Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура острова патогенности XII стрептококков группы B

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структура острова патогенности XII стрептококков группы B"

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

<У "

КУЛЕШЕВИЧ Евгения Владимировна

СТРУКТУРА ОСТРОВА ПАТОГЕННОСТИ XII СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В

03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-8 ИЮЛ 2015

005570456

Санкт-Петербург 2015

005570456

Работа выполнена в отделе молекулярной микробиологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины»

Научный руководитель: Суворов Александр Николаевич,

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Нарвская Ольга Викторовна, доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Сбойчаков Виктор Борисович, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой микробиологии ФГБВОУ ВПО Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов Федерального медико-биологического агентства

Защита состоится « » С-бИМ Л (УрЛ. 2015 г. в //. 00 на заседании

диссертационного совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Биологический факультет, аудитория Щ ')

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета и на сайте spbu.ru

Автореферат разослан «_ / » ЫШЛ- 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Е. И. Шарова

Общая характеристика работы Актуальность темы

Стрептококки группы В (СГВ) или Streptococcus agalactiae, впервые выделенные у коров, больных маститом, длительное время рассматривались исключительно как возбудители заболеваний животных. И лишь начиная с 90-х годов XX века для научного сообщества стало очевидным, что СГВ способны вызывать тяжелые инфекции у человека (Тотолян и др., 2009). Большинство исследователей относят эти бактерии к условно-патогенным микроорганизмам (Покровский и др., 2006), которые вызывают в определенных условиях целый ряд заболеваний (Тотолян и др., 2009). Инфекция СГВ у беременных может приводить к тяжелым патологиям новорожденных в форме сепсиса, менингита и пневмонии. Смертность новорожденных при развитии заболеваний достигает 4-6% (Verani et al., 2010). СГВ также являются причиной многих заболеваний взрослых людей, а именно пневмонии, перитонита, артрита, менингита, эндокардита, абдоминального абсцесса, кистозного фиброза, некротизирующего фасциита, инфекций урогенитапьного тракта, кожи, мягких тканей и костей (Bishop et al., 2007; Martins et al., 2007; van der Mee-Marquet et al., 2008; Eickel et al., 2009; Imam et al., 2012; Sambola et al., 2012; Ulett et al., 2012; Cheng et al., 2013).

Установлено, что СГВ вызывают заболевания у самых различных видов млекопитающих: крупного рогатого скота, собак, кошек, слонов, кур, верблюдов, лошадей, обезьян, нутрий, хомяков, мышей, морских млекопитающих, крокодилов, лягушек и различных рыб (Bishop et al., 2007; Evans et al., 2008; Richards et al., 2011; Pereira et al., 2013). Таким образом, СГВ обладают способностью колонизировать различные экологические ниши и являются причиной развития инфекционного процесса как у людей, так и животных, что во многом обусловлено особенностями генетической организации стрептококков группы В, содержащих в геноме множественные мобильные генетические элементы.

Мобильные генетические элементы (плазмиды, транспозоны, бактериофаги и острова патогенности) вносят существенный вклад в формирование вирулентного фенотипа патогенных микроорганизмов. Острова патогенности характеризуются целым рядом структурных и генетических особенностей, в частности, наличием генов патогенности и генов, кодирующих системы секреции (Hacker, Carniel, 2001; Chen et al., 2007). Они могут мигрировать как в пределах одного генома, так и участвовать в генетическом обмене. Острова патогенности участвуют в эволюции бактерий, способствуя выживанию микроорганизма в организме хозяина. Миграция островов приводит к образованию высоковирулентных эпидемических штаммов бактерий за счет получения генов патогенности от других бактерий. На острове патогенности XII СГВ локализован

ген sspBl, кодирующий поверхностный адгезин, относящийся к системе секреции V типа, а также кластер генов, кодирующих систему секреции IV типа. Высказано предположение, что продукты генов sspB семейства влияют на развитие внутриутробной инфекции в организме плода или новорожденных детей и могут способствовать адгезии СГВ к эпителию мочеполового тракта (Зациорская и др., 2006; Suvorov et al., 2006). Присутствие гена sspBl, а также генов других факторов патогенности на данном острове может усиливать вирулентность СГВ, способствуя формированию эпидемически актуальных штаммов. Однако информации об организации данного острова патогенности и его распространенности среди штаммов СГВ в научной литературе недостаточно. Учитывая тот факт, что остров патогенности XII по всем имеющимся признакам относится к мобильным генетическим элементам, способным влиять на степень патогенности бактерии, в настоящей работе была поставлена задача изучения распространенности и организации острова патогенности XII в геноме стрептококков группы В.

