Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАСТВОРИМАЯ И ИММОБИЛИЗОВАННАЯ БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗА CURVULARIA INAEQUALIS И ГИДРОЛИЗ ЕЮ ЛАКТОЗЫ В МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКЕ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "РАСТВОРИМАЯ И ИММОБИЛИЗОВАННАЯ БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗА CURVULARIA INAEQUALIS И ГИДРОЛИЗ ЕЮ ЛАКТОЗЫ В МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКЕ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А,Н.БАХА

На лравах рукописи

БАВВА Вера Сергеевна

РАСТВОРИМАЯ И ИШОБШШЗОВАННАЯ В-ГАЛАКТОЗИДАЗА синташил ИШфИАИВ И ГИДРОЛИЗ ЕЮ ЛАКТОЗЫ В МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКЕ

03*00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации аа соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 1980

¡гьм

Работа вшолнена в Ордена Левина институте биохимии ям» А.Н.Бага АН СССР* Институте биоорганаческой химии им. И.И.Шемякина АЦ СССР к Всесоввном научно-исследовательском институте молочной промышленности.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор В.К.Антонов

кандидат биологических наук Д.С.Тихомирова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.В.Мосолов

кандидат биологических наук Р.Н.Гребеиова

Ведущее предприятие: кафедра технологии микробиологических производств Московского ордена Трудового Краевого Знамени технологического института пищевой промышленности.

Защита диссертации состоится ^{ъ^Л Л 1980г.

в час. ва заседании специализированного совета К 002.96.01 по присуждение учёной степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (Москва, 117071, Ленинский пр., 33, корп. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Отделения биологических наук АН СССР (Москва, 117071, Ленинский пр., 33, корп. I).

Автореферат разослан .иаЬтпО 1980г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологи чес- . (\ к^ М .И .Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Решениям а ХХ7 съезда КПСС, касающимися основных направлений развитие народного хозяйства СССР на 197680 годы, предусмотрено высокими тешами развивать производство про» дуктов литания на основе современных достижений науки к техники. Одним из передовых приемов интенсификации современной технологни является применение растворимых и иммобилизованных ферментов»

2-Галактозидаза (в-о-галактоэид-галактогядролаэа, лактааа, Кф. 3.2.1.23) относится в ферментам, всводгзование которого должно привести к существенному улучшению технологии переработки молока. Применение в-галактозидазы основано на том* что фермент гидроли-эует лактозу до моносахаридов: глюкозы и галактозы. В результате гидролиза малосладкий* плохорастворимый дисахарид превращается в более сладкую смесь моносахаридов и полученная смесь лучше растворяется в воде. Кроме того, лактоза в ряде случаев плохо усваивается человеком и сельскохозяйственными животными, ока не сбраживается хлебопекарными дрожжами, в то время* как продукты гидролиза лактозы усваиваются лучше.

Лактоза является основной составной частью сухих веществ дельного молока и продуктов его переработки: сыворотки* пахты, обезжиренного молока и их ультрафильтратов, - которые в настоящее время утилизируется лишь частично. По сведениям Международной молочной федерации в среднем\31 % молочной сыворотки используется на пищевые цели* а 50 ¡6 ее составляют потери* что отрицательно сказывается на окружающей среде ( Хохлов н др.* 1978 ). Сочетание современных технологических процессов с обработкой молочного сырья &-галактозидаэой позволит Солее полно использовать составные части молока. Обработка вторичного молочного сырья в-галактоэидазой увеличивает возможно его использования

; ^зграяиш Лаучгш Епблзметз (орд. Лссха Сслшз, | /ч -и.с^пя на. и, д. Тяаарюсга

в хлебопекарной и кондитерской пгюиыжленностях, создает экономию пуки и сахарозы, способствует созданию новых навятвов из молоч-вой сыворотки я ее ультрафидьтратов. Гидролиз лактозы цельного иоловд позволяет получать концентраты лучдего качества, лвяенвые порока "песчанистости", изготовлять диетические молочные продукты для лпдей. страдаимх лактазной недостаточности).

В последнее время ведутся широкие исследования по выделению, изучению свойств и применению в-гапактозндаз микроорганизмов. В налей стране работ в этом направлении проводятся в Ордена Ленина институте биохимии ни. А.Н.Бега ¿В СССР. В этой институте получены препараты в-гадактоэидавы из дрожжей, а тавхе из микроскопических грибов. Изучение гидролиза лактозы в сложных биологических средах« а именно в подсырнвй сыворотке, новым отечественным ферментным препаратом В-галактоэвдазы , полученным из гриба Сиг-ти1аг1а 1павчиа11в , до настоящего исследования не проводилось. Важно также, что применение растворимой в-галанхозидазы лл ив тируется относительно высокой её стоимость» и одноразовым использованием. Иммобилизация дает возможность многократного использования препарата, позволяет осуществлять непрерывный технологический процесс переработки и исключает попадание фермента в готовый продукт. Кроме того, исследование иммобилизованной в-галактози-даэы дает информацию о влиянии модификации бедка па его стабильность и функциональную активность.

Цель исследования. Целью данной работы является иммобилизация в-гапактозидазы Сшпги1аПа 1па.едиа11я, гидролиз лактозы в молочной сыворотке растворимым и иммобилизованным ферментом, а также исследование влияния иммобилизации на физико-химические и каталитические свойства в-галактозидазы.

