Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая характеристика стрептококков группы В; картирование генома

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Генетическая характеристика стрептококков группы В; картирование генома"

РГЗ од

2 Ь НО Я '007

На правах рукописи

ДМИТРИЕВ Александр Валентинович

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В; КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОМА

Специальность 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте экспериментальной медицин: Российской Академии медицинских наук.

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук А.Н.Суворов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Н.Рыбчин, доктор биологических наук А.П.Перевозчиков

Ведущее учреждение-.

Санкт-Петербургский Институт эпидемиологии и микробиологии им.Пасте! Минздравмедпрома РФ.

Защита диссертации состоится "."/6. ." 1997 г. в ..... часов на заседаю

Диссертационного совета К.001.23.01 по защите диссертаций на соискание ученой степеи кандидата наук при Научно-исследовательском Институте экспериментальной медицин РАМН по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ РАМН.

Автореферат разослан "....."......... 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

О.Г.Куликова.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. В последние десятилетия работами ведущих микробиологических лабораторий мира продемонстрировано значительное распространение стрептококков группы В (СГВ) среди людей. По данным ряда авторов, четвертая часть населения планеты независимо от возрастных категорий инфицирована этим микробом (Baker С., Barrett F., 1983, Easmon С., 1983, Jelinkova J., 1977). Наиболее остро стоит вопрос о роли стрептококков группы В в патологии беременности и новорожденных, в том числе и в этиологии инвазивных инфекций. Особую опасность в этом случае представляют матери-носители инфекта. Заражение ребенка происходит либо внутриутробно, либо при прохождении через родовые пути. У детей заболевание чаще всего протекает в форме менингита и сепсиса и в 20-50% случаев заканчивается летально (Ferrieri Р., 1985, Klein J., 1984).

По существу, борьба с СГВ - инфекцией есть борьба за здоровое материнство и детство. Следовательно, изучение биологии и патогенетических свойств стрептококка группы В актуально не только с научно-медицинской, но и с экономической, и с социальной точек зрения.

Хорошо известно, что вирулентность стрептококков группы В коррелирует с их способностью продуцировать полисахаридную капсулу (Durham D., Straus D., 1981). Однако, наряду с полисахаридами, СГВ синтезируют большую группу патогенно активных веществ белкового происхождения, таких как а и ß антигены, С5а пептидаза, нуклеазы, протеазы, CAMP фактор и др., роль которых в формировании вирулентности изучена крайне недостаточно.

Несмотря на значительные достижения в области генетики патогенных стрептококков, о генетике стрептококков группы В известно очень мало. К настоящему времени почти нет данных о распространённости генов, кодирующих факторы патогенности, среди штаммов стрептококков группы В различных серологических типов. Также мало известно о размере, строении и составе генома стрептококков группы В. Физическое и генетическое картирование генома стрептококков этой группы до настоящего времени не осуществлено. Соответственно, на их хромосомной карте до сих пор не локализованы гены потенциальных факторов патогенности. Экспериментальные данные о корреляции между серологическим типом СГВ и особенностями строения его генома

отсутствуют. Именно этой малоизученной области генетики патогенных стрептококков группы В и посвящено настоящее исследование.

Целью настоящего исследования является картирование и анализ гетерогенности генома стрептококков группы В. Для этого предстояло выполнить следующие задачи:

1) проанализировать штаммы СГВ методом электрофореза ДНК в пульсирующем электрическом поле и локализовать ряд генов на рестрикционных ДНК фрагментах, оценить степень гетерогенности рестрикционных паттернов ДНК и паттернов ДНК-ДНК гибридизации;

2) осуществить картирование генома СГВ; сравнить физические и генетические карты генома штаммов различных серологических типов;

3) оценить наличие и уровень корреляции особенностей строения генома штаммов СГВ и индивидуальных серологических характеристик;

4) определить количество копий рибосомальных оперонов в геноме СГВ;

5) установить распространённость генов, кодирующих а и Р антигены СГВ -потенциальные факторы патогенности, среди штаммов различных серологических типов;

6) разработать экспресс-метод иммунологической детекции штаммов стрептококков группы В, связывающих иммуноглобулины А;

7) сравнить данные молекулярно-генетической детекции bac гена, кодирующего IgA связывающий белок, с результатами иммунологической детекции;

Научная новизна и теоретическая ценность работы.

