Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск способов стабилизации ферментов с целью повышения эффективности технологических биоорганических катализаторов (на примере дрожжевой бета-галактозидазы)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лайдсаар, Рейне Бадриковна

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Постановка задачи

1.2. Аннотация работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Конформационная стабильность глобулярных ферментов

2.2. Термоинактивация ферментов с четвертичной структурой.

2.3. Методы стабилизации ферментов

2.4. Физико-химические свойства р -галактозидазы

2.5. Применение Р -галактозидазы.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Использованные реактивы и препараты

3.2. Использованная аппаратура

3.3. Методы проведения экспериментов

3.3.1. Определение активности р -галактози-дазы.

3.3.2. Определение термоинактивации р -галак-тозидазы

3.3.3. Микрокалориметрическое определение изменения энтальпии

3.3.4. Иммобилизация р -галактозидазы на органических носителях

3.3.5. Иммобилизация р -галактозидазы включением в полиакриламидный гель

3.3.6. Определение концентрации белка

3.3.7. Математическая обработка экспериментальных данных

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

4.1. Характеристика дрожжевой р -галактозидазы

4.1.1. Изучение зависимости активности дрожжевой р -галактозидазы от температуры и

4.1.2. Зависимость удельной активности р -галактозидазы от концентрации белка при разных температурах

4.1.3. Ингибирование дрожжевой р -галактозидазы галактозой

4.2. Диссоциативная термоинактивация дрожжевой

-галактозидазы.

4.2.1. Изучение термоинактивации дрожжевой р -галактозидазы при различных концентрациях белка.

4.2.2. Влияние Сахаров на термостабильность дрожжевой р -галактозидазы

4.2.3. Влияние модификации дрожжевой у<3-галактозидазы глиоксалем на диссоциативную термоинактивацию

4.2.4. Термоинактивация Р -галактозидазы в присутствии р -меркаптоэтанола

4.3. Разработка методов иммобилизации дрожжевой р-галактозидазы

4.3.1. Разработка методов иммобилизации дрожжевой Р -галактозидазы на органических носителях

4.3.2. Разработка методов иммобилизации дрожжевой уЗ -галактозидазы включением белка в полиакриламидный гель.

4.3.3. Характеристика иммобилизованных препаратов дрожжевой уЗ -галактозидазы

5. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск способов стабилизации ферментов с целью повышения эффективности технологических биоорганических катализаторов (на примере дрожжевой бета-галактозидазы)"

1.1, Постановка задачи

Расширение и углубление научных исследований в области биотехнологии является одной из важнейших задач советской науки. Одним из наиболее перспективных направлений биотехнологии следует считать инженерную энзимологию - технологический катализ с помощью иммобилизованных ферментов. Практическое применение ферментов, однако, до сих пор ограничивается сравнительно низкой стабильностью ферментных препаратов. Поэтому изучение механизмов инактивации ферментов составляет научную основу стабилизации ферментов и является одной из важнейших задач инженерной энзимологии. Особый интерес представляет изучение термостабильности ферментов с четвертичной структурой, так как процессы диссоциации-ассоциации влияют на стабильность изучаемых препаратов и их кинетические свойства в процессе термической инактивации.

Использованию ферментов в пищевой промышленности отводится важное место при реализации решений Продовольственной программы СССР. В связи с задачами, вытекающими из Постановления ЦК КПСС и Совета Министров СССР о мерах по улучшению использования обезжиренного молока, пахты и молочной сыворотки, актуальное значение приобретает изучение фермента -галактозидазы, катализирующей реакцию гидролиза уз -галактозидов, в том числе и молочного сахара - лактозы.

В настоящее время в молочной промышленности поставлена задача резкого увеличения производства обезжиренного молока, пахты и молочной сыворотки. В Советском Союзе промышленность ежегодно получает 32-35 млн. т обезжиренного молока и пахты и 10 млн. т молочной сыворотки. К началу одиннадцатой пятилетки промышленная переработка сыворотки достигла 3,4 млн. т, т.е. перерабатывается только 30-40% ценного молочного сырья.

В текущей пятилетке предусмотрено резко увеличить производство сухой и сгущенной сыворотки, к которым проявляют большой интерес со стороны предприятий пищевой промышленности. Однако сгущенные концентраты из сыворотки имеют специфический недостаток - слишком высокое содержание лактозы. Кристаллизуясь, она выпадает при хранении в осадок, что снижает товарные качества продукта. Не сбраживаясь пекарскими дрожжами, лактоза может только ограниченно вноситься в хлебобулочные и кондитерские изделия и в корма для сельскохозяйственных животных.

Устранить отмеченные недостатки молочных концентратов можно цутем полного или частичного гидролиза лактозы до моносахаридов - глюкозы и галактозы. Это повышает сладость продукта, его стойкость к кристаллизации и улучшает питательные свойства.

Концентраты гидролизованной сыворотки можно с успехом применять в хлебопечении для улучшения качества хлеба и экономии муки и сахара; в кондитерской промышленности; при производстве напитков; в мясной промышленности; в заменителях цельного молока для сельскохозяйственных животных и в производстве кормовых продуктов.

