Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка генетических методов создания штаммов молочнокислых стрептококков с повышенной бета-галактозидазной активностью

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка генетических методов создания штаммов молочнокислых стрептококков с повышенной бета-галактозидазной активностью"

министерство медицинской промышленности ссср.

всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных никроорганизнов.

__^^яаг^ГЛ-»^____________________________________________________

На правах рукописи

молотов сергеи владимирович.

разработка генетических методов создания штаннов молочнокислых стрептококков с повышенной^-галактозидазнои активностью.

03.00.15 - генетика.

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий Всесоюзного научно - исследовательского института генетики и селекции промышленных никроорганизнов Министерства медицинской промышленности СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В. В. Суходолец.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор А. А. Прозоров; кандидат биологических наук В. А. Лившиц.

Ведущая организация - КаФедра генетики биологического Факультета ИГУ им. Н, в. Ломоносова.

Зашита диссертации состоится "¿2Г" 1991 г.

в /¿'"'час. на заседании специализированного совета Д. 0&&/2. 01 при ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке "ВНИИгене тика"

Автореферат разослан "20* А/сг/Р 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета к. б. н.

В. И. Щербакова.

. гл! ВВЕДЕНИЕ.

■го^Мстгальпость тем« диссертации. Молочнокислые бактерии широко >■ йЭД®цзуются в молочной промышленности в качестве заквасок при производстве сыра, творога, йогурта и многих других молочных продуктов. Однако, применяемые в настоящее время природные штаммы этих микроорганизмов не обеспечивают полного сбраживания лактозы молока, и огромные ресурсы углеводов в виде молочной сыворотки остаются неиспользованными. По данным Международной молочной Федерации из более чен 80 млн. т. сыворотки, получаемой. в нире, почти 50 '/■ процентов выливается в канализацию. Решение проблемы использования остаточной лактозы молочной сыворотки может быть достигнуто на основе различных подходоп, в частности путем создания штаммов молочнокислых бактерий с повышенной активностью Фермента /-галактозидазы, расшепляшего лактозу молока до более сладких и растворимых, а так же более усвояемых для человека и животных моносахаридов - глюкозы и галактозы.

В настоящее время имеются многочисленные данные о продуцентах /3-галактозидазы, созданных на основе различны; микроорганизмов, но в то же время, возможности молочнокислых стрептококкоков в этой области в настоящее время почти не изучены.

Настоящая работа посвяшепа разработке генетических нетодов получения штаммов молочнокислых стрептококков с повышенной ?-галактозидазной активностью. Большинство нолочнокислых стрептококков осуществляют гидролиз лактозы с использованием другого Фермента - ФосФо-yg -галактозидазы, для которого требуется ФосФорилированный субстрат. Однако, известно, что молочнокислые бактерии вида S. therroophilus используют для гидролиза лактозы именно ji-галактозидазу. Кроме того, некоторые штаммы мезоФильных молочнокислых стрептококков способны синтезировать Фермент _/3-галактозидазу. Это обстоятельство и определило выбор объекта исследования: в данной работе использованы бактерии Streptococcus thermophilus и L. lactls subsp. lactis.

Целью настоящей работы явилось исследование возможности получения штаммов молочнокислых бактерий с повышенной актив-ностью^-галактозидазн на основе различных ,в том числе и генно-инженерных подходов При выполнении работы были поставлены и решались следующие экспериментальные задачи:*

- осуществить отбор природных штаммов нолочнокислых стрепто-

/ - аза

- г -

кокков ( S. thermophilic, L.lactis), обладающих повышенной активностью /-галактозидазы.

- установить локализацию и провести клонирование генов ß-ra-лактозидазы различных производственных штаммов молочнокислых стрептококков.

- изучить особенности синтеза Фермента^- галактозидазы клетками Streptococcus thermophilus.

- исследовать возможность получения штаммов молочнокислых стрептококков с повышенной ß-галактоз ида з но й активностью с использованием методов генетики и генной инженерии.

Перечисленные задачи решены в данной работе, и полученные результаты представляют интерес как в отношении научной новизны, так и практического использования в молочной промышленности.

Научная новизна.

Осуществлено клонирование хромосомных генов jS-галактозидазы трех ранее не исследованных производственных штаммов Streptococcus thermophilus. Установлено, что все три гена имеют одинаковую структуру, отличную от клонированного ранее ШакКэй. 1988) гена jg-галактозидазы Streptococcus thermophilus.

Обнаружено, что в процессе роста штамма Str. thermophilus бкб при поддержании постоянных значениях pH в культуральной жидкости накапливается внеклеточный Фермент jS-галактозидаза. На основе штамма 6кб впервые получен нутантный штамм Str. thermophilus CHI351, обладающий способностью накапливать внеклеточную^-галактозидазу в культуральной жидкости значительно быстрее, чем родительский штамм.

Осуществлено клонирование геновдгалактозидазы, имеющих плаз нидную локализацию, ранее не исследованных производственных штаммов L. lactis subsp. lactis 111 и 144, с использованием клонированных генов получены штаммы L. 1 actis с повышенной^-галак-тозидазной активностью.

Практическая значимость работы. Полученные штаммы L.lactis subsp. lactis с повышенной активностью>-галактозидаз могут быть испытаны в качестве компонентов заквасок для произ водства различных молочных продуктов. В то же время клонирован генов ^-галактозидазы различных молочнокислых стрептококков является важным этапом для последующей работы по конструированию продуцентов Дгалактозидазы.

Использование штамма Str. thermophilus СМ1351 в составе заква-:ок для творога позволит получать сыворотку, обогащенную (родуктами гидролиза лактозы.

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введе-гая, обзора литературы, экспериментальной части, включающей »писание материалов и методов, а тагане изложение экспериментальных результатов, обсуждения результатов и выводов. Работа одержит 127 страниц машинописного текста, включает 17 рисунков, ' таблиц. Список литературы включает 129 наименований, в том шсле 119 - зарубежных авторов.

