Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая характеристика патогенных стрептококков групп А и В

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая характеристика патогенных стрептококков групп А и В"

Р Г 5 СЛ.

на правах рукописи

СУВОРОВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТОГЕННЫХ СТРЕПТОКОККОВ ГРУПП АИВ

Специальность 03.00.07 - Микробиология

автореферат

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Санкт- Петербург 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН, Москва

Научный консультант:

доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор А.А. Тотолян

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН профессор B.C. Гайцхоки

доктор медицинских наук, профессор, В. В. Тец

доктор медицинских наук, профессор А. М. Королюк

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи, РАМН

Защита состоится "_"_ 1997 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001. 23.02 по защите диссертаций, представленных на соискание ученой степени доктора наук при НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. И.П. Павлова,12).

С диссертацией можно ознакомится в научной библиоткеке института Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук

JT.A. Бурова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Заболевания стрептококковой этиологии занимают ведущее место среди инфекционных заболеваний бактериальной природы. Стрептококки группы А (СГА) вызывают широкий спектр разнообразных болезней человека, таких как тонзиллит, фарингит, скарлатина, рожистое воспаление и стрептодермия, которые в целом ряде случаев осложняются острым гпомерулонефритом, ревмокардитом, стрептококковым сепсисом и гнойными процессами в фасциях и мышцах. Стрептококки группы В (СГВ) занимают видное место в патологии беременности и вызывают тяжелые, подчас летальные, заболевания новорожденных ( сепсис, менингит).

Стрептококковые заболевания человека известны достаточно давно. В литературе описаны неоднократные эпидемии скарлатины в Европе, в Азии и в Америке, уносившие тысячи жизней. После открытия антибиотиков, в первую очередь, пенициллинового ряда, к которым стрептококки оказались высоко чувствительными, проблема стрептококковой патологии, казалось, отошла на второй план. Однако, в последнее десятилетие частота возникновения заболеваний, вызванных стрептококками вновь резко возросла. Из заболеваний, вызываемых стрептококками (главным образом, вызванных стрептококками группы А) по тяжести на первое место выходят такие, как сепсис, токсический шок и некротический фасцит или миозит, приводящие к смерти больного за считанные часы даже на фоне интенсивной антибиотикотерапии (Stevens D. et al. 1996). 70% тяжелых осложнений, вызванных стрептококковыми заболеваниями, связаны со стрептококками группы А двух серотипов - Ml и МЗ, удельный вес которых в стрептококковой патологии до начала семидесятых годов был невысок. Наиболее вероятно, что повышенное количество тяжелых стрептококковых заболеваний, вызванных штаммами этих М серотипов, связано со снижением уровня специфической иммунной защиты населения против серотипов, которые длительное время не циркулировали в человеческой популяции (Тотолян с соавт. 1994). Однако, нельзя исключить, что изменения в эпидемиологии стрептококковых заболеваний связаны с появлением новых высоко вирулентных стрептококковых штаммов с повышенным уровнем вирулентности .

В последнее время изменилась и клиническая картина заболеваний, вызванных стрептококками группы В. Теперь они вызывают не только тяжелые заболевания новорожденных такие как сепсис или менингит, но и ранее несвойственные им

воспалительные поражения глаз и легких. При этом заболевания взрослых, в том числе септического характера, возникают столь же часто, что и заболевания новорожденных (Facklam R. et а]. 1991). Накопились данные о способности СГВ вызывать серьезные инвазивные поражения с летальными исходами (Schwartz В. et al. 1991), в том числе токсические состояния и некротические фасциты (Schlievert P. et al. 1993).

Повышение тяжести протекания стрептококковых заболеваний часто влечет за собой их переход в хронические формы: хронический гломерулонефрит, пиелонефрит, различные формы пороков сердца. Многие из таких пациентов переходят на инвалидность, что усиливает социально-экономическое значение стрептококковых заболеваний. Очевидно, что для выявления и своевременной локализации эпидемических вспышек стрептококковых заболеваний необходим адекватный уровень эпидемиологического надзора, основанный на современной лабораторной базе.

Существующая в настоящее время лабораторная идентификация и классификация стрептококков, базируется исключительно на серологических методах исследования и не позволяет осуществлять детальный клинико-эпидемиологаческий анализ стрептококковой заболеваемости, а тем более изучать пути формирования эпидемически актуальных штаммов. Титрование стрептококков группы А, например, осуществляется на основании антигенных различий их М белков, которых существует более 80 различных типов. Однако, полного набора анти-М сывороток нет ни в одной лаборатории мира, а имеющиеся сыворотки не позволяют осуществлять точную эпидемиологическую идентификацию штаммов. На основе генетического анализа показано, что штаммы, принадлежащие к одному и тому же М серотипу, могут существенно отличаться друг от друга. Молекулярно-генетическая идентификация эпидемических штаммов стрептококков практически не разработана, и исследования в этом направлении носят эпизодический характер. Исследования последних лет, проводимые с использованием генно- инженерной технологии, позволили накопить данные о структурной организации некоторых генов стрептококков групп А и В, кодирующих потенциальные факторы вирулентности. Так были проклонированы и изучены гены стрептококковых М белков различных серотипов, гены рецепторов иммуноглобулинов А и G, гены ряда стрептококковых токсинов, цитолизинов, поверхностно локализованных ферментов таких как стрептокиназа, ДНКазы, С5а пептвдаза и др.. Однако, исследования, направленные на изучение отдельных стрептококковых генов, кодирующих белки, участвующие в формировании вирулентности, носят фрагментарный характер. Неизвестно взаимное расположение

генов вирулентности на генетической карте стрептококков. Практически не изучены механизмы регуляции экспрессии этих стрептококковых генов.

Все вышесказанное повышает социально-экономическое и общемедицинское значение исследований стрептококков, как в плане необходимости улучшения диагностики стрептококковых заболеваний, так и с точки зрения исследования молекулярных механизмов их возникновения. Следовательно, изучение биологии и патогенетических свойств стрептококков групп А и В актуально как с научной, так и с экономической и социальной точек зрения.

Хорошо известно, что вирулентность стрептококков групп А и В коррелирует с их способностью продуцировать на поверхности клеточной стенки ряд белков, а также полисахаридную капсулу, однако роль всех стрептококковых белков в патогенезе, не исключая такие хорошо известные белки, как М белок стрептококков группы А, до сих пор недостаточно изучена. Более того, знания о стрептококках и механизмах, повышающих вирулентность этих микроорганизмов, которые казались очевидными 10 лет назад, сейчас подвергаются сомнению и пересмотру. В полной мере это относится и к состоянию научных знаний о стрептококках группы В. Все вышесказанное определило цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является осуществление генетического анализа стрептококков групп А и В посредством исследования хромосомной организации стрептококковых генов, а также структуры отдельных генов, участвующих в реализации вирулентного фенотипа. Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

1. Для осуществления молекулярно-генетического анализа стрептококков адаптировать такие методы как трансформация посредством электропорации, электрофорез в пульсирующем электрическом поле и экспресс - полимеразная цепная реакция.

2. Осуществить анализ хромосомной ДНК стрептококков группы А для:

- построения физической и генетической карты хромосомы стрептококка группы А

- проведения сравнительного анализа локализации генетических маркеров на хромосомах стрептококков группы А различных серотипов.

3. Осуществить молекулярио - генетический анализ ряда стрептококковых генов, потенциально принимающих участие в реализации вирулентного фенотипа ( С5а пептидаза, глутаминсинтегаза, Ree А ):

- клонирование генов,

- определение их нуклеотидной последовательности,

- компьютерный анализ нуклсотидных последовательностей,

- получение рекомбинантных белков в системе Е.соН,

- создание интегративных векторов и получение изогенных мутантов стрептококков по исследуемым генам.