1) В ходе настоящего исследования разработан экспресс-метод иммуноблотинга, позволяющий быстро выявлять IgA связывающие штаммы СГВ.

2) Изучена распространённость генов Ьса и bac, кодирующих аир антигены, соответственно. Показано, что наличие гена bac в геноме коррелирует с размером EcoRI фрагмента ДНК, содержащего Ьса ген. Обнаружено, что наличие bac гена и кодируемого им IgA рецегггорного белка являются маркерами, позволяющими разделить стрептококки группы В на две субпопуляции.

3) Методом электрофореза в пульсирующем электрическом поле проанализированы геномные ДНК штаммов СГВ. Обнаружена высокая степень гетерогенности рестрикционных паттернов ДНК и паттернов ДНК-ДНК

гибридизации. На ДНК рестрикционных фрагментах СГВ локализованы 10 генов. Показано наличие в геноме СГВ 6 копий рибосомальных оперонов.

4) Построены первые физическая и генетическая карты генома штамма 78 / 471, серотип II /( а + Р). Размер генома оказался равным 2200 т.н.п.

5) Построенные физическая и генетическая карты генома штамма 78 / 471, серотип II / (а + Р), сопоставлены с предполагаемыми физической и генетической картами генома штамма СГВ 1 / 6586, серотип III / а. Установлено, что, несмотря на высокую степень гетерогенности рестрикционых паттернов ДНК и паттернов ДНК-ДНК гибридизации, общая организация генома стрептококков группы В характеризуется консервативностью расположения генов.

Практическая ценность.

Исследование носит теоретический характер. Однако, экспресс-метод иммуноблотинга, позволяющий быстро оценить способность штаммов СГВ связывать иммуноглобулины А человека, может быть использован в клинической практике дня дифференцировки штаммов по наличию у них IgA рецепторного белка - одного из потенциальных факторов патогенности.

Положения, выносимые на защиту.

1) IgA связывающий белок всегда экспрессируется штаммами СГВ при наличии у них bac гена, что указывает на биологическую значимость IgA связывания для жизнедеятельности стрептококков группы В. Установлено, что IgA связывающая способность штаммов СГВ и наличие bac гена являются маркерами, позволяющими разделить популяцию стрептококков группы В на 2 субпопуляции.

2) Полученные методом пульс-электрофореза рестрикционые паттерны ДНК и паттерны ДНК-ДНК гибридизации СГВ штаммов 78 / 471, серотип II / (а+3), и 1 / 6586, серотип III I а, обладают высокой степенью гетерогенности, однако, общая организация генома стрептококков группы В характеризуется консервативностью расположения генов.

3) Существующая серологическая классификация стрептококков группы В не отражает особенности строения генома различных штаммов.

Достоверность полученных результатов подтверждается следующим:

1) Высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов исследования (полимеразная цепная реакция, ДНК-ДНК гибридизация, иммуноблотинг и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные.

2) Применением наиболее современных способов компьютерного анализа (использование банка данных GENBANK, компьютерной программы SEQAID и т.д.).

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 10 научных работах и доложены на 8 симпозиумах и конференциях: 4-ой Международной Конференции по стрептококковой генетике, Санта Фе, США, в 1994 г.; Конференции "Новые направления биотехнологии", Пущино, Россия, в 1994 г.; Международной Конференции "Биотехнология-94", Санкт-Петербург, Россия, в 1994 г.; Международной Конференции памяти акад. А.А.Баева, Москва, Россия, в 1996 г.; Международном Симпозиуме по оригинальным методам и стандартизации в микробиологии, Кошице, Словацкая Республика, в 1996 г.; XIII Международном Симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, в 1996 г.; VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, Россия, в 1997 г., 8-ой Европейской Студенческой Конференции, Берлин, Германия, в 1997 г. Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1994, 1995,1996, 1997 гг.).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 114 страницах машинописного текста, включающего: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 4 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы. Работа проиллюстрирована 13 таблицами и 16 рисунками, указатель литературы содержит 172 источника, в том числе 4 отечественных и 168 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали 69 штаммов стрептококков группы В различных

серологических типов и штамм E.coli DH5a.