Апробация диссертации. Результаты работы докладывались на всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы генетических зроцессов" (г. Москва, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Актуальные №облемы переработки молока" (г. Вологда. 1989), конференции 'Интенсификация производства и повышение качества сыра" [г.Барнаул 1989), на семинаре отдела молекулярной генетики ЗНИИгенетика, 1991 г.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Бактериальные штаммы. В работе были использованы следующие атаммы молочнокислых стрептококков: S. thermophilus 6кб, 19t, >2, 24г, 38м, 3KC, 21/1, 20t, 7/2, 15/2, IM, 27м, 6t, 17t, 1Г, 'г, 18м, Р22, 14/2, 35м, 7м, П , L. ] act is subsp. lactis 111, .?4, 43, 11, 5AK, 8/4, 25, 37, 71, 129, 90, 57, 203,a, 17, 456 , 513, KPl, 167/2, 37, 543 , A, 251, 1, OMK3, 41, 722, 71, 243, 19, 728, 24AK, 98 , K2, 57, 78, 144, полученные из коллекции ЗНИИКМИ. Штамм Е. coli Т61 ( К12, й (lac-pro), supE , thi.strA, lacy, (F /traD36, proAB, laclf,z M15) и В. siibti lis M (прототроФ) получены из коллекции ВНИИгелетика.

Плазмиды. Для клонирования генов^,-галактозидазы в работе 5ыли использованы плазмиды: PBR322 из коллекции ВНИИгенетика и РСВ20, полученная от А. В. Сорокина ( ВНИИгенетитка).

Среды. Для выращивания молочнокислых стрептококков использовали среду М21 (Румер и Лившц., 1990). Для вырашивания клеток ?.. coli и В. subtil is использовали среду LB (Миллер., 1976), в качестве минимальной среды для Е. coli - среду Адамса. При трансформации клеток В. subtil is были использованы среды "пицайзен I и Спицайзен II (Spizizen., 1968)

Определение активностидгалактозидазы. Активность^-галак-гозидазы клеток Е, coli определяли в ед/кл (Миллер., 1976). Для

клеток молочнокислых стрептококков удельную _/$-галактозидазную активность определяли в ед/мг белка. За единицу активности при нимали такое количество Фермента, которое необходимо для расщепления 1 нйоля ОНФГ за 1 минуту при 37 С. Белок определяли по стандартной методике (Лоури. . 1951).

выделение плазмидной ДНК. Плазмидные ДНК выделяли щелочным методом (Бирнбойм и Доли., 1979). Для лизиса клеток L.lactis и В. subtills был использован лизоцим в концентрациях 10 мг/мл и 2 мг/мл, соответственно. Время обработки лизоцимом при 37 С для I,. lactis -30 минут, для Bacillus subtilis - 10 минут. При определение размеров плазмид в качестве маркеров были использованы плазмиды Col IB (93 т. п. н. ), R6K (38 т. п. н. ) и PBR322 (4. 3 т. п. н. ), полученные из коллекции ВНИИгенетика.

Выделение хромосомной ДНК s. thermophjlus проводили как описано в работе (Харман и др., 1986)

Электрофорез ДНК проводили в горизонтальном 0. 7 - 1.0 х агарозном геле, буфер трис-ацетатный pH 7. 9.

Рестрикция. Растепление ДНК рестриктазани проводили как описано (Маниатис и др. ,1984). Рестриквдгонные эндонуклеазы были получены из лаборатории прикладной энзимологии ВНИИгенетика и использованы в условиях рекомендованных изготовителем.

Лигирование проводили как описано (Маниатис и др., 1984). Использовали ДНК лигазу Фага Т4, полученную из лаборатории прикладной энзимологии ВНИИгенетнка. Лигирование проводили при 12 С в течение 4 часов.

Трансформацию клеток Е. сои проводили как описано (Ледер-берг и др. ,1974)

Трансформацию клеток В. subtilis проводили как описано (SPlzizen., 1968)

Трансформацию клеток L. lactis проводили как описано (Ру-мер и ЛиФшиц., 1990)

Получение Lac - вариантов L. lactis subsp. lactis описано в разделе "Натериалы и нетоды" диссертации.

Мутагенез. Мутагенную обработку клеток S. thermophilus проводили как описано (Tensón at al.,1982)

Исследование динамики накопленияуЗ-галактозидазы в культу-ральной жидкости при культивировании S. thermophilus 6кб в условиях Ферментера при постоянных значениях pH проводили на ферментерах "Марубиши" (1 литр). Среда - Н21 с 5 лактозы или

глюкозы, температура - 37 с, время Ферненташш - 48 часов. Постоянные значения pH поддерживались за счет автоматической подтитровки 10 '/. раствором НаОН. В отобранных пробах определяли активность/-галактозидазы в клеточной суспензии и в бесклеточной культуральной жидкости, полученной после осаждения клеток центрифугировниек в течение 15 кинут при 4000 об/мин на центрифуге К24. В том и другом случае активностьjj-галактозида-зы расчитывали на содержание белка клеточной суспензии.

Селекция мутантов, выделяющих /-галактозидазу в культу-ральную жидкость. Обработанные нитрозогуанидином клетки S. thermophilus бкб высевали на чашки с агаризованной средой Н21 с 1 У- лактозы для получения отдельных колоний. Отдельные клоны вносили в 5 мл жидкой среды Н21 с 1 z лактозы и выращивали при 37 С. Через 24 часа культивирования в полученных культурах определяли активность Дгалактозидазы в бесклеточной культуральной жидкости. Нутанты отбирали по уровню^-галактози-дазной активности в бесклеточной культуральной жидкости.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Изучение особенностей синтеза Фернента jj-галактозидазы клеткани S. thermophilus.