4. Провести молекулярно-эпид синологическое исследование на предмет изучения распространенности ряда генов вирулентности в штаммах стрептококков групп А и В различных серотипов (сгрептолизина О, эритрогенного токсина А, С5а пептидазы, альфа и бета антигена, глутаминсинтетазы ).

Научная новизна исследования

Научная новизна работы состоит в том, что:

1. Впервые для целей молекулярно-генетичссхого анализа стрептококков осуществлены трансформация посредством электропорации, электрофорез в пульсирующем электрическом поле и экспресс - полимеразная цепная реакция.

2. Впервые показано, что гены С5а пептидазы и глутаминсинтетазы представлены в хромосомной ДНК всех исследованных штаммов стрептококков группы В в отличие от генов бета антигена, представленного у 50% штаммов серотипов I и II и практически отсутствующего у штаммов серотипа Ш.

3. Впервые определена нуклеотидная последовательность генов С5а пептидазы и гена глутаминсинтетазы стрептококков группы В, а также гена 11есА стрептококков группы А.

4. Впервые проклонированы полноразмерные гены С5а пептидазы и глутаминсинтетазы СГВ в гетерологичной системе Е.соИ, в результате чего получены и проанализированы рекомбинантные белки С5а пептидазы и глутаминсинтетазы стрептококков группы В.

5. Впервые сконструированы изогенные мутанты стрептококков группы В с нарушенной экспрессией гена С5а пептидазы и гена глутаминсинтетазы, что позволит в дальнейшем использовать их для получения приоритетных данных о вкладе этих белков в формирование вирулентного фенотипа СГВ.

6. Впервые построены рестрикционная и генетическая карты хромосомы стрептококка группы А серотипа М1.

7. Впервые показано, что хромосомные ДНК различных штаммов стрептококков группы А характеризуются высокой степенью полиморфизма рестрикционных фрагментов и в то же время консервативностью порядка расположения генов на хромосоме.

Теоретическое значение исследования.

Данная работа носит теоретический характер. Построение первой генетической карты стрептококка группы А позволило установить взаимное расположение различных генов, в частности генов, относящихся к реализации вирулентного фенотипа. В ходе картирования установлен размер стрептококкового генома, количество рибосомальных оперонов и их относительная локализация. Построение первой генетической карты стрептококка группы А представляет ценность для всех специалистов, занимающихся исследованиями отдельных стрептококковых генов и вопросами регуляции их функций. Выяснено, что стрептококки, одного и того же серотипа характеризуются высокой степенью полиморфизма рестрикционных фрагментов, определяющих различия в их рестрикционных картах. Это демонстрирует ограниченные возможности современной серологической диагностики. Установлено, что несмотря на натичие рестрикционного полиморфизма у стрептококков различных серотипов, общая последовательность взаимного расположения генов остается неизменной. Молекулярно- эпидемиологический анализ коллекции штаммов СГА м СГВ различных серотипов позволил установить высокую степень консервативности стрептококковых генов С5а пептидазы и глутаминсинтетазы. Было показано, что ген С5а пептидазы консервативен по структуре как среди штаммов стрептококков группы В, так и группы А, что может указывать на важность С5а пептидазы для выживания и колонизации тканей хозяина стрептококками этих групп. Все это также указывает на эволюционную общность происхождения стрептококков групп А и В или на возможность генетического обмена между стрептококками разных видов.

Обнаружение свойств стрептококковой глутаминсинтетазы, подобных свойствам поверхностных белков стрептококков, а также выявление способности связывать иммуноглобулины класса А, позволили создать концепцию многофункциональности некоторых белков, паразитирующих микроорганизмов.

Разработка метода генетической трансформации стрептококков посредством электропорации послужило началом появления нового направления анализа функции стрептококковых генов, заключающегося в создании изогенных мутантов с использованием интегративных векторов.

Практическое значение исследования.

Разработанный метод экспресс ПЦР может быть использован для анализа клинических изолятов стрептококков групп А и В как на наличие отдельных генов, так и для эпидемиологического анализа штаммов с использованием метода

случайной затравки. Метод оказался пригодным и для анализа штаммов патогенных сальмонелл и туберкулезной палочки. Проведенные исследования по клонированию и экспрессии генов стрептококков в системе кишечной палочки могут быть использованы в дальнейшем для создания вакцинных препаратов с целью предупреждения стрептококковых заболеваний. Заложены основы для введения

в практику единого, унифицированного способа молекулярно-эпидемиологического анализа патогенных стрептококков групп А и В. Положения, выносимые на защиту:

1. Стрептококки группы А характеризуются высокой степенью полиморфизма рестрикционных фрагментов ДНК даже в штаммах, принадлежащих к одному серотипу поэтому, действующая в настоящее время серологическая классификация стрептококков может быть существенно дополнена и уточнена молекулярно-генетическими методами исследования. Одной из причин полиморфизма являются генетические перестройки, обусловленные интеграцией в геном стрептококков умеренных бактериофагов.

2. Общий порядок локализации генов стрептококков группы А на генетических картах хромосом различных штаммов является единым и не зависит от серотипа.

3. Гены С5а пептидазы и глутаминсинтетазы стрептококков группы В гомологичны генам стрептококков группы А, что является указанием на общность происхождения этих генов.

4. Использованный в работе молекулярно-генетический подход, основанный на выключении функции отдельно взятого гена стрептококка, за счет интеграции в структуру этого гена маркера антибиотикорезистентности, является эффективным способом получения изогенных мутантов для выяснения роли стрептококковых генов в вирулентности.

Достоверность полученных результатов подтверждается следующим:

1. Высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов исследования (пшимеразная цепная реакция, электрофорез в пульсирующем электрическом поле, секвенирование ДНК, ДНК-ДНК гибридизация, иммуноблотинг и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные.

2. Электрофорез фрагментов ДНК осуществлялся в присутствии адекватных по размеру ДНК маркеров, а расчет молекулярных весов, образующихся в результате гидролиза хромосомных ДНК стрептококков различными эндонуклеазами, осуществлялся с использованием компьютерных программ типа 5(х}а1<1.

3. Применением наиболее современных способов компьютерного анализа данных секвенирования микробной ДНК с привлечением таких банков данных как СЕКВАМК, ЕМВО и т.д.

Апробация работы.

Материалы диссертации опубликованы в 49 научных статьях, многократно доложены на международных симпозиумах и конференциях ("Генетика и молекулярная биология стрептококков, энтерококков и лактоюкков", Миннеаполалис, США, 1991, "Новые направления биотехнологии", Пущино на Оке, 1992, "XII международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям", Санкт-Петербург, Россия, 1993, "Генетика стрептококков энтерококков и лактококков", Санта Фе, США, 1994, " Биотехнология Санкт-Петербург-94" Санкт-Петербург, 1994, " Новые методы в микробиологии" Кошице, Словакия, "XIII международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям", Париж, Франция , 1996, на конференции Отделов микробиологии и педиатрии Университета Миннесоты (США), 1996, на заседании Отдела микробиологии и молекулярной биологии института им. Пастера, Париж, (Франция) 1996. Данные работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН, 1994-1997, и на заседании Ученого Совета НИИЭМ РАМН, 1996.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 210 страницах машинописного текста, включающего: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, 6 глав собственных исследований с обсуждением полученных результатов, заключение, выводы, список литературы. Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 25 рисунками, указатель литературы содержит 284 источника в том числе 12 отечественных и 272 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для анализа использовались штаммы стрептококков группы А (СГА) и группы В (СГВ) из коллекции Отдела Молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН, Отдела микробиологии и иммунологии Университета Оклахомы, Отделов Микробиологии и Педиатрии Университета Миннесоты, Отдела Микробиологии и Иммунологии Пекинского Детского госпиталя. Общее количество проанализированных в ходе

различных экспериментов штаммов СГА и СГВ - 334. Для генно-инженерных процедур использовались штаммы E.coli JM109, DH5a, Q358, Q359, ВНВ2688, ВНВ2690, генетические характеристики которых изложены в руководстве (Maniatis D. et. al. 1982).