Для культивирования стрептококков использовали среду ТНВ (Todd Hewitt Broth, Difco, USA). При изготовлении плотных агаризованных сред к расплавленному 2,5 % агару добавляли свежую кровь барана или отмытые от консерванта эритроциты барана (5%). Клетки E.coli выращивали в LB бульоне. При выращивании E.coli, несущих плазмиды с маркерами ампициллинустойчивости в питательную среду добавляли ампициллин в концентрации 75 мг / мл.

Для иммуноблотинга бактериальных колоний нитроцеллюлозный фильтр с перенесёнными на него колониями инкубировали в 0,1% SDS и 0,2н NaOH. Затем фильтр отмывали физиологическим раствором при рН=7,4 и инкубировали в 4% растворе обезжиренного молока, содержащего ДНКазу. После этого фильтр выдерживали 2 часа при комнатной температуре в 4% растворе обезжиренного молока, содержащего иммуноглобулины А человека (0,1 г/л), меченые пероксидазой хрена. Для иммунологической детекции IgA связывающих штаммов стрептококков группы В использовали окрашивающий раствор, содержащий 3 г/л пара-фенилендиамина и 0,15% Н2О2.

Для выделения хромосомной ДНК клетки лизировали добавлением лизоцима 1 мг/мл, EDTA до ЮшМ, SDS до 1%. Депротеинизацшо ДНК осуществляли с помощью протеиназы К (0,5 мг/мл). ДНК обрабатывали фенолом и хлороформом, а затем экстрагировали этанолом. Выделение плазмидной ДНК проводили по Birnboim Н.С. 1979. Выделение ДНК из агарозного геля осуществляли с использованием препарата "QIAGEN" (USA), согласно прилагаемой инструкции.

При приготовлении ДНК препаратов для электрофореза в пульсирующем электрическом поле бактериальные клетки ресуспендировали в растворе, содержащем 25 тМ Трис-HCl, рН=8, ЮгаМ EDTA, 50 иМ глюкозы. К суспензии добавляли 1 объём 1,5% раствора легкоплавкой агарозы при 55°С и разливали по формочкам для приготовления блок-вставок. После застывания приготовленные препараты инкубировали 16 часов при 37°С в растворе, содержащем ЮтМ Трис-HCl, рН=7,б, IM NaCl, 0,5% саркозин и лизоцим в концентрации 1мг/мл. Затем, обработанные таким образом препараты инкубировали 24 часа при 65°С в растворе 0,5М EDTA, содержащем 0,5% саркозина и протеиназу К (Boehringer Mannheim, Germany) в концентрации 1мг/мл.

Электрофорез ДНК проводили в 0,7-1,5% агарозном геле в горизонтальном аппарате с использованием Трис-боратного буфера. Электрофорез ДНК в пульсирующем электрическом поле проводили в 1% агарозном геле в аппарате Geneline (Beckman, USA) с использованием TAFE буфера (ЮтМ Трис, 0,025% уксусной кислоты, 0,4 mM EDTA).

Гидролиз ДНК рестриктазами проводили по Маниатис Т. с соавт., 1982. Для пульс-электрофореза гидролиз препаратов ДНК достигался инкубированием в течение 4 часов 10 мм3 агарозных блок-вставок, содержащих ДНК, в 100 мкл ТЕ буфера, содержащего 20 ед. той или иной рестриктазы. Оптимальные температуры гидролиза для рестриктаз Smal и SgrAI составляли 25°С и 37°С, соответственно.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по Kawasaki Е. 1990. К 0,1-0,5 мкг хромосомной ДНК добавляли 5-10 пикомолей каждого из специфических примеров, фланкирующих исследуемую последовательность, буфер для полимеразы, по 0,2 шМ каждого из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, объем смеси доводили водой до 50 мкл. Смесь инкубировали при +94°С в течение 3 минут. Добавляли по 0,5-2 ед. термостабильной ДНК полимеразы (Ttb или Tag). Амплификатор фирмы Perkin Elmer (USA) программировали на температуру денатурации +94°С - 1 минута, температуру отжига +48°С - 4-65°С - 1 минута, температуру синтеза ДНК - +72°С - 1 минута. Последовательность таких циклов повторялась 30 раз.

