Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение процессов генетического обмена у молочнокислых стрептококов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение процессов генетического обмена у молочнокислых стрептококов"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОЛШШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

■к

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА У МОЛОЧНОКИСЛЫХ СТРЕПТОКОККОВ

Специальность 03.00.15 — Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1992

На правах рукописи

РУМЕР

Леонид Михайлович

Работа выполнена в лаборатории молочнокислых и анаэробных бактерий Научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов-

Научный руководитель:

кандидат биологических наук старший научный сотрудник

В. А. Лившиц

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор

Р. Р. Азизбекян

доктор биологических наук профессор

Л. С. Чернин

Ведущее учреждение: ВНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Защита диссертации состоится « 2 » февраля 1993 г. в /V часов на заседании Специализированного Ученого совета Д. 098.12.01 при Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1 Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИгсне-тика.

Автореферат разослан « 30» декабря 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук

Щербакова

Обшая характеристика работы.

Актуальность темы. Молочнокислые стрептококки используются в промышленности для производства кисломолочных продуктов и в сыроделии. С их помощью получают пептидный антибиотик низин, который является эффестквным и безвредным пищевым консервантом. Кроме того на их основе получат пробиотики, т. е. перпараты, содержащие яивые культуры бактерий, которые стимулируют рост и развитие сельскохозяйственных животных. Для создания эффективных производственных штаммов молочнокислых стрептококков с использованием современных генетических и генно-инженерных методов необходимо разработать и изучить системы генетического переноса для этих бактерий.

В настоящее время наиболее универсальным способом введения ДНК в клетки бактерий является метод трансформации протопластов. Удобной альтернативой этому методу могут явиться конъюгация и конъюгативная мобилизация. Кроме того, наличие плвз-мнд, способных к конъюгационному'переносу в исследуемые штаммы, может суюественно облегчить задачу разработки метода трансформации 'протопластов. Использование для этой цели, препаратов ДНК конъюгативных плазмид, выделенных из трансконъюгантов исследуемых штаммов, позволит избегать действие их систем рестрикции и адекват-но оценивать способность протопластов к трансформации.

Согласно традиционной классификации к молочнокислым стрептококкам относили представителей серологических групп N и D рода Streptococcus. Главным объектом настоящей работы являются представители группы N, которые, согласно современной классификации, объединены в род Lactococcus (молочные кокки, или лакто-кокки). Однако для решения поставленных задач использовались' тага» штаммы стрептококков группы D, которые в настоящее время объединены в род Enterococcus.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка и изучение процессов генетического обмена у молочнокислых стрептококков.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие экспериментальные задачи.

- Изучить возможность использования метода конъюгативной мобилизации для переноса в лактококки плазмид и транспозонов.

- Разработать надетый метод получения и трансформации

протопластов лактококков.

- Подобрать векторы, удобные для клонирования в лактокок-

ках.

- Определить локализацию в геноме штамма Lactococcus lactis АГСС 11454 генов биосинтеза низина.

- Использовать системы генетического переноса для конструирования штаммов лактококков, перспективных для промышленности.

Новизна результатов и научно-практическое значение работы. Разработан надежный метод получения жизнеспособных трансформируемых протопластов лактококков с.помощью лизоцима. Показано, что лактококки чувсвительны к лизоциму и что ключевыми факторами, определяющими способность их протопластов регенерировать ■ на гипертонической среде, являются концентрация лизоцима и время инкубации с этим ферментом в процессе протопластирования клеток. Осуществлена трансформация протопластов лактокококков плазмидами рСВ20 и pLF2, которые являются удобными векторами для клонирования и способны реплицироваться в грамположительных бактериях и в Escherichia coli. Протопласты дактококкков трансформированы плазмидами, производными рСВ20 и pLF2, с клонированными на них генами человеческого а2-интерферона, человеческого проинсулина и бактериальной а-амилазы, находящимися под контролем регуляторньк элементов гена а-амилазы В. amyloliquefaciens. Экспрессия этих генов в клетках лактококков была очень слабой или вообшэ не определялась. Показана экспрессия гена Б-галагсгозидазы S. salivarius var. thermophilic , клонированного на рСВ20, в клетках лактококков. Существенно расширен круг хозяев плазмзды рАК§31. С помощью плазмиды pAMpi осуществлена конъюгативная мобилизация плаз-мид, несущих гены метаболизма лактозы, из штаммов, сбраживающих этот углевод, в штамм, неспособный усваивать лактозу. Показано, что мобилизация осуществляется в результате коинтег-рации pAMBl и лакгозных плазмид. Грансконъюганты, хорошо сбраживающие лактозу, могут иметь промышленное значение. Установлено, что гены биосинтеза низина штамма L. lactis АТСС 11454 локализуются на хромосоме. С помощью конъюгационных скрещиваний гены биосинтеза низина перенесены в штаммы лактококков, обладающие ценными промышленными свойствами. Получен- . ные трансконъюганта являются эффективными продуцентами низина.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (включает материалы и методы, результаты, обсуждение результатов) и выводов; иллюстрирована 16 рисунками и 5 таблицами. Библиография содержит 18V наименований.

Апробация. Материалы диссертационной работы были доложены на Всесоюзной конференции молодых ученых "Молодежь - научно-техническому прогрессу'Ч Москва, 1987); Всесоюзном семинаре "Современные проблемы антибиотикорезистентности" ( Москва, 1988); Всесоюзной конференции "Новые направления биотехноло-гии"(Пущиш, 1988); Всесоюзной научно-технической конференции "Современная технология сыроделия и безотходная переработка молока" (Ереван, 1989), а также на межлаборагорном семинаре отдела у пекулярной генетики ВНИИгенетика

Материалы и методы.