Стрептококки культивировали на среде ТНВ (Todd-Hewitt-Broth, Difco, USA). В зависимости от штамма и задач исследования в среду добавляли лошадиную сыворотку (10%), эритромицин (5 мкг/мл), 10 % крови барана при приготовлении плотных агаризованных сред. Клетки E.coli выращивали в LB бульоне. При выращивании E.coli, несущих плазмиды с маркерами антибиотикоустойчивосги, в среду добавляли ампициллин (50-100 мкг/мл) или эритромицин (300 акг/мл).

Для идентификации стрептококков группы В, выделенных от больных и носителей, использовали CAMP тест; определение серотиповой принадлежности штамма производили методом двойной иммунодиффузии между поверхностными антигенами стрептококка и группо- и типо- специфическими сыворотками.

Рутинные генно-инженерные процедуры, такие как выделение плазмидной и хромосомной ДНК, гидролиз ДНК рестрикционными ферментами, трансформация при помощи ДНК штаммов E.coli, гибридизация ДНК, перенесенной на нитроцеллкшозные или нейлоновые фильтры с бактериальных колоний или из агарозного геля, также осуществлялись в соответствии с протоколами из руководства (Maniatis D. et al. 1982). Детекция гибридизующихся ДНК фрагментов осуществлялась с использованием ДНК-зондов, меченных дегоксигенином согласно протоколов к наборам фирмы Boehringer Mannheim Genius™ DNA Labelling and Hybridization kit или Multicolor DNA detection kit, Германия.

Электрофорез ДНК проводили с использованием 0.8-2% агарозного геля, в горизонтальном пластинчатом аппарате с использованием Трис-боратного или Трис-ацетатного буфера.

Создание геномной библиотеки штамма 78-471 СГВ осуществляли в фаговом векторе X L. 47.1. или X DASH П. Геномную ДНК СГВ рестрицировали эндонуклеазой Sau ЗА в условиях неполного гидролиза, после чего рестрицированные фрагменты литеровали с ДНК вектора, рестрицированной эндонуклеазой Bam HI. Селекцию рекомбинантных клонов осуществляли на культуре Q359.

Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводилось в соответствии с методом (Sanger F. et.al. 1977) при использовании набора фирмы USB, США. Для секвенирования биотинилированных продуктов ПЦР использовали так называемое твердофазное секвенирование (Hultman Т. et. al. 1989). Особенностью этого

метода является применение магнитных частиц, меченых стрептавидином, Dynabeads М280 Streptavidin (Dynalas, Norway) для разделения цепей ДНК.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по разработанному в ходе исследования методу , позволявшему использовать непосредственно бульонную культуру стрептококков в качестве источника ДНК для ПЦР. Стрептококковые клетки обрабатывали литическим буфером 5 минут при 93°С, а затем отбирали порцию из лизата и добавляли ее к реакционной смеси для ПЦР. Метод не требовал получения чистого препарата ДНК и позволял существенно упростить и ускорить ПЦР, применяемый для диагностики стрептококков.

Трансформацию клеток стрептококка группы В плазмидной ДНК проводили методом электропорации, который был адаптирован для патогенных стрептококков и впервые применен для их трансформации. Для трансформации стрептококков бактерии выращивали в присутствии треонина и глицина до OD650- 0.3 , многократно отмывали в 10% глицерине и осаждали центрифугированием до концентрации 1010 клеток/мл. Дня создания электрошока использовали прибор Gene Pulser (Bio-Rad, США). Параметры электротрансформацин - 2500V, 25MF.

Выделение белка С5а пептидазы и глутаминсинтетазы (GSB) с поверхности СГВ проводили с помощью мутанолизина. Рекомбинантные белки (С5а пептидазу и глутаминсинтетазу) очищали методом хроматографии. Электрофорез белков в SDS-полиакриламидном геле проводили по (Laerarali U. 1970). Перенос белков на нитроцачлюлозную мембрану проводили по (Towbin H. et al. 1979). Иммуноблотннг перенесенных белков осуществляли с различными сыворотками против альфа и бета антигенов, рекомбинантного белка С5а пептидазы стрептококков ipynroi A (SCPA) из стрептококка серогипа М12, а также против сывороточного IgA. Биологическую активность рекомбинатного белка С5а пептидазы стрептококков группы В (SCPB) определяли в тесте на подавление хемотаксиса клеток крови в ответ на стимуляцию знмозан активированной сывороткой, по протоколу описанному (Metealf J. et a!. 1985).

Электрофорез хромосомной ДНК стрептококков в пульсирующем электрическом поле проводили на приборах фирмы Bio-Rad, США ( Pulsophor) либо Beckman, США (Gene Line). Приготовление препаратов ДНК к обработке рестрикционными ферментами осуществлялась в соответствии с протоколом (Suvorov A. and Ferrett J. 1991). Для рестрикционного анализа хромосомы стрептококков применялись эндонухлеазы Sma, Sfil, SgrAI,

Расчет молекулярных размеров рестрикционных фрагментов ДНК осуществлялся с использованием компьютерной программы Seqaid. Анализ последовательностей ДНК проводилась с использованием компьютерных программ PC GENE, SEQAID, PUSTELL, DNA Strider 1.0 на персональных компьютерах IBM и Mackintosh различных конфигураций. Для проведения исследований по сравнению нуклеотидных и белковых последовательностей с банками данных использовалась информация банков данных таких как GenBank, EMBL, EMBL Update, Brookhaven Protein, SWISS-PROT, Kabat-pro, а также программы белкового анализа SOPMA, Top Pred II и ряд других.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для решения задач, поставленных в данной диссертационной работе, применительно к анализу патогенных стрептококков были адаптированы молекулярно-гснетические методы, ранее применявшиеся для изучения других биологических объектов. Для этих целей были разработаны и впервые применены три группы методов: экспресс полимеразная цепная реакция, электрофорез в пульсирующем электрическом поле и трансформация посредством электропорации.

Благодаря методу экспресс ПЦР стрептококков, появилась возможность существенно упростить постановку полимеразной цепной реакции для стрептококков.

Это особенно важно, учитывая сложности такого рода диагностики для стрептококков как модели, так хак для стрептококков с высоким уровнем продукции ДНКаз и мощной клеточной стенкой не применимы методы, используемые для ПЦР ДНК эукариот и грам - отрицательных бактерий. Использование экспресс ПЦР с набором специфических или универсальных (случайных) праймеров может бьггь положено в основу стандартного набора диагностических процедур молекулярно-генетического характера, позволяющих быстро и точно идентифицировать стрептококки как возбудителя, сравнивая их с другими стрептококковыми штаммами, распространенными в том же регионе. Экспресс ПЦР может стать существенным дополнением классическим методам серодиагностики. В перспективе планируется сформировать международный банк компьютерных образов ПЦР паттернов, доступный врачам-микробиологам через систему электронной почты. Использование такого рода системы позволит быстро и точно сравнивать эпидемические и эндемические штаммы стрептококков, изолированные в любой точке земного шара.