Гибридизацию ДНК проводили по Southern Е., 1975. Для всех гибридизационных процедур использовали набор "DNA Labeling and Detection Kit Nonradioactive" (Boehringer Mannheim, Germany). При этом ДНК зонд метили дигоксигенином, а участки ДНК-ДНК гибридизации выявляли с помощью щелочной фосфатазы в присутствии субстрата Х-фосфата и красителя NBT..

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ штаммов стрептококков группы В на присутствие генов, кодирующих а и ß антигены.

Для выяснения широты распространения генов Ьса и bac, кодирующих аир

антигены, соответственно, среди стрептококков группы В, были

проанализированы 69 штаммов, относящихся к основным серотипам I, II, III и нетипируемым по полисахаридной капсуле. Данные штаммы представляли собой изоляты СГВ, выделенные от больных и носителей в различных регионах мира -России, Китае, Швеции и США: Все штаммы, вошедшие в коллекцию, анализировали на наличие генов bac и Ьса методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ДНК-ДНК гибридизации, что позволило установить распространённость данных генов среди различных эпидемических штаммов.

ДНК фрагмент гена bac размером 1500 н.п., кодирующий IgA связывающий домен, был амплифицирован методом ПЦР и использован в качестве ДНК зонда при гибридизации. Как методом ПЦР, так и методом ДНК-ДНК гибридизации обнаружено, что ген bac присутствует у 32% штаммов СГВ, что подтверждает достоверность полученных данных. Наиболее часто ген bac встречается у штаммов серотипов Ib и II, гораздо реже - у штаммов серотипа 1а и никогда не встречается у штаммов серотипа III. Использование теста на экспрессию стрептококками группы В р антигена, связывающего IgA, показало, что в 100% случаев наличие этого белка у СГВ коррелирует с присутствием гена bac в геноме. Данный факт указывает на важное значение способности связывать иммуноглобулины класса А для реализации физиологических функций стрептококков группы В.

Ген Ьса, кодирующий а антиген, также выявляли методами ПЦР и ДНК-ДНК гибридизации. Обнаружено, что ген Ьса встречается у всех штаммов СГВ, за исключением штаммов серотипов II и III, содержащих R белок. Ранее было показано, что и а антиген, и R белок являются поверхностными белками, обладают сходными функциями (устойчивость к действию трипсина) и проявляют сходные паттерны при анализе их методом SDS-PAGE (Fenieri P., Flores А., 1996, Flores A., Ferrieri Р., 1989, Madoff L.C. et al., 1991, Michel J.L. et al., 1994). Таким образом, полученные нами данные позволяют предположить, что СГВ обладают семейством физиологически значимых белков, сходных по структуре и свойствам, но различных по антигенному строению. Данное предположение находит подтверждение в литературе, где указывается на наличие у стрептококков группы В иммунологически отличных поверхностных белков, устойчивых к действию трипсина и проявляющих сходные структуры (напоминающие по внешнему виду лестницу) при анализе их методом SDS-PAGE (Erdogan S. et al., 1996, Lachenauer C.S., Madoff L.C., 1996, Stalhammar-Carlemalm M. et al., 1993, Wastfelt M. et al., 1996).

В результате анализа, проведённого методом ДНК-ДНК гибридизации хромосомных ДНК СГВ эндонузслеазой EcoRI было установлено, что размеры EcoRI фрагментов, гибридизующихся с Ьса зондом, различны (15 т.н.п. и 11 т.н.п.). Обнаружена корреляция между размером фрагмента, гибриднзующегося с Ьса зондом и наличием гена bac. Все штаммы СГВ, обладавшие фрагментом размером 15 т.н.п., гибридизующимся с Ьса зондом, обладали одновременно и bac геном. Штаммы, обладавшие гибридизующимся фрагментом размером И т.н.п., не имели bac гена (Табл. 1).

Таблица 1

Корреляция между наличием гена bac и размером EcoRI фрагмента, гибриднзующегося с зондом на ген Ьса

Штаммы СГВ Серотип Размер EcoRI фрагмента, гибридизующегося с зондом на ген Ьса

обладающие геном bac, связывающие IgA la, Ib, II 15 т.п.п.

