Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение препарата грибной β-галактозидазы для коррекции лактазной недостаточности

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение препарата грибной β-галактозидазы для коррекции лактазной недостаточности"

На правах рукописи

СУХИХ Ольга Анатольевна

г

ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА ГРИБНОЙ р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ЛАКТАЗНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

Специальность 03.00.23. — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1111111111111Ш11Н111

003066262 Москва-2007 I_______]

Работа выполнена в лаборатории биологически активных веществ Научно-технического центра «Лекарства и биотехнология» (НТЦ «Лекбиотех»)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук БРABOBA Галина Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ГРАДОВА Нина Борисовна

кандидат технических наук, доцент ВОЙНО Людмила Ильинична

Ведущая организация: Институт микробиологии

им. С.Н Виноградского РАН

Защита состоится « 4$> » (Жт<Ы1<Л 2007 г. В ч мин

на заседании диссертационного совета ДМ.212.204 13 в Российском химико-технологическом университете им. ДИ Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., д.9.

С диссертационной работой можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ им. Д И. Менделеева

Автореферат диссертации разослан «. 42 » 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат технических наук ШакирИВ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Ферменты широко используются в различных отраслях промышленности, сельского хозяйства, научных исследованиях, медицине В последние годы в мире значительно возрос объем производства ферментов для медицинских целей, причем около 50% из них получают из микробного сырья. Наиболее емким является рынок пищеварительных ферментов Это связано с тем, что с ухудшением экологической обстановки и повышением психо-эмоциональных нагрузок, число людей, страдающих нарушениями пищеварения из-за ферментной недостаточности, растет из года в год Одна из серьезных патологий - непереносимость молока, встречающаяся у 15-30% населения России [Жвавый и др, 1991; Козлов, 1992], обусловлена дефицитом в организме человека фермента лактазы (Р-галактозидазы), который вырабатывается в тонком кишечнике и катализирует расщепление лактозы (молочного сахара) на глюкозу и галактозу, которые затем легко всасываются в кровь Из-за недостатка лактазы (гиполакгазии) больные вынуждены исключать из рациона молоко и молочные продукты [Валенкевич, 1989], что особенно опасно для детей грудничкового возраста.

Коррекция лактазной недостаточности может быть осуществлена двумя путями использованием молочных продуктов с частично гидролизованной лактозой, либо приемом лекарственных препаратов, содержащих фермент лактазу

В нашей стране производство низколактозных молочных продуктов и лекарственных средств для восполнения дефихщта лактазы отсутствует Импортные препараты, закупаемые в ограниченном количестве, не удовлетворяют спрос в нужном объеме В связи с этим создание конкурентоспособного отечественного универсального препарата Р-галактозидазы, который может быть использован как для предварительного гидролиза лактозы в молочных продуктах, так и для приема внутрь, является весьма актуальным и практически важным

В НТЦ «Лекбиотех» на основе микроскопического гриба РетсМгит сапеясет Р-178, активного продуцента р-галактозидазы, разработана технология получения ферментного препарата Лактоканесцин Г20Х, предназначенного для

гидролиза лактозы в молочной сыворотке и разрешенного к использованию в пищевой промышленности Однако при гидролизе лактозы молока препаратом Лак-токанесцин было обнаружено изменение органолептических показателей обрабатываемого продукта, что указывало на недостаточную степень очистки р-га-лактозидазы от сопутствующих ферментов и на невозможность использования препарата для получения низколактозного молока и коррекции дефицита лактазы Результаты проведенной работы явились основой для исследований по получению из препарата Лактоканесцин препарата |3-галактозидазы медицинского назначения

Цель настоящего исследования состояла в разработке эффективной технологии получения высокоочищенного ферментного препарата грибной (З-галактозидазы для коррекции лактазной недостаточности, а также в изучении физико-химических и каталитических свойств фермента.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи

• исследовать ферментный комплекс препарата Лактоканесцин Г20Х,

• разработать рациональную схему выделения и очистки из комплексного ферментного препарата субстанции р-галактозидазы с активностью не менее 10000 ед/г для коррекции энзимодефицита,

• разработать способ и получить высокоочищенную форму фермента р-галактозидазы с целью использования его в качестве стандартного образца при определении активности (подлинности) лекарственного средства,

• изучить основные физико-химические и каталитические свойства фермента Р-галакгозвдазы в субстанции и в ферменг-стндарте,

• исследовать процесс гидролиза лактозы в молоке и молочных продуктах, катализируемый препаратом Р-галактозидазы, и разработать оптимальные режимы их ферментативной обработки,

• разработать готовую лекарственную форму препарата Р-галакгозвдазы и сравнить его эффективность с действием зарубежного препарата «Лактраза» (США) на лактозу молочных продуктов в условиях, имитирующих среду организма

Научная новизна работы заключается в следующем

• впервые по оригинальной технологии получена лекарственная субстанция (препарат Галактозим) и готовое лекарственное средство (капсулы Галак-тозим) для коррекции лактазной недостаточности на основе р-галактозидазы из Pénicillium canescens,

• на основе хроматографического разделения ферментного комплекса получена высокоочшценная Р-галакгозидаза для использования в качестве стандарта при определении лактазной активности (подлинности) лекарственного средства,

• проведено комплексное изучение физико-химических и каталитических свойств выделенного фермента,

• исследовано специфическое действие препарата Галактозим на лактозу молочных продуктов и определены оптимальные условия их ферментативной обработки с целью достижения требуемой степени гидролиза молочного сахара

Научная новизна подтверждена получением положительного решения о выдаче патента на изобретение «Средство для коррекции дефицита лактазы» (Заявка № 2006110265 от 31 03 2006 г )

Практическая ценность работы состоит в разработке технологии получения из комплексного ферментного препарата Лактоканесцин лекарственной субстанции, содержащей грибную Р-галактозидазу Разработанная технология апробирована в опытных условиях и обеспечивает выход фермента по активности не менее 75% Разработана готовая лекарственная форма препарата в виде капсул По эффективности действия полученный препарат не уступает зарубежному аналогу Лактразе (США) Проведены доклинические исследования и показана целесообразность использования препарата Р-галакгозидазы для коррекции лактазной недостаточности Препарат может использоваться как для получения низколактозных молочных продуктов, так и в качестве лекарственного средства для восполнения энзимодефицита

Разработана нормативно-техническая документация, включающая технологические регламенты и фармакопейные статьи предприятия (ФСП) на субстанцию, готовое лекарственное средство и фермент-стандарт Наработаны экспериментальные и опытные образцы препаратов Решением Фармкомитета Министерства здравоохране-

ния и социальной политики РФ препарат рекомендован для клинических испытаний

Работа выполнена в рамках Государственного контракта № 15.802 1.1 0002 от 15 марта 2002 г «Организация производства ферментных субстанций и импортозамещающих лекарственных средств для заместительной терапии, лечения дерма-томикозов и коррекции энзимодефицита» и является вкладом в реализацию приоритетного национального проекта «Здоровье»

Апробация работы. Основные положения и результаты исследований докладывались на научно-технических конференциях, семинарах и конгрессах, в том числе на П Международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2003 г), на 8-м Международном семинаре - презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2005» (Наукоград Пущине, 2005 г ), на заседаниях Ученого совета НГГЦ «Лекбиотех

Публикации. По результатам исследований опубликовано 4 печатные работы, в которых отражены основные положения диссертации, и получено положительное решение ФГУ ФИПС на заявку о выдаче патента на изобретение

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 247 источников, и приложения Материал изложен на 177 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 18 таблиц

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

В обзоре литературы представлены основные сведения об источниках получения |3-галактозидаз, способах выделения и очистки фермента, свойствах Р-галакгозвдаз различного происхождения и механизме их действия. Рассмотрены области применения р-галактозидаз Особое внимание уделено использованию фермента в медицине для коррекции дефицита лактазы

2. Экспериментальная часть

2.1 Материалы и методы исследований

Исходным продуктом для получения лекарственной субстанции служил фер-

менгаый препарат Лактоканесцин Г20Х из Pénicillium canescens F-l 78 со стандартной активностью р-галакгозидазы 1000 ед/г (по о-НФГ), произведенный на ОАО «Восток» по технологии, разработанной в НТЦ «Лекбиотех»

Очистку Р-галакгозидазы осуществляли методами ультра- и микрофильтрации с использованием отечественных ультрафильтрационных и микрофильтрационных мембран с различными размерами пор, с последующим осаждением фермента этиловым спиртом и лиофильным высушиванием Для дальнейшей очистки р-галактозидазы применяли методы ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и ДЭАЭ-целлюлозе («Serva»), гель-фильтрацию на сефадексах G-100 и G-200 («Pharmacia») Степень чистоты фермента определяли с помощью диск-электрофореза в полиакрила-мидном геле по методу Дэвиса на установке фирмы «Реанал»

Определение Р-галактозидазной активности проводили по гидролизу лактозы в соответствии с ТУ 11249895-13-10-92 и по гидролизу орто-нитрофенил-P-D-галактопиранозида (о-НФГ) («Fluka») по методу [Kuby, Lardy, 1953] Определение других гликозидазных активностей (а-галактозидазы, Р-фукозидазы, р-глю-козидазы) проводили по методу [Kuby, Lardy, 1953] с использованием в качестве субстратов соответствующих гликопиранозидов («ICN») Активность протеина-зы определяли по гидролизу казеината натрия («Fluka») по ГОСТ 20264 2-74, эн-дополигалактуроназы — по уменьшению вязкости свекловичного пектина по ГОСТ 20264 3-81 Активность Р-ксиланазы и р-глюканазы определяли по количеству восстанавливающих Сахаров (с ДНС-реактивом), образующихся при гидролизе ксилана овса или глюкана ячменя, соответственно, в стандартных условиях температура 50 °С, рН 4,7, время гидролиза 1 ч [Bailey et al, 1992] Содержание белка определяли по методу Лоури

Молекулярную массу Р-галактозидазы определяли методом гель-фильтрации на хроматографе FPLC («Pharmacia») на колонке Superase 12 HR10/30 Изоэлектрическую точку фермента определяли методом хроматофокусирования на колонке Mono Р HR 5/20 в системе буферов 25 мМ трис-HCl буфер рН 7,1 - полибуфер 74 рН 5,0 Константу Михаэлиса (Km) и максимальную скорость (Vlmx) определяли по начальным скоростям

гидролиза лактозы и о-НФГ по методу Корниш-Боудена или Хейнса-Вулфа [Корниш-Боуден, 1979] Для определения характера ингибирования и расчета константы ингиби-рования использовали методы Лайнуивера-Берка и Д иксона [Диксон, Уэб, 1961]

Специфическое действие препарата р-галактозидазы исследовали на молочных продуктах (молоке, кефире, твороге, йогурте) в соответствии с «Методическими рекомендациями по экспериментальному изучению новых ферментных препаратов, предлагаемых для клинических испытаний» [1981] Определение образующихся в ходе расщепления лактозы продуктов реакции (глюкозы и галактозы) и расчет степени гидролиза лактозы осуществляли по методу [Кигг, Веийег, 1974]

Микробиологическую чистоту препарата определяли в соответствии с ГФ XI, вып 2, стр 187, Изм №3 от 19 06 2003 г

Статистическую обработку результатов проводили по ГФ XI, вып 1, с 199 2.2. Результаты исследований

221 Характеристика ферментного комплекса препарата Лактоканесщн Г20Х Изучение ферментного комплекса исходного препарата показало, что помимо основного фермента (3-галактозидазы (1000 ед/г), в нем в значительном количестве присутствуют а-галактозидаза (75 ед/г), Р-фукозидаза (90 ед/г), Р-ксиланаза (730 ед/г), Р-глюканаза (280 ед/г), эндополигалактуроназа (600 ед/г) и протеиназы кислые -13 ед/г (рН 2,5), 19 ед/г (рН 5,5) и нейтральная - 7 ед/г (рН 7,2)

2 2 2 Выделение и очистка /3-галактозидазы из комплексного препарата К чистоте ферментов медицинского назначения предъявляют особые требования они должны быть освобождены от большинства сопутствующих белков и обладать определенной микробиологической чистотой Для очистки Р-галактозидазы использовали методы ультра- и микрофильтрации Водный раствор исходного препарата, используемый для ультрафильтрации, имел следующие характеристики- активность р-галактозидазы - 67-68 ед/см3, содержание белка - 13,0-14,0 мг/см3, содержание сухих веществ - 6,9-7,1%, величина рН - 5,8-6,2 Сравнительный анализ результатов ультрафильтрации ферментного раствора с использованием различных мембран показал, что оптимальное соотношение производительности, выхода фер-

