poluektova Е., Kanapina A., Kanapin A., Sapogova Е., Prozorov A. Properties of cryptic plasmids from the soil Bacillus subtilis strains. 12th European meeting on bacterial gene transfer and expression. Siena, Italy, 1996. P.121.
2. Poluektova E.U., Thorsted P.B., Nezametdinova V.Z., Lotareva O.V., Gagarina E.J., Thomas C.M., Prozorov A.A. Bacillus subtilis cryptic plasmids, and their possible transfer in natural habitats. 13th European meeting on bacterial transformation and 5th European meeting on the molecular biology of the Pneumococcus. Kaiserslautern, Germany, 1999. B.3.
3. Poluektova E.U., Thorsted P.B., Nezametdinova V.Z., Lotareva O.V., Thomas C.M., Prozorov A.A. Cryptic plasmids found in the Bacillus subtilis strains from the Moscow region soils. International conference on bacilli. Senri-Chuo, Osaka, Japan, 1998. P.74.
4. Полуэктова Е.У., Лотарева O.B., Незаметдинова B.3., Федорина Е.А., Титок М.А., Прозоров А.А. Крупные плазмиды из почвенных штаммов Bacillus subtilis и осуществляемая ими конъюгативная мобилизация. Международный симпозиум «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология». Москва, 2001. С.132.
5. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Лотарева О.В., Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Хольсаппель С., Тимакова Н.В., Прозоров А.А. Мелкие и крупные плазмиды в природных штаммах Bacillus subtilis. Тезисы III съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». Москва, 2004. С.344.
6. Шиловский И.П., Полуэктова Е.У. Идентификация генов конъюгации плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis. Тезисы
международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И.Алиханяна. Москва-Пущино, 2006. С.178-179.
7. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Лотарева О.В., Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Шиловский И.П., Прозоров A.A. Различные классы плазмид, обнаруженные в штаммах Bacillus subtilis из почв некоторых регионов Восточно-Европейской равнины: свойства, молекулярная характеристика, возможная роль в биоценозах. Тезисы международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера». Москва, 2007г. С.102.
8. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Незаметдинова В.З., Шиловский И.П., Прозоров A.A. Характеристика /га-района конъюгативной плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19. Тезисы международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты». Минск, 2008г. С.26-27.
9. Полуэктова Е.У., Незаметдинова В.З., Шиловский И.П., Прозоров A.A. Строение /га-района конъюгативной плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis. Тезисы съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, и V съезда ВОГиС. Москва, 2009г. 4.1. С.42.
Подписано в печать:
30.03.2010
Заказ № 3488 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Полуэктова, Елена Ульриховна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Конъюгация у бактерий.
2.1.1. Основные закономерности конъюгации (на примере F-фактора Е. coli).
2.1.1.1. Общая характеристика конъюгации.
2.1.1.2. Этапы конъюгации.
2.1.1.3. Гены и белки конъюгации.
2.1.1.4. Регуляция процесса конъюгации.
2.1.2. Сходство элементов конъюгативного аппарата с компонентами системы секреции IV типа.
2.1.3. Конъюгативная мобилизация.
2.1.4. Конъюгативные транспозоны.
2.1.5. Особенности конъюгации у грам-положительных микроорганизмов.
2.1.6. Особенности конъюгации у бацилл.
2.1.6.1. Конъюгация у бацилл группы В. cerens.
2.1.6.2. Конъюгация у бацилл группы B.subtilis.
2.2. Плазмиды бацилл.
2.2.1. Мелкие плазмиды бацилл.
2.2.1.1. гер-модуль RCR-плазмид и общая схема RC-репликации.
2.2.1.1.1. dso.
2.2.1.1.2. Rep-бвлки.
2.2.1.1.3. sso.
2.2.1.1.4. Регуляция RC-репликации.
2.2.1.2. Локусы, обуславливающие стабильное наследование плазмид.
2.2.1.3. Модули устойчивости к антибиотикам.
2.2.1.4. тоЬ-моцулъ.
2.2.1.5. ир-модуль.
2.2.1.6. гар-модуль.
2.2.1.7. Прочие элементы генома RCR-плазмид.
2.2.1.8. Способность RCR-плазмид к интеграции в другие репликоны.
2.2.1.9. Стабильность RCR-плазмид и их использование в качестве векторов.
2.2.2. Крупные плазмиды бацилл.
2.2.2.1. Репликативный модуль крупных плазмид.
2.2.2.1.1. Репликативный модуль плазмид группы А.
2.2.2.1.2. Репликативный модуль плазмид группы Б.
2.2.2.1.3. Репликативный модуль плазмид группы Е.
2.2.2.1.4. Репликативный модуль плазмид группы Б.
2.2.2.1.5. Репликативные модули плазмид с неопределенной классификацией.
2.2.2.2. Сегрегационные модули.
2.2.2.3. Модули токсинообразования на тета-плазмидах бацилл.
2.2.2.4. Мобильные элементы крупных плазмид бацилл.
2.2.2.5. Прочие генетические модули крупных плазмид бацилл.
2.2.2.6. Векторы на основе крупных плазмид бацилл.
2.2.2.7. Характеристика отдельных крупных плазмид бацилл.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Штаммы микроорганизмов и плазмиды.
3.2. Реактивы.
3.3. Среды.
3.4. Выделение ДНК.
3.5. Трансформация бактериальных клеток и протопластов.
3.6. Конъюгативные скрещивания.
3.7. Рестрикция и лигирование ДНК.
3.8. Отбор клонов с рекомбинантными плазмидами.
3.9. Электрофорез ДНК.
3.10. Перенос ДНК на нейлоновые фильтры.
3.11. Радиоактивное мечение ДНК.
3.12. ДНК-ДНК-гибридизация на фильтрах.
3.13. ПЦР.
3.14. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
3.15. Анализ секвенированных последовательностей ДНК.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. Использованные в работе коллекции природных штаммов
ВлиШИк.
4.2. Изучение структуры мелких плазмид.
4.2.1. Рестрикционный анализ и классификация мелких плазмид.
4.2.1.1. Характеристика мелких плазмид из 19 штаммов московской коллекции.
4.2.1.2. Характеристика мелких плазмид из 10 штаммов белорусской коллекции.
4.2.1.3. Характеристика штаммов с несколькими мелкими плазмидами.
4.2.1.3.1. Штамм 1387.
4.2.1.3.2. Штамм 1546.
4.2.1.3.3. Штамм 1516.
4.2.2. Определение нуклеотидной последовательности мелких нлазмид.
4.2.2.1. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды р 1414.
4.2.2.2. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды р 1516S.
4.2.2.3. Определение нуклеотидной последовательности EcoRl-Hindlll фрагмента плазмиды р 1516L.
4.2.3. Поиск гомологов ряда плазмидных генов среди штаммов бактериальных коллекций.
4.2.3.1. Гибридизация с зондами - участками генов.
4.2.3.2. Наличие гомологов ISÄs7i2 в хромосомной ДНК штаммов B.subtilis.
4.3. Анализ крупных нлазмид.
4.3.1. Характеристика крупных плазмид из ¡московсхсой коллекции и р19 из белорусской коллекции.
4.3.1.1. Поиск крупных плазмиды в штаммах B.subtilis. Размеры плазмид.
4.3.1.2. Сравнение обнаруженных крупных плазмид с минирепликоном плазмиды р19 из белорусской коллекции штаммов B.subtilis.
4.3.1.3. Определение способности крупных плазмиды из штаммов
B.subtilis к конъюгативному переносу.
4.3.1.4. Характеристика плазмид штамма В.subtilis 19.
4.3.2. Изучение конъюгативного переноса, осуществляемого плазмидои р19 из почвенного штамма B.subtilis.
4.3.2.1. Мобилизация мелких неконъюгативных плазмид.
4.3.2.1.1. Определяющая роль р 19 в мобилизации pUBl 10.
4.3.2.1.2. Кинетика переноса pUBl 10 при разных температурах.
4.3.2.1.3. Мобилизационный перенос pUBl 10 при использовании различных штаммов B.subtilis.
4.3.2.1.4. Перенос pUBl 10 в штаммы разных видов Bacillus.
4.3.2.1.5. Мобилизация других неконъюгативных плазмид.
4.3.2.1.5.1. Изучение переноса плазмид с сигма-типом репликации (рВС 16, рС194).
4.3.2.1.5.2. Изучение переноса плазмиды, имеющей тета-репликон.
4.3.2.2. Изучение конъюгативного переноса собственно крупной плазмиды р19.
4.3.2.2.1. Маркирование крупной криптической плазмиды р19.
4.3.2.2.2. Частота конъюгативного переноса плазмиды р19cat.
4.3.2.2.3. Конъюгативный перенос р19cat при разных соотношениях донора и реципиента.
4.3.2.2.4. Кинетика конъюгативного переноса р 19cat.