Шгакмы бактерий и плазмидм (перечисляются только исходные штаммы. Происхождение штаммов, полученных в данной работе ясно' из контекста). Штаммы Enterococcus•faecal i s DS5; JH2-2, DS16C3 получены от D. В. Cleve 11 из Мичиганского университета, США; штаммы Lactococcus lactis subsp. lactis LP1T6 и LM3302 получены от L: L: McKay из университета Миннесоты, США; штаммы L. lactis subsp. lactis-25, 438, Зс, 551.7, 6D, HD, 15D, 203.10, 125.7, 220, 164с, ID, 3D. 40, 57.4, 1605, 90, 384, 20, 17D, 30, 36с, 157.3, 4154; L. lactis subsp. cremoris 244 , 3966, 151, 48a, 11, 160c, 168c, 18D, 19D, • 20D, 101; L. lactis subsp. lactis var. diacetylactis 419 из коллекции ВНИКМИ получены от В. Ф. Семени-хиной, ВНИКШ; L. lactis АТСС 11454 получен из музея ВНИИгене-тика; штаммы Bacillus subtil is 5 68 thr his, В. airyloliquefaciens A50, В. brevis 9999, В. cereus 21, В. coagulans 733 получены в музее ВНШгенетика; штаммы В. sphaericus 4 strl В. licheniforrois 7, В. megaterium 216, В. megateriimi БШ, В. thuringiensis. (рВС16), В. 'sp. АР19, В. sp. БП4, В. sp. ИК5 получены от H Ф. Рябченко; штаммы Е. faecíum М74 и Lactobacillus buchneri получены в лабораторной коллекции; штамм Escherichia coli TGI получен из музея ВНШгенетика. Штаммы В. subtil is с плазмидами рСВ20, pRTA6 получены от А. Сорокина; В. subtil is с плазмидами pBinsl, pRT84 получены от А. Новикова; Е. coli с плазмидой pLF2 получен иэ лабораторной коллек-

ции.

Среды и условия культивирования. Ддя выращивания молочнокислых стрептококков исползовалась разработанная нами среда Ißl с 1Z глюкозой, сахарозой или лактозой, в которую для тестирования способности лактококков и энтерококков сбраживать тот или иной сахар до молочной кислоты добавлялся индикатор бромкрезо-ловый пурпуровый в концентрации 40 мг/л. Изменение фиолетовой окраски среды вокруг колоний на желтую свидетельствовало о способности сбраживать сахар до молочной кислоты. Для выращивания штаммов Е. coli и бацилл использовалась среда Хоттингера. В опытах по конъюгационному переносу в бациллярные реципиенты использовалась минимальная среда Спицайэена с IX глюкозой , в которую в зависимости от потребностей штамма добавлялись необходимые аминокислоты.

Штаммы лактококков выращвались при теипературе 30eC без аэрации, штаммы энтерококков при 37°С без аэрации, бациллы и Е. coli при 37"С с интенсивной аэрацией.

Выделение ДНК. Выделение ДНК из лактококков и энтерококков в зависимости от цели опыта осуществляли по следующим методикам: 1) метод, описанный (Ыаниатис, 1984 ), адаптированный Kl Йомантасом для граыположительных бактерий, и затеи адаптированный в данной работе ддя лактококков и энтерококков, который в дальнейшем именуется обычным методом. Метод подробно описывается в тексте диссертации. В опытах по определению локализации гена предшественника низина использовались тага® методы (Anderson и McKay, 1983, LeBlanc и Lee, 1979, Hansen и Olsen, 1978). Метод (Hansen и Olsen, 1978) был адаптирован нами для ' применения к грамположительным бактериям. Выделение-ДНК из бацилл и Е. ■ col i осуществлялось по обычному методу.

Электрофорез препаратов ДНК осуществляли в 0.71 агарозном геле, в буфере-ТА, при напряженности 4 Б/сы.

Опыты по гибридизации ДНК - ДНК. Перед переносом ДНК по Саузерну из геля на нитроцеллюлозный фильтр гель инкубировали в 0. 25 Ы HCl как у (Vahl et el., 1979). Все' остальные операции, предшествующе переносу и сам перенос проводились как у (Маниа-тис, 1984). Высушенные фильтры прогревали при 80°С под вакуумом 4 ч.

Препараты ДНК для дот-гибридизации наносили как у (Маниа-тис, 1984).

В качестве зонда на структурный ген низина использовали 21-членник: ATGG6TTGTAACATGAAAACA. Зонд синтезирован В. IL Вейко. Для включения в зонд радиоактивной метки проводили реакцию с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 как у ( Маниатис, 1984). В качестве метки использовалиАТР с величиной удельной активности 4000 Ci/ммоль. На одну реакцию брали 25 пмоль зонда.

Предгибридизаиию фильтров осуществляли в растворе 6 х SSC, 5 х Денхардт, ДНК из спермы лосося 100 мкг/'мл при 65°С. Гибридизацию проводили при 48°С, 18 ч в растворе для предгибридиза-ции, в который добавляли раствор меченого зонда в смеси для реакции кинироЕания иэ расчета О. 3 мкл на 1 мл раствора . После гибридизации фильтр отмывали в 6 х SSC при 37®С до полного исчезновения радиоактивности в отмывающем растворе. Фильтр Еыеушивали и экспонировали в кассете при минус 70"С в течение 84 ч.

Рестригамонные эндонуклеааы были получены из лаборатории прикладной энзимологии БНИИгенетика и использовались в условиях рекомендованных изготовителем.

Трансформация пртотопластов и конъюгация. Методы получения и трансформации протопластов лактокококков и способы оптимизации условий конъюгации при скрещивании на фильтрах и на поверхности агаризованной среды разрабатывались в процессе выполнения настоящей работы и описываются в разделе "Результаты и обсуждение".

Активность низина в культуральной жидкости определяли по известной методике (Hurst. 1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

~L- Конгюгшиошый перенос и конъюгативная мобилизация в лактококки с помощью адз^иды EA.Mp.L_

Для решения задач, поставленных е работе, использовалась контюгативная плазмида pAKJil. идентифицированная в штамме Enterococcus raecalis DJ5 (Clewell et el, 1974). Она имеет молекулярную массу 17 мД, детерминирует устойчивость к антибиотикам группы MLS и может передаваться в различные грампо-ложительные бактерии. Показана также способность pAf/jpi осуществлять конъюгативную мобилизации неконъюгативных плазмид и хромосомы. В связи с этим интересно было изучить возможность

, - 6 -

переноса этой плазмиды в лактококки, а также попытаться использовать ее для мобилизации в лактококки бациллярных векторов.

Конструирование эффективного донора pAljgl. В нашей коллекции имелся штамм Enterococcus faecal is DS5, который несет плазмиду рМф1. Было известно, что из-за присутствия дополнительных плазмид, перенос pAMpi из клеток этого штамма происходит с низкой частотой. Поэтому для получения эффективного донора осуществлялся перенос pAMBl из штамма DS5 в бесплазмид-ный рещпиент Enterococcus faecal is JHS2. Полученные трансконъ-юганты использовались затем в качестве доноров pAM^l в скрещиваниях с бесплазмидным реципиентом Е. faecal is DS16C3. Были отобраны несколько клонов трансконъюгантов штаммов Е. faecal is JH2-2 и DS16C3 из которых эффективность переноса pAKjBl была максимальной и на два порядка превышала эффективность переноса pAl^Bl из Е. faecal is DS5.