мента по активности и степени очистки в процессе ультраконцентрирования обеспечивает полиамидная мембрана марки УПМ-67 (табл 1)

Таблица 1

Характеристика процесса ультрафильтрации р-галакгозидазы на мембранах УПМ

Исследуемый раствор Марка мембраны Средняя производитель-ность, дм3/м2ч Объем см3 Общее количество белка, мг Общее кол-во Р-гал. активности, ед. Удельная активность, ед/мг белка Степень очистки Выход по актив ности, %

Исходный раствор 500 6800 34000 5 -

Концентрат Фильтрат УПМ-20 15,8 50 450 4860 1830 33048 204 6,8 1,36 97,2

Концентрат Фильтрат УПМ-50 32,4 50 450 1469 5281 32402 578 22,7 4,54 95,3

Концентрат 'Фильтрат УПМ-67 , * 34'5 50 • 450 1226 4 5516 . .31314 1190 25,6 5,1 92,1

Концентрат Фильтрат УПМ-100 44,0 50 450 1205 5574 25126 8432 21,5 4,3 73,9

Изучение влияния рН и степени концентрирования ферментного раствора на

процесс ультрафильтрации показало, что максимальная производительность (34,5 дм3/м2ч) наблюдается в зоне рН 5,5-6,5 (естественный рН раствора), а выход фермента в концентрате при изменении рН меняется незначительно Ферментный раствор Р-галактозидазы может быть сконцентрирован в 10-15 раз на мембране УПМ-67 с выходом по активности 91-93 % и степенью очистки 5,1

С целью очистки концентрата от контаминирующей микрофлоры был применен способ микрофильтрации с использованием мембран МФЦ с различным размером пор (0,6, 0,4 и 0,22 мкм) Стерилизующая фильтрация через мембрану с размером пор 0,22 мкм позволила получить готовый продукт, соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи

В результате проведенных операций активность Р-галактозидазы на этом этапе очистки (в лиофильно высушенном концентрате) повысилась более чем в 10 раз при значительном снижении количества сопутствующих ферментов

глюканазы, ксиланазы и фукозидазы - на 65-75%, эндополигалактуроназы и протеиназы - на 60%, а-галактозиадзы - на 35%

Следует отметить, что наличие протеиназы в препаратах, предназначенных для обработки молока, нежелательно, т к она вызывает протеолиз молочных белков, изменяя органолептические показатели обрабатываемых продуктов Для очистки препарата от протеиназы были использованы методы, основанные на различных принципах разделения белковых смесей гельфильтрация на сефадексе О-100 и осаждение органическими растворителями (этиловым спиртом) Наилучшие результаты были достигнуты при использовании способа осаждения р-галакгозидазы из концентрата этанолом при содержании спирта в смеси 57,6 % (1,5 об/об), рН 6,5 и температуре 0^- °С, что позволило дополнительно отделить 85% протеиназы и обеспечить выход р-галактозидазы более 83%. Осадок после отделения спирта высушивали лиофильно Молочные продукты, обработанные лиофшшзированным препаратом, не имели горького привкуса или каких-либо других нежелательных органолептических показателей, что указывало на достаточную степень очистки фермента от сопутствующих белков

Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана технологическая схема выделения и очистки р-галактозидазы, позволяющая получить базовый препарат с активностью 12850 ед/г (по о-НФГ), содержанием белка 48%, удельной активностью 26,7 ед/мг белка (степень очистки 5,34), выходом по активности 75% (табл 2) и лекарственную субстанцию (препарат Галактозим) со стандартной активностью 10000±500 ед/г для коррекции лакгазной недостаточности (рис 1)

Исследованы условия эфанения препарата и показано, что Галактозим сохраняет активность и другие характеристики, заложенные в ФСП, более 4 лет при его хранении в защищенном от света месте при 4 °С и 20 °С

223 Разработка способа получения высокоочищенной ¡5-гашжтозидазы (фермент-стандарта)

При разработке нового ферментного препарата медицинского назначения помимо лекарственной субстанции требуется создание стандартного образца фермента (фермент-стандарта), представляющего собой высокоочищенную, по возмож-

Рис. 1 Технологическая блок-схема получения целевых продуктов из препарата Лактоканесцин

Приготовление 7% раствора Лактоканесцина и центрифугирование 10000 об /мин , 20-25 мин, Т=0-4 °С

_1 Фугат_

Ультрафильтрация УМП-67, п= 10-15 раз, Т = (19±1) °С, р = 0,3-0,4 МПа

_| Концентрат_

Микрофильтрация размер пор - 0,22 мкм, Т=(19±1) °С, р = 0,1-0,2 МПа

Микрофильтрат

Осаждение этил 1,5 об/об , рН 6,5, Т= 0 овым спиртом -4 °С, время - 20 мин

Высокоочищенный препарат Р-галактозидазы (фермент-стандарт)

Таблица 2

Характеристика стадий получения базового препарата_

Стадии процесса Объем масса, см3, г Содержание белка Активность Р-галактозидазы Удельная активность ед/мг белка Выход, %

мг/г мг/см3 суммарное, мг ед/г ед/см3 суммарная, ед на стадии от исх

Растворение препарата Лак-токанесцин 140 г в 2000 см3 200,0 мг/г 28000 1000 ед/г 140000 5,0 100 100

Центрифугирование раствора Лактоканесци-на 1950 10,7 20865 70,0 136500 6,5 97,5 97,5

Ультрафильтрация 140 35,0 4904,0 898,1 125734 25,6 92,1 89,8

Микрофильтрация 135,2 34,5 4669,6 898,0 121410 26,0 96,6 86,7

Осаждение спиртом и сушка 8,2 г 481,3 3946,7 12850 105370 26,7 86,7 75,2

ности, гомогенную, форму для контроля активности фермента в лекарственном средстве Высокоочшценная форма фермента нужна также для более полного изучения свойств белковой молекулы

Задача состояла в разработке способов очистки р-галакгозидазы с минимальным количеством стадий и максимальным выходом фермента На первой стадии использовали метод ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе при оптимизированных условиях проведения процесса сорбция в 0,015 М фосфатно-цитратном буфере, рН 5,2, элюция (3-галактозидазы 0,4 М №С1 в 0,015 М фосфатно-цитратном буфере, рН 5,2 В этих условиях сорбция фермента достигала 95%, элюция 85-87% Предложенный режим позволил отделить инертные белки и большую часть ксиланазы, глю-каназы и эндополигалаюуроназы, которые не сорбировались на КМ-целлюлозе и вышли в пике несорбированных белков, что было подтверждено определением специфических ферментативных активностей (рис 2 , пик I) При элюции в градиенте ИаС1 (01 М) был получен один белковый пик (пик П), вышедший при концентрации соли 0,4 М, в котором обнаруживались активности а- и р-галактозидаз

Рис 2 Хроматография р-галактозидазы на колонке с КМ-целлюлозой, 1 - белок, Е)280» 2 - активность р-галактозидазы, 1)420, 3 - активность а-галакто-зидазы, 0405, 4 - градиент ИаС1 (0-1 М)

Для разделения а- и Р-га-лактозидаз использовали гель-фильтрацию на сефадексах О-ЮО и в-200, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе в различных вариациях и последовательностях, что однако не привело к значительному повышению удельной активности Р-галактозидазы и не позволило разделить комплекс а- и Р-галактозидаз Это указывало, с одной стороны, на достаточно высокую степень очистки Р-галактозидазы, с другой - на схожесть физико-химических свойств этих ферментов. Кроме того, с каждой следующей стадией очистки увеличивались механические потери р-галактозидазы, так как обработке подвергались только наиболее активные фракции фермента В связи с этим включение стадий гель-фильтрации на сефадексах и хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в схему очистки было признано нецелесообразным

Элюат после хроматографии на КМ-целлюлозе был обессолен и сконцентрирован методом диа- и ультрафильтрации на мембране УПМ-20 и лиофильно высушен Высушенный препарат содержал 85% бежа с активностью 44200 ед/г

Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана схема получения высокоочшценной р-галактозидазы (фермент-стандарта) (рис 1), включающая ионообменную хроматографию на КМ-целлюлозе, обессоливание и концентрирование элюата методом ультрафильтрации на мембране УПМ-20 с последующим лиофильным высушиванием, позволяющая получить фермент с удельной актиностью 52 ед/мг и выходом 71% (табл 4)

№а м

а.гал р.«я 230 км

Таблица 4

Характеристика стадий получения фермент-стандарта

Стадии процесса Объем, масса, см3, г Содержание белка Активность р-галактозидазы Удельная активность, ед/мг белка Степень очистки Выход, %

мг/см^ мг/г суммарное, мг ед/см^, ед/г суммарная, ед

Растворение базового препарата 1,5 г в 15 см3 481,3 722 12850 19275 26,7 1 100

Диализ против 0,015 М фосфат-но-цитратного буфера 17 40,0 680,7 1077,1 18311 26,9 1 95

ИОХ на КМ-целлюлозе 65 4,7 305,8 243,7 15839 51,8 1,9 82

Диа- и ультрафильтрация 6,0 47,7 286,5 2506,7 15035 52,5 1,97 78

Лиофильное высушивание 0,309 850 263,5 44200 13685 52,0 1,95 71

Процесс очистки контролировали методом диск-электрофореза в полиакрила-мидном геле (рис 3), показавшем эффективность используемых методов очистки

Рис 3 Электрофоретический спектр белков в препаратах 1 - Лакгоканесцин, 2-субстанция Галактозим, 3 - фермент-стандарт

12 3

22 4 Изучение свойств Р-галактозидазы

Изучение каталитических свойств Р-галактозидазы показало, что фермент, вне зависимости от степени очистки, максимально активен при температуре 50-55 °С и рН 3,8-4,5 (по о-НФГ и по лактозе) Р-Галактозидаза стабильна в интервале рН от 3,5 до 6,5 после инкубации в течение 4 ч и температуре 37 °С, близкой к температуре тела млекопитающих, она сохраняла 95% от исходной активности При рН 2,5 и рН 7,0 фермент сохранял 57% и 90% от исходной активности, соответственно

Исследования температурной стабильности,ß-галактозидазы цри pH 4,2 показали, что в течение 4 ч фермент полностью сохраняет свою активность в интервале температур от 4 °С до 25 °С При 30 °С и 40 °С фермент сохранял 96% и 94% от исходной активности, соответственно, при 50 °С - 65%, а при 60 °С - 50% активности

На активность фермента не влияли ионы одно- и двухвалентных металлов (Na+, К+, Са2+, Mg2+, Zn2+, Ва2+, Mn2+, Cu2+, Fe2+, Pb2+, Со2+, Cd2+), а в присутствии ионов Fe3+ активность ß-галактозидазы снижалась на 60% за 1 ч инкубации при 20 °С, через 24 ч наблюдалась полная потеря активности Было установлено, что причиной инактивации является не действие ионов железа, а резкое падение pH среды с 6,2 до 2,5 при добавлении к ферментному раствору соли металла ЭДТА и и-ХМБ в исследуемых концентрациях (10"3 и 5x10"3 М) не оказывали ингиби-рующего действия на ß-галактозидазу

Таким образом, можно заключить, что ß-галактозидаза из Pénicillium canescens не относится к металлозависимым ферментам и не содержит функционально значимых SH-групп, что согласуется с литературными данными, приведенными для других грибных ß-галактозидаз [Летунова и др, 1981, Watanabe et al, 1983, Gonzales et al, 1991]

Изоэлектрическая точка ß-галакгозидазы, определенная методом хроматофоку-сирования, равнялась 6,7 Молекулярная масса фермента была определена методом гель-фильтрации на хроматографе FPLC с использованием тестовых белков и составила около 130 kD Константа Михаэлиса, определенная разными методами по гидролизу лактозы и о-НФГ, не зависела от степени очистки фермента и равнялись 16 Мм (Vmax=40 мкмоль/мин мг) и 0,5 Мм (^=48 мкмоль/мин мг), соответственно, что показало более высокое сродство ß-галактозидазы к синтетическому субстрату При изучении процесса ингибирования ß-галакгозидазы продуктами гидролиза лактозы установлено, что глюкоза не оказывает ингибирующего действия на фермент, в то время как галактоза ингабирует фермент по смешанному типу (рис 4), приводя к изменению как Км, так и V^, с константой ингибирования К, = 20 мМ (рис 5)