Применение У3 -галактозидазы имеет особое значение для лечения людей с лактозной недостаточностью и при получении продуктов детского и диетического питания с более усваиваемым углеводным составом.

Для гидролиза лактозы на практике используют грибную, бактериальную и дрожжевую УЗ -галактозидазу. С практической точки зрения наиболее изученной является грибная уЗ -галактозидаза, пригодная по своим энзиматическим свойствам для обработки лактозы в сыворотке молока, в частности, в творожной сыворотке. Учитывая значения рН-оптимума фермента для гидролиза лактозы в цельномолочных продуктах и обезжиренном молоке, а также в под-сырной сыворотке, более целесообразно применять р -галактози-дазу дрожжевого происхождения. Однако технологическое применение дрожжевой ув -галактозидазы до сих пор затруднено ее низкой стабильностью.

В связи с вышеуказанным, проблем изучения механизмов инактивации и термоинактивации дрожжевой -галактозидазы следует считать весьма актуальной. Решение этого вопроса имеет большое практическое значение.

Целью настоящей работы явилось исследование кинетики термоинактивации уЗ -галактозидазы из дрожжей Миууеготусяв ^ГЗ^Шв , выяснение механизма и причин инактивации фермента, изучение на этой основе возможностей стабилизации его активной четвертичной структуры и разработка методов получения стабильных препаратов дрожжевой -галактозидазы.

Постановка настоящей работы связана с выполнением целевой комплексной программы 0.74.05, задания 05: "Исследование возможностей целенаправленного изменения каталитических свойств ферментов путем их химической модификации, включая иммобилиза цию их разными методами".

Автор выражает глубокую благодарность проф. О.М.Полтораку и д.х.н. Е.С.Чухрай из Московского государственного университета за ценные советы при теоретическом анализе экспериментальных данных.

1.2. Аннотация

Актуальность. Избирательный гидролиз лактозы в побочных продуктах молочной промышленности с помощью уб -галактозидазы позволяет целесообразно использовать питательные вещества обезжиренного молока и молочной сыворотки и вырабатывать новые виды продуктов детского и диетического питания. Однако до настоящего времени остались недостаточно изученными механизмы инактивации и причины термоинактивации дрожжевой рЬ -галактозидазы, не выяснены возможности иммобилизации этого технологически важного фермента. Поэтому изучение механизма термоинактивации и стабилизации дрожжевой р -галактозидазы относится к актуальным проблемам современной инженерной энзимологии.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось исследование этого процесса и использование полученных данных для поиска путей стабилизации активной четвертичной структуры р »галактозидазы и разработки методов получения стабильных иммобилизованных препаратов дрожжевойув -галактозидазы.

Научная новизна работы. На основании полученных в работе данных установлена двухстадийная кинетическая схема диссоциативной термоинактивации уЗ -галактозидазы в растворе, выяснен механизм ее термоинактивации и определены все кинетические константы этого процесса.

Найдено и охарактеризовано стабилизирующее действие на фермент галактозы, глюкозы и лактозы, а также р -меркаптоэтанола. Показано, что их стабилизирующее действие связано с подавлением первой стадии диссоциативной термоинактивации дрожжевой уЗ -гакинетики термоинактивации р -галактозидазы из дрожжей Yeromyces fragt Iis , выяснение кинетического механизма лактозидазы.

Установлено, что инактивация р -галактозидазы в растворе связана с окислением -5Н -групп, ответственных за формирование активной четвертичной структуры фермента.

Практическое значение работы. Предложен способ иммобилизации дрожжевой ув -галактозидазы на органоминеральных носителях и показана пригодность полученных нерастворимых препаратов для гидролиза лактозы при нейтральных значениях рН, наиболее подходящих для переработки продуктов из цельного молока.

Определены характерные значения кинетических параметров процесса термоинактивации дрожжевой р -галактозидазы по диссоциативному механизму, необходимые при оптимизации технологического процесса с применением биокатализаторов.

Апробация работы. Результаты работы доложены на 1У-ой Республиканской конференции молодых ученых-химиков ЭССР (г. Таллин, 1981); 1У-ом Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (г. Киев, 1983).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 научных статьи и тезисы двух докладов.

Содержание и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (163 ).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лайдсаар, Рейне Бадриковна

ВЫВОДЫ

1. Детально изучена кинетика термоинактивации дрожжевой галактозидазы из к/иууегс/пусев ¡/Ы^/кв в растворе и установлено, что термоинактивация фермента происходит по двух стадийной кинетической схеме диссоциативной термоинактивации.

2. Изменение удельной активности фермента при разбавлении коммерческого препарата связано с ингибирупцим эффектом галактоза на активность дрожжевой уЗ -галактозидазы. Установлено,что ингибирование фермента галактозой является смешанным и вычислены константы равновесия диссоциации галактозы из комплекса со свободным ферментом и для фермент-субстратного комплекса, равные <1 = 1,7.Ю~2 М и к/= 5,6-Ю~2 М, соответственно.