Степень разработанности темы

Стрептококки группы В обладают широким набором различных факторов патогенности, что определяет различия в вирулентности отдельных штаммов, при этом многие гены, кодирующие факторы патогенности, локализованы на мобильных генетических элементах. Полногеномное секвенирование стрептококков группы В позволило установить, что в состав генома этих бактерий помимо «коровой» части входят разнообразные мобильные генетические элементы. В геноме СГВ по данным различных авторов обнаружено от 14 до 15 островов патогенности, несущих разнообразные детерминанты вирулентности, что составляет около 17% всего генома СГВ (Ferretti, Suvorov, 2002; Glaser et al., 2002; Tettelin et al., 2002).

В связи с этим понимание характера организации мобильных элементов СГВ и роль генов, кодирующих отдельные факторы патогенности, важно для выяснения вклада данных факторов в формирование вирулентного фенотипа и патогенеза стрептококковых заболеваний.

Первоначально в штамме 090R СГВ методом вычитающей гибридизации был обнаружен ген поверхностного адгезина sspBl (Suvorov, Ferretti, 2004). Позднее в результате поиска гомологов sspBl в других штаммах СГВ был обнаружен ген sspBla (Suvorov et al., 2006). Наличие генов sspB семейства коррелировало с возникновением инфекций в урогенитальном тракте (Суворов и др., 2005). Анализ литературы, а также нуклеотидных последовательностей геномов СГВ показал, что гены sspBl, sspBla, а также scpB и Imb, кодирующие С5а пептидазу и ламинин-связывающий белок соответственно, локализованы на острове патогенности XII СГВ (Glaser et al., 2002; Herbert et al., 2005; Suvorov et al.,

2006). Другие авторы полагают, что эта область острова патогенности XII, за исключением генов, фланкирующих scpB и Imb, является конъюгативным элементом (Tettelin et al., 2002; Brochet et al., 2008). Гены scpB и Imb, по мнению Franken и Al Safadi, локализованы на сложном транспозоне (Franken et al., 2001 ; Al Safadi et al., 2010).

Белок SspB 1, как фактор патогенности, включен в состав разрабатываемой в Отделе молекулярной микробиологии вакцины против СГВ.

Таким образом, в литературе отсутствует единое мнение об организации мобильного генетического элемента (острова патогенности XII), а также его распространенности среди штаммов СГВ.

Все вышеперечисленное определило цели и задачи данного исследования.

Цель исследования

Целью исследования является определение распространенности и изучение генетической организации острова патогенности XII в штаммах стрептококков группы В.

Задачи исследования

1) Определить распространенность острова патогенности XII, ассоциированного с геном sspBI, среди штаммов стрептококков группы В, выделенных в России и зарубежных странах.

2) Установить генетическую организацию острова патогенности XII стрептококков группы В.

3) Выявить распространенность мобильного генетического элемента, ассоциированного с геном sspBla, среди штаммов стрептококков группы В.

4) Сравнить организацию мобильных генетических элементов, ассоциированных с генами sspBI и sspBla, среди штаммов стрептококков группы В.

5) Сконструировать новые векторы для экспрессии и инактивации гена sspBI.

