Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Субмикроскопическая организация гемолитических стрептококков и их Л-форм

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чурилова, Надежда Станиславовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Ультраструктура стрептококков

Глава П. Биологические особенности, морфология и ультраструктура Л-форм стрептококка.

Глава Ш. Взаимодействие Л-форм стрептококка с фагоцитирующими клетками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава I. Материалы и методы.

1. Штаммы микроорганизмов и условия их культивирования

2. Метод выявления полисахаридов с рутениевым красным по Лафту ;.

3. Метод выявления дегидрогеназ

4. Метод выявления АТФ-азы

5. Иммунохимические методы изучения локализации антител.

6. Методы приготовления электронномикроскопических препаратов и условия микроскопирования

7. Метод криофрактографии.

8. Методы изучения взаимодействия Л-форм с макрофагами

9. Обнаружение антигена Л-форм методом иммунофлу-оресценции в световом микроскопе

10. Синхронизация культур методом температурного шока.

11. Условные обозначения

Глава П. Ультраструктура (ь -гемолитического стрептококка группы А, его Л-форм и ревертанта.

I. Ультраструктура стрептококка.

2. Ультраструктура Л-форм стрептококка группы А

Ультраструктура ревертанта.

Глава Ш. Ультраструктура /ь -гемолитического стрептококка группы В и его Л-форм.

1. Ультраструктура стрептококка

2. Ультраструктура Л-форм стрептококка группы В.

Глава 1У. Локализация антигенов у стрептококков, Л-форм и ревертанта.

Глава У. Взаимодействие Л-форм ^-гемолитического стрептококка групп А и В с макрофагами

I. Электронномикроскопическое изучение взаимодействия Л-форм (Ъ -гемолитического стрептококка групп А и В с макрофагами в опытах in vitro

2. Электронномикроскопическое изучение взаимодействия Л-форм /з> -гемолитического стрептококка групп А и В с макрофагами в опытах in vivo

3. Изучение взаимодействия Л-форм ^-гемолитического стрептококка групп А и В с макрофагами методом непрямой иммунофлуоресценции

РИФ) в опытах in vitro и in vivo

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Субмикроскопическая организация гемолитических стрептококков и их Л-форм"

Роль -гемолитического стрептококка группы А в этиологии ревматизма, эндокардита, пиелонефрита и других заболеваний человека хорошо известна, fi -Гемолитический стрептококк группы В долгое время считался коменсалом верхних дыхательных путей и урогенитального тракта. Только сравнительно недавно была установлена его роль при неонатальных инфекциях, затем при септицемии, менингите, инфекциях мочеполового тракта, артрите, фарингите у новорожденных, а также при артрите, пиелонефрите, перитоните, эндокардите и других заболеваниях у взрослых (8, 240). Все возрастающий интерес к стрептококку группы В послужил основанием для изучения его субмикроскопической организации в сравнении с более полно изученным стрептококком группы А. Исследования в этом плане ранее не проводились.

Хронический, рецидивирующий характер большинства заболеваний, вызываемых стрептококками, может быть обусловлен способностью возбудителя, спонтанно или под действием антибиотиков, переходить в Л-формы и, при определенных условиях, реверсировать в исходные бактерии (80, 81, 83, 84). Если особенности процесса Л-трансфор-мации у стрептококка группы А изучены в значительной степени (68, 82, 127, 189), то у стрептококка группы В они только начинают изучаться. Не описана ультраструктура Л-форм стрептококка группы В, не установлено наличие у них антигенов, общих с исходным стрептококком и Л-формами стрептококка группы А, не изучен характер локализации у них антигенов на субмикроскопическом уровне. Выяснение этих вопросов важно для понимания того, в каких структурах клетки Л-форм сосредоточены антигены, общие с исходным стрептококком.

Патогенность Л-форм стрептококка группы А показана при экспериментальном моделировании инфекций. Однако механизм патогенного действия полностью не выяснен. Так, известно, что при экспериментальной инфекции мышей, вызванной Л-формами стрептококка группы А, патологический процесс сопровождается длительной персистенцией возбудителя в организме и протекает без выраженной макрофагаль-ной реакции (12). В отношении стрептококка группы В подобные сведения отсутствуют. Вместе с тем, макрофагальная реакция является одной из первых защитных реакций макроорганизма на введение патогенного агента, а незавершенный фагоцитоз может способствовать диссеминации возбудителя. Изучение взаимодействия Л-форм стрептококков групп А и В с макрофагами может помочь в выяснении механизма персистенции возбудителя в условиях макроорганизма.

Сказанное определяет актуальность настоящего исследования, предмет которого составляло изучение структуры стрептококка группы В и его Л-форм, локализации у них антигенов на субмигфоскопи-ческом уровне и взаимодействие Л-форм с макрофагами в сравнении с ранее изученными стрептококками и Л-формами группы А.

Исследования проводили в соответствии с планом Проблемной комиссии союзного значения "Медицинская микробиология", с целевой программой научно-исследовательской работы по эпидемиологии и клинике инфекционных болезней человека бактериальной этиологии, направленной на совершенствование системы лечебных и противоэпидемических мероприятий (раздел 1.3.02 - Роль Л-форм в персистенции патогенных бактерий), целевой программой НИИЭМ им. Н.Ш. Гамалеи АМН СССР "Персистенция патогенных микроорганизмов" и планом основной научной тематики НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, темы № 81032556 и 79048997.

Целью диссертационной работы является сравнительное изучение субмикроскопической организации р> -гемолитических стрептококков групп А и В, их Л-форм и ревертанта, а также изучение взаимодействия Л-форм с макрофагами. Конкретные задачи исследования.

1. Сравнительное изучение субмикроскопической организации стрептококков групп А и В, а также ревертанта в зависимости от фазы роста культуры.

2. Сравнительное изучение субмикроскопической организации Л-форм стрептококков групп А и В.

3. Изучение локализации общих и специфических антигенов у стрептококков, Л-форм и ревертанта на субмикроскопическом уровне.

4. Выяснение характера взаимодействия Л-форм с перитонеаль-ными макрофагами мышей в опытах in vivo и in vitro

При проведении экспериментальных исследований по теме диссертации получены следующие новые данные:

- Впервые изучена ультраструктура стрептококков групп А и В в лаг-, экспоненциальной и стационарной фазах. Показано, что система внутренних мембран у стрептококков обеих групп аналогична и представлена так называемыми S -мембранами. У стрептококка группы В обнаружена микрокапсула полисахаридной природы.

- У Л-форм стрептококка группы В впервые обнаружены мембранные органоиды ламелярного и миелиноподобного типов.

- У ревертанта, полученного из Л-форм стрептококка группы А, выявлены ламелярные и 5-образные мембранные структуры.

- Показано, что АТФ-азная активность локализована в цитоплаз-мат ичес кой мембране Л-форм в такой же степени, как у исходного стрептококка.

- С помощью иммуноферритинового и иммунопероксидазного методов установлено, что общие антигены Л-форм, исходного стрептококка и ревертанта локализованы в цитоплазматической мембране. Антигены, специфические для стрептококка и ревертанта, локализованы в микрокапсуле и на поверхности клеточной стенки.

- Показано, что при взаимодействии с перитонеальными макрофагами мышей основная часть фагоцитированных Л-форм разрушается в течение первых суток, однако, единичные клетки обнаруживаются до б суток, а антиген Л-форм до 7 и более суток.

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлены закономерности локализации АТФ-азы, а также общих и специфических антигенов у стрептококков и их Л-форм на ультраструктурном уровне. Дана ультраструктурная характеристика Л-форм стрептококка группы В. Выявлены закономерности взаимодействия Л-форм стрептококка с перитонеальными макрофагами мышей. Установленный факт сохранения единичных клеток Л-форм в макрофагах может быть использован для объяснения одного из механизмов персистенции возбудителя и его диссеминации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава I

Ультраструктура стрептококков

Известно, что критерием групповой принадлежности у стрептококков являются антигенные различия полисахаридов, входящих в состав клеточной стенки (59, 178). Дать ультраструктурную характеристику стрептококков в зависимости от их принадлежности к серологическим группам не представляется возможным из-за отсутствия данных по каждой из групп. По этой причине, в настоящем обзоре мы приводим общие сведения о субми1фоскопической организации стрептококков.

С помощью метода сканирующей электронной микроскопии показано, что колонии /J-гемолитического стрептококка группы А погружены в "матрикс", образованный веществом неизвестной природы. Слой этого вещества имеет болыцую толщину и, как указывают авторы, по-видимому, выделяется клетками стрептококка (133, 227).

Помимо матрикса, окружающего колонию в целом, на поверхности отдельных клеток стрептококка описаны различные поверхностные структуры - капсула, микрокапсула, а также фибриллы и фимбрии. Все эти структуры следует считать поверхностными структурами бактериальной клетки, благодаря их расположению кнаружи от клеточной стенки.

Так, о наличии капсулы, которая выявляется методом негативного окрашивания тушью в световом микроскопе, у различных групп стрептококка сообщают Л.Н. Кац, Н.А. Волкова (1966), я. Cole (1968), V.A. Feschetti et al., (1981) и другие. Эти исследования показали, что капсула образована гиалуроновой кислотой (98), о чем свидетельствует её чувствительность к гиалуронидазе. Напротив, устойчивость капсулы к трипсину : позволяет предположить отсутствие в ней мукопептидов. Капсулу, состоящую из гиалуроновой кислоты, невозможно обнаружить в электронном микроскопе методом ультратонких срезов, во всяком случае, без предварительной обработки клеток гомологичной сывороткой. Капсула существует непродолжительное время. У стрептококка она развивается через 2-2,5 часа после посева, то есть в экспоненциальной фазе, и потом исчезает почти бесследно (39).

В отличие от капсулы, микрокапсула может быть выявлена методом ультратонких срезов и имеет фибриллярное строение. У некоторых бактерий микрокапсула может существовать и в отсутствии капсулы. У других бактерий, как,например, у стрептококка - микрокапсула составляет внутренний слой капсулы, выявляемой на тушевых препаратах (I).

У стрептококка, как и у других бактерий, ми1фокапсула имеет фибриллярное строение. Диаметр фибрилл составляет 20-25 А, толщина всей микрокапсулы - 35-40 нм (39, III). При обычных методах фиксации ми1фокапсула выявляется плохо. Несколько лучше она выявляется при фиксации с рутениевым красным, так как этот метод специфически выявляет кислые мукополисахариды (242). Волокна микрокапсулы контрастируются также антителами к антигену М, и благодаря этому, становятся более заметными на ультратонких срезах (III).

Таким образом, у стрептококка капсула образована гиалуроновой кислотой, имеет значительную толщину и существует только в экспоненциальной фазе. Она не выявляется методом ультратонких срезов. Внутренняя часть капсулы - микрокапсула на ультратонких срезах обнаруживается в виде фибриллярного слоя толщиной 35о

-40 нм с диаметром фибрилл 20-25 А.

Установлено, что штаммы стрептококка группы А, имеющие хорошо развитую микрокапсулу, обладают более высокой способностью адсорбироваться на цитоплазматической мембране клеток культуры тканей, чем штаммы с менее развитой микрокапсулой (210).

Помимо капсулы и микрокапсулы, на поверхности клеточной стенки у некоторых стрептококков обнаружены фибриллы и фимбрии (154, 155, 161). Фибриллы различаются по длине. Короткие (95 нм) располагаются всегда перитрихиально и присутствуют не у всех штаммов. Длинные (175 нм), напротив, отмечены у всех штаммов, имеющих фибриллы, и могут располагаться либо перитрихиально, либо в виде пучка. При действии на клетку протеаз или трипсина сохраняются только длинные фибриллы.

Фимбрии - это структуры, имеющие длину 0,5-1 мкм и толщину 3-4 нм. Они также, как и фибриллы, расположены перитрихиально. При действии протеаз и трипсина их количество изменяется незначительно.

Относительно природы и функций фибрилл существуют различные и часто противоречащие друг другу мнения. Имеются сведения о том, что липотейхоевая кислота фибрилл обеспечивает вирулентность стрептококка (140). Кроме того, липотейхоевая кислота фибрилл обеспечивает прикрепление стрептококка к поверхности фагоцитирующих клеток (91, 97, 145). Наряду с этим, существует также мнение о том, что волокна микрокапсулы неправильно обозначают как фимбрии (230).

Клеточная стенка стрептококка группы А на ультратонких срезах имеет гомогенное, иногда ячеистое строение. Её толщина обычно составляет 15-17 нм. В местах формирования перегородок клеточная стенка, как правило, утолщена. В некоторых случаях можно наблюдать как бы трехслойное строение клеточной стенки за счет уплотнения наружной и внутренней части стенки. В участках, где клеточная стенка контрастирована более интенсивно, ее трехслойное строение не выявляется (71, 72). С помощью метода замораживания-скалывания у стрептококка было показано двухслойное строение клеточной стенки (165).

Цитоплазматическая мембрана имеет типичное трехслойное строение. Её наружный слой у стрептококка настолько близко подходит к внутренней поверхности клеточной стенки, что цитоплазматическая мембрана имеет вид однослойной структуры. В участках, где цитоплазматическая мембрана слегка отходит от клеточной стенки, обнаруживается асимметричный профиль мембраны, обусловленный большей толщиной её наружного слоя по сравнению с внутренним слоем.

Изучение цитоплазматической мембраны с помощью метода замораживания-травления дает представление о структуре гидрофобной области мембраны (29). При этом, количество мембраносвязанных частиц на единицу площади поверхности мембраны и размеры этих частиц позволяют судить о физиологической активности мембраны. Указанные закономерности могут быть в равной степени отнесены не только к цитоплазматической мембране, но и ко многим другим биомембранам.