4.3.2.2.5. Особенности переноса р19 при использовании в качестве партнеров при конъюгации различных штаммов B.subtilis.
4.3.2.2.6. Передача р19 в клетки других видов бацилл.
4.3.3. Клонирование, определение нуклеотидной последовательности и анализ секвенированных фрагментов ДНК fra-района плазмиды р19.
4.3.3.1. Клонирование фрагментов плазмиды р19, предположительно относящихся к fra-району плазмиды.
4.3.3.2. Определение нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК плазмиды р19.
4.3.3.3. Характеристика секвенированных фрагментов ДНК.
4.3.3.3.1. Общая характеристика секвенированных фрагментов ДНК.
4.3.3.3.2. Инактивация предполагаемых конъюгативных генов плазмиды р19.
4.3.3.3.3. Характеристика г ер-района плазмиды р19.
4.3.3.3.4. Характеристика ORF плазмиды р19, которым можно приписать определенную функцию. Выделение ¿га-района р19.
4.3.3.3.5. Характеристика or/Т района плазмиды р19.
4.3.4. Поиск у других плазмид систем конъюгации, гомологичных системе конъюгации р19.
4.3.4.1. Способность других крупных плазмид из белорусской коллекции к конъюгации.
4.3.4.2. Поиск генов конъюгации р19 на других крупных плазмидах из природных штаммов B.subtilis с помощью ПЦР.
4.3.4.3. Сопоставление in silico конъюгативной системы плазмиды р19 с аналогичными системами других грам-положительных бактерий.
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетические свойства и структура плазмид природных штаммов Bacillus subtilis"
Bacillus subtilis является вторым по значимости (после E.coli) объектом бактериальной генетики и физиологии и наиболее изученным видом грам-положительных бактерий. Ряд свойств В. subtilis делают ее перспективным объектом генетической инженерии. В.subtilis экологически безопасна: она исходно непатогенна, и организм человека не является для нее постоянным хозяином. В.subtilis не требовательна к условиям роста. Как и другие бациллы, В.subtilis секретирует белки в культуральную среду и служит важным промышленным объектом для получения различных ферментов. Одной из старейших областей применения В. subtilis является использование ее для ферментация соевых бобов; получаемые пищевые продукты широко распространены в странах юго-восточной Азии. Штаммы В.subtilis используются и в качестве хозяев для экспрессии рекомбинантных ДНК и продукции в их клетках чужеродных белков. В сельском хозяйстве используется также способность штаммов В. subtilis подавлять рост патогенов растений.
Для лабораторного штамма В.subtilis 168 была определена полная нуклеотидная последовательность генома (Kunst et al., 1997). Дальнейшее изучение генетики этой бактерии требует определения нуклеотидных последовательностей и исследования функциональной активности внехромосомных компонентов генома - плазмид и фагов, а также изучения особенностей геномов других штаммов В.subtilis, используемых в промышленном производстве и выделяемых из природных источников.
Плазмиды часто несут гены, в определенных условиях дающие селективное преимущество содержащим их клеткам. Многие известные свойства бактерий могут определяться плазмидными генами: устойчивость к антибиотикам, солям тяжелых металлов, ультрафиолетовому облучению, синтез бактериоцинов и антибиотиков, способность к деградации органических и неорганических соединений или фиксации азота; плазмиды могут содержать островки патогенности с генами, определяющими вирулентность и синтез токсинов, или нести гены клеточного метаболизма.
Лабораторный штамм В.subtilis 168 не содержит плазмид. Долгое время в качестве векторов для клеток В.subtilis использовались плазмиды других грам-положительных микроорганизмов - стафилококков и стрептококков. Позже плазмиды были обнаружены в клетках некоторых природных и промышленных штаммах B.subtilis; подавляющее их большинство не определяет каких-либо заметных свойств бактериальной клетки, т.е. плазмиды являются криптическими.
Многие крупные плазмиды различных микроорганизмов несут гены, определяющие способность бактериальных клеток к конъюгации. Наряду с трансформацией и трансдукциеи, конъюгация является способом горизонтального переноса генов у микроорганизмов. Возможен конъюгативный перенос плазмид между бактериями, принадлежащими к разным видам, родами и даже царствам про- и эукариот. Механизм, сходный с конъюгацией, обуславливает передачу Т-ДНК Ti-плазмид Agrobacteriiim в клетки высших растений. Быстрое распространение устойчивости к антибиотикам за счет конъюгации создает серьезные проблемы для медицины, как и распространение генов, обуславливающих вирулентность и продукцию токсинов.
До недавнего времени считалось, что основными способами горизонтального переноса генов у B.subtilis является трансформация и трансдукция. К началу нашей работы была описана лишь одна конъюгативная плазмида подвида B.subtilis (natto); конъюгация происходила с низкой частотой и осталась практически не исследованной. Таким образом, существовало несоответствие между изученностью и востребованностью B.subtilis и отсутствием сведений о плазмидах этого микроорганизма, а также их участия в процессе конъюгации.
Целью данной работы являлось изучение структуры и функций криптических плазмид из коллекций природных штаммов Bacillus subtilis, выделенных из почв Москвы, Московской области и различных районов Белоруссии. Такое широкомасштабное изучение плазмид, находящихся в штаммах B.subtilis, предпринято впервые. Мы надеемся, что результаты нашей работы позволят глубже понять закономерности организации геномов плазмид бацилл, а также будут использованы в биотехнологических работах по конструированию новых векторов и их горизонтальному переносу.
В задачи исследования входило:
1. Поиск и характеристика критических плазмид из природных штаммов B.subtilis, относящихся к московской и белорусской коллекциям.
2. Определение нуклеотидной последовательности некоторых мелких плазмид и их фрагментов.
3. Рестрикционный и гибридологический анализ мелких плазмид, позволяющий установить степень их родства и наличие у них тех или иных генов.
4. Поиск в природных штаммах B.subtilis крупных плазмид, способных осуществлять конъюгативный перенос ДНК.
5. Характеристика процесса конъюгации, осуществляемого плазмидами из природных штаммов B.subtilis.
6. Определение нуклеотидной последовательности и изучение строения генов /га-района конъюгативных плазмид из природных штаммов B.subtilis.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Полуэктова, Елена Ульриховна
7. ВЫВОДЫ
1. Проведен анализ плазмид из природных штаммов B.subtilis, выделенных в Москве и Московской области (московская коллекция) и различных районах Белоруссии (белорусская коллекция). В 24 из 42 штаммов московской коллекции обнаружены плазмиды. Охарактеризованы 32 мелкие плазмиды из 29 штаммов обеих коллекций. Определена нуклеотидная последовательность двух плазмид: р1414 (7949 пн) и pl516S (9881 пн). По величине, характеру рестрикции и гомологии ДНК исследованные мелкие плазмиды составляют однородную группу.
2. На основании данных сиквенса и гибридизации установлено, что у изученных мелких плазмид имеются следующие модули и входящие в них гены: mob (гомологичные гены, присутствуют у всех проверенных плазмид, кроме одной); hsp (гомологичные гены, встречаются у большинства плазмид), rap (имеются у некоторых плазмид и обладают не столь выраженной гомологией). Гены модуля par не обнаружены ни у одной плазмиды. Ген hsp, кодирующий белок - гомолог белков теплового шока, обнаружен нами в составе мелких плазмид впервые.
3. В клетках B.subtilis впервые обнаружен и полностью секвенирован IS-элемент - \SBsu2 (1383 пн), находящийся на плазмиде. Установлено, что гомологи данного IS-элемента присутствуют в геноме различных штаммов B.subtilis.
4. Обнаружено, что плазмида р19 (97 тпн) из штамма B.subtilis 19 белорусской коллекции способна эффективно осуществлять конъюгативный перенос ДНК. Эффективность переноса значительно превосходит таковую для единственной известной конъюгативной плазмиды B.subtilis {natío) - pLS20. С помощью инсерционного мутагенеза плазмида р19 была маркирована геном устойчивости к хлорамфениколу, что позволило изучать различные виды и свойства конъюгативного переноса.
5. Изучены параметры самопереноса р 19 и мобилизационного переноса pUB 110. Перенос идет как на твердой, так и в жидкой среде и может осуществляться в клетки других видов бацилл. Частота самопереноса достигает 100%, частота мобилизационного переноса на два порядка ниже. Перенос р19 начинается сразу после контакта клеток-партнеров; мобилизационный перенос начинается лишь через 60 минут. Частота самопереноса мало зависит от изменения количественного соотношения клеток донора и реципиента и существенно зависит от того, какие штаммы используются в качестве партнеров. Мобилизационный перенос происходит в широком диапазоне температур (21°-37°С). Мобилизация осуществляется, вероятно, по механизму донации.