не обладающие геном bac, ' не связывающие IgA la, Ib, II, III 11 т.н.п.

Различное распределение рестрикционных фрагментов, гибридизующихся с Ьса зовдом при наличии в геноме гена bac, позволяет предположить, что штаммы СГВ, содержащие ген bac и не содержащие этот ген, представляют собой отдельные субпопуляции, разделившиеся в процессе эволюции стрептококков группы В.

2. Анализ штаммов стрептококков группы В методом электрофореза в пульсирующем электрическом поле.

Проведение анализа генома стрептококков группы В методом электрофореза в пульсирующем поле позволило осуществить изучение стрептококковой хромосомной ДНК штаммов, принадлежащих к различным серологическим типам. Были выбраны следующие штаммы, представляющие различные субпопуляции - обладающий геном bac штамм 78 / 471 (IgA связывающий, серотип II / а+Р) и не обладающий геном bac штамм 1 / 6586 (IgA несвязывающий, серотип III / а). Эти штаммы были проанализированы методом электрофореза в пульсирующем электрическом поле с использованием рестриктаз

Smal и SgrAI, гидролизуюпщх хромосомные ДНК штаммов 78 / 471 и I / 6586 на 14 Smal, 8 SgrAI и 13 Smal, 7 SgrAI фрагментов, соответственно. Размеры рестрикционных фрагментов были рассчитаны с использованием компьютерной программы "SEQAID"; размер генома обоих штаммов оказался приблизительно равен 2200 т.н.п., что существенно меньше размера генома E.coli (4700 т.н.п.), B.subtilis (5700 т.н.п.) и несколько больше размера генома Streptococcus pyogenes (1920 т.н.п.). Учитывая паразитарный тип существования стрептококков группы В, не требующий полного комплекса генов, кодирующих различные ферментные белки, естественным представляется небольшой размер их хромосомы, близкий размеру Streptococcus pyogenes, адаптированного к паразитированию в организме человека.

Методом ПЦР были приготовлены ДНК зонды на гены стрептококков групп А и В, Bacillus subtilis и Enterococcus hirae. Методом ДНК-ДНК гибридизации на рестрикционных Smal и SgrAI фрагментах были локализованы гены auß антигенов (Ъса, bac), С5а пептидазы (scpB), CAMP фактора (cß>), аланиндегидрогеназы (aid), глутаминсинтетазы (glnA), валил-т-РНК синтетазы (va/5), ДНК полимеразы (polA) и по 6 копий генов 23S рРНК (rrl) и 16S рРНК (rrs) (Табл. 2). Было обнаружено, что рестрикционные паттерны анализируемых штаммов СГВ обладают высокой степенью гетерогенности не только по электрофоретической подвижности ДНК фрагментов, но и по данным ДНК-ДНК гибридизации. Лишь 5 Smal фрагментов (230, 57, 45, 5,1 и 3,6 т.н.п.) и 3 SgrAI фрагмента (75, 70, 5,1 т.н.п.) присутствовали в обоих рестрикционных паттернах и гибридизовались с одинаковыми ДНК зондами (valS, rrs, rrl).

ДНК зонды на "house keeping" гены стрептококков группы А (glnA), Bacillus subtilis (polA, aid, valS) и Enterococcus hirae (rrs, rrl) хорошо гибридизовались с хромосомной ДНК стрептококков группы В, указывая тем самым на высокую консервативность этих генов среди храмположитеяьных и грамотрицательных микробов. Что касается генов emm, Jbp54 и hylP, кодирующих специфические для стрептококков группы А факторы патогенности (белок М, фибриноген / фибронектин связывающий белок, гиалуронидаза), то они не были обнаружены у СГВ при ДНК-ДНК гибридизации. Аналогично, гены bca, bac и cfb, кодирующие факторы патогенности СГВ (аир антигены, CAMP фактор) не были обнаружены в геноме СГА методом ДНК-ДНК гибридизации. Так как, за исключением высококонсервативного гена С5а пептидазы, гены, кодирующие факторы патогенности СГА и СГВ, оказались различными, то и механизмы формирования

вирулентности микроба и патогенеза заболеваний, вызываемых этими микробами, вероятно, также должны существенно различаться.