С целью выбора условий для максимального сиетеза^-галакто-зидазы клетками S. thermophilus было изучено влияние некоторых Физиологических Факторов на процесс синтеза этого Фермента. На примере штаммов бкб и 14/2 было показано, что максимальное значение активности ^-галактозидазы соответствует середине логарифмической фазы роста ( 31000 и 24000 ед/мг белка у штаммов бкб и 14/2, соответственно). При переходе культуры в стационарную Фазу роста ,й-галактозидазная активность снижается в 3-4 раза по сравнению с максимальным значением. Фактором , обуславливающим переход клеток в стационарную Фазу, является накопление молочной кислоты и связанное с этим закисление среды. При нейтрализации молочной кислоты щелочью рост культуры продолжается.

На примере трех штаммов S. thermophilus (бкб, 19t, П) было изучено влияние различных Сахаров, используемых в качестве источника углерода, на синтезД-галактозидазы. Установлено, что клетки указанных штанмов синтезируют наибольшее количество jj-галактозидазы на среде с лактозой. При использовании в качестве

Z-U5Z

источника углерода таких Сахаров как глюкоза, галактоза, сахароза и Фруктоза активность фермента составляет 40-50Х от таковой в условиях роста на среде с лактозой.

о

Время (час)

Рис. 1. Изменение оптической плотности при 660 нм (• ), обшей jj-галактозидазной активности клеточной суспензии (* ) и ß -галактозидазной активности бесклеточной культуральной жидкости (+ ) в процессе роста клеток Streptococcus thermophilus бкб в Ферментере на среде Н21 с лактозой при pH 8. о.

При исследовании ^-галактозидазной активности клеток штамма бкб при росте на среде с лактозой и глюкозой в качестве единственного источника углерода в культуральной жидкости после удаления клеток центрифугированием был обнаружен внеклеточный Фермент jj-галактозидаза. Причем, если при росте клеток на среде с лактозой через 24 часа в культуральной жидкости обнаруживается не более 2 А-галактозидазы клеточной суспензии, то в

случае роста на среде с глюкозой этот Фермент накапливается в культурэльной жидкости значительно быстрее. Так через 24 часа культивирования на среде с глюкозой более 20 у. jj-галактозидазы клеточной суспензии.находится в бесклеточной культурэльной жидкости, Появление внеклеточной ^-галактозидазы в культурэльной жидкости можно обьснить либо лизисом части клеток бактериальной популяции, либо его экскрецией из клеток в культуральную жидкость.

С целью выбора оптимальных условий для накопления внеклеточной ^-галактозидазы в культурэльной жидкости мы исследовали динанику накопления этого фермента при длительном культивировании штамма S. thermophilus бкб на среде с лактозой, а также с глюкозой при постоянных значениях рН. Клетей выращивали в Ферментере на среде с лактозой при поддержании постоянных значений рН б. О, 7, о, 8.0. Было установлено, что через 48 часов культивирования клеток при РН 6, 0 в бесклеточной культуральной жидкости находится только 10 у. jî-галактозидазы клеточной суспензии (7000 ед/мг белка). В том случае, когда культура растет при рН 7. о через 48 часов в культурэльной жидкости находится 30 У- Фермента (20000 ед/мг белка). Наибольшее количество î-галактозидазы выделяется в культуральную жидкость в том случае, если рН среды 8.0. Так через 21 час культивирования клеток в этих условиях активность jj-галактозидазы в культуральной жидкости составляет приблизительно 90 '/■ от обшей активности клеточной суспензии, что соответствует 53000 ед/мг белка (см. рис.1), таким образом, РН среды является Фактором, определяющим накопление jî-галактозидззы в культуральной жидкости.

При культивировании штзнма бкб на среде с глюкозой при рН 8. О выход 90 У- всей Дталактозидазы в среду отмечен уже через 15 часов культивирования. Однако, максимальное значение зктивности Фермента на среде с глюкозой более чем в 2 раза ниже, ïem на среде с лактозой, (см. рис Z. ). Нужно отмотать, что при росте клеток на среде с глюкозой, как и на среде с лактозой, три рН 8. ОДгалактозидаза появляется в культуральной жидкости те в логарифмической Фазе роста. При этом не происходит сниже-шя оптической плотности клеточной суспензии, что неизбежно юлжно происходить при лизисе клеток. Можно предположить, что тетки S. thermophilus бкб в определенных условиях способны жскретировать Фермент jj-галактозидазу в культуральную жидкость.

30 40

Время (час.)

Рис, г. Изменение оптической плотности при 660 нм ( • ), обшей ß-галактозидазной активности клеточной суспензии (Jfc-) и активности _/3-галактозидазы бесклеточной культуральной жидкости (+) в процессе роста клеток Streptococcus thermophilus 6кб в Ферментере на среде Н21 с глюкозой при PH 8. 0.

На следующем этапе работы на основе штамма S. thermophilus 6кб был получен мутантный штамм ,при росте которого накопление _р-галактозидазы в культуральной жидкости происходило значительно быстрее, чем у родительского штамма дикого типа. Нутагенез и селекцию мутантов проводили как описано в разделе "Материалы и методы". При отборе мутантов было исследовано 950 клонов. Об-

наружено 5 мутантных вариантов, у которых ^-галактозидазная активность в бесклеточной культуральной жидкости составляла от 1500 до 2000 ед/кг белка, в то время как для клеток дикого штамма бкб, которые использовались в качестве контроля, активность Фермента в культуральной жидкости составляла менее 150 ед/мг белка. Среди 5 вариантов был обнаружен только 1, у которого после рассева все из 20 проверенных клонов сохранили способность синтезировать внеклеточную ^-галактозидазу на уровне 1800 - 2000 ед/мг белка. Этот вариант был использован для дальнейшей работы. Для него было принято обозначение

S. thermophilus CHI 351. g

Й -1

§ 60h ..............-........ • -•--

aj . ч-

и _______

S 60--------------'-----------------------. --

СП / /

| —............. /------ / .............