3. Показано, что моносахариды - глюкоза и галактоза, а также дисахариды - лактоза, сахароза и рафиноза стабилизируют активную уЗ -галактозидазу, препятствуя диссоциации комплекса фермент-сахар. Наличие в системе Ъ% раствора лактозы стабилизирует иммобилизованный препарат /3 -галактозидазы.

4. Изучено влияние модификации дрожжевой уЗ -галактозидазы глиоксалем на диссоциативную термоинактивацию и показано, что в растворе глиоксаль не приводит к стабилизации активной четвертичной структуры и способствует дестабилизации субъединиц фермента.

5. Показано, что нестабильность у? -галактозидазы в растворе является результатом окисления ЗН -групп, ответственных за формирование активной (стабильной) четвертичной структуры фермента.

6. Изучены способы ковалентной иммобилизации фермента и включением в ПАА-гель и предложен способ иммобилизации дрожжевой р -галактозидазы на органоминеральном носителе с использованием активного красителя "ярко-голубой КХ",показана пригодность полученных нерастворимых препаратов для гидролиза лактозы при нейтральных значениях рН. л

7. Изучена териоинактивация различных иммобилизованных препаратов уЗ -галактозидазы я показано, что инактивация также протекает по механизму двухстадийной диссоциативной инактивации.При атом не наблюдается изменение константа скорости денатурации.

8. Использование бифункционального реагента - глиоксаля для кодификации иммобилизованной дрожжевой /2 -галактозидазы показало, что обработка глиоксалем не закрепляет активную четвертичную структуру, но повышает стабильность диссоциированных субъединиц.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лайдсаар, Рейне Бадриковна, Таллин

1. Баева B.C. О возможности получения низколактозных молочных продуктов детского питания с использованием ß -галактозида-зы. Вопр. питания, 1981, № 2, с. 63-65.

2. Березин И.В., Клесов A.A. Практический курс химической и ферментативной кинетики. M., 1976. - 320 с.

3. Березин Й.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М., Высшая школа, 1977. - 279 с.

4. Брандтс Дж.Ф. Конформационные переходы белков в воде и в смешанных водных растворителях. В кн.: Структура и стабильность биологических макромолекул /Под ред. М.В.Волькен-штейна. M., 1973, с. 174-254.

5. Василисина В.В., Чеботарева Н.Г., Василисин C.B. Ферментативный гидролиз лактозы молочной сыворотки. Нов. в техн. и технол. перераб. молоч. сыворотки. Углич: 1981, с. 50-54.

6. Виллако К.П., Кууск И.Э., Тамм А.О. Молоко и молочный сахар.- Ээсти лоодус, 1977, № 9, с. 558-562.

7. Грачев Ю.П. Математические методы планирования экспериментов. M., 1979, с. 92-99.

8. Дикчювене A.A., Песлякас И.И., Дагене М.И., Паулгоконис А.Б. Определение количества белка, иммобилизованного на нерастворимом носителе. В кн.: Методы в биохимии. Вильнюс, 1975, с. 13-17.

9. Дженкс В. Катализ в химии и энзимологии. М., Мир, 1972,- 467 с.

10. Жоли М. Физическая химия денатурации белков. М., Мир, 1968, - 363 с.ш

11. Загустина H.A., Тихомирова A.C. Очистка и свойства /3 -га-лактозидазы из гриба Curvulsria ihseCjua/ie . Биохимия, 1976, т. 41, вып. 6, с. I061-1965.

12. Загустина H.A., Тихомирова A.C., Рафаловская Т.Я., Янголь Л.М., Грачева А.Ю., Фениксова Р.В. Получение и свойства препарата уЗ -галактозидазы из Alt&rnsr/ä fenU/s . Прикл. биохим. и микробиол., 1975, т. II, № 5, с. 724-729.

13. Золотова B.C., Тихомирова A.C., Козлов Л.В., Антонов В.К. Модифицирование и иммобилизация уЗ -галактозидазы. Биохимия, 1976, т. 41, вып. 9, с. I07I-I676.

14. Иммобилизованные ферменты. I /Под ред. И.В.Березина, В.К. Антонова, К.Мартинека. М., Изд. Моск. ун-та, 1976, с. 202-224.

15. Кестнер А.И., Сиймер Э.Х., Таммеранд И.И. Математическая модель макрокинетики иммобилизованных ферментов для глубокой конверсии субстрата. Труды Таллинского политехи, ин-та, 1983, № 552, с. 3-16.

16. Кестнер А.И., Креэн М.И. Способ получения иммобилизованных в структуре полимеризационных гелей ферментов. Заявл. 13.09.73, опубл. 25.09.74 БИ. № 35, м.кл. clZd , 13/10. СССР A.C. $ 443902.

17. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М., 1979, с. 81.

18. Куликова А.К., Тихомирова A.C., Фениксова Р.В. Очистка и свойства ß -галактозидазы SsccharornifCcs fragt Ifs. -Прикл. биохим. и микробиол., т. 1972, т. 37, № 4, с. 405.

19. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. М.: Наука, 1978, - 248 с.

20. Кутузова Г.Д. Влияние химической модификации функциональных групп ферментов на их структуру и стабильность (на примереиз 1&пероксидазы из хрена). Автореферат, МГУ, 1981. - 17 с.