Научная новизна

В результате проведенной работы получены новые данные об организации участка генома, кодирующего несколько факторов патогенности. Впервые установлено, что остров патогенности XII, на котором локализован ген sspBI, состоит из трех мобильных генетических элементов, а именно: сложного транспозона (PAI-C), геномного островка (PAI-B) и острова патогенности (PAI-A). Впервые определена распространенность острова патогенности PAI-A, ассоциированного с геном sspBI, среди штаммов СГВ из России (Санкт-Петербурга) (14%). Данный мобильный генетический элемент не был обнаружен в штаммах из США, Германии, Великобритании, Португалии, Анголы, Чешской республики. Каждый элемент характеризуется гетерогенностью по составу

включенных в него генов. Выдвинуто предположение о том, что интеграция геномного островка и острова патогенности происходит за счет прямых повторов, локализованных на концах мобильных генетических элементов. Показана способность острова патогенности и геномного островка образовывать циклическую структуру. Частота встречаемости гена язрШа и острова патогенности РА1-А1 превышает частоту встречаемости гена ххрВ! и острова патогенности РА1-А.

Теоретическая и практическая значимость Стрептококки группы В впервые были обнаружены как возбудители мастита у коров. В настоящее время установлено, что СГВ вызывают широкий спектр заболеваний человека и животных. Они способны быстро адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды за счет содержания в геноме мобильных элементов. Адаптации бактерий к разным экологическим нишам способствуют острова патогенности, ассоциированные с факторами патогенности. Установлено, что характер течения инфекционного заболевания связывают с наличием определенного острова патогенности. На острове патогенности, ассоциированном с геном локализованы гены различных факторов

патогенности. В связи с тем, что наличие острова с генами семейства в штаммах СГВ коррелирует с инфекциями в урогенитальном тракте, вызванными данными штаммами, понимание организации и распространенности острова патогенности имеет большое практическое и теоретическое значение. Выявление роли отдельных генов на данном генетическом элементе в формировании вирулентного фенотипа позволяет глубже понимать патогенез стрептококковой инфекции, а также использовать их в качестве маркеров для детекции высоковирулентных штаммов стрептококков группы В, обнаруженных у беременных. В свою очередь выявление носительства вирулентных штаммов у беременных позволит снизить риск инфицирования новорожденных стрептококками группы В.

Методология и методы исследования

Методологией исследования является экспериментальная работа по анализу геномов штаммов стрептококков группы В с использованием микробиологических, молекулярно-биологических, молекулярно-генетических методов. Данные обрабатывали с помощью компьютерного и статистического анализов.

Положения, выносимые на защиту

1) Остров патогенности XII состоит из трех мобильных генетических элементов, каждый из которых включает элементы, необходимые для транспозиции.

2) Остров патогенности PAI-A обнаруживается в штаммах стрептококков группы В из России (Санкт-Петербурга) и не определяется в штаммах СГВ из зарубежных стран.

3) Остров патогенности PAI-A1 циркулирует в штаммах СГВ из различных стран и более широко распространен, чем остров патогенности PAI-A.

Степень достоверности и апробация результатов

Степень достоверности полученных результатов определяется достаточным объемом выборки (235 штаммов СГВ), использованием молекулярно-генетических методов, компьютерного анализа и точного критерия Фишера.

Результаты исследования были доложены на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», на III Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения — 2009», на 20-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, на Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», на XVIII Международном Симпозиуме Лэнсфильд, на II всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия».

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 112 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы. Список литературы включает в себя 130 источников, в том числе 15 - отечественных и 115 - иностранных. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 27 рисунками.

Основное содержание работы Материалы и методы исследования

В данном исследовании использовались 235 штаммов стрептококков группы В, полученных из различных коллекций России (113 штаммов), США (12 штаммов), Чешской республики (9 штаммов), Германии (16 штаммов), Португалии (56 штаммов) и Анголы (19 штаммов).

Штаммы из Германии, Португалии, Анголы относились к двум группам: инвазивные (45 штаммов) и выделенные от носителей (46 штаммов).

Штаммы Escherichia coli (Е. coli) DH5a, JM109, М15 были использованы при создании конструкций для экспрессии и инактивации гена sspB 1.

В исследовании использовались следующие плазмидные векторы: р7ЕгшВ, pQE-32, pGEMTEasy.