Таблица 2

Локализация генов на Бта! и 8§гА1 ресгрикционных фрагментах

Штамм 116586, (серотип III / а) Штамм 78 / 471, (серотип П1 а + Э)

Локус Активность (функция) Размер рестрикционных фрагментов (т.н.п.)

Smal SgrAI Smal SgrAI

ф CAMP фактор 945 1900 450 1800

Ьса a антиген 275 45 600 70

bac Pантиген — ~ 75 75

glnA Глутаминсинте-таза 945 1900 450 1800

scpS С5а пептидаза 945 1900 470 1800

polA ДНК полиме-раза 67 75 75 80

aid Аланиндегидро-геназа 63 67 60 65

valS Валил т-РНК синтетаза 230 1900 230 1800

rrs 16SpPHK 72; 67; 67; 63; 57; 45 94; 75; 70; 67; 45; 5,1 75; 60; 54; 45; 7,7; 5,1 100; 80; 80; 70; 65; 5,1

rrl 23S рРНК 72; 67; 67; 52; 5,1; 3,6 94; 75; 70; 67; 45; 5,1 75; 75; 57; 54; 5,1; 3,6 100; 80; 80; 70; 65; 5,1

Результаты гибридизационного анализа хромосомных ДНК 12 штаммов СГВ с зондами на гены рибосомального оперона (rrl, rrs) продемонстрировали наличие гибридизующихся Smal и SgrAI фрагментов различных размеров, в том числе Smal фрагментов размерами 7,7; 5,1; 3,6 т.н.п. Рестрикционные Smal фрагменты размерами 5,1 и 3,6 т.н.п. присутствовали во всех штаммах СГВ, тогда как 7,7 т.н.п. Smal фрагмент присутствовал только в геноме штаммов, обладающих bac геном и связывающих IgA. Этот факт является дополнительным доказательством генетических различий между штаммами, принадлежащими к популяциям IgA связывающих и IgA несвязывающих штаммов.

Дополнительные исследования методами классического

фингерпринтирования, ДНК-ДНК гибридизации и лазерной денситометрии показали присутствие в геноме штаммов СГВ 6 копий рибосомальных оперонов и

наличие в нуклеотадной последовательности рибосомальных оперонов Sraal сайта. Наличие 6 копий рибосомальных оперонов в геноме является также характерной чертой и для других видов грамположительных кокков, что позволяет расценивать данную особенность как важный таксономический признак данной группы микробов.

Чтобы подтвердить, что наличие гена bac и экспрессия ïgA связывающего белка являются признаками, позволяющими разделить стрептококки группы В на две субпопуляции, был проведён сравнительный анализ 20 штаммов методами пульс-электрофореза и ДНК-ДНК гибридизации с зондами на гены bac (ген р антигена), Ъса (ген а антигена) и glnA (ген глутаминсинтетазы).

Обнаружено, что Smal рестрикционные паттерны IgA связывающих штаммов СГВ отличаются от Sraal паттернов IgA несвязывающих штаммов, что согласуется с результатами классического фингерпринтирования. Данные ДНК-ДНК гибридизации позволили разделить все штаммы СГВ на 4 генетические линии (Рис. 1).

Штаммы СГВ

субпопуляция В2

субпопуляция В1

bac

В21

В22

В23

( bac ', bca *) (bac, bcat+) (bac, bca2+ ) II, III III I, II

Генотип

Серотип

bac+

В11

фас*, Ьса3+) I. H

Рис. 1. Генетические типы стрептококков группы В.

Штаммы серотипа I, как оказалось, имеют генотип В11 или В23, штаммы сдэотила II - генотипы В11, В21 или В23, а штаммы серотипа III - генотип В21 или В22. Очевидно, что серологическая характеристика штаммов СГВ не отражает

особенности строения их геномов, возможные эволюционные процессы и степень генетического родства между различными штаммами.

