Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая организация и функции криптических плазмид Bacillus megaterium и Bacillus thuringiensie

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рябченко, Николай Федорович

ВВЕДШИЕ .I

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ПМЗМИДЫ БАЦИЛЛ.

ГЛАВА I. ПМ31ЛВДЫ СТАФИЛОКОККОВ И СТРЕПТОКОККОВ В

БАЦИЛЛАХ

ГЛАВА II. ПРИРОДНЫЕ ПЛАЗШЩЫ БАЦИЛЛ

ГЛАВА III. ПМЗМИДШЕ КОМПЛЕКСЫ Bacillus thuringiensis И Bacillus megaterium

§1. Состав шгазглидных комплексов

§2. Структура плазмидных комплексов.

§3. Бактериоципы

§4. Конъюгация.

§5. (5*—токсин

§6. Эксперименты по молекулярному клонированию гена S -токсина

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическая организация и функции криптических плазмид Bacillus megaterium и Bacillus thuringiensie"

Актуальность темы. Если бактерии Escherichia coli u Bacillus subtilis принято считать классическими объектами молекулярной генетики, то энтомопатогенную бактерию Bacillus thuringiensis можно назвать классическим объектом микробиологической промышленности. Открытая, еще в 1915 году, Берли-нером, эта бацилла привлекла внимание исследователей в 50-х годах, в связи с необходимостью использования в сельском хозяйстве экологически нейтральных инсектицидов, со строго специфическим действием (12). К настоящему времени на основе различных штаммов в.thuringiensis производят энтомопатогенные препараты: энтобактерин, битоксибациллин, дендробавдллин (СССР), диспарин (НРБ), тюрингин (ПНР), батурин (ЧССР), дипел, тюри-цид, биотрол (США), бактоспеин (Франция), биоспор (ФРГ) и др. (I). Основным действующим диктором в.thuringiensis является кристаллический белковый токсин, т.н. с?-токсин, действующий на гусениц бабочек и личинок некоторых двукрылых (12).

Го

В прцессе роста, на стадам споруляции в клетках в.thuringiensis происходит сверхсинтез § -токсина, в результате чего формируется белковый кристалл, составляющий до 30% общего белка в.thuringiensis(12, 53). Необходимо отметить, что в отличии от большинства бацилл, и даже близкородственного организма B.cereus все кристадлообразующие штаммы в.thuringiensis характеризуются наличием "плазмидных комплексов", включающих от 2-х до 17 плазмид (Табл. 2). Обязательное присутствие плазмид в штаммах в.thuringiensis предполагает их существенное значение для жизнедеятельности этой бактерии. Действительно, первые предположения о том, что в сверхпродукции кристаллического белка существенную роль играют плазмиды, в настоящее время нашли убедительное подтверждение (5, 13, 123). Гены, ответственные за синтез S-токсина, картированы на больших плазмидах в.thuringiensis, осуществлено клонирование этих,, генов (64, 89, 118). Установлено, что плазмиды B.th.uringiensis имеют и ряд других интересных свойств, а именно: существует значительная гомология ДНК между плазмидами как одного, так и различных штаммов; показано участие плазмид в процессе обмена генетической информации у B.thuringiensis аналогичном конъюгационному E.coli (II, 66). Все эти такты открывают новые возможности создания штаммов-продуцентов энтомотокси-нов. Поэтому несомненно, что изучение свойств плазмид B.tim-ringiensis представляет интерес как с практической, так и теоретической точек зрения.

Существование плазмидных комплексов описано еще у одного представителя рода Bacillus - B.megaterium . Детально изученный генетически штамм B.megaterium 216 содержит 10 плазмид с молекулярными весами от 4 до 100 МД. (46). При помощи методик слияния и трансформации протопластов установлено, что плазмида рШЗОЭ из штамма B.megaterium2i6 несет ген мегацина А (116). По своей функции мегацин А является фосфолипазой А (112). Наличие хорошо разработанной системы трансформации B.megaterium и существование плазмидного комплекса, содержащего маркированную плазмиду рВМ309, определило выбор B.megaterium 216 в качестве второго объекта сравнительного изучения организации и функции плазмид бацилл.