Компьютерный анализ проводился с помощью базы данных National Centre of Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и компьютерных

программ BLAST, ClustalW2 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov,

http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustaIw2). Праймеры создавались с помощью компьютерной программы Primer 3.0. G+C состав генов определяли с помощью программы FastPCR. Статистический анализ осуществлялся с помощью программы Statistica ver.lO. При представлении нуклеотидной последовательности в виде вторичной структуры использовалась компьютерная программа The mfold Web Server (http://mfold.rna.albanv.ecki/?q=mfold/RNA-Folding-Form). Построение филогенетического дерева осуществлялось программой MEGA 6, использовался метод Maximum Parsimony.

ДНК из штаммов СГВ была выделена с использованием фенол-хлороформного метода или набора «ДНК-экспресс» («Литех», Россия).

ДНК из 10 выделенных от носителей штаммов из Великобритании была выделена с помощью MagNA Pure Compact сотрудниками центра по защите здоровья (Health Protection Agency) в Лондоне.

Масс-спектрометрия была проведена в сотрудничестве с лабораторией биомедицинской и фармацевтической масс-спектрометрии отдела молекулярной микробиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН под руководством Мильмана Б.Л.

В процессе исследования были использованы следующие методы: полимеразная цепная реакция, электрофорез в агарозном геле, клонирование, ДНК-секвенирование.

Результаты исследования и их обсуждение Молекулярно-генетическая организация и распространенность острова

патогенности XII

Для оценки распространенности острова патогенности среди штаммов стрептококков группы В были определены предполагаемые функции 81 гена штамма NEM316 с помощью геномной базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и компьютерной программы blastx (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) (поиск белков по транслируемой нуклеотидной последовательности) (рисунок 1). Гены gbsl374, gbsl375, gbsl376 локализованы за пределами острова патогенности XII.

Для дальнейшего исследования были выбраны гены gbsl343, gbsl348, gbsl352, gbsl356 (sspBl), gbsl360, gbsl364, gbsl376, кодирующие zeta токсин, белок Zn-finger, метилтрансферазу, SspBl, компонент системы секреции IVC VirB4, компонент системы секреции IVC VirD4, АТФ-зависимую протеазу соответственно. Ген gbsl376 локализован за пределами острова патогенности, поэтому был выбран в качестве положительного контроля ПЦР.

Гены острова патогенности XII (PAI XII) были обнаружены в геномах 16 из 113 штаммов из России и отсутствовали в зарубежных штаммах (таблица 1). При этом организация острова характеризовалась гетерогенностью по составу генов.

Серотипы СГВ штаммов из России, США, Германии оценивали с помощью мультиплексной ПЦР на гены капсульного оперона (Poyart et al., 2007).

Серотипы штаммов из Чешской республики, Великобритании, Португалии и Анголы были известны.

Распределение 235 штаммов из названных регионов по серотипам представлено на рисунке 2. 37 штаммов были отнесены к серотипу 1а, 25 - к Ib, 31 - ко И, 56 - к Ш, 34 - к IV, 18 - к V, 1 - к VI, 1 - к Vil, 1 - к VIII.

Сопоставление данных мультиплексного типирования с результатами анализа на локализацию генов острова показало, что не существует корреляции между наличием острова патогенности XII и серотипом СГВ.

Масс-спектрометрический анализ штаммов стрептококков группы В

Штаммы СГВ с островом патогенности XII и без него были проанализированы с использованием масс-спектрометрии в диапазоне молекулярных весов от 2000 до 18000 Да, однако различия по этому признаку между штаммами не были выявлены.

Создание рекомбинантных конструкций для экспрессии и инактивации гена

sspBl

В процессе анализа свойств гена sspBl создана конструкция для экспрессии гена sspBl с применением экспрессионного вектора pQE-32, которая может быть использована при создании вакцины против стрептококков группы В. Конструкции для инактивации гена sspBl по односайтовой рекомбинации и по дойному кроссинговеру были получены на основе векторов p7ErmB и pGEMTEasy для определения вклада гена sspBl в формирование вирулентных свойств СГВ.