21. Кутузова Г.Д., Угарова Н.Н., Березин И.В. Взаимосвязь между структурой и стабильностью белков и ферментов из мезофиль-ных и термофильных источников. Биоорг. хим., 1982, т. 8, № II, с. 1445-1461.

22. Кушнер В.П. Конформационная изменчивость и денатурация биополимеров. Л.: Наука, 1977. - 274 с.

23. Мандель М.О., Сиймер Э.Х., Кярема К.А., Кестнер А.И. Торможение ферментативного гидролиза бензилпенициллина в условиях применения иммобилизованной пенициллинамидазы. Труды Таллинского политехи, ин-та, 1974, № 367, с. 9-15.

24. Мартинек К., Можаев В.В., Березин И.В. Основные принципы стабилизации ферментов. Докл. АН СССР, 1978, т. 239, с. 483-485.

25. Мартинек К., Торчилин В.П. Основные принципы стабилизации ферментов. В кн.: Итоги науки и техники. Биологическая химия /В.Л.Кретович, И.В.Березин. М., 1978, т. 12, с. 17-48.

26. Менерт А.А. Кинетика односубстратных ферментативных реакций. Сообщение УЛ. Использование автоматического анализатора "Контифло" для исследования кинетики ферментативного гидролиза лактозы. Труды Таллинского политехи, ин-та, 1984, в печати.

27. Методы химии углеводов. Под ред. Н.К.Кочеткова, М.: Мир, 1967. - 174 с.

28. Можаев В.В., Мартинек К. Инактивация и реактивация белков (ферментов). -Мол. биол., 1982, т. 16, №4, с. 676-694.

29. Молочная промышленность СССР. Мол. пром., 1982, № 6, с. 4-16.

30. Мецлер Д. Биохимия. I. М.: Мир, 1980, с. 173.1^4м

31. Налимов В.В., Чернова И.А. Статистические методы планирования экстремальных экспериментов. М.: Наука, 1965. 145 с.

32. Нестеренко П.Г., Василисина В.В., Чеботарев Е.А. Использование молочной сыворотки в хлебопекарном и кондитерском производстве. Молоч. пром., 1982, № 5, с. 25-27.

33. Паппель К.Э., Кестнер А.И., Фениксова Р.В., Тихомирова А.С. Получение иммобилизованной уЗ -галактозидазы. Труды Таллинского политехи, ин-та, 1974, № 367, с. 35-40.

34. Полторак О.М., Чухрай Е.С. Кинетика и механизм инактивации ферментов с четвертичной структурой. Вестн. Моск. унта, сер. 2, Химия, 1979, т. 20, № 3, с. 195-211.

35. Позин М.Е., Батунер Л.М. Математические методы в химической технике. Л.: Химия, 1971, с. 609-659.

36. Производство сухой подсырной сыворотки. М.: ЦНИИ Инф. и тех. эконом, исс., 1975. - 40 с.

37. Рид Дж. Ферменты в пищевой промышленности. М.: Пищевая промышленность, 1971. - 410 с.

38. Самсонов Т.В. Полимерные комплексы, включающие синтетические полиэлектролиты и физиологически активные компоненты. Высокомолекулярные соединения, 1979, т. (А)ХХ1, № 4,с. 723-733.

39. Сиймер Э.Х., Мандель М.0. 0 рН-зависимости ферментативных реакций. Труды Таллинского политехи, ин-та, 1975, № 383, с. 3-7.

40. Степанов Б.И. Введение в химию и технологию органических красителей. М.: Химия, 1977, с. 190-194.

41. Тихомирова А.С., Куликова А.К., Фениксова Р.В. 0 лабильности растворов уЗ -галактозидазы ЗэссИагртусез ^г<эд///'$>• -Прикл. биохим. и микробиол., 1971, т. 7, № 2, с. 155-159.1.i.

42. Тихомирова A.C., Куликова A.K., Фениксова P.B. Образование уЗ -галактозидазы в культурах грибов и бактерий. Микробиология, 1974, т. 43, № 2, с. 257-260.

43. Тихомирова A.C., Загустина H.A. Получение препаратов уЗ -галактозидазы из Curvular/'a /nae^ualis . Прикл. биохим. и микробиол., 1976, т. 12, № 2, с. 221-226.

44. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии. I. М.: Мир, 1981, с. 166-206.

45. Угарова H.H., Рожкова Г.Д., Березин И.В. Химическая модификация 6 NHi -групп лизина в пероксидазе хрена. Влияние ее на каталитические свойства и пространственную структуру фермента. - Биохимия, 1978, т. 43, вып. 7, с. 1242-1250.

46. Фениксова Р.В., Тихомирова A.C., Куликова А,К., Эльпинер И.Е., Тоголев М.Н. Получение препаратов уЗ -галактозидазы из дрожжей S . fragil¡5 . Прикл. биохим. и микробиол., 1971, т. 7, № I, с. 34.

47. Хиппель П., Шлейх Т. Влияние нейтральных солей на структуру и конформационную стабильность макромолекул в растворе. В кн.: Структура и стабильность биологических макромолекул / Под ред. М.В.Волькенштейна. М., 1973, с. 320-480.