Целью настоящей работы являлось изучение генетической организации и функции критических плазмид B.thuringiensis И B.megaterium.

Обнаруженная нами высокая нестабильность ряда штаммов В. thuringiensis по признакам продукции бактериоцинов и cnopy-ляции определило следующие направления работы: а) поиски бактериоциногенных плазмид B.thuringiensis, б) изучение роли плазмид в регуляции споруляции B.thuringiensis.

С целью изучения возможностей молекулярного клонирования в B.megaterium, а также применения плазшд B.thuringiensis и B.megaterium в качестве векторов проведена работа по: в) молекулярному клонированию гена мегацина А в B.megaterium, г) изучению генетической организации плазмиды рВМЗОЭ из В. megaterium 216.

Научная новизна и практическое значение.

Изучено распространение явления бактериоциногении среди различных серотипов B.thuringiensis, выявлены плазмиды, определяющие синтез бактериоцинов.

Показано участие плазмид B.thuringiensis в регуляции споруляции. В связи с этим объяснены причины нестабильности штаммов B.thuringiensis по признаку синтеза с? -токсина.

Проведено клонирование в B.megaterium гена мегацина А на векторной плазмиде pBD9 . Показана возможность использования B.megaterium в качестве хозяина при проведении генно-инженерных работ.

При помощи манипуляций in vitro получены делещюнные варианты мегациногенноы плазмиды рВМЗОЭ, проведено картирование гена мегацина А. Установлено, что генетическая организация бактериоциногенных плазмид из бацилл имеет много общего с таковой бактериоциногенных плазмид грам-отрицатель-ных бактерий. Полученные делеционные варианты, в дальнейшем, могут быть использованы для конструирования векторов. l

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ шзииш еащм

Согласно классическому определению, плазмида - это внехромосомальный генетический элемент (15). Лаконичность определения подразумевает большое разнообразие свойств плазмид. При описании внехромосомальных генетических элементов используют следующие характеристики: особенности репликации, способность осуществлять собственный конъюгационный перенос, присутствие на плазмиде специфических маркеров. Для удобства можно представить некую универсальную шгазмиду, содержащую основные признаки внехромосомальных элементов:

Рис. I Универсальная плазмида из грам-отрицательных бактерий.

1. Репликация. Сюда входят: oriv - точка начала репликации; гер - белок, необходимый для автономной репликации плазмиды; par - точка прикрепления ДНК плазмиды к мембране, участвует в процессе распределения копий плазмиды между дочерними клетками при делении; inc - белок (РНК), определяет несовместимость плазмиды с родственными репликонами, также как и par участвует в установлении числа копий плазмиды в клетке-хозяине.

2. Конъюгация. oriT - точка начала переноса ДНК в процессе конъюгации (мобилизации); Тга - оперон, в состав которого входят гены, определяющие функции, связанные с автономным конъ-югационным переносом; тоЪ - гены, ответственные за мобилизационный перенос неконъюгативных плазмид при помощи транс-миссибельных.

3. R-детерминант. н - ген, определяющий устойчивость к антибиотику (ионам тяжелых металлов). Как правило, локализован внутри транспозона (Тп).

4. Кроме этого, на плазмидах часто присутствуют отдельные дзз элементы.

5. Бактериоциноген.

Ъс - ген бактериоцина; im - ген иммунности к бактериоцину.

В большинстве случаев, синтез бактериоци-нов находится под контролем системы репарации G0G. Бактериоцины играют важную роль в установлении популяционного равновесия мевду родственными бактериями (15).

6. Область X. Это может быть:

- гены утилизации органических веществ у Pseudomonas , гены, ответственные за проявление симбиотических функций у Rizobium, или индукции опухолей растений, вызываемые Agrobacterium ; хромосомальные гены, входящие в состав плазмид р' , гены токсинов.