Научная новизна. Изучен гидролиз лактозы отечественным препаратом в-галактоэидаэа о. 1паефда11в в подсырпой сыворотке. Пред-

ложен новые метод иммобалиаацвн в-галактоаидааы с. ш&еди&Ив» позволяющий получать препараты с высокой активностью. Истод состоят из предварительной модификации фермента активным яркоораяжевым КГ, содержащим эл ектро о три цател ыше группы, а последующей до садки на анионик, Иссдедов&аы фкзико-хвмические и ферментативные свойства модифицирована!»К и вммоСил и з ов анно й в-галактоаидавы, термическая денатурация фермента, определены активацвоаные параметры термической денатурации натидноВ, модифицированной я иммобилизованной д-гадактоэвдазы.

Практическая ревность. Подобраны оптимажьаыэ условия гидролиза лактозы растворимой В-галактоэядаэоЯ с. Шаедшця в подсыряой сыворотке, что позволяет получать сыворотку с различной степенью гидролиза лактозы* Показана возможность гидролиза лактозы в молочной сыворотке к ее ультрафильтрам вммоСалиэозаваой в-гаяакто-звдаэоВ, что расширяет оСластя применения этого ценного пвяевого сырья.

Объем работы, диссертация состоят из 164 страниц машинописного текста, содержит введение, весть глав, обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы, содержащий £70 работ, в том число-отечественных 75 м 195 работзарубежннх исследователей. Материал диссертации иллюстрирован 13 'таблицам* я 23 ртсуваамя.

Апробация работы. Результаты работы быки представлены яа расширенном кодюквиуие яо Всесоюзном научно-исследовательском институте молочной промышленности (Ноская, 1976), на II Всесоюзном симпозиуме по получение я применению иммобилизованных ферментов (Дбовяя, 1977), на Республяканском семинаре ао комплексной про-кыаленеой переработке молока (Ставрополь, 1977), на 7-ой конференция молодых ученых яо проблемам кикройиологив и вирусологии (Рига, 1977) я опубликованы в вести печатных работах*

- б -

I* Материалы ы методы исследований.

Новым продуцентом ß-галактоэидазы служил ми кро снопи че сии Я триб Curvularia Inaequalis, отобранный среда 200 других ятаммов Грибов в лаборатории Ферментных препаратов Института биохимии им. А.Н.Ка-ха АН СССР.

Культура грибов поддерживалась на агаризованной среде следующего состава (г/л); лактоза - 40,0; ш^яо^ - 2,0; Na^o^ - 0,55; MgS04 - 0,5; KCl - 0,7; кукурузный экстракт - 7,0 мл.

Гриб культивировали 78 часов при 27-28° в колбах Эрлевиейера, объемом 750 мл, на качалке или в ЗО-литровьц ферментерах фирмы "Uarubiebi" на оптимизированной методом математического планирования среде <г/л): соевая мука - 20,0 ¡(Ш^зо^. - 2,0; KgS04 - 0,15; KCl - 0,5 в 0,1 Ц фосфатно-цитратном буфере pH 2,6. Посевная культура (2-5%) выращивалась 48 часов на среде того же состава в 0,1 II фосфатно-щтратном буфере pH 3,0.

Активность а-галактозидазы (растворимой м иммобилизованной) определяли колориметрически по количеству освободившегося из п-витрофеввя-ß-D-галахтоп в рано зида (п-НФГ) окрашенного п-нитрофеиола (Kuby e.Lardy , 1958) м по количеству глюкозы, образоваваейся при гидролизе лактозы. Для определения глюкозы использовали глюкозо-оксидазвый метод (Щербухвя в др., 1970). Условия проведения реакции- были разработаны в лаборатории ферментных препаратов Института биохимии им. А.В.Баха АН-СССР (Куликова и др., 1971).

Белок определяли по Лоури я яа спектрофотометре СФ-4А при 280 нм. Изозлектрофокусирование £-галактозидазы проводили по методу Vesterberg е.а» (1967) яа приборе шведской фирмы "lkb". Лактозу в молочной сыворотке определяли методом Somogi-Neison (1952).

Грибную ß-галактозидаэу иммобилизовали ковалентно на аминоаз-росиле изоциаватным методом и принципиально ноши методом физической сорбции, разработанным в лаборатории химии ферментов Института биоорганической химии им. U.U.Шемякина АН СССР под руководством

профессора В.К.Антонова и ст. научного сотрудника Л ..В.Козлова. Метод заключается в предварительной модификации фермента активным яркооранжевый КХ, содержащим три сульфогруппы, и доследующей сорбции модифицированного белка на авионитах.