Метод электрофореза в пульсирующем электрическом поле, успешно зарекомендовавший себя для тестирования эукариотических геномов, был впервые применен для стрептококков. Суть метода основывается на обработке запаянных в агарозу стрептококков мутанолизином, лизоцимом, протеиназой К и тщательной отмывке в Трис- БИТА буфере. При таким подходе сначала вскрывается клеточная стенка, а затем стрептококковая ДНК освобождается от окружающих ее белков, без повреждения своей макромолекулярной структуры. Преимуществом метода является возможность длительного хранения агарозных блоков, которые можно гидролизовать различными рестрикционными ферментами в случае необходимости. Использование электрофореза в пульсирующем поле позволяет достигать разделения в электрическом поле фрагментов хромосомной ДНК размером более 600 т.н.п., что невозможно при других методах исследования. Использование этого методического подхода позволило решить две взаимосвязанные задачи: осуществить генетический анализ хромосомы патогенных стрептококков с целью выяснения взаимного расположения стрептококковых генов на хромосоме, а также осуществить молекулярно-эпидемиологический анализ стрептококковых штаммов, принадлежащих к одному или различным серотипам для выяснения степени их эпидемиологического и генетического родства. Разработанным нами методом в настоящее время пользуется несколько лабораторий мира, а сам подход основанный на анализе стрептококков посредством электрофореза в пульсируюшем электрическом поле стал широко применяться в эпидемиологической практике .

Разработка метода трансформации стрептококков группы А впервые открыла возможность введения генетического материала в эти бактерии, лишенные природной трансформации. Суть метода заключалась в проведении электрошока стрептококковых клеток в присутствии ДНК. Были разработаны параметры оптимальных условий обработки стрептококков перед эяектротрансформацией . С использованием такого подхода возникла возможность инактивации отдельно взятых стрептококковых генов посредством инсерционного мутагенеза с целью последующего исследования их роли в формировании вирулентного фенотипа. Практически ни одна серьезная современная работа, посвященная анализу функции стрептококковых генов не обходится без получения мутантов, за счет инсерций плазмид, неспособных реплицироваться в стрептококках, в хромосому. Другим приложением данного метода является введение в патогенные стрептококки репликативных плазмид с целью исследования ситуаций,

когда изучаемый ген не находится в обычном состоянии на хромосоме, а транскрибируется в составе мультикопийной плазмвды. Данный подход представляется перспективным для целей изучения влияния различных стрептококковых регуляторных белков на функции стрептококковых регулонов, а также отдельных генов.

Молекулярно-эшщемиологический анализ штаммов стрептококков групп А и В позволил изучить распространенность ряда генов, относящихся к формированию вирулентности (Рис.1). Так, штаммы стрептококков группы В, принадлежащие к различным серотипам, были проанализированы на наличие генов альфа и бега антигенов, а также генов С5а пептидазы (всрВ) и глутаминсинтетазы (в!пА) в геноме. Все исследованные штаммы СГВ содержали в своем геноме гены 8срВ и glnA, причем анализ хромосомных ДНК на наличие полиморфизма рестрикционных фрагментов, содержащих эти гены, выявил практически идентичную картину. Из 40 штаммов СГВ различных серотипов, проанализированных на наличие «срВ и glnA был обнаружен лишь один штамм с делецией в области структурной части 8срВ и один штамм с отличающимся рестрикционным паттерном ДНК фрагментов, гибридизующихся с геном £1пА. Эти данные указывают на высокую степень консервативности данных генов в СГВ.

Анализ СГВ на наличие генов альфа и бета антигенов позволил установить степень распространенности генов бета среди различных эпидемических штаммов. Установлено, что ген бета обнаруживается примерно в 50% штаммов СГВ, преимущественно принадлежащих к I и II серотипам. Использование теста на экспрессию на поверхности СГВ бета белка, связывающего ^А, показало, что в 100% случаев наличие этого белка на поверхности, коррелировало с присутствием гена бета в геноме. Данный факт указывает на важное значение способности связывать иммуноглобулины класса А для реализации физиологических функций стрептококков группы В.

Ген альфа обнаруживался практически во всех штаммах стрептококков группы В и не обнаруживался лишь в штаммах II и III серотипов, содержащих Я белок. Выявлена связь между ресгрикционным паттерном СГВ штаммов, гибридизующихся с геном альфа и наличием в этих штаммах гена бега. Иное распределение рестрикционных фрагментов, гибридизующихся с геном альфа при наличии в геноме гена бета позволяет предположить, что штаммы СГВ, содержащие ген бета и не содержащие этот ген представляют собой отдельные популяции, разделившиеся в процессе эволюции стрептококков группы В.

гены ста гены СГВ

Рис. 1 Распространенность некоторых генов вирулентности в клинических штаммах стрептококков групп А и В.

Анализ штаммов СТА на наличие генов эритрогсниого токсина A (speA) и стрептолизина О (slo) проводился с целью выяснения распространенности этих генов в популяции, а также с целю выяснения степени консервативности нуклеотидных последовательностей этих генов. На примере анализа штаммов стрептококков выделенных в Санкт-Петербурге бьио установлено, что ген SpeA обнаруживается в 15% стрептококковых штаммов, выделенных от носителей и в 56% штаммов вызывающих скарлатину, что меньше, указанного другими исследователями (Müller-Adolf H. et al. 1993), (Weeks C.Ret al. 1986) . Возможным объяснением данного феномена являются псевдоположительные реакции гибридизации с геном speA учитывая высокую степень гомологии данного гена с генами эритрогенного токсина С и В.

Ген стрептолизина О оказался высоко консервативным у стрептококков группы А. Проведенный анализ показал, что паттерны рестрикционных фрагментов генов slo различных штаммов СГА практически идентичны. Вероятно, высокая консервативность

slo является отражением важности данного гена для осуществления физиологических функций стрептококков группы А.

Более детальный анализ некоторых генов стрептококков был осуществлен после их клонирования в системе Е. coli. Генетический анализ проводился по общей схеме: создание хлонотеки стрептококковых генов, селекция клона с геном, предназначенным для анализа, секвенирование ДНК, компьютерный анализ нуклеотидной последовательности, получение рекомбинантного белка в системе E.coli, клонирование фрагмента гена в векторе, неспособном реплицироваться в стрептококках, трансформация стрептококков с целью получения интегративных мутантов по изучаемомому гену. В результате работы, таким образом, были детально проанализированы два гена СГВ ( С5а пептидазы и глутаминсинтетазы) и один ген СГА ( RecA белка).

Необходимость клонирования гена стрептококкового RecA была обусловлена отсутствием удобных штаммов - реципиентов для генно-инженерных манипуляций на патогенных стрептококках. При этом, если инсерционный мутагенез предполагает RecA зависимую интеграцию в области изучаемых генов, то, как уже отмечалось ранее, в перспективе исследования стрептококковых генов потребуют осуществления экспериментов, предполагающих введение в стрептококки генов на репликативных плазмндах. Это связано, как с неспособностью ряда генов стрептококков экспреесироваться в E.coli, так и с необходимостью изучения влияния отдельных регуляторных генов на функции стрептококковых генов in trans. Клонирование гена было осуществлено путем создания плазмидной библиотеки, в которой клон, содержащий искомый RecA ген, был найден путем гибридизации. Проклонированный в плазмидном векторе, ген стрептококкового RecA оказался способным экспреесироваться в кишечной палочке, комплементируя дефицит по RecA. После того, как фрагмент ДНК, соответствующий центральной части гена, был проьпонирован в плазмидном векторе DL268, неспособном реплицироваться в стрептококках, и полученной при этом плазмидой pSF150 были трансформированы стрептококки группы А серотипа М49, удалось получить RecA- мутанты (Рис. 2).