Экстрахромосомальные элементы найдены практически у всех микроорганизмов, однако, наиболее детально они изучены у грам-отрицательных бактерии, что и нашло подтверждение в приведенной схеме (15, 24, 126). Было бы интересно провести сравнительный анализ плазмид грам-отрицательных бактерий и бацилл, что мы и попытались сделать в своем обзоре.

Перед тем как перейти к рассмотрению собственно плазмид бацилл, необходимо остановиться на генетических работах с использованием внехромосомальных элементов стафилококков и стрептококков в Bacillus subtilis.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Рябченко, Николай Федорович

ВЫВОДЫ

1. Изучено распространение явления бактериоциногении среди различных серотипов B.thuririgiensis. в штаммах-; B.th.var. morrisoni Н8, var.tolwortlii Н9, var.darmstadiensis M10 выявлены плазмиды, ответственные за продукцию-тюрицинов.

2. В штаммах B.tli.var.berliner 1715» var.kurstaki НЗаЗЪ, var.galleria 69-6, var.morrisoni Н8, var.tolworthi Н9 u var.darmstadiensis M10 идентифицированы плазмиды, участвующие в регуляции, споруляции.

3. Показана возможность передачи спорулявдонных и тюрици-ногенных плазмид при смешанном культивировании штаммов

В•thuring iens is.

4. Получены делеционные производные мегациногенной плазгли-ды рШЗОЭ из B.megaterium216. Построена генетическая карта плазмиды: установлено, что генетическая организация бакте-риоциногенной плазмиды рШЗОЭ имеет много общего с таковой колициногенных плазмид E.coli.

5. Осуществлено клонирование в B.megaterium гена мегацина А на векторной плазмиде pBD9 . Показана возможность использования B.megateriumB качестве хозяина при проведении генно-инженерных работ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рябченко, Николай Федорович, Москва

1. Алешина О.И., Заикина ИЛ., Раковская Н.И. Бактериальныеинсектициды. М. 1977.

2. Бойцов А.С., Голубков В.И. Трансформация Bacillus subtilisстрептококковыми плазмидами. Докл. АН СССР, 1980, 254, 490-492.

3. Галушка Ф.П., Азизбекян P.P. Исследования плазмид штаммов различных вариантов Bacillus thuringiensis. Докл. АН СССР, 1977, 236, 1233-1235.

4. Григорьева Т.Н., Азизбекян P.P. Изучение одновременной реверсии по генам thy, dra, dim у Bacillus thuringiensis. Генетика, 1983, 19, 406-415.

5. Дебабов В.Г., Азизбекян P.P., Хлебалина О.И., Дьяченко

6. Дебабов В.Г., Хлебалина О.И., Галушка Ф.П., Сладкова И.А.

7. Плазмиды Bacillus thuringiensis var. galleria, штамм 612. Мол.биология, 1980, 14, 1039-1044.

8. Доморадский И.В., Левадина Т.Б., Ситников Б.С., Рассадин

9. Л.С., Денисова Г.С. Трансформация Bacillus subtilis изолированной ДНК плазмиды .?. Докл. АН СССР, 1976, 226, 1443-1445.

10. Звенигородский В.И., Поздняков В.Н., Бугайчук Ю.Д., Иванов В.Г. Трансформация Bacillus licheniformis плазмидной ДНК. Генетика, 1983, 6, 1036-1038.

11. Ю.Йомантас Ю.В,, Рабинович П.М., Ребентиш Б.А., Степанов А.И. Эксперименты по генной инженерш бацилл. Докл. АН СССР, 1980, 254, 493-495.

12. Ц.Карабеков Б.П., Чахмачян А.Г., Оганесян М.Г. Трансмиссивные генетические факторы у Bacillus thuringiensis. Генетика, 1982, 18, 1062-1066.

13. Коппел X., Мертинс Д. Биологическое подавление вредных насекомых. "Мир", М. 1980.

14. Лебедев А.Н., Саканян В.А., Алиханян С.И. Участие плазмид Bacillus thuringiensis в синтезе инсектицидного8 -эндотоксина. Докл. АН СССР, 1982, 264, 974-976.