6. Впервые для крупных плазмид B.subtilis определена нуклеотидная последовательность ДНК значительной части конъюгативной плазмиды р19 (33506 пн). На этой последовательности идентифицировано 39 открытых рамок считывания (ORF). Идентифицирован rep-район плазмиды р19, обусловливающий репликацию плазмиды и состоящий из гена rep (ORF8) и ориджина репликации. 20 ORF (19914 пн) могут быть отнесены к /га-району, обусловливающему конъюгативный перенос ДНК. Идентифицированы ORF, кодирующие белки-гомологи релаксазы, лизоцим-подобного белка, VirD4-, VirB4-, VirB 11-подобных белков плазмиды pTi A. tumefaciens; идентифицирован ориджин конъюгативного переноса.
7. Крупные плазмиды из штаммов белорусской коллекции составляют однородную группу, отличающуюся от других известных крупных плазмид грам-положительных микроорганизмов по строению rep- и /га-районов.
8. Судя по результатам компьютерного анализа предполагаемых продуктов ORF, принадлежащих к /га-району р19, конъюгативная система этой плазмиды имеет частичное сходство с конъюгативными системами ряда грам-положительных микроорганизмов (роды Bacillus, Clostridium, Exiguobacterium, Listeria), хотя и существенно отличается от них.
9. Конъюгативный перенос ДНК достаточно широко распространен у природных штаммов B.subtilis и может играть существенную роль в горизонтальном распространении генов.
б.Заключение.
В работе охарактеризована большая группа плазмид из природных штаммов В.зиЫШя. Изученные свойства плазмид позволяют лучше понять эволюцию плазмид и их роль в жизнедеятельности бактериальной клетки. Данные плазмиды могут быть использованы для создания векторов, а также в качестве маркеров для характеристики штаммов В.зиЫШя и близких бацилл. Последнее особенно относится к обнаруженному в нашей работе мобильному элементу 18.0.57/2, который может быть использован для характеристики и идентификации штаммов бацилл.
Мы полагаем, что наиболее важным результатом работы является обнаружение и характеристика плазмиды р19 из природного штамма В.яиЬИНз. способной с высокой частотой осуществлять конъюгативный перенос ДНК. В настоящее время подобная плазмида является уникальной для ВлиЫШя. Данные о свойствах подобной плазмиды расширяют представление о механизмах горизонтального переноса генов у бацилл и могут быть использованы для переноса генетического материала между штаммами и видами бацилл в лабораторной и биотехнологической практике.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Полуэктова, Елена Ульриховна, Москва
1. Азизбекян P.P., Смирнова Т.А., Споро- и кристаллообразование у Bacillus thuringiensis. Успехи микробиологии. М., Наука. 1988. С.82-105.
2. Гайденко Т.А., Хайкинсон М.Я., Звенирогодский В.К, Жданов В.Г., Степанов А.И. Выделение и характеристика плазмиды из термотолерантного штамма Bacillus licheniformis. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1987. Т. 12. С. 16-20.
3. Каменева C.B. Конъюгативные транспозоны бактерий. Генетика. 1998. Т.34. С.23-31.
4. Каменек JI.К.,Каменск Д.В., Тюлъпинева A.A., Терпиловский М.А. Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в отношении фитопагогенных грибов родов Phytophthora и Fusarium. Биотехнология. 2008. С.76-89.
5. Канапина А.Ш. Плазмиды бацилл, родственных Bacillus subtilis. Молекулярная генетика; микробиолоия и вирусология. 1992. Т. С.5-10.
6. Канапина А.Ш., Канапин А А., Прозоров A.A. Определение и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности фрагментов минирепликона криптической плазмиды р1414 из почвенного штамма Bacillus subtilis. Генетика. 1995. Т.31. С.1201-1209.
7. Козловский Ю.Е., Прозоров A.A. Система рестрикции-модификации у штаммов бацилл, близких к Bacillus subtilis. ДАН СССР. 1981. Т.258. С.1457-1459.
8. Корецкая Н.Г., Светоч O.E., Добрица А.П. Конъюгативный перенос плазмид между Bacillus spp. ДАН СССР. 1998. Т.303. С.488-491.
9. Кузнецова Н.И., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н., Ганушкина Т.Н., Азизбекян P.P. Штамм Bacillus thuringiensis, токсичный для комнатной мухи. Биотехнология. 1995. №3-4. С.11-14.
10. Лагодич A.B., Штанюк Я.В., Прозоров A.A., Титок М.А. Характеристика систем репликации плазмид природных штаммов Bacillus subtilis. Молекулярная биология. 2004. Т.38. С.1-5.
11. Лагодич A.B. Характеристика плазмид природных штаммов Bacillus subtilis. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Минск. 2005.
12. Лотарева О.В., Прозоров A.A. Конъюгативный перенос плазмид у Bacillus subtilis в условиях почвенных микрокосмов. Микробиология. 2003. Т.72. С.780-784.
13. Лотарева О.В., Шиловский И.П., Прозоров A.A. Явление плазмидного ретропереноса при конъюгации у Bacillus subtilis. Генетика. 2006. Т.42. С.1735-1738.
14. Лотарева О.В., Незаметдинова В.З., Прозоров A.A. Конъюгативный перенос хромосомных генов у Bacillus subtilis. Генетика.2007. Т.43. С.898-904.
15. Лотарева О.В., Прозоров A.A. Особенности передачи некоторых хромосомных генов при конъюгации у Bacillus subtilis. Генетика. 2009. Т.45. С.595-600.
16. Лукин С.А., Малгтина Т.В., Прозоров A.A. Аллозимная вариабельность у штаммов . почвенных бацилл, близких к Bacillus subtilis. Генетика. 1994. Т.ЗО. С.181-184.
17. Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукД. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.
18. Незаметдинова В.З., Канапина А.Ш., Козловский Ю.Е., Прозоров A.A. Критические плазмиды почвенных штаммов бацилл. Генетика. 1992. Т.27. С.49-55.
19. Прозоров A.A. Трансформация у бактерий. М., Наука, 1988.
20. Прозоров A.A. Конъюгация у бацилл. Микробиология. 2003. Т.72. С.517-527.
21. Прозоров A.A., Даниленко В.И. Системы «токсин-антитоксин» у бактерий: инструмент апоптоза или модуляторы метаболизма? Микробиология. 2010. Т.79. С.147-159.
22. Ракитин А.Л. Конструирование модельных систем для селекции генноинженерных штаммов Bacillus subtilis — продуцентов рибофлавина. Автотореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 2000.
23. Смирнова Т.А., Богданова Т.Л., Гальперин М.Ю., Григорьева Т.М., Азизбекян P.P. Гомологичная и гетерологичная трансцепция Сгу+-плазмид Bacillus- thuringiensis. Мол.генетика, микробиол.и вирусол. 1987. Т.10. С.23-27.
24. Стукалин Г.С., Козловский Ю.Е., Василяускас Ю.Ф., Прозоров А.А. Амилолитическая активность почвенных бацилл, родственных Bacillus subtilis. Микробиология. 1984. Т.53. С.1007-1011.
25. Титок М.А. Плазмиды грамположительных бактерий. Минск, издательство БГУ, 2004.
26. Чан Кам Ван, Кузин Ю.Ю., Козловский Ю.Е., Прозоров А.А. Изучение способности к генетической трансформации у выделенных из почвы бацилл, близких к Bacillus subtilis. Генетика. 1985. Т.21. С.1953-1959.
27. Akhtar P., AnandS.P., Watkins S.C., Khan S.A. The tubulin-like RepX protein encoded by the pXOl plasmid forms polymers in vivo in Bacillus anthracis. J.Bacteriol. 2009. V.191. P.2493-2500.
28. Amadio A.F., Benintende G.B., Zandomeni R.O. Complete sequence of three plasmids from Bacillus thuringiensis INTA-FR-4 environmental isolate and comparision with related plasmids from the Bacillus cereus group. Plasmid. 2009. V.63. P.172-182.
29. Anagnostopoulos C., Spizizen J. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. J.Bacteriol. 1961. V.81. P.741-746.
30. Anand S.P., Mitra P., Naqvi A., Khan S.A. Bacillus anthracis and Bacillus cereus PcrA helicases can support DNA unwinding and in vitro rollin-gcircle replication of plasmid pT181 of Staphylococcus aureus. J.Bacteriol. 2004. V.186. P.2195-2199.
31. Andrup L., Damgaard J., Wasserman K. Mobilization of small plasmids in Bacillus thuringiensis subsp. israelensis is accompanied by specific aggregation. J. Bacteriol. 1993. Y.175. P.6530-6536.
32. Andrup L., Damgaard J., Wasserman К, Вое L., Madsen S.M., Hansen F.G. Complete nucleotide sequence of the Bacillus thuringiensis subsp. israelensis plasmid pTX14-3 and its correlation with biological properties. Plasmid. 1994. V.31. P.72-88.