Перенос в лактококки. В качестве доноров в

конъюгационных скрещиваниях со штаммами лактококков использовались один из высокоэффективных трансконъюгантов Е. faecal is JH2-2, обозначенный Е. faecal is (pAbjpl) и трансконъюгант штамма DS16C3, обозначенный DS16C3 (pAKJJl). В скрещиваниях на мембранных фильтрах удалось осуществить перенос рАК^З! во все использованные реципиенты L. lactis (табл. 1). Был осуществлен также обратный перенос pAl^l из трансконъюгантов всех штаммов в бесплазмидные DS16C3 и JH2-2.

li. íL Перенос pAMffl в бациллы. Для осуществления эффективной передачи плазмиды pAK^l в бациллы необходимо было подобрать условия, обеспечивающие хороший рост как бацилл, так и стрептококков, Смеси донора и реципиента осаждались на мембранные фильтры и помешались на поверхность богатой среды М21 с глюкозой. Инкубация проводилась при 30" С. В этих условиях эффективно растут как бациллы, так и стрептококки и подавляется спорообразование у бацилл. Отбор трансконъюгантов проводился на минимальной среде Спицайзена, содержащей эритромицин (25 мкг/мл). На этой среде стрептококки не растут. Нам удалось перенести pAMpl во все исследованные штаммы бацилл: В. sphaericus 4, В. ainyloliquefaciens А50, В. brevis 9999. В. cereus 21, В. coagulare 733, В. licheniformis 7, В.

Таблица 1. Частота конъюгационного переноса pAMBl в лактококки и из лактокококков (на клетку реципиента). Доноры pAMßl DS16C3 JH2-2 LP1T6 25 419 244 (pAljßl) (pAl^l) CpAMjgl) (pAl^l) (pAùjpl) (pAf^ft)

Реципиент

L.

lactis LP1T6 25 438 3c

561.7 var. diacet. 419 cremoris

244 E. faecalis DS16C3 JH2-2

-4

5x10 5x10* 2x10* 3x10

1x10

5x10

-4

3x10

1x10

5x10 5x10

-л

5x10 5x10

ixw3

3x1 er

5x10"* >1x10""* 3x10"* lxl Ö4

3x10

5x10

r*

lxlÖJ 2x1 б3 2x104

2x10

1x10

2x10

-i

' 2х10~* 1x10~*

megaterium 216, B. megaterium БП1, B. subtilis 168, B. thuringiensis 69-6, Bacillus sp. AP19, Bacillus sp. БП4, Bacillus sp. ИК5. Эффективность переноса варьировала в зависимости от реципиента: она была максимальной для штаммов В. 1 icheniformis, В. coagulans, В. sphaericus (10 на клетку реципиента) , тогда как для других видов - на два порядка низке. Исследовалась стабильность наследования pAhjBl в новых хозяевах. Едазмида нестабильна в клетках большинства штаммов бацилл и с высокой частотой элиминируется. Максимальная ста-' бильность плазмиды наблюдалась в штаммах В. thuringiensis, В. cereus, В. sp. ИК5: 96, 99, и 95% соответственно. Максимальная нестабильность pAMßl наблюдается в трансконъюгантах В. subtilis. При выращивании в неселективных условиях частота потери pAMJM составляла 100%.

1.4. Перенос pAMgl из бацилл в стрептококки. При использовании трансконъюгантов бацилл в качестве доноров pAMßl в скрещиваниях с молочнокислыми стрептококками удалось осуществить перенос из всех полученных трансконъюгангов бацилл во все штам-

мы стрептококков, использованные в качестве реципиентов. Высокие частоты переноса были получены для штаммов, перечисленных в табл. 2 .

Таблица 2. pAMBl из бацилл

Доноры pAMBl

В. thuririgiereis 69-6 В. megater-ium 216 В. 1 i chéri ¡forms 7 В. sphae-ricus 4 В. sp. ЖХ

В. coagulare

Результаты конъюгашонного переноса плазмиды в лактококки и энтерококки. Реципиенты

L. lac- L. lac- L. ere- L. lac- E. faec-tis 25 morís 244

is

LP1T6 1 xlO*6

2x10

-С

-¿

3x10

5x10

3x1

1x10

-â

,-6

1x10

1x10

3xl0£

5x10 *

3x10

K'ID

t i s var. al i з diacet. ÏH2-2

1x10

,-fc

1x10

1x10

3x10

¡ílO

1x10

■5

419

6

1x10 2x10"4

lxld6

K'10

{10

3x10

-5

ixio"6

2x10 е

5x10

5x10

3x10

5x10

§i_ КонъюгатиЕная мобилизация с помощью £)AMgL_ Штамм Е. faecal is D316C3 несет на хромосоме конъюгативный транспо-зон TnOlo, детерминирующий устойчивость к тетрациклину. Конъ-югативные возможности этого транспозона и высокая неспецифичность его транспозиции, благодаря которым он способен передаваться во многие виды грамположительных бактерий и итерироваться в их хромосомы и плазмиды, предполагают возможность его использования для транспозонного мутагенеза. В предварительных опытах по конъюгашюнному переносу Тп916 из Е. faecal is DS16C3 е Е. faecal is JH2-2 и в лактококки частота переноса была низкой. В одном скрещивании удавалось подучить. 5-10 колоний трансконъюгантов. 'В последующих опытах в качестве донора использовался трансконъюгант Е. faecal is DS16C3 (pAKJBl). Частота появления трансконъюгантов лактококков и Е. f aecal is JH2-2. устойчивых к тетрациклину, при этом повысилась на два порядка, что позволило получить 500-1000 колоний в ре-

- g -

зуяьтате одного скрещивания Среди ТсГтрансконъюгантов варианты, устойчивые к эритромицину, обнаруживались очень редко. Это указывают на то, что частота переноса-увеличивается за счет усиления коныогатганых возможностей транспозона в при-сутсвии pAKj3l.

Трансконъюганг В. thuringlensis (pMJjBl, рВС15) несет плазмиду рВС1б, которая используется в качестве вектора для клонирования в бациллах. Была предпринята попытка осуществить конъюгативную мобилизацию рВС1б из этого штамма в различные стрептококки. Эти попытки оказались безуспешными, по-видимому, в связи с тем, что рВС16 не может реплицироваться в лак-тококках. Во внутривидовых скрещиваниях, в которых реципиентом был штамм В. thuringiensi's , такой перенос осуществить удалось.