У stг. feeсаlie в условиях сбалансированного роста не наблюдается различий в количестве, распределении и размерах мембраносвязанных частиц на вогнутой поверхности скола цитоплазматической мембраны ( EFcm) в зависимости от фазы роста культуры (112), в то время, как на выпуклой поверхности скола цитоплазматической мембраны ( РРсш) было обнаружено прогрессивное снижение их количества при переходе культуры из экспоненциальной фазы и роста в стационарную фазу отмирания. Так, количество частиц на

0,2 мкм уменьшалось от 69 в начале лог-фазы, до 57 в ранней стационарной фазе и с 42 после 6 часов до 30, спустя 24 часа. В лого

-фазе диаметр мембраносвязанных частиц составлял 60 А. Через о

6 часов уже основная их часть имела диаметр 90 А, а некоторые о

120 А; и только незначительное количество мембраносвязанных часо тиц имели диаметр 60 А. Авторы считают, что снижение функциональной активности мембраны в процессе роста популяции является одной из основных причин изменения структуры гидрофобной области цитоплазматической мембраны. Размеры мембраносвязанных частиц, по-видимому, варьируют в зависимости от вида стрептококка. Так, у орального стрептококка их размеры на выпуклой поверхности скола цитоплазматической мембраны (PFcm ) 25 нм, а на вогнутой (ерсш ) - 7-13 нм (165). При этом следует отметить, что для большинства бактерий гетерогенность размеров мембраносвязанных частиц укладывается в пределах от 6 до 10 нм (29).

Наряду с этим, существует мнение, согласно которому, распределение мембраносвязанных частиц на гидрофобной поверхности цитоплазматической мембраны зависит от условий приготовления препа

Мы пользуемся терминологией, принятой на симпозиуме 1975 г. (104). В соответствии с ней две половинки наружной мембраны (клеточной стенки), образующиеся цри сколе, обозначены как PFcw -- половинка, граничащая с цитоплазмой, efcw - половинка, граничащая с окружающей средой. Истинные поверхности наружной мембраны обозначены как PScw - поверхность, граничащая с цитоплазмой, EScw - поверхность, граничащая с 01фужающей средой. Соответственно, половинки цитоплазматической мембраны, образующиеся при сколе, обозначены как PFcm и EFcro , а истинные поверхности как PScm и EScm . Для мезосомальных мембран приняты обозначения: PFras , EFms - для половинок мембран, образующихся при сколе и PSms и ESms - для истинных поверхностей. рата. Выдерживание материала перед скалыванием при температуре ниже 10°, а также центрифугирование клеток приводит к образованию "лысин", т.е. участков, лишенных мембраносвязанных частиц. При нагревании перед скалыванием до 10-25° внутримембранные частицы восстанавливаются (235).

Внутрицитоплазматические мембранные структуры у стрептококка развиты слабо. Обычно они имеют простое кольцевидное строение. Иногда, в местах формирования поперечных перегородок, можно обнаружить более сложно устроенные мембранные структуры везикулярного, реже ламелярного строения (71, 72, III, 165). Установлена связь таких мембранных структур с нуклеоидом и цитоплазматической мембраной (71, 72, 165). Интересные данные относительно частоты встречаемости мезосом у str. faecalis получены с помощью метода замораживания-травления. Показано, что при замораживании с разломом нефиксированных клеток мезосомы встречаются на 92% реже, чем у фиксированных клеток. Авторы объясняют это тем, что в нефиксированных клетках мезосомы скалываются поверхностно, а у фиксированных клеток скол проходит посредине мезосомы, обнажая витки мембраны мезосом и делая их тем самым более заметными (162).

Нуклеоид у стрептококка имеет обычную для бактерий структуру и содержит фибриллы ДНК диаметром 2,5 нм. Методом замораживания--травпения на нефиксированных препаратах нуклеоид обнаружить не удается. После предварительной фиксации нуклеоид у стрептококка обнаруживается в виде сети фибрилл. Кроме того, предварительная фиксация, охлаждение и фильтрация материала способствуют централизации ядерного вещества в цитоплазме (131).

Таким образом, ультраструктура стрептококка изучена достаточно подробно, однако, имеющиеся данные не позволяют судить о том, существуют ли различия в структуре у стрептококков, относящихся к различным серологическим группам. Остаётся также неясным -- является ли слабое развитие системы внутренних мембран отличительным свойством стрептококка, которое, возможно, в какой-то мере компенсируется за счет извилистости цитоплазматической мембраны, обеспечивающей увеличение рабочей поверхности мембраны. Возможно также, что система внутренних мембран наиболее развита и дифференцирована на ранних стадиях развития культуры. Выяснение правильности обоих предположений возможно при исследованиях на синхронных культурах.

Глава П

Биологические особенности, морфология и ультраструктура JI-форм стрептококка

Первые сведения об Л-формах стрептококка относятся к началу 50-х годов. В 1953 году L. Dienes получил колонии Л-форм ^-гемолитического стрептококка, культивируя стрептококк, вьщеленный из зева больного ангиной, на среде с пенициллином, глицином и сывороткой. В 1954 году J. Sharp также получил пассируемые Л-формы при выращивании уз-гемолитического стрептококка группы А на плотной питательной среде с градиентной концентрацией пенициллина.

Образование Л-форм у стрептококка, как и у других грамположи-тельных бактерий, является результатом нарушения синтеза пепти-догликана. Очевидно, следствием нарушения синтеза пептидогликана является угнетение процесса клеточного деления, stroming (1968) различает 3 фазы в процессе синтеза пептидогликана и считает, что блокирование любой из них может привести к образованию Л-форм, так как нарушение синтеза пептидогликана приводит к разрыву клеточной стенки и выходу содержимого клетки во внешнюю среду. Результатом потери клеточной стенки является "выталкивание" из клетки мезосом. Лишенные мезосом клетки Л-форм теряют способность к организованному делению, которое сопровождается равномерным распределением материала между дочерники клетками. Диспропорция между правильно проходящей репликацией ДНК и процессом отделения клеток при делении клетки приводит, в частности, в результате потери клеточной стенки к полиморфизму, который у Л-форм выражен очень ярко, а также к формированию гигантских клеток. Результатом потери клеточной стенки является изменение отношения клеток к окраске по Граму. JI-формы всех микроорганизмов по Граму окрашиваются отрицательно.

По сравнению с Л-формами грамотрицательных бактерий, которые относятся к группе осмотически независимых, Л-формы грамположи-тельных бактерий, в том числе и Л-формы стрептококка,более чувствительны к изменению осмотического давления и поэтому их относят

Ы ЛЦ б'-'-. к группе осмотичест^гзависимых (83, 107, 108, 180, 199, 200, 222).

Потеря клеточной^оценки и осмотическая хрупкость определяют требования, предъявляем^Л-формами стрептококка к условиям культивирования и составу питательных сред. Оптимальное значение рН для Л-форм стрептококка - 7,4-7,6. Концентрация NaCl для соле-зависимых Л-форм, к которым относятся и Л-формы стрептококка, колеблется от 0,25 до 1,1 М NaCl или других солей, которые могут быть использованы вместо него ( KCl,CaCl2»MgCl2 ). Эти соли выполняют не только роль осмотической защиты, но оказывают также стабилизирующее действие на цитоплазматическую мембрану благодаря связыванию их катионов с остатками фосфолипидов (176, 225, 226). Те же авторы указывают, что необходимые для существования Л-форм осмотические условия может создавать и 0,25-0,88 М сахароза, добавление которой существенно снижает потребность Л-форм в солях.

Для выращивания Л-форм используют чаще всего полужидкий агар (0,3-0,7%) - агаровый гель, приготовленный на триптическом переваре сердечной мышцы крупного рогатого скота с добавлением сыворотки млекопитающих и солевых стабилизаторов. Агаровый гель замещает отсутствующую у Л-форм ригидную клеточную стенку и служит механической защитой для хрупких клеток Л-форм (83).

На плотной питательной среде Л-формы стрептококка, как и Л-формы других микроорганизмов, образуют два типа колоний - тип А и тип В (30, 31, 32, 163). Колонии типа А характерны для стабильных Л-форм, они мелкие (50-100 мкм в диаметре), нежные, белёсые, с перламутровым оттенком. При длительном выращивании этих колоний появляется незначительная пигментация. Колонии типа А лучше растут в аэробных условиях, независимо от присутствия пенициллина. Они могут расти и на жидкой питательной среде. Реверсия колоний этого типа отмечается очень редко (83).

Колонии типа В - с нежным кружевным краем и врастающим в среду центром. Их диаметр - 0,5-2,0 мм. Эти колонии хорошо видны невооруженным глазом. При длительном хранении они приобретают желто-коричневую пигментацию за счет накопления флавина. На среде без пенициллина они быстро реверсируют в бактериальные формы.

Ферментативные свойства Л-форм стрептококка, хотя и изучены недостаточно, тем не менее, установлено, что они значительно изменяются по сравнению с исходной бактериальной клеткой (83, 197, 201). Так, известно, что Л-формы стрептококка группы А, как и бактериальные формы, осуществляют молочнокислое сбраживание глюкозы, глюкозамина, N -ацетилглюкозамина. Гексозы сбраживаются с более высокой скоростью, чем пентозы и фосфорилированные гексозы (201). В отличие от бактериальной культуры, Л-формы стрептококка потребляют ацетат. Они более активны в отношении галактозы, рамнозы, рибозы, глюкозо-6-фосфата и диоксиацетата, чем глюкозы, глюкозамина, N -ацетилглюкозамина, маннозы и фруктозы (83). При этом следует иметь в виду, что это изменение ферментативной активности может быть связано с воздействием высоких концентраций NaCl (186, 187). Кроме дегидрогеназ, у Л-форм ^-гемолитического стрептококка группы А показано наличие АТФ-азы, щелочной и кислой фосфатазы (192). Содержание щелочной фосфатазы у Л-форм ниже, чем у бактериальной формы. Кислая фосфатаза бактерий и Л-форм стрептококка имеет разный оптимум рН (226). По-видимому, при потере стрептококком клеточной стенки оптимум рН кислой фос-фатазы изменяется.

Потеря клеточной стенки, до некоторой степени, обуславливает и различия в химическом составе клетки Л-форм и исходных бактериальных штаммов. Сравнительное изучение химического состава Л-форм /3 -гемолитического стрептококка группы А, протопластов стрептококка группы А, а также исходного стрептококка и ревертан-тов, показали, что в процессе Л-трансформации происходит изменение химического состава клетки, который не полностью восстанавливается при реверсии (7, 107, 170, 196, 199). Так, у Л-форм не были обнаружены такие компоненты группового С-полисахарида, как ДАЛ, глутаминовая и мурамовая кислоты, глюкозамин и рамноза. Однако способность продуцировать М-белок у них сохранилась (198). Вместе с тем, еще в процессе Л-трансформации происходит накопление предшественников в синтезе материала клеточной стенки.

Изучение состава белков мембран Л-форм различных видов бактерий, например, у Proteus, Streptococcus, Staphylococcus, Strep-tobacillus методом электрофореза в полиакриламидном геле показало их видовую специфичность (200). Мембраны Л-форм стрептококка различных групп также различаются по составу белков.

Имеются сведения об изменении нуклеотадного состава /Ь -гемолитического стрептококка группы А в процессе Л-трансформации (207). ДНК стрептококка и его Л-форм - двухспиральная, АТ-типа, содержит одинаковое количество аденина и тимина, РНК - ГЦ-типа. Содержание ДНК у Л-форм на единицу массы остается постоянным, независимо от фазы роста культуры. Содержание РНК изменяется, и в период логарифмической фазы роста культуры её содержание снижается в два раза. Относительно скорости синтеза нуклеиновых кислот у Л-форм, по отношению к исходному стрептококку, существуют разноречивые мнения. L.H. Mattman (1968), М. S. Chattman, L.H.

Mattman (1969) считают, что содержание ДНК в культурах

Л-форм нарастает значительно быстрее, по сравнению с исходным штаммом, в течение одинакового срока инкубации. С. Panos (1967), напротив, говорит о замедлении процесса синтеза нуклеиновых кислот у Л-форм. Изучая нуклеотидный состав ДНК и РНК у исходных видов стрептококка и его Л-форм, с. Panos (1967) делает вывод об отсутствии изменений в его составе при переходе в Л-формы.

Как было сказано выше, Л-формы стрептококка группы А обладают повышенной осмотической хрупкостью. Они очень чувствитель ны к механическим воздействиям, легко разрушаются при приготовлении препаратов (123, 125, 175), центрифугировании (170) или при энергичном встряхивании культур, выросших в жидкой среде (163). Они также очень чувствительны к воздействию ультразвука (125, 175), но устойчивы к действию лизоцима (204, 205), поскольку лизоцим действует на р> -гликозидные связи полисахарид-ного остова адуреинов. По-видимому, потребность в повышенной концентрации солей у солезависимых Л-форм можно объяснить необходимостью стабилизации мембраны, состоящей из липидов. Мембраны Л-форм содержат больше суммарных липидов и гликолипидов и меньше фосфолипидов, чем мембраны протопластов (109, 196, 199, 201). J. КгогаЪе! (1961) и др. утверждают, что содержание липидов у Л-форм значительно возрастает при их культивировании на средах с повышенным содержанием солей.