33. Andrup L., Jorgensen O., Wilcks A., Smidt L., Jensen G. Mobilization of "nonmobilizable" plasmids by the aggregation-mediated conjugational system of Bacillus thuringiensis. Plasmid. 1996. V.36. P.75-85.
34. Andrup L. Conjugation in Gram-positive bacteria and kinetics of plasmid transfer. APMIS suppl. 84. 1998. V.106. P.47-55.
35. Andrup L., Smidt L., Andersen K„ Boe L. Kinetics of conjugative transfer: a study of the plasmid pX016 from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Plasmid. 1998, V.40. P.30-43.
36. Andrup L., Jensen G.B., Wicks A., Smidt L„ Hoflack L., Mahillon J. The patchwork nature of rolling-circle plasmids: comparision of six plasmids from two distinct Bacillus thuringiensis serotypes. Plasmid. 2003. V.49. P.205-232.
37. Andrup L., Barford K.K., Jensen G.B., Smidt L. Detection of large plasmids from the Bacillus cereus group. Plasmid. 2008. V.59. P.139-143.
38. Aronson A.I., Beckman W. Tansfer of chromosomal genes and plasmids in Bacillus thuringiensis. Appl.Eviron.Microbiol. 1987. V.53. P.1525-1530.
39. Auchtung J.M., Lee C.A., Monso R.E., Lehman A.P., Grossman A.D. Regulation of Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response. PNAS USA. 2005. V.102. P. 2554-12559.
40. Auchtung J.M., Lee C.A., Garrison K.L., Grossman A.D. Identification and characterization of the immunity repressor (ImmR) that controls the mobile genetic element ICEÄsl of Bacillus subtilis. Molec. Microbiol. 2007. V.64. P.1515-1528.
41. Baas P.D. DNA replication of single-stranded Escherichia coli DNA phages. Biochem.Biophys.Acta. 1985. V.825. P.l 11-139.
42. BabicA., Lindner A.B., Vulic M., Stewart E. J., RadmanM. Direct visualization of horizontal gene transfer. Sience. 2008. V.319. P. 1533-1536.
43. Backert S., Meissner K., Borner T. Unique features of the mitochondrial rolling circle-plasmid mpl from the higher plant Chenopodium album (L). Nucleic Acids Res. 1997. V.25. P.582-589.
44. Bannam T.L., Teng W.L., Bulach D., Lyras D., Rood J.I. Functional identification of conjugational and replication regions of the tetracycline resistance plasmid pCW3 from Clostridiumperfringens. J.Bacteriol. 2006. V.188. P.4942-4951.
45. Bashkirov V.l., Khasanov F.K., Prozorov A.A. Illegitimate recombination in Bacillus subtilis: nucleotide sequence of recombination DNA junctions. Mol.Gen.Genet. 1987. V.210. P.578-580.
46. Bates S., Cashmore A.M., Wilkins B.M. IncP plasmids are unusually effective in mediating conjugation of Escherichia coli and Sacharomyces cerevisiae: involvement of Tra2 mating system. J. Bacteriol. 1998. V.180, P.6538-6543.
47. Battisti L., Green B., Thome C.B. Mating system for transfer of plasmids among Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis. J.Bacteriol. 1985. V.162. P.543-550.
48. Baum J A., Gilbert M.P. Characterization and comparative sequence analysis of replication origins from three large Bacillus thuringiensis plasmids. J.Bacteriol. 1991. V.173. P.5280-5289.
49. Baum J.A., Gonzalez Jr. J.M. Mode of replication, size and distribution of naturally occurring plasmids in Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol.Lett. 1992. V.98. P.143-148.
50. Bayer M, Iberer R., Bischof K., Rassi E., Stabentheiner E., Zellnig G., Koraimann G. Functional and mutational analysis of pi9, a DNA transfer protein with muramidase activity. J.Bacteriol. 2001. V.183. P.3176-3183.
51. Becker E., Herrera N.C., Gunderson F.Q., DermanA.J., Dance A.L., Sims J., Larsen R.A., Pogliano J. DNA segregation by the bacterial actin AlfA during the Bacillus subtilis growth and development. EMBO J. 2006. Y.25. P.5919-5931.
52. Berg 71, Firth N., Apisiridej S., Hettiaratchi A., Leelaporn A., Skurray R. Complete nucleotide sequence of pSK41: evolution of Staphylococcal conjugative multiresistance plasmids. J.Bacteriol. 1998. V.180. P.4350-4359.
53. Bernhard K., Schrempf H., Goebel W. Bacteriocin and antibiotic resistance plasmids in Bacillus cereus and Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 1978. V.133. P. 897-903.
54. Berns K.I. Parvovirus replication. Microbiol.Rev. 1990. V.54. P.316-329.
55. Bignell C., Thomas C.M. The bacterial ParA-ParB partitioning proteins. J.Biotechnol. 2001. V.91.P.1-34.
56. Bingham A.H.A., Bruton C.J., Atkinson T. Isolation and characterization of four plasmids from antibiotic-resistant thermophilic bacilli. J. Gen. Microbiol. 1979. V.l 14. P.401-408.
57. Birnboim H.C., Doly J. A rapide alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 1979. V.7. P.1513-1523.
58. Bongiorni C., Stoessel R., Schoemaker D., Perego M. Rap phosphatase of virulent plasmid pXOl inhibits Bacillus anthracis sporulation. J.Bacteriol. 2006. V.188. P.487-498.
59. Brantl S., Behnke D., Alonso J.C. Molecular analysis of the replication region of the Streptococcus agalactiae plasmid pIP501 in Bacillus subtilis. Comparison with plasmids pAMßl and pSM19035. Nucleic Acids Res. 1990. Y.18. P.4783-4790.
60. Brantl S., Wagner E.G.H. Antisense RNA-mediated transcriptional attenuation: an in vitro study of plasmid pTl 81. Mol.Microbiol. 2000. V.35. P.1469-1482.
61. Brautaset T., Jakobsen O.M., Flickinger M.C., Valla S., Ellingsen T.E. Plasmid-dependent methylotrophy in thermotolerant Bacillus methanolicus. J.Bacteriol. 2004. V.1896. P.1229-1238.
62. Bron S., BolhuisA., Tjalsma H., Holsappel S., Vene ma G., van Dijl J.M. Protein secretion and possible roles for multiple signal peptidases for precursor processing in Bacilli. J. Biotechnol. 1998. V.64. P.3-13.
63. Bruand C., Le Chatelier E., Ehrlich S.D., Jannerie L. A fourth class of theta replicating plasmids: the pAMßl family from Gram- positive bacteria. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. V.90. P.11668- 11672.
64. Bruand C., Ehrlich S.D. Transcription-driven DNA replication of plasmid pAM-beta 1 in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 1998. V.30. P.135-145.
65. Bruand C., Ehrlich S.D. UvrD-dependent replication of rolling-circle plasmids in Escherichia coli. Molec.Microbiol. 2000. V.35. P.204-210.
66. Buchanan-Wollaston V, Passiatore J.E., Cannon F. The mob and oriT mobilization functions of a bacterial plasmid promote its transfer to plants. Nature. 1987. V.328. P. 172175.
67. Budzik J. M., Marraffini L.A., Schneewind O. Assembly of pili on the surface Bacillus cereus vegetative cells. Molec. Microbiol. 2007. V.66. P.495- 510.
68. Burrus V., Pavlovic G., Decaris B., Guedon G. Conjugative transposons: the tip of the iceberg. Mol. Microbiol. 2002b. V.46. P.601-610.
69. Burrus V., Walder M.K. Shaping bacterial genomes with integrative and conjugative elements. Res. Microbiol. 2004. V.155. P.376-386.
70. Cahan R., Friman H., Nitzan Y. Antibacterial activity of CytlAa from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Microbiology. 2008. V.154. P.3529-3536.
71. Cao T. B., Saier M. H., Jr. Conjugal type IV macromolecular transfer systems of Gramnegative bacteria: organismal distribution, structural constraints and evolutionary conclusions. Microbiology. 2001. V.147. P.3201-3214.
72. Carlton B C., Helinski D.R. Heterogenous circular DNA elements in vegetative cultures of Bacillus megaterium. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1969. V.64. P.592-599.
73. Carlton B.C., Swith M.P.W. Size distribution of the closed circular deoxyribonucleic acid molecules of Bacillus megaterium'. sedimentian velocity and electron microscope measurements. J. Bacteriol. 1974. V.117. 1201-1209.
74. Caryl J.A., O'Neill A.J. Complete nucleotide sequence of pGOl, the prototype conjugative plasmid from the staphylococci. Plasmid. 2009. V.62. P.35-38.
75. Ceglowski P., Lurz R., Alonso J.C. Functional analysis of pSM19035-derived replicons in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol.Lett. 1993. V.109. P.145-150.
76. Chambers S.P., Prior S.E., Barstow D.A., Minton N.P. The pMTL nic-cloning vectors. I. Improuved pUC polylinker regions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing. 1988. Gene. V.68. P. 139-149.