Гены лактозного метаболизма большинства известных штаммов лактококков локализуются на неконгюгативных плазмидах. Задача поиска новых плазмид, на которых' локализуются гены, обеспечивающие сбраживание лактозы, й разработки метода'переноса.этих плазмид в штаммы лактококков или других бактерий, которые .неспособны хорошо сбраживать лактозу, представляет практический интерес. В связи с этим изучалась 'возможность использования pAMßl для конъюгативной мобилизации лактозных•плазмид лактококков. С этой целью в скрещиваниях с бесплазмидным реципиентом LM3230 rf, в качестве доноров использовались штаммы L. lactis subsp. cremoris 244 ( p/J$31), subsp. lactis 25 (pAbjßl), и subsp. lactis var. diacetylactis 419 (pM£31) . В результате этих скрещиваний с частотой 10 на реципиента были получены Lac*" трансконъюгаяты LM3230 rf. Все трансконъюганты помимо способ- • но'сти сбраживать лактозу приобрели также устойчивость к эритромицину. Это свидетельствует о том, что pAMpi и лактозные гены переносятся совместно. •

Трансконъюганты LMD230 rf lac"егГиспользовались в качестве Доноров в скрещиваниях с бесплазмидным lac"реципиентом LMD230 strî" Частота переноса генов еггГи 1ас+в этих скрещиваниях была одинаковой и составляла 10 на клетку реципиента. Полученные результаты указывают на то, что в описанных выше скрещиваниях имеет место перенос коинтеграта рАМ)В1 и генетических элементов лактококков, несущих ла:стозные гены. Результаты злектрофорети-ческого анализа препаратов ДНК, выделенных из трансконъюгантов,'

- 10 -

подтвердили это предположение.

Разработка метода получения и трансформации протопластов лактококков и подбор векторов.

К моменту начала настоящей работы существовали литературные данные о получении протопластов молочнокислых стрептококков и их использовании в опытах по слиянию и трансформации протопластов . Как авторы, так и пользователи этих методов отмечали их низкую репродуцибельность. Во Есех этих исследованиях указывалось, что молочнокислые стрептококки проявляют высокую устойчивость клизоциму, ферменту, который наиболее часто используется для удаления клеточной стенки бактерий.' Авторы предлагали различные варианты преодоления этой трудности: длительная инкубация с лизоцимом в высокой концентрации (Gasson, 1980)), длительная инкубация с лизоцимом в присутствии вспомогательного фермента (неочищенного препарата бактериальной а-амилазы) (Okaraoto et al., 1983 ), замена лизоцима на мутанолизин (Kondo и МсКау, 1982).

2.1. Разработка метода получения протопластов лактококков.-Поскольку мутанолизин и фермент предложенный (Okamoto et el.) являются труднодоступными реактивами, первоначально изучалось влияние длительной инкубации с лизоцимом в' различных'концентрациях на прогопласгирование -клеток различных штаммов лактококков, имеющихся в нашей коллекции. Клетки выращивались до середины логарифмической фазы роста, а затем отмывались и ресуспен-дировались в гипертоническом буфере. После этого клетки обрабатывались лизоцимом в концентрациях от 50 до 2000 мкг/мл в течение 3 часов, В качестве осмотического стабилизатора использовалась 0,5 Ы сахароза. Контрольные пробы обрабатывались лизоцимом в буфере без стабилизатора. Предполагалось, что при оптимальной концентрации лизоцима, в пробирке без стабилизатора с течением времени будет -наблюдаться просветление инкубационной смеси из-за лизиса протопластов, а в пробирке со- стабилизатором мутность будет сохраняться. Такой тест использовался в ряде работ по подбору оптимальных условий протолластированкя'грамполош-тельных бактерий в том числе и лактококков . В предварительных опытах на В. subtilis этот тест оказался эффективным.

Однако при использовании этого тоста для подбора условий протопласткровшшя штаммов лактококков, использованных в настоящей работе, просветление суспензии если и наблюдалось, то

только параллельно в обеих пообирках, как в присутствии ста-

Таблица 3. Влияние различных концентраций лизоцима на просветление суспензий клеток лактококков в присутствии осмотического стабилизатора после 3 часов инкубации.

Штаммы Концентрация лизоцима .

(мкг/мл)

50 100 Й00 400 1000 2000

11454 + + + + + + ,

LM 3302 - - - + - + +

LP1T6 - + - + - + +

Примечание: + - сильное просветление

- просветление не наступает + - - неполное просветление

билизатора, так я без него (табл. 3). Динамика просветления зависела от штамма и от концентрации лизоцима.'

Результаты не изменялись при варьировании параметров, которые, согласно литературным данным, могут влиять на стабильность протопластов в растворе: температура, вид и концентрация стабилизатора, наличие ионое двухвалентных металлов. Полученные данные позволили предположить, что длительная инкубация клеток лактококков с лизоцкмси в высокой концентрации приводит к их лизису даже в присутствии осмотического стабилизатора При этом чувствительность к лизоциму существенно зависит от штамма Дальнейшая работа была связана с подбором оптимальных условий лизиса клеточной стенки. Для каждого штамма необходимо было найти такое сочетание концентрации лизоцима и длительности' инкубации с этим ферментом, которое обеспечило бы высокую выживаемость клеток и в то ж время высокий процент протопластирова-йия. Для этого клетки каждого штамма инкубировались в гипертоническом буфере различное время с различными концентрациями лизоцима и после этого высевались на среду М21 без осмотического стабилизатора для подсчета осмотически стабильных клеток и на один из двух вариантов регенерационной среды: среда М21, содержащая 0,5М сахарозу в качестве осмотического стабилизатора и среда (Okamoto et. el, 1983), специально разработанная для ре-

генерации протопластов лакгококков, в состав которой помимо 20Z сахарозы, используемой в качестве осмотического стабилизатора, входит желатина и ионы двухвалентных металлов - компоненты, которые в некоторых случаях положительно влияют на выживаемость протопластов. Результаты опыта суммированы в таблице 4 . Они не зависели от вида регенерационной среда Аналогичные результаты были получены при замене сахарозы на сукцинат. Введение в среду БСА, компонента, который предлагается в некоторых работах для повышения стабильности протопластов также не привело к изменению результатов. Во всех описанных выше опытах использовался лизоцим, который производится заводом им. Карпова для медицинских целей. Результаты опытов не изменились яри использовании лизоцимов, производимых фирмами " Serva", " Signa" и "CalBiocherrí Т. о., из полученных результатов видно, что главными факторами, определяющими эффективность получения и'регенерации протопластов лакгококков, являются концентрация лизоцима в инкубационной смеси и время инкубации с этим ферментом. Как видно из табл. 4 реакция клеток лакгококков на лизоцим характе- . ризуется высокой штаммоспецифичностыэ. На основе полученных данных были подобраны оптимальные условия протопластирования и регенерации протопластов для ряда промышленных штаммов лакгококков.