Отношение Л-форм к антибиотикам определяется механизмом действия последних на бактериальную клетку. Так, Л-формы не чувствительны к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной стенки (пенициллин, бацитрацин и др.). По отношению к антибиотикам, подавляющим синтез белка и нуклеиновых кислот, их устойчивость возрастает только в 2-3 раза или не меняется вообще (83, 198). Такие антибиотики как тетрациклин, хлорамфеникол, эритромицин, стрептомицин оказывают достаточно эффективное действие на Л-формы.

Чувствительность к фагу сохраняется только у нестабильных Л-форм. Стабильные Л-формы утрачивают фаговосприимчивые рецепторы вместе со способностью синтезировать клеточную стенку (232). Однако следует отметить, что эти данные получены для Л-форм других видов бактерий.

В последнее десятилетие появились сведения о способности стабильных Л-форм fb -гемолитического стрептококка персистировать в организме, обуславливя хроническое рецидивирующее течение патологического процесса с повревдением различных органов и тканей организма (II, 13, 67, 209). Это можно объяснить сохранением у них факторов патогенности исходного стрептококка. Так, теряя в процессе Л-тралсформации групповой С-полисахаридный компонент клеточной стенки (137, 138, 148, 163, 166, 172), Л-формы стрептококка группы А сохраняют М-протеин, который представляет собой типо-специфический антиген стрептококков и выявляется методом имцуно-флуоресценции, а также другими методами на поверхности микробной клетки и в цитоплазматической мембране (9, 10). Местом синтеза М-протеина, по данным ряда авторов, является цитоплазматическая мембрана (138, 173). У стабильных Л-форм он обнаруживается в цитоплазматической мембране и легко дифундирует в среду.

Долгое время считали, что антигены цитоплазматической мембраны и цитоплазмы Л-форм идентичны соответствующим антигенам бактериальной клетки (159). Однако различия в химическом состав Л-форм и протопластов стрептококка предполагают специфичность антигенного состава Л-форм.

Действительно, исследование антигенных свойств JI-форм стрептококка группы А показало присутствие у Л-форм комплекса антигенов, совершенно отличных от антигенов цитоплазматической мембраны и цитоплазмы бактериальной формы стрептококка (15, 16, 17, 19, 20, 33, 87, 116, 209).

Впервые специфический антиген Л-форм был получен Crawford Y. (I960) с помощью термической экстракции, а позже - методом ультразвуковой дезинтеграции (15 ). Растворимый антиген стабильных Л-форм по химическому составу отличается от аналогичного антигена исходного стрептококка. Он обладает высокой специфичностью не только по отношению к исходному стрептококку, но и по отношению к Л-формам других видов бактерий.

Кроме М-протеина, у Л-форм /^-гемолитического стрептококка сохраняется способность продуцировать и другие экстрацеллюлярные продукты, являющиеся факторами патогенности стрептококка. К ним относятся гемолизины, стрептокиназа, дезоксирибонуклеаза (142, 143, 191). Кроме того, Л-фюрмы способны синтезировать кардиотроп-ный токсин и содержат антигены, общие с тканями млекопитающих, в частности, с сарколемой сердечной мышцы (59, 138).

В последние годы стала известна роль /3-гемолитического стрептококка группы В и его Л-форм в этиологии многих заболеваний человека. Стрептококк группы В ( Streptococcus agalactiae ) долгое время считался возбудителем заболеваний у животных (167). Сейчас установлена его роль при неонатальных инфекциях человека, а также при целом ряде заболеваний у новорожденных детей и у взрослых (8, 96, 132, 203, 240). В настоящее время интенсивно изучаются ультраструктура, а также биологические и антигенные особенности стрептококка группы В и его Л-форм (130, 134, 140, 141, 185). Так выделены группоспецифический и типоспецифический антигены стрептококка группы В (117, 118, 119, 229). R. Swenson с соавторами (1981) сообщает о выделении из клеток стрептококка группы В растворимого антигена. С помощью иммуноферритинового метода на изолированных клеточных стенках стрептококка этой группы, а ранее у стрептококка группы С,было показано, что типоспецифичес-кий антиген локализуется исключительно на наружной стороне клеточной стенки, а группоспецифический - на внутренней стороне клеточной стенки (238, 239). Л-формы стрептококка группы В синтезируют групповой и типоспецифический антигены, секретируемые в жидкую среду. При этом, групповой антиген Л-форм стрептококка группы В лишь частично идентичен бактериальному. Типовые антигены Л-форм и бактерий - идентичны (136).

Морфология и ультраструктура Л-форм р> -гемолитического стрептококка группы А достаточно хорошо изучена как на светооптичес-ком (32, 80, 83, 99, 102, III, 122, 124, 194), так и на субмикроскопическом уровне (28, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 100, 101, III, ИЗ, 114, 115, 125, 152, 234). Ультраструктура стрептококка группы В и его Л-форм не изучена.

При изучении Л-форм (Ь -гемолитического стрептококка группы А с помощью фазово-контрастной микроскопии и цейтраферной микрокиносъёмки было установлено, что популяция Л-форм стрептококка, как и Л-форм других видов бактерий, крайне полиморфна (32, 82, 41). В процессе этих исследований удалось описать и классифицировать наиболее характерные для Л-форм типы клеток. К первой группе Л-элементов были отнесены "сферические тела, варьирующие по форме, оптической плотности и размерам", ко второй - "элементарные тела или гранулы, располагающиеся экстра- и интрацеллюлярно в крупных сферических телах и вакуолях", к третьей - "аморфные, как бы бесструктурные массы, все время растущие и меняющие конфигурацию" и, наконец, к четвертой - "извитые и нитевидные структуры, значительно варьирующие в размерах" (83). Следует отметить, что к "сферическим телам" авторы относят клетки размером от I до 50 мкм, подразделяя их на тела с гомогенной цитоплазмой и полностью или частично вакуолизированные. Последние также варьируют по форме и размерам и могут содержать различное количество подвижных гранул (83). В настоящее время "сферические тела" подразделяют на шаровидные клетки размером от I до 5 мкм и большие тела от 5 до 50 мкм (68).

Кроме сведений о гетероморфности популяции JI-форм, светоопти-ческими и бактериологическими методами были получены данные о способах репродукции Л-форм. Вопрос о способах репродукции Л-форм представляет большой интерес. Особую роль в этом процессе играют большие тела. По данным ряда авторов, полученным с помощью фазово-контрастной микроскопии и подтвержденным позже методами электронной микроскопии, большие тела могут содержать гранулы и сферические элементы разного размера (21, 22, 82, 99, III). D.J. Bibel, J.W. Lawson (1975) с помощью микроманипулятора удалось выделить из культуры Л-форм стрептококка большие тела, содержащие более мелкие клетки. Поместив большие тела на плотную питательную среду, авторы наблюдали разрыв мембраны большого тела и выход из него мелких клеток, которые дали начало колониям Л-форм. Однако на 100-200 клеток, содержащихся в больших телах, только 3 способны образовывать колонии. Показана также возможность бинарного деления шаровидных тел, причем, в результате такого деления формируются как новые шаровидные клетки, так и нитевидные структуры (III, 125).

Таким образом, на светооптическом уровне был установлен полиморфизм клеток в популяции Л-форм, описаны и классифицированы отдельные морфологические типы клеток и получены некоторые данные о способах их репродукции.

Исследование^Л^орм методом скширукщей электронной микро-скопии^ Сканирующая электронная микроскопия открыла новые возможности для изучения структуры JI-форм. Так, этим методом была изучена структура колоний Л-форм стрептококка группы А, выращенных на милипоровых фильтрах (21, 22, 58, 243). Было показано, что периферическую зону колонии составляют шаровидные клетки различного диаметра. Поперечные бороздки, обнаруженные на их поверхности, по-видимому, соответствуют начальной стадии деления клетки и поэтому свидетельствуют об их жизнеспособности.

Нитевидные элементы, характерные для колоний Л-форм стрептококка, в различные периоды их роста располагаются между шаровидными клетками, выступая над ними вершинами V -образных структур. Ближе к центру колонии находятся большие тела, имеющие сферическую или уплощенную форму. Центральная часть колонии образована бесструктурными аморфными массами (22).

Изучение Л-форм стрептококка группы А по фазам роста (100) позволило установить определенную закономерность в смене одних элементов Л-популяции другими. Так, для лаг-фазы характерны большие тела, хотя в целом в популяции Л-форм они встречаются редко. Следует отметить, что в лаг-фазе большие тела имеют более неправильную форму, чем в логарифмической фазе роста. Это объясняется лабильностью цитоплазматической мембраны в этот период (100, 101). Выделение элементарных тел во внешнюю среду происходит через разрыв цитоплазматической мембраны (22, 48).

Нитевидные структуры также существенно изменяются в процессе роста культуры. На ранних сроках они имеют вид тонких нитей диаметром 0,3 мкм, а на более поздних - их толщина достигает 1,5 мкм. Нити большего диаметра имеют неоднородную структуру и, вероятно, образуются в результате слияния более тонких нитей (22). Следует отметить, что нитевидные структуры не обнаружены у Л-форм стрептококка методом ультратонких срезов. По-видимому, форма нитевидных структур настолько причудлива, что вероятность того, что срез пройдет по их продольной оси, очень мала.

Трехмерность изображения в сканирующем микроскопе дала возможность получить объемное представление о форме отдельных элементов Л-форм. Было показано, что шаровидные и элементарные тела, возникающие в результате почкования, часто сохраняют связь с материнскими клетками, еще больше усложняя тем самым их конфигурацию.

Из^ченис^^кту£ыЛн|)ОЕм методом jjmт]эатонких—с^езов. Метод ультратонких срезов даёт информацию о внутренней структуре клетки. С помощью этого метода было показано, что клетка Л-форм стрептококка имеет все органоиды, свойственные нормальной бактериальной клетке, за исключением клеточной стенки. Долгое время считали, что Л-формы не имеют внутрицитоплазматических мембранных структур. Однако позднее было установлено, что стабильные Л-формы стрептококка группы А, также как и Л-формы других видов бактерий, имеют систему хорошо развитых мембранных структур (45, 75). Ранее сложно устроенные мембранные структуры были описаны для Л-форм стрептококка группы D(113, 114). У Л-форм Str. pyogenes обнаружены также и миелиноподобные структуры, которые иногда отграничивают элементарные тела от остальной части цитоплазмы.

Цитоплазматическая мембрана имеет трехслойное строение. Она характерна для всех морфологических типов клеток Л-форм, однако обнаруживается не у каждой клетки и не на всем протяжении. Интересно, что структура цитоплазматической мембраны у различных штаммов Л-форм str. pyogenes неодинакова (28).

Цитоплазматическая мембрана Л-форм является полноценной в отношении функциональных особенностей.Так,установлено,что она является местом избирательного отложения диформазана при реакциях с тетранитросиним тетразолием (ТНСТ) и,следовательно,местс?'локализации дегидрогеназ (44,50).Кроме того,мембрана всех типов клеток, включая элементарные тела, в значительной степени определяет антигенные свойства культуры,что было показано с помощью иммуноферри-тинового метода (51).

Цитоплазма клеток Л-форм представляется гомогенной,но имеет различную электронную плотность у разных клеток (73). Иногда она занимает большую часть клетки. В других случаях центральная часть клетки занята нуклеоидом.

Интересные сведения получены с помощью метода ультратонких срезов относительно внутренней структуры различных типов клеток популяции Л-форм.Только нитевидные структуры этим методом не удалось выявить.Так,методом ультратонких срезов получены важные сведения о способах формирования элементарных тел внутри шаровидных и больших тел (28,71).Установлено,также,что элементарные тела могут располагаться довольно большими группами в вакуолях как шаровидных (28),так и больших тел,или непосредственно в цитоплазме. При этом,вокруг уплотненного участка цитоплазмы формируется трехслойная мембрана (51,54).Показано также образование элементарных тел путем почкования на поверхности шаровидных и больших тел.

Сведения о структуре больших тел Л-форм стрептококка, полученные методом ультратонких срезов, соответствуют представлениям, сложившимся при сканирующей микроскопии. На поперечном срезе большие тела Str, pyogenes имеют вид крупных,более 5 мкм клеток, неправильной формы, часто сильно вакуолизированных. В вакуолях содержатся элементарные тела разного диаметра и формы. Однако описаны и большие тела, полностью или частично сохранившие цитоплазму. Они могут иметь также хорошо выраженный нуклеоид и сложно устроенные мембранные структуры (100, III). Не менее важные сведения были получены в отношении структуры элементарных тел. Элементарные тела являются важнейшим структурным элементом JI-форм различных бактерий, в том числе и стрептококка. Они представляют собой минимальные репродуктивные частицы культур Л-форм, проходящие через бактериальные фильтры (123). Их размеры колеблются от 0,1 до 1,0 мкм. Неоднородны также элементарные тела и по структуре (51). Различными методами показано, что размеры жизнеспособных элементарных тел должны быть не менее 0,24 мкм (124, 115, 243).

Существует, по крайней мере, две попытки классифицировать элементарные тела. Первая из них принадлежит 1 (1968), который подразделяет элементарные тела на "мелкие элементы" размером от 0,1 мкм до 0,3 мкм круглой или овальной формы с гомогенной или гранулярной структурой и на "большие элементы" более 0,3 мкм диаметром, овальные или причудливо изогнутые с гетерогенной цитоплазмой. Такая классификация элементарных тел, хотя и основана на морфологических признаках, косвенно отражает и их физиологические особенности. Р* Trung et al.,

Другая классификация основана на субмикроскопической структуре элементарных тел. В зависимости от присутствия у них нук-леоида и выраженной трехслойной структуры цитоплазматической мембраны элементарные тела подразделяют на потенциально жизнеспособные и потенциально нежизнеспособные элементы (51).