15. И.Лукин А.А., Козьмина Л.М., Лысенко A.M., Дробышев В.И., Народицкая В.А., Ребентиш Б.А. Изучение фенотшшческого выражения плазмиды ppl7065 Bacillus pumilis в свободном и интегрированном состоянии. Генетика, 1983, 14, 440-446.

16. Мейнел Г. Бактериальные плазмиды. "Мир", М. 1976.

17. Митева В. Плазмиди и кристалообразуване при Bacillusthuringiensis. (нн болгарском языке) Acta Microbiol.

18. Bulgarica, 1975, 5, 36-41.

19. Митева В. Почуване върху плазмидите на Bacillus thuringiensis. Автореферат канд. диссертации (на болгарском языке) София, 1979.

20. Прозоров А. А. Генетическая трансформация и трансфекция.1. Наука, М. 1980.

21. Раутенштейн Я.И., Соловьева И.Я., Курковская Г.Е., Блохина Т.П., Москаленко JI.H., Филатова А.Д. Особенности лизогении умеренных фагов культур спороносных кристал-лообразующих бактерий, вьщеленных из разных источников. Микробиология, 197I, 40, 532-539.

22. Рнбченко Н.Ф., Буканов И.О., Саканян В.А., Алиханян С.И.

23. Трансформация протопластов Bacillus thuringiensis var.galleria плазмидой pBCI6. Докл. АН СССР, 1980, 253, 729-731.

24. Саканян В.А., Селиванова Г.II., Буканов Н.0., Крупенко М.

25. А., Алиханян С.И. Распространенность, гомология и клонирование критических плазмид Bacillus thuringiensis. Генетика, 1982, 18, I8I-I90.

26. Степанов А.И. Организация генома бактериальных плазмид.в кн."Молекулярные механизмы генетических процессов", М. 1982.

27. Честухина Г.Г., Костина Л.И,, Залунин И.А., Котова Т.С.,

28. Катруха С.П., Кузнецов 10.С., Степанов В.М. Белки кристаллов §-эндотоксина Bacillus thuringiensis. Биохимия, 1977, 42, 1660-1667.

29. Честухина Г.Г., Залунин И.А., Костина Л.И., Котова Т.С.

30. Катруха С.П., Люблинская Л.А., Степанов В.М. Протеиназы, связанные с кристаллами Bacillus thuringiensis. Биохимия, 1978, 43, 857-864.

31. Честухина Г.Г., Котова Т.С., Заяунин И.А., Степанов В.М.

32. Протеиназы в процессе роста и спорообразования Bacillus thruingiensis. Биохимия, 1979, 44, 796-802.

33. Хайкинсон М.Я., Рабинович П.М., Степанов А.И. Роль прямых и инвертированных повторов в трансформации Bacillus subtilis плазмидной ДНК. Докл. АН СССР, 1982, 265, 975-978.

34. Хайкинсон М.Я., Рабинович П.М., Степанов А.И. Моделитрансформации Bacillus subtilis плазмидной ДНК. Докл. АН СССР, 1982, 265, 1264-1267.

35. Aronson A.I., Tyre11 D.J., Fitz-James P.s., Bulla L.A.fielationship of the sinthes^s of spore coat protein and parasporal crystall protein in Bacillus thuringiensis. J.Bacterid., 1982, 151, 399-4-10.

36. Barany D.B., Boeke J.D., Tomasz A. Staphylococcal plasmids that replicate and express eiytromycine resistance in both Streptococcus pneumoniae and Escherichia coli.

37. Proc.Natl.Acad.sci.UoA, 198З, 79, 2991-2995.

38. Bechtel D.B., Bulla L.A. Electron microscope study ofcrystall formation in Bacillus thuringiensis. J.Bacte-riol., 1976, 127, 1472-1481.

39. Behnke D., Golubkov V.I., Malke H., Boitsov A.s., Totolian A.A. Restriction endonuclease analisis of group A streptococcal pla^mids determining resistance to macroislids, lincosamids and streptogramin antibiotics. FEM Microbiol.Lett., 1979, 6, 5-9.