2.2. Разработка метода трансформации протопластов. Опыты по изучению трансформации протопластов наиболее удобно осуществлять на бесплазмидном штамме. В связи с этим с помощью метода-протопластирования и регенерации протопластов был получен Сесп-лазмидный вариант штамма L. lactis LP1T6, обозначенный L. lactis LMD230 rf. В штамм LMD230 гf с помощью "конъюгацинного скрещивания с донором Е. faecal is DS16C3 (pA^Bl) была введена плазмида ptäßl. Из полученного трансконъюганта L. lactis Ш3230 (рА)^В1) выделяли плазмидную ДНК, которая использовалась в опытах по трансформации протопластов исходного реципиента LM3230 rf. Б этих опытах протопласты отмывались и ресуспендировались в буфере SM и после добавления препарата pAMJBl обрабатывались полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000) в концентрации 22% 20 минут. После отмывки от ПЭГ протопласты ресуспендировались в бульоне М21 с 0.5 М сахарозой и перед высевом на регенерационную среду с эритромицином выдергивались различное время для того, чтобы произошла экспрессия генов устойчивости к эритромицину плазмиды.

Таблица 4. Влияние концентрации лизоцима и времени инкуба' ции с ним на выживаемость клеток и 1асиа

Штамм Концент- Время инку- % прото- % регенера-

рация бации пластир- ции на М21

лизоцима (мин.) ования с сахарозой

(мкг/мл)

L lactis 0 0

LP1T6 200 20 97.5 50

200 30 99,5 25

200 45 99,75. 12,5

200 90 99,9 3

200 120 >99,9 0,4

200 150 >99,9 1

^ 2000 10 99,95 1

" 2000 30/ >99.99 0,03

L. lactis 0 0

Lrn 3302 2000 .10 99,99 50

2000 ■ > 30 >99,99 10

2000 60. >99,99 ■ 1

L. lactis 0 0

ATCC 11454 50 10 1 10

50 30 99,98 1,5

50 60 >99,99 ' 0,02

L lactis 25 0 0 .

50 20 99 50

.100 20 99,75.г . 20

200 20 ,. 99,97 3,5

рАЫр1. При высеве на регенерационную среду были получены клоны, устойчивые к эритромицину.

Выяснилось, что инкубация в течение двух часов в жидкой гипертонической среде примерно на порядок снижает выживаемость протопластов. Это свидетельствует в пользу того, что нами полу-

- u - •

чены истинные протопласты, которые, как известно, не обладают способностью регенерировать и размножаться в жидкой питательной среде . Поэтому мы стремились максимально сократить время инкубации в бульоне, необходимое для экспрессии устойчивости к эритромицину. Оптимальные результаты были подучены при времени инкубации 40 минут. Частота появления колоний устойчивых к эритромицину составляла при этом 1(/на мкг ДНК Варьирование концентрации ЮГ приводило к снижению частоты трансформации. При этом повышение его концентрации приводило к снижению выжи-, ваемости протопластов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что предложенный метод получения протопластов позволяет осуществлять их трансформацию под действием ПЭР. Это позволило изучить возмож-■ ность использования в качестве векторов для лактококков плазмид более удобных, чем pAf^l. Б дальнейшем были проделаны опыты по трансформации лактококков плазмидами, сконструированными на ■основе репликона плазмиды pSM19035. Эта плазмида относится к той же группе несовместимости, что и pAf$31 и поэтому имелись основания предполагать, что ее производные будут экспрессиро^ ваться в лактококах.

2. 3. Трансформация лактококков плазмидами pRT84 и рСВ20.

Плазмида pRT84 содержит' область репликации и ген индуци-бельной устойчивости к эритромицину плазмиды PSM19035, а также ген а-амилазы В. amyloliauefaciens. Препарат плазмиды pRT84, выделенный из пггаммз В. sub^ilis (pRT84) и очищенный ? градиенте CsCl - BE, использовался в опытах по трансформации штамма L. lactis LM3230 rf. Первоначально частота трансформации составляла 5х1(^/мкг-ДНК. Оптимизация метода поз-

L

волила повысить частоту трансформации до 10 /мкг ДНК. Б оптимальных условиях протопласты сразу после отмывания от ПЭР, высеавались в мягком питательном агаре на слой твердого питательного агара, содержащего эритромицин в концентрации 0,4 мкг/мл. Такая концентрация обеспечивает' контрселекцию чувствительных к эритромицину клеток, позволяет выдерживать протопласты для возобновления экспрессии генов в слое мягкого агара, е котором протопласты хорошо регенерируют, и обеспечивает инд-кукцию генов устойчивости к эритромицину по мере диффузии антибиотика в мягкий агар. Такой способ высева использовался в дальнейшем для трансформации протопластов плазмидой рСВ20 и ее

производными рСВ20.

Плазмида рСВ20 является удобным двурепликонным вектором, который содержит репликой pSM19035 и репликон плазмиды p8R322. За счет этого рСВ20 может поддерживаться как в грамположитель-ных, так и в грамотрицательных бактериях. Как и pRT84, рСВ20 несет ген устойчивости к эритромицину. В описанных выше условиях были получены такие же частоты трансформации рСВ20, как и для pRT84.

2.4. Трансформация, лактококков плазмидой pLF2. Для того чтобы расширить круг плазмид, которые способны реплицироваться в клетках лактококках и могут быть использованными в экспериментах по молекулярному клонированию, исследовалась возможность их трансформации плазмидой pLF2. Плазмида pLF2 скоструирована на осрове криптической плазмиды Lactobacillus fermentum, и содержит ген устойчивости к хлорамфениколу плазмиды рС194. Показано, что эта плазмида может реплицирозаться в Е. coli. Частота трансформации в лактококки плазмиды pLF2 достигала l(f на мкг ДНК.

Плазмиды рСВ20, pRT84 и pLF2 были выделены из полученных трансформантов лактококков и вновь использовались для трансформации штамма LKD230 rf. Частота трансформации при этом на изменилась по сравнению с частотами, подученными для, препаратов этих плазмид, выделенных из В. subtil is. Это указывает на отсутствие в штамме LM0230 гГ системы рестрикции-модификации, снижающей частоту трансформации. ' .

Все трансформированные плазмиды' стабильно поддерживались в клетках трансформантов при их культивировании в несетектиеных условиях. Частота потери при этом была меньше чем 10 на клетку на генерацию.

