Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

b-галактозидаза микромицета Penicillum canescens F-436

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Черемушкина, Ирина Валентиновна, Воронеж

.-'Л # fi Г\ Г" : J О S

¿»v « U ij — h > -Ï «Л ; — f /

w , ■ v w» « j - v, ,

Воронежская государственная технологическая

академия

На правах рукописи

Черемушкина

Ирина Валентиновна

[3-ГАЛАКТОЗ ИДАМ МИКРОМИЦЕТА PENICILLIUM CANESCENS F-436. ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Специальность 03.00.23 - Биотехнология Диссертация

на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Н.А. Жеребцов

Научный консультант кандидат технических наук, доцент О.С. Корнеева

Воронеж -1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробные источники (3-галактозидазы 9

1.2. Направленный биосинтез (3-галактозидазы

ю

1.3. Влияние состава питательной среды на биосинтез (3-галактозидазы

1.4. Влияние условий культивирования микроорганизмов на биосинтез (3-галактозидазы

1.5. Выделение' и очистка препаратов (3-галактозидазы /У

1.6. Физико-химические свойства 2,0

1.6.1. Стабильность и оптимальные условия действия (З-галактозидаз £()

1.6.2. Специфичность действия (З-галактозидаз

1.6.3. Влияние ингибиторов и активаторов на

активный центр фермента ££

1.7. Применение (З-галактозидаз Л? ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследований 3{

2.2. Методы определения (З-галактозидазной активности

3<

2.3. Культивирование продуцентов 33

2.4. Биохимические и микробиологические методы исследовании

2.5. Получение технических препаратов (3-галактозидазы

2.6. Получение высокоочищенного препарата (3-галактозидазы

2.7. Определение молекулярной массы 35

2.8. Электрофоретические исследования фермента 38

2.9. Математическое планирование эксперимента и статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. ВЫБОР АКТИВНОГО ПРОДУЦЕНТА

Р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ. ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ БИОСИНТЕЗА ГРИБНОЙ Р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

3.1. Подбор продуцента Р-галактозидазы ^д

3.2. Влияние некоторых факторов на биосинтез

Р-галактозидазы АО

3.3. Изучение влияния компонентов питательной среды

на биосинтез р-галактозидазы грибом Р. сапезсеш Г-436 ¿/6

3.3.1. Влияние различных источников углерода на рост Р. сапезсепБ ¥-436 и биосинтез Р-галактозидазы

3.3.2. Влияние минерального и органического азота

на биосинтез Р-галактозидазы „ 46

3.3.3. Зависимость синтеза Р-галактозидазы Р. сапезсепБ Р-436

от соотношения углерода и азота в питательной среде Si

3.4. Разработка питательных сред для Р. сапеБсепБ Р-436 53

3.5. Оптимизация питательной среды для Р. сапеэсепз Б-436 продуцента Р-галактозидазы ^^

3.6. Заключение •

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА

Р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО СВОЙСТВ

4.1.

4.2.

Получение технического препарата р-галактозидазы Р. сапезсеш Р-436

Очистка р-галактозидазы Р. сапезсепв Г-436

6д

4.3. Исследование некоторых физико-химических

свойств Р-галактозидазы микромицета Р. сапеБсеш Р-436 ^

4.4. Кислотная и термическая инактивация р-галактозидазы

4.5. Идентификация функциональных групп активного

центра Р-галактозидазы 30

4.6. Заключение дд

"" с.

ГЛАВА 5. КИСЛОТНЫЙ И ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ

ГИДРОЛИЗ ЛАКТОЗЫ »

5.1. Кислотный гидролиз лактозы <02

5.2. Ферментативный гидролиз лактозы Юд

5.3. Сопоставление механизмов ферментативного

и кислотного гидролиза лактозы НО

ГЛАВА 6. ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ В ПРОИЗВОДСТВЕ ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ

6.1. Исследование процесса гидролиза сиропа лактозы ферментным препаратом р-галактозидазы

Р. сапевсепз Р-436 420

6.2. Влияние ферментативных гидролизатов на процесс брожения теста

6.3. Выбор технологии булочных изделий на основе положений теории нечеткой логики

6.3.1. Математическое обеспечение теории /36

6.3.2. Практическое применение теории нечеткой

логики к выбору технологии производства булочных изделий 433

выводы

ЛИТЕРАТУРА ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Ферменты широко используются в народном хозяйстве нашей страны. Особенно актуально их применение в пищевой, легкой промышленности, медицине, генетической инженерии. Ферментные препараты уникальны по своей природе, они позволяют получить продукты высокого качества и с большим выходом.