Сравнительный анализ белков SspBl и SspBl а с гомологичными белками других

микроорганизмов

В связи с тем, что существует два гомологичных гена sspBl и sspBla в штаммах СГВ, был проведен сравнительный компьютерный анализ белка SspBl и его гомолога SspBla. В результате анализа обнаружили, что белок SspBla имеет более высокую степень гомологии со сходными по строению белками других микроорганизмов, что свидетельствует о большей распространенности белка SspBla по сравнению с белком SspBl. По результатам филогенетического анализа можно сделать предположение о том, что ген, кодирующий белок SspBl, принадлежал к геному общего предка с бактериями, содержащими гомологи SspBla, после чего в процессе эволюции произошла дивергенция данных генов, которые в настоящее время обнаруживаются в различных штаммах СГВ (рисунок 3). Не исключено, что гены sspBl и sspBla попали в СГВ из различных хозяев в процессе горизонтального переноса.

¡§ s| S § § S S S §

S i %, £ %, í.

="<=ïO&

s. &

1 <=c)c> <==*=>

■§>■§. %> H ■§, € H. -§> Ц

Д л S л «i Л л

■ж :

s S ¡3 ? I | si S I 5SS

Гены gbsl307, gbsl308, gbsl311, gbsl314, gbsl316, gbsl324, gbsl325, gbsl327, gbsl335, gbsl338, gbsl343, gbsl344, gbsl348, gbsl352, gbsl356, gbsl360, gbsl364, gbsl374, gbsl376 кодируют LmB; ScpB; транспозазу; сайт-специфическую рекомбиназу

из семейства фаговых интеграз; белок, участвующий в репликации плазмиды; рестриктазу типа I1G и метилтрансферазу; сайт-специфическую рекомбиназу из семейства фаговых интеграз; LacX; LacB; релаксазу; zeta токсин; epsilon антитоксин; белок Zn-finger; метилтрансферазу; SspBl ; компонент системы секреции IVC VirB4; компонент системы секреции 1VC VirD4; рибосомный белок 50S; АТФ-зависимую С1р протеазу соответственно. Стрелками обозначены относительные размеры и направление трансляции генов, локализованных на «острове патогенности». Рисунок 1 - Генетическая организация острова патогенности XIIСГВ

Таблица 1 — Анализ штаммов стрептококков группы В методом ПЦР

Число Страна Тип организации генома* вЬэШЗ gbsl348 СЧ «о СЛ -О 60 .ч.чрВ! §Ьз1360 вЬэ1364 о с-- .О 00

95 Россия А +

2 Россия В - + + - - - +

1 Россия С + +

10 Россия Б + + + + + + +

5 Россия Е - + + + + - +

1 Россия Р + + - + + - +

12 США А +

9 Чешская республика А +

16 Германия А +

10 Великобритания А +

12 Португалия А +

44 Португалия О т м т - т П1

19 Ангола в - т Ш Ш

* Типы организации генома представлены в виде буквенных обозначений п! — не тестированы

■ Великобритания ШГермания

□ Португалия

□ Россия ПИ США

Е1 Чешская республика ЕЗ Ангола

Рисунок 2 — Серотипы штаммов СГВ

Enterococcus faecium

S.thermophüus

S.porci

Staphytococcus aureus S.suis

S.plurextorum

S agalactiae (SspBIa)

S.hyovaginalis

S macedonicus

S equi subsp.zooepidemicus

S.pasteurianus

S.orisratti

S.equinus

S agalactiae (SspBl) S intermedius S.consteliatus S.anginosus S.tigurinus

Рисунок 3 - Дендрограмма белков БэрВ!, БзрВ 1а и их гомологов

Определение распространенности гена Российские и зарубежные штаммы СГВ, у которых отсутствовал ген 88рВ1, проанализировали на наличие гена 88рВ1а. В результате было обнаружено, что распространенность гена 88рВ1а среди штаммов СГВ различного географического происхождения оказалась значительно выше по сравнению с таковой гена 8зрВ1 (рисунок 4).