2.5. Трансформация протопластов L. lactis плазмидами, на которых клонированы гетерологичные гены, и изучение экспрессии этих генов. Ранее во ВНМгенетика на плазмидах, производных PSM19035, были клонированы ген лейкоцитарного а2-интерферона человека - плазмида pRTA6, и ген человеческого проиксулина -плазмида pBinsl. Интересно было ввести эти гены в лактококки и изучить их экспрессию. Указанными плазмидами трансформировали штамм L. lactis LMD230 rf. Ресгрикционный анализ выделенных из трансформантов плазмид показал, что они содержат неизмененные плазмиды pRTA6 или pBinsl. Количественное определение уровня ;

синтеза проинсулина клетками лактококков, трансформированными плазмидой pBinsl, позволило тестировать незначительное количество проинсулина (5нг/л) в пробах культуральной жидкости, отобранных в середине логарифмической фазы роста. Примерно такое хе количество проинсулина удалось определить в клетках. (Содержание проинсулина определялось с помощью иммуноферментно-го анализа JL Д. Дунаевской). Синтез интерферона в клетках лак-тококков, трансформированных плазмидой pRTA6' определить не удалось. Ген проинсулина был переклонирован на плазмиду pLF2. В полученных трансформантах не наблюдали увеличения синтеза проинсулина по сравнерию с трансформантаыи, несущими плазмиду pBinsl.

Во всех использованных плазмидах клонированные гены находились под контролем регуляторных элементов 8. amyloliquefaciens. По-видимому, незначительная экспрессия этих генов связана с тем, что регуляторные элементы бацилл плохо функционируют в клетках лактококков.

2.6. Трансформация в дактококки гена JB-галактоз идазы salivarius var. therirophi lus. Б работе (Молотов с соавт., 1990; ген В-галактозидазы S. therirophi lus, был клонирован на плазмид! рСВ20. Значительный практический интерес представляет изучение экспрессии этого гена в клетках стамшв Lactococcus lactis, ко торые в подавляющем большинстве случаев утилизируют лактозу за счет фосфо-^-галакгозидазной активности. С этой целью плазмида рШ21, представляющая собой рСВ20 с клонированным на ней геном ^-галакгозидазы'Б. thermophilus, выделенная из Е. coli, исполь зовалась для трансформации различных штаммов лактококков. Удалось трансформировать этой, плазмидой штамм L. lactis LM0230 rf а также штаммы L. lactis var. ; diacetilactis 111 и L. lactis 144, для которых предварительно были подобраны условия получения и регенерации протопластов.

Присутствие в клетках L. lactis var. diacrtilactis 111 и L. lactis 144 плазмиды pMD21 привело к увеличению продукции В-галактозидазы этими штаммами на 80%. Трансформанты штамма LM0230 приобрели способность сбраживать лактозу, которой не оС ладалй клетки исходного реципиента. Плазмида рШ21 стабильно поддерживалась в трансформантах всех штаммов.

а_ Локализация генов биосинтеза низина в штамме lacti: АТСС 11454 и получение новых штаммов-продуцентов низина^

К моменту начала работы имелись многочисленные данные, указывающие на плазмидную локализацию генов биосинтеза низина в клетках штамма L. lactis АТСС 11454. Способность синтезировать низин с высокой частотой теряется под воздействием агентов, индуцирующих излечивание клеток от плазмид. Утрата этой способности коррелировала с потерей плазмиды pDR2 массой 30 мД. Был осуществлен конъюгационный перенос способности продуцировать низин в непродуцирующие реципиенты. Однако все попытки идентифицировать в трансконъюгантах плазмиду pDR2 или какую-либо другую дополнительную плазмиду оказались безуспешными (LeBlanc и Lee, 1973. Gonsales и Kunka, 1985, Steele и McKay, 1986).

3.1. Конъюгационный перенос генов биосинтеза низина в бесплазмидный реципиент. Известно, что результаты анализа плаз-мидного состава для одного и того же штамма могут существенно меняться в зависимости от метода выделения плазмидной ДНК . Поэтому, на' первом этапе работы осуществлялся конъюгационный перенос генов биосинтеза низина из L. lactis АТСС 11454 в бесп-лагмидный реципиент L. lactis LMD230 rf, для того чтобы затем осуществить сравнительный анализ плазмидного состава донора и трансконъюгантов, используя различные методы выделения.

В опытах по конъюгации использовалось то обстоятельство, что гены биосинтеза низина сцеплены с генами, детерминирующими способность сбраживать сахарозу. Реципиент LM3230 rf не способен утилизировать сахарозу, поэтому трансконъюганты этого штамма, приобретающие способность продуцировать низин, удобно отбирать на среде с сахарозой в присутствии индикатора. Поскольку предполагалось использовать Метод конъюгационого переноса для введения генов биосинтеза низина в различные промышленно важные штаммы лактококков, осуществлялась также оптимизация условий конъюгации. Оптимальные результаты удалось получить в условиях, при которых клетки реципиента отбирались для приготовления коншгационной смеси и высева ее на поверхность агара в поздней логарифмической фазе, а клетки донора - в ранней экспоненциальной фазе- роста с использованием а-химотрипсина, который наносили на поверхность агара (0,005 мкг/мм); а-химотрипсин инактиви-рует низин . В этих условиях частота конъюгации достигала 10~5 трансконъюгантов на клетку реципиента Снижение титра клеток реципиента по сравнению с контролем при этом не наблюдалось. Все проверенные трансконъюганты оказались способными продуциро-

вать низин. Десять клонов были проверены также на способность выступать в качестве доноров генов биосинтеза низина в скрещиваниях со штаммом L. lactis LM CpLF2). Все они проявили донор-ную активность.

3. 2. Сравнительна анализ плазмидного состава L. lactis АТСС 11454 и продуцирующих низин трансконъюгантов lactis LM3230 rf. В настоящей работе использовали четыре метода выделения плазмид. 1) Метод (Aderson и МзКау, 1983), специально разработанный для выделения плазмидной ДНК из молочнокислых стрептококков, который в настоящее время широко используется для выделения плазмид из грамположительных бактерий. 2) Метод (LeBlanc и Lee, 1979 ), также разработанный для выделения плазмид из стрептококков и уже применявшийся для определения плазмидного состава штамма L. lactis АТСС 11454. 3) Метод (Hansen и Olsen). Этот метод позволяет выделять большие плазмиды, которые, как известно, часто требуют особых условий выделения, а таюю? плазмиды, содержащие участки РНК. Метод был адаптирован в данной работе для грамположительных бактерий. 4) "Обычный метод". Этот метод успешно использовался в данной работе для выделения плазмид из лактококков, энтерококков и других грамположительных бактерий. Используя его в предварительных опытах, нам удалось идентифицировать даже-плазмиду pLM2301 в штамме L. lactis LP1T6, выделение которой, как известно, связано с существенными трудностями (Klaenhammer et al., 1978).