К -у /

S / / § 30........./ ...../••• — --

^ L / /

s 20..... / -/- -----------------------

§ / /■ 3 ю- / х

I ^ -г-""^

-ь; q_I--г_i__I__1_I_1_I_

О 3 6 0 12 15 18 21 24 30

Время (час)

Рис. з. Изменение^-галактозидазной активности бесклеточной культуральной жидкости при росте клеток Streptococcus thermophilus 6кб ( • ) и Streptococcus thermophilus СН1351 (+) на среде Н21 с лактозой при pH 8.0. В последующих экспериментах была изучена динамика накопления внеклеточной _0-галактозидазы в культуральной жидкости в процессе длительного культивирования штамма CHI 351 при постоянном значении pH. В качестве контроля был использован штамм бкб. Как видно из рис. 3 При росте штамма CHI 351 на среде с лактозой Ь'/ИЗЦ

-

V"

/

/+ /

/ /

_|_1_и

при pH 8.0 уже через 12 часов активность^-галактозидазы в кул туральной жидкости составляет 53000 ед/нг белка, что соотве ствует 90 у. всей активности jj-галактозидазы клеточно суспензии. Для того, что бы активность jfj-галактозидазы в куль туральной жидкости составила 53000 ед/мг белка ( 90 активности клеточной суспензии ) при росте штамма б кб в тех же условиях, потребовался 21 час. Таким образом главным достоинством полученного штамма CHI 351 является спо собность выделять jg-галактозидазу в культуральную жидкость. ] поскольку этот штамм создан на основе промышленного штамм; бкб, то использование его в составе заквасок для творога поз волит получать сыворотку, обогащенную продуктами гидролиз; лактозы.

II. Клонирование генов ^/З-галактозидазы нолочнокислых стрептококков.

II.I. Клонирование генов _^-галактозидазы промышленных штаммов S. thermophilus.

С целью отбора штаммов S. thermophilus с повышенной ß-raaa-ктозидазной активностью нами исследовано 24 производственных штамма стрептококков этого вида. В нашей коллекции были обнаружены такие высокоактивные штаммы как бкб, П и 7/2, у которш JJ-галактозидазная активность составляет 28000-31000 ед/нг белка, что в 2-3 раза превышает средний уровень, характерный дл* штаммов этого вида (12000-15000 ед/нг белка). Для клонирования геновjj-галактозидазы были использованы 3 штамма S. thermophilus выделенные из независимых природных источников и различающихся по активности ^-галактозидазы : бкб (30750 ед/мг белка), Я (28284 ед/мг белка) и 19t (11490 ед/нг белка). Перечисленные штаммы S. thermophilus не имеют плазмид.

Для клонирования генов jS-галактозидазы были использованы препараты хромосонннх ДНК. На первом этапе работы был клонирован ген jj-галактозидазы штамма бкб. Клонирование, проводили с использованием рестриктазы Pstl клетках Е. coli TGi (Lac-) на векторе PBR322, несушен гены устойчивости к анпициллину и тетрациклину. Уникальный сайт Pstl, использованный для клонирования на плазмиде PBR322 расположен в пределах гена устойчивости к ампициллину. Векторную и хромосомную ДНК, расщепленную рестриктазой Pstl лигировали, и лигазной смесью трансФорнирова.

летки Е. coli. Отбор клонов, содержащих рекокбинантные плазмиды генон ß-галактозидазы проводили по наличию синей окраски на реде LB. содержашей X-gal и тетрациклин. Среди 2000 трансФор-антов было обнаружено 5 клонов с ярко голубой окраской. Все 5

с г*

лонов имели Фенотип Ар , Тс . в результате рестриктазного нализа плазмид, выделенных из клонов с 1,ас+ Фенотипом было становлено, что дашшё плазниды являются производными PBR322

содержат вставку сегмента ДНК с геном ^-галактозидазы разме-ом б т. п. н. очевидно, в пределах этой вставки ДНК и локализо-ан гену$-галактозидазы, который и определяет Lact фенотип кле-ок. Одна из выделенных плазмид была использована в дальнейшей аботе и обозначена PSH1. Для плазмиды PSM1 была построена естриктазная карта (см. рис. 4).

Л

'ис. 4. Рестриктазные карты плазмид pSHl и pRHl1б - производных PBR322, содержащих PstI-Фрагменты ДНК Streptococcus thermophilus (штаммы бкб и 19258, соответственно) с генами jj-галактозидазы.

Для изучения экспрессии гена jj-галактозидазы в клетках 'ранположительных микроорганизмов Pstl-Фрагнент ДНК с геном

ji-галактозидазы был клонирован по Fstl сайту на бирепликонны? вектор рсв20, способный реплицироваться в клетках Е. coli » грамположительных никроорганизнов. плазнида РСВ20 определяет устойчивость клеток Е. coli к аниициллину и устойчивость гран-положительных никроорганизнов к эритромицину. PstI -Фрагмента ДНК плазмиды pSHI лигировали с ДНК' плазмиды рсвго, растепленной рестриктазой Pstl, и лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli. Отбор клонов, содержащих рекомбинантные плазмиды проводили по наличию синей окраски на среде, содержа-шей анпициллин и x-gal. При помощи рестриктазного анализа было установлено, что плазмиды, выделенные из голубых клонов являются производныни pcb20 и по Pstl сайту содержат вставку ДНК длиной б т. п. н. Полученная на основе рсв20 рекомбинантная нлазмида с геном jj-галактозидазы в составе фрагмента ДНК размером б т. п. н. была обозначена как рМШ