40. Brown B.J., Von Tersch M.A., Wilson C.E., Carlton B.C.

41. Characterization of the plasmid of Bacillus megaterium restriction endonuclease digestion, southern blotting analisis and partial denaturation mapping. Plasmid, 1980, 4, 305-315.

42. Brewin N.J., Beynon J.L., Johnston A.W.В. Ihe role of

43. Rhizobium plasmids in host specificity. Genetic Enge-neering of Simbiotic Nitrogen FicSation and Conservation of Fix Nitrogen (Eds J.M.Lyons, R.C.Valentine, D.A.Phillips, D.W.Rains, R.C.Huffaker) Plsmum Press, N.Y., 1981, 65-77.

44. Carlton B.C., Brown B.J. Physical mapping of a plasmidfrom Bacillus megaterium by restriction endonuclease cleavage. Plasmid, 1979, 2, 59-68.

45. Carlton B.C., Gonzales Jr., J.M. Plasmid-assotiated Deltaendotoxin production in Bacillus thuringiensis» In: Molecular Cloning and Gene Regulation in Bacilli. (Eds J.Hoch, A.T.Ganesan) Academic Press, H.Y. 1984.

46. Canosi U., Iglesias A., Trautner T. Plasmid transformationin Bacillus subtilis: effects of insertion of Bacillus subtilis DM into plasmid рС194. Mol.Gen.Genet., 1981, 181, 434-440.

47. Carreira L.H., Carlton B.C. Characterization of theplasmids of Bacillus megaterium: base composition and reassotiation kinetics analisis. Plasmid, 1980, 4, 316331.

48. Coote J.G. sporulation in Bacillus subtilis. Genetic analysis of oligosporogeneous mutants. J.Gen.Microbiol., 1972, 71, 17-27.

49. Chang S., Cohen b.N. High frequency transformation of

50. Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA. Mol.Gen. Genet., 1979, 168, 111-116.

51. Demerec M., Adelberg E.A., Clark A.J., Hartman P.E.

52. A proposal for uniform nomenclature in bacterial genetics. Genetics, 1966, 54, 61-76.

53. Dobritsa A.P., Dobritsa S.V., Tanyashin V.I. Isolationand characterization of plasmid from Bacillus brevis var. G.-B cells. Mol.Gen.Genet., 1978, 164, 195-205.

54. Donoghue H.D. Properties and comparative starch—gelelectrophoresis of megacins from several Bacillus me-gaterium strains. J.Gen.Microbiol., 1972, 72, 473-483.

55. Donovan E., 1-Tiezgodsf ii D.M., Twaddle G.M. Parasporalcrystal produced by oligosporogeneous mutant of Bacillus thuringiensis. Can.J.Microbiol.,1980, 26, 486-491.

56. Dubnau D. Genetic transformation Bacillus subtilis.1.: The Molecular Biology of the Bacilli (Ed. D.Dubnau) Academic Press, H.Y., 1982, 14-7-178.

57. Dulmage H.T. Insecticidal activity of isolates of Bacillus thuringidnsis and their potential for pests control. In: Microbial control of pests and plant de-SeaSes, I97O-I98O, (Ed. H.D.Burges) Academic Press, N.Y., 1981, 193-222.

58. Eckhardt T. A rapid method for the identification ofplasmid desoxiribonucleic acid in bacteria. Plasmid, 1978, 1, 584-588.

59. Ehrlich S,D, Replication and expression of plasmidsfrom Staphylococcus aureus in Bacillus subtilis. Proc.Natl.Acad.Sci.U^A, 1977, 75, 1433-1436.

60. Ehrlich »->garamella V. Barriers to the heterospe—cific gene expression among procariotes. Trends Bio-chem.Sci., 1978, 3, 259-261.

61. Espinosa M., Lopez P., Perez-Urena Т., backs C.A.1.terspecific plasmid transfer between Streptococcuspneumoniae and. Bacillus subtilis. Mol.Gen.Genet., 1982, 188, 195-201.

62. Faust E.M., Spizizen J., Gage V., Travers E.S. Extrachromosomal DM in Bacillus thuringiensis var.kurs-taki, var.finitimus, var.sotto and in Bacillus po-pillae. J.Invertebrate Pathol., 1979, 33, 233-238.