77. ChangS., Cohen S.N. High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA. Mol.Gen.Genet. 1979. V.168. P.lll-115.
78. Chao L., Qiyu B., Fuping S., Ming S., Dafang H., Guiming L., Ziniu Y. Complete nucleotide sequence of pBMB67, a 67-kb plasmid from Bacillus thuringiensis strain YBT-1520. Plasmid. 2007. V.57. P.44-54.
79. Chen Y., Erickson P. In vitro assembly studies of FtsZ/tubulin-like proteins (TubZ) from Bacillus plasmids. J.Biol.Chem. 2008. V.283. P.8102-8109.
80. Christie P.J. Type IV secretion: intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Molec.Microbiol. 2001. V.40. P.294-305.
81. Christie P.J., Atmakuri K., Krishnamoorthy V., Jakubowski S., Cascales E. Biogenesis, architecture, and function of bacterial type IV secretion system. Annu. Rev. Microbiol. 2005. V.59. P.451-485.
82. Christie P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial type IV secretion systems (review). Mol. Membr. Biol. 2005. V.22. P.51-61.
83. Christie-Oleza J.A., Lanfranconi M.P., Nogales B., Lalucat J., Bosch R. Conjugative interaction induces transposition of \SPst9 in Pseudomonas stutzeri. J.Bacteriol. 2009. V.191. P.1239-1247.
84. Clark A. J., and Warren G. J. Conjugal transmission of plasmids. Annu. Rev. Genet. 1979. V.13. P.99-125
85. Clewell D.B., Jaworski D.D., Flartnagan S.E., Zitzow L.A., Su Y.A. The conjugative transposon Tn916 of Enterococcus faecal is: structural analysis and some key factors involved in movement. Dev. Biol. Stand. 1995. V.85. P.l 1-17.
86. Clewell D.B. Properties of Enterococcus faecalis plasmid pAD, a member of a widely dessiminated family of feromone-responding, conjugative, virulence elements encoding cytolysin. Plasmid. 2007. V.58. P.205-227.
87. Cooper T.F., Heinemann J.A. Postsegregational killing does not increase plasmid stability but acts to mediate the exclusion of competing plasmids. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2000. V.23. P.12643-13648.
88. Dai Z., Sirard J.-C., Mock M., Koehler T. M. The atxA gene product activates transcription of the anthrax toxin genes and is essential for virulence. Mol. Microbiol. 1995. V.16. P.l 171—1181.
89. Darabi A., Forough R„ Bhardwaj G., Watabe M., Goodarzi G., Gross S.C., Watabe K. Identification and nucleotide sequence of the minimal replicon of the low-copy-number plasmid pBS2. Plasmid. 1989. V.22. P.281-286.
90. De Boever E.H., Clewell D.B., Fraser CM. Enterococcus faecalis conjugative plasmid pAM373: complete nucleotide sequence and genetic analyses of sex pheromone response. Molec.Microbiol. 2000. V.37. P.1327-1341.
91. Del Solar G., Moscoso M., Espinosa M. Rolling-circle replicating plasmids from grampositive and -negative bacteria: a wall falls. Mol.Microbiol. 1993. V.8. P.789-796.
92. Del Solar G., Acebo P., Espinosa M. Replication control of plasmid pLSl: efficient regulation of plasmid copy number is exerted by the combined action of two plasmid components, CopG and RNAII. Mol.Microbiol. 1995. V. 18. P.913-924.
93. Del Solar G., Giraldo R., Riuz-Echevarria M.J., Espinosa M., Diaz-Orejas R. Replication and control of circular bacterial plasmids. MicrobiolMolec.Biol.Rev. 1998. Y.62. P.434-464.
94. Del Solar G., Espinosa M. Plasmid copy number control: an ever-growing story. Molec. Microbiol. 2000. V.37. P.492-500.
95. Devine K.M., Hogan S.T., Higgins D.G., McConnell D.J. Replication and segregational stability of Bacillus plasmid pBAAl. J.Bacteriol. 1989. V.171. P.l 166-1172.
96. Di Franco C., Pisaneschi G., Beccari E. Molecular analysis of two rolling-circle replicating cryptic plasmids, pBMYdx and pBMYl, from the soil gram-positive Bacillus mycoides. Plasmid. 2000. V.44. P.280-284.
97. Dobritsa A.P., Dobritsa S.V., Tanyashin V.I. Isolation and characterization of plasmid from the Bacillus brevis var Q.-B. cells. Mol. Gen. Genet 1978. V.164. P.195-204.
98. Dougherty B.A., Hill C., Weidman J.F., Richardson D.R., Venter J.C., Ross R.P. Sequence and analysis of the 60 kb conjugative, bacteriocin-producing plasmid pMRCOl from Lactococcus lactis DCP3147. Molec.Microbiol. 1998. V.29. P.1029-1038.
99. Draper O., Cesar C.E., Machon C., de la Cruz F., Lloza M. Site-specific recombinase and integrase activities of a conjugative relaxase in recipient cells. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2000. V.102, P.16385-16390.
100. Ehrlich S.D. Replication and expression of plasmids from Staphylococcus aureus in Bacillus subtilis. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1977. V.74. P.1433-1436.
101. Firth N., Ippen-Ihler K., Skurray R.A. Structure and function of the F factor and mechanism of conjugation. In: Escherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology. ASM Press, Washington, D.C. 1996. P. 2377-2401.
102. Flannagan S.E., Zitzow L.A., Su Y.A., Clewell D.B. Nucleotide sequence of the 18-kb conjugative transposon Tn916 from Enterococcus faecalis. Plasmid. 1994. V.32. P.350-354.
103. Franke A. E., Clewell D. B. Evidence for a chromosome-borne resistance transposon (Tn916) in Streptococcus faecalis that is capable of "conjugal" transfer in the absencc of a plasmid. J. Bacteriol. 1981. V. 145. P.494-502.
104. Frost L., Ippen-Ihler K., Skurray R.A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol.Rev. 1994. Y.58, P. 162-210.
105. Gamel P.H., Piot J.C. Characterization and properties of a novel plasmid vector for Bacillus thuringiensis displaying compatibility with host plasmids. Gene. 1992. V120. P. 17-26.
106. Garcillan-Barcia M.P., de la Cruz F. Why is entry exlusion an essential feature of conjugative plasmids? Plasmid. 2008. V.60. P.l-18.
107. Garcillan-Barcia M.P., Francia M.V., de la Cruz F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiol.Rev. 2009. V.33. P.657-687.
108. Gasson M.G., Swindell S., Maeda S., Dodd H.M. Molecular rearrangement of lactose plasmid DNA associated with high-frequency transfer and cell-aggregation in Lactococcus lactis 111. Mol.Microbiol. 1992. V.6. P.3213-3223.
109. Geist C., Brantl S. Tra M protein of plasmid RI: in vitro selection of the target region reveals two consensus 7 bp binding motifs spaced by a 4 bp linker of defined sequence. Plasmid. 2008. V.59. P.20-35.
110. Gennaro M.L. Genetic evidence for replication enhancement from a distance. Proc.Natl.Acad,Sci.USA. 1993. V.90. P.5529-5533.
111. Gleave A., Mountains A., Thomas C. Use of a novel cassette to label phenotipically a cryptic plasmid of Bacillus subtilis and map loci involved in its stable maintenance. J. of Gen. Microbiol. 1990. V.136. P.905-912.
112. Gomis-Ruth F.X., Moncalian G., de la Cruz F., Coll M. Conjugative plasmid protein TrwB, an integral membrane type IV secretion system coupling protein. J.Biol.Chem. 2002. V.277. P.7556-7566.
113. Gonzalez J., Carlton B.C. A large transmissible plasmid is required for crystal toxin production in Bacillus thuringiensis subsp.israelensis. Plasmid. 1984. V.ll. P.38-38.
114. Grandjean V., Nguen J., Hauck Y., Hirschbein L. Establishment of a new replicon generated from an integrational plasmid and a cxyptic pUBllO origin-like region in Bacillus subtilis. Plasmid. 1993. V.30. P.l-30.
115. Grass A., Ehrlich S.D. The family of highly interralated single-stranded deoxyribonucleic acids plasmids. 1989. Microbiol.Rev. V.53. P.231-241.
116. Green B.D., Battisti L., Thome C.B. Involvement of Tn 4430 in transfer of Bacillus anthracis plasmids mediated by Bacillus thuringiensis plasmid pX012. J. Bacterid. 1989. V.171. P.104-113.
117. Grohmann E., Muth G., Espinosa M. Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiol.Molec.Biol.Rev. 2003. V.67. P.277-301.
118. Guerout-Fleury A.-M., Shazand K, Frandsern N., Stagier P. Antibiotic-resistance cassettes for Bacillus subtilis. 1995. Gene. V.167. P.335-336.