Таким образом, при изучении Л-форм стрептококка с помощью различных методов световой и электронной микроскопии были выявлены следующие закономерности их структуры: Установлено, что на всех стадиях развития культуры для популяции Л-форм характерен полиморфизм. Были описанк и классифицированы различные типы клеток, составляющие популяцию JI-форм: большие тела, элементарные тела, шаровидные тела, нитевидные структуры, а также бесструктурные массы. Было выявлено взаимоотношение между различными клетками культуры Л-форм в динамике развития культуры. Наконец, были установлены особенности в структуре клетки Л-форм по сравнению с исходными бактериями.

Тем не менее, до настоящего времени остаётся открытым вопрос о том, почему у отдельных клеток, особенно у элементарных тел не всегда выявляется трехслойная структура цитоплазматической мембраны,не у всех клеток в популяции Л-форм. Кроме того, следует учесть, что почти все указанные данные получены для Л-форм стрептококка группы А. Данные по ультраструктуре Л-форм стрептококка группы В в известной нам литературе отсутствуют. Не изучена также локализация антигенов у Л-форм на ультраструктурном уровне.

Глава Ш

Взаимодействие JI-форм стрептококка с фагоцитирующими клетками

В последние годы в литературе все чаще встречаются сведения о роли Л-форм различных возбудителей в развитии патологических процессов, носящих хронический рецидивирующий характер (24, 25, 64, 77, 78, 79, 89, 156, 157, 216). Л-Формы стрептококков групп А и В, по-видимому, также играют определенную роль в патогенезе многих заболеваний стрептококковой этиологии» Об этом свидетельствует выделение Л-форм стрептококка из организма больных ревматизмом, эндокардитом, пиелонефритом, а также при менингите, различных урологических заболеваниях и стоматите (25, 56, 60, 62, 67, 76, 103, 127, 189, 217, 241). Подтверждением патогенности Л-форм стрептококка является моделирование экспериментальных инфекций у различных животных, при инфицировании их Л-формами. Так, используя многократное массированное заражение приматов Л-формами стрептококка группы А, удалось получить модель хронической инфекции (34, 128). При этом, независимо от места введения Л-форм, у животных развивалась экспериментальная ангина с последующим поражением сердца, без развития септического процесса. Бактериальные формы стрептококка также вызывали ангину, однако,, процесс протекал более остро и без терапевтического вмешательства заканчивался летально. В отдельных случаях из организма, инфицированного Л-формами стрептококка, удалось выделить Л-формы через 9-12 дней и даже через 22 дня после заражения.

Однократное внутрибрюшинное инфицирование мышей стабильными Л-формами сопровождалось изменениями в центральных и периферических органах иммуногенеза (35). Ешмантайте Н.А. с соавторами (1975) показала, что при внутрибргошинном вживлении камер с культурой Л-форм гемолитического стрептококка группы А у животных развивается поражение митральных сердечных клапанов. При заражении в сердце выявляются изменения, напоминающие ревматические поражения соединительной ткани (26). 0 персистенции стабильных Л-форм стрептококка в организме мышей и реакции на неё лимфатических узлов и селезенки сообщили также н. Maus, J. Schmitt -Slomska (1977).

Достоверно установить значение персистенции Л-форм в генезе хронической стрептококковой инфекции позволили опыты Вульфо-вич Ю.В. (1974). Методом иммунофлуоресценции была показана динамика распространения персистирующих в организме Л-форм при однократном внутрибрюшинном инфицировании мышей. Уже в первые часы после заражения антиген Л-форм обнаруживался в печени. Затем его количество снижалось и через 13-52 недели возрастало вновь. Антиген Л-форм обнаруживался также в лимфоидной ткани, в сердце, где максимальное его количество отмечалось через 52 недели. В почках персистенция Л-форм стрептококка наблюдалась в течение года. При этом, автор отмечает морфологические изменения соответствующих органов, и даже системные поражения ткани.

Персистенция Л-форм стрептококка и их повреждающее действие было показано и в опытах in vitro, В зависимости от вида используемой культуры клеток и вирулентности Л-форм, авторы наблюдали более или менее ярко выраженный цитопатический эффект, персистен-цию, реверсию и даже размножение Л-форм внутри клеток. Так, сравнивая поведение стабильных и условно стабильных Л-форм стрептококка (str. faecalls ) в культуре клеток почки эмбриона человека, м. Green с соавторами (1974) отметили персистенцию стабильных Л-форм в течение всего срока наблюдения (1-2 месяца), в то время как в питательной среде, предназначенной для культивирования клеток НЕК, Л-формы сохранялись только в течение 24-48 часов. Цитопатический эффект в этом случае не был отмечен. Условно стабильные Л-формы Stг. faecalls реверсировали на 25 день пошпе инфицирования культуры клеток, в то время как в обычных условиях культивирования, они реверсируют уже на 6-10-й день. При этом, реверсия условно стабильных Л-форм сопровождалась гибелью клеток НЕК.

Таким образом, Л-формы стрептококка, попадая в макроорганизм, или формируясь в нем под действием антибиотиков или спонтанно, способны длительно персистировать в организме и даже вызывать генерализованный патологический процесс. Однако до настоящего времени не известны пути распространения Л-форм в макроорганизме, а также роль клеток РЭС и, в частности, макрофагов в развитии патологического процесса, вызываемого Л-формами стрептококка.

Известно, что макрофагальная реакция является одной из первых защитнных реакций организма на внедрение патогенного агента (53). Вместе с тем, существует мнение, что развитие патологического процесса, вызванного Л-формами стрептококка, протекает без выраженной макрофагальной реакции (Вульфович, 1974). Сведения о роли макрофагов в развитии инфекции, вызванной Л-формами, практически отсутствуют, а изучению ультраструктурных особенностей взаимодействия Л-форм стрептококка с макрофагами посвящена только одна работа J. Schmitt-Slomska (1973). Вместе с тем, применение метода электронной микроскопии во многом изменило представление об ответных реакциях организма при инфекционных заболеваниях. Так, показано, что для хронически протекающих инфекционных заболеваний характерна незавершенная фагоцитарная реакция (23). Н.М. Овчинниковым и В.Д. Делекторским (1977) описано свойство клеток очагов поражения при хронически протекающих инфекциях образовывать "полимембранные фагосомы", что обеспечивает длительную персистенцию возбудителей в организме. Показана также возможность персистенции Л-форм гонококка в лимфоцитах и макрофагах. С помощью электронной микроскопии показано, что Л-формы сальмонелл успешно фагоцитируются перитонеальными макрофагами. Однако установить факт персистенции Л-форм в ма1фофагах с помощью этого метода авторам не удалось (18).

В настоящем обзоре мы приводим имеющиеся в литературе сведения об ультраструктурных особенностях взаимодействия Л-форм стрептококка с различными фагоцитирующими клетками, в том числе, и с макрофагами, а также данные об ультраструктуре Л-форм стрептококка внутри различных фагоцитирующих клеток. Вопрос об ультраструктуре и сохранности Л-форм стрептококка внутри макрофагов тем более интересен, что макрофаги могут играть роль в распространении возбудителя в организме.

Л-Формы, в случае инфицирования ими организма или культуры тканей, попадают внутрь клетки путем фагоцитоза. С помощью электронной микроскопии показано, что Л-формы фагоцитируются не только профессиональными фагоцитами (макрофагами и полиморфно-ядерными лейкоцитами), но и другими клетками макроорганизма. Так, М. Green с соавторами (1974) показала, что Л-формы стрептококка попадают в культивируемые клетки почки эмбриона человека путем классического фагоцитоза. Такой вывод автор делает на том основании, что в клетках НЕЙ, наряду с вакуолями, содержащими Л-формы, были обнаружены и вакуоли, содержащие небиологические объекты. Фагоцитозу предшествует адсорбция Л-форм на поверхности фагоцитирующей клетки. Долгое время принято было считать, что прикрепление бактерий к фагоцитирующим клеткам осуществляется с помощью фимбрий. Предполагали также, что М-протеин играет определенную роль в процессе прикрепления бактерий к клеткам-фагоцитам. Однако позже было установлено, что определяющую роль в процессе адсорбции выполняет липотейхоевая кислота (144, 145, 195). Липотейхоевая кислота входит в состав цитоплазматической мембраны. Она способна пенетрировать через поры клеточной стенки и таким образом выступать в роли компонента поверхности клетки. При этом, даже незначительное количество липотейхоевой кислоты обеспечивает прикрепление микроорганизма к фагоцитирующей клетке (202, 237). Наличие же или отсутствие М-протеина у бактерий не отражается на их прикреплении к фагоцитирующим клеткам (91, 97).

По данным электронной микроскопии, адсорбция Л-форм стрептококка на поверхности макрофага наблюдается уже через 10 минут после инфицирования макрофагов (215). Установлено, что Л-формы фагоцитируются медленнее и хуже, чем исходные бактериальные клетки (126, 158, 181). Работами H.J. Harwick с соавторами (1972) было показано, что бактерии фагоцитируются лучше Л-форм, очевидно, вследствие положительного хемотаксиса, обусловленного свойствами клеточной стенки возбудителя.

Процесс захвата Л-форм полиморфноядерными лейкоцитами и макрофагами, по данным J* Schmitt-Slomska (1973), происходит путем истинного фагоцитоза и, по-видимому, не отличается от такового для бактерий. Фагоцитирующая клетка может образовывать выросты цитоплазмы. Также может происходить впячивание участка макрофага, контактирующего с Л-формой. Между мембраной макрофага и мембраной Л-формы сохраняется зазор в 10 нм. Через I час после захвата Л-форм макрофагом фагосома, содержащая Л-формы, ограничена трехслойной мембраной. О наличии фагосомальной мембраны вокруг фагоцитированных JI-форм говорит и Н. G. Harwik с соавторами (1972), подчеркивая, что Л-формы в клетке окружены шестислой-ной мембраной. Рядом с фагоцитарной вакуолью, содержащей Л-фор-мы, у полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов, отмечено присутствие лизосом. Однако процесс слияния лизосом с фагосомами, содержащими Л-формы, наблюдать не удалось (215).

Ультраструктурные особенности процесса взаимодействия бактерий с полноценной клеточной стенкой с фагоцитирующими клетками на примере Е. с о И изучены различными методами электронной микроскопии (сканирующая электронная микроскопия, метод ультратонких срезов и замораживания-травления). P. L. Moore с соавторами (1978) показали, что во время контакта и захвата бактериальной клетки полиморфноядерным лейкоцитом между бактериальной клеткой и мембраной нейтрофила имеется расстояние в 33 нм. Клеточная стенка бактерии сохраняется интактной и на ранней стадии слияния фагосомы с лизосомой. Но уже через 10 минут после проникновения бактерии в лейкоцит происходит разрушение бактериальной клетки, которое сопровождается слиянием фагосомы с лизосомой. Тот факт, что в макрофагах, содержащих Л-формы, не наблюдали слияние фаго-сом с лизосомами, по-видимому, обусловлен отсутствием у Л-форм клеточной стенки(209). Процесс взаимодействия других бактерий с макрофагами аналогичен описанному выше (52, 211).

Как отмечалось ранее, в литературе имеются весьма ограниченные сведения об изменениях ультраструктуры Л-форм стрептококка в процессе фагоцитоза или при их персистировании в различных клетках макроорганизма. Так, электронномикросконическое исследование взаимодействия Л-форм стрептококка группы А с полиморфно-ядерными лейкоцитами и перитонеальными макрофагами мышей показало, что через I час после захвата фагоцитами Л-форм в фагосомах, несмотря на то, что не удалось зафиксировать слияние с ними ли-зосом, находится, по вьфажению автора, "довольно плотный, плохо структурированный материал". В этих же клетках описаны вакуоли "второго" типа, содержащие внутренние мембраны. Эти мембраны не отличаются от мембраны, ограничивающей вакуоль (215). Из вышесказанного следует, что несмотря на то, что автору удалось наблюдать персистенцию и размножение JI-форм стрептококка в культуре диплоидных клеток человека (214), обнаружить персистирующие Л-формы в перитонеальных макрофагах и полиморфноядерных лейкоцитах с помощью электронной микроскопии не удалось. Описанные выше вакуоли, по-видимому, содержали фрагменты разрушающихся Л-форм.

В культуре клеток НЕК морфология Л-форм как стабильных, так и условно стабильных, значительно меняется. В процессе персис-тенции в этой ткани Л-формы претерпевают изменения от "больших мембранных тел" до частиц с большой и малой электронной плотностью небольшого размера (152). Автор считает, что эти частицы представляют собой элементарные тела. Плотные тела размером от 0,05 до 0,15 мкм были найдены после инфицирования клеток НЕК как стабильными, так и условно стабильными Л-формами, плотные тела размером 0,3 мкм - только после инфицирования стабильными Л-формами.

Через 8-14 суток в культуре клеток НЕК наблюдали Л-формы и большой, и малой электронной плотности при заражении как стабильными, так и условно стабильными Л-формами. Через 17-42 суток в клетках, зараженных стабильными Л-формами, в большом количестве отмечались элементы с малой электронной плотностью. В начальные же сроки заражения культуры клеток почки эмбриона человека авторы отмечают лизис больших мембранных тел Л-форм, характерных для контрольной культуры.

Л-Формы стрептококка, выделенные из организма больных людей, представлены большими телами, имеющими в диаметре 25 мкм, и шаровидными телами, содержащими вакуоли с элементарными телами (27, 74), а также свободнолежащими элементарными телами (127).

