Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Рецепторные белки стрептококков
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Рецепторные белки стрептококков"
Р Г 5 ОД
на правах рукописи
ГУПАЛОВА ТАТЬЯНА ВИТАЛЬЕВНА
РЕЦЕПТОРНЫЕ БЕЛКИ СТРЕПТОКОККОВ: КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВ, ЭКСПРЕССИРУЕМЫХ В Е.соК
Специальность 03.00.04 - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург 1998
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук (директор: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Б.И. Ткаченко )
Научный консультант:
академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.А. Тотолян Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор B.C. Гайцхоки член-корреспондент РАЕН, доктор биологических наук, профессор А.В.Арутюнян доктор медицинских наук, профессор B.C. Гуревич.
Ведущее учреждение: Институт биохимии им. А.Н. Баха, РАН
Защита состоится " ¡^^ " o^t^CM \ 995 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 001.23.01 по защите диссертаций, представленных на соискание ученой степени доктора наук при НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. И.П.Павлова, 12).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института ( Санкт-Петербург, ул. акад. И.П.Павлова, 12).
Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук
JI.B. Пучкова
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы.
Изучение патогенных стрептококков и вызываемых ими заболеваний продолжает оставаться одной из актуальных задач теоретической медицины и практического здравоохранения. Это объясняется весьма широким распространением стрептококкового носительства и стрептококковых заболеваний практически во всех странах мира как в форме первичных инфекций, так и их осложнений токсической, септической, аллергической и иммунологической природы.
Стрептококки разных серогрупп занимают лидирующее положение в инфекционной патологии, вызываемой бактериями. Они вызывают такие распространенные заболевания, как ангины, фарингиты, скарлатина, сепсис, стрептодер-мии, ревматическая лихорадка, ревматическое заболевание сердца, острый гломе-рулонефрит, менингит, хорея, а также гнойные поражения органов и тканей. Клиническое разнообразие форм стрептококковых заболеваний варьирует в зависимости от биологических особенностей возбудителя, условий формирования очага инфекции и состояния организма инфицированного хозяина. Распространенность перечисленных заболеваний в большинстве стран и связанная с ними хроническая патология и инвалидизация части населения представляют не только медицинский, но и экономический интерес.
В настоящее время накоплена значительная информация о структуре клеток стрептококка, о биологических свойствах их антигенов, токсинов и энзимов. Большое развитие получили исследования по идентификации клеточных компонентов данных микроорганизмов, по клинической и эпидемиологической иммунологии и иммунопатологии стрептококковых заболеваний. Однако, наши знания относительно механизмов патогенности и вирулентности стрептококков нуждаются в дальнейшем накоплении и развитии, так как прогресс в понимании молекулярных основ их патогенности, безусловно отстает по сравнению с большинством других бактериальных систем. В связи с изложенным актуальность углубленного изучения стрептококков не может вызывать сомнений.
Как и в случае всех инфекционных заболеваний, патогенез стрептококковых инфекций является итогом взаимодействия биологических систем организма хозяина и микроба. К числу биологически активных веществ патогенных стрептококков в первую очередь следует отнести многие вещества белковой природы, секре-тируемые микробной клеткой или входящие в состав ее клеточной стенки.
Хорошо известно, что вирулентность стрептококков групп А, С и G коррелирует с их способностью продуцировать на поверхности ряд белков. Однако, роль всех стрептококковых белков в патогенезе, не исключая таких хорошо известных белков, как M белки стрептококков групп А, С, и G, до сих пор недостаточно хорошо изучена. Более того, знания о стрептококках и механизмах их вирулентности, которые казались совсем недавно очевидными, сейчас подвергаются сомнению.
Еще совсем недавно считалось, что поверхностные фибриллы вирулентных штаммов стрептококков представлены исключительно M белком, однако в составе клеточной стенки уже сейчас обнаружены разнообразные структуры белков и ферментов. С самим же M белком, входящим в состав группы M подобных белков, наиболее вероятно связана способность связывать фибриноген организма хозяина. При этом уменьшается деспозиция СЗЬ компонента комплемента на бактериальной поверхности. Это свойство помогает стрептококку избежать фагоцитоза.