В исследовании ферментов наиболее актуальными являются такие вопросы, как биосинтез, физико-химические свойства, расшифровка механизма катализа. Решение этих вопросов имеет важное практическое значение с точки зрения рационального использования ферментных препаратов и интенсификации технологических процессов.

Среди гидролитических ферментов, нашедших свое применение в промышленности, важное место занимает ß-галактозидаза.

ß-Галактозидаза (К. Ф. 3.2.1.23) осуществляет гидролиз ß-1,4-гликозидной связи в лактозе. Образующийся гидролизат находит широкое применение в пищевой промышленности. Биотехнология ферментного препарата связана с подбором эффективных продуцентов ß-галактозидазы. В решении данного вопроса перспективными являются микромицеты рода Pénicillium, Aspergillus и другие, которые продуцируют экзогенную ß-галактозидазу.

Настоящая работа выполнилась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии по проблеме «Изыскание оптимальных условий микробного синтеза ферментов и исследование их физико-химических свойств». Данная проблема включена в Координационный план РАН по программе «Микробиологический синтез и

научные основы микробиологического получения практически ценных веществ».

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлось выделение высокоспецифичного продуцента Р-галактозидазы, получение активного препарата для гидролиза лактозосодержащего сырья, исследование его некоторых физико-химических свойств и механизма катализа.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решить следующие задачи:

• отбор * активного продуцента Р-галактозидазы среди микромицетов;

• исследование условий биосинтеза Р-галактозидазы и рационального режима культивирования продуцента;

• разработка эффективного метода выделения и очистки Р-галактозидазы из культуральной жидкости при глубинном культивировании продуцента;

• исследование некоторых физико-химических свойств Р-галактозидазы: рН - и температурного оптимума действия, рН - и термостабильности фермента;

• идентификация функциональных групп активного центра фермента, исследование механизма действия Р-галактозидазы;

• сопоставление режимов ферментативного и кислотного гидролиза лактозы;

• использование препарата р-галактозидазы в производстве пищевых продуктов.

Научная новизна. Отобран микромицет Pénicillium canescens F - 436, осуществляющий активный биосинтез Р-галактозидазы; подобраны

рациональные условия биосинтеза и состав питательной среды для глубинного культивирования микромицета; разработан способ получения препарата р-галактозидазы и предложена схема его очистки. Найдены оптимальные рН и температура действия фермента. Исследован процесс термической и кислотной инактивации Р-галактозидазы. На основе экспериментальных данных произведено сопоставление режимов кислотного и ферментативного гидролиза лактозы. Показана целесообразность применения ферментного препарата в производстве некоторых хлебобулочных изделий.

Практическая значимость работы. Штамм Pénicillium canescens F-436 рекомендуется для ферментной промышленности в качестве продуцента Р-галактозидазы.

Препарат р-галактозидазы апробирован при производстве хлебобулочных изделий в АО «Псковский хлебокомбинат». Рассчитана экономическая эффективность использования ферментного препарата при производстве булочных изделий, которая составляет 232 тыс. руб. в год.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Микробные источники ß-галактозидазы.

ß-Галактозидаза (ß-D-галактозид-галактогидролаза, лактаза, КФ 3.2.1.23) является одним из самых распространенных ферментов, катализирующих гидролиз гликозидных связей.

Фермент найден в животном и растительном мире, но особенно активно синтезируют ß-галактозидазу различные микроорганизмы.

ß-галактозидазы микробного происхождения вызывают всё больший интерес из-за возможности увеличения продуктивности продуцента за счет селекции и направленного биосинтеза, сравнительно невысокой их стоимости.

Довольно полно изучена ß-галактозидаза, образуемая прокариотами -бактериями рода Eschrichia, Bacillus, Aeromonas, Aerobacter, молочнокислыми стрептококами [ 112, 122, 124, 136, 166, 174]. Наиболее широко из перечисленных прокариотов исследована ß-галактозидаза Е. coli, ставшая классической моделью в исследованиях по индукции и репрессии синтеза ферментов [107,133,138,145,160,161, 163, 171].