48. Храмцов А.Г., Василисина В.В., Чеботарева Н.Г., Фисенко Л.П. Теоретическое обоснование гидролиза лактозы молочной сыворотки. Ставроп. политехи, ин-т, Ставрополь, 1961•- 6 с.

49. Церетели А.К., Куликова А.К., Шиян С.Д., Тихомирова A.C. Очистка внутриклеточной уЗ -галактозидазы Saccharomyces fragil¡5, Прикл. биохим. и микробиол., 1980, т. ХУ1, вып. 6, с. 902-908.

50. Чухрай Е.С. Критерии диссоциативного механизма термоинактивации ферментов с четвертичной структурой. Вестн. Моск. ун-та. Серия 2, Химия, 1981, т. 22, № 4, с. 331-340.

51. Чухрай Е.С., Кирсис В.Х. Трехстадийная диссоциативная термоинактивация кислой фосфатазы из Asfi. i^rrcus в растворе. Вестн. Моск. ун-та. Серия 2, Химия, 1980, т. 21, № 5, с. 432-437.

52. Anfinsen C.B., Pfaber E. Studies on the reduction and reformation of protein disulfide bounds. J.Biol.Chem., 1961, vol.236, p.1361.

53. Anfinsen C.B., Scheraga H.A. Experimental and theoretical aspects of Protein folding. Adv. Chem., 1975, vol.29, pp. 205-300.

54. Applications of yeast lactases a Review. - Novo Industry A/S - Novo Alle - DK - 2880 Bagsvaerd, Denmark, 1979, -29 p.

55. Arakawa M., Ogata S.fi -galactosidases from jack bean meal and almond emulsin. Application for the enzymatic distinction of Galfi\—M GlcNAc and Gal/51-*-3GlcNAc linkages.

56. J. Biochem., 1974, vol.75, Nr.4, pp.707-714.

57. Bavet J.A., Dohan L.A. Corning glass works. Pat. (France), Nr. 2483728, 6.06.80, Nr. 801216, 11.12.81., № A 23 c 2t/02, c 12 P 19/02.

58. Bartley I.M. fi -galactosidase activity in ripening apples. -Phytocdemistry, 1974, vol.13, Nr.10, pp.2107-2111. k

59. Bernal J.D. Structure arrangements of maoromolecules. -Faraday Soc., 1958, vol.25, p.7.

60. Borglum G.B., Sternberg M.Z. Properties of a fungal lactase. J. Food Sci., 1972, vol.37, Nr.4, p.619.

61. Boury F.A.H. Applications for lactase treated whey. Food Prod. Develop., 1975, vol.9, Nr.2, pp.10-14.

62. Brandts J.F. Heat effects on protein and enzymes. In: Ther-mobiology/ A.H.Rose, London-New York etc.: Acad. Press, 1967, p.25-72.

63. Chotia C. Hydrophobic bonding and accessible surface area in proteins. nature, 1974, vol.248, p.338.

64. Chotia C., Janin J. Principles of protein-protein recognition. Nature, 1975, vol.256, p.705.

65. Chotia C., Wodak S., Janin J. Role of subunit interfaces in the allosteric mechanism of hemoglobin. Proc. Hat. Acad. Sci. USA, 1976, vol.73, p.3793.

66. Craven 6.R., Steers E., Anfinsen C.B. Purification, composition and molecular weight of the p -galactosidase of E. coli K 12. J. Biol. Chem., 1965, vol.240, Nr.6, pp.24682477.

67. Coughlin R.V., Charles M., Julkowski K. Experimental results from a pilot plant for converting acid whey to potentially useful food products. Food, Phaxmaoential and Bioeng.

68. A1 Che Symp. Ser., 1976/77, vol.74, Nr. 172, pp.40-46.

69. Dairy by-product converted to human food ingradient by new process. Confect. prod., 1982, vol.48, Nr.2, pp.58-59, 67.

70. Dicker R. Whey hydrolysis a "sweet" breakthrough. Dairy Ind. Int., 1982, vol.47, Nr.4, pp.19-21.

71. Dickson R.C., Dickson L.R., Markin J.S. Purification and properties of an inducible^-galactosidase isolated from the yeast Kluyveromyces lactis. J. of Bacteriology, 1979, vol.137, Nr.1, pp.51-61.

72. Feeney R.E. Chemical modification of food proteins. Ins Food Proteins. Improvement through chemical and enzymatic modification / R.E.Feeney, J.R.Whitaker, Washington, 1977, p.3-36.

73. Fenton D.M. Solvent treatment fory?- c£) -galactosidase release from yeast cells. Enzyme and Microbiol. Technol., 1982, vol.4, Nr.4, pp.229-232.

74. Fink A.L., Angelides E.J. The j3 -galactosidase-catalysed hydrolysis of o-nitrophenol-yS-c^-galactoside at subzero temperatures: evidence for a galactosylenzyme intermediate. Biochem. Res. Communs., 1975, vol.64, Nr.2, pp.701-708.