Рис 4 Ингибирование р-галакшзвдазы галак- Рис 5 Константа ингибирования Э-гапакгозидазы

тозой (метод Лайнуивера-Берка) 1- без инги- галактозой (метод Диксона) I -0,14 М раствор

бшора, 2- в присутствии ингибитора (галакго- лактозы, 2 - 0,07 М раствор лакшзы, 3 - 0,035 М

зы) в концентрации 0,05 М раствор лактозы

Таким образом, изучены основные физико-химические и каталитические свойства |3-галактозидазы, важные для ее практического применения (табл 5)

Таблица 5

Свойства ß-галактозидазы из Pénicillium canescens F-l 78_

Показатель Характеристика

pH-оптимум 3,8-4,5

Т-оптимум, иС 50-55

pH-стабильность 3,5-6,5

Термостабильность, "С не выше 60

Молекулярная масса, ГО ~ 130

ИЭТ 6,7

Км, мМ ~ 16 (по лактозе) ~ 0,5 (по о-НФГ)

Vmax, мкмоль/мин мг 40 (по лактозе) 48 (по о-НФГ)

Константа ингибирования галактозой, мМ 20

2 2 5 Исследование процесса ферментолиза лактозы в молочных продуктах Исследовано специфическое действие ß-галактозидазы (препарата Галактозим) на лактозу молока и кисломолочных продуктов с целью выбора оптимальных режимов их ферментолиза В экспериментах учитывали тот факт, что у большинства людей, страдающих гиполактазией, при употреблении молочных продуктов со степенью гидролиза лактозы не менее 50% симптомы непереносимости лактозы не возникают [Brand, Holt, 1991]

Динамика гидролиза лактозы при температуре 20 °С в молоке и кисломолочных продуктах различными концентрациями фермента показала (рис 6), что более 50% лактозы в молоке расщепляется при концентрации р-галакгозидазы 0,2% (2000 ед) за 6 ч или за 4,5 ч при концентрации фермента - 0,4% В кисломолочных продуктах гидролиз происходит значительно быстрее, тк рН 4,3-4,5 соответствует оптимуму действия фермента. Степень гидролиза лактозы в кефире и йогурте достигала 50-60% за 1,5-3 ч в зависимости от концентрации фермента (рис 7) Лактоза в твороге гидролизовалась более чем на 90% за 1 ч даже минимальными концентрациями фермента (0,1%)

| 70----

§ 60--

я 50---^у^гЗа

1 <0--^У^а^Зз»

I зо--

| ------

0 2 4 6

Время, ч

Рис 6 Динамика гидролиза лактозы в молоке в зависимости от концентрации фермента (20 °С)

........ в кефире

----- в твороге

Время обработки молочных продуктов при 20 °С должно бьггь ограничено из-за

возможного микробного заражения и закисления продукта. С учетом этого, оптимальной концентрацией фермента, обеспечивающей степень гидролиза молочного сахара более 50%, была принята доза 2000 ед на 100 г кисломолочных продуктов и 4000 ед на 100 г цельного молока В связи с однотипностью динамики гидролиза лактозы в кефире и йогурте в дальнейших исследованиях использовали только кефир

Изучен процесс гидролиза лактозы в молочных продуктах выбранными дозами фермента при различных температурах (рис 8) и показано, что 50% лактозы может быть прогидролизовано при температуре 4 °С за 10-12 ч, либо при 37 °С - за 1-3 ч, в зависимости от вида продукта

Рис 7 Динамика гидролиза лактозы в кисломолочных продуктах в зависимости от концентрации фермента (20 °С) — в йогурте

Время, ч Время, ч

Рис 8 Динамика гидролиза лактозы молока (А, доза фермента 4000 ед) и кефира (Б, доза фермента 2000 ед) при различных температурах 1 - 4 °С, 2 -20 °С, 3 - 37 °С

Таким образом, к числу факторов, влияющих на процесс гидролиза лактозы в молочных продуктах, относятся активная кислотность среды, температурный режим, концентрация |3-галактозидазы и длительность процесса Рекомендованы следующие режимы обработки молочных продуктов препаратом Галактозим, обеспечивающие степень гидролиза лактозы не менее 50%

Обрабатываемый продукт Доза фермента (на 100 г продукта) Температура, °С Время гидролиза, ч

4 не менее 12

Молоко 4000 ед 20 4-5

37 3

Кисломолочные продукты 2000 ед 4 20 37 10-12 2-3 1

2 2 6 Разработка готовой лекарственной формы препарата Галактозим и изучение эффективности препарата

По результатам проведенных исследований разработана готовая лекарственная форма препарата Галактозим в виде капсул, содержащих 0,2 г (2000 ед) (3-галактози-дазы и 0,1 г вспомогательных веществ (крахмала растворимого 0,095 г и кальция стеа-рата 0,05 г), выступающих в роли смазывающих и скользящих средств (рис. 1). Изучены некоторые фармакологические свойства лекарственной формы. Установлено, что используемые твердые желатиновые капсулы при температуре 37 °С распадаются за 4-6 мин в исследуемых растворах 0,1 М НС1 (рН 2,0), ОД М ацетатном буфере (рН 4,2),

дисгитшрованной воде (рН 5,5), из чего можно заключить, что препарат при приеме per os начнет действовать уже с первых минут Изучена растворимость капсул Галакгозима с использованием прибора «Вращающаяся корзина» среда растворения - 0,2М ацетатный буфер рН 4,2, объем раствора 500 мл, температура 37 °С, скорость вращения 100 об/мин Установлено, что за 45 мин в среду растворения переходит 100% содержащейся в капсуле р-галактозидазы, что удовлетворяет требованиям [ГФ XI, вып2, стр 145], по которым при указанных условиях в среду растворения за 45 мин должно перейти не менее 75% активного вещества от содержания его в лекарственной форме

Для изучения эффективности разработанного препарата Галактозим при приеме внутрь в экспериментах были имитированы условия внутренней среды организма температура 37 °С, присутствие 10 % (об) желудочного сока. Время обработки ограничили двумя часами, тк, известно [Козловский, 2001], что первые клинические симптомы лактазной недостаточности возникают через 1,5-2 ч после употребления молочных продуктов Эффективность действия Галактозима сравнивали с действием импортного препарата «Лактраза» (США), предназначенного для перорального применения одновременно с приемом молочной пищи, в тех же дозах

Было установлено, что в условиях, приближенных к условиям организма, в зависимости от дозы вносимых препаратов лактоза молока гидролизуется одинаково эффективно обоими препаратами на 55% (2000 ед) или 65% (4000 ед) за 2 ч За это же время степень гидролиза лактозы в кефире и йогурте достигает соответственно 87 и 91%, а в твороге уже в течение 1 ч лактоза гидролизуется полностью Сравнительный анализ действия препаратов Галактозим и Лактраза показал, что Галактозим по своим гидролитическим свойствам в условиях, имитирующих среду организма, не уступает импортному препарату

Таким образом, препарат Галактозим обладает высокой эффективностью действия на лактозу молока и кисломолочных продуктов и может быть использован для коррекции дефицита лакгазы как для обработки молочных продуктов перед употреблением, так и для приема внутрь одновременно с приемом молочной пищи

Токсикологические исследования Галактозима, проведенные совместно с ООО «ТОКСОФАРМ», показали, что препарат относится к веществам с малой токсичностью, не обладает аллергизирующими, анафилактогенными и иммуно-токсическими свойствами, не оказывает тератогенного и эмбриотоксического действия и может быть использован в медицинских целях

ВЫВОДЫ

1 Исследован ферментативный комплекс исходного препарата Лактока-несцин и разработана технология выделения и очистки из него р-галактозидазы с использованием методов ультрафильтрации, микрофильтрации и спиртоосаждения, позволившая повысить удельную активность фермента более чем в 5 раз. Выход фермента составляет 75%

2 Впервые по разработанной технологии получена лекарственная субстанция на основе Р-галактозвдазы из Pénicillium canescens (препарат Галактозим) со стандартной активностью 10000 ед/г для коррекции лактазной недостаточности

3 Для определения активности (подлинности) лекарственного средства получен высокоочшценный препарат р-галактозидазы (фермент-стандарт) с содержанием белка 85% и активностью 442000 ед/г по схеме, включающей ионообменную хроматографию на КМ-целлюлозе, диа- и ультрафильтрацию и лиофильное высушивание.

4 Изучены физико-химические и каталитические свойства высокоочшценной р-галактозидазы: молекулярная масса фермента около 130 kD, изоэлектрическая точка - 6,7, оптимумы действия - температура 50-55 °С, рН 3,8-4,5; зона стабильности в пределах рН 3,5-6,5, константа Михазлиса и максимальная скорость гидролиза природного и синтетического субстратов - 16,0 мМ и 40 мкмоль/мин мг, 0,5 мМ и 48 мкмоль/мин мг, соответственно Установлен смешанный характер ингибирова-ния фермента галактозой с К, = 20 мМ Показано, что р-галактозидаза не относится к металлозависимым ферментам и не содержит функционально значимых SH-rpynn

5 Изучена динамика гидролиза лактозы в молоке и кисломолочных продуктах препаратом Галактозим Разработаны оптимальные режимы предварительной обработки молочных продуктов для получения необходимой степени гидролиза лактозы

6. Разработана готовая лекарственная форма препарата в виде капсул (капсулы Галактозим) и установлено, что препарат по эффективности действия не уступает импортному препарату Лактраза и может быть использован в качестве корректора энзимодефицита как для приема внутрь одновременно с приемом молочных продуктов, так и для их предварительной обработки перед употреблением

1 Мотина Л И, Сухих О А, Югова Л В , Шишкова Э А Галактозим - новый эффективный препарат для коррекции лактазной недостаточности// Материалы II Московского Международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» -Ч 2. - Москва, 2003 -С 236

2 Югова Л В, Мотина Л И, Сухих О А, Шишкова Э.А Грибная р-галак-тозидаза для переработки молочной сыворотки получение и применение// В кн «Микробные катализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» - М Пищепромиздат, 2004 - С 67-70

3 Мотина Л И, Сухих О А, Нестеренко Е А, Полетаева О А, Шишкова

3 А, Югова Л В Гастропек и Галактозим - новые лекарственные ферментные препараты для профилактики и лечения энзимодефицита// Материалы научно-практической конференции 8-й Международный семинар - презентация инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2005» - Наукоград Пущино,2005 -С 37-39

4 Заявка № 2006110265 от 31 03 2006 о выдаче патента на изобретение «Средство для коррекции дефицита лактазы» (Положительное решение от 03 04 2007)/ Мотина Л И, Сухих О А, Шишкова Э А, Бравова Г Б, Югова Л В

5 Сухих О А, Мотина Л И, Югова Л В , Шишкова Э А, Бравова Г Б Получение препарата Галактозим для коррекции дефицита лактазы // Биотехнология -2007,№3 -С46-51

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Подписано в печатьЮ О? В? г Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Заказ № Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им Н Н Блохина РАМН 115473, Москва, Каширское ш , 24

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сухих, Ольга Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 (3-галактозидаза и источники ее получения.

1.2 Механизм действия р-галактозидазы.

1.3 Свойства (3-галактозидаз из различных источников.

1.4 Выделение и очистка Р-галактозидаз.

1.5 Применение препаратов Р-галактозидазы.

1.6 Анализ обзора литератры и задачи исследований.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Методы выделения и очистки фермента.

2.2 Методы определения ферментативной активности.

2.3 Методы химических анализов.

2.4 Методы определения степени чистоты препарата.

2.5 Определение молекулярной массы.

2.6 Определение изоэлектрической точки.

2.7 Определение оптимальных условий действия и стабильности фермента.

2.8 Определение влияния различных реагентов на активность Р-галактозидазы.

2.9 Определение кинетических констант гидролиза субстратов.

2.10 Определение специфической активности р-галактозидазы.

2.11 Определение микробиологической чистоты препарата.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Исследование ферментативного комплекса исходного препарата

Лактоканесцин.

3.2 Выделение и очистка Р-галактозидазы из исходного комплексного препарата.

3.2.1 Изучение стабильности р-галактозидазы в водном растворе.