С целью укорочения сегмента ДНК, несущего ген^З-галактозида-зы, ДНК плазмиды pSMl мы обрабатывали рестриктазой Sau3A в условиях неполного гидролиза. Полученные Sau3A-Фрагменты были лигированы с ДНК плазмиды PCB20, обработанной рестриктазой BamHl, лигазной смесью трансформировали клетки Е.coli. На чашках с агаризованной средой, содержащей ампициллин и X-gal, было получено И клонов трансформзнтов, имеющих голубую окраску. Анализ плазмидных ДНК, выделенных из полученных клонов, позволил установить, все они являются производнымти PCB20 и содержат вставки ДНК по сайту BamHI. Однако 5 из полученных реком-бинантных плазнид содержат вставку больше б т. п. н. Такие плазмиды далее не изучались. Плазмиды, выделенные из б оставшихся клонов, содержали вставки сегментов ДНК длиной менее б т. п. н. Эти плазмиды получили обозначение от pHDll до pHDlö. Размеры вставок ДНК, с геном ^-галактозидазы определенные методом рестриктазного анализа (с использованием рестриктазы PvuII) приведены в таблице 1. Как видно из представленной таблицы 1, минимальный Фрагмент ДНК, несущий ген jS-галактозидазы имеет размер 1.2 т. п. н. По результатам рестриктазного анализа плазми ды PMD15 , была построена рестриктазная карта минимального клонированного ЗаиЗА-Фрагмента с геном JJ-галактозидазы и установлена локализация этого Фрагмента ■ в пределах Pstl-фрагмента ДНК плазмиды pHDI. рестриктазные карты плазмид плазм1 PHD1 и PMD15 приведены на рисунке 5.

Таблица l.

Зависимость экспрессии гена jj-галактозидазы Streptococcus thermophilus в клетках Е. coli от размера клонированного сегмента ДНК.

N Плазмида Длина вставки ДНК с Активность/3-галактозидазы

геном jg-гал. (т. п. н. (ед/кл. )

1 PSM1 6. 0 345

2 PHD1 б. 0 328

3 рШМ 1 5. 1 300

4 PMD12 5. 6 318

5 PMD13 3. 9 '11

7 PMDH 1. 5 '10

8 рмш 5 1. 2 35

9 PHD16 5. 7 30

На следующем этапе работы была определенау}-галактозидазная активность клонов, содержащих различные реконбинантные плазми-ды. Результаты определения активности ш:,.;?еденн в таблице I. Как следует из чре-.пставлепнои ™лбливд t укорочение сегмента ДНК, "^сущего ген^-галактозидазы приводит к снижению активности Фермента в 7-8 раз. Только у клонов с плазмидами PMD11 и PMD12, имеющими вставки длиной 5.1 и 5. б т. п. к. активность /-галактозидазн практически не отличалась от клонов, несущих плазмиду pffl)i. Снижение активности можно объяснить, предположив, что считывание генаДгалактозидазы S. thermophilus может осушествлятся с двух промоторов. Один из них (слабый) расположен в непосредственной близости от структурного гена, другой сильный на значительном расстоянии от него; деления сильного промотора , происходящая при укорочении клонированного Фрагмента ДНК, приводит к снижению экспрессии гена.

Для изучения экспресии гена^-галактозидазы в клетках грам-положительннх микроорганизмов плазмида рШ)! посредством трансФормации была передана в клетки В. subt.Iiis. Селекцию трансФормантов проводили на агаризованной среде LB, содержащей эритромицин и X-gal. Среди 200 устойчивых к эритромицину клонов не было обнаружено ни одного окрашенного в голубой цвет, хотя

плазмиды, выделенные из нескольких клонов транс Формантов Еш*1, были идентичны по своей струтуре рШ)1. Очевидно, ген ^-галакто-зидазы Б. №егтор)Шиз не способен зкспрессироваться в клетках В. зиМШэ.

Рис. 5. рестриктазные карты плазмид PHD1 и PHD15 - производных РСВ20, содержащих Pstl и Sau3A - Фрагменты ДНК Streptococcus thermophilus бкб с геном ^-галактозидазы.

С целью исследования структуры генов ^-галактозидазы различных штаммов S. thermophilus , в настоящей работе кроме штамма 6кб для клонирования генов _£-галактозидазы были также использованы штаммы п и 19t. Было установлено, что гены jJ-галакто-зидазы штаммов п и 19t, также как и штамма 6кб, локализованы в пределах Pstl-фрагмента ДНК длиной 6 т. п. н. При последующей рестриктазном анализе было показано, что сегменты ДНК с генами JJ-галактозидазы трех различных штаммов S. thermophilus идентичны по расположению сайтов узнавания рестриктаз PvuII, EcoRI и SPhI Таким образом, в настоящей работе было показано, что гены jS-галактозидазы штаммов бкб, П и 19t инеют сходную структуру. Вместе с тем по данным рестриктазного анализа гены, клонированные в данной работе не имеют сходства с генами Jl-галактозидазы исследованными в работах других авторов ( Herman at al., 1986,

Hermanatal., 1987, Schroeder at al., 1990) (см. рис. 4). Различия структуры фрагментов фрагментов ДНК, содержащих гены jS-ra-лактозидазы различных штаммов s. thermophilus, объясняется тем, что у разных штанмов эти гены ногут иметь различное происхождение. В клетки S. thermophilus они, вероятно, попали в результате генетического взаимодействия с микроорганизмами, относящимися к различным видам.