75. Finocchiaro T., Olson N.F., Ricardson T. Use of immobilized lactase in milk systems. Adv. Biochem. Eng., 1980, vol.15, pp.71-88.

76. Fisher H.F. A limiting law relating the size and shape of protein molecule to their composition. Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1964, vol.51, Nr.6, pp.1285-1291.

77. Frezal J., Ogier H. Les intolerences aux sucres. Med. et nutr., 1981, vol.17, Nr.3, pp.189-191.

78. Frigon R.P., Lee J.C. The stabilization of calf-brain microtubule protein by sucrose. Arch. Biochem. Biophys., 1972, vol.153, pp.587-589.

79. Griffiths U.W., Muir D.D. Hydrolysis of lactose by a thermostable ß -galactosidase immobilised on DEAE-cellulose. -J. Sei. Pood and Agr., 1980, vol.31, Nr.4, pp.394-404.

80. Groen G. Van der, Wouters-Leysen J., Yde M., De Bryne O.K. Effects of alcohols onß -galactosidase catalyzed hydrolysis of n-alkyl-^-^Q-galactopyranosides. Eur. J. Biochem., 1973, vol.38, Nr.1, pp.122-129.

81. Guy E.J. Stabilization of frozen goat milk concentrates by enzymatic lactose hydrolysis. J.Food Sei., 1982, vol.47, Nr.2, pp.423-428.

82. Gunther E., Burger E. A new method of manufacturing lactose-hydrolysed yoghurt by means of JZ -galactosidase. Util. enzymes technol. alim. Symp. int. Versailles, 1982, Paris, pp. 243-248.

83. Hayn M., Heikonen M«, Kreula U. Heiko M. Optimization of an immobilizedß -galactosidase system. Food Process Eng. Proc. 2nd Int. Congr. Eng. and Food and 8th Eur. Food Symp., Helsinki, 1979, vol.2, London 1980, pp.133-136.

84. Hartmeier W. Immobilisierte Enzyme fur die Lebensmitteltechnologie. Int. Z. fur Lebensm. Technol., 1977, vol.77, Nr.9.

85. Hartley J.C., Vedamuthu E.R. ß -galactosidase of Propionibacterium shermanii. Appl. Microbiol., 1975, vol.29, Nr.1, pp.74-80.

86. Hill J.A., ШЬег R.E. The mechanism of Na activation of E.coliß -galactosidase and the inhibitory effect of high con2+centrations of Mg T on this activation. Int. J. Biochem., 1974, vol.5, Nr.9-10, pp.773-779.

87. Hirschmann R., Nutt R.F., Veber D.F., Vitali R.A., Varga S.L., Jacob T.A., Holly F.W., Denkewalter R.G. Studies on the total synthesis of an enzyme. V. The preparation of enzymati-cally active material. J.Amer.Chem.Soc., 1969, vol.91,p.507.

88. Huber R.E., Fowler A.V. Zabin I. Inactivation of ß -galac-tosidase by iodination of tyrosine-253. Biochemistry, 1982, vol.21, pp.5052-5055.

89. Huber R.E., Gaunt M.T. The inhibition of ß -galactosidase (Escherichia coli) by amino sugars and amino alcohols. -Can.J.Biochem., 1982, vol.60, pp.608-612.

90. Huber R.E., Kurz G., Wallenfols K. A quantitation of the factors which äffest the hydrolase and transgalactosylase C activities of ß -galactosidase (E. coli) on lactose. -Biochemistry, 1976, vol.15, Nr.9, pp.1994-2001.

91. Holsinger V.H., Robert N.E. Hew products from lactose hydro-lysed milk. Dairy and Ice Cream Field, 1976,'vol.159, Nr. 3, p.30.

92. Huang C.Y., Rhee S.G., Chock P.B. Annu. Rev. Biochem., 1982, vol.51, pp.935-971.

93. Immobilized enzymes. Ed. by Mosbach K. New-York, London: Acad. Press, 1976, 996 p.

94. Janin J. Chotia C. Stability and specifity of proteinprotein interactions: The case of the trypsin-trypsin inhibitor complexes. J.Mol.Biol., 1976, vol.100, p.197.

95. Jornwell H., Fowler R. Probe of ß -galactosidase structure with iodoacetate. Biochemistry, 1978, vol.17, Nr.24, p. 5160.

96. Kaheshi.ro C.M., Enns C.A., Hahn M.G., Peterson J.S., Reithel F.J. Evidence for active dimer of E.coli ß -ga-lactosidase. Biochem. J., 1975, vol.151, Nr.2, pp.433434.

97. Käsemolke wird zu süssem Sirup. Lebensmitteltechnik, 1982, vol.14, Hr.6, pp.266-268.

98. Kauzmann W. Some factors in the interpretation of protein denaturation. Adv. Prot. Chem., 1959» vol.14, p.1.

99. Kim D.H., Hahn Y., Hong S.K. Inactivation kinetics of ß~ JO -galactosidase. Hanguk Saenghwa Hakhoe Chi., 1982, vol.15, Nr.1, pp.26-41.