Таким образом, на основании приведенных данных можно сказать, что Л-формы стрептококка способны размножаться или, по крайней мере, персистировать в клетках, не обладающих выраженным фагоцитирующим действием., Данные о размножении Л-форм стрептококка в макрофагах и других клетках ретикулоэндотелиальной системы отсутствуют.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава I Материалы и методы

I. Штаммы^^о^ганизм^в^и^у^л^вия^их культиви^оьзания.

Известно, что стрептококковые инфекции характеризуются хроническим рецидивирующим течением, развивающимся на фоне персистенции возбудителя в тканях и органах макроорганизма. Исходя из предположения, что стрептококк может персистировать в организме в виде Л-форм, а рецидивы могут быть результатом реверсии Л-форм в исходную культуру, мы избрали в качестве объекта исследований у2>-гемолитический стрептококк групп А и В, их Л-формы и ревер-тант.

1. Стабильные Л-формы стрептококка группы А, штамм 406- L, выделены Г.Я. Каган и B.C. Михайловой из крови больного ревматизмом и эндокардитом, пассируемый в течение 20 лет на питательных средах и утративший способность к реверсии. Л-Формы этого штамма при инфицировании ими различных животных вызывают длительно текущий патологический процесс (12, 35). Поэтому представляет интерес изучение взаимодействия Л-форм этого штамма с макрофагами. Штамм получен из коллекции научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. И.Ф. Гамалеи.

2. Ревертант, штамма 406- R, получен на первых пассажах из Л-форм штамма 406-L , когда он еще легко поддавался реверсии.

3. Поскольку исходным штаммом стрептококка мы не располагали, для сравнения нами был взят штамм Ю- s уЗ-гемолитического стрептококка ( Streptococcus pyogenes), Лансфилдовская группа А ( Bergey* s Manual of determinative bacteriology, 1975), из коллекции того же института. 18-и часовая культура имеет вид кокков, соединенных в цепочки, грамположительна, спор не образует, факультативный анаэроб.

4. ^-Гемолитический стрептококк ( Streptococcus agalactiae), Лансфилдовская группа В ( Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1975), штамм GBS, выделенный из родовых путей женщины (178).

5. Стабильные Л-формы стрептококка группы В, штамм B96-L , полученный под действием пенициллина по общепринятой методике из р> -гемолитического стрептококка группы В штамма gbs (30).

Культуры стрептококка групп А и В, а также ревертант штамма 406- R выращивали на среде, основу которой составлял трипти-ческий перевар мышцы сердца крупного рогатого скота с добавлением 10% нормальной лошадиной сыворотки. Для Л-форм в эту же среду дополнительно вводили бензилпенициллин (1000 ВД/мл) и NaCl до конечной концентрации 2,6%.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Чурилова, Надежда Станиславовна

ВЫВОДЫ

1. При сравнительном изучении ультраструктуры стрептококков групп А и В в лаг-, экспоненциальной и стационарной фазах роста установлено, что они сходны по структуре мембранных органоидов, представленных S -мембранами, но различаются по форме и размерам клетки в различных фазах. Микрокапсула полисахаридной природы развита интенсивнее у стрептококка группы В, чем у стрептококка группы А.

2. У Л-форм стрептококков группы А и В обнаружены мембранные органоиды ламелярного и миелиноподобного типа, но отсутствуют образования типа S -мембран, характерные для исходных стрептококков.

3. Л-формы стрептококка группы В отличаются от Л-форм стрептококка группы А более быстрым темпом развития, что подтверждается результатами подсчета жизнеспособных клеток и нарастанием количества лизированных клеток в динамике развития культуры.

4. Впервые показано, что АТФ-азная активность у Л-форм локализована в цитоплазматической мембране в такой же степени, как у исходного стрептококка. НАДН-дегидрогеназная активность также локализована в цитоплазматической мембране. Структура гидрофобной области мембраны у Л-форм и стрептококка принципиально не различается. Эти данные свидетельствуют о сохранении основных функций цитоплазматической мембраны стрептококка в процессе образования Л-форм.

5. Клетки ревертанта отличаются от клеток исходного стрептококка хорошо развитой микрокапсулой, утолщенной клеточной стенкой (34 нм у ревертанта и 15-17 нм у стрептококка) и присутствием мембранных органоидов ламелярного типа, свойственных Л-формам, помимо S -мембран, характерных для стрептококка.

6. Установлена локализация общих и специфических антигенов у стрептококка, JI-форм и ревертанта, причем, общие антигены обнаружены в цитоплазматической мембране, а антигены, специфические для стрептококка и ревертанта - в микрокапсуле и на поверхности клеточной стенки. У Л-форм имеется большее количество общих детерминант с ревертантом, чем с исходным стрептококком. Впервые на ультраструктурном уровне показано, что стрептококки групп А и В обладают антигенной специфичностью, а их Л-формы имеют больше общих детерминант, чем исходные стрептококки.

7. Показано, что Л-формы стрептококков групп А и В фагоцитируются перитонеальными макрофагами мышей. Основная часть фагоцитированных Л-форм разрушается в течение первых суток, однако,единичные клетки Л-форм в отдельных макрофагах обнаруживаются до б суток, а антиген Л-форм - до 7 и более суток. В опытах in vivo процесс разрушения Л-форм происходит быстрее, чем в опытах in vitro

8. Определены оптимальные условия фиксации клеток для выявления структуры микрокапсулы, клеточной стенки, мембранных органоидов и цитоплазматической мембраны у стрептококков и их Л-форм. Впервые показано, что при использовании специальных методов фиксации у всех клеток в популяции Л-форм может быть обнаружена трехслойная структура цитоплазматической мембраны.

Материалы диссертации использованы в научно-популярном кинофильме "Микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ" (Центрнаучфильм, Москва, 1984), в монографии G.J.Dominque (ed), Cell Wall-Deficient Bacterial Basic Principles and Clinical Significance, London-Amsterdam, 1982, p.456, 459, в учебном процессе кафедры микробиологии Пермского фармацевтического института и кафедры физиологии растений по курсу микробиологии Пермского ордена Трудового Красного Знамени Государственного Университета им. A.M. Горького.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чурилова, Надежда Станиславовна, Москва

1. АВАКЯН А.А., КАЦ Л.Н., ПАВЛОВА И.Б. Атлас бактерий, патогенных для человека и животных. - М.: Медицина, 1972.

2. АРИЭЛЬ Б.М. Взаимодействие микроорганизмов с клетками хозяина в процессе фагоцитоза. Архив патологии, 1976,т.38, № I, с. 80-88.

3. БИРШОВА В*И. Мембранные структуры микроорганизмов. М.: Наука, 1973.

4. БИРШОВА В. И. Единство структурной организации мембран у микроорганизмов эукариот и прокариот. - Автореф. дисс. докт., М., 1981.

5. БИРШОВА В.И., ПОГЛАЗОВА М.Н. О гетерогенности бактериальных мезосои. Успехи микроб., 1977, т.12, с.28-41.

6. БИРШОВА В.И., ПОГЛАЗОВА М.Н., КОСТРИКИНА Н.А. О биологическом значении нуклеидосом у бактерий. Микробиология, 1980, т.49, № 3, с.497-513.

7. БИТКОВА А.Н., КОПТЕЛОВА Е.И., КОВТОРИНА Р.П. Химический состав Л-культуры р -гемолитического стрептококка группы А и её ревертантов. Вестн. АМН СССР, 1965, т.20, № 81, с.29-31.

8. БУЛГАКОВА Т.Н., ГРАБОВСКАЯ К.Б., ТОТОЛЯН А.А. Стрептококки группы Б в патологии человека. Ж. микроб, эпидемиол., 1983, № 8, с.7-17.

9. ВВЕДЕНСКАЯ О.И., КАЦ Л.Н. Изучение методом иммуноэлектрофоре-за антигенов клеточной стенки одного из типов стрептококка группы А. Ж. микробиол. эпидемиол., 1966, № 6, с.138-142.

10. ВВЕЩЕНСКАЯ О.И., ХАТАНЕВЕР М.Л., КАЦ Л.Н. Изучение антигенов цитоплазма стрептококка группы А типа 29. Ж. микроб, эпидемиол., 1969, № 10, с.7-И.

11. ВУЛЬФОВИЧ Ю.В., РАСКОВА Т.М., КАГАН Г.Я. Обнаружение антигена Л-форм (!> -гемолитического стрептококка в тканях экспериментально зараженных мышей при помощи реакции иммунофлуорес-ценции. Бюлл. экспер. биол. и мед., 1972, № 9,с.65-67.

12. ВУЛЬФОВИЧ Ю.В. Персистенция и повреждающее действие стабильных Л-форм стрептококка группы А в условиях длительного эксперимента. Автореф. дисс.канд., М., 1974.

13. ВУЛЬФОВИЧ Ю.В., НЕУСТРОЕВА В.В., РАСКОВА Т.М. Выделение Л-форм стрептококка из организма инфицированных мышей различными методами. Вестн. АМН СССР, 1976, № 5,с.37-41.

14. ГАЙЕР Г. Электронная гистохимия. М., Мир, 1974.

15. ГОНЧАРОВА С.А., ЧУМАЧЕНКО Н.В., СОНИНА Н.В. Некоторые антигенные особенности стабильных л-Ф°рн гемолитического стрептококка группы А. Й1кроб/ол. журн., 1979, № 7, с.56-61.

16. ГОНЧАРОВА С.А. Антитела к стабильным л~Ф°Рмам стрептококка группы А у экспериментально инфицированных животных и больных ревматизмом. Автореф. дисс.канд. М., 1980.

17. ГОНЧАРОВА С.А., ВУЛЬФОВИЧ Ю.В., КОНСТАНТИНОВА Н.Д. Определение антигенной специфичности стабильных Л-форм стрептококка группы А различными методами. Ж. микроб, эпидемиол., 1981, № 8, с.78-82.

18. ГОРЕЛОВ А.Л. Биологическая характеристика Л-форм возбудителя брюшного тифа и их способность к персистенции. Автореф. дисс. канд. М., 1982.

19. ГОРИНА Л.Г., НЕВЕРЖЕЕВА И.В., ГОНЧАРОВА С.А. Использование реакции агрегатгемагглютинации для выявления антигенов

20. Л-форм гемолитического стрептококка группы А и микоплазм. -- Лабораторное дело, 1981, № II, с.686-688.

21. ГОРИНА Л.Г., ЖЕВЕРЖЕЕВА И.В., ЧУМАЧЕНКО Н.В. Выявление антигена Л-форм гемолитического стрептококка группы А в сыворотках больных ревматизмом после разделения имунных комплексов. -- Ж. микроб, эпвдемиол., 1981, № 7, с.42-45.

22. ШЕВСКАЯ С.А., КАЦ Л.Н., МИХАЙЛОВ А.Б. Л-Формы стрептококка в сканирующем электронном микроскопе. I. О структурных элементах Л-колоний. Ж. микроб, эпидемиол., 1976, № 8, с. 29-32.

23. ГШВСКАЯ С.А., КАЦ Л.Н., ВУЛЬФОВИЧ D.B. Изучение Л-форм стрептококка в сканирующем электронном микроскопе. П сообщение. Динамика структурных элементов Л-колоний на разных стадиях роста. Ж. микроб, эпидемиол., 1977, № 2, с.18-22.

24. ДЕЛЕКТОРСКИЙ В.В. Клеточные основы противоинфекционной защиты (Материалы ультраструктурного анализа и количественной электронной микроскопии). В сб.: ХХХУП Всесоюзная научная сессия, посвященная Дню радио. Тезисы докладов, Москва, 1984,с.95.

25. Д0Р0ЖК0ВА И.Р. Формы персистирования микобактерий туберкулеза в организме человека. Автореф. дисс.докт. ,М., 1974.

26. ЕЗПМАНТАЙТЕ Н.А. Биологическая характеристика и патогенные потенции Л -форм стрептококков (экспериментальные и клинические исследования). Автореф. дисс.докт.,Вильнюс, 1974.

27. ЕЗПМАНТАЙТЕ Н.А., ПТАШЕКАС Р.С., АСТРАЦЕКАЙТЕ И.И. Экспериментальное изучение роли Л -форм гемолитического стрептококка в инфекционной патологии. Ж. микроб, эпидемиол., 1975, № 2, с.62-65.

28. ЕЗПМАНТАЙТЕ Н.А., РИМКУНАС А.И., ШАУЛАУСКЕНЕ И.И. Взаимодействие Л-форм стрептококков и клеток культур тканей. Ж. микроб. эпидемиол., 1980, № II, с.80-83.

29. ЖЕВЕРЖЕЕВА И.В., ВУЛЬФОВИЧ Ю.В., АМБАЩЦАНЯН Р.С. Получение in vitro стабильных Л -форм ft> -гемолитического стрептококка группы А типов I и 12. -К. микроб, эпвдемиол., 1976, № 10, с.77-79.

30. ЗАИЧКИН Э.И. Ультраструктурная топография мембран микроорганизмов. Автореф. дисс.докт., Оболенск, 1982.

31. КАГАН Г.Я., ЛЕВАШОВ B.C. О методике получения Л -форм гемолитического стрептококка группы А и их реверсии в бактериальные культуры. Ж. микроб, эпидемиол., 1959, № II, с.68-73.

32. КАГАН Г.Я., МИХАЙЛОВА B.C. Ввделение Л -форм стрептококка из крови больных ревматизмом и эндокардитом. Ж. гиг. эпид. микробиол. (Прага), 1963, №7, с.291-295.

33. КАГАН Г.Я. Биологические особенности Л-форм некоторых патогенных видов бактерий. Автореф. дисс. докт. М., 1963.

34. КАГАН Г.Я., ЕРШОВ Ф.И., КОПТЕЛОВА Е.И. Об антигенной структуре Л -форм гемолитических стрептококков. Билл, экспер.биол. и мед., 1965, № I, с.78-81.