Рис. 2. Схема инактивации гесА посредством введения в хромосому интегративного вектора р8Р150, содержащего фрагмент структурной части гена .

Селекция проводилась по признаку устойчивости к спектиномицину. Полученные трансформанты СГА оказались дефектными по ЯесА, что проявлялось в отсутствии способности трансформироваться линейной ДНК и отсутствии устойчивости к ультрафиолету (Рис. 3).

NZ13I

10 20 Лоза ультоасЬиолета в секундах

Рис. 3 Устойчивость к ультрафиолету мутантного по RecA штамма СГВ Reell и штамма дикого типа NZ131

Таким образом, впервые удалось создать стрептококковый штамм, который можно было использовать как штамм-реципиент для введения автономно реплицирующихся генетических элементов путем трансформации. При этом исключается возможность интеграции плазмидной ДНК в хромосому стрептококка. Дополнительным удобством получения реципиента на основе штамма NZ131 серотипа М 49 является тот факт, что данный штамм не способен синтезировать гиалуроновую капсулу и потому легко трансформируется посредством злектропорации. Другой перспективой использования RecA гена будет создание интегративных мутантов с введением различных генов в область рекомбинации, что позволит создавать клоны стрептококков с инсерцией в хромосому генов, которые не способны к выщепленшо из генома.

Клонирование и последующее секвенирование гена С5а пептидазы стрептококков группы В было проведено по той же схеме, что и гена RecA. Ген С5а пептидазы был первоначально обнаружен в клонотеке генов СГВ, сделанной в фаговом векторе Ä.L47.1, после чего проведено секвенирование гена. Окончательное клонирование его структурной части для достижения экспрессии в системе Е. coli было проведено посредством ПЦР. Участок scpB, соответствующий центральному участку структурной части гена, бьш проклонирован в плазмидном векторе с целью получения вектора pC5al, впоследствии использованного для получения интегративных СГВ мутантов по гену scpB (Рис. 4). Клонирование этого гена позволило установить, что выявленная ранее способность стрептококков этой группы расщеплять фракцию комплемента С5а, обусловлена ферментом, родственным С5а пептидазе СГА. Этот ген и, соответственно, кодируемый им беяок, оказался настолько высоко гомологичным белку из стрептококков группы А серотипа М12, что степень гомологии между данными белками оказалась выше, чем между С5а пептидазами из СГА серотипов М12 и М49. Единственным отличием в структуре белка С5а пептидазы СГВ от СГА оказался участок в 17 аминокислот, отсутствующий в белке из стрептококков группы В. Данный участок соответствовал у С5а пептидазы СГА, согласно компьютерному анализу (PEST тесту), наиболее "уязвимой" областью для воздействия протеаз. Поэтому, оправдано предположить, что для стрептококков группы В, для которых характерно длительное бессимптомное носительство, делеция в данной области обеспечивает более устойчивую защиту от фагоцитоза. Рекомбинантный белок, полученный из штамма кишечной палочки с геном scpB оказался способным ингабировап, хемотаксис полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЯл) , а сыворотка

против SCPB реагировала как с рекомбинангаым белком, так и с С5а пептидазой СГА. Эти данные позволяют сделать заключение о возможности использования рекомбинантного белка SCPB в качестве основы для создания нового вакцинного препарата, который будет стимулировать иммунный ответ как против стрептококков группы А, так и против стрептококков группы В. Используя разработанную стратегию инсерционного мутагенеза, участок структурной области scpB гена был проклонирован в интегративном векторе, после чего полученная конструкция была введена в геном штамма-реципиента СГВ посредством электролоршши. Мутанты по гену scpB были проанализированы на предмет интеграции вставки плазмиды в области структурной части гена, после чего их проверили на способность подавлять хемотаксис ПМЯл в экспериментах in vitro и in vivo. Оказалось, что мутанты неспособны экспрессировать на поверхности С5а пептидазу, и фагоцитируются на два порядка интенсивнее, чем бактерии дикого типа, с нормальным уровнем продукции фермента.

N1

scpB

51 ил. ТШЯ

r>(pstl)j~> PstI [ HindlII Г* Г* (~KpnI V Xbal,

Tr- J J -

B8Ü8

ПЦР

1.2 T.HJ1. амплификат

\

pUC18

КЛОНИРОВАНИЕ

Рис. 4. Рестрикционная карта гена всрВ с участками присоединения ДНК

праймеров, использованных для секвенирования (обозначены стрелками) и клонирование фрагмента структурной части гена всрВ, жирными линиями - продукты ПЦР, треугольником - область отличия вер генов у СГА и СГВ.

Полученные данные указывают на значительную роль С5а пептидазы в поддержании паразитарного состояния стрептококков в человеческом организме и подчеркивают перспективность исследований, направленных на создание вакцинных препаратов на основе С5а пептидазы.

Другим геном, проанализированным в ходе данной работы, является ген стрептококковой глутаминсинтетазы. Глутаминсинтетаза бактерий, являясь ключевым ферментом в процессах, связанных с ассимиляцией азота, обладает чрезвычайно высоким уровнем консервативности как среди бактерий, так и среди эукарнот. У стрептококков группы В данный фермент необходим как для синтеза компонентов клеточной стенки, так и полисахаридной капсулы.

Ген глутаминсинтетазы стрептококков бьи проклонирован в плазмидном векторе риС18 с образованием плазмиды рЯ512 (Рис. 5) и из штамма, содержащего эту плазмиду, был выделен рекомбинантный белок .

рЛ512

ЕеоЫ Крп1 5рЫ Ира1 РуЫ1 ХЬа! ЕсоЮ

-а , —-

в 7 2 ^ 3 4

рА832

ризг

Рис.5. Рестрикционная карта плазмиды рИ512, и ее дериватов. Область гена

глутаминсинтетазы и напрашение транскрипции обозначены стрелкой.

В результате клонирования и секвенирования гена глутаминсинтетазы СГВ было установлено, что данный белок, наряду со свойствами, присущими глутаминсинтетазам других бактерий, обладает выраженной лмдерной последовательностью и участком "заякоревания" в клеточной мембране, свойственными поверхностным стрептококковым белкам (Рис. 6). Компьютерное моделирование возможной локализации белка в клетке также указало на то, что стрептококковая гяутаминсинтетаза связана с клеточной мембраной в области С конца. В

многообразных иммунологических тестах было показано, что данный белок реагирует с сыворотками против различных поверхностных белков СПВ, таких как альфа и бета, а также связывает иммуноглобулин А. Стрептококковая глутаминсинтетаза оказалась способной комгиементировать неспособность мутантных штаммов кишечной палочки синтезировать глутаминсинтетазу, что указывает на функциональность данного фермента в системе Е.соК.

Белок

Аминокислотная последовательность

Мб LPSTGETAN РБТТАААЬТУМАТАСУААУУ КИСЕЕ ввв ЬгеП.Н1\ЛГЖЛГ.И)КУУКЛЛШТН11"Г\П.О КИЕ Вас ЬРУТСУА8\ ЬУЬЕШСЬЬСЬЮТЗИАМ КШ^

А - ЬРЕТвЕЕ^ ЬЮТТУРССЬБЬАЬСААЬЬАС белок

ЬРХТвХ

„„___ „ участок связывания

консервативная ^

последовательность с мембраной

заряженная хвостовая часть

Рис. 6. Сравнение аминокислотной последовательности С терминальной области стрептококковой глутаминсинтетазы с аналогичными

последовательностями поверхностных белков грамположительных кокков. Мб - белок М СГА серотипа Мб, ОЗВ- глутаминсинтетаза СГВ, белок бета СГВ, А белок-1^0 рецепторный белок стафилококков.