Кроме классического M белка большая группа белков, гомологичных по своей структуре M белкам, в частности, IgG-связьгаающие белки, относятся к семейству M подобных белков. Штаммы стрептококков группы А могут экспресси-ровать один, два или три M подобных белка, гены которых локализованы последовательно на стрептококковой хромосоме. На настоящий момент принято разделение всех штаммов стрептококков группы А (СГА) на два класса. Фенотипически эти классы различаются по способности экспрессировать OF белок ( фактор опа-лесценции сыворотки, гидролизующий липидсодержащие компоненты крови), OF-штаммы обычно имеют только один emm (ген M белка) подобный ген, и для этих штаммов продукт этого гена имеет антифагоцитарные свойства. OF* штаммы экспрессируют два или три M подобных белка и разделение антифагоцитарной функции между ними не всегда является легкой задачей. Практически все исследования, связанные с клонированием генов M белков СГА, выполнены на OF" штаммах. В силу того, что OF+ и OF- штаммы стрептококка различаются по структуре клеточной стенки, антигенности M белка, по количеству emm подобных генов, очевидно, что данные, полученные для О F штаммов, не могут быть автоматически распространены на группу OF+ штаммов.
IgG Fc-связывание известно не только для СГА, но и для стрептококков групп С и G. Большинство штаммов стрептококков групп С и G экспрессируют белок G - IgG-связывающий белок. Он связывает, в отличие от стафилококкового белка А, все подклассы человеческого IgG, IgG многих видов млекопитающих и
человеческий альбумин (ЧСА). Роль Бс-связывающих рецепторных белков в патогенезе стрептококковых инфекций еще не очень понятна. Однако, благодаря своей способности связывать плазменные белки человека, как Бс-рецепторные белки СГА, так и О белок, имеют большое прикладное значение.
Таким образом, помимо изучения структуры и функции конкретных генов, изучения их роли в патогенезе стрептококков той или иной группы, большую роль приобретает получение биологически активных белков, кодируемых данными генами, которые являются высоко актуальными для клиники и диагностики, для целей иммунологии, иммунохимии и биотехнологии.
Все выше сказанное определило цепи и задачи настоящего исследования.
Целью настоящей работы явилось изучение разных типов рецепторных белков патогенных стрептококков, как относящихся к вирулентности штаммов разных серогрупп, так и актуальных для клинико-лабораторной практики и биотехнологии.
Для этого планировалось выполнить следующие задачи:
1. Осуществить клонирование генов двух поверхностных рецепторных белков, М белка и Рс-рецептора, стрептококка группы А, потенциально принимающих участие в реализации вирулентного фенотипа.
-осуществить клонирование гена М белка 12 серотипа в конъюгативной плазмидерУ! 101.
-создать двурепликонные плазмидные векторы, позволяющие клонировать стрептококковые гены в Е.соН и в стрептококке группы Н. С использованием такого рода векторов показать экспрессию гена М белка 12 серотипа в стрептококке группы Н.
-осуществить клонирование ещт подобных генов, М белка и Бс-рецептора, стрептококка группы А М48 ОР+ штамма в фаговом и плазмидном векторах.
2. Осуществить клонирование гена С белка стрептококка группы в в фаговом и плазмидном векторах.
-осуществить клонирование гена, кодирующего двуфункциональный в белок, способный реагировать с ^С и с альбумином человека; осуществить клонирование фрагмента гена, кодирующего монофункциональный 1;>0-связывающий в белок;
-осуществить клонирование фрагмента гена, кодирующего монофункциональный белок, способный связывать сывороточный альбумин человека.
3. Создать высокоактивные штаммы-продуценты перечисленных рецептор-ных белков. Выделить и очистить рецепторные белки, охарактеризовать их физи-ко-химиеские и специфические свойства.
4. Создать на основе рецепторных белков новые реагенты для аффинной хроматографии.
5. Создать на основе альбуминового рецептора диагностические тест-системы для определения концентрации альбумина в биологических жидкостях человека.
Научная новизна исследования
Научная новизна работы состоит в том, что:
1. Впервые проклонированы етш подобные гены, гены М белка и Рс-рецептора, стрептококка группы А М 48 серотипа ОР+ штамма в гетерологичной системе Е.соИ и показано, что проклонированный ген М белка кодирует антифагоцитарные детерминанты.
2. Создана группа двурепликонных плазмид, позволяющих клонировать стрептококковые гены В клетках Е.соИ и в стрептококке группы Н. С использованием такого рода вектороу впервые показана экспрессия гена М белка 12 серотипа стрептококка группы А в стрептококке группы Н. Благодаря трансмиссибель-ности гибридных плазмид впервые осуществлен конъюгативный перенос гена М белка стрептококка группы А в стрептококк группы О и показана его экспрессия в стрептококке группы Р.
3. Впервые осуществлено клонирование полноразмерного гена О белка, обладающего двумя функциональными активностями в гетерологичной системе Е.соИ, в результате чего получен и проанализирован в белок, оказавшийся слитым с Р-галактозидазой.
4. Впервые в нишей стране осуществлено клонирование отдельных фрагментов гена в белка в гетерологичной системе Е.соИ, в результате чего получены и проанализированы ^в-связывающий и альбумин-связывающий белки.