63. Faust B.M., Travers E.g. Occurence of resistance toneomycin and kanamicin in Bacillus popillae and certain serotipes of Bacillus thuringiensis. Mutation potential in sensitive strains. J.Invertebrate Pathol., 1981, 37, 113-116.

64. Faust E.M., Abe K., Held G.A., Izuka L.A., Bulla L.A.,

65. Meyers C.L. Evidence for plasmid-assotiated crystal toxin production in Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Plasmid, 1983, 9, 98-103.

66. Flock J.-I. Cosduction: Transduction of Bacillus subtilis with phage ^105 using a jd105 cosplasmid. Mol. Gen.Genet., 1983, 189, 301-308.

67. GlatronM.F., Eapoport G. Biosynthesis of parasporalinclusion of Bacillus thuringiensis: half-life of its corresponding messenger ERA. Biochimie, 1972, 54, 1291-1301.

68. Gonzales Jr.J.M., Carlton B.C. Patterns of plasmid

69. DM in crystalliferous and aerystalliferous strains of Bacillus thuringiensis. Plasmid, 1980, 3, 92-98.

70. Gonzales Jr.J.M., Dulmage H.T., Carlton B.C. Correlation between specific plasmids and ^-endotoxin production in Bacillus thuringiensis. Plasmid, 1981,5, 35,1-365.

71. Gonzales Jr.J.M., Carlton B.C. Plasmid transfer in

72. Bacillus thuringiensis. In: Genetic Exchange (Eds U.H.£treips, W.E.Guild, s.H.Goodgal, G.A.Wilson) H.Y., 1982.

73. Gonzales Jr.J.M., Brown B.J., Carlton B.C. Transferpof Bacillust thuringiensis plasmid coding о-endotoxin among strains of B.thuringiensis and B.cereus. Proc.Natl.Acad.Sci.UsA, 1982, 79, 6591-6595. ^

74. Gonzales Jr.J.M., Carlton B.C. A lage transmissibleplasmid is requiered for crystal toxin production in Bacillus thuringiensis variety israelensis. Plasmid, 1984, 11, 203-221.

75. Goze A., Ehrlich S.D. Replication of plasmid from

76. Staphylococcus aureus in Escherichia coli. Proc. Hatl.Acad.Sci.UbA, 1980, 77, 7333-7337.

77. Grosch J.C., Wooweber K.L. Transformation of Bacilluslicheniformis and Bacillus amyloliquefaciens protoplasts by plasmid DM. In: Genetic Exchange (Eds U.N. Streips, S.N.Goodgal, V/.R.Guild, G.A.Wilson) N.X. , 1982, 97-105.

78. Gryczan T.J., Contente Б., Dubnau D. Characterizationof btaphylococcal aureus plasmids introduced by transformation into Bacillus subtilis. J.Bacteriol., 1978, 134, 318-329.

79. Gryczan Т., Shyvacumar A.G., Dubnau D. Characterizaition of chimeric plasmid cloning vehicles in Bacillus subtilis. J.Bacteriol., 1980, 141, 246-253.

80. Gryzan Т., Gontente S., Dubnau D. Molecular cloningof heterologous chromosomal DШ by recombination between a plasmid vector and a homologous resident plasmid in Bacillus subtilis. Mol.Gen.Genet., 1980, 77, 459-467.

81. Gryczan Т., Hahn J., Contente S., Dubnau D. Replication and incompatibility properties of plasmid рЕ194 in Bacillus subtilis.J*Baot,1982, 152, 722-735.

82. Gryczan Т., Dubnau D. Direct selection of recombinantplasmid in Bacillus subtilis. Gene, 1982, 20, 459-469.

83. Hakkart H.J.J., Wesseling J.G., Veltkamp E., Nijkamp

84. H.J.J. Maintanance of bacteriocinogenic plasmid CloDP 13 in Escherichia coli cells. Mol.Gen.Genet., 186, 531-539.

85. Holland I.B. The purification and properties of megacin, a bacteriocin from Bacillus megaterium. Biochem. J., 1961, 78, 641-648.