3.2.2 Разработка способа очистки Р-галактозидазы методом ультрафильтрации

3.2.3 Очистка концентрата от микрофлоры методом микрофильтрации

3.2.4 Разработка способа очистки (3-галактоидазы от протеиназы.

3.3 Технологическая схема получения лекарственной субстанции (препарата Галактозим) и ее апробация

3.4 Разработка способа получения высокоочищенной Р-галактозидазы (фермент-стандарта).

3.4.1 Выбор условий предварительной очистки фермента.

3.4.2 Выбор оптимальных условий хроматографического процесса

3.4.3 Обессоливание и концентрирование элюата.

3.4.4 Исследование способов разделения а- и Р-галактозидаз.

3.5 Определение степени чистоты препаратов Р-галактозидазы.

3.6 Изучение физико-химических и каталитических свойств Р-галактозидазы.

3.6.1 Влияние рН среды на активность фермента.

3.6.2 Влияние температуры на активность р-галактозидазы.ЮЗ

3.6.3 Влияние ионов металлов и специфичесих реагентов на активность Р-галактозидазы.

3.6.4 Оределение молекулярной массы.

3.6.5 Определение изоэлектрической точки.

3.6.6 Определение кинетических характеристик Р-галактозидазы.

3.6.6.1 Определение константы Михаэлиса.

3.6.6.2 Определение характера ингибирования и константы ингибиро-вания (3-галактозидазы продуктами гидролиза.

3.7 Изучение специфического действия Р-галактозидазы.

3.7.1 Изучение динамики гидролиза лактозы в молочных продуктах препаратом Галактозим.

3.7.2 Разработка готовой лекарственной формы препарата Галактозим и изучение его эффективности в условиях, имитирующих среду организма.

3.7.2.1 Изучение некоторых фармакологических свойств готовой лекарственной формы препарата Галактозим.

3.7.2.2 Сравнение эффективности действия препаратов Галактозим и Лактраза на лактозу молочных продуктов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение препарата грибной β-галактозидазы для коррекции лактазной недостаточности"

Актуальность темы. Согласно статистическим данным в последние годы в мире значительно сократились темпы роста производства ферментных препаратов для традиционных отраслей применения (пищевая промышленность, бытовая химия, переработка отходов, сельское хозяйство и пр.) ввиду насыщения рынка, в то время как объем производства ферментов для медицинских целей непрерывно растет. По оценкам американской консалтинговой фирмы «Business Communications», среднегодовой прирост объема продаж ферментов медицинского назначения составляет 25,4%. На сегодняшний день в мировой практике до 50% ферментов, используемых в медицине, получают из микробного сырья.

Препараты на основе ферментов используются для профилактики и лечения нарушений пищеварительных процессов, заболеваний сердечно-сосудистой системы, при системной терапии воспалительных процессов, для лечения онкологических заболеваний, ожоговых ран, заболеваний полости рта и др.

Наиболее емким является рынок пищеварительных ферментов. Это связано с тем, что с ухудшением экологической обстановки и повышением психоэмоциональных нагрузок число людей, страдающих нарушениями пищеварения, связанными с недостаточным образованием ферментов, растет из года в год.

Одной из серьезных ферментных патологий является дефицит в организме человека лактазы (гиполактазия). Лактаза ф-галактозидаза) - фермент, вырабатываемый в верхнем отделе тонкого кишечника и катализирющий расщепление лактозы (молочного сахара) на глюкозу и галактозу, которые затем легко всасываются в кровь. Отсутствие или недостаток лактазы приводят к тому, что больные не могут использовать в своем рационе молоко и молочные продукты [Валенкевич, 1989; Turck, 2004]. Это заболевание особенно опасно для детей грудничкового возраста, т. к. молоко является для них основным продуктом питания, и найти молоку полноценную замену для грудных детей чрезвычайно сложно [Корниенко и др., 2006]. По данным ряда авторов, из-за отсутствия или недостатка в слизистой оболочке тонкой кишки лактазы непереносимость молока встречается у 15-30% и более населения нашей страны [Валенкевич, Яхонтова; 1991, Жвавый и др., 1991; Козлов, 1992].

Лицам, страдающим гиполактазией, ранее рекомендовалось исключать из пищи молоко и молочные продукты. Однако необходимо помнить, что молоко занимает особое место среди продуктов питания человека, являясь источником белка, кальция, рибофлавина [Лоранская и др., 1997]. Исключение из рациона молока и молочных продуктов при гиполактазии, особенно у детей, приводит к неоптимальности регулирующих систем организма [Котлукова, 1994].

Лактозная непереносимость может быть преодолена двумя путями: использованием молочных продуктов с частично гидролизованной лактозой, либо приемом биологически активных добавок или лекарственных препаратов, содержащих лактазу.

В настоящее время за рубежом рядом фирм внедрена в производство технология получения низколактозного молока путем предварительного расщепления в нем лактозы с помощью ферментных препаратов микробного происхождения. Низколактозные продукты выпускаются в большинстве стран Западной Европы, Аргентине, Канаде, Японии, Новой Зеландии, США и др.

Новым шагом в лечении гиполактазии стало появление лекарственных препаратов на основе р-галактозидаз микробного происхождения. Первый из подобных ферментных препаратов в таблетированной и жидкой формах был получен фирмой «Sugar Lo Со» (США) из дрожжей Kluyveromyces lactis («Lact-Aid») и применялся для обработки молока перед употреблением в домашних условиях. Затем фирма «Fermentation Industries Kingstree» (США) выпустила в продажу порошок для приема внутрь («Lactrase-N»), содержащий лактазу из микроскопического гриба Aspergillus niger. Известен японский препарат «Га-лантаза» из Aspergillus sp. (фирма «Amano Pharmaceutical»), который применяется для лечения диареи у новорожденных. В настоящее время в США лактаза как средство, помогающее пищеварению, занимает 40% от всего количества производимых пищеварительных ферментов.

В нашей стране производство низколактозного молока и молочных продуктов отсутствует. Не производятся и лекарственные средства для коррекции дефицита лактазы. Импортные препараты, присутствующие на российском фармацевтическом рынке, не удовлетворяют спрос в полном объеме и, кроме того, имеют высокую стоимость. В связи с этим проблема создания конкурентоспособного отечественного высокоэффективного ферментного препарата Р-галактозидазы, который может быть использован как для предварительного гидролиза лактозы в молоке и молочных продуктах, так и для приема внутрь, отличающегося от зарубежных аналогов существенно более низкой ценой, является весьма актуальной, как с позиции социального эффекта, так и с позиции развития биотехнологии - одной из стратегически важных отраслей экономики.

В НТЦ «Лекбиотех» на основе глубинного культивирования микроскопического гриба Penicillium canescens F-l 78 - продуцента Р-галактозидазы - разработана технология получения ферментного препарата Лактоканесцин, предназначенного для гидролиза лактозы в молочной сыворотке. Наличие препарата, содержащего Р-галактозидазу и разрешенного к применению в пищевой промышленности, а также значительная потребность отечественного здравоохранения в пищеварительных средствах с лактазной активностью, явились основой для исследований по получению из препарата Лактоканесцин препарата Р-галактозидазы медицинского назначения.

Цель настоящего исследования состояла в разработке эффективной технологии получения высокоочищенного ферментного препарата грибной р-галактозидазы для коррекции лактазной недостаточности, а также в изучении физико-химических и каталитических свойств фермента.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• исследовать ферментный состав препарата Лактоканесцин Г20Х;

• разработать рациональную схему выделения и очистки из комплексного ферментного препарата субстанции Р-галактозидазы с активностью не менее 10000 ед/г для коррекции энзимодефицита;

• разработать способ и получить высокоочищенную Р-галактозидазу для использования ее в качестве стандартного образца при определении активности (подлинности) лекарственного средства;

• изучить основные физико-химические и каталитические свойства выделенного фермента в лекарственной субстанции и в фермент-стандарте;

• исследовать процесс гидролиза лактозы в молоке и молочных продуктах, катализируемый препаратом р-галактозидазы, и разработать оптимальные режимы их ферментативной обработки;

• разработать готовую лекарственную форму препарата р-галактозидазы и сравнить его эффективность с действием зарубежного препарата «Лактраза» (США) на лактозу молочных продуктов, в условиях, имитирующих среду организма.

Научная новизна работы заключается в следующем:

• впервые по оригинальной технологии получена лекарственная субстанция (препарат Галактозим) и готовое лекарственное средство (капсулы Галакто-зим) для коррекции лактазной недостаточности на основе Р-галактозидазы из Penicillium canescens;

• на основе хроматографического разделения ферментного комплекса получена высокоочищенная Р-галактозидаза для использования в качестве стандарта при определении лактазной активности (подлинности) лекарственного средства;

• проведено комплексное изучение физико-химических и каталитических свойств выделенного фермента;

• исследовано специфическое действие препарата Галактозим на лактозу молочных продуктов и определены оптимальные условия их ферментативной обработки с целью достижения требуемой степени гидролиза молочного сахара.

Научная новизна подтверждена получением положительного решения на Заявку № 2006110265 от 31.03.2006 г. о выдаче патента на изобретение «Средство для коррекции дефицита лактазы».

Практическая ценность работы состоит в разработке технологии получения из комплексного ферментного препарата Лактоканесцин лекарственной субстанции, содержащей грибную Р-галактозидазу, с применением современных методов выделения и очистки. Разработанная технология апробирована в опытных условиях и обеспечивает выход фермента не менее 75%. Анализ свойств очищенного препарата (3-галактозидазы показал целесообразность его использования для коррекции лактазной недостаточности. Препарат универсален для применения: он может быть использован как для получения низколак-тозных молочных продуктов, так и в качестве лекарственного средства для заместительной терапии. Разработана готовая лекарственная форма препарата в виде капсул. По эффективности действия полученный препарат не уступает зарубежному аналогу «Лактразе» (США), предназначенному для перорального применения при непереносимости молочного сахара.

На основе проведенных испытаний разработана нормативно-техническая документация, включающая технологические регламенты и Фармакопейные статьи предприятия (ФСП) на субстанцию Галактозим, готовое лекарственное средство в виде капсул и фермент-стандарт. Наработаны опытные образцы препарата и проведены их доклинические испытания. Фармакопейный комитет Министерства здравоохранения и социального развития Российской и

Федерации после рассмотрения комплекта представленной документации рекомендовал препарат для клинических испытаний.

Работа выполнена в рамках Государственного контракта № 15.802.1.1.0002 от 15 марта 2002 г. «Организация производства ферментных субстанций и импортозамещающих лекарственных средств для заместительной терапии, лечения дерматомикозов и коррекции энзимодефицита» и является вкладом в реализацию приоритетного национального проекта «Здоровье», поскольку создание отечественного препарата лактазы расширит ассортимент лекарственных средств, предназначенных для лечения желудочно-кишечных заболеваний, позволит избежать закупок аналогичных препаратов за рубежом, а его использование качественно улучшит питание значительной части населения.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Сухих, Ольга Анатольевна

выводы

1. Исследован ферментативный комплекс исходного препарата Лактоканесцин и разработана технология выделения и очистки из него р-галактозидазы с использованием методов ультрафильтрации, микрофильтрации и спиртоосажде-ния, позволяющая повысить удельную активность фермента в 5,3 раза. Выход по активности составляет 75%.

2. Впервые по разработанной технологии получена лекарственная субстанция (препарат Галактозим) на основе р-галактозидазы Penicillium canescens со стандартной активностью 10000 ед/г для коррекции лактазной недостаточности. Разработана научно-техническая документация на препарат Галактозим.

3. Для определения активности (подлинности) лекарственного средства получен высокоочищенный препарат р-галактозидазы (фермент-стандарт) с содержанием белка 85% и активностью 44200 ед/г по схеме, включающей ионообменную хроматографию на КМ-целлюлозе, диа- и ультрафильтрацию с последующим лиофильным высушиванием, с выходом по активности 71%.

4. Изучены физико-химические и каталитические свойства р-галактозидазы из Penicillium canescens: молекулярная масса фермента около 130 kD; ИЭТ- 6,7; оптимумы действия - температура 50-55 °С, рН 3,8-4,5; зона стабильности в пределах рН 3,5-6,5; константа Михаэлиса и максимальная скорость гидролиза природного и синтетического субстратов (16,0 мМ и 40 мкмоль/мин мг; 0,5 Мм и 48 ммоль/мин мг). Установлен смешанный характер ингибирования галактозой с К; = 20 мМ. Показано, что р-галактозидаза не относится к металлозависимым ферментам и не содержит функционально значимых SH- групп.