II. Получение и свойства в-галактозидазы.

Экспериментальная работа била начата с получения В-гадактогвда-зы из нового отечественного продуцента Curvularia inaequalia. Для изучения гидролиза лактозы s молочной сыворотке, а также для работ по иммобилизации в-галактозидазы получены препараты различной степени очистки. Технический пренарат в-галактозидазы (лактои-неквалнн Г10Х) выделяли из кулыурадьной жидкости осаждением 1,5 объемами ацетона и переосаждением 4 объемами этанола по опясаяной ранее методике (Тихомирова и Загусткна, 1976). Количество белка (по Лоурк) в препарате составляло 60-6? мг/г, активность по синтетическому субстрату (п-НФГ) была 270-300 Е/г, по природному (лактозе) - 100-120 Б/г. Использование технического препарата затруднялось наличием в нем значительного количества солей и других низкомолекулярных примесей. Поэтому технический препарат подвергали гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25 или диализу против дистиллированное воды. Такой диофшино высувешшй препарат имел активность 1000-12СЮ Е/г по П-НФГ и 450-500 Е/г по лактозе. Кроме того, получен более чистый препарат В-галактозидазы, очинённый последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлшозв, с активность» по д-НФГ 5640 Б/г и удельной активность!) 25 Е/ыг белка. Выход на конечной стадия составил 40 Î от первоначальной активности в кудьтуральноИ жидкости. Таким образом, используя ионообменную хроматографии, удалось накопить высокоочиценный и достаточно активный лиоФильно высушенный препарат в-галактозидазы с. inaequaits. Характеристики полученных и используемых в данной работе препаратов й-галактозидазы приведены в таблице I.

2-196

Препараты ß-галакюэидазы испытаны на стабильность при хранении, В течение трех лет лиофильно высушенные препараты ( в тон числе высокоочищенный) ори температуре 5° без доступа влаги не потеряли активности, что говорит о высокой стабильности полученных препаратов ß-галавтозндазы.

Таблица I.

Характеристика используемых в работе препаратов ß-галактоэи-дазы Curvularia inaequalia разной степени очистки

Способ получения фермента

Активность,

___Ч* _

по п-НФГ

по лак^ тозе

Белов, мг/г

Уд.активность,

„ _ JS/ME___

по пЧЮГ

по лактозе

Протео-литическая активность , Б/г_ I _

Осаждение органическими растворителями (технический)

Диофилизяция после очистки на сефа-денсе G-25 (частично очищенный)

Лиофялизацяя после очистки на ДЭАЭ-целлплозе (высоко-очищенин^)_____

270

1000

£640_

108

450

2040

€0

168

224

4,5

5,9

1,8

2,7

<10

<10

25.2

Изучены физико-химические и каталитические свойства грибной в-га-лактозядааы. Максимальную активность лактаза проявляла в интервале рН 4,0-4,2 и при температуре 55-60°. Кт для гидролиза п-НФГ и лактозы соответственно равны 0,30-Ю"3 и и 4,14-Ю"3 П. Данные соответствуй« полученным ранее Тихомировой и Загустиной (1976) и Загусти-ной и Тихомировой (1976) для гомогенной в-галавтозидазы. Исследование температурной зависимости позволило рассчитать энергии активации реакции гидролиза лактозы (Б), которая составила 5997 кал/моль (25,1 кДх/моль).

Термостабильностъ нативной ß-галактозидазы изучали в диапазоне температур от 35 до 75D с концентрацией активного белка в растворе 0,02 Е/мл. В условиях 15 мня преинкзйацви при pH 4,2 не наблюдается ннактивируюцего действия температуры, при 65° сохраняется около 85Ц активности фермента, полная инактивация наступает при 75°.

В интервале температур 60-70° изучена кинетика термической денатурации вативной ß-галактоэидаэы и определены константы скорости денатурации фермента. Исходя из зависимости Аррениуса, рассчитаны ахтивацнонные параметры процесса денатурапии в-галахтозидазы. Анализ данных говорит о том, что кинетика термической денатурации вативной я-галактозидазы подчиняется уравнению первого порндка и величина свободной энергии активации денатурации « 27,1 ккал/моль (ИЗ,46 кДж/моль) совпадает со значением дР^ для других белков различной природы (Холи« 1968).

III. Гидролиз лактозы сыворотки растворимой в-галакто-зндазой Curvularla inaequails.

Наиболее распространенным естественным субстратом в-галактози-дазы является лактоза (молочный сахар). Лактоза составляет 5,0 % цельного молока и вторичного молочного сырья, использование которого представляет собой важную нерешенную проблему.

В СССР были проведены исследования по гидролизу лактозы в молоке и сыворотке дрожжевой в-галактозидазой Sacch. fragllis (Попова и др., 1975; 1амагаева, 1975; Фениксоза и др., 1975) и грибной ß-галактозидазой в сыворотке с кислым рВ (Василисина, 1979). При гидролизе лактозы в молоке и подсырной сыворотке (в слабокислых и нейтральвыг средах) до настоящего исследования действие грибного фермента ае изучалось. Ранее установлено, что грибная ß-галактоэи-даза отличается от дрожжевой большей устойчивостью к изменениям окружающей среды, более аироким диапазоном pH и температуры« в ко-

тором проявляется ее активность, поэтому этот фермент является более перспективным для практического использования.

В надих опытах показано, что в сложной биологической среде также, как и я водных растворах лактозы, на ферментативный гидролиз влияет значение рН. Скорость гидролиза лактозы в сыворотке с различными значениями.рН определяли при температуре 50°, При этой температуре в течение 1-6 часов не наблюдали понижения активной кислотности сыворотки за счет жизнедеятельности молочнокислых бактерий, которые активнее развиваются при более низких температурах. Оптимум рН-действня для грибной в-галактозидазы (с активностью 1000 Е/г препарата) в молочной сыворотке составляет 4,0-5,0 (рис. I). Достаточно интенсивный гидролиз идет*при увеличении рЦ до 6,5-

А, %

100

50

О

2

3

4

5

б 7 рН

Рис.