86. Hopwood D.A. Genetic studies with bacterial protoplasts. Ann.Hev.Microbiol., 1981, 35, 237-272.

87. Horrinouchi S., Weisblum B. Nucleoted sequence andfunctional map of рЕ194, a plasmid that specifies inducible resistance to macrolid, lincosamide and streptogramin type В antibiotics. J.Bacterid., 1982, 150, 804-814.

88. Iizuka Т., Abe K., Faust E.M., Ohba M., Bulla L.A.isolation of covalently closed circular DM from Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, kuma-totocuensis and tochiquiensis. J.Sericult.^ci.Jap., 1982, 51, 209-217.

89. Imanaka Т., Figii I.I., Aiba t>. isolation and characterization of antibiotic resistance plasmid from thermophilic bacilli and contraction of deletion plas-mids. J.Bacterid., 1981, 146, Ю91-Ю97.

90. Imanaka Т., Fu$ii M., Aramori I., Aiba S. Transformation of Bacillus stearothermophilus with plasmid DMA and characterization of shuttle vector plasmid between Bacillus stearothermophilus and Bacillus subtilis. J.Bacterid., 1982, 149, 824-830.

91. Ivanovics G., Alfoldi L. A new anti-bacterial principle: megacin. Nature (London), 1954, 174, 465.

92. Kinney D.M., Bramucci M.G. Analysis of Bacillus subtilis sporulation with, spore-converting bacteriophage EMB12. J.Bacterid., 1981, 145, 1281-1285.

93. Klier A.P., Lecadet M.-M., Dedonder R. Sequential modification of DKA-dependent RHA-polimerase during sporogenesis in Bacillus thuringiensis. Eur.J.Bio-chem., 1973, 36, 317-327.

94. Klier A., Pargette P., Ribier J., Rapoport G. Cloningand expression of crystal protein genes from Bacillus thuringiensis strain berliner 1715. EMBO J., 1982, 1, 791-799.

95. Klier A., Parsot C., Rapoport G. In vitro transcriptionof cloned chromosomal crystal gene from Bacillus thuringiensis. Nucl.Acid Res., 1983, 11, 3973-3987.

96. Kono M., sasatsu M., Hamashima H. Transformation of

97. Bacillus subtilis with staphylococcal plasmid DKA. Microbious Lett., 1978, 5, 55-59.

98. Kreft J., Bernhard K., Gobel W. Recombinant plasmidcapable of replication in Bacillus subtilis and Escherichia coli. Mol.Gen.Genet., 1978, 162, 59-67.

99. Krieg A. Thuricin a bacteriocin produced by Bacillusthuringiensis. J.Invertebrate Pathol., 1970, 15, 291-294.

100. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning (A Laboratory Mammal). Cold Spring Harbor Laboratory, N.X., 1982.

101. Marrero R., Lovett P.*j. Interference of plasmid рСМ194with lysogeny of bacteriophage Бро2 in Bacillus subtilis. J.Bacteriol., 1982, 155, 284-290.

102. Martin Ph.A.¥., Lohr J.R., Dean D.H. Transformationof Bacillus thuringiensis protoplasts by plasmid deoxyribonucleic acid. J.Bacteriol., 1981, 145, 980-983.

103. Masaji IT., Nishitsutsuji-Uwo J. Sporoless mutant of

104. Bacillus thuringiensis: 3. The process of crystal formation. Tissue cell, 1980, 12, 233-242.

105. Michel В., Niaudet В., Ehrlich S.D. DNA cloning in

106. Bacillus subtilis. 4-. Transformation of competent cells by internally repeated plasmids. In: Molecular Cloning and Gene Regulation in Bacilli (Eds A.T.Ga-nesan, S.Chang, J.A.Hoch) Academic Press, ИГ, 1982, 73-82.

107. Michel В., Palla E., ITiaudet В., Ehrlich s.D. DRA cloning in Bacillus subtilis. III. Efficiency of random-segment cloning and insertional inactivation vectors. Gene, 1980, 12, 147-154.