119. Guglielmetti S., Mora D., Manachini P.L., Parini C. Genetic relationship among Bacillus licheniformis rolling-circle-replicating plasmids and complete nucleotide sequence of pBL63.1, an atypical replicon. Plasmid. 2005. V.54. P.93-103.
120. Haima P., Sinderen D., Schotting H., Bron S., Venema G. Development of a p-galactosidase a-complementation system for molecular cloning in Bacillus subtilis. Gene. 1990. V.86. P. 63-69.
121. Haima P., Bron S., Venema G. Novel plasmid marker rescue transformation system for molecular cloning in Bacillus subtilis enabling direct selection of recombinants. Molec.Gen.Genet. 1990. V.223. P.185-191.
122. Ilames B.D., Higgins S.J. Nucleic acid hybridization. A practical approach. IRL Press.
123. Helgason E. Okstad O.A., Caugant D.A.,Johansen H.A., Fouet A., Mock M, Hegna I., Kolsto A.B. Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis one species on the basis of genetic evidence. Appl.Environ.Microbiol. 2000. V.66. P.2627-2630.
124. Helmann J.D. Complication and analysis of Bacillus subtilis sigma A-dependent promoter sequences: evidence extended contact between RNA polymerase and upstream promoter DNA. //Nucl. Acid Res. 1995. v. 23. p. 2351-2360.
125. Hofemeister J., Israeli-Reehar M., Dubnau D. Integration of plasmid pE194 at multiple sites on the Bacillus subtilis chromosome. Mol. Gen. Genet. 1983. V.189. P.58-68.
126. Hoflack L., Wilcks A., Andrup L., Mahillon J. Functional insights into pGI2, a cryptic rolling-circle replicating plasmid from Bacillus thuringiensis. Microbiology. 1999. V.145. P.1519-1530.
127. Holtwick R., von Walbrunn A., Keveloh H., Meinhardt F. A novel rolling-circle replicating plasmid from Pseudomonas putida P8: molecular characterization and use as vector. Microbiology. 2001. V.147. P.337-344.
128. Hoshino T., Ikeda T., Narushima H., Tomizuka N. Isolation and characterization of antibiotic-resistance plasmids in thermophilic bacilli. Can. J. Microbiol. 1985a. V.31. P.339-345.
129. Hoshino T., Ikeda T„ Tomizuka N., Furukawa K. Nucleotide sequence of the tetracycline resistance gene of pTHT15, a thermophilic Bacillus plasmid: comparison with staphylococcal TcR controls. Gene. 1985b. V.37. P.131-138.
130. Hoshino T., Ikeda T., Furukawa K., Tomizuka N. Genetic relationship between pUBllO antibiotic-resistance plasmids obtained from thermophilic bacilli. Can. J. Microbiol. 1985c. V.31. P.614-619.
131. Hu X., Hansen B.M., Yuan Z., Johansen J.E., Eilenberg J., Hendriksen N.B., Smidt L„ Jensen G.B. Transfer and expression of the mosquitocidal pBtoxis in Bacillus cereus group strain. FEMS Microbiol.Lett. 2005. V.245. P.239-247.
132. Huang J., Guo S., Mahillon J., Van der Auwera G., Wang L., Han D., Yu Z, Sun M. Molecular characterization of a DNA fragment harboring the replicon of pBMB165 from Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis. BMC Genomics. 2006. V.7.270.
133. Imanaka T., Fujii M., Aiba S. Isolation and characterization of antibiotic resistance plasmids from thermophilic bacilli and construction of deletion plasmids. J. Bacterid. 1981. V.146. P.1091-1097.
134. Jmanaka T., Ano T., Fujii M, Aiba S. Two replication determinants of an antibiotic-resistance plasmids, pTB19, from a thermophilic bacillus. J. Gen. Microbiol. 1984. V.130. P.1399-1408.
135. Janniere L., BruandC., Ehrlich S. D . Structurally stable Bacillus subtilis cloning vectors. Gene. 1990. V.87. P.53-61.
136. Janniere L., Gruss A., Ehrlich S. Plasmids. In: Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology and molecular genetics. Sonenshein A.L., Hoch J.A., Losick R., eds, Amer.Soc.for Microbiol. 1993. Washington, D.C. P.625-644.
137. Jaworski D. D., Clewell D. B. A functional origin of transfer (oriT) on the conjugative transposon Tn916. J. Bacteriol. 1995. Y.177. P.6644-6651.
138. Khan S.A. Plasmid rolling-circle replication: highlights of two decades of research. Plasmid. 2005. V.53. P.126-136.
139. Kimura K, Inatsu Y., Itoh Y. Frequency of the insertion sequence IS4&zd among Bacillus subtilis strains isolated from fermented soybean foods in Southeast Asia. Biosci.Biotechnol.Biochem. 2002. Y.66. P. 1994-1996.
140. Kimura K, Itoh Y. Determination and characterization of IS45ral-insertion loci and identification of a new insertion sequence element of the IS256 family in a natto starter. Biosci.Biotechnol.Biochem. 2007. V.71. P.2458-2464.
141. Koehler T.M., Torne C.B. Bacillus subtilis (natto) plasmid pLS20 mediates interspecies plasmid transfer. ¿Bacterid. 1987. V.169. P.5271-5278.
142. Kramer M.G., Espinosa M„ Misra T.K, Khan S.A. Characterization of a single-strand origin, ssoU, required for broad host range replication of rolling-circle plasmids. Mol.Microbiol. 1999. V.33. P.466-475.
143. Kunnimalaiyaan M., Stevenson D.M., Zhou Y., Vary P.S. Analysis of the replicon region and identification of a rRNA operon on pBM400 of Bacillus megaterium QM B1551. Molec.Microbiol. 2001. Y.39. P.1010-1021.
144. Kunnimalaiyaan M., Vary P.S. Molecular characterization of plasmid pBM300 from Bacillus megaterium QM B1551. Appl.Eviron.Microbiol. 2005. V.71. P.3068-3076.
145. Kurenbach B., Bohn C., Abudukerim M., Szewzyk U., Grohmann E. Intergenic transfer of the Enterococcus faecalis plasmid pIP501 to Escherichia coli and Streptomyces lividans and sequence analysis of its tra region. Plasmid. 2003. V.50. P.86-93.
146. Kuroki A., Ohtani N., Tsuge K, Tomita M., Itaya M. Conjugational transfer system to shuttle giant DNA cloned by Bacillus subtilis (BGM) vector. Gene. 2007. V.399. P.72-80.
147. KwakJ. H., Weisblum B. Regulation of plasmid pE194 replication: control of cop-repF operon transcription by Cop and of repF translation by countertranscript RNA. J. Bacteriol. 1994. V.176. P. 5044-5051.
148. Lacey R, Chopra I. Genetic studies of a multiresistant strain of Staphylococcus aureus. J.Med.Microbiol. 1974. Y.7. P.285-297.
149. Lambert C.M., Hyde H., Strike P. Conjugal mobility of the multicopy plasmids NTP1 and NTP16. Plasmid. 1987. Y.18. P.99-110.
150. Lanka E., Wilkins B. DNA processing reactions in bacterial conjugation. Ann.Rev.Biochem. 1995. V.64, P. 141-169.
151. Lederberg J., Tatum E.L. Gene recombination in E. coli. Nature. 1946. V.158. P.558.
152. Lee C.A., BabicA., Grossman A.D. Autonomous plasmid-like replication of a conjugative transposon. Molec. Microbiol. 2010. V.75. P.268-279.
153. Le Hegarat J. C., Anagnostopulos C. Detection and characterization of naturally occuring plasmids in Bacillus subtilis. Mol. Gen. Genet 1977. V.157. P.167-174.
154. Lereclus D., Lecadet M.M., Ribier J., Dedonder R. Molecular relationships among plasmids of Bacillus thuringiensis: conserved sequences through 11 cristalliferous strains. Mol. Gen.Genet. 1982. V.186. P. 391-398.
155. Lereclus D., GuoS., Sanchis V., Lecadet M.-M. Characterization of two Bacillus thuringiensis plasmids whose replication is thermosensitive in B. subtilis. FEMS Microbiol.Lett. 1988. V.49. P.417-422.
156. Lovett P.S., Bramucci M.G. Plasmid deoxyribonucleic acid in Bacillus subtilis and Bacillus pumilus. J. Bacteriol. 1975. V. 124. P.484-490.
157. Lovett P.S., Duvall E.J., Keggins K.M. Bacillus pumilus plasmid pPLlO: properties and insertion into Bacillus subtilis 168 by transformation. J. Bacteriol. 1976. V. 127. P.817-828.
158. MacDowell D.G., Mann N.H. Characterization and sequence analysis of a small plasmid from Bacillus thuringiensis var.kurstaki HD1-DIPEL. Plasmid. 1991. V.25. P.l 13-120.