35. КАГАН Г.Я., ШМИТТ-СЛОМСКА Ж., КОПТЕЛОВА Е.И. Экспериментальная инфекция у обезьян, вызванная Л -формами стрептококка группы А. Ж. микроб, эпидемиол., 1972, № 2, с.107-112.

36. КАГАН Г.Я., ВУЛЬФОВИЧ Ю.В., ГУСМАН Б.С. Значение Л-форм стрептококка в патогенезе хронической инфекции и постинфекционных осложнений, Вест. АМН СССР, № 5, с.41-49^1976.

37. КАГАН.Г.Я., ШМИТТ-СЛОМСКА Ж., ГОНЧАРОВА С.А. Некоторые антигенные особенности л -форм стрептококка группы В. Ж. микроб. эпидемиол., 1983, №4, с.33-36.

38. KAFP Я. Макрофаги. М.: Медицина, 1978, с. 188.

39. КАЦ Л.Н., ВВЕДЕНСКАЯ О.И. О субми!фоскопической структуре гемолитического стрептококка. Ж.микроб.эпидемиол.,1966, № 8, C.II3-II6.

40. КАЦ JI.H., ВОЛКОВА Н.А. Цитохимическое и электронномикроско-пическое исследование капсул некоторых бактерий. Микробиология, 1966, т.35, № 4, с.660-666.

41. КАЦ Л.Н., СОЛОВЬЕВ Н.Н., ВОЛКОВА Н.А. Методы цитологического исследования бактериальных капсул. Ж. мшфоб. эпидемиол., 1966, № 4, с.95-98.

42. КАЦ Л.Н., ВОЛК А.В., КОНСТАНТИНОВА Н.Д. Ультраструктура Л-форм. Сообщение I. Мус. tuberculosis -Ж. микроб, эпиде-миол., 1974, №4, с.73-77.

43. КАЦ Л.Н., КОНСТАНТИНОВА Н.Д. 0 локализации меченных ферри-тином антител внутри бактериальной клетки. - Ж. микроб, эпи-демиол., 1974, № 2, с.96-99.

44. КАЦ Л.Н., КОНСТАНТИНОВА Н.Д., РАСКОВА Т.М. Ультраструктура

45. Л-ф°Рм* Сообщение Ш. Л-Формы Salmonella typhi И Proteus vulgaris Ж. микроб, эпидемиол., 1975, № 3, с.19-23.

46. КАЦ Л.Н., КОНСТАНТИНОВА Н.Д., ХАРАТЬЯН Е.Ф. Ультраструктура

47. Л -форм. Сообщение У. О локализации дегидрогеназной активности в клетках Л -форм. Ж. микроб, эпидемиол., 1976, № 2,с.67--69.

48. КАЦ Л.Н. Мембранный аппарат Л-форм бактерий. В кн.: Биомембраны. Структура, функции, методы исследования. Ред. М.Е. Бек-кер, Г.Я. Дубур. Рига: Зинатне, 1977, с.105.

49. КАЦ Л.Н., КОНСТАНТИНОВА Н.Д., ШУЛЬГА М.А. Система внутренних мембран у Л -форм. Изв. АН СССР, сер. биол., 1977, № I,с.140-144.

50. КАЦ Л.Н., ШЕВСКАЯ С.А., ПРОЗОРОВСКИЙ С.В. Морфологическая характеристика шаровидных элементов Л-форм бактерий по данным сканирующей электронной ми1фоскопии. Ж. микроб, эпидемиол., 1977, № 7, с.67-70.

51. КАЦ Л.Н., ГУЛЕВСКАЯ С.А., ПРОЗОРОВСКИЙ С.В. Морфологическая характеристика больших тел в культуре Л-форм бактерий по данным сканирующей электронной микроскопии. Ж. микроб, эпи-демиол., 1977, № 10, с.108-111.

52. КАЦ Л.Н., Субмикроскопическая структура микроорганизмов с дефектной клеточной стенкой. Успехи микробиологии, 1980, т.15, с.186-195.

53. КАЦ Л.Н., ХАРАТЬЯН Е.Ф. Изучение локализации окислительных ферментов методом электронномикроскопической цитохимии. Ж. микроб, эпидемиол., 1980, № 3, с.16-22.

54. КАЦ Л.Н., КОНСТАНТИНОВА Н.Д., ТАРТАКОВСКИЙ И.С., ПРОЗОРОВСКИЙ С.В. Некоторые особенности в структуре элементарных тел у Л-форм бактерий. Ж. микроб, эпидемиол., 1981, № 5, с.57-62.

55. КИРИЛЛОВА Ф.М., ТИМЧЕНКО Н.Ф. Электронно-микроскопическое изучение взаимодействия jereinia pseudotuberculosis с макрофагами и клетками Не 1а Ж. микроб, эпидемиол., 1984, № 7, с.95-96.

56. КОНСТАНТИНОВА Н.Д., КАЦ Л.Н., К0ТЛЯР0ВА Г.А. Ультраструктура Л-форм. 2 сообщение. Л-Формы Lysteria monocytogenes -- Ж. микроб, эпидемиол., 1975, № 2, с.58-61.

57. К0ПТЕЛ0ВА Е.И. Л-Формы менингококка и их значение при гнойных менингитах. Автореф. дисс.докт., М., 1974.

58. К0ЧЕМАС0ВА З.Н., ШУЛЬЦЕВ Г.П., КАССИРСКАЯ Н.Т. Л -Формы бактерий в моче больных хроническим пиелонефритом. I. микроб, эпидемиол., 1975, № 4, с.102-104.

59. КУШНАРЕВ В.М., СЕЛЕЗНЕВА В.П. Изучение ультраструктуры макрофагов перитонеального экссудата иммунных и нормальных животных. Цитология, 1967, т. 9, № I, с.88-90.

60. ЛЕВИНА Г.А., ЛАВРОВА Л.Н., СЕМЕНОВА Л.Р. Применение метода выращивания микроорганизмов на миллипоровых фильтрах для изучения их структуры со сканирующим электронным микроскопом.- Ж. микроб, эпидемиол., 1980, № 2, с.98-102.

61. ЛЯМПЕРТ И.М. Этиология, иммунология и иммунопатология ревматизма. М.: Медицина, 1972.

62. МАШКОВ А.В. Видовая принадлежность Л-форм, выделенных из крови детей при гломерулонефрите и хроническом пиелонефрите.- Ж. микроб, эпидемиол., 1978, № I, с.35-36.

63. МАЯНСКИЙ Д.Н. Клетка Купфера и система мононуклеарных фагоцитов. Новосибирск: Наука, Сибирск.отделение, 1961.

64. НЕУСТРОЕВА В.В., ВУЛЬФОВИЧ Ю.В., КАГАН Г.Я. Локализация и возможный цикл развития микоплазм и Л-форм бактерий в культуре клеток. Бюлл. экспер. биол.мед», 1976,т.£1, № 4,с.439-440.

65. НИКИТИНА Э.С. Методы синхронизации бактериальных культур.- Изв. АН СССР, сер.биол., 1968, № 4, с.590-593.

66. ОВЧИННИКОВ Н.М., ДЕЛЕКТОРСКИЙ В.В., ТУКАНОВА Е.И. Возможность образования Л -форм гонококка при хронической гонорее.- Вестник дерматол. венерол., 1977, № 4, с.17-25.

67. ПАВЛОВА И.Б., РАТГАУЗ Г.Л. Субмикроскопическая структура стафилококка в процессе токсинообразования. Ж. микроб, эпидемиол., 1970, № 3, с.85-87.

68. ПОПОВ В.Л., БЕСКИНА С.Р., ШАТКИЙ А.А. Электронно-микроскопическое определение локализации группоспецифического антигена гальпровий (хламидий) прямым иммунопероксидазным методом.- Ж. микроб, эпидемиол., 1976, № 12, с.70-73.

69. ПРОЗОРОВСКИЙ С.В., ЛЕВИНА Г.А., БЛИНОВА С.В. Вестник АШ СССР., 1965, т. 20, № 8, с.23-27.

70. ПРОЗОРОВСКИЙ С.В., КАЦ Л.Н., КАГАН Г.Я. Л -Формы бактерий.- М., 1981.

71. РАТГАУЗ Г.Л. Морфологические особенности, антигенная структура и токсиногенез патогенного стафилококка. Автореф. дисс. канд., М., 1970.

72. РАЙХЛЙН Н.Т., БУХВАЛОВ И.Б. Перспективы свинцового метода Гомори в электронно-микроскопической гистохимии АТФ-азы.- Арх. анат.гистол.эмбриол., 1973, т.65, № 12, с.109-118.

73. RIMKUNAS А, Streptokoko iz jo L-formu ultrastruktura. -Vilnius, Mokslas, 1976.

74. РИМКУНАС А., КАЦ Л.Н., МОРОЗ Л.Ф. Об изменении ультраструктуры гемолитического стрептококка под действием пенициллина и грамицидина С. Антибиотики, 1970, № 12, с.1099-1101.

75. РИМКУНАС А.И., ЧУМАЧЕНКО Н.В. Ультраструктура стрептококка на разных этапах Л -трансформации. Ж. микроб, эпидемиол., 1971, № 4, с.65-68.

76. РИМКУНАС А.И., ШАУЛАУСКЕНЕ И.И., ЕШМАНТАЙТЕ Н.А. Субмикроскопическая структура Л -форм стрептококков, выделенных из живого организма. Ж. микроб, эпидемиол., 1978, № 4,c.II0-II2.

77. РИМКУНАС А.И., ШАУЛАУСКЕНЕ И.И., ЕШМАНТАЙТЕ Н.А. Внутрицито-плазматические мембранные структуры у Л -форм гемолитического стрептококка. Ж. мшфоб. эпидемиол.,1978, № 9,с.21-22.

78. СУХОДОЛЬСКАЯ А.Е., РУДЕНКО А.В. Современное состояние вопроса и перспективы развития учения о роли Л-форм бактерий и микоплазм при урологических заболеваниях человека. Ж. микроб. эпидемиол., 1975, №8, с. 122-126.

79. ТОЛМАЧЕВА Т.А. Реверсия Л-форм бруцелл in vitro и in vivo и свойства полученных ревертантов. Д. микроб, эпидемиол., 1975, № I, с.145-146.

80. ТОЛМАЧЕВА Т.А., КАЦ Л.Н. Биологические свойства и ультраструктура бруцелл в процессе Л-трансформации и реверсии. Ж. микроб. эпидемиол., 1977, № I, с.90-93.

81. ТОЛМАЧЕВА Т.А., КАЦ Л.Н., ГРЕКОВА Н.А. Структура клетки и па-тогенность бруцелл на ранних этапах Л -трансформации. Ж. микроб, эпидемиол., 1979, № 8, с.63-67.

82. ТИМАКОВ В.Д., КАГАН Г.Я. Биология Л -форм бактерий. М.: Медицина, 1961.

83. ТИМАКОВ В.Д., КАГАН Г.Я. Л-Формы гемолитического стрептококка и их обнаружение в крови больных ревматизмом и септическим эндокардитом. Вопр. ревматизма, 1962, № 2, с.3-8.

84. ТИМАКОВ В.Д., КАГАН Г.Я. Семейство Mycoplasraataceae и Л -формы бактерий. М.: Медицина, 1967.

85. ТИМАКОВ В.Д., КАГАН Г.Я. Л -Формы бактерий и семейство мусоplasmataceae в патологии. М.: Медицина, 1973.

86. ТИМАКОВ В.Д., КАГАН Г.Я. Л-Формы бактерий, семейство Мусоplasmataceae и проблема микробного персистирования. -- Ж. микроб, эпвдемиол., № 4, с.3-10.

87. УЧИТЕЛЬ И.Я. Лиз ос омы и иммунитет. Ж. микроб, эпидемиол., 1973, № 8, с.64-70.

88. УЧИТЕЛЬ И.Я. Макрофаги в иммунитете. М.: Медицина, 1978.

89. ЧУМАЧЕНКО Н.В.,СМИРНОВА Т.Д. Метод иммунизации лабораторных животных микоплазмами и Л-формами бактерий.-Лаб. дело, 1974, I? 1,с.39-41.

90. ШАТКЙН А.А.,ВЕСНИНА С.Р.,ПАНКРАТОВА В.Н. Индикация антигенов гальпровий (хламидий ) прямым иммунопероксидазным' методом.-К» микроб.эпидемиол.,1976,Р 9,с.74-78.

91. ШМЕЛЕВ Н.А.,ДОРОККОВА И.Р.,ЗЕМСК0ВА З.С. Персистирование возбудителя туберкулеза в организме в виде Л-форм и их повреждающее действие.-Вест* АШ СССР, $ 5,с. 29-36.

92. ШУВАЛОВ Л.П.,ТОЛМАЧЕВА Т.А. Изучение взаимодействия Л-тран-сформированных бруцелл с культурой перитонеальных макрофагов.- Ж. микроб, эпидемиол», 1974, Ш 6, с. 15-19.

93. ALKAN М.,ОЕЕК L. ,BEACHEY Е.Н. Adherence of pharyngeal and skin strains of group A streptococci to human skin and oral epithelial cells,-Infect Immun.,1977,v.18,pp. 555-557.

94. ANDRES G.A.,HSU K.S., SEEGAL B.C. Immunoferritin technique for the identification of antigens by electron microscopy. In? HandU-book of experimental immunology. Ed. D.M. Weir, Black-well Oxford,1967,pp.527-570.