Обнаружено, что для каждой генетической линии СГВ характерен свой размер Sraal фрагмента, гибридизующегося с зондом на ген Ьса. Интересно отметить, что у IgA связывающих штаммов размеры Smal фрагментов, гибридизующихся с зондом на ген glnA, оказались отличными от размеров Smal фрагментов, гибридизующихся с зондом на ген glnA, у IgA несвязывающих штаммов. На основании приведённых данных можно предположить, что популяция стрептококков группы В на ранних стадиях эволюции разделилась на две субпопуляции. Первая из них представлена стрептококками, обладающими bac геном (субпопуляция Bl), а вторая - не обладающая bac геном (субпопуляция В2). Возможно, в дальнейшем субпопуляция В2 разветвилась на генетические линии В21, В22 и В23 (Рис. 1). Ниже приведённые данные являются доказательством генетических различий между штаммами СГВ, обладающими bac геном, и штаммами СГВ, не обладающими bac геном:

1) PFGE рестрикционные паттерны IgA. связывающих (позитивных по гену bac) штаммов СГВ существенно отличаются от аналогичных паттернов IgA несвязывающих (негативных по гену bac) штаммов;

2) все штаммы СГВ, имеющие в геноме 15 т.н.п. EcoRI фрагмент, гибридизующийся с зондом на Ьса ген, обладают bac геном, а штаммы, имеющие 11 т.н.п. EcoRI фрагмент, гибридизующийся с зондом на Ьса ген, не имеют bac ген;

3) Smal рестрикционные фрагменты размером 7,7 т.н.п. присутствуют в геноме всех штаммов, обладающих bac геном, и отсутствовуют у всех штаммов, не обладающих bac геном;

4) все штаммы СГВ, обладающие bac геном, имеют в геноме 600 т.н.п. Smal фрагмент, гибридизующийся с зондом на Ьса ген (генотип В11, Ьас+,Ьса3+). Штаммы, не имеющие bac гена, либо не обладают Ьса геном (генотип В21, bac, Ьса'), либо имеют в геноме Smal фрагменты размером 275 т.н.п. или 170 т.н.п., гибридизующиеся с зондом на Ьса ген (генотипы В22, bac,Ьса,* и В23, bac,bca2+, соответственно);

5) у IgA связывающих (позитивных по гену bac) штаммов СГВ размеры Smal фрагментов, гибридизующихся с зондом на ген glnA, отличаются от таковых у IgA несвязывающих (негативных по гену bac) штаммов.

Более широкий молекулярно-биохимический анализ большей коллекции штаммов СГВ с определением гораздо большего количества характеристик,

несомненно, представляет существенный научный интерес и является целью будущих исследований.

В результате анализа штамма 78 / 471, серотип II / (а + Р), впервые в мире были построены циркулярные физическая и генетическая карты генома стрептококка группы В (Рис. 2). В исследовании были использованы две эндонуклеазы: БтаГ и Б^АГ Эти ферменты гидролизовали геном штамма 78 / 471 на 14 и 8 фрагментов, соответственно. Для построения карты применялись такие подходы, как одиночный и двойной гидролиз хромосомной ДНК, выделение рестрикционных фрагментов ДНК из агарозы и использование их в качестве ДНК зондов, а также гибридизация с ДНК зондами на известные гены.

Рис. 2. Циркулярные физическая и генетическая карты хромосомы СГВ штамма 78/471.

После построения генетической карты генома СГВ было обнаружено, что гены bac, bca, scpB, cjb, кодирующие потенциальные факторы патогенности, локализуются на различных участках генома, что сильно отличает его от генома СГА, в котором гены факторов патогенности оказались компактно локализованы в одной области генома (Suvorov A., Ferretti J., 1996). "House keeping" гены, такие,

как polA, aid и 6 копий рибосомальных оперонов у СГВ, как оказалось, локализуются на небольшом участке генома, составляющем менее 20% его размера.

В ходе настоящего исследования были построены также линейные физическая и генетическая карты генома штамма СГВ 1 / 6586, серотип III / а. Полученные карты сопоставлены с аналогичными картами генома штамма 78/471, серотип II / (а + ß) и обнаружено, что, несмотря на высокую степень гетерогенности рестрикционнмх паттернов и паттернов ДНК-ДНК гибридизации, геном штаммов СГВ различных серотипов характеризуется общностью организации и консервативностью расположения генов (Рис. 3).