Определение области интеграции острова патогенности, ассоциированного с

геном sspBl

Исследование распространенности острова патогенности XII среди штаммов СГВ выявило определенное противоречие в данных научной литературы, посвященной организации геномов СГВ. Известно, что ген scpB, первоначально локализованный на PAI XII, встречается у 100% штаммов, выделенных от человека (Chmouryguina et al., 1996; Dmitriev et al., 1999; Glaser et al., 2002). Однако по результатам ПЦР анализа остров патогенности XII был обнаружен только у 14% штаммов СГВ из России. В связи с этим было сделано предположение о том, что ген scpB не обязательно принадлежит к PAI XII, а может быть локализован на другом генетическом элементе. Так, показано, что гены scpB и !mb входят в состав сложного транспозона (Franken et al., 2001; AI Safadi et al., 2010). Анализ результатов ПЦР и компьютерных данных выявил присутствие в составе PAI XII трех мобильных генетических элементов: сложного транспозона (PAI-C), геномного островка (PAI-B) и острова патогенности, ассоциированного с геном sspBl (PAI-A).

Рисунок 4 - Распространенность генов sspBla и sspBl среди штаммов СГВ

В межгенном пространстве генов gbsl324-gbsl325 и gbsl373-gbsl374 были обнаружены нуклеотидные последовательности, образующие вторичные структуры в виде «шпилек». Наличие двух «шпилек» в областях gbsl324-gbsl325 и gbsl373-gbsl374 допускает возможность ошибки репликации хромосомной ДНК с «выщеплением» мобильного элемента в виде автономного ДНК фрагмента.

В геноме штамма 2603V/R в области острова патогенности XII присутствуют гомологи генов, локализованных на PAI 89К Streptococcus suis

(Chen et al., 2007, Li et al., 2011). Такие же прямые повторы были обнаружены на интегративных конъюгативных элементах, прилегающих к гену рибосомного белка, у штаммов СГВ NEM316, 2603V/R, А909 (Brochet et al., 2008). В результате компьютерного поиска повторы были обнаружены на 3' конце гена gbs 1374, кодирующего рибосомный белок 50S, и в межгенном пространстве генов gbsl313-gbsl314, gbsl324-gbsl325. Повторы в межгенном пространстве gbsl313-gbsl314, gbs 1324-gbs 1325 и на 3' конце гена gbsl374 подтверждают выдвинутую, на основании данных ПЦР, гипотезу о комплексной организации острова патогенности XII, включающего три мобильных генетических элементов (рисунок 5). Способность острова патогенности PAI-A и геномного островка PAI-B выходить из генома как совместно, так и по отдельности была показана с использованием ПЦР анализа.

Рисунок 5 - Структура острова патогенности XII

Так как было установлено, что остров патогенности XII включает все три упомянутые структуры, однако приведенные выше данные о распространенности этого острова среди штаммов СГВ относятся не ко всему генетическому элементу, а только к той его части, которая ассоциирована с геном ,чхрВ I и обозначенному как РА1-А. Таким образом, распространенность острова патогенности РА1-А составляет 14%, тогда как в геноме изученных зарубежных штаммов данный элемент не был обнаружен.

Сравнительный анализ острова патогенности, ассоциированного с геном

х%рВ1, с островом патогенности, ассоциированным с геном .ч.<,рВ1а

Остров патогенности РА1-А содержит ген А\^рВ1. Гомолог гена .мрй/ — ген мрВ/д также локализован на мобильном генетическом элементе, который в данном исследовании был обозначен, как РА1-А1.

Сравнительный анализ структуры островов патогенности, ассоциированных с генами .мр.0/ и .чярВ/а, позволил сформулировать предположение о том, что острова патогенности РА1-А и РА1-А1 являются независимыми мобильными генетическими элементами, а существенные отличия в их генетической организации указывает на то, что дивергенция данных мобильных генетических элементов от общего предка произошла достаточно давно. Локализация идентичных прямых повторов на концах данных мобильных генетических элементов, имеющих гомологичные области, может привести к формированию нового генетического элемента.