Результаты электрофоретического анализа ДНК донора и трансконъюгантов в основном совпадали для Есех перечисленных выше методов. В трансконъюгантах, полученных в результате скрещивания L. lactis АТСС 11454 с LM0230 rf' плазмид обнаружено не было.

Известно, что существуют плазмиды, которые при электрофорезе мигрируют на одном уровне с деградированной хромосомной ДНК. Для того чтобы получить препараты свободные от хромосомной ДНК, осуществлялось также выделение плазмидной ДНК в градиенте плотности CsCl-BE из всех анализируемых штаммов. При этом в реципиенте и трансконъюгантах плазмид обнаружено не было, а в L. lactis АТСС 11454 были обнаружены две плазмиды, которые при электрофорезе препаратов, неочищенных в градиенте были скрыты в хромосомной полосе.

Т. о. . несмотря на использование широкого набора методов

выделения ДНК, в клетках трансконъюгантов не удалось идентифицировать ни плазмиду pDR2, ни какую-либо другую плазмиду.

Для того чтобы решить, вопрос о локализации генов биосинтеза низина использовался метод гибридизации ДШ с олигонуклео-тидным зондом на ген, кодирующий предшественник низина. Такой зонд был синтезирован на основе данных о нуклеотидной последовательности этого гена (Buchman et al. , 1988).

3. 3. Гибридизация препаратов ДНК, выделенных из штамма L_ 1 actis ATCG 11454 с олигонуклеотидным зондом на ген предшественника низина. Для определения локализации гена предшественник ка низина препараты ДНК штамма L. lactis АТСС 11454 наносились в О. 7 % агарозный гель и после электрофореза переносились на нитроцеллюлозный фильтр для последующей гибридизации с олигонуклеотидным зондом. При гибридизации не удалось получить положительный ответ ни для одной из полос, соответствующих плазмид-ной ДНК. В полосе, соответствующей остаткам хромосомной ДНК удавалось получить слабый ответ. Это позволило предположить, что ген находится на хромосоме и что слабость ответа связана с недостаточной концентрацией хромосомной ДНК в препарате, полученном после обработки щелочью. Для повышения концентрации хромосомной ДНК в препаратах стадия обработки щелочью была исключена из процедуры выделения. В результате получались препараты, в которых концентрация хромосомной ДНК была примерно в 50 раз выше, чем в препаратах, полученных после обработки щелочью (рис. 1а) дорожки 1 и 6 ). Однако при электрофорезе такого препарата хромосомная полоса получалась очень широкой и скрьтала плазмидные полосы , которые- в обычных препаратах мигрируют выше хромосомы ( рис. 1а) дорожка 6 )

На рис 16), дорожка 1 видно, что ДНК , мигрирующая на уровне хромосомы в препарате, выделенном без обработки щелочью хорошо гибридизуется с олигонуклеотидным зондом. Контрольный препарат ДНК Е. со 1 ¡ IG! , полученный без обработки щелочью импульса не дал ( рис 16, дорожка 9). Этот результат указывает на то, что ген предшественника низина находится на хромосоме, а не на какой-либо плазмиде.

Для того, чтобы исключить предположение о том. что какая-либо из плазмид. мигрирующих выше хромосомы в препаратах, выделенных с обработкой щелочью, лучше выделяется без обработки щелочью и скрывается при электрофорезе в широкой хромосомной

Рис. 1. Результаты б.гот-гибридизации олигонугслеотидного зонда на ген предшественника низина с препаратами ЩК штамма L. ¡.actis АТСС 11454: а) Электрофореграммы препарате}; ШГи. 1. 11454, выделенный без обработки щелочью. г; 5 - coo?i.»?c?b-bho 2, 5, 10 и 20 -е разведения препарата 11454. выделенного обработки щелочью. 6 - 8 - соответственно препараты 11464. полученные после 30, 45 и 300 минут обработки щелочью. 9 препарат ДНК Е. coli TGI, полученный бег обработки имен..«.'. 16 ; ai-торадиограмма препаратов, изображенных на рис. Ja>. полученная после гибридизации с олигонуклеотидным зондом; нумерация соответствует нумерации рис. 1а).

полосе, были проведены электрофорез и гибридизация разведений 'препарата, полученного без обработки щелочью (рис. 1 а) и б) дорожки 2 - 5 ) и препарата, полученного после пятичасовой обработки щелочью ( рис. 1а) и 16) дорожки 8) ). Результаты показывают, что в разведенных препаратах плазмиды, мигрирующие выше хромосомы, не идентифицируются. Это указывает на то, что концентрация плазмид в таких препаратах не выше, чем в препаратах, полученных после обработки щелочью. Это подтверждается также тем, что пятичасовая обработка щэлочыо не приводит к снижению концентрации плазмид (рис. 1а) дорожка 8).

Отрицательный ответ при гибридизации с препаратом плазмиды, очищенным в градиенте СбСИ-ВЕ указывает на то, что ген предшественника низина не связан ни с одной из плазмид, скрывающихся в хромосомной полосе при электрофорезе.

Масса хромосомы лактококков примерно 2000 ЫД. Если предположить, что существует плазмида массой 30 Щ, на которой находится ген низина, то можно ожидать, что при гибридизации эта плазмида даст ответ такой же силы, что и хромосома, если ее взять в количестве в 65 раз меньшем по массе, чем хромосомы. На рис. 1а) и 16) дорожки 2-5, видно, что положительный ответ обеспечивает дате двадцатое разведение препарата, полученного без обработки щэлочыа В этом разведении массовая концентрг гия хромосомной ДНК примерно в 5 раз больсе, чем массовая концентрация плазмид, идентифицированных в препаратах, полученных после обработки делочыо ( рис 1а), дорожки 5-8). Это указывает на то, что отрицательный ответ при гибридизации плазмидных ДНК не связан с их недостаточным количеством.

При гибридизации с препаратами ДНК трансколгюгантов штамма ШУ230 гГ сильный ответ также удалось получить с препаратами, выделенными без щелочи.

Т. о., полученные результаты свидетельствуют о том, что ген предшественника низина штамма Ь. ¡асЫэ АТСС 11454 находится не на плазмиде, а на хромосоме.

Вывод о хромосомной локализации гена предшественника низина согласуется с гипотезой о том, что зтот ген расположен на транспозоне, который, возможно, является конъюгативным. В связи с этим представлялось интересным получить прямые даиоателъства способности генетического элемента, несущего гены биосинтеза низина, к транспозиции. !