159. Mahillon J., Chandler M. Insertion sequences. Microbiol.Molec.Biol.Rev. 1998. V.62. P.725-774.
160. Marenda M., Barbe V., Gourgues G., Mangenot S., Sagne E., Citti C. A new integrative conjugative element occurs in Mycoplasma agalactiae as chromosomal and free circular forms. J. Bacteriol. 2006. V.188. P.4137-4141.
161. Mason V.P., StrettN., Hassanali T., OsbornA.M. Diversity and linkage of replication and mobilization genes in Bacillus rolling-circle replicating plasmids from diverse geographical origins. FEMS Microbiol.Ecol. 2002. V.42. P.235-241.
162. Meijer W.J.J., de Boer A. J., van Tongeren S., Venema G., Bron S. Characterization of the replication region of the Bacillus subtilis plasmid pLS20: a novel type of replicon. Nucl.Acids Res. 1995b. V.23. P.3214-3223.
163. Moller-Jensen J., BorchJ., DamM., Jensen R.B., Roepstorff P., Gerdes K. Bacterial mitosis. 2003. Mol.Cell. V.12. pl477-1487.
164. Monod M., Denoya G., Dubnau D. Sequence and properties of pIM13, a macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance plasmid. J. Bacteriol. 1986. V.167. P.138-147.
165. Morton T. M., Eaton D. M., Johnston J. L., Archer G. L. DNA sequence and units of transcription of the conjugative transfer gene complex (trs) of Staphylococcus aureus plasmid pGOl. J. Bacteriol. 1993. V.175. P. 4436-^*447.
166. Muller A.K., Rojo S„ Alonso J.C. The level of the pUBl 10 replication initiatior protein is autoregulated, wich provides an additional control for plasmid copy number. Nucleic Acids Res. 1995. V.23. P.1894-1900.
167. NagaiT., Tran L.-S.P., Inatsu Y., Itoh Y. A new IS4 family insertion sequence, IS4Ä?wl, responsible for genetic instability of poly-y-glutamic acid production in Bacillus subtilis. J.Bacteriol. 2000. Y.182. P.2387-2392.
168. Nguyen H.H., Nguyen A.D., Ferreire R.C., Ferreira L.C.S., Tran L.T., Schumann W. Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting full structural stability. Plasmid. 2005. V.54. P.241-148.
169. Noirot-Gros M.F., Bidnenko V., Ehrlich S.D. Active site of the replication protein of the rolling circle plasmid pC194. The EMBO J. 1994. V.13. P.4412-4420.
170. Okinaka, R., Cloud K, Hampton., Hoffmaster A. R„ Hill K., Keim P., Koehler T., Lamke G., Kumano S., Manter D., Martinez Y., Ricke D., Svensson R., Jackson P. Sequence, assembly and analysis of pXOl and pX02. J.Appl.Microbiol. 1999a. V.87. P.261-262.
171. Osborn A.M., Boltner D. When phage, plasmids, and transposons collide: genomic islands, and conjugative- and mobilizable-transposons as a mosaic continuum. Plasmid. 2002. Y.48. P.202-212.
172. Oskam L., Hillenga D.J., Venema G., Bron S. The large Bacillus plasmid pTB19 contains two integrated rolling-circle plasmids carrying mobilization functions. Plasmid. 1991. V.26. P.30-39.
173. Ozawa K, Iwahana H. Involvement of a transmissible plasmid of heat-stable exotoxin and delta-endotoxin in Bacillus thuringiensis subspecies darmstadiensis. Curr.Microbiol. 1986. V.13. P.337-340.
174. Panned J., Okinaka R.T., Sabin R., Kuske C.R. Bacillus anthracis pXOl plasmid sequence conservation among closely related bacterial species. J. Bacteriol. 2002. V.184. P.134-141.
175. Parini C., Fortina M.G., Manachini P.L., de Rossi E., Riccardi G. Detection and characterization of naturally occurring plasmids in Bacillus licheniformis. FEMS Microbiol.Lett. 1991. V.81. P.329-334.
176. Parini G, Guglielmetti S., Mora D., Ricci G. Complete sequence and structural organization of pFL5 and PFL7, two cryptic plasmids from Bacillus licheniformis. Plasmid. 2004. V.51. P. 192-202.
177. Perego M., Brannigan J. A. Pentapeptide regulation of aspartylphosphate phosphatases. Peptides. 2001. V.22. P.1541-1547.
178. PolakJ., NovickR. Closely related plasmids from Staphylococcus aureus and soil bacilli. Plasmid. 1982. V.7. P. 152-162.
179. Pomerantsev A.P., Camp A., Leppla S.H. A new minimal replicon of Bacillus anthracis plasmid pXOl. J.Bacteriol. 2009. V.191. P.5134-5146.
180. Projan S.J., Novick R. Comparative analysis of five related Stapylococcal plasmids. Plasmid. 1988. V.19. P.203-221.
181. Pujol C., ChedinF., Ehrlich S.D., Janniere L. Inhibition of a naturally occurring rolling-circle replicon in derivatives of the theta-replicating plasmid pIP501. Molec.Microbiol. 1998. V.29. P.709-718.
182. Reddy A., Battisti L., Thome C.B. Identification of self-transmissible plasmids in four Bacillus thuringiensis subspecies. J.Bacteriol. 1987. V.169. P.5263-5270.
183. Reisner A., Holler B.M., Molin S., Zehner E.L. Synergistic effects in mixed Escherichia coli biofilms: conjugative plasmid transfer drives biofilm expansion. J.Bacteriol. 2006. V.188. P.3582-3588.
184. Rosso M.-L., Vary P.S. Distribution of Bacillus megaterium QM B1551 plasmids among other B.megaterium strains send Bacillus species. Plasmid. 2005. V.53. P.205-217.
185. Sakaya N., Kaneco S., Matsunaga S., Itaya M. Experimental basis for a stable plasmid, pLS30, to shuttle between Bacillus subtilis species by conjugational transfer. J.Biochem. 2006. V.139. P.557-561.
186. Salyers A.A., Shoemaker N.B., Stevens A.M., Li L.-Y. Conjugative transposons: an unusual and diverse set of integrated gene transfer elements. Microbiol. Rev. 1995. V.59. P.579-590.
187. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1977. Y.74. P.5463-5467.
188. Scheer-Abramowitz, J., T. J. Gryczan, and D. Dubnau. Origin and mode of replication of plasmids pE194 and pUBl 10. Plasmid. 1981. V.6. P.67-77.
189. Scholle M.D., White C.A., Kunnimalaiyaan M., Vary P.S. Sequencing and characterization of pBM400 from Bacillus megaterium QM B1551. Appl.Eviron.Microbiol. 2003. V.69. P.6888-6898.
190. Schroder G., Lanka E. The matting pair formation system of conjugative plasmids A versatile secretion machinery for transfer of proteins and DNA. Plasmid. 2005. V.54. P.l-25.
191. Schwarz F., Perreten V, Teuber M. Sequence of the 50-kb conjugative multiresistance plasmid pRE25 from Enterococcus faecalis RE25. Plasmid. 2001. V.46. P. 170-187.
192. Seery L.T., Nolan N.C., Sharp P.M., Devine K.M. Comparative analysis of the pC194 group of rolling circle plasmids. Plasmid. 1993. V.30. P.185-196.
193. Salinger L.B., McGregor M.F., Khachatourians G.G., Hynes M.F. Mobilization of closely related plasmids pUBl 10 and pBC16 by Bacillus plasmid pX0503 requires transacting open readinf frame f3. J.Bacteriol. 1990. V.172. P.3290-3297.
194. Simpson F.E., Skurray R.A., Firth N. A single gene on the staphylococcal multiresistance plasmid pSK41 encodes a novel partitioning system. J.Bacteriol. 2003. Y.185. P.2143-2152.
195. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J.Mol.Biol. 1975. V.98. P.503-517.
196. Spizizen J. Transformation of biocamicalli deficient strains of Bacillus subtilis by deoxiribonucleate. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 1958. V.44. P.1072-1078.
197. Srivatsan A., Han Y., Peng J., Tehranchi A.K., Gibbs R., Wang J.D., Chen R. High-precision, whole-genome sequencing of laboratory strains facilitates genetic studies. PLoS Genet. 2008. V.4. 8.
198. Stahl S.R. Plasmids in Bacillus stearothermophilus coding for bacteriocinogeny and temperature resistance. Plasmid. 1991. V.26. P.94-107.
199. Stenz R., Gasson M., Shearman C. The Tra domain of the Lactococcal CluA surface protein is a unique domain that contributes to sex factor DNA transfer. J.Bacteriol. 2006. V.188. P.2106-2114.
200. Stroms ten N. J., Benson S. D., Burnett R. M., BamfordD.H., Bamford J.K.H. The
201. Bacillus thuringiensis linear double-stranded DNA phage Bam35, which is highly similar to the Bacillus cereus linear plasmid pBClinl5, has a prophage state. J. Bacteriol. 2003. V.185.P. 6985-6989.