I. Зависимость скорости гидролиза от максимальной) лактозы в молочной сыворотке (I) и в буферном растворе (2) Б-галактозидаэой С. ЬсаедиаИэ от рН.

7,0* Степень гидролиза в этой области составляет 70 % от максимальной. Это дает возможность успешно проводить гидролиз лактозы гребным ферментом не только в висло» творожной сыворотке, во и в род-сырной и в свежем молоке без предварительного снижения кислотности среды, которое необходимо при гидролизе лактозы в молочной сыворотке дрожжевой в-галактозидазой (Василисина, 1379).

Гидролиз лактозы в подсырной сыворотке изучали при 5, 20, 35, 50° в течение 6-48 часов. Полученные данные показывает, что основными факторами, регулирущими процесс гидролиза лактозы в молочной сыворотке грибной в-галактозидазой, являются концентрация фермента, температурный режим и время проведения реакции. Наиболее интенсивный гидролиз происходит при 50°. За три часа при внесении в-галактозидазы в количестве I Е/мл гидролизуется 42 % лактозы, при внесении 5 В/мл - 70 % лактозы подвергается расщеплен»». В то время, хак для достижения £0 56-ного гидролиза при 35° требуется 6 часов выдерживания сыворотки с концентрацией фермента 5 Е/мл. Аналогичная степень гидролиза тем же количеством фермента прн 20° достигается за 24 часа. Причем, при 20 и 35° яроисходиг нарастание кислотности среды за счет жизнедеятельности молочнокислых бактерий, что не наблюдается прн 50°.

Учитывая термическую стойкость грибной £-галактозидазы и«ее субстрата, а также необходимость предупреждения развития посторонней микрофлоры, очевидно,наиболее рационально использовать в-га-лактозидазу с. 1еаечиа11з для гидролиза лактозы в подсырной сыворотке при 50°. При этой температуре, варьируя концентрацию фермента и продолжительность термостатированая, за более короткое время можно достичь заданной степени гидролиза. Па рис.2 приведены кривые гидролиза лактозы в подсырной сыворотке при 50° с внесением различного количества а-галактозидазы. Прн увеличении концентрации фермента до 5-10 Е/мл гидролизуется 63-72 % лактозы за 2

3-196

часа, за 3 часа инкубации снеси достигается более 80 % гидролиза лактозы. Ери внесении в-галактозвдазы 10 Е/ьел ухе за первые час расщепляется 60 % лактозы.

Таким образом, в течение короткого времени (1-3 часа), используя в-галактозидазу с. ¡.паедиаНа, при 50° можно получить более 80 % гидролиза лактозы в додсырной сыворотке с наименьшими изменениями ее качества. На необходимость использования повышенных температур для гидролиза лактозы грибными в-гадактозидаэами в молоке и в молочных продуктах указывал Ротегапа (1964), Сыворотка с гидролизованкой лактозой может быть использована в виде сгуненных или сухих концентратов в качестве белкового наполнителя в хлебобулочных и кондитерских изделиях; для получения белковых гидролиэатов; как ингредиент в продуктах детского и диетического питания.

фермента: 1-Х Е/мл; 2 - 1,5 Е/мл; 3-3 Е/мл; 4 -5 Е/мл; 5-7 Щ/мл; 6-10 Е/мл.

17. Иммобилизация в-галактоэадазы с. 1аавдиаИэ.

Широкие возможности применения в-галактозидазы требуют изыскания путей сокращения расхода фермента на единицу.обрабатываемого ею продукта. Одним из таких путей является иммобилизация, которая, кроме того, удовлетворяет требованиям современной технологии.

Для ковалентной иммобилизации использовали аминосиланизированный аэросил, активированный толуилендиизоцианатом. Готовый активированный носитель получали из Института физической химии АН УССР. В результате получены препараты иммобилизованной в-гадактозидазы с. 1па-едиаИз с активностью 70-80 Б/г носителя. Изучено влияние способа высушивания на иммобилизованную данным методом в-галактозидазу. При ляофилизацни препараты теряли 90 % активности. Практически не уменьшалась активность при высушивании над хлористым кальцием в вакууме или на воздухе. Препараты имиобилизованной в-гадактозидазы были стабильны при хранении в течение двух месяцев без доступа влаги иди в буфере рН 4,2 (активность не изменилась).

Несмотря на удовлетворительную активность и стабильность, использование препаратов иммобилизованной на аминоаэросил-толуилен-дянзоцаанате в-галактозидазы осложнено высокодисперсным характером носителя, создающий определенные трудности при его удалении из реакционной смеси.

Учитывая высокую стабильность в-галактозадаэы с. ^яе^илИз в широком диапазоне значений рН, а также литературные сведения, для иммобилизации в-галактозидазы нами был применен принципиально новый метод адсорбции. Способ включает предварительную модификацию фермента красителем активный аркооранжевым КХ (для введения в моле-

"Я

кулу фермента электро о три дательных хрупа) я последующую сорбцию его в& анионитах. Краситель содержит три сульфогрушш, которые обеспечивают хорошую сорбцию в широком диапазоне рН. Кодифицирование фермента происходит в результате адкилирования атакуемых групп белка (аминогрупп) молекулой красителя, содержащей активные атомы хлора. В данном методе используются доступные реактивы (краситель отечественного производства), метод хорошо воспроизводится, достаточно прост в исполнении, позволяет выбирать носители с различными физическими свойствам* и поэтому перспективен для иммобилизации в теоретическом я практическом плаве.