- 22 - '

Описанные в настоящее время ксшъюгативные транспозоны характеризуются низкой специфичностью транспозиции и способностью к конъюгационному переносу в широкий круг грамположительных бактерий. Поэтому была предпринята, попытка осуществить транспозицию контыогативного элемента, несущего гены биосинтеза низина, на плазмиду pAMjBl в конъюгативных скрещиваниях L. lactis АТСС 11454 с L. lactis LM3230 гГ (pAkJil). В этих опытах было показано, что ни в одном из Ю^траксконъюгантов, которые приобрели способность продуцировать низин, не произошла транспозиция соответствующих генов в pALJBl. Это свидетельствует о высокой специфичности процесса интеграции данного генетического элемента в геном реципиента. То обстоятельство, что в скр.даваниях L. lactis АТСС 11454 с неродственными реципиентами В. rragaterium 216, L. buchneri и Е. faecium не удалось получить продуцирующих низин трансконъюгантов, свидетельствует о неспособности данного генетического элемента переноситься в клетки других видов бак-■ терий. Следовательно, если предполагаемый транспозон и существует, то он обладаэт свойствами, нетипичными для известных конъюгативных транслозонов.

3. 4. Перенос генов биосинтеза низина в промышленные штаммы лактококков. Получение новых шташов-продуцентов низина с помощью конъюгации может стать' эффективной альтернативой поиску . природных штаммов-продуцентов, а также использоваться для получения штаммов с целью составления низин-продуцирующих заквасок в кисломолочной промышленности и з сыроделие. В связи с этим осуществляли кояъюгационный перенос генов биосинтеза низина в промышленные штаммы лактококков. Штаммы L. lactis 438, Зс и L. cremoris 19D, неспособные сбраживать сахарозу, использовались в качестве реципиентов в скрещиваниях с донором L. lactis АТСС 11454. В условиях скрещивания, описанных ранее, для .каждого реципиента были получены трансконъюганты, способные продуцировать низин. Из нескольких клонов трансконъюгантов, полученных в каждом скрещивании, выделялась плазмидная ДНК. Плазмидный состав трансклнъюгатов не отличался от плазмидного состава исходных реципиентов. Трансконъюганты использовались в качестве доноров низиновых генов в скрещиваниях с непродуцирующими реципиентами и проявили способность выступать в качестве таких доноров.

Количественное определения уровня биосинтеза низина пока-загА", что трансконъюганты всех реципиентов являются высокоэф-

- 23 -

фектявными продуцентами этого антибиотика

Выводы.

1) Конъюгативная плазмида перенесена в клетки различных видов бацилл и штаммов лакгококков. Тем самым существенно расширен круг хозяев этой плазмиды.

2) Показано, что pAMßl мобилизует неконъюгативные плазмиды лактококков, несущие гены метаболизма лактозы. Мобилизация осуществляется за счет образования коинтегратов pAMBl с лактозны-ми плазмидами.

3) Разработан метод получения трансформируемых протопластов лактококков с помощью лизоцима. Показано, что длительная инкубация с лизоцимом и высокие концентрации этого фермента нарушают способность протопластов к регенерарации.

4) Протопласты лактококков трансформированы плазмидами . рСВ20 и pLF2. Обе плазмиды содержат сайты, удобные для клонирования, способны'реплицироваться как в грамположительных б airre- ■ рйях,.так и в Е. coli, и стабильно поддерживаются в лактокок-ках.

5) ©гаммы лактококков трансформированы плазмидами, производными рСВ20 и pLF2, с клонированными на них генами зукариоти-чёского и прокариотического происхождения: человеческого а-? интерферона, человеческого лроинсулина, а-амилазы В. amyloliquefaciens, ß-галактозидазы S. therirophilus. Обнаружена экспрессия гена JJ-гаяактозидазы в лактококках," экспрессия остальных генов была незначительной или отсутствовала

6) Показано, что ген предшественника пептидного антибиотика низина в штамме Lactococcus lactis АТСС 11454 локализуется на хромосоме.

7) С помощью конъхзгационных скрещиваний-гены биосинтеза низина введены в промышленные штаммы лактококков. Полученные трансконъвганты эффективно продуцируют низин.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Румер Л. М., Лившиц Е А. Трансформация сферопластов Streptococcus lactis плазмидами. Биополимеры и клетка, 1990, 6, 100-104.

2. Молотов С. Е , Данилевич в. Н., Дужий Д. Б. , Румер Jl М., Лившиц Е А., Суходолец Е Е Структура гена ^ß-гапактсзидазы i

- 24 - ■

Streptococcus thermophilus и его экспрессия в клетках Escherichia coli и Streptococcus diacetylactis 144. Иол. Генет. Микробиод. Вирусол., 1991, б, 24-29.

3. Румер Л iL , Лившиц Е А. Ген предшественника пептидного антибиотика низина Lactococcus lactis АТСС 11454 локализуется на хромосоме. Биотехнология, 1992, 3, 20-24.

4. Рябчёнко Е Ф., Румер Л М., Лившиц Е L , Козлов Ю. К. Конъюгационный перенос плазмиды pAMßl в бациллы разных видов. Мол. Генет. Микробиод. Зирусол. . 1938, 8, 23-28.

5. Рябченко Н. Ф. , Румер Л. М. Конъюгационный перенос плазмиды pAMßl между бациллами и стрептококками. В сборнике докладов Конференции молодых ученых "Молодею - научно-техническому прогрессу. 1987, Москва

6. Румер JL М. , Абилев С. К., Семенова Е. Е , Рябченко а Ф. , Лившиц К А. Конъюгационный перенос плазмиды pAMßl, несущей детерминанты устойчивости к макролидным антибиотикам, между различными грамиолокителькыми бактериями. В сборнике докладов Всесоюзного семинара "Современные проблемы антибиотикоре-зистентности. " 1988, Уэсква.

7. Лившиц & А. , Румер Л. Ы. Получение и трансформация протопластов Streptococcus lactis. В сборнике докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии.". 1988, Цуда-но.

8. Румер JL М., Лившиц Е А. Трансформация сферопластов Streptococcus lactis. В сборнике докладов всесоюзной конференции, 1989. Цущино.

9.' Лившиц Е А., Румер Л. М. , Семенова Е. Е Введение плазмид в клетки молочнокислых бактерий с помощью трансформации протопластов и конъюгации. Материалы Всесоюзной Научно-технической Конференции/'Современная технология сыроделия и безотходная переработка молока," 1989, Ереван.

10. Rumer L. М , Livshits V. А. Gene encoding the peptide antibiotic nisin precursor' in Lactococcus lactis ATCC 11454 is located on its chromosome. 11-th International Meeting on ' Genetic Transformation, Budapest, 1992.