100. Klostermeyer H., Herlitz E., Jürgens R.H., Reimerdes E.H., Thomasow J. Lactasebehandlung von Magermilch zur Herstellung lactosereduzierten Magermilchpulvers. Kieler Milöh-wirtschaftliche Forschungsberichte, 1978, vol.30, Nr.3, pp.334.

101. Klotz I.M., Darnall D.W., Langerman N.R. Quaternary structure of proteins. In: The Proteins (H.Neurath, Ed.), 3rd., vol.1, New-York: Acad. Press, 1975, pp.293-411.

102. Kuby S.A., Lardy H.A. Purification and kinetics otß -£>-galactosidase from E.coli, strain K-12. J.Amer. Chem. Soc., 1953, vol.75, pp.890-896.

103. Lactose hydrolysates. MKT Tehtoaat OY, Finland, Firmas New-letter, 1981, may.

104. Lee J.C., Timasheff S.N. The stabilization of proteins by sucrose. J. Biol. Chem., 1981, vol.256, Nr.14, pp. 7193-7201.

105. Levitt M., Warshel A. Computer simulation of protein folding. Nature, 1975, vol.253, Nr.5494, pp.694-698.

106. Loo L.G.W. van der. De bereiding van instant vol melkpoe-der. Voedingsmiddelen technologie7 1976, vol.9, Nr.22, pp. 14-17.

107. Mahoney R.R. Whitaker J.R. Purification and physicocherai-cal properties of J& -galactosidase from Kluyveromyces fra-gilis. J.Food Sci., 1978, vol.43, pp.584-591.

108. Means G.E., Feeney R.E. Chemical Modification of Proteins. -San Francisco: Holden-Day, 1971, -254 p.

109. Miyata N., Kikuchi T;, Furuichi E. Lactose hydrolysis in milk and whey with lactic acid bacteria cells immobilized in agar gel. XX Inter. Dairy Congress, 1978, E, pp.957958.

110. Monod J., Wymann J., Changeux J.-P. On the nature of allosteric transitions: A plausible model. J. Mol. Biol., 1965, vol.12, p.88.

111. Montreuil J. Les voies métaboliques du lactose et du galactose. Méd. et nutr. 1981, vol.17, Nr.3, pp.163-166.

112. Morisi F., Pastore M., Viglia A. Reduction of lactose content of milk by entrapped-galactosidase. I Characteristics of JS -galactosidase from yeast and E.coli. J.Dairy Sci., 1973, vol.56, Nr.9, pp.1223-1127.

113. Naudts M. L'hydrolyse du lactose. Lait et nous, 1982, Nr.3, pp.25-28.

114. Nourinen E. Hydrolysoideen laktoosin Kayttomahdollisuuksista elintarviketeollisuudessa. Karjantuote, 1975, vol.58,1. Nr.4, pp.12-15.

115. Norden A.G.W., O'Brien J.S. Gangloside GM, fè -galactosidase: studies in human liver and brain. Arch. Biochem. and Biophys., 1973, vol.159, Nr.1, pp.383-392.13 u

116. Okos M.R., Grubke E.A., Syverson A. Hydrolysis lactose in acid whey using yS-galactosidase adsorbered to a phenol formaldehyde resin. J. Pood Sci., 1978, vol.43, Nr.2, pp.566571.

117. Ooshima H., Harano Y. Kinetics and Properties of Immobilized Lactose on Sepharose 2B. Mem. Pac. Eng. Osaka City Univ., 1976, vol.17, pp.131-138.

118. Pace C.N. Picher L.M., Cupo J.P. Globular protein stability: aspects of interest in protein turnover. Acta biol. et med.germ., 1981, vol.40, Nr.10-11, pp.1385-1392.

119. Pastore M. Produzione industriale di Latti Delattosati Mediante j3 -galaktosidasi Immobilizata in Pibse. II latte r Riv. techn. ind. lattiero-casenaria, 1977, vol.2, No. 7-8, pp.456-460.

120. Pauling L., Corey R.B., Branson H.R. The Structure of proteins: Two hydrogen-bounded helical configurations of the polipeptide chain. Proc. Acad. Sci. USA, 1951, vol.37, p.205.

121. Perutz M.P. Stereochemistry of cooperative effects of haemoglobin. Nature, 1970, vol.228, p.726.

122. Pollard H.B., Steers E. Jr. Bacillus megaterium, KM J3 -ga-lactosidase: purification by affinity chromatography and characterization of the active species. Arch. Biochem. and Biophys., 1973, vol.158, Nr.2, pp.650-661.

123. Pomeranz V. Lactase (^5-<^7-galactosidase). II. Possibilities in the food industries. Pood Technol., 1964, Nr.5, pp. 96-103.

124. Ponnuswaray P.K., Muthusamy R., Manavalan P. Aminoacid composition and thermal stability of proteins. Int. J. Biol.

125. Macromol., 1982, vol.4, pp.186-190.

126. Premi L., Sandine W.E., Elliker P.R. Lactosahydrolyzing enzymes of Lactobacillus species. Appl. Microbiol., 1972, vol.24, Nr.1, p.51.