5. Изучена динамика гидролиза лактозы в молоке и кисломолочных продуктах препаратом Галактозим. Разработаны оптимальные режимы предварительной обработки молочных продуктов для получения необходимой степени гидролиза лактозы.

6. Разработана готовая лекарственная форма препарата в виде капсул (капсулы Галактозим) и установлено, что препарат по эффективности действия не уступает импортному препарату Лактраза и может быть использован в качестве корректора энзимодефицита как для приема внутрь одновременно с приемом молочных продуктов, так и для их предварительной обработки перед употреблением.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сухих, Ольга Анатольевна, Москва

1. Антошина Л.П., Тельцов Л.П. Динамика активности лактазы тонкой кишки у телят этапа новорожденное™. //Вестник Ветеринарии. -1998, т.8, №2, с.36-40.

2. Безбородов A.M., Астапович Н.И. Секреция ферментов у микроорганизмов. -М.: Наука, 1984.-72 с.

3. Бидлингмейер Б., Фрайд Б., Хегнауер Г., Хемпер Б. и др. Препаративная жидкостная хроматография: Пер. с англ. М.: Мир, 1990. - 360 с.

4. Билай В.И., Школьный А.Т., Элланская И.А. и др. Штамм Penicillium canescens 20171 продуцент Р-галактозидазы/ А.с. №1065476 (СССР). Опубл. 07.01.84. Бюл. №1.

5. Борисенко Ю.В., Цветкова М.В. Очистка Р-галактозидазы для иммунофер-ментного метода. // Препараты для экспресс-диагностики. Л.: Наука, 1981, с.127-130.

6. Боровик Т.Э., Семенова Н.Н., Сирота А.В. Клинико-лабораторные параллели пищевой неперносимости у детей. // Педиатрия. -1996, №4, с.77-81.

7. Вавилова Е.А., Винецкий Ю.П. Индукция синтеза эндо-1,4-Р-ксиланазы и Р-га-лакгозидазы в исходных и рекомбинантных штаммах триба. Penicillium canescens. //Прикладная биохимия и микробиология. 2003, т. 39, № 2, с. 167-172.

8. Валенкевич Л.Н. Синдром дефицита лактазы.// Клиническая медицина -1989, т.68, №4, с. 143-150.

9. Валенкевич Л.Н., Яхонтова О.И. Распространение дефицита лактазы среди народов СССР.// Вопросы питания. -1991, №4, с. 10-13.

10. Валенкевич JI.H., Яхонтова О.И., Шубина М.Э. Применение ферментных заместительных препаратов при гиполактазии. //Клиническая медицина -1996, т.74, №8, с.46-48.

11. Валенкевич Л.Н., Яхонтова О.И., Шубина М.Э. Молоко и синдром гиполактазии. Петрозаводск, 1998,120 с.

12. Валенкевич Л.Н. Опыт использования ферментного заместительного препарата Лактразы при гиполактазии. // Клиническая фармакология и терапия. -1999, т.8, №1, с.23-24.

13. Варначева Л.Н., Сазонова Н.Е., Дорофейчук В.Г. Лечебное питание при лак-тазной недостаточности у детей раннего возраста. // Педиатрия. 1993, №2, с. 18-20.

14. Виха И.В., Воробьев А.А., Желудева С.И., Касьянова Т.А., Кудрявцев С.И. Получение высокоактвного препарата P-D-галактозидазы. // Прикладная биохимия и микробиология. 1987, т.ХХШ, вып.З, с. 291-298.

15. Водилова О.В., Гаппаров М.М., Никольская Г.В. Лактазная недостаточность у детей первого года жизни. // Вопросы питания. 2003, т.72, №1, с. 14-17.

16. Ганина В.И, Калынина JI.B., Большакова Е.В. Р-Галактозидазная активность молочнокислых бактерий и бифидобактерий. // Молочная промышленность. 2002, №8, с. 36-37.

17. Гомартели М.М., Куликова А.К., Церетели А.К., Безбородов A.M., Квеси-тадзе Г.И. Р-Галактозидаза Penicillium canescens штамм 20171. // Прикладная биохимия и микробиология. 1988, т. XXIV, вып.1, с.20-27.

18. Гомартели М., Квеситадзе Э., Безбородов А.М., Школьный А.Т. и др. Мутанты Penicillium canescens с повышенной ксиланазной активностью. // Прикладная биохимия и микробиология. 1998, т.34, № 6, с. 650-654.

19. Гомзикова Н.Д., Бурыкина И.М. Влияние р-галактозидазы на консистенцию молока цельного сгущенного с сахаром.//В сб. Эффективные технологии в производстве и переработке сельскохозяйственной продукции. Вологда, 2004, с.37-40.

20. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Элевар, 2000.

21. Данилов М.Б. Характеристика микроорганизмов, используемых в производстве молочных продуктов по бета-галактозидазной активности. // Изв. вузов. Пищевая технология. 2002, № 1, с.31.

22. Денисова Е.В. Оптимизация биотехнологии получения минорных моносахаридов и разработка лечебно-профилактических препаратов на их основе. Ставрополь, 2002.

23. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты.- М.: Изд. иностранной литературы, 1961.

24. Добриян Е.И., Калугин В.В. Использование Р-галактозидазы в производстве молочных консервов.// Материалы междунар. научн.-техн.конф. Пищевой белок и экология. М., 2000.

25. Добриян Е.И., Остроумова Т.Л., Зоров И.Н. Особенности использования препарата Р-галактозидазы при различных значениях рН.// В сб. Научноеобеспечение молочной промышленности (ВНИМИ 75 лет). - М., 2004, ГНУВНИМИ, с.84-87.

26. Екисенина И.Н. Диагностика и лечение лактазной недостаточности при заболеваниях кишечника. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатоло-гии. 1997,т.7, №6, с.27-31.

27. Жвавый Н.Ф., Козлов А.И., Кондик В.М. Лактазная недостаточность у представителей некоторых народностей Сибири.// Вопросы питания. 1991, №5, с. 32-35.

28. Жукова Р.А., Лапина И. К., Шабунов Б.Е. и др. Curvularia inaequalis штамм 75 продуцент Р-галактозидазы./ А.с. № 727685 (СССР). Опубл. 15.04.80. Бюл. №5.

29. Загустина Н.А., Тихомирова А.С., Рафаловская Т.Я., Янголь Л.М., Грачева А.Ю., Фениксова Г.В. Получение и свойства препарата Р-галактозидазы из Alternaria tenuis. Н Прикладная биохимия и микробиология 1975, т. XI, в. 5, с. 725-729.

30. Загустина Н.А., Тихомирова А.С. Очистка и свойства р-галактозидазы из гриба Curvularia inaequalis. II Биохимия. -1976, т. 41, № 6, с.1061-1066.

31. Захарова И.Я., Буглова Т.Т., Тихомирова А.С. Ферменты, трансформирующие галактозу. Киев, Наукова думка, 1988.

32. Заявка № 49-22709 (Япония). Способ получения р-галактозидазы. Опубл. 11.04.1974.

33. Заявка № 49-21078 (Япония). Ферментативный способ получения лактазы. Опубл. 29.05.1974.

34. Заявка № 52-27035 (Япония). Способ получения Р-галактозидазы. Опубл.2911.1977.

35. Заявка №53-20486 (Япония). Получение Р-галактозидазы. Опубл.2402.1978.

36. Заявка № 95211 (Япония). Способ получения Р-галактозидазы. Опубл. 15.08.1982.

37. Клесов А.А., Березин И.В. Ферментативный катализ. М.: Изд-во Московского университета, 1980, 264 с.

38. Козлов А.И. Исследование лактазного полиморфизма у представителей различных этнотерриториальных групп. // Биологические науки. 1992, №1, с.64-68.

39. Козлов С.П., Просеков А.Ю., Муругова И.И. Технологические свойства фермента Ha-Lactase из дрожжей Klyuveromyces fragilis в сыворотке.// Хранение и переработка сельхозсырья. 2004, №5, с.39-40.

40. Козлов С.Г., Просеков А.Ю., Муругова И.И. Состав углеводов сыворотки, гидролизованной бета-галактозидазой из дрожжей Klyuveromyces fragilis.// Хранение и переработка сельхозсырья. 2004, № 11, с. 21-22.

41. Козлов С.Г., Просеков А.Ю., Баканова О.А. Современное состояние биотехнологии гидролиза лактозы в производстве молочных продуктов.// Хранение и переработка сельхозсырья, 2004, №9, с.38-44.

42. Козловский А.А. Лактазная недостаточность. // Медицинские новости -2001 г., №1, с.20-24.

43. Корнеева О.С., Жеребцов Н.А., Черемушкина И.В. Идентификация каталитически активных групп Р-галактозидазы Penicillium canescens F-436.// Биохимия 2001, том 66, вып. 3, с.412-418.

44. Корниенко Е.А., Митрофанова Н.И., Ларченкова Л.В. Лактазная недостаточность у детей раннео возраста.// Вопросы современной педиатрии. 2006, №5 (4), с. 82-86.

45. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир, 1979.

46. Коршунов М.Ф., Даркина Е.Е. Постдиарейная лактазная недостаточность у новорожденных. // Педиатрия -1997, № 3, с.25-28.

47. Костер А.И., Паппель К.Е., Фениксова Р.В., Тихомирова А.С., Загустина Н.А., Летунова Е.В. Получение и свойства иммобилизованной Р-галактозидазы.// Прикладная биохимия и микробиология. -1974, №10, с. 851-855.

48. Котлукова Н.П. Гормонально-метаболические изменения при целиакии и лактазной недостаточности у детей. // Педиатрия. 1994, № 1, с.36-40.

49. Краснов М.П., Коневец В.И., Охрименко О.В. Влияние степени предварительного гидролиза лактозы на молочнокислый процесс.// Там же. с. 101-103.

50. Кретович В.Л. Токарева P.P. Проблема пищевой полноценности хлеба. М.: Наука, 1986.-288 с.

51. Куликова А.К., Тихомирова А.С., Фениксова Р.В. Очистка и свойства Р-галактозидазы SaccharomycesJragilis. II Биохимия. -1972, т. 37, №2, с. 405-408.

52. Куликова А.К. //Автореф.дис.на соиск.уч.степ.канд.биол.наук. М., 1978.

53. Куликова А.К., Гомартели М.М., Церетели А.К., Безбородов A.M., Квеси-тадзе Г.И., Билай Т.И. Р-Галактозидазы низших эукариот (грибов и дрожжей). Обзор. // Прикладная биохимия и микробиология. 1989, т. XXY, вып. 6, стр. 734-746.

54. Курьянинова В.А. Оценка эффективности диетотерапии при непереносимости лактозы у детей грудного возраста адаптационными соевыми смесями. // Педиатрия. 2001, №2, с.57-60.

55. Ладодо К.С., Боровик Т.Э., Рославцева Е.А., Семенова Н.Н., Степанова Н.Н., Сирота А.В. Диетотерапия при лактазной недостаточности. // Педиатрия.-1998, №3, с.30-35.

56. Лезебная В.В., Мартынова К.Г., Четвертак А.А., Куликова А.К., Тихомирова А.С. Гидролиз лактозы в молоке под действием фермента.// Молочная промышленность -1981, №1, с. 28-30.

57. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1974.

58. Летунова Е.В., Тихомирова А.С., Шиян С.Д., Маркин В.А., Хорлин А.Я., Безбородов A.M. Очистка и свойства |3-галактозидазы Altemaria tenuis. II Биохимия. 1981, т. 46, № 5, с.911-919.

59. Летунова Е.В. Выделение и свойства Р-галактозидазы Altemaria tenuis. II Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук. М., 1981,19 с.

60. Логинов А.С., Парфенов А.И. Болезни кишечника М.: Медицина, 2000,383 с.

61. Лоранская Т.Н., Полушина Н.Д., Рапопорт С.И., Фролков К.К. Молоко в нашем питании, плюсы, минусы, альтернативные средства профилактики. Обзор. // Клиническая медицина 1997, т.75, №2, с.13-16.

62. Матвеева И.В. Применение ферментного препарата р-галактозидазы при производстве пшеничного хлеба с молочной сывороткой. //Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. техн. наук. М., 1983,27 с.