Молекулярно-генетический анализ штаммов СГВ, использованных в работе показал, что распространенность гена 55рВ1а оказалась значительно выше, чем распространенность гена $БрВ1. Следовательно, распространенность острова патогенности РА1-А1, ассоциированного с геном хьрВ1а, превышает распространенность острова патогенности РА1-А, ассоциированного с геном Штаммы СГВ, несущие РА1-А1, в отличие от штаммов с РА1-А циркулируют не только в России, но и в зарубежных странах.

Не обнаружено корреляции между наличием гена 5ярВ1а, острова РА1-А1 и серотипом СГВ.

В Санкт-Петербурге (Россия) циркулируют штаммы СГВ, содержащие несколько вариантов островов патогенности, гомологичных РА1-А и РА1-А1.

Анализ штаммов из Португалии и Анголы на наличие генов, ассоциированных

с геном ь$рВ1а

В связи с отсутствием РА1-А в штаммах из стран зарубежья, коллекция штаммов СГВ из Португалии и Анголы была проанализирована на наличие генов мобильных генетических элементов РА1-А1 и РА1-В, распространенность которых составила 13% и 87% соответственно. Объединив с ранее полученными результатами, выявили, что геномный островок РА1-В встречается у 66% штаммов СГВ, а остров патогенности РА1-А1 — у 33% штаммов, что указывает на большую распространенность по сравнению с островом патогенности РА1-А.

Заключение

Стрептококки группы В являются актуальными возбудителями тяжелых и часто смертельных заболеваний человека и животных. Относительно высокая

скорость эволюции генома СГВ обусловлена присутствием мобильных генетических элементов, в частности островов патогенности, несущих гены, способствующие быстрой адаптации микроорганизма к новым экологическим нишам.

Проведенное исследование было посвящено одному из таких мобильных генетических элементов - острову патогенности XII, присутствие которого в геноме СГВ ассоциировано с вирулентным фенотипом. Установлено, что в геноме штаммов СГВ, изолированных в различных географических регионах, гетерогенный по структуре остров патогенности XII встречается с разной частотой. Анализ генетический организации выявил три мобильных элемента в составе острова патогенности XII: сложный транспозон РА1-С, геномный островок РА1-В и один из двух вариантов острова патогенности: РА1-А или РА1-А1а, ассоциированных с генами ^рВ1 или ББрВ1а (гомолог я.чрВ1) соответственно. Рекомбинантный фрагмент белка 8БрВ1 (продукт гена .«узй/) используется в качестве одного из компонентов разрабатываемой в отделе молекулярной микробиологии вакцины против СГВ.

В работе осуществлено клонирование фрагмента гена ырВ1 в экспрессионном вееторе и созданы новые конструкции для инактивации гена ¿¿рВ1.

Установлено, что доля штаммов (зарубежных), несущих РА1-А1, значительно превышала таковую для РА1-А. Данные последовательности кодируют глюкан-связывающие белки и адгезины — факторы вирулентности многих грамположительных патогенных стрептококков и энтерококков. Наличие нескольких мобильных элементов в составе изученного острова патогенности XII СГВ свидетельствует о возможности формирования новых мобильных генетических элементов посредством горизонтального переноса генов.

Выявленное методом ПЦР многообразие генотипов российских штаммов СГВ по острову патогенности XII отражает гетерогенность структуры данного генетического элемента и имеет значение для эпидемиологической диагностики и мониторинга СГВ инфекции в России.

Выводы

1) Остров патогенности XII стрептококков группы В состоит из трех мобильных генетических элементов: сложного транспозона РА1-С, геномного островка РА1-В и острова патогенности РА1-А, ассоциированного с геном .мрй/. Геномный островок и остров патогенности фланкированы прямыми повторами.

2) Остров патогенности РА1-А был обнаружен только в штаммах стрептококков группы В из России и отсутствовал в геномах штаммов из ряда зарубежных стран.

3) Острова патогенности PAI-A и PAI-A1, ассоциированные с генами sspBI и sspBJa соответственно, являются независимыми генетическими элементами, способными самостоятельно «выщепляться» из хромосомы.