Длительная обработка фермента данным красителем может привести к снижению активности (Янушаускайте я др., 1974; Виноградова к др., 1975). В связи с зтим возникла необходимость определения оптимальной продолжительности реакции модификатора с испытуемым белком. Активность в-галактоэидазы не менялась при обработке фермента при комнатной температуре от I мня до 4-х суток. Стабильность в-га-лактоэидазы свидетельствует о том, что модифицирование не 'затрагивает существенных для проявления ферментативной активности групп. При проведении модификации фермента красителем реагирует первый атом хлора в молекуле красителя, замещение же второго атома происходит крайне медленно. Оставшийся атом хлора может медленно гидро-лиэоваться в процессе длительной обработки фермента. По данным спектральных измерений было обнаружено, что к ферменту присоединяется две молекулы красителя.

Изозлектрофокусирование модифицированного бедка показало картину аналогичную той, которая получается при разделении нативного препарата в градиенте рН 3-6. Наблюдался линь некоторый сдвиг изо-электрячесвой точки а-галавтоэндазы при присоединении красителя, содержащего сульфогрушш: с pi 4,5 до р! 4,4. Высокий молекулярный вес а-галактоэмдазы (II5000) в содержание большого количества

положительных в отрицательных группировок в ферменте создают высо-. кую буфернуо емкость самого белка и введение вести судьфогрупп красителя яе приводит к суиествевному изменению изозлектрической точки модифицированной лактазы. Важно, что модифицирование ве влияет на фериевтатвввые свойства и термическую стаонльность ь-галая-тозидазы.

Для сорбционноя иимобилизации модифицированной е-галактозида-зы в качестве сорбентов использовали анионитн с полисахаридной основой: ДЭАЭ-сефадевс, ДЭАЭ-целлюлоэу; со сткролдивинилбензольной основой: амберлиты 1ЕА-Э38 в со-400 I, дауэкс 1x2, отечественный авионит АВ 17x12; отечественный а&ионит ва основе полхвввилового спирта АГС-4.

* Несмотря яа незначительное изневевие изоэлектрической точки модифицированной й-галактозмдаэы, препарат модифицированного фермента обладал свойством хорошо сорбироваться на аяионятах. Значительное количество активного белка остается на носителе даже после промывки его растворами с высокой ионной силой (0,5 11 НаС1). Из вше перечисленных носителей лишь при иммобилизации ва ДЭАЭ-сефадевсе удалось подучить высокую активность сорбированной в-галактоэидазы — 68-80 Б/г носителя, а при иммобилизации с высокой исходной удельной активностью - 380-400 Б/г. Высокая сорбирующая способность модифицированного белка связана, по-видимому, со свойством модификатора образовывать не только анионные, но и гидрофобные связи с матрицей* Из других испытанных носителей можно отметить слабоосяоваой анно-вит на основе поливинилового спирта АГС-4, содержащий ДЭАЭ-группы. Сорбция з-галавтозидазы ва этом носителе приводит в получению сравнительно активного препарата фермента. Кроме того, было обнаружено при качественной оценке, что на ДЭАЭ-целлппоэе сорбируется довольно много белка, однако активность его невысока, очевидно, из-за ив-гябирущего действия носителя. Сорбция ва других анйонообменвиках,

имеющих стиролдивинвлбензольную основу, не приводила к получении препаратов с удовлетворительное активностью. В табл.2 приведены активности препаратов в-гахакт о зидазы, иммобилизованной ва различных носителях.

Таблица 2.

Активности препаратов &-гадактозидазы с. 1паечиа1±8, иммобилизованной на различных носителях.

Носитель Активность по п-НФГ , Е/г носителя по лактозе

ДЭАЭ-сефадекс 68 26

ДЭАЭ-сефадекс 340* 183*

ДЭАЭ-целлюлоза 0,8 0,4

Аниовит АГС-4 5,0 2,5

¿мберлит С6-400 X 0,4 0,3

Амберлит 1ВД-938 0,62 0.3

Дауэкс 1x2 0,03 0

Аннонит ¿В 17x12 0,03 0

Аминоаэросилтолуилен-_Д£И301ОДШ£Т________ ___М____ ___3fi.fi______

Иммобилизация высокоочищенной ь-галактозидазы.

Во всех случаях иммобилизовали малавтозидазу с активность» 1000 Е/г. Иммобилизация технического препарата с активность» 270300 Е/г приводит к нестабильным результатам, по-видимому, за счет помех от присутствия большого количества солей и других примесей. Наилучше результаты получены при использовании для иммобилизации высокоочнщеиного фермента с активность» 5600 Е/г (после очистки на ДЗА^Ьцелдюлозе).

- 17 -

У. Свойства иммобилизованной 8-галактозидазы.

Иммобилизация фермента на носителях, несущих ионогенные группы, часто приходит к изменения важных характеристик ферментов* В связи с этим было проведено определение физико-химических и каталитических свойств фермента в условиях наиболее вероятного его применения: в реакторе с перемениванием и в колонке с пропусканием через нее раствора субстрата.