Взаимодействие фермента с 1§А, наиболее вероятно, обусловлено тем, что за счет поверхностной локализации глутаминсинтетазы, в процессе эволюции, на белке сформировался эпитоп, обеспечивающий ненммунное взаимодействие с Рс областью иммуноглобулина А. Выполнение различных функций одними и теми же белками характерно для многих поверхностных белков патогенных микроорганизмов.

Для выяснения роли глутаминсинтетазы в вирулентности стрептококков был сконструирован вектор рА832 для интегративной инактивации glnA. Однако,

несмотря на получение мутантов, с инсерцией в структурной части гена, мутантные клоны сохраняли глугаминсинтетазную активность. Возможно, что сохранение ферментативной активности происходило за счет укороченного белка, который теоретически мог синтезироваться с использованием данного вектора. Выяснить этот вопрос позволит создание набора новых интегративных векторов, которые содержат области гомологии с 3', 5' и центральной частью гена.

Данные гибридизапионного анализа выявили, что ген глутаминсинтетазы СГВ (GSB), как и ген С5а пептидазы (SCPB), гомологичны аналогичным генам СГА, поэтому возможно, что сыворотки против рекомбинантных белков SCPB и GSB будут реагировать и со стрептококками группы А. Дальнейшие исследования в области изучения этих двух генов, и белков ими кодируемыми, в первую очередь, будут связаны с изучением структуры антигенных детерминант данных белков, локализации белков на поверхности стрептококков и возможности получения протективных сывороток, защищающих лабораторных животных от стрептококковой инфекции, при иммунизации данными рекомбинантными белками.

Проведение анализа генома стрептококков посредством электрофореза в пульсирующем электрическом поле позволило осуществить изучение стрептококковой хромосомной ДНК, как отдельно взятого штамма серотипа М1, так и группы стрептококковых штаммов, выделенных из различных регионов и относящихся к различным серотилам.

В результате анализа штамма SF370 серотипа М1 впервые была построена физическая и генетическая карты генома патогенного стрептококка группы А. В исследовании были использованы три эвдонуклеазы : Smal, Sfil и SgrAI. Эти ферменты разрезали геном штамма SF370 на соответственно 15, 6 и 11 фрагментов. Для построения карты применялись такие подходы как одиночный и двойной гидролиз хромосомной ДНК, создание библиотеки концевых участков ДНК, соответствующих сайтам гидролиза рестриктазами, выделение рестрикционных фрагментов из агарозы и использование данных фрагментов в качестве ДНК зондов, а также гибридизация с известными генами стрептококков. Размер генома оказался равен 1920 т. н. п., что существенно меньше размера генома Е. coli и В. subtilis. Учитывая паразитарный тип существования стрептококков, не требующий полного комплекса генов, кодирующих различные ферментные белки, естественным представляется небольшой размер их хромосомы.

На хромосоме СГА были локализованы более 40 различных генов, включая как гены "вирулентности", так и гены 6 рибосомальных оперонов и Т РНК синтетаз (Рис. 7). Гены, кодирующие белки, связанные с формированием . вирулентного фенотипа, такие как ген М белка (emm), С5а пептидазы (scpA) , стрептолизина О (slo), фибронектинсвязываюших белков (sfbl, sfbll), рецептора плазмина (plr), эритрогенного токсина В (speB) , митогенного фактора (mf) и стрегггокиназы (ska) оказались компактно локализованы в одной области генома. Вероятно, что эта часть хромосомы подверглась наибольшим эволюционным изменениям по сравнению с сапрофитами по мере адаптации стрептококков к организмам хозяевам. В геноме стрептококков также были обнаружены последовательности бактериофагов, причем из данные гибридизации указывают на наличие нескольких фагов в геноме. Это подтверждает значение стрептококковых бактериофагов в биологии стрептококков.

fbp54 Т12int

T12ctt

ATPase pep pfl

ггп5 orfX hylP so gp trmD

sfbll myc ssa dnaK дуг А, В rnnö thr

sfbl rofA rrn l,2.i val hasA.8

slo tee

rrn4, glnA

his

recA

emm I scpA, speB, mf

Рис. 7. Физическая и генетическая карта генома СГА штамма SF370 серстипа Ml.

Построение первой генетической карты СГА сделало возможным использовать эти данные для начала секвенирования всего генома стрептококков группы А, причем объектом для секвенирования стал тог же стрептококковый штамм, который был

выбран для генетического картирования (Рис. 7). В настоящее время полное секвенирование генома штамма 8Р370 проводится в сотрудничестве между Отделом молекулярной микробиологии НИИЭМ и Отделом Микробиологии Университета Оклахомы, США. Работа находится в фазе завершения.

Проведение молекулярно-эпидемиологических исследований методом электрофореза в пульсирующем электрическом поле штаммов СГА, принадлежащих к одному (М1) серотипу позволило установить, что после гидролиза эндонуклеазой вшаГ рестрихционные паттерны штаммов, принадлежащих к одному серотипу существенным образом отличаются. Удалось обнаружить, как минимум, 7 различных рестрикционных паттернов, присущих штаммам этого серотипа. Эти результаты дополнительно свидетельствуют о том, что серологическая классификация стрептококков далеко не всегда отражает эпидемические и эволюционные связи между штаммами, изолированными в разных регионах и разное время. Дополнительно в данной работе было проверено предположение (С1еагу Р. е1 а1. 1992), постулировавшего существование двух генетических линий СГА М1 серотипа (инвазивных и неинвазивных штаммов). Как уже отмечалось, исследования выявили 7 типов рестрикционных паттернов, а не 2, причем некоторые из стрептококков, относившиеся по классификации С1еагу к неинвазивным, согласно анамнезу, вызывали тяжелые системные поражения организма. Наиболее вероятно, что тяжесть протекания стрептококковых заболеваний не является исключительно функцией генетической организации патогенных бактерий, а обусловлена сложным комплексом взаимодействия паразита и хозяина, причем состояние иммунного статуса хозяина играет столь же важную роль, что и генотип микроорганизма.

Получение информации об организации генома одного из штаммов СГА позволило поставить вопрос о том, насколько такая организация генома присуща другим штаммам СГА. Анализ 10 стрептококковых штаммов, принадлежащих к различным серотипам, позволил выяснить, что полиморфизм рестрикционных фрагментов стрептококковых штаммов мало зависит от серотипа и что часто штаммы, принадлежащие к одному серотипу, отличаются друг от друга более, чем штаммы различных серологических типов (Рис. 8).

Позднее удалось построить предварительные генетические карты геномов этих штаммов.

штаммы СГА различных М ссротипов

Рис. 8 Степень полиморфизма рестрихциошгых фрагментов выявленная после анализа 8гоа1 ДНК фрагментов после разделения методом электрофореза в пульсирующем электрическом поле.

В результате было установлено, что несмотря на существенные отличия в рестрикционных картах, общая организация стрептококковых генов на хромосомах различных штаммов сохраняется. Наибольшей степенью полиморфизма характеризовались ДНК фрагменты, гибридизующиеся с последовательностями стрептококковых бактериофагов. Вероятно, что возникновение генетических отличий между стрептококковыми штаммами во многом обусловлено бактериофагами, интегрирующими в геном. Установлено, что степень полиморфизма рестрикционных фрагментов не зависит от серотиповой принадлежности СГА, что дополнительно свидетельствует об относительности знаний о стрептококках, предоставляемых современной системой серодиагностики.