II. 2. Получение штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis с повышенной активностью ji-галактозидазы.

Одним из способов конструирования штаммов молочнокислых стрептококков с повышенной^-галактозидазной активностью является клонирование структурных генов ^-галактозидазы на соответствующих векторах и последующее введение рекомбинантных плазнид с генами в клетки молочнокислых стрептококков. В качестве исходного натериала в настоящей работе были использованы природные штаммы Lactococcus lactis subsp. lactis, обладающих повышенной jS-галактозидазной активностью, по сравнению с другини штамнани данного вида, с целью отбора высокоактивных штаммов было исследовано 38 производственных штаммов L. lactis. Среди них было обнаружено только 13 штаммов, синтезирующих Фермент ^-галактозидазу. Исследованные штанмы сушественнно различались нежду собой по уровню _/3-галактозидазной активности ( от 200 до 12000 ед/нг белка). В дальнейшей работе были использованы штаммы, обладающие наибольшей активностью Фермента - 111 ( 11946 ед/нг белка) и 144 (7400 ед/нг белка).

Для клонирования генов jS-галактозидазы штаммов 111 и 144 необходимо было установить, где локализованы гены: на плазмиде или на хроносоне. При изучении плазмидных профилей было установлено, что пгганн 111 содержит 2 плазмиды 38 и 50 т. п. н., а штанм 144 - 3 плазмиды 35,40 и 50 т. п. н.

Используя нетод тенпературной элиминации плазнид нами были получены Lac- варианты для штанна 111. У клеток с Lac- Феноти-пон отсутствовала плазнида разнером 38 т. п. н. Это позволило предположить, что данная плазмида содержит ген ^З-галактозидазн штамма 111. Для штамма 144 Lac- варианты получить не удалось, тен не ненее для клонирования генов jj-галактозидазы штампов 144 и 111 были использованы препараты плазнидных ДНК, выделенные из клеток этих штанмов.

В экспериментах по клонированию плазмидные ДНК штаммов 111 и 144 расщепляли рестриктазой Bglll и лигировали с вектором PBR322, обработанным рестриктазой BamHI. Лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli TGI. Отбор клонов с рекомбинантными плазмидами проводили по наличию синей окраски на среде LB. содержащей ампициллин и X-gal. При трансформации клеток Е. coli лигазной смесью с Фрагментами плазнчдной ДНК штамма 111 на селективной среде было обнаружено более 500 клонов трансформантов ар", среди них три имели голубую окраску. В случае использования лигазной смеси с фрагментами ДНК штамм 144 среди 680 трансФормантов Арг6ыло обнаружено 5 клонов с голубой окраской. В том и другом случае клетки голубых клонов имели Фенотип Арг, Tcs, так как при встраивании BglIi-фрагмента ДНК по сайту BamHI на плазмиде PBR322 инактивируется ген устойчивости к тетрациклину.

Из клеток голубых клонов были выделены плазмидные ДНК. Расщепление плазмид, полученных в опыте с днк штамма ill рестрик-тазами PvuII и EcoRI позволило установить, что плазниды, выделенные из трех голубых клонов имеют одинаковую структуру , являются производными PBR322 и по сайту BamHI содержат вставку сегмента ДНК размером 4. 8 т. п. н. Очевидно, в пределах сегмента ДНК размером 4. 8 т. п. н. локализован ген jß-галактозидазы L. lactis subsp. lad is 111. Одна из выделенных плазмид была обозначена PSH2 и использована в дальнейшей работе. При исследовании рекомбинантных плазмид, полученных в опыте с ДНК штамма 144 было установлено, что эти плазмиды превышают по размеру PBR322 на 2. 8 т. п. н. По данным рестриктазного анализа плазмиды, выделенные из 5 голубых клонов имели одинаковую структуру: все они содержали вставку ДНК размером 2. 8 т. п. н., встроенную по сайту BamHI. В пределах этой вставки, очевидно, и локализован генДгалактозидазч штамма L. lactis subsp. lactis 144. Одна из выделенных плазмид была обозначена PSM3 и использована в дальнейшей работе.

С целью изучения экспресии генов jj-галактозидазы штаммов 111 и 144 в клетках молочнокислых стрептококков фрагменты ДНК с генами ß-галактозидазы этих штаммов были клонированы с плазмид PSH1 и PSH2 на бирепликонный вектор PCB20. Отбор клонов с рекомбинантными плазмидами, производными PCB20 с генами jj-галактозидазы штаммов 111 и 144 проводили в 2 этапа.

На первом этапе ДНК плазнид PSH2 и PSH3 обрабатывали рестрик-тазой SauЗА в условиях неполного гидролиза. Полученные при этом фрагменты лигировали с ДНК плазниды PCB20, предварительно обработанной рестриктазой ВашН1. Лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli TGI. Селекцию трансФормантов проводили на на агаризованной среде LB. содержащей ампициллин и X-gal. Из клонов трансФормантов Арг, имеющих голубую окраску, выделяли плазмидную ДНК, определяли размеры рекомбинантных плазмид и отбирали те, которые превышали по размеру РСВ20. Из 55 исследованных плазмид с геном^-галактозидазы штанна 111 было отобрано 18 рекомбинантных плазмид, размер которых превышал размер PCB20. Среди 25 исследованных плазнид с геномjfc-галактозидазы штамма 144 было обнаружено И рекомбинантных плазмид, превосходящих по разнеру РСВ20.

С целью отбора плазмид, способных реплицироваться в гран-положительных микроорганизмах на втором этапе отбора плазмиды, содержащие гены jg-галактозидазы штамнов 111 и 144 и превышающие по размеру PCB20 были использованы для трансформации клеток В. subtilis. селекцию трансФормантов проводили на агаре LB, содержащем эритромицин и X-gal. В ходе зкспоринентов были обна-pyжt¿iíг 4 плазмиды с геном jj-галактозидазн штамма 144 ( эти плазмиды были обозначены рнтш - phd34) и 8 плазмид с геном jj-галактозидазы штамма 111 (их обозначили pmd21 - pH1)28), способах реплицироваться в клетках В. subtilis и определять Фенотип Em1* трансФормантов. Следует отметить, что клоны В. subtilis, содержащие рекомбинантные плазмиды с генами jj-галактозидазы штаммов 111 и 144, на среде с X-gal не имеют голубой окраски. Очевидно, гены _$-галактозидазы штаммов 111 и 144 не способны зкспрессироваться в клетках в. subtilis.