95. AVRAMEAS S«, Immunoenzyme techniques: Enzymes as markers for the location of antigens and antibodies.-Int. Rev. Cytol., 1970,v.27, pp. 349-385.

96. AVRAMEAS S. ,TERITYTTCK T. Peroxidase labelled antibody and Pab conjugates with enhaced itracellular penetration.-Immunochemistry,I97I,v« 8,pp,II75-II79.

97. BAYER A.S. Comparative in vitro bactericidal activity of ce-fonicid, ceftizoxime and penicillin against group В streptococci. Antimicrob. Agents Chemother., 1982, v.21, N 2, pp.344 346.

98. BEACHEY E.H., OPEK J. Epithelial cell binding of group A streptococci by lipoteichoic acid on fimbriae denuded M-pro-tein. J. Exp. Med., 1976, v. 143, pp. 799 - 771.

99. BENCHETRIT L.C., AVELINO C.C., BARRUCAND L. Hyaluronidase production by group A,B,C and G streptococci: a statistical analysis. Zntrbl. Bakt. Parasit., 1984, v.257, pp. 27-37.

100. BIBEL D.J. , IiAWSON J.W. Reversion of streptococcal protoplast J. Bact., 1972, v. 112, N 1, pp. 611 - 614.

101. BIBEL D.J., LAWSOW J.W. Development of streptococcal L-form colonies . J. Bact., 1972, v. 112, N 1, pp. 602 - 610.

102. BIBEL D.J., LAWSON J.W. Scanning electron microscopy of L-phase streptococci II. Growth in broth and upon milipore filters. Canad. J. Microb., 1972, v. 18, N 8, pp. 11791184.

103. BIBEL D.J., LAWSOU J.W. Morphology and viability of large bodies of streptococcal L-forms. Infect. Immun., 1975, v. 12, К 4, pp. 919 - 930.

104. BRANTON D., BULLIVAHT S., GILULA N.B. Preeze etching no -menclature. -Science, 1975, v. 190, N 4209, pp. 44 - 46.

105. CORFIELD P.S., SMITH D.G. Ultrastructural changes during propagation of a group D streptococcal L-form. Arch. Mic-rob., 1970, v. 75, N 1, pp. 1 - 9.

106. COUSSONS R.T. , COLE R.M. The size and replicative capaci -ties of small bodies of group A streptococcus L-forms. In: Currant Research on Group A Streptococcus. Ed. R. Caravano, Amsterdam, 1968, pp. 327 - 331.

107. Crawford Y.E. Studies of a complement fixing antigen from group A streptococcal L-forms. J. Immunol., 1960, v. 84, N 1, pp. 85 - 92.

108. CUMMING C.G., ROSS P.W. , POXTON J.R. Immunochemical studies on the cell wall antigen of group В streptococcus, type 1b. - J. Gen. Microb., 1981, v. 126, pp. 477 - 482.

109. CUMMING C.G., ROSS R.W., POXTON S.R. Further studies on the immunochemical nature of the cell wall antigens of group Б Streptococcus type 1a. - In: Abstr. VIII Intern. Symp. Strep, and Streptoc. Dis. Lund, 1981, pp. 91 - 92.

110. CUMMING C.G., HAY A.J., ROSS P.W., POXTON J.R. The isolation and immunochemical characterization of a cell-wall carbo -hydrate and membrane lipocarbohydrate antigen of group В Streptococcus, type II. J. Med. Microb., 1983, v. 16, pp. 63 - 60.

111. DALTON A. A chrome-osmirum fixative for electron microsco -py. Anat. Rec., 1955, v. 121, pp. 281 - 284.

112. DIENES L. L- type cultures isolated from streptococci. -Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1953, v. 83, IT 3, pp. 579 583.

113. DIENES L., BULLIVANT S. Comparison of the morphology of PPLO and L-forms of bacteria with light and electron mic -roscopy. -Ann. N.Y. Acad. Sci., 1967, v. 143, pp. 719-730.

114. DIENES L., MADOFF S., BULLIVNAT S. Study of I-forms as seen in thin sections with the electron microscope. In: Current Research on Group A Streptococcus. Ed. R. Caravano, Amsterdam, 1968, pp. 342 - 345.

115. DOMINQUE G.J., LOYD K., SCHLEGEL J.U. In vitro phagocytosis of transitional phase bacterial variants utilizing autora -diography. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1974, v. 146, pp. 635 - 642.

116. DOMINQUE G.J., SCHLEGEL J.U., HEIDGER P.M. Novel bacterial structures in human Bblood. Cultural isolation ultrastructu-ral and biochemical evaluation. In: Spheroplasts, Proto -plasts and L-forms of Bacteria. Ed. J. Roux, Paris, 1976, pp. 279 - 298.

117. DRACH G., SCHMITT-SLOMSKA J. Incidence of cellular and humoral factors on group A streptococcal L-forms.II. Killing effect of sera and phagocitic cells. Ann. Inst. Pasteur, 1973, v. 124 B, pp. 463 - 476.

118. ШОВДЗ K,F*f WETZEL B.K., HEPEEL L.A. Biochemical and cyto-chmeical evidence for the polar concentration of periplas -mic enzymes in a "Minicell" strain of E. coli. J. Bact., 1970, v. 104, pp. 543 - 548.

119. DURHAM D.L. , MATTINGLY S. J. , DO RAW T.J. Correlation between the production of extracellular subetanceB by type III group В streptococcal strains and virulence in a mouse model. -Infect. Immun., 1981, v. , pp. 448 454.

120. EDELSTEIN E., PARUS L., TSIEN H.C., DANE0-M00RE H. Nucleoids structure in freeze-fractures in Streptococcus faecalis ef -fects of filtration and chilling. J. Bact., 1981, v. 146, IT 2, pp. 798 - 803.

121. EDWARDS M.S., FUSELIER P.A., RENCH M.A., KASPER D.L. Class specificity of naturally aequired and vaccine-induced antibody to type III group В streptococcal capsular polysaccharide. Infect. Immun., 1984, v. 44, N2, pp. 257 - 261.

122. EMYANITOFF R.G., RUCINSKY Т.Е., BIRDSELL D.C. Electron mic -roscopy of antibody-labelled cells of Streptococcus mutans. Canad. J. Microb., 1976, v. 22, N 6, pp. 891 - 895.

123. FERRIERI P. Biochemical and immunological characterization of the extracellular nucleases group В streptococci. J. Exp. Med., 1980, v. 151, N 1, pp. 56 - 68.

124. FESCHETTI V.A., MANJULA. B.N,, FAZIO M. The X-helical coiled -coil structure in streptococcal M protein. In: ABSTR. VIII Intern. Symplon Strept. and Streptoc. diseases., Lund, 1981, pp. 85 - 86.

125. FLORES A.E., FERRIERI P. Conversion and growth in the L-phase of group B, type III streptococcal strein. In: Abstr. VIII Intern. Syrup, on Strept. and Streptoc. diseases, Lund, 1981, pp. 127 - 131.

126. FREIMER E.H. Studies of L-forms and protoplasts of group A streptococci. II. Chemical and immunological properties of the cell membrane. J. Exp.Med.,1963, v. 117, pp.377 - 413.

127. GEMMEL C.G., PETERSON P.K., REGELMAN W. Phagocytosis and killing of Streptococcus pyogenes by human alveolar macro -phages. Infect. Immun., 1981, v. 32, N 3, pp. 1298 - 1200.

128. GEUNG M.K., MATTINGLY S.J. Biosynthesis of cell wall pepti-doglycan and polysacharide antigens of protoplasts of type III group В Streptococcus. J. Bact., 1983, v. 154, N 1, pp. 211 - 220.

129. GEUNG M.K., MATTINGLY S.J. Biosynthetic capacity far type -specific antigen synthesis determines the virulence of se -rotype III streins of group В streptococci. Infect. Immun. 1984, v. 44, N 2, pp. 217 - 221.

130. GINSBURG J. Mechanisms of cell and tissue injury induced by group A streptococci: Relation to poststreptococcal seque -lae. J. Infect. Dis., 1972, v. 126, N 3, pp. 294 - 341.

131. GINSBURG J. Mechanisms of cell and tissue injury induced by group A streptococci :Relation to <;paststreptococcal seque -lae. J. Infect. Dis., 1972, v. 126, N 4, pp. 419 - 456.

132. GIBBONS R.J., van HAUTE J. Bacterial adherence in oral microbial ecology. ANN. Rev. Microb., 1975, v.29, pp. 19-44.

133. GOLDSCHMIDT J.P., PANOS C. Teichoic acids of Str. agalac -tiae: chemistry, cytoxicity and effect on bacterial adhe -rence to human cells in tissue culture. Infect. Immun., 1984, v. 43, N 2, pp. 670 - 677.

134. GOMORI G. Microscopic histochemistry principles and practice. University of Chicago Press,1952»

135. GOODER H. Streptococcal protoplasts and Ъ-form growth induced by muralytic enzymes. In: Microbial : protoplasts,sphe-roplasts and L-forms. Ed. L.B. Guze, Baltimoore, 1968, pp. 40 - 51.

136. GORDON G.B., MILLER L.R., BEUSCH K.G. Studies on the intra -cellular digestive process in mammalian tissue culture cells. J.Cell Biol., 1965, v. 25, N 2, part 2, pp. 41 - 56.

137. GOREN M.B. Phagocyte lysosomes: interactions with infections agents, phagosomes and experimental perturbations in func -tions. Ann. Rev. Microbiol., 1977, v. 31, pp. 507 - 512.

138. GOSH B.K., MURRAY R.G. Pine structure of Listeria monocyto -genes in relation to protoplast formation. J. Bact., 1967, v. 93, N 1, pp. 411 - 426.

139. GREEN M.T., HEIDGER P.M., DOMINQUE G. Demonstration of the phenomena of microbial persistence and reversion with bacterial L- forms in human embryonic kidey cells. Infect. Im -num., 1974, v. 10, N 4, pp. 889 - 914.

140. GREEN M.T., HEIDGER P.M., DOMINQUE G. Proposed reproductive cycle for a relatively stable L-phase variant of Streptococcus faecalis. Infect. Immun., 1974, v. 10, N 4, pp.915-927.

141. HAHN G., TOLLE A. Vergleichende Untersuchungen zur Charakte-risierung von aus Mensch und Rind isolierten Gruppe В -Streptokokken mit Hilfe .eines Bakterizide Tests. Z. Bakt. Parasit., 1981, Abt. I, Orig. A, Bd. 249, N 2, S.15-18.

142. HANDLEY P.S. , JACOB A.E. Some structural and physiological properties of fimbrial of Str. faecalis. J. Gen. Microb., 1981, v. 127, pp. 289 - 293.

143. HANDLEY P.S., CARTER P.L., FIELDING J. Streptococcus salivarius strains carry either fibrils or fimbriae on the cell surface. J. Bact., 1984, v. 157,N 1» PP* 64 - 72.

144. HATTEN B.A., SULKIN S.E. Intracellular production of Bru -cella L-forms. J. Bact., 1966, v. 91, pp. 285 - 296.

145. НАТТЕЖ B.A., SULKIU S.E. Possible role of Brucella L-forms in the patogenesis of Brucellosis. In: Microbial proto --plasts, spheroplasts and L-forms. Ed. L.B. Guze, Baltimore, 1968, pp. 457 - 459.

146. HARWICK H.J., BARAJAS L., MONTGOMERIE J.Z. Phagocytosis of microbial L-forsm. Infect. Immun., 1972, v. 5, pp. 976 -981.

147. HAVLI&EK J. Some notes on the antigenic structure of group A Streptococcus L-forms. In: Current Research on Group A Streptococcus. Ed. R. Caravano, Amsterdam, 1968,pp.346-349»

148. HAYASHI T.T., MACKAWA S., GAMAUCHI T. Studies on serological typing of group В steptococci by slide agglutination reaction. In: Abstr. VIII Intern. Symp. on Strept. and Streptoc. diseases, Lund, Sweeden, 1981, pp. 48 - 49.

149. HEHRIKSEN D.A., HENRIKSEN J. Twitching mobility and possesion of polar fimbriae in spreading Str. sanguis. Acta pathol. microbiol. Scand., 1975, v. 383,pp. 133 - 140.

150. HIGGINS M.L. , DA2TE0 MOORE L. Factors influencing the frequency of mesosomes observed in fixed and unfixed cells of Streptococcus faecalis. - J. Cell Biol., 1974, v. 61,1. N 2, pp. 288 300.

151. HIJMANS W., van BOVEN C., CLASENER H. Fundamental biology of the L-phase of bacteria. In: The mycoplasmatales and L-phase of bacteria. Ed. L. HAYFLICK, U.Y., 1969, pp.67-147.

152. HTRSCH J.G. Phagocytosis. -Ann. Rev. Microbiol., 1965, v. 19, pp. 339 364.

153. HOLT S.C., LEADBETTER E.R. Comparative ultrastructure of selected oral streptococci thin-sectioning and freeze-et -ching studies. Canad. J. Microb., 1976, v. 22, N 4, pp. 475 - 485.

154. HRYNIEWIEZ W., Streptococcal L-forms and some of their properties. In: Spheroplasts, Protoplasts and L-forms of Bacteria. Ed. J.Roux, Paris, 1976, pp. 39 - 56.

155. HUIS in*T VELD J.H., LINSSEN W.U. The localization of strep* tococcal group and type antigens: an electron-microscopic study using ferritin-labelled antisera. J. GEN. Microb., 1973, v. 74, N 2, pp. 315 - 324.

156. ITO S., KARNOVSKY M. Formaldehyde glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell Biol., 1968, v. 39, pp. 168 - 169.