Возможным путем изучения эпидемиологии стрептококков может стать создание глобальной системы компьютерного анализа и депонирования образов рестрикционных паттернов стрептококков. Создание такой системы с банком образов рестрикционных паттернов, доступным через средства электронной почты типа INTERNET позволит в недалеком будущем легко идентифицировать и классифицировать любые эпидемические штаммы СГА без привлечения серодиагностики.

Таким образом, проведенная работа по генетическому анализу патогенных стрептококков групп А и В создает методические предпосылки и закладывает теоретические основы для группы работ, эпидемиологическою и молекулярно генетического характера, направленных на изучение, точную идентификацию и, в конечно итоге, на эффективную профилактику и лечение стрептококковых заболеваний человека.

ВЫВОДЫ

1. Впервые для изучения генетики стрептококков осуществлена генетическая трансформация стрептококков группы А (СГА) посредством электропорации и проведен анализ хромосомной ДНК СГА методом электрофореза в пульсирующем электрическом поле.

2. Построена первая физическая и генетическая карты хромосомы стрептококка группы А серотипа Ml . Установлен размер генома СГА (1930 т.н.п.), а также определено взаимное расположение более 40 генов.

3. Установлено, что штаммы, принадлежащие к серотипу Ml характеризуются высокой степенью полиморфизма рестрикционных фрагментов, отражающего полиморфизм нуклеогидных последовательностей. Анализ штаммов различных серотипов показал, что степень полиморфизма рестрикционных фрагментов не коррелирует с серотшом .

4. Впервые проведен сравнительный анализ локализации генетических маркеров на хромосомах стрептококков группы А различных серотипов, в результате которого установлено, что геном стрептококков различных серотипов характеризуется консервативностью организации.

5. Впервые осуществлено клонирование и секвенирование гена С5а пептидазы стрептококков группы В (СГВ). Доказано, что С5а пептидаза СГВ высоко гомологична

С5а пептидазе СГА, путем интегративного мутагенеза сконструированы СГВ мутанты, дефектные по способности синтезировать С5а псптидазу и расщеплять С5а и продемонстрировано, что данный белок существенно содействует устойчивости бактерий к фагоцитозу.

6. Впервые проведено клонирование и сехвенирование гена глутаминсинтетазы стрептококков группы В. Показано, что глутаминсинтетаза стрептококков группы В наряду с ферментативной активностью обладает свойствами поверхностных белков стрептококков.

7. Впервые осуществлено клонирование гена ИесА стрептококков группы А. Определена вуклеотидная последовательность данного гена. Сконструированы интегративные мутанты СГА по гену ЯесА, которые можно использовать в качестве удобных штаммов-реципиентов для клонирования генов в стрептококках.

8. Проведено молекулярно-генетическое исследование штаммов стрептококков групп А и В различных серотипов на предмет распространенности ряда генов вирулентности

(стрептолизина О, эритрогенного токсина А, С5а пептидазы, альфа и бета антигена , шутаминсинтетазы). Установлена степень консервативности каждого из этих генов, отражающая их физиологическую значимость . Разработанные для проведения этого исследования на модели стрептококков методические подходы (экспресс-полимеразная цепная реакция, электрофорез в пульсирующем атектрическом поле) могут быть положены в основу молекулярно-эпидемиологического анализа патогенных стрептококков.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Голубков В.И., Суворов А.Н., et al. Клонирование М белка 12 серотипа стрептококка группы А в гетерологичных системах, Москва:Тезисы X Всесоюзной конференции по программе "Плазмида", 1986, С. 64.

2. Суворов А.Н., Голубков В.И., Гупалова Т.В., Нестерчук Л.Б. and Тотолян А.А. Система для введения клонированных генов в хромосому стрептококков группы Н, Пущино на Оке: Тезисы Всесоюзной конференции "Новые подходы в биотехнологии", 1986. С. 46.

3. Totolian А.А., Suvorov A.N., Gupalova T.V., Cleaiy P.P. and Nesterchuk L.B.- Cloning of group A streptococcal genes in heterologous and homologous streptococcal species: H ASM conference on Streptococci and Streptococcal Diseases,1986,Florida,USA,C. 14-14.

4. Гсшубков A.H., Суворов A.H., et al. Клонирование гена M белка в штегративных векторах, Ленинград: "Стратегия возбудителя в организме хозяина" 1987. С. 72-80.

5. Суворов А.Н., Голубков В.И. and Тотолян А.А. Современные данные о клонировании факторов вирулентности патогенных стрептококков, :"Молкулярная генетика, микробиология, Вирусология", 1988. N. 2 С. 3-12.

6. Suvorov A.N., Kok J. and Venema G.- Transformation of group A streptococci by eiectroporation: FEMS Microbiol.Lett.,1988,56,C. 95-100.

7. Suvorov A.N., van Gemen B. and van Knippenberg P.H.- Increased kasugamycin sensitivity in Escherichia coli caused by the presence of an inducible erythromycin resistance (erm) gene of Streptococcus pyogenes: Mol Gen Genet,1988,215,С 152-155.

8. Голубков A.H., Савельева И.А., Суворов А.Н. and Тотолян А.А. Идентификация гена эритрогенного токсина типа А в штаммах стрептококка группы А. : Вестник Академии Медицинских наук, 1989. N. 116, С. 59-62.

9. Ferretti J.J., Huang J.C., Suvorov A.N., Hynes W.L. and Malke H. Genetics of group A streptococcal extracellular products, :3RD International ASM Conference on streptococcal Genetics, 1990. C. 14-14.

10. Suvorov A.N., Cleary P.P. and Ferrieri P. C5a peptidase gene in group В streptococcus, Minneapolis:III International ASM conference on streptococcal genetics., 1990. C. 30-30.

11. Suvorov A.N. and Ferretti J.J. Genetic analysis of Streptococcus pyogenes M 49 chromosomal DNA by pulsed field gel electophoresis, Minneapolis.'III International ASM conference on streptococcal genetics., 1990. C. 28-28.

12. Ferretti J.J., Huang J.C., Suvorov A.N., et al. Extracellular product genes of group A streptococci, Washington DC, USA:Genetics and molecular biology of streptococci, lactococci and enterococci. Edited G.Dunny.P.Cleary, L.McKay, 1991. C. 201-205.

13. Golubkov V.I., Suvorov A.N., Nesterchuk L.B., Dukhin A. and Totolian A.A. Cloning of immunoglobulin G Fc receptor protein of streptococcus pyogenes type M48, Washington DC:Genetics and molecular biology of streptococci,lctococci and enterococei.Edited G.DunnyJ'.Cleary, L.L.McKay. ASM., 1991. C. 230-232.

14. Suvorov A.N., Ravdonikas L., Knippenberg P. and Totolian A.A. Kasugamycin methylase in group A streptococci, Berlin:Abstracts 17th International congress of chemotherapy., 1991. C. 829-829.

15. Suvorov A.N. and Ferretti J.J.- Genetic analysis of Streptococcus pyogenes M49 chromosomal DNA: Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci,1991,C. 233-234.

16. Suvorov A.N., Cleary P.P. and Ferrieri P.- C5a peptidase gene from group В streptococci: Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci, 1991,C. 230-232.

17. Суворов A.H., Шмурыгина И.И. and Клери П.П. Клонироаиие гена С5а пептидаз стрептококков группы В, Пущино-на Оке : Тезисы V конференции Росийской федерации, 1992. С. 133-133.