108. Minnich a.A., Aronson A.I. Regulation of protoxinsynthesis in Bacillus thuringiensis. (in press),

109. Miteva V. I.,Characterization of 3 plasmids of Bacillus thuringiensis var.thuringiensis, 1 serotype. Compt.rend.Acad.Sci.Bulg., 1978, 31, 1024-1027.

110. Ochi Т., Xanagase У., Higashi X., Amano Т. A specific inhibitor of megacin A from Bacillus megaterium producing megacin A. Biken J., 1970, 13, 63-76.

111. Ozaki M., Higashi X., Saito H., An Т., Amano T.1.entity of megacin A with phospholipase A. Biken J., 1966, 9, 201-213.

112. Perlak P.J., Cathy L., Mendelson C.L., Thorne C.B.

113. Converting bacteriophage for sporulation and crystal formation in Bacillus thuringiensis. J,Bacterid., 1979, 140, 699-706.

114. Pol ale J., Novick R.P. Closely related plasmids from

115. Staphylococcus aureus and soil Bacilli. Plasmid, 1982, 7, 152-162.

116. Primose 6.В., Ehrlich ^.D. Isolation of plasmid delation mutants and stady of their instability. Plasmid, 1981, 6, 193-201.

117. Rostas K., Dobritsa S.V., Dobritsa A.P., Koncz Cs.,

118. Alfoldi L. Megacinogenic plasmid from Bacillus megaterium 216. Mol.Gen.Genet., 1980, 180,323-329.117. bcheer-Abramowitz J., Giyczan T.J., Dubnau D. Origin and mode of replication of plasmid рЕ194 and PUB110. Plasmid, 1981, 6, 67-77.

119. Schnepf H.E., Whitly H.R. Cloning and egression ofthe Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli. Proc.Katl.Acad.bci.U^A, 1981, 75, 2893-2897.119. ohivarova K., Por^ter W., Jacob H.-E., Grigorova R.

120. Possible origin and function of the parasporal crys tala in Bacillus thuringiensis. Biochem.Biophys.

121. Res.Com., 1978, 84, 581-588.

122. Tagg J.R., DaganiA.S., Wannamaken L.W. Bacteriocinsof gram-positive bacteria. Bacteriol.Rev., 1976, 40, 722-730.

123. Von Tersch M.A., Carlton B.C. Bacteriocin from Bacillus megaterium ATCC 19213: comparative studieswith megacin A-216. J.Bacteriol.,1983,155, 866-871.

124. Von Tersch M.A., Carlton B.C. Megacinogenic plasmidsof Bacillus megaterium. J.Bacterid., 1983, 155, 872-877.

125. Vorobjeva I.P., Khmel J.A., Alfoldi L. Transformationof Bacillus megaterium protoplasts by plasmid DNA. FEMs Microbiol.Lett., 1980, 7, 261-263.

126. Williams D.M., Duvall E.J., Lovett P.S. Cloning restriction fragments that promote expression of a gene in Bacillus subtilis. J.Bacterid., 1981, 146, 1162-1165.

127. Wong H.C., Bchnepf H.E., Whitly H.R. Transcriptionaland transiational sites for the Bacillus thuringiensis crystall protein gene. J.Biol.Chem., 1983, 268, 1960-1967.

128. Young M. The mechanism of Insertion of a segment ofheterologous DNA into the chromosome of Bacillus subtilis. J.Gen.Microbiol., 1983, 129, 1497-1512.

129. Yoshimura K., Xamomoto 0., Seki Т., Oshima X. Distribution of heterogeneous and homologous plasmids in Bacillus spp. Appl.Environment.Microbiol., 1983, 45, 1733-1740.

130. Yosten A.A. A method for the isolation of asporogenic mutants of Bacillus thuringiensis. Can.J. Microbiol., 1978, 24, 492-494.

131. Yu R.S.T., Hung T.V., Azad A .A. PlaSmid complementand sequence homology of some technological strains of lactic streptococci. Austral.J.Dairy Technol., 1983, 38, 104-109.