157. JAMES M.M. , HILL M.Y., MAXTED W.R. A comparative study of bacterial cell wall, protoplasts membrane and L-form envelope of Streptococcus pyogenes. Antoniae van Leuwenhoek J., 1965, v. 31, pp. 423 - 429.

158. KAGAN JG. Streptococcal L-forms and rheumatic fever. In: Cell wall-deficient bacteria basic principles and clinical significance. Ed. E.J. DQminque, London-Amsterdam, 1982, pp. 453 - 464.

159. KAGAN G., GUSMAN В., VULFOVITCH Y., BESOUGLOVA T. As a trigger of immunomorphological canges of the heart and immo-nogenicorgans. In: Spheroplasts, Protoplasts and L-forms of Bacteria. Ed.Jitoux , Paris, 1976, pp. 259 - 264.

160. KARAKAWA W.W., ROTTA J., KRAUSE R.M. Detection of M protein in colonies of streptococcal L-forms by immunofluorescence.- Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1965, v. 118, pp. 198 201.

161. KAWARAI J., NAHANE P.K. Localization of tissue antigens on the ultrathin sections with peroxidase labelled antibody method. J. Histoch. Cytoch., 1970, v. 18, pp. 161 - 168.

162. KLIENEBERGER NOBEL E. Die L-formen der Bakterien. - Z. Bakt. Parasit., 1958, Abt. I, Orig. A, Bd. 173, S.376-385.

163. KOCH A.L., JUGGINS M.L. Control of wall band splitting in Streptococcus faecalis. J. Gen. Microb. , 1984, v. 130, pp. 735 - 745.

164. KROMBEL J., DELUZERCHE A., MINEK R. Sur les lepides des formes L stables du Proteus P 18. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1961, v. 253, N 18, pp. 2005.

165. LANCEFIELD R.C. Current problems in studies of streptococci.- J. Microb., 1969, v. 55, N 2, pp. 161 163.

166. LEIJH P.O., van der BARSELAAR M.Th., van FURTH R. Kinetics of phagocytosis and intracellular killing of St. aureus and E. coli by human monocytes. Scand. J. Immun., 1981, v.13, pp. 159 - 174.

167. LEON 0., PANOS C. Adaptation of an osmoticaly fragile L-form of Streptococcus pyogenes to physiological osmotic conditions and its ability to destroy human heart cells in tissue cul -ture. Infect. Immun., 1976, v. 13, pp. 252 - 262.

168. LISOWSKI J., WIECZOREK Z., KANTOCH M. Phagocytosis of Escherichia coli protoplasts. Nature (London), 1959, v. 183, pp. 1828 - 1829.

169. LUPT J.H. Ruthenium red staining of the myotendinal junction. J. Appl. Phys., 1966, v. 37, N 10, pp. 3921 - 3923.183* LUPT J.H. Ruthenium red and violet II Pine structural loca -lization in animal tissues. Anat. Rec., 1971, v. 171, N 3, pp. 369 - 415.

170. LUPT J.H. Improvements in epoxy resin embedding methods. -J. Biophys. Biochem. Cytol., 1961, v. 9, pp. 409 415.

171. LtfTTICKEN R. Investigations on the structure and the trans -ferability of group В streptococcal R-plasmids. In: Abstr. VIII Intern. Symp. on Strept. and Streptoc. Diseases, Lund, Sweeden, 1981, pp. 242 - 244.

172. LYNN R.J., MYELLENBERG M.B. Immunological properties of an L-form of a group A beta hemolytic Streptococcus. Antoniae van Leuwenhoec J., 1965, v. 31, N 1, pp. 15 - 24.

173. LYNN R.J. Biochemical and immunological studies of the L -form of beta homolytic Streptococcus. In: Abstr. VIII Intern. Congr. Microb., Monreal, 1962, pp. 125 - 128.

174. MATTMAN L.H. L-forms isolated from infection. In: Micro -biol protoplasts, spheroplasts and L-forms. Ed. L.Guze, Baltimore, 1968, pp. 472 - 473.

175. MATTMAN L.H., JUDGE M.S. Septicemia and some associated in -fections demonstration of cell wall-deficient bacteria. In: Cell wall-deficient bacteria. Ed. G.J. Dominique, London -Amsterdam, 1982, pp. 427 - 451.

176. MAUSS H., SCHMITT-SLOMSKA J. Changes due to streptococcal L-forms in parathypic lympte nodes and in the spleen of themouse. In: Spheroplasts, Protoplasts and L-forms of Bacteria. Ed. J. Roux, Paris, 1977, pp. 345 - 354.

177. Ml6'RNER H., HAVLICEK J., KRONVALL G. Surface characteris -tics of group A streptococci with and without M-protein. -Adta Pathol. Microb. Scand., Sect. B, 1984, v. 92, N 1, pp. 23 - 30.

178. MOORE P.L., BANK H.L., BRISSIE N.T. Phagocytosis of bacteria by polymorphonuclear leucocytes. J. Cell Biol., 1978, v. 76, pp. 158 - 174.

179. MORTIMER E.A., VASTINE E.L. Production of capsular polysa -charide ( hyaluronic acid ) by L colonies of group A strep -tococci. -J. Bact., 1967, v. 99, N 1, pp. 269 271.

180. NEALON T.J., MATTINGLY S.J. Role of cellular lipoteichoic acid in mediating adherence of serotype III strains of group В streptococci to human embryonic, fetal and adult epithelial cells. Infect. Immun., 1984, v. 43, N 2, pp. 523 - 530.

181. PANOS C., BARCULIS S., HAYACHI J. Streptococcal L-forms II Chemical composition. J. Bact., 1960, v. 80, pp. 336 - 342.

182. PANOS C., COHEN M. Cell wall inhibition in a stable streptococcal L-form. Bioch. Bioph. Acta,1966, v. 117, pp. 98-104.

183. PANOS C., COHEN M., KAGAN G. Antibiotic inhibition and ben -ding studies with a group A streptococcal L-form. J. Gen. Microb., 1967, v. 116, p. 299 - 310.

184. PANOS C. Biochemistry of streptococcal L-forms. In: Current

185. Research on a Group A Streptococcus. Ed. R. Caravano, Amsterdam, 1968,pp. 313 314.

186. PANOS C. Comparative biochemistry of membranes from Streptococcus pyogenes and derived stable L-forms. In: Microbiol protoplasts, spheroplasts and L-froms. Ed. L.Guze, Baltimere, 1968, pp. 154-156.

187. PANOS C. Chemical and physiological aspects of the bacterial L-phase variants. In: The Mycoplasmatales and L-phase of Bacteria. Ed. H. Hayflick, 1969, pp. 503 - 524.

188. PANOS C. Effect on L-forms of Streptococcus pyogenes on cultured cells and ira immunosuppressed mice. In: Microbiology, Waschington, 1978, pp. 408 - 411.

189. PETERSON P.K. Kinetics of phagocytosis and bacterial killing by human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Inf. Dis., 1977, v. 136, N 4, pp. 502 - 509.

190. RAZIN S. , ARGMAN M. ; rLisis of mycoplasma, bacterial pro to -plasts, spheroplasts and L-forms by various agents. J. Gen. Microb., 1963, v. 30, pp. 155 - 161.

191. RAZIN S., BOSCMITZ C. The membrane of the Streptobacillus moniliformis L-phase. J. Gen. Microb, 1968, v. 54, N 1, pp. 21 - 32.

192. RECHARDT L., KOKKO A. Electron microscopic observations on the mitohondriae adenosinetriphosphotase in the rat spinal cord. Histochemie, 1967, v. 10, pp. 278 - 285.

193. ROTH G.S. , SHOCKMAN Y.D., DANEO MOORE L. Balanced macro -molecular biosynthesis in protoplasts of Streptococcus faecalis. - J. Bact., 1971, v. 105, N 3, pp. 710 - 717.

194. ROTH J., BINDER M. Colloidal gold, ferritin and peroxidase as markers for electron microscopic doulle labeling lectintechniques, J.Histoch.Cytoch., 1978, v.26, К 3, pp.163 -169.

195. ROUa J, In vivo study of L-forms, spheroplasts, protoplasts, interaction with cells and tissues. In: Spheroplasts, Protoplasts and L-forms of Bacteria, Ed. J. Roux, Paris, 1977, pp. 235 - 246.

196. R?C K., GRABOVSKAYA K.B. Ultrastructural study of interac -tion of group A streptococci with tissue culture cells. -Z'.v. Bakt. Hug., 1981, I Abt. , Orig. A249, pp. 302 309.

197. RYTER A., de CHASTELLIER C. Phagocyte-pathogenic microbe interactions. Intern. Rev. Gyt., 1983, v. 85, pp. 287 - 334.

198. SCHMITT-SLOMSKA J., BOVE A., CARAVANO R. A carrier state in human diploid, cell cultures infected with L-forms of group A Streptococcus. In: Current Research group A Streptococ -cus. Ed. R; CARAVANO, Amsterdam, 1968, pp. 352 - 359.

199. SCHMITT-SLOMSKA J., CARAVANO R., ANOAL M. Isolation of L -forms from ':the spleens of Brucella suis-infected, Penicillin-treated mice. Ann. Inst. Pasteur, 1981, v. 132 A, pp. 253 - 265.

200. SCHULZE W. , WOLLEEBERGER A. Elektronenmikroskopischen Nach-weis von mitochodrialer Adenosintriphosphotaseaktivitat in tierischen Geweben. Histochemie, 1965, v. 5, N 5, pp.417 429.

201. SHANDS J.W. Localization of somatic antigen on gram-negative bacteria using ferritin antibody conjugates. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1966, v. 133, N 2, pp. 292 - 298.

202. SHANDS J.W. Localization of somatic antigen on gram-negative bacteria by electron microscopy. J. Bact., 1965, v.90, N 1, pp. 266 - 270.

203. SHARP J.T. L-colonies from hemolytic streptococci new technic in the study of L-forms of bacteria. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1954, v. 87, pp. 94 - 97.

204. SHARP J.T., HIJMANS W., DIENES L. Examination of the L-forms of group A streptococci for the group specific polysacha-ride and M-protein. - J. Exp. Med., 1957, v. 105, pp. 153159.

205. SHERMAN M. Group В streptococcal lung infection in neonatal rabbits. Paediatr. Res., 1982, v. 16, N 3, pp. 209 - 212.

206. SINGER S.J., SCHICK A.P. The properties of specific stains for electron microscopy prepared by the conjugation of an -tibody molecules with ferritin. J. Bioph. Bioch. Cytol.,1961, v. 9, N 3, pp. 519 538.

207. SMITH P.P., ROTHBLAT C. Comparison of lipid composition of pleuropneumonia-like and L-type organisms. J. Bact., 1962, v. 83, N 3i pp. 500 - 506.

208. SMITH P.P. Comparative physiology of pleuropneumonia-like and L-type organisms. Bact. Rev., 1964, v. 28,pp.97-125.

209. SPRINGER E.L., ROTH J.L. Scanning electron microscopy of bacterial colonies. I Diplococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes. Canad. J. Microb., 1972, v. 18, N 2, pp. 219 - 223.

210. SFURR A.R. A low-viscosity epoxy resin embidding medium for electron microscopy. J. Ultrastr. Res., 1969, v. 26, pp. 31 - 43.

211. STEPHEN D.L., MATTINGLY G., DORAN T.J. Correlation between the production of extracellular substances by type III group В streptococcal strains and virulence in a mouse mo -del. Infect. Immun., 1981, v. 34, pp. 448 - 454.

212. SWANSON J.K., HSU C., GOTSCHLICH E.E. Electron microscopic studies on streptococci. I M-an±±gen. J. Exp. Med., 1969, v. 130, pp. 1063 - 1067.

213. SWENSON R.M., DeCUENINCK В., EISENSTEIN Т.К. The soluble antigens of type III, II and la group В streptococci. In: ABstr. VIII Intern. Symp, on Strept. and Streptoc. Diseases, Lund, Sweeden, 1981, pp. 94 - 96.

214. TAUBENECK U. Demonstration of lysogeny in stable L-forms of Proteus mirabilis. J. Bact., 1963, v. 86, pp. 1265 - 1269.

215. TOMASZ A., JAMIESON J.D., OTTOLENGHI E. The fine structure of Diplococcus pneumoniae. -J.Cell Biol.,1964, v. 22, N 2, pp. 453 367.

216. TRUNG P;, BOUE A., SCHMITT-SLOMSKA J. Ultrastructure of group A Streptococcus L-forms. In: Current Research on group A Streptococcus. Ed. R. CARAVANO, Amsterdam, 1968, pp. 235 -241.

217. TSIEN H.C., HIGGINS M.L. Effect of temperature on the dis -tribution of membrane particles in Streptococcus faecalis as seen by the freeze-fracture technique. J. Bact., 1974, v. 118, N 2, pp. 725 - 734.

218. VENABLE J.H., COGGESHALL R. A simplified lead citrate starn for use in electron microscopy. J. Cell Biol., 1965, v. 25, N 2, pp. 407 - 408.

219. VUONO J., PA2TOS C. Effect of L-form Streptococcus pyogenes and of lipoteichoic acid on human cells in tissue culture. -Infect. Immun., 1978, v. 22, I 1, pp. 255 265.

220. WAGNER M., WAGNER В., KUBIN K. Immanoelectron microscopic study of the location of group specific and type - specific polysacharide antigens on isolated walls of group В streptococci. - J. Gen. Microb., 1980, v. 120, pp. 369-376.

221. WILKINSON H.W. Group В streptococcal infection in human. -Ann. Rev. Miccob., 1978, v. 32, pp. 41 58.