18. Cleary P.P., Handley J., Suvorov A.N., Podbielski A. and Ferrieri P.- Similarity between the Group В and A streptococcal C5a Peptidase genes: Infect.Immun.,1992,60, C. 4239-4244.

19. Suvorov A.N., Tang C.E. and Ferretti J.J.- Analysis of the streptolysin О (slo) gene of Streptococcus pyogenes: Prot. Eng., 1992,C. 10-14.

20. Suvorov A.N., Tang Y„ Yu C.E. and Ferretti J.J. PCR analysis of the sttreptolysin О (slo) gene of Streptococcus pyogenes, Siena.Italy:New perspectives on streptococci and streptococcal infections: Proceedings of the XI Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, ed. by G.orefici.G.Fisher., 1992. C. 124-125.

21. Gupalova T.V., Suvorov A.N., Ustinovitch I.A., et al- Biotechnological approaches to developing receptors for the different classes of immunoglobulins: Biotechnology St.Petersburg'94,1994, C. 39-40.

22. Gupalova T.V., Golubkov V.I., Suvorov A.N. and Totolian A.A.Construction of the E.coli strains expressing IgG binding and albumin binding proteins: Pathogenic streptococci: present and future edt.by A.Totolian, St.Petersburg.Russia,1994,C. 252-253.

23. Shmurigina I.I., Cleary P.P. and Suvorov A.N.- Analysis of C5a peptidase genes in group В streptococci: Pathogenic streptococci: present and future edt.by A.Totolian, StPetersburg.Russia,1994,С 249-252.

24. Shmurigina I.I., Cleary P.P., Totolian A.A. and Suvorov A.N.Analysis of C5a peptidase genes in group В streptococci: Biotechnology St.Petersburg'94,1994,C 87-88.

25. Suvorov A.N., Klochkova Т., Ravdonikas L. and Totolian A.A.Puised field electrophores analysis of transposon induced kasugamycin resistant mutants: Pathogenic streptococci: present and future edt.by A.Totolian, St.Petersburg.Russia,1994,C 254-255.

26. Гупалова T.B., Суворов A.H., Устинович И. А., Тотолян А.А.. Биотехнолопгческие подходы к созданию рецепторов к различным классам иммуноглобулинов, Пущино -на Оке : Новые подходы в Биотехнолпш, 1994. С. 38-38.

27. Suvorov A.N., Savelieva I.A., Dmitriev A.V., Gupalova T.V. and Totolian A.A. IgA receptor genes in group В streptococci, Santa Fe, USA:Abstracts of the 4th International Conference on Streptococcal Genetics, 1994. C. 33-33.

28. Suvorov A.N., Flores A.E. and Ferrieri P.- Cloning of the glutamine synthetase gene from group В streptococcus: Pathogenic streptococci: present and future edt.by A.Totolian, St.Petersburg.Russia,1994,C. 314-316.

29. Шмурыгина И.И., Суворов A.H., Клери П.П. and Тотолян A.A. Молекуляная характеристика гена С5а пептидазы стрептококков группы В, С.Петербург, Россия: Тезисы международного симпозиума "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями", 1995. С. 45-45.

30. Suvorov A.N., Sverdlova A., Totolian A.A. and Ferretti JJ.Rapid gene analysis of streptococci by PCR: Med.Microbiol.Lett.,1995,4, C. 341-345.

31. Tao L., Hoilingshead S.K., Suvorov A.N., Ferretti J.J. and McSchan W.M.-Construction of a Streptococcus pyogenes recA mutant via insertional inactivation and cloning and sequencing of the complete recA gene: Gene,1995,162, C. 59-62.

32. Дмитриев A.B., Суворов A.H., Устинович И.А. and Тотолян A.A. Молекулярно-эпидемнологическнй анализ генов альфа и бета антигенов патогенных стрептококков группы В, Москва:Издание Российской Академии наук.Тезисы мемориальной конференции им. Баева, 1996. С. 82-83.

33. Воробьев А.В., Тотолян A.A. and Суворов А.Н. Генетический анализ глутаминсинтетазы стрептококков группы В и ее экспрессия в , Изданиеие Российской Академии наук.Тезисы мемориальной конференции им. Баева, 1996. С. 114-115.

34. Гупалова Т.В., Голубков В.И., Суворов А.Н. Тотолян А.А.. Конструирование и свойства рекомбинантного IgG связывающего белка стрептококков группы G, : Вестник Академии Медицинских наук, 1996.N. 3 С. 44-49.

35. Chmourygina I., Suvorov A.N., Ferrieri P. and Cleary P.P.- Conservation of the C5a peptidase genes in group A and В streptococci: Infect.Immun.,1996, C. 2387-2390

36. Dmitriev A.V., Suvorov A.N. and Totolian A.A.- Analysis of pathogenic GBS by PFGE: ХП1 Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal diseases,1996, C.267.

37. Dmitriev A.V., Suvorov A.N., Schalen C. and Totolian A.A.- Analysis of the genes encoding alpha and beta antigens: XIII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal diseases,1996, C.143.

38. Dmitriev A.V., Suvorov A.N. and Totolian A.A. Heterogeneity of the group В streptococcal genome, Kosice:International symposium on novel methods and standartisation in microbiology, 1996. C. 23-23.

39. Ferretti J.J., Clifton S.W., Roe B.A., Suvorov A.N. and McShan W.M.- The Streptococcus pyogenes genome sequencing project: A progress report: XIII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal diseases, 1996, С 36.

40. Satorov S., Suvorov A.N. and Tez.A.N. Diagnostical and epidemiological use of express-PCR and ribotyping in typhoid fever and salmonella infections, Kosice:Intemational symposium on novel methods and standartisation in microbiology, 1996. C. 32-32.

41. Shmurigina I.I., Suvorov A.N., Ferrieri P., Totolian A.A. and Cleary P.P.- Cloning and sequencing of C5a peptidase gene from GBS: ХШ Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal diseases, 1996, ppl41.

42. Shmurigina I.I., Suvorov A.N. and Cleary P.P. C5a peptidase gene from group В streptococcus, Kosice:Intemational symposium on novel methods and standartisation in microbiology, 1996. C. 33-33.

43. Suvorov A.N. and Ferretti J.J.- Physical and genetic chromosomal map of an M type 1 strain of streptococcus pyogenes: J.Bacteriol.,1996,178,C 5546-5549.

44. Suvorov A.N. and Ferretti J.J.- Chromosomal analysis of group A streptococci by pulsed field gel electrophoresis: XIII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal diseases,1996, С 237.

45. Сатаров С. и Суворов А.Н. Использование молекулярно-генетического анализа в диагностике сальмонсллезкых инфекций, Москва, Издание Российской Академии наук.Тезисы мемориальной конференции им. Баева, 1996: С 133-133.

46. Шмурыгина И.И., Суворов А.Н. and Клери П.П. Клонирование гена С5а пептидазы стрептококков группы В, Издание Российской Академии наук.Тезисы мемориальной конференции им. Баева, 1996. С. 138-138.

47. Suvorov A.N., Flores А.Е., Ferrieri P. Cloning of the glutamine synthetse gene from group В streptococci : Infect. Immun., 1997, 65, C. 191-196.

48. Suvorov A.N., Dmitriev A.V., Ustinovitch I.A., Schalen C„ Totolian A.A. Molecular analysis of clinical group В streptococcal straims by use of a and b gene probes : FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997, 17, С 149-154.

49. Chmourygina I.I., Suvorov A.N. Ferrieri P.P., Cleary P.P. Conservation of the C5a peptidase genes in group A and В streptoccocci: Infect.Immun., 64, C. 2387-2390.