127. Reimerdes E.H., Gottschick W. Neue Verwendung smoglich-keiten fur Milch, Molke und Permeate durch Milchzuker-spaltung (Teil I). Lebensmitteltechnik, 1981, vol.13, No. 9, pp.402-403, 406.

128. Rheinlander M. Lactosehydrolysatie van wei en de berei-ding van gehydrolyseerd weipoeder. Voedingsmiddelen-technologie, 1982, vol.15, Nr.12, pp.27-31.

129. Richmond M.L., Gray J.I., Stine C.M.y^-galactosidase. -J.Dairy Sci., 1981, vol.64, pp.1759-1771.

130. Rippa M., Signorini M., Bellini T. The effect of inorganic phosphate on the stability of some enzymes. Bio-chem. J., 1981, vol.197, pp.747-749.

131. Roseanu A., Vasu S. Activitatea lactazica si maltazicaa unoz tulpini de Aspergillus. Stud, si cerc. biochim., 1980, vol.23, Nr.1, pp.69-73.

132. Rossmann M.G. Liljas A., Branden C.-I., Banaszak L.J. Evolutionary and structural relationships among dehydrogenases. The Enzymes, 1975, vol.11, p.61.

133. Sadana A. A deactivation protection model for immobilized and soluble enzymes. Enzyme Microbiol. Technol., 1982, vol.4, Jan., pp.44-46.

134. Sato M., Yamashina I. Purification of a J3 -galactosidase from hog smal intestine and its action on glucoproteins and glucopeptides. J.Biochem., 1974, vol.76, Nr.6, pp. 1155-1163.13 e

135. Sewell A., Gehler G., Spranger C. Urinary Oligosaccharide Screening in Patients with J$ -galactosidase Deficiency. Bur. J. of Pediatrics, 1980, vol.133, Nr.3, p.269.

136. Shukla T.P. yg-galactosidase technology: a solution to the lactose problem. CRC. Crit. Rev. Food Tech-nol., 1975, vol.5, p.325.

137. Skinner K.J. Enzymes technology. Chem. Engn. News, 1975, vol.53, Nr.33, pp.22-37.

138. Stasiw R.O., Patel A.B., Brown H.D. Utilization of bound lactase in clinical chemistry. Biotechn. Bioeng., 1972, vol.14, Nr.4, pp.629-635.

139. Stephens R., De Busk A.G.ß -galactosidases from Neu-rospora crassa. Methods Enzymol., 1975, vol.42, pp. 497-503.

140. Steven F.S., Podrazky V., Al-Habib A., Griffin M.M. Biphasic kinetics of metal ion reactivation of trypsin-thiol complexes. Biochim. Biophy. Acta, 1979, vol. 571, pp.369-373.

141. Sugiura M., Suzuki M., Sasaki M., Shimomura T. Studies on yS -galactosidases. I. Purification and properties of j3 -galactosidase I and II from Sclerotium tulipa-rum. Chem. and Pharm. Bull., 1976, vol.24, Nr.4,pp.788-793.

142. Tanaka Y., Kagamiishi A., Kiuchi A., Hoiiuchi T. Purification and properties of Jb -galactosidase from Aspergillus oryzae. J. Biochem., 1975, vol.77, Nr.1, pp.241-247.

143. Thomas G.V., Kalra M.S., Singh A. Immobilization and Characterization of Kluyveromyces fragilis fi -galactosidase. -Indian J. of Exp. Biol., 1980, vol.18, pp.1020-1023.

144. Tomino S., Meisler M. Biochemical and immunological studies of purified mouse j5 -galactosidase. J. Biol. Chem., 1975, vol.250, Nr.19» pp.7752-7759.

145. Tumerman L., Fram H., Comely K.W. The effect of lactose crystallization on protein stability in frozen concentrated milk. J.Dairy Sci., 1954, vol.37, pp.830-839.

146. Udeira H., Udeira H. The effect of sugars on the thermal denaturation of lysosyme. Bull. Chem. Soc. Jap., 1980, vol. 53, Nr.9, pp.2451-2455.

147. Vandamme K., Delbeke R. L'hydrolyse du lactose et la fabrication de lait chocolate. Lait, 1981, vol.61, Nr.605-606, pp.282-293.

148. Wallenfels K., Malhotra 0.P.J3-galactosidase. Enzymes, 1960, vol.4, pp.409-429.

149. Wallenfels K., Weil R. j3 -galactosidase. Enzymes, 1972, vol.7, pp.618-661.

150. Wetlaufer D.B., Ristaw S. Aquisition of three-dimensional structure of proteins. Annu. Rev. Biochem., 1973, vol. 42, p.135.

151. Wiederschain G.Y., Prokepenkov A.A. J3 -c^-galactosidase and -«^-fucosidase of pig kidney. Arch. Biochem. Bio-phys., 1973, vol.158, Nr.2, pp.539-543.

152. Yu-Bin Ghiao, Moffitt K., Smallwood Y., Glew R.H* Glycon-amides as Inhibitors of Human J3 -galactosidases and J3 -Galactosidases. Arch, of Biochem. and Biophys., 1979, vol.192, Nr.1, pp.1-9.