Однако с практической точки зрения наибольший интерес представляют эукариоты. Так как способность продуцировать экзогенную ß-галактозидазу найдена только у микроскопических грибов [42]. Это облегчает выделение фермента. Дрожжи накапливают значительную биомассу в отличие от бактерий. В качестве наиболее пригодных продуцентов для получения эндогенной ß-галактозидазы известны дрожжи Candida pseudotropicalis, Kluyveromyces bulgaricus, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces (Kluyveromyces) fragilis, Torulopsis versatilis, Torulopsis

spherica [44, 78, 94, 106, 114, 115, 118, 128, 129, 132, 137, 151, 153, 158, 179, 182, 186, 188].

Среди грибов подробно исследованы представители родов Aspergillus, Mucor, Penicillium [3, 16, 65, 95, 96, 97, 99, 101, 102, 104, 123, 126, 149, 150, 155, 157, 178, 180, 181, 184, 187, 188].

Актиномицеты как возможные продуценты р-галактозидазы изучены мало. Это связано, по всей видимости, с низким температурным оптимумом их действия. Большинство работ посвящено изучению возможности использования индуцированного синтеза Р-галактозидазы у актиномицентов рода Streptomyces [139, 176, 183].

Анализ литературных источников показал, что ферменты, полученные из разных таксономических групп, сильно отличаются по своим свойствам. Наиболее перспективными в производственном отношении являются продуценты, секретирующие . р-галактозидазу в культуральную жидкость.

1.2 Направленный биосинтез Р-галактозидазы

Направленный биосинтез ферментов можно осуществлять, применяя физиологические методы воздействия без изменения структуры генома, путем создания необходимых условий факторами внешней среды.

Способность продуцировать какой - либо конкретный фермент сильно варьируется у различных штаммов даже одного рода.

Большинство ферментов микроорганизмов являются индуцибельными. Такие ферменты обычно присутствуют в клетке в малых количествах, но их содержание резко возрастает в присутствии в среды специфических индукторов, которые могут усиливать биосинтез ферментов, не влияя или подавляя биосинтез других.

Теория регуляции активности генов, разработанная лауреатами Нобелевской премии Жакобо и Моно, лежит в основе экспериментальных исследований направленного биосинтеза биологически активных веществ [24, 25, 138, 145].

Роль индуктора выполняет чаще всего субстрат соответствующих

'О

ферментов или его структурный аналог.

В дрожжевых клетках Kluyveromyces lactis индуцированный синтез [3-галактозидазы начинался через 10-15 мин после добавления в питательную среду индуктора. В качестве индуктора использовали лактозу, галактозу, лактобионовую кислоту [119].

Индуцированный синтез [3-галактоз ид азы в микроскопических грибах изучен недостаточно.

Интенсивный синтез внеклеточной |3-галактозидазы Alternaría tenuis происходил в присутствии арабинозы, галактозы и лактозы [77].

Из микромицета Neurospora crassa были выделены две )3-галактозидазы: внутриклеточная и внеклеточная [100, 109, 111]. В первом случае лучшими индукторами были лактоза и целлобиоза, для внеклеточного фермента - ксилоза и галактоза. По данным [123], добавление лактозы или D-галактозы, к питательной среде при культивировании A. nidulans индуцирует синтез только внутриклеточной (З-галактозидазы.

В литературе имеются данные, описывающие конститутивную природу синтеза [3-галактозидазы микроскопическими грибами, когда фермент образуется в отсутствии веществ являющихся потенциальными индукторами. Добавление лактозы при культивировании Scopulanopsis sp. не оказывало существенного влияния на образование фермента. Внеклеточную (3-галактозидазу культура продуцировала при росте на среде с пшеничными отрубями [164]. На жидкой среде с крахмалом и пептоном, и на твердой

среде с пшеничными отрубями, без добавления лактозы, синтезировалась внеклеточная ß-галактозидаза микромицетом A. oryzae [162]. Однако при выращивании микроорганизмов на сложных средах, содержащих пектин, крахмал, пшеничные отруби, соевую муку, нельзя полностью исключить присутствие веществ, которые могли бы оказаться индукторами.

Одним из механизмов регуляции синтеза фермента различными продуцентами является катаболитная репрессия.