63. Маурер Г. Диск-электрофорез. М.: Мир, 1971,247 с.

64. Михайлова Н.И. Гидролиз лакгозы.// Переработка молока. 2003, №5, с. 11-13.

65. Нахапетян Л.А., Мотина ЛИ. Получение глюкозо-галактозных сиропов из молочной сыворотки. //Биотехнология.-1998, т.4, №1, с. 4-9.

66. Нестеренко П.Г., Василисина В.В., Чеботарев Е.А. Использование молочной сыворотки в хлебопекарном и кондитерском производстве. // Молочная промышленность. 1982, № 5, с.25-27.

67. Николаев И.В., Ходова О.М., Тимохина Е.А., Алексеенко А.Ю., Винецкий Ю.П. Молекулярные характеристики секретируемой Р-галактозидазы Penicillium canescens. //Биохимия. 1989, т.54, вып. 8, с.1294-1299.

68. Николаев И.В. Структура и особенности регуляции экспрессии генов Р-галактозидаз у мицелиального гриба Penicillium canescens.!I Автореф. дис. на соиск. уч. степ. канд. биол. наук. М., 1992.

69. Остерман JLA. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1983.

70. Парфенов А.И., Полева Н.И., Екисенина Н.И., Петраков А.В. Диагностика и лечение лактазной недостаточности при заболеваниях кишечника. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1997, т. 7, №6, с.27-31.

71. Патент Японии. №52-30591 от 09.08.1977 г.

72. Патент Японии. №61-260882 от 19.11.1986 г.

73. Патент США 5876981 от 02.03.1999.

74. Патент Болгарии № 62547 от 29.02.2000 г.

75. Патент США. №6,410,018 В1 от 25 июня 2002 г.

76. Патент России. № 2259748 от 10.09 2005.

77. Пахарукова Е.М. Исследование р-галактозидазной активности различных видов молочнокислых микроорганизмов.// В сб. Технологические и экономические аспекты обеспечения качества продукции и услуг в торговле и общественном питании Кемерово, 2003, с.37-38.

78. Погорелова Н.А. Кинетика процесса ферментации лактозы препаратом Максилакт.//Пища. Экология. Качество. Новосибирск, 2002, с.61-63.

79. Поландова Р.Д., Матвеева И.В., Югова JI.B., Черемнова Т.А. Вличние молочной сыворотки с гидролизованной лактозой на свойства теста и качество хлеба из пшеничной муки. // Хлебопекарная и кондитерская промышленность 1983, № 4, с.24-25.

80. Полторак О.М., Атякшева Л.Ф., Чухрай Е.С. Термостабильности иммобилизованной и растворимой Р-галактозидазы. // Журнал физической химии. -2004, 78, №3, с. 550-554.

81. Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева Л.В. Определение активности ферментов. Справочник. М.: ДеЛи принт, 2003, с. 134-141

82. Просеков А.Ю., Козлов С.Г., Муругова И.И. Гелеобразные напитки на основе гидролизованной сыворотки // Пиво и напитки. 2004, №4, с.76

83. Пулатова Д.Б. Состяние кишечного микробиоценоза у детей с кишечными энзимопатиями. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2001, №3, с.97-99.

84. Рахимов К.Р. Задержка естественной репрессии лактазной активности у преждевремнно отнятых крыс связана с изменением их тиреоидного статуса. //Доклады Российской Академии Наук. -1992, Т.325, №5, с. 1077-1080.

85. Рипелиус К., Двинский Б.М. Максилакт ферментная обработка молока решает проблему непереносимости лактозы.// Молочная промышленность. -1995. №5, с. 33-24.

86. Самошина Н.М., Лотменцева Е.Ю., Борисова В.Н., Нахапетян Л.А. Сравнительное изучение некоторых кинетических параметров грибных р-галактозидаз.// Прикладная биохимия и микробиология. 1985, т. XXI. в.6, с.745-751.

87. Свириденко Ю.А., Смурыгин В.Ю. Гидролиз лактозы: мировой опыт. // Молочная промышленность. -1996, №7.

88. Синицын А.П., Зоров И.Н., Калугин В.В., Добриян Е.И., Рыжова С.А. Технологические свойства Р-галактозидазы.// Молочная промышленность. -2001, №6, с. 55-56.

89. Строкач Д.А., Арсеньева Т.П. Исследование процесса гидролиза лактозы в молоке.// Хранение и переработка сельхозсырья. 2003, №8. с. 94-95.

90. Строкач Д.А. Исследование и разработка технологии молочных продуктов с регулируемым углеводным составом.// Автореф. дис. на соиск. уч. степ, канд. техн.наук, СтПб, 2004 г.

91. Тихомирова А.С., За1устина Н.А. Получение и свойства ферментных препаратов Р-галактозидазы из Curvularia inaequalis.ll Прикладная биохимия и микробиология. 1976, т.12, №2.

92. Тихомирова А.С. р-Галактозидазы микромицетов и перспективы их применения./ Автореф. дис. на соиск. уч.ст. д-ра хим. наук. М.: 1981, ИНБИ АН СССР.

93. Тихомирова А.С., Церетели А.К., Куликова А.К., Летунова Е.В., Безбородое А.М. Трансгликозилирующее действие ферментных препаратов Р-галактозидаз. // Прикладная биохимия и микробиология. -1980, т. XYI, вып. 1, с. 65-71.

94. Тихомирова А.С. Сравнительный анализ биохимических свойств Р-галактозидазы прокариотов и эукариотов // Тез. докл. 5 Всесоюз. биохим. съезда, Киев, 27-31 янв. 1986 г. -М.: Наука, 1986,3, с.182-183.

95. Ткаченко Е.И., Першко A.M. Лактазная недостаточность. // Санкт-Петербургские врачебные ведомости. -1994, №8, с. 30-32.

96. ТУ 11249895-13-10-92 Препарат ферментный Лактоканесцин Г20Х.

97. Уголев A.M. Теория адекватного питания и трофология Санкт-Петербург, Наука, 1991-271 с.

98. Улезло И.В., Церетели А.К., Портная И.Б., Безбородов A.M. Р-Галактозидаза из супертермофильной анаэробной бактерии Thermoanaerobin sp. 2905 и ее иммобилизация.// Прикладная биохимия и микробиология. -2001,37, №1, с.48-52.

99. Устинникова Б.А., Ермолин Г.А. Метод дискового электрофореза в ПААГе для фракционирования и изучения белков. Обзор. ЦНИИТЭИ пищепром, Москва, 1972.

100. Федоренко Б.Н. Разработка технологии ультрафильтрации некоторых гидролитических ферментов. // Дис. канд. техн. наук. М., 1987.

101. Федоренко Б.Н. Ферменты и мембраны: научные основы взаимодействия: Монография, М.: МГУПП, 2002. -195 с.

102. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. М., Мир, 1980.

103. Хамагаева И.С. Теоретическое обоснование и разработка технологии кисломолочных продуктов на основе использования Р-галактозидазы и бифи-добактерий. // Автореф. дис. на соиск. учен. степ, доктора биол. наук. М., 1989,28 с.

104. ПЗ.Хорлин А.Я. Активные центры карбогидраз. //В сб. Структура и функции активных центров ферментов. М.: Наука, 1974.

105. Храмцов А.Г., Жидков В.Е., Холодов Г.И. Биотехнология напитков из молочной сыворотки. Ставрополь, 1996.

106. Церетели А.К., Куликова А.К., Тихомирова А.С. и др. Очистка внутриклеточной Р-галактозидазы Klyuveromyces fragilis. II Прикладная биохимия и микробиология -1980,15, № 6, с. 902-908.

107. Церетели А.К. Получение и свойства дрожжевой Р-галактозидазы.// Авто-реф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук. -М., 1981,23 с.

108. Шершевский М.Г., Нищий В.А., Тихомирова А.С. и др. Недостаточность Р-галактозидазы тонкого кишечника и ее энзимотерапия.// Вопросы питания.-1976, № 6, с. 54-56.

109. Шейбак М.П. Клинические синдромы и лечебная тактика при непереносимости коровьего молока у детей раннего возраста. // Педиатрия. 1991, №9, с. 77-80.

110. Шейбак М.П. Недостаточность кишечной лактазы у детей (непереносимость лактозы). // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 1995, т.40, №4, с.45-48.

111. Шиндер Д.А., Усманова О.Д., Рахимов К.Р. Изменение сахарахной и лактазной активностей тонкой кишки крыс-сосунков, преждевременно отнятых от кормящих матерей. // Физиологический жернал им. И.М. Сеченова. -1992, т.78, №1, с.53-58.

112. Шишкова Э.А., Орещенко Л.И., Фокина С.С. Использование мембранной технологии в производстве ферментов. // Межд. симпозиум по мембранам и процессам мебмранного разделения. ПНР, г. Торун, 1989, с. 1-2.

113. Шишкова Э.А., Орещенко Л.И., Фокина С.С. Технологические особенности концентрирования ферментных растворов. // В сб. Концентрирование, выделение и очистка продуктов микробиологического синтеза. М., 1985, с. 3-5.

114. Agrawal S., Sonawat Н.М., Dutta S.M. Thermostable P-galactosidase from fungi.// J Dairy Sci. 1982, v. 65, N 5, p. 866-870.

115. Anema P.J. Purification and some properties of P-galactosidase of Bacillus subtilis. II Biochim. Biophys. Acta, 1964, v. 89, p. 495-502.

116. Bacalova N.G., Petrova S.D., Ilieva S.Z., Atev A.P., Bhat M.K., Kolev D.N. Purification and properties of P-galactosidase from Chaetomium thermophilum -ATCC-28076. // Biotechnology Biotechnological Equipment. 2002, vol.16, N 2, p. 132-136.

117. Bailey M.J., Biely P., Poutanen K. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity.// Jornal of Biotechnology. 1992, N 23, p.257-270.

118. Bardosa M.S., Silva D.O., Pinheiro A.R. et al. Production of p-galactosidase from Klyuveromyces fragilis groun in cheese whey. // J. Dairy Sci. 1985, 68, N 7, p.1618-1623.

119. Becerra M., Cerdan E., Gonzales S.I. Micro-scale purification of P-galactosidase from Klyuveromyces lactis reveals that dimeric and tetrameric forms are active.// Biotechnology Techniques -1998, v. 12, N 3, p. 253-256.

120. Bernal V., Pavel J. Lactose hydrolysis by Klyuveromyces lactis P-D-galactosidase in skim milk, whey, permeate and model system.//Can. Inst. Sci. Technol. J. 1985, 18, p.17-19.

121. Beutler И.О. Methoden der enzymatischen Analyse, (Bergmeyer H.U., ed.) 3rd ed., Vol.VI, pp. 104-112, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel.

122. Bhosale J.H., Shevale J.G., Aryl P-galactosidase from Sclerotium rolfsii: physiological and biochemical studies. // Hindustan Antibiot. Bull. 1995, 37, p. 25-36.

123. Biller Y.A., King S., Rosenthal A.,Grand R.//J. Pediatrics- 1987- Vol.111, №1 -p.91-94.

124. Borglum G.B., Sternberg M.Z. Properties of a fungal lactase.// J. Food Sci. -1972, v. 37, p. 619-623.

125. Borzini P., Tedesco S., Greppi N., Rebulla P., Parrvicini A., Sirghia G. An immunoenzymatic assay for the detection and quantitation of platelet antobodies: the platelet P-galactosidase test (PGT). //J. Immunol. Metods. -1981, v.44, p. 323-332.

126. Brandao R.L., Nicoli J.R., Souza Figueiredo A.f. Purification and characterization of a P-galactosidase from Fusarium oxysporum var. lini.// J. Dairy Sci. -1987, 70, p.1331-1337.

127. Budriene S., Gorochovceva N., Dienys G., Zubriene A. P-Galactosidase from Penicillium canescens. Properties and immobilization. //Central European J. of Chemistry. 2005, 3 (1), p. 95-105.

128. Carpio C., Gonzalez P., Ruales J., Batista-Viera F. Bone-bound enzymes for food industry application.//Food Chem. 2000,68, p.403-409.

129. Castillo F.Y., Moreno B. Properties of lactase produced by Candida pseudotropicalis. //J. Daury Sci. -1983, 66, N 8, p. 1616-1621.

130. Castillo F.Y., Blanch H.W., Wilke C.R. Lactase production in continuous culture by Trichoderma reesei RUT-C30. // Biotechnol.Lett. -1984.6, N.9, p.593-596.