78 / 471, серотипII /( а + ß)

bac.rrn (l-6),polA,ald scpß ффА ^ ¿ca

470 450 230 540 160

SgrAI

116586, серотип Ш la

rrn(l-6),polA,ald

scpB, cfl>, glnA valS bca

945 230 325 230 4£

7

ЭдгА!

Рис- 3. Физические и генетические карты генома двух штаммов СГВ. Вертикальные линии обозначают 8та1 сайты.

Таким образом, результаты выполненного исследования обладают высоким научным приоритетом и создают предпосылки для дальнейшего молекулярно-генетического анализа патогенных стрептококков группы В, в частности, для разработки системы точной идентификации штаммов СГВ, секвенирования генома СГВ и др.

ВЫВОДЫ

1. Построены первые физические и генетические карты хромосомы стрептококков группы В двух серологических типов - II / (а + (3) и III / а. Размер генома стрептококков группы В составляет 2200 т.н.п.

2. Несмотря на высокую степень гетерогенности рестрикционных паттернов ДНК и паттернов ДНК-ДНК гибридизации, геном стрептококков группы В различных серотипов характеризуется консервативностью расположения генов.

3. Ген Ьас и кодируемый им IgA связывающий белок являются маркерами, позволяющими дифференцировать стрептококки группы В на 2 субпопуляции.

4. Серологическая характеристика штаммов стрептококков группы В не отражает эволюционные связи и степень генетического родства между штаммами различных серологических типов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. A.Suvorov, I.Savelieva, A.Dmitriev, T.Gupalova, and A.Totolian. IgA receptor genes in group В Streptococci. Abstracts of 4th International Conference on Streptococcal Genetics, Santa Fe, New Mexico, USA, 1994, P. 33.

2. Т.В.Гупалова, А.Н.Суворов, И.А.Усгинович, С.Н.Орлова, А.В.Дмитриев, А.А.Тотолян. Биотехнологические подходы к созданию рецепторов различных классов иммуноглобулинов. Тезисы докладов VI конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии", Пущино-на-Оке, 1994, С. 38.

3. T.V.Gupalova, A.N.Suvorov, I.A.Ustinovich, S.N.Orlova, A.V.Dmitriev, A.S.Andreev, A.A.TotoIian. Biotechnological approaches to developing receptors for the different classes of immunoglobulins. Abstracts of International Conference "Biotechnology, St.Petersburg'94", St.Petersburg, 1994, P. 39-40.

4. А.В.Дмитриев, А.Н.Суворов, И.А.Устинович, А.А.Тотолян. Молекулярно-эпидемиологический анализ генов альфа и бета антигенов патогенных стрептококков группы В. Тезисы Международной Конференции, посвященной памяти акад. А.А.Баева. 1996, С. 80.

5. AV.Dmitriev, A.N.Suvorov, A.A.TotoIian. Heterogeneity of the group В streptococcal genome. Abstracts of International Symposium on the Novel Methods and Standardization in Microbiology, Kosice, Slovak Republik, 1996, P. 23.

6. A.V.Dmitriev, A.N.Suvorov, C.Schalen, A.A.Totolian. Analysis of the genes encoding alpha and beta antigens. Abstracts of Xlllth Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Paris, France, 1996, P. 143.

7. Дмитриев А., Суворов А., Тотолян А. Лабораторная диагностика факторов патогенности стрептококков группы В. Материалы VII Всероссийского Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 1997, С. 377-378.

8. A.N.Suvorov, A.V.Dmitriev, I.A.Ustinovich, C.Schalen, A.A.Totolian. Molecular analysis of clinical group В streptococcal strains by use of alpha and beta gene probes, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1997, 17, P. 149-154.

9. A.V.Dmitriev, Jane V.Pak, A.N.Suvorov, C.Schalen, A.A.Totolian. Analysis of pathogenic group В streptococci by pulsed field gel electrophoresis. In: Advances inexperimental medicine and biology: Streptococcci and the host, edited by Th.Horaud etal., 1997, 418, P. 351-353.

10. A.V.Dmitriev. Chromosomal map peculiarities of the group В streptococci. Abstracts of 8й European Students Conference of the Charite, Berlin, Germany, 1997, P. 13.