Обработка рекомбинантных плазнид серии PHD2 рестриктазой Pvull позволила ' установить, что анализируемые плазмиды действительно являются производными PCB20 и содержат вставки ДНК различной длины по сайту BamHI. Разнеры вставочных сегментов ДНК у полученных реконбинантных плазнид и значения ß-галактозидазной активности клеток Е. coli, содержащих эти плазмиды приведены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2 генjî-галактозидазы штамма 111 на плазмидах серии phd расположен в пределах вставочных сегментов ДНК различной длины. Причем присутствие всех рекомбинантных

плазмид, кроне pi№21 и pffi)27, в клетках Е. coli приводит к сниже-нию^-галактозидазной активности. Очевидно, при лигировапии имело место включение в состав плазмиды рСВЗО двух или большего количества БаиЗА-Фрагментов ДНК, имеющих различную локализни» в исходном Bg111-Фрагменте размером 4.8 т. п.н. Для дальнейшей работы была использована плазмида PMD21, содержащая минимальную вставку ДНК - 1.2 т.п.н. При этон£-галактозидазная активность клеток Е. coli. содержащих плазниду PHD21, была наибольшей.

Таблида 2.

Экспрессия гена jS-галактозидазы Lactococcus lactis subsp. lactis 111 в клетках Е. coli в составе рекомбинантных плазмид - производных PBR322 и PCB20.

к Плазмиды Длина вставки ДНК с геном^-галактозидазы (т. п. н. ) Активность jj-галактозидазы ед/кл

1 PSH3 4. 8 260

2 PHD1 1. 2 260

3 PHD11 б. 3 75

4 PHD12 4.8 99

С РЙ1ИЗ 3.7 75

б PHD14 ' 8. 2 80

7 PHD15 2. 5 82

8 PUD 16 3. 9 ,258

9 PMD178 7. 0 91

Обработка ДНК рекомбинантных плазнид серии pHD рестриктазой Pvull позволила установить, что анализируемые плазниды являются производными РСВ20 и содержат вставки ДНК различной длины. Размеры вставочных сегментов ДНК у полученных рекомбинантных плазмид и значения активности jj-галактозидазы клеток Е. coli, содержащих эти плазмиды приведены в таблице 3

HrndlW fVuii

>ис. 6. Рестриктазные карты плазнид PSM2 и PMD21, содержащие Фрагменты ДНК с геном jj-галактозидазы Lactococcus lactis subsp. lactis l И,

Таблица 3

Экспрессия гена _/?-галактозидазн Lactococcus lactis :ubsp. lactis 144 в клетках Е. coli в составе рекомбинантннх ¡лазмид - производных PBR322 и рСВ20.

н Плазмиды Длина вставки ДНК с геном _/?-галактозидазы (т. п. н.) Активность ^-галактозидазы ед/кл

PSH3 2. 8 200

phd31 5. 8 19

PHD32 О. б 32

PWD33 б. 8 31

PMD34 1. 3 198

Как видно из таблицы 3, размер наименьшего клонированного фрагмента ДНК с геном^-галактозидазы штамма 144 составляет 1.3 т. п. г. При этом/-галактозидазная активность клеток Е. соП, содержащих плазмиду рШ)34 с наименьшей вставкой ДНК, была наибольшей. Плазнида рШ)34 была использована для дальнейшей работы.

Рис. 7. Рестриктазные карты плазнид PSH3 и PHD34, содержащих фрагменты ДНК с геном ^-галактозидазы Lactococcus lactis subsp. lactis 144.

С целью изучения структуры клонированных фрагментов с генами jS-галактозидазы L. lactis subsp. lactis 111 и 144 был проведен рестриктазный анализ плазмид PSH2, PHD21, PSH3 и PHD34. ДНК указанных плазмид обрабатывали рестриктазами Pstl, PvuII, Hindlll, EcoRl, BamHI, Kpnl, SPhI и Bglll, а также различными сочетаниями рестриктаз. Были построены рестриктазные карты данных плазнид (см рис. 6,7),

Исследуя phd21 с минимальным размером вставки , нам удалось установить локализацию гена jj-галактозидазы в пределах

eg ill -Фрагмента ДНК размером 4.8 т. п. н. на плазмиде PSH2. На рисунке 6 показано расположение клонированных фрагментов ДНК с генами _Дталзктозидазн гатлмна ill на плазмидах PSH2 и PHD21.

Рсстриктазные карты плазмид PSM3 и pHD34 показаны на рисунке 7. В результате рестриктазного анализа PHD34 было установлено, что данная плазмида является делеционной производной РСВ20 со вставкой ЗаиЗА-фрагмента ДНК, встроенной по сайту BamHI. Размер клонированного Фрагмента гена jj-галактозидазы составил 1.3 т. п. н. Как видно из рисунка 7 этот Фрагмент является непрерывным и представляет из себя часть клонированного ранее Bgl II-Фрагмента ДНК размером 2.8 т. п. н. На плазмиде PHD34 обнаружена деления сегмента ДНК, расположенного между детерминантом устойчивости к ампициллину и локусон orfA на плазмиде рСВ20, размер делении 1 т. п. н. Деления не затрагивает детерминантов устойчивое^ к ампициллину и эритромицину, а также области существенные для репликации плазмиды в клетках Е. col 1 ив. subtil is.