Было установлено наличие катаболитной репрессии, как способа контроля синтеза индуцированного фермента, у Е. coli [108] и у Streptococcus lactis [111]. Введение в среду глюкозы или других легкометаболизируемых источников углерода ингибировало синтез ß-галактозидазы у многих грибов [77, 119, 123, 131, 135, 143,165, 171, 177].

Изучение механизмов контроля биосинтеза ферментов дает возможность повышать выход ферментов с помощью методов физиологического воздействия.

1.3. Влияние состава питательной среды на биосинтез ß -галактозидазы

Состав питательной среды во многом определяет интенсивность биосинтеза ферментов. Изучение закономерностей роста микроорганизма и биосинтеза фермента на средах'определенного состава позволяет подобрать дешевые и доступные комплексные среды для промышленного применения.

Углеродосодержащие соединения служат источником энергии для микроорганизмов. Кроме того, эти соединения являются основным пластическим материалом клетки и имеют важнейшее функциональное • значение [48].

Одним из самых благоприятных источников углерода для биосинтеза ß-галактозидазы большинства микроорганизмов является лактоза [84, 95, 101, 175, 185]. Часто в качестве источника углерода используется молочная сыворотка, которая содержит 4,0 - 4,8 % лактозы [6]. Потребность различных продуцентов в лактозе неодинакова. Например, увеличение концентрации лактозы выше 4 % ингибировало синтез ß-галактозидазы у Saccharomyces fragilis, возможно за счет катаболитной репрессии [79], в то время как наибольшая удельная активность ß-галактозидазы Candida pseudotropicalis [114] достигается при культивировании на питательной среде с 10 - 12 % молочной сыворотки.

Предположение о ингибировании синтеза ß-галактозидазы за счет катаболитной репрессии у Saccharomyces fragilis подтверждаются данными [186]. Уровень образования фермента на среде с 5 % лактозы или галактозы одинаков, в то время как внесение 5 % глюкозы подавляет рост культуры.

В качестве источника углерода в питательную среду для выращивания микроскопических грибов вводили различные углеводы: галактозу, рафинозу, ксилозу, арабинозу, целлюлозу, глицерин, дульцит, арабитол [80, 91, 110, 134, 141].

В состав комплексных сред для биосинтеза ß-галактозидазы микроскопическими грибами часто входят естественные богатые органическими соединениями продукты и отходы ряда производств: пшеничные отруби, растворимый картофельный крахмал, декстрины, сахароза, глюкоза, соевая мука и сорбитол [53, 80, 101, 157, 162, 164]. Питательная среда для A. niger, продуцирующая конститутивно ß-галактозидазу, может содержать пшеничные отруби, молочную сыворотку или гидролизованный кукурузный крахмал [52].

Таким образом, способность ряда продуцентов [3-галактозидазы использовать в качестве источника углерода отходы ряда производств, позволяет подбирать в промышленности дешевые и доступные комплексные среды.

Кроме источника углеродного питания, микроорганизмам для нормального роста, развития и биосинтеза ферментов необходим источник азота. Азот играет важную роль в обмене веществ микроорганизмов. Большинство их способно усваивать нитратный и аммонийный азот, многие нуждаются в органических формах азота, некоторые способны усваивать наряду с другими формами атмосферный азот [6, 41, 63].

Очень часто состав сред, используемых для культивирования как дрожжей, так и грибов, синтезирующих (З-галактозидазу, входят такие аммонийные соли минеральных кислот , как гидрофосфат аммония, сульфат аммония и нитрат аммония [52, 53, 75, 78, 84, 157]. Аммонийные соли считаются более доступными, поскольку атом азота включается в клетку в основном в виде иона аммония [6, 63].

Следует отметить, что использование в составе сред только неорганических источников азота не обеспечивает высокого уровня синтеза (3-галактозидазы. Поэтому наряду с источником минерального азота вводили дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт, пептон [78, 79, 84, 114, 141, 162, 186].

Потребность в азотистых веществах для Kluyveromyces fragilis обеспечивают пептон, гидролизат казеина; введение их в питательную среду повышало биосинтез фермента в 4 раза; для A. niger - соевая мука, казеин, пивные дрожжи; для Р. multicolor - пептон, эестракт солодовых ростков, дрожжевой экстракт; для A. oryzae АТСС 20423 - дрожжевой экстракт,

пептон, мясной экстракт , кукурузный экстракт, экстра