202. Szpirer C., Top E., Couturier M., Mergeay M. Retrotransfer or gene capture: a feature of conjugative plasmids, with ecological and evolutionary significance. Microbiology. 1999. V.145. P. 3321-3329.
203. Tanaka T., Koshikawa T. Isolation and characterization of four types of plasmids from B. subtilis (natto). J. Bacteriol. 1977. V.131. P. 699-701.
204. Tanaka T., Kuroda M., Sakaguchi K. Isolation and characterization of four plasmids from B.subtilis. J. Bacteriol. 1977. V.129. P.M87-1494.
205. Tanaka T., Oguro M. A novel Bacillus natto plasmid pLS32 capable of replication in Bacillus subtilis. FEBS Letters. 1998. V.422. P.243-246.
206. Tanaka T., Ishida H., Maehara T. Characterization of the replication region of plasmid pLS32 from the natto strain of Bacillus subtilis. J.Bacteriol. 2005. V.187. P.4315-4326.
207. Tang M„ Bideshi D.K., Park H.-W., Federici B.A. Minireplicon from pBtoxis of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Appl.Environ.Microbiol. 2006. V.72. P.6948-6954.
208. Telford J.L., Barocchi M.A., Margarit R., Grandi G. Pili in gram-positive pathogens. Nat.Rev.Microbiol. 2006. V.4. P.509-519.
209. I.Thomas CM. Paradigm of plasmid organization. Mol.Microbiol. 2000. V.37. P.485-491.
210. Thomas D.J.I., Morgan J.A.W., Whipps J.M., Saunders JR. Plasmid transfer between Bacillus thuringiensis subsp. israelensisn strains in laboratory culture, river water, and dipteran larvae. Appl.Environ.Microbiol. 2001. V.67. P.330-338.
211. Thompson J.K., Collins M.A. Completed sequence of plasmid pIP501 and origin of spontaneous deletion derivatives. Plasmid. 2003. V.50. P.28-35.
212. Timmery S., Modrie P., Minet O., Mahillon J. Plasmid capture by the Bacillus thuringiensis conjugative plasmid pX016. J. Bacteriol. 2009. V. 191. P.2197-2205
213. Tinsley E., Naqvi A., Bourgogne A., Koehler T., Khan S. Isolation of a minireplicon of the virulence plasmid pX02 of Bacillus anthracis and characterization of the plasmid-encoded RepS replication protein. J. Bacteriol. 2004. V.186. P.2717-2723.
214. Tinsley E., Khan S.A. A novel FtsZ-like protein is involved in replication of the anthrax toxin-encoding pXOl plasmid in Bacillus anthracis. J.Bacteriol. 2006. 188. P.2829-2835.
215. Tinsley E., Khan S. A. Bacillus anthracis-based in vitro system supports replication of plasmid pX02 as well as rolling-circle-replicating plasmids. Appl.Environ.Microbiol. 2007. V.73. P.5005-5010.
216. Titok M.A., Chapius J., Selezneva Y.V., Lagodich A.V., Prokidevich V.A., Ehrlich S.D., Janniere L. Bacillus subtilis soil isolates: plasmid replicon analysis and construction of a new theta-replicating vector. Plasmid. 2003. Y.49. P.53-62.
217. Tjalsma K, van den Dolder J., Meijer W.J.J., Venema G., Bron S., van Dijl J.M. The plasmid-encoded signal peptidase SipP can functionalli replace the major signal peptidases SipS and SipT of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 1999. V.142. P.2448-2454.
218. To mil a H., Yke Y. Genetic analysis of transfer-related regions of the vancomycin resistance Enterococcus conjugative plasmid pHTp: identification of ori'T and a putative relaxase gene. J.Bacteriol. 2005. Y.187. P.7727-7737.
219. Tourasse N.J., Stabell F.B., Reiter L., Kolsto A.-B. Unusual group II introns in bacteria of the Bacillus cereus group. J.Bacteriol. 2005. V.187. P.5437-5451.
220. Toussaint A., Merlin C. Mobile elements as a combination of functional modules. Plasmid. 2002. V.47. P.26-35.
221. Uozumi T., Ozaki A., Beppu T., Arima K. New cryptic plasmid of Bacillus subtilis and restriction analysis of other plasmids found by general screening. J.Bacteriol. 1980. V.142. P.315-318.
222. Van der Auwera G., Mahillon J. TiiXOl, a germination-associated class II transposon horn Bacillus anthracis. Plasmid. 2005. V.53. P.251-257.
223. Van der Auwera G. A, Andrup L., Mahillonl J. Conjugative plasmid pAW63 brings new insights into the genesis of the Bacillus anthracis virulence plasmid pX02 and of the Bacillus thuringiensis plasmid pBT9727. BMC Genomics. 2005. V.6. 103.
224. Van der Auwera G., Timmery S., Hoton F., Mahillon J. Plasmid exchanges among members of the Bacillus cereus group in foodstuffs. InternJ.Food Microbiol. 2007. V.113. P.164-172.
225. Van der Auwera G., Timmery S., Mahillon J. Self-transfer and mobilization capabilities of the pX02-like plasmid pBT9727 from Bacillus thuringiensis subsp. konkukian 97-27. Plasmid. 2008. V.59. P.134-138.
226. Vogel J., Andrew II., Wong S., Isberg R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 1998. V.279. P.873-876.
227. Waters V.L. Conjugation between bacterial and mammalian cells. Nature Genetics. 2001. V.29. P.375-376.
228. Weaver K.E., Kwong S.M., Firth N., Francia M.V. The RepAN replicon of Grampositive bacteria: a family of broadly distributed but narrow host range plasmids. Plasmid. 2009. V.61. P.94-109.
229. Wilcks A., Jayaswal N., Lereclus II, Andrup L. Characterization of plasmid pAW63, a second self-transmissible plasmid in Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD73. Microbiology. 1998. V.144. P.1263-1270.
230. Wiclks A., Smidt L., Okstad O.A., Kolsto A.-B., Mahillon J., Andrup L. Replication mechanism and sequence analysis of the replicon of the pAW63, a conjugative plasmid from Bacillus thuringiensis. J.Bacteriol. 1999. V.181. P.3193-3200.
231. Wilks A., Smidt L., Bahl M.I., Hansen B.M., Andrup L., Hendriksen N.B., Licht T.R. Germination and conjugation of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis in the intestine of gnotobiotic rats. J.Appl.Microbiol. 2008. V.104. P.1252-1259.
232. Wu E., Jun L., Yuan Y., Yan J., Berry C., Yuan Z. Characterization of a cryptic plasmid from Bacillus sphaericus strain LP1-G. Plasmid. 2007. V.57. P.296-305.
233. Xiong Z., JiangY., Oi D., Lu H., Yang F„ Yang J., Chen L„ Sun L., Xu X, Xue Y., Zhu Y., Jin Q. Complete genome sequence of the extremophilic Bacillus cereus .strain Q1 with industrial applications. J.Bacteriol. 2009. V.191. P. 1120-1121.
234. Yasukawa H., Hase T„ Sakai A., Masamune Y. Rolling-circle replication of the plasmid pKYM isolated from a Gram-negative bacterium. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1991. V.88. P.10282-10286.
235. Yeo H.-J., Waksman G. Unveiling molecular scaffolds of the type IV secretion system. ¿Bacterid. 2004. V.186. P.1919-1926.
236. Yoshimura K, Yamamoto O., Seki T., Oshima Y. Distribution of heterogeneous and homologous plasmids in Bacillus spp (corrected version). Appl. Environ. Microbiol. 1983. V.46. P.1268-1275.
237. Yuan Y.M., Hu X.M., Liu H.Z., Hansen B.M., Yuan Z.M. Kinetics of plasmid transfer among Bacillus cereus group strains within lepidopteran larvae. Arch.Microbiol. 2007. V.187. P.425-431.
238. Zawadzki P., Riley M.A., Cohan F.M. Homology among nearly all plasmids infecting three Bacillus species. ¿Bacterid. 1996. V.178. P.191-198.
239. Zhao A.C., Ansari R.A., Schmidt M.C., Khan S.A. An oligonucleotide inhibits oligomerization of a rolling circle initiator protein at the pT181 origin of replication. J.Biol.Chem. 1998. V.273. P.16082-16089.
-
Полуэктова, Елена Ульриховна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2010
-
ВАК 03.02.07
- Изучение конъюгативных свойств плазмиды p19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19
- Изучение мелких криптических плазмид, обнаруженных в почвенных штаммах Bacillus subtilis
- Изучение природных плазмид BACILLUS SUBTILIS
- Генетическая организация и функции криптических плазмид Bacillus megaterium и Bacillus thuringiensie
- Конструирование модельных систем для селекции генноинженерных штаммов Bacillus subtilis - продуцентов рибофлавина