В реакторе с перемешиванием исследовали кинетику гидролиза природного и синтетического субстратов с целью изучения и сравнения каталитических свойств препаратов нативной, модифицированной и иммобилизованной в-галактозидазы. Определены кинетические константы гидролиза лактозы и п-НФГ (табл. 3).

Таблица 3*

Кинетические константы гидролиза лактозы и я-ЙФГ исходным ферментом и препаратами модифицированной и иммобилизованной В-галактозидазы С. 1пае<ща11э.

в-галактозидаза мкм оль/мин*мг мЫ Лактоза

Нативная 0,бб±0,02 4,14+0,19 0,160+0,006

Модифицированная 0,84+р,04 5,56+0,38 0,150+0,008

Иммобилизованная 0,02810,001 4,37+0,19 0,0064+0,0002

п-нитрофенил- &-]>-галактопиранозид

Нативная 1,92+0,03 0,30±0,01 6,4+0,01

Модифицированная 2,40±0,03 0,25+0,01

Иммобилизованная 0,093+0,006 0,53+Р,03 0,175+0,001

Изучение влияния рН раствора на расщепление лактозы иммобилизованной на ДЭАЭ-сефадехсе в-галактоэидазоГ. показало, что

оптимум pH гидролиза лактозы совпадает с оптимумом рН для натдвного фермента и равен <»,0-4,2. По-видимому, «арнд матрицы не влияет на состояние ионвзнруэдихся групп активного центра в-галактоаидазы. В этой связи следует отметить, что иммобилизация в-гадантозидазы с. inaequalie на известных в настоящее время носителях: на сило-хромах (Паппель и др., 1975; Паппель, 1979), на КМ-целлгаозв (Ель-чиц и др., 1975), включение в п оли акриламидны й гель (Кёстнер и др., 1974)» - также не приводила к смещению оптяыума рН.

Важной характеристикой с точки зрения практического применения иммобилизованного фермента является зависимость активности от температуры. Температурную зависимость снимали на термостатируемой колонке, изменяя температуру от 30 до 80°. Температурный оптимум иммобилизованной в-галактоэвдазы равен 55-60°, что соответствует температурному оптимуму нативной В-галактозидазы. Дальнейшее повышение температуры приводит к снижению активности, что, очевидно, связало с денатурацией фермента. Энергия активации (В) гидролиза лактозы яри этом составила 5997 кал/моль (25*1 цДж/моль), что соответствует нативному ферменту.

Устойчивость к тепловой денатурации определяет температурная зависимость, однако в силу условий определения активности иммобилизованного фермента (в колонке) такая зависимость н* может характеризовать термостабильность фермента, так как субстрат и продукты реакции могут защищать фермент от денатурирующего воздействия температуры (Суровцев и др., 1972; Weetall» 1Э73; цаппель и др., 1976). Поэтому необходимо было изучить термостабильность иммобилизованной ¿-галактозидазы в равных условиях с нативноп, без присутствия защитных факторов: субстрата, продуктов реакции.

Зхспериментальяо показано, что модификация оеака красителем не влияет на термическую стабильность. Отмечено некоторое снижение терш>стабильности иммобилизованной на ДЭАЭ-сефадексв в-галактоза-

дазы в пределах температур 60-70°. Подлая инактивация иммобилизованной в-галактозидазы наступает при 75°, как и в случав нативно-го фермента (ряс. 3).

Ряс. 3. Вляяняе на активность (А) 15 мин преинкуСации i 0,1 U фосфатно-онтратноы буфере, рВ 4,2 при различных температурах нативной (I) и иммобилизованной (2) грибной &-гадактозидазы. Остаточную активность определяли при 30°.

Исследована кинетика тепловой денатурации нативной, модифицированной я иммобилизованной на ДЗАЭ-сефадекое в-галактозидазы при температурах от 60 до 70° с интервалом в 2,5°. реакция денатурации фермента следует кинетике первого порядка. Изучение кинетики денатурации позволило рассчитать константы скорости денатурации препаратов при различных температурах. Акгиванионные параметры реакции денатурация находили, исходя из уравнения Аррениуса для зависимости логарифма константы скорости денатурации os обратной величины абсолютной температуры (рис. 4). В таблице 4 сведены актя-

вацнонные параметры денатурации нативаой, модифицированной и иммобилизованной в-галакто зидазы. При рассмотрении данных таблицы видно« что актив анионные параметры модифицированного фермента близки

2,90 2,95 3,00 108д(

Рис. 4. Зависимость Аррениуса для скорости тепловой денатурации наивной (I), модифицированной (2) и иммобилизованной (3) грибной в-галактозидазы.

Таблица 4*

¿ктивационные параметры термической денатурации В-галактозидазы Смг7\а.аг1а 1пае5иа1Ав.

аР4 (60°). ~ - 7"?----

е-галактозидаэа ккал/моль ккал/моль знтр.ед.