4) Распространенность острова патогенности PAI-A1 составила 33% среди российских и зарубежных штаммов, что значительно превышает распространенность острова патогенности PAI-A (14%).

5) Сконструированы векторы для экспрессии и инактивации гена sspBI.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Афиногенова, А. Г. Влияние бигуанидов на формирование стрептококковой биопленки на модели культуры клеток фибробластов кожи эмбриона человека [Текст] / А. Г. Афиногенова, К. Б. Грабовская, Е. В. Кулешевич, А. Н. Суворов, Г. Е. Афиногенов // Инфекции в хирургии. - 2011. - Т. 9, № 1.-С. 3-11.

2) Кулешевич. Е. В. Анализ «острова патогенности» № XII в клинических штаммах стрептококков группы В [Текст] / Е. В. Кулешевич // Медицинский академический журнал. - 2010. — Т. 10, № 5. - С. 87.

3) Кулешевич. Е. В. Генетическая организация «острова патогенности» № XII стрептококков группы В [Текст] / Е. В. Кулешевич // Сборник тезисов III Международного молодежного медицинского конгресса «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009». - 2009. - С. 113.

4) Кулешевич. Е. В. Изучение «острова патогенности» стрептококков группы В [Текст] / Е. В. Кулешевич // Приложение к журналу «Вестник Российской Академии медицинских наук» №6. - 2008. — С. 228.

5) Кулешевич. Е. В. Распространенность и генетическая организация «острова патогенности» №ХН у клинических штаммов стрептококков группы В [Текст] / Е. В. Кулешевич, А. М. Савичева, О. Н. Аржанова, А. Н. Суворов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2013. -№1. — С. 26-30.

6) Кулешевич. Е. В. Сравнительная характеристика организации «острова патогенности» №ХН в различных штаммах стрептококков группы В [Текст] / Е. В. Кулешевич // Медицинский академический журнал. - 2012. - Т. 12, № 4. -С. 49-51

7) Пат. 2542483 Российская Федерация, МПК С07К14/315, C12N15/09, C12N15/31,C12N1/21, А61К38/16. Рекомбинантный полипептид StV, обладающий протективными свойствами в отношении Streptococcus agalactiae, рекомбинантная ДНК StV, его кодирующая и рекомбинантный штамм Escherichia coli M15-StV, содержащий рекомбинантную плазмиду PQE-StV (Текст] / А.Н. Суворов, Т.В. Гупалова, Е.В. Кулешевич, К.Б.

Грабовская, Г.Ф. Леонтьева; заявитель и патентообладатель ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН. -№2012120508/10; заявл. 17.05.2012; опубл. 20.02.2015, Бюл. №5. -13 с.

8) Grabovskaya, К. SspB 1 - streptococcal surface protein as possible component of recombinant streptococcal vaccine [Text] / K. Grabovskaya, T. Gupalova, G. Leontieva, A. Korjueva, L. Meringova, E. Kuleshevitch. A. Totolian, A. Suvorov // Clinical Microbiology and Infection. - 2009. - Vol.15, N 4. - P. 0176.

9) Kuleshevich. E. Distribution of pathogenicity island XII of group В streptococci [Text] / E. Kuleshevich. A. Savicheva, A. Suvorov // Clinical Microbiology and Infection. - 2011. - Vol. 17, N s4. - P. S249.

10) Kuleshevich. E. Genetic organization of pathogenicity island XII of group В streptococci [Text] / E. Kuleshevich. A. Suvorov // Clinical Microbiology and Infection. -2010.-Vol. 16,N2.-P. S587.

11) Kuleshevich. E. The analysis of group В streptococcal gene sspBl localized on pathogenisity island [Text] / E. Kuleshevich. K. Grabovskaya, G. Leontieva, A. Suvorov // Abstract book of XVIII Lancefield International Symposium. - 2011. - P. 170.

Подписано в печать 22.06.2015 г. Формат 60x84 1/8. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №3848.

Отпечатано в ООО «Издательство "J1EMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, 1-я линия В.О., д.28 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://vvww.lemaprint.ru