131. Cavaille D., Combes D. Characterization of beta-galactisidase from of Klyuveromyces lactis. II Biotechnol. Appl. Biochem. 1995, v. 22, p.55-64.

132. Chen K.S., Houng J.Y. Product inhibition of the enzymatic hydrolysis of lactose.//Enzyme and Microbiol. Technol. -1985,7, N 10, p. 510-514.

133. Collins M.S., De Palma Y.A., Pierson W.P. et al.// Gastroenterology 1986, vol.90, p.1377-1378.

134. Comp P., Lester G. Properties of an extracellular p-galactosidase secreted by Neurosporacrassal111. Bacteriol. 1971, v. 34, p. 300-306.

135. Craven G.R., Steers EJr., Anfinsen C.B. Purification, composition and molecular weight of the p-galactosidase E. coli K-12. // J. Biol. Chem. 1965, v. 240, N 6, p.2468-2477.

136. Darnall D.W., Klotz J.M. Subunit constitution of proteins. // Handbook of Biochem. and Molecular Biol. 2. Proteins. New York; London : Pergamon. Press, 1977.-25 p.

137. Deguchi E., Ueno M., Fusyuku S., Okamoto M., Akuzawa M. Lactose Intolerance in Suckling Piglets with Diarrhea. // J. Japan Veter. Med. Assn. -1997. vol. 50, N12, p. 701-704.

138. Deguchi E., Ueno M. Effect of Oral Administration of p-galactosidase on Diarrhea in Suckling Piglets. // J. Japan Veter. Med. Assn. 1997. vol. 50, N12, p. 713-716.

139. De Palma Y.A., Collins M.S. Enzyme replacement for lactose malabsorption using a beta-D-galactosidase.// J. Clin. Gastroenterol. -1989, vol.ll, №3, p.290-293.

140. Desnick R.J. Enzyme replacement and beyond. // J. Interit. Metab. Disease. -2001,24, N2. p.251-265.

141. Dickson R.C., Dickson L.R., Markin J.S. Purification and properties of an inducible P-galactosidase isolated from the yeast. // Bacteriol. 1979, v. 137, N1, p. 51-61.

142. Dovogelar J., Mainquet P., Faille I Osteoporosis and lactose intolerance. //Rev. Rhum.- 1996, v.63, N 6, p.460-461.

143. Endo Y., Ohtaki S., Kan H., Yoshitake S., Ishikawa E. A simultaneous enzyme-linked immunoassay for human thyroglobulin. // An. Letts, 1983, v. 16 (B3), p.181-195.

144. Fernandes S., Geueke В., Delgado O., Coleman J., Hatti-Kaul R. P-Galactosidase from a cold-adapter bacterium: purification, characterization and application for lactose hydrolysis.// Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, 58, p.313-321.

145. Field R.A., Haines A.H., Chrystal E.J.T., Luszniak M.C. Histidines, histamines and imidazoles as glycosidase inhibitors.//Biochem. J 1991,274, p.885-889.

146. Finocchiaro Т., Olson N.F., Richardson T. Use of immobilized lactase in milk systems. //Adv. Biochem. Eng. 1980, v.15, p. 71-88.

147. Gargova S., Pishtijski I., Stoilova I. Purification and properties of P-galactosidase from Aspergillus oryzae. II Biotechnol. Biotechnol. Equip. 1995, 9, p.47-51.

148. Gekas V., Lopez-Leiva M. Hydrolysis of lactose: a literature review.// Process Biochem. 1985,20, N1, p.2-12.

149. GoncalvesJ.A., Castillo FJ. Partial purification and characterization of P-galactosidase from Klyuveromyces marxsianus. I I J. Dairy Sci. 1982, v. 65, N11, p. 2088-2094.

150. Gonzalez R.R., Monsan P. Purification and some characteristics of P-galactosidase from Aspergillus fonsecaeus. I I Enzyme Microb. Technol. 1991, 13, p. 349-352.

151. Goodman R.E., Pederson D.M. P-Galactosidase from Bacillus stearothermophilus. II Can J. Microbiol., v. 22, p. 817-825.

152. Goroom R.F., Krose J.A., Pouwel P.H. et al. Systems for analyse promotors E. coli in Aspergillus nidulans. //Eur. Congr. Biotechnol., Munchen, 10-14 Sept., 1984 Weinheim. - 1984, v. 3, p. 305-310.

153. Gregory K. New dairy processes using lactase.//Food Processing Industry. -1980, p.44-46.

154. Green M.L.// Milk Industry, 1980, v.82, N 3, p.25-31

155. Greenberg N.A., Mahoney RR Rapid purification of p-galactosidase (Aspergillus niger) from commerzial preparation. // J. Food Sci. -1981,46, p. 684-687.

156. Greenberg N.A., Mahoney R.R. Immobilization of lactase (P-galactosidase) for use in dairy processing: a review. // Process Biochem. 1981, v.16, N 2, p. 2-8.

157. Greenberg N.A., Mahoney R.R Formation of oligosaccharides by p-galactosidase from Streptococcus thermophilus. // Food Chem. 1983, v. 10, N 3, p. 195-204.

158. Guy E., Edmondson L. //Dairy Sci. 1978, v.61, p.542.

159. Higgins J.J., Lewis D.L., Daly W.H., Lilly M.D. Investigation of the unit operations involed in the continuous flow isolation of p-galactosidase from Escherichia coll //Biotechnol. and Bioeng- 1978, v.20, N 2, p.159-182.

160. Hirata H., Negoro S., Okada H. High production of thermostabil P-galactosidase of Вас. stearothermophilus in Вас. subtilis. //Appl. and Environ. Mikrobiol. -1985, v. 49, N6, p. 1547-1549.

161. Hussein L., Elsayed S., Foda S. Reduction of lactose in milk by purifed lactase produced by Klyuveromyces lactis.Hh of Food Protect., 1988, 52, N 1, p.30-34.

162. Hu A.S., Wolfe R.G., Reithel F.J. The preparation and purification af P-galactosidase from Escherichia coli ML-308. // Arch. Biochem. Biophys-1959, v. 81, p.500.

163. In M.J., Jin J. Characterization of P-galactosidase from a Bacillus sp. with high catalytic efficiency for transgalactosylation. // J. Microbiol. Biotechnol. 1998, 8 (4), p. 318-324.

164. Itoh Т., Suzuki M., Adachi S. Production and characterization of p-galactosidase from lactose yeasts. // Agr. and Biol.Chem. -1982,46, N 4, p. 899-904.

165. Jagota S.K., Ramana M.V., Dutta S.M. P-Galactosidase of Streptococcus cremoris.ll J. Food Sci. 1981, v.46, p. 161-165.

166. Jimenez-Guzman I., Cruz-Guerrero A.E., Rodriguez-Serano G., Lopez-Munquira A. Enhancement of Lactase Activity in Milk by Reactive Sulfhydryl Groups indused by Heat Treatment.// J. Dairy Sci. 2002. 85, p.2497-2502.

167. Johnson H.N., DeBusk A.G. The P-galactosidase system of Neurospora crassa. I. purification and properties of the pH 4,2 enzyme. // Arch. Biochem. Biophys. -1970,138, p. 408-411.

168. Jurado E., Camacho F., Luron G., Vicaria J.M. A new kinetic model proposed for enzymatic hydrolysis of lactose by a P-galactosidase from Klyuveromyces fragilis.H Enzyme Microbiol. Technol. 2002, 31, p.3 00-309.

169. Ipsita Roy, Munishwar N. Gupta. Lactose hydrolysis by Lactozym™ immobilized on cellulose beads in batch and fluidized bed modes. // Proccess Biochemisry -2003, 39, p. 325-332.

170. Kitagawa Y., Kanayama Y., Yamaki S. Isolation of P-galactosidase fractions from pear: activiti against native cell wall polysaccharides. // Physiol.Pantarum. -1995, v. 93, N 3. p.545-550.

171. Kowalewska-Piontas I., Bednaski W. The attemps to intensify of galactooligicaccharides in the process of enzymatic lactose hydrolysis. // Pol. J. Food Nutrit. Sc. 2001, v. 10, N 3, p. 43-46.

172. Kowalewska-Piontas I., Bednaski W., Bieleska M. Comparison of the hydrolytic and transgalactolisation properties exhibited by p-galactosidase of different origin.// Pol. J. of natural sciences Olsztyn, 2002, N 11, p.7-16.

173. Kuby S.A., Lardy H.A, Purification and kinetics of p-galactosidase from E. coli strain K-12. // J/ Amer. Chem. Soc. 1953, v. 75, N 1, p. 890-896.

174. Kulp K. Carbohydrases. In: Enzymes in food processing. Academic Press, New York, 1975, p. 92-97.

175. Ladero M., Santos A., Garsia-Ochoa F. Kinetic modeling of lactose hydrolysis with an immobilized p-galactosidase from Klyuveromyces fragilis.// Enzyme and Microbiol. Technol.- 2000. -27. N8, p.583-592.

176. Ladero M., Perez M.T., Santos A., Garsia-Ochoa F. Hydrolysis of lactose by free and immobilized P-galactosidase from Thermus sp. strein T2. // Biotechnol. Bioeng. 2003, 81, p.241-252.

177. Lai E.C.K, Morris S.A., Street I.P., Withers S.G. Substituted glycols as probes of glycosidase mechanisms.// Bioorg. Medical Chem. 1996,4, p.1929-1037.

178. Lee Y.C. Inhibition of P-D-galactosidase by D-galactal.// Biochem. Biophys. Res. Comm.-1969,35, p.161-167

179. Lowiy O.N., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. 1951, v. 193, N 1, p.265-275.

180. Macris В J., Marcacis P. Characterization of exstracellular P-D-galactosidase from Fusarium moniliforme grown in whey. // Appl. and Environ. Microbiol. -1981,41, N.4, p. 956-958.

181. Mahoney R.R., Whitaker J.R. Purification and physicochemical properties of p-galactosidase from Klyuveromyces fragilis. // J. Food Sci. 1978,43, p. 584-591.

182. Mahoney R.R. Galactisyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis: a review. // Food Chem. 1998, v. 63, N 2, p. 147-154.

183. Mandelstam J. Induction and repression of P-galactosidase in non-growing Escherichia coli.// Biochem. J. 1961, v. 79,N 3, p.489-496.

184. Mangala P, Nair C.K.K., Pradhan D.S. Purification and characterization of inducible P-galactosidase from Corynebacterium murisepticum. // Arch. Microbiol. 1989, v.151, p. 49-53.

185. Manzanares P., de Graaff L.H., Visser J. Characterization of galactosidases from Aspergillus niger, purification of a novel a-galactosidase activity. // Enzyme Microb. Technol. 1998,22, p.383-390.

186. Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis. Instruction for the Analysis of Foodstuffs in Research, Production and Official Control. Boehringer Mannheim GmbH, 1989, p. 86-88.

187. Moskovitz M., Curtis C., Gavaler Y.// Am.J. Gastroenterol. 1987- vol.82, №7 p.632-635/

188. Nagy Z., Kiss Т., Szentirmai A., Biro S. P-Galactosidase of Penicillium chrysogenum: production, purification and characterization of the enzyme. // Prot. Expr. Purif. 2001,21, p. 24-29.

189. Nakamura A., Maeda H., Mizuno M., Koshi Y., Nagamaisu Y. P-Galactosidase and its significance in ripening of "Saijyo" Japanese Persimmon Fruit. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67 (1), p. 68-76.

190. Ogushi S., Yoshimoto Т., Tsuru D. Purification and comparison of two types P-galactosidase from Aspergillus oryzae. II J. Ferrnrnt. Technol. 1980, 58, N 2, p. 115-122.

191. Paige D.M. Bauless Т., Huang S., Wexler R. Lactose hydrolyzed milk.// Am. J. Clin. Nutr., 28, p.818-822.

192. Park Y.K., De Santi M.S., Pastore G.M. Production and characterization of P-galactosidase from Aspergillus oryzae. II J. Food Sci. 1979,44, p. 100-103.

193. Pastore G.M., Park Y.K. Screening of high P-galactosidase producting fungii and characterising the hydrolysis properties of a selected strain. // J. Food.Sci. 1979, v. 44, N6, p. 1577-1579.