Натявная 27,1 121 + 12 282 £ 34

11 о дифицированная 27,2 115 t 3 262 * 7

Иммобилизованная 25,7 73 + 19 142 + 58

к таковым для нативной в-галактозидазы. Однако для иммобилизованной в интервале температур 60-70° величины энтальпии и энтропии активации денатурации существенно уменьшатся по сравнение с вели-

чинами для натизной лавтазы. Такое явление обусловливается тем, что при фиксировании белка на носителе образование связей повышает информационную жесткость молекулы, что и ведет к снижении энтальпии активации* Кроме того, уменьшается число конформеров белка, находящихся в активированном состоянии, по сравнении с числом для активированного состояния нативной в-галактозидазы. Это выражается в меньшей энтропии активации денатурации иммобилизованного фермента по сравнении с натнвным. Уменьшение энтальпии активации денатурации приводит в дестабилизации структуры, а уменьшение энтропии - в стабилизации. Повышение или снижение стабильности фермента при иммобилизации зависит от того, какой из эффектов вносит больший вклад. В случае некоторых ферментов при связывании их с матрицей наблюдалось повышение стабильности, так как энтропийный вклад был велик (Суровцев в др., 1971). В случае а-галактоэидазы, иммобилизованной на ДЭАЭ-сефадексе, при температурах выше 60° наблюдается некоторое снижение стабильности вследствие относительно невысокого энтропийного эффекта в заметного уменьшения энтальпии активации.

Большое практическое значение имеет исследование свойств иммобилизованной в-галактозидазы в условиях максимально приближенных к условиям практического применения фермента, т.е. в условиях непрерывного гидролиза лактозы. К наиболее распространенным типам непрерывного реактора гетерогенного катализа относится колонка. Непрерывный ферментативный процесс на колонке предъявляет ряд требований к исследуемой системе. Одним из таких требований является отсутствие падения активности фермента в результате десорбции, а также в результате сорбции продуктов реакционной сиеси, что может привести к пространственному блокированию катализатора.

Для исследования активности ферментной колонки брали буферные растворы лактозы, подсырную сыворотку и ультрафильтрат обезжиренного молока и подсырвой сыворотки. Растворы определенной концентра-

цив субстрата с помощь» насоса подавали с заданной скорость» на термостатируему»*колонку для подогрева до температуры териостатвро-вания фермента я затек яа колонку с иммобилизованной 6-галаятозида-зой. На выходе из колонки смесь анализировалась на наличие глюкозы я в-гадактозидазы. При непрерывном пропускании раствора лактозы в ОД U фосфатно-цитратиом буфере рН 4,2 через колонку с иммобилизованной fi-галактозидазой в течение 250 часов не было обна- . рухено десорбции модифицированной в-галактозидазы (определяемой по отсутствие гидролиза л-НФГ и поглощения при 490 нм) в выходящей из колонки смеси.

Кинетику гидролиза лактозы на колонке с иммобилизованной 6-га-лактозидазой изучали при 30° с шестью концентрациями лантозы (от 4,7 мК до 142,5 м11) при рН 4,2. Для расчета кинетических констант ферментной колонки воспользовались интегрированным уравнением Ии-хаэлиса-Иентен р = Кшт(1-Р) ♦ С/я« где р- концентация продукта в данный момент, Кш - константа иихаэлиса, F - доля превратившегося субстрата, С - реакционная емкость колонки и Я- скорость потока раствора субстрата. Нерастворимая грибная ft-галактозидаза в условиях колонки обнаружила линейную зависимость между р и1п (I-P), указывая тем самым на то, что кинетику можно описать уравнением Ынхазлиса-Иентен. Полученные зависимости Кщи С от ^приведены на рис.5. Как видно из рисунка, значения Клпрактически не зависят от скорости потока раствора суострата через колонку. Рассчитанные значения для колонки приближается к значениям для "перецениваемого" реактора при максимальных исследуемых скоростях. Реакционная емкость колонки (С) возрастаем с увеличением скорости потока (я) от 3 мл/час до 90 мл/час. Рост реакционной емкости колонки яри увеличении скорости потока раствора субстрата через колонку, по-видимому, свидетельствует о преодолевши диффузионного лимитирования в результате уменьшения толщины диффузионного слоя.

щ

о

а

я

0.«

0,2

0 20 40 60 80 100

4 мл/час

Рис. 5. Влияние скорости потока субстрата (q) на Km (I)» С (2) i иа отнояеяие каталитических констант скорости гидролиза я "проточном" и "перемеииваемом* реакторах (3).

Наибольший практический интерес представляет научение способности непрерывного ферментного реактора осуществлять гидролиз ла»-тозы в слоеных биологических средах (молоке, сыворотке, их ультрафильтратах). Проведение гидролиза лактозы в молоке иммобилизованной s-rалактозида зо Й невыгодно из-за быстрого закупоривания реакторов белком. Периодическое пропускание буферного раствора лактозы я подсырной сыворотки через колонку с иммобилизованной В-га-лактозидаэой показало, что белки сыворотки не оказывают ингябн-рукщего действия на процесс гидролиза. Однако длительное пропускание сыворотки через реактор приводит к постепенному закупоривание колонки. Подобного отрицательного эффекта не наблюдали при пропускании через колонку с иммобилизованной в-галактозидазой Уль~ трафияьтрнтов обезжиренного молока ила подсырной сыворотки. В производственных условиях с развитием удьтрафильтрации молоха и вто-

речного молочного сырья ультрафильтрах накапливается в значительна количествах* Утилизация таких депрохенвизнрованных молочных продуктов представляет собой больвуя проблему* Обработка ультрафильтратов иммобилизованной в-галактозидазой позволит увеличить возможности применения этого сырья.