Для получения штаммов Lactococcus lactls subsp. lactis с повышенной ¿-галактозидазной активностью клетки штаммов 111 и 144 трансформировали плазмидами PHD21 и PHD34. Получение сФеро-пластов клеток L. lactis, регенерацию сФеропластов и трансформацию плазмидной ДНК проеодили как описано в разделе "Материалы и методы" дссертации. Эффективность регенерации сФеропластов в опытах со штаммом 144 достигала 40*. При трансформации сФеропластов штамма 144 плазмидой PMD34 на 1 мкг плазмидной ДНК было получено около 100 трансФормантов. Отбор трансФормантов проводили на среде Н21 с лактозой и эритромицином. Из клеток транс-формантов были выделены плазмидные ДНК. Как оказалось, помимо трех плазмид, характерных для штамма 144 в клетках трансформантов присутствовали плазмиды, соответствующие по своей электро-Форетической подвижности плазмиде PKD34. При определении -галактозидазной активности клеток трансФормантов было установлено, что присутствие в клетках'штамма 144 плазмиды PHD34 приводит к увеличению ^-галактозидазной активности на 80*. Активность ^-галактозидазы клеток полученных трансФормантов составила 13300 ед/мг белка.

Для трансформации клеток штамма 111 была использована плазмида PMD21. Эффективность регенерации сФеропластов для штанма 111 составила 20 г, при трансформации на 1 мкг плазмидной ДНК

было получено около 500 трансФормантов с фенотипон Emr. Из клеток трансФормантов были выделены плазмидные ДНК. Помимо двух плазмид, характерных для штамма 111, в клетках анализируемых трансФормантов присутствовали плазмиды, соответствующие по своей электроФоретической подвижности плазмиде PMD21. При определении р-галактозидазной активности клеток трансФормантов было установлено, что присутствие в клетках штамма 111 плазмиды PMD21 приводит к увеличению^-галактозидазной активностина Чоох. Ак-тивность_рталактозидазы клеток полученных трансФормантов составила 24200 ед/мг белка.

Таким образом, за счет введения плазмид PSH21 и PHD34 в клетки штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis 111 и 144 происходит увеличение дозы гена в клетке и связанное с ним увеличение продукции jS-галактозидазы.

ВЫВОДЫ

1. В результате исследования коллекции производственных штам-нов Streptococcus thermophilus был обнаружен штанм бкб, обладающий повышенной^-галактозидазной активностью по сравнению с другими штаммами данного вида.

2. Обнаружено, что при длительном культивировании клеток штамма S. thermophilus 6кб при постоянных значениях pH среды происходит накопление Фермента^-галактозидазы в бесклеточной куль-туральной жидкости. Наибольший выход фермента^-галактозидазы в культуральную жидкость происходит при росте клеток штамма 6кб при pH в. 0.

3. Получен мутант Streptococcus thermophilus СМ1351, способный за 12 часов культивирования накапливать в культуральной жидкости Фермент ^-галактозидазу в количестве 5300Ö ед/мг белка.

4. Осуществлено клонирование геновДгалактозидазы трех производственных штаммов Streptococcus thermophilus (6кб, 19t и П) На основании рестриктазного анализа установлено, что гены_^га-,лактозидэзы трех различных штаммов S. thermophilus имеют сходную структуру.

5. В результате исследования коллекции производственных штам-нов Lactococcus lactis subsp. lactis 111 обнаружены два штамма - 111 и 144, обладающие повышенной jj-галактозидазной активностью по сравнению с другими штаммами того же вида.

6. Осуществлено клонирование геновjj-галактозидазы Lactococcus lactis subsp. lactis 111 и 144. Проведен рестриктазный анализ клонированных генов. Установлено, что гены js-галактозидазн штаммов 111 и 144 различны по своей структуре.

7. С использованием клонированных генов_^-галактозидазы мезо-Фильных стрептококков получены штаммы Lactococcus lactis subsp. lactis обладающие повышенной (в 1.8 - 2 раза) jj-галакто-зидазной активностью по сравнению с родительскими штаммами 111 и 144.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. С. В. Молотов, Д. Е. Дужий, В. Н. Данилевич, В. В. Суходолец "Клонирование гена^-галактозидазы Streptococcus thermophilic ;т его экспрессия в клетка;: Е, coli и В. "îbtilis". Молекулярная генетика, чттробиология и вирусология, 1990, N 4, с, 10-14.

2. С. В. Молотов, Д. Е. Дужий, В. Н. Данилевич, В. В. Суходолец "Исследование активности^-галактозидазы у производственных штаммов S.thermophilus и клонирование структурного гена этого Фермента в Е, coli и В. subtil is", - Всесоюзный симпозиум "Актуальные проблемы переработки молока и производства молочных продуктов", Тезисы докладов, Вологда, 1990 , с. 86.

3. В. Н. Данилевич, С. в. Молотов, Д. Е. ДужиП, В. В. Суходолен. " О перспективах получения промышленных продуцентов^галактозидазн на основе Str. thermophilic",- Конференция "Интенсификация производства и повышение качества сыра", Тезисы докладов, г.Барнаул, 1989, с. 12г..

4. С. В. Молотов, В. Н. Данилевич, Р. М. Линд, В, В, Суходолец "Синтез и экскреция^-галзктозидазн клетками St'- thermophllus", - Биотехнология, 1991, N2, с. 34-37.

5. С. В. Молотов, Д. Е. Дужий, В. II, данилевич, Р.М.Линд, В. В. Суходолен, клонирование гена_£-галактозидазы и его экспрессия в клетках Е. coli", - Всесоюзная конференция "Молекулярные механизмы генетических процессов", Тезисы докладов, г.Москва, 1990, с. 246,

6. С. В. Молотов, Д. Е. Дужий, В. Н. Данилевич, в. В. Суходолец, "Клонирование гена дталактозидазы производственного штамма Str. lactis ill в клетках Е. coli и коньгациошгай перенос этого гена в клетки Str. thermophilic", Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1991, N4, с. 3-7.