194. Pastore G.M., Park Y.K. Purification and characterization of P-galactosidase from Scopulariopsis sp. II J. Ferment. Technol. 1980, v. 58, N 1, p. 79-81.

195. Pedrique M., Castillo F.J. Regulation of p-D-galactosidase synthesis in Candida pseudotropicalis. //Appl. Environ. Microbiol. 1982,43, p. 303-310.

196. Petrova S.D., Bacalova N.G., Ilieva S.Z., Atev A.P., Bhat M.K., Kolev D.N. Production of P-galactosidases from Sporotrihum thermophile. И Biotechnology Biotechnological Equipment. 2002, vol.16, N 2, p.127-131.

197. Pical-Cleland K.A., Rodrigues H.N., Amidor G.L., Carpenter J.F. Protein denaturation during freering and thawing in phosphate buffer systems: monomeric and tetrameric P-galactosidase. // Biochem. and Biophys. 2000, 384, N2, p.3 98-406.

198. Pollard H., Steers E. Bacillus megaterium KM P-galactosidase: purification by affinity chromatography and characterization of the active species. // Arch. Biochem. Biophys. -1973, v. 158, N 2, p.650-661.

199. Ramirez F., Lee K., Graham D. A lactase prepsrstions are not the same: results of a prospective, placebo-controlled trial. // Am. J. Gastroenterol. 1994, v. 89, N 4, p. 566-570.

200. Rogello Lopes Brandao, Jaques Robert Nicoli. Purification and characterization of P-galactosidase from Fusarium oxysporum var. lini/ // J. of Dairy Science. -1987, v.70, N7, p.1331-1337.

201. Rosado J., Solomons N., Lisker R. Effective reduction of lactose malabsorption and milk intolerance by direct addition of P-galactosidase to milk at mealtime.// Gastroenterology 1984, v.87, p.1072-1082.

202. Ross G.S., Vergzyn Т., MacRae E.A., Bedgwell R.J. Apple beta-galactosidase. Activity against cell wall polysaccharides and characterization of related cDNA clone. // Plant. Physiol. 1994, v. 106, N 2, p.521-528.

203. Rubens C., D' Arcadia, Gisele B.I. Properties of new fungal p-galactosidase with potencial application in the daily industry // Rev. Microbiol. 1999, v. 30, N 3, p. 265-271.

204. Samoshina N.M., Yugova L.V., Gross P.H., Bravova G.B., Shishkova E.A., Samoshin V.V. Partial purification and characterization of glucosidases from

205. Aspergillus oryzae and Penicillium canescens. И In: Abstracts of 219 National Meeting of the American Chemical Society. San Francisco, CA: The American Chemical Society. 2000. p. 160.

206. Samoshina N.M., Samoshin V.V. Michaelis Constants Ratio for two substrates with mould and yeast (3-galactosidases. // In: Abstracts of 227th National Meeting of the American Chemical Society. 2004, p.CARB 47.

207. Sakaguchi K., Yamaguchi T. Properties of ezstracellular acid-side P-galactosidase from Sclerotium tuliparum. Я J. Ferment. Technol. 1973, v. 51, N 10, p. 750-752.

208. Shaikh S.A., Khire J.M., Khan M.J. Characterization of a thermostable extracellular P-galactosidase from thermophilic fungus Rhizomucor sp. И Biochim. Biophys. Acta (Gen. Subjects), 1999,1472, p. 314-322.

209. Shan N., Nickerson T.//J.Food Sci. 1978, v.43, p. 1081

210. Shi Yi-Min, Yan Ji-Qiong, Fei Xue-Nan, Xu Yu-Quan. Purification and properties of P-galactosidase from intercellularfluid of tomato leaves. // Acta phitophysiol. Sinica. 1994, v.20, N 2, p.l 13-120.

211. Shukla H., Chaplin M. Nocompetitive inhibition of P-galactosidase (A. oryzae) by galactose. // Enzyme Microb. Technol. 1993, v. 15, p.297-299.

212. Solomons N., Guerrero A., Torun В.// Am. J. Clin. Nutr. 1985 - vol.41, №1, p. 222-227.

213. Sonawat H.M., Agarwal A., Dutta S.M. Purification of P-galactosidase from Klyuveromyces fragilis grown on whey. // Folia microbiol. 1981, v. 26, N 5, p. 70-376.

214. Sorensen S.C., Crisan E.v. Termostable lactase from termophilic fungi. // J. Food Sci.-1974, v. 39, N6, p. 1184-1187.

215. Steers Jr.E., Cuatrecasas P., Pollard H.B. The purification of p-galactosidase from Escherichia coli by affiniti chromatography. // J. Biol. Chem. -1971,246, p. 196-200.

216. Stephens R., DeBusk S.G. P-Galactosidase from Neurospora crassa. II Methods Enzymol. 1975,42, p. 497-503.

217. Sugira M., Susuki M., Sasaki M., Shimomura Т. Studies on p-galactosidase. I. Purification and properties of P-galactosidase I and II from Sclerotium tuliparum.il Chem. and Pharm. Bull. -1976, v. 24, N 4, p. 788-793.

218. Sykes D.E., Abbas S.A., Barlow J.J., Matta K.L. Substrate specificity and other properties of the P-D-galactosidase from Aspergillus niger. H Carbohydr. Res. -1983, 116, p. 127-138.

219. Szczodrak J. Hydrolysis of lactose in whey permeate by immobilized p-galactosidase from Penicillium notatum. //Acta Biotechnol. -1999, 19, p. 235-250.

220. Takenishi S., Vatanabe Y, Miwa Т., Kobayashi R. Purification and some properties of p-galactosidase from Penicillium multicilor. II Agric. Biol. Chem. -1983,47, p. 2533-2540.

221. Toba Т., Tomita Y., Itoh Т., Adachi S. p-Galactosidase of lactic acid bacteria: characterization by oligosaccharidis formed during hydrolysis of lactose. // J. Dairy Sci. -1981, v. 64, N 2, p.185-192.

222. Toba Т., Yokota A., Adachi S. Oligosaccharide structures formed during the hydrolysis of lactose by Aspergillus oryzae P-galactosidase. // Food Chem. -1985, v. 16, N 2, p.147-162.

223. Tsen H-Y., Lin c-C-K. Properties of two lactases from yeasts and the comparision of enzyme kinetics. // J. Chim. Agric. Chem. Soc. 1986, v.24, p. 330-342.

224. Turck D. Lactase and lactose malabsorption.// Nutrition infantile. 2004, N 4, p.38.

225. Uwajima Т., Yagi H., Terada О. Purification, crystallization and some properties of P-galactosidase from Saccharomyces fragilis. // Agric. Biol. Chem. 1972, 36, p. 570-577.

226. Vella M., Greenwell P. Purification and characterizatin of P-galactosidase from Trichomonas foetidus.ll Glycoconjugate J. 1997,14, p.883-887.

227. Vidmer F., Leuba J. P-Galactosidase from Aspergillus niger. Separation and characterization of three multiple forms. // Eur. J. Biochem. 1979, 100, N 2, p. 559-567.

228. Williams SJ, Notenboom V, Wicki J, Rose DR, Withers SG A new, simple high-affinity glycosidase inhibitor: analysis of binding through X-ray crystallography, mutagenesis and kinetic analysis.// J Am. Chem. Soc. 2000,122, p.4229-42230.

229. Xie Yi, Jiang Peu-hong, Guo Jie-Yan. Studies on the stability of Klyuveromyces lactisJIFudan xuebao. Ziran Kexue ban = J. Fudan Univ. Nat. Sci. 1999, 38, N 5, p. 523-528.

230. Watanabe Y., Kibesaki Y., Takenishi S., Sakai K., Tsujuisaka Y. Purification and properties of p-galactosidase from Penicillium citrinum. II Agr. Biol. Chem. -1979, v. 43, N5, p. 943-950.

231. Watanabe Y., Miva Т., Kobayashi R. Purification and some properties of p-galactosidase from Penicillium multicolor. II Agr. Biol. Chem. 1983, v. 47, N11, p. 2533-2540.

232. Wendorff W.L., Amundson C.H. Characterization of P-galactosidase from Saccharomyces fragilis. I I J. Milk Food Technol. -1971, v. 34, p.300-306.

233. Zhegkun Zhou Q., Dong Chen X., Xuemei Li. Kinetics of lactose hydrolysis by p-galactosidase of Klyuveromyces lactis immobilized on cotton fabric.// Biotechnol. Bioeng. 2003, v. 81, N 2, p.127-133.

234. НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ЦЕНТР «ЛЕКБИОТЕХ» «НТЦ ЛЕКБИОТЕХ»1. УТВЕРЖДАЮ

235. Директор-НТЦ~~«Лекбиотех» П.Б. Бравова М 2002 г.1. JO /технический центрЬЛбиотехнология»/^

236. ЛАБОРАТОРНЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ РЕГЛАМЕНТполучения субстанции ГАЛАКТОЗИМА1. J1P-40062583-80-2002

237. Срок действия регламента до «25» июня «2005 г.4У157

238. РАЗДЕЛ 16 ИНФОРМАЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ

239. Разработчиком лабораторного технологического регламента на получение субстанции Галактозима является лаборатория биологически активных веществ НТЦ "Лею

240. Для производства субстанции Галактозима в качестве базового препарата используется коммерческий ферментный препарат Лактоканесцин Г20Х, производимый на ОАО «Восток» и используемый в настоящее время для нужд молочной промышленности.

241. Лабораторный технологический регламент разработан на основании ранее проводимых исследований по получению очищенного ферментного препарата Лактоканесцин Г20Х (ТУ 11249895-13-10-92).1. Литературные источники:

242. Положение о технологических регламентах производства продукции на биотехнологических предприятиях, действующее с 01.01.96 г.

243. Пожаровзрывоопасность веществ и материалов и средств их тушения, справ, изд. в 2-х книгах, под ред. А.Н.Баратова и А.Я.Корольченко, М., Химия, 1990.

244. Физико-химические величины для основных продуктов, обращающихся в медицинской и микробиологической промышленности (рекомендуемые справочные данные и методы расчёта), Купавна, 1989.

245. Рябова М.В. Справочник «Пожарная опасность веществ и материалов», М., 1970.

246. Вавилин О.А., Падалкин В.П., Панферов Н.Н. Справочник по охране труда в микробиологической промышленности, М., Лесная промышленность, 1981.

247. ГОСТ 12.1.004-91 Пожарная безопасность. Общие требования.

248. ГОСТ 12.1.007-76. Вредные вещества. Классификация и общие требования , безопасности.

249. Разработчики: Зав. лабораториейбиотех".биологически активных веществ1. Ст. научный сотрудник1. Э.А. Шишкова1. Научный сотрудник1. О.А. Сухих

250. Инженер по охране труда и технике безопасностбезопасност1. В.Н. Гордеев

251. Ведущий специалист отдела стандартизации1. В.М. Лаврухина

252. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

253. УТВЕРЖДАЮ Руководитель Департамента Государственного контроля качества лекарственных средств и медицинской техники1. В.Е. Акнмочкин» 200 г.

254. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО1. СРЕДСТВА

255. ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ ПРЕДПРИЯТИЯ

256. НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ЦЕНТР «ЛЕКБИОТЕХ»

257. ГАЛАКТОЗИМ вводится впервые (лактаза).

258. Срок введения установлен с « » 200 г.1. Срок действиядо « »200 г.

259. Настоящая фармакопейная статья предприятия распространяется на препарат Галактозим, содержащий микробную лактазу (Р-галактозидизу), и применяемый для приготовления лекарственного средства.1. ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ1. ПЕРЕПЕЧАТКА ВОСПРЕЩЕНА1. ФСП 42с.16

260. Хранение. Препарат хранится в сухом, защищенном от света месте, при

261. Срок годности. 4 года. Определен при хранении препарата в условиях, предусмотренных проектом ФСП. Результаты исследования стабильности прены в табл.2.

262. В течение всего срока хранения (4 года и 6 месяцев) препарат сохраняет активность и все физико-химические свойства. Хранение продолжается.

263. Аналитические данные по 5 сериям препарата Галактозима представлены в таблице 3.1. Исполнители:температуре от 5 до 15°С.парата Галактозим при хранении по условиям ФСП 42приведе

264. Зав. лабораторией, к. т. н.1. Э.А. Шишкова

265. Ведущий научный сотрудник, к. х. н. ///А^^, Л.И. Мотина1. Научный сотрудник1. О.А. Сухих