Важной характеристикой иммобилизованного фермента является про- ' должительность его непрерывной работы, так называемый период сохранения половины активности. Эта величина, определенная по экспоненциальной кривой падения активности с 5 ? раствором лактозы в условиях непрерывной работы колонки при 45°, для иммобилизованной в-галажтовидазы оказалась равной 36 дням, т.е. фермент проявляет каталитическую активность достаточно длительное время, что позволяет считать такую иммобилизацию перспективной.

выводи

1. Исследован гидролиз лактозы в молочное сыворотке новый отечественным препаратом В-г&лахгозидаэы Сигоавп* 1аввдиа11в. установлены оптимальные условия гидролиза лактозы. ваилучяне результаты гйдролиза с наимевыцямк кзмененжями кислотности сыворотки получены яри 50°, за три часа пря концентрации фермента 10 В/ил гидролизуетсн 80 % лактоз», о 5 Б/мл - 70 56. Данные условия гидролига могут быть рекомендованы для получения молочной сыворотки с гид-ролизовавной лактозой, которая может использоваться при выработке белковых концентратов, применяющихся в хлебопечения, кондитерской пргаошленности, при приготовлении детских и диетических продуктов.

2. Грибная в-галазтозидаза иммобилизована принципиально новыми методами. Предварительное модификацией фермента активным яркооранжевым КХ с последупсей адсорбцией на анионитах (ДЭАЭ-еефадексе, ДЭАЭ-целлюлозе, анионитах АГС-4 и АЗ 17x12, дауаксе, амберлнтах). Лучшие результаты получены на ДЭАЗ-сефадексе: 60-60 Е/г носителя при иммобилизации в-галантозидазы с удельной активностью ;> Е/мг

белка и 380-400 Б/г носителя при использовании высокоочйщенно! в-галактозидазы с удельной активность» 25 В/кг белка* Удовлетворительная активность получена также при иммобилизации изоцнанат-ным методом на аминоаэросиле (70-80 Е/г носителя).

3. Исследованы физико-химические, каталитические свойства нативной, модифицированной и иммобилизованной на ДЗДЭ-сефадекее &-га-лактозидааы. модификация и иммобилизация не влияют на свойства фермента: оптимум рН гидролиза лактозы равен 4,0-4,2; температурный оптимум составляет 55-60°, енергяя активации гидролиза лактовы соответствует 5997 кал/моль (25,1 кДж/модь); Кш(каж)

дня гидролиза лактозы равна 4,4*10~^ II и для п-нитрофенил-В-Б-галактопираяозида - 0,53«IO"3 U.

4. Изучена термическая стабильность а термическая денатурация нативной, модифицированной и иммобилизованной на ДЭАЭ-сефадексе s-галактозидазы* В интервале температур от 60 до 70° наблюдается дестабилизирующее действие матрицы (константа скорости термической денатурации при дня нативной В-галактовидазы равна 10,8'Ю-5 сек-1, для иммобилизованного фермента - 35,0'КГ5 сек-1). Полная инактивация нативной и иммобилизованной ¿-галактозидазы наступает при 75° за 15 мин. Кинетика термической денатурации препаратов в-гадактозидазы в интервале температур 60-70° подчиняется уравнении первого порядка.

5* Определены актявационные параметры термической денатурации в-галактозидазы C.inaequalie. Отмечен относительно вевысокий энтропийный эффект и заметное уменьшение энтальпии активации денатурации иммобилизованного фермента, что свидетельствует о информационных изменениях молекулы в-галактозидазы при её фиксировании на матрице.

6* Период сохранения половины активности в оптимальных режимах работы колонки с иммобилизованным ферментом при пропускании 5 го раствора лактозы составил 36 дней.

7. показана возможность использования иммобилизованной на ДЭАЭ-

сефадексе в-галактозидаэы С. inaequalis для гидролиза лактозы

в молочной сыворотке.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Болотова B.C., Тихомирова A.C., Козлов Л.В., Антонов В.К., 1976. кодифицирование и иммобилизация ß-галантоэидаэы. Биохимия, 41, It 9, 1671-1675.

2. Баева B.C., Козлов 1.В., Антонов В.К., Тихомирова A.C., 1977. Ферментативные свойства иммобилизованной ß-галактозидазы из Gurvularia luaequalia. Биохииия, 42, № 4 , 706-711.

3. Баева B.C., Козлов Л.В., Тихомирова A.C., Антонов В.К., 1977. Иммобилизация сорбцией модифицированной грибной fr-гаяактознда-вы на анвовитах и применение ее для гидролиза лактозы сыворотка. Тезисы II Всесоюзного симпозиума по получению и применению иммобилизованных ферментов, 30, г. Абовян.

4. Тихомирова A.C., Баева B.C., 1977. Использование в-галактозидаэы Curvularia inaequails для гидролиза лактозы. Тезисы Республ. семинара по комплексной ирониил. переработке молока, 189, г. Ставрополь.

Летунова Е.В., Загустила U.A., Баева B.C., 1^77. Условия активного биосинтеза внеклеточное грибной й-галактозидазы. Тезисы доклада на 7-ой конф. молодых ученых по проблемам микробиологии и вирусологии, IIO-III, г* Рига.

6. Тихомирова A.C., Баева B.C., 1978. гидролиз лактозы в-галак-тозидазой Cunmlarla inaequalis, Прикл. биохим. И микробиол., 14, Л? 2 , 223- 227.

T-0042S 3.3.80г. тир. ISO as к Л 66 ВНИИ К И