5. Впервые созданы штаммы-прдуценты ^(5-связывающего белка и альбуминового рецептора.
6. Впервые в нашей стране выделены высокоочищенные препараты альбумина и ДО человека аффинной хроматографией с использованием полученных рекомбинантных белков в качестве лигандов.
7, Впервые созданы диагностические тест-системы для определения концентрации альбумина в биологических жидкостях человека на основе рекомби-нантного альбуминового рецептора.
Теоретическая ценность работы.
Работа носит теоретический характер. В части работы, посвященной изучению генов вирулентности стрептококков группы А осуществлено клонирование н анализ генов М подобных белков, М белка и Рс-рецептора, в фаговом и плазмид-ном векторах. Это исследование является важным с теоретической точки зрения, так как оно касается генов, принадлежащих к ОР позитивным штаммам стрептококков, которые лока недостаточно изучены. Детальное изучение различных поверхностных белков - потенциальных факторов патогенности и накопление сравнительных данных о генетических и биологических характеристиках различных поверхностных белков, выделенных из разных штаммов, поможет понять всю сложность действия факторов патогенности стрептококков. Анализ свойств различных поверхностных белков стрептококков в сопоставлении с вызываемыми ими заболеваниями должен помочь в определении путей, по которым бактерия атакует организм хозяина.
"Практическая неняость.
Проведенные исследования позволили создать активные штаммы-продуценты ^С-связываюгцего белка и альбуминового рецепторного белка, актуальные для биотехнологии и клинико-лабораторной практики. Разработаны условия получения больших количеств рецепторных белков, которые могут быть использованы как лиганды в аффинной хроматографии. Получены два патента на изобретение: патент № 2056859 "Рекомбинантный 1§С-связывающий О белок стрептококка группы О", зарегистрированный 27 марта 1996 г., патент № 2065746 "Рекомбинантный ГОА-рецептор стрептококка группы С," зарегистрированный 27 августа 1996 г. Составлена и утверждена научно-техническая документация на производство рекомбинантного в белка от 13 июня 1997 г. На основании использования альбумин-связывающего белка созданы два варианта тест-системы, позволяющие проводить раннюю диагностику диабетической нефропатии. Подготовлена документация для регистрации и сертифицирования в Государственном Научно-исследовательском Институте Стандартизации и Контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича иммуноферментной тест-системы для определения микроальбуминурии. Эффективность, высокая специфичность и чувствительность указанной тест-системы подтверждена положительными актами
апробации из рада практических клинических лабораторий различных регионов России. Получено положительное решение на изобретение "Способы определения альбумина в биологических жидкостях" от 19 ноября 1996 года.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Проююнированный ген M белка 48 OF+ серотипа кодирует антифагоцитарные детерминанаты, а соответствующий M белок содержит протективные эпи-топы.
2. Проклонированный ген IgG Fc-рецеитора стрептококка M 48 в E.coli подтверждает наличие в OF+ штаммйх. нескольких M подобных белков.
3. Создана группа двурепликонлых плазмид, с помощью которых можно осуществлять клонирование генов стрептококков в кликах E.coli и в стрептококке группы Н. С использованием такого рода векторов показана экспрессия гена M белка 12 серотипа стрептококка группы А в стрептококках группы Н.
4. Проклонированные части гена G белка стрептококка группы G кодируют определенные функциональные белки, обладающие способностью связывать только IgG или альбумин-
5. G белок, способный связывать все четыре подкласса IgG человека и IgG большинства млекопитающих, в отличие от белка А, сможет заменить белок А в диагностических тест-системах, тем самым повышая их чувствительность.
6. Созданы высоко специфичные тест-системы для определения концентрации альбумина в биологических жидкостях на основе альбуминового рецептора.
Достоверность полученных результатов подтверждается высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов исследования ( ДНК-ДНК гибридизация, секвенирование ДНК, иммунологические методы анализа и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные результаты.
Апробация работы.
Материалы диссертации опубликованы в 38 научных работах и многократно доложены и обсуждены на различных Российских и Международных конференциях и симпозиумах: II Международный конгресс по генетике стрептококков в США, Флорида, 1986; Всесоюзный симпозиум в Ленинграде "Стратегия возбудителя в организме хозяина", 1987. Новые направления в биотехнологии", Пущино-на-Оке, 1992; XII Ленсфильдовский Международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Санкт-Петербург, Россия, 1993; "Биотехнология, Санкт-Петербург-94", Санкт-Петербург, 1994; "Российский съезд
специалистов по лабораторной диагностике", Москва, 1995; "Новые методы в микробиологии", Кошице, Словакия, 1995; III Нефрологический семинар, Санкт-Петербург, 1995; IY Нефрологический семинар, Санкт-Петрбург, 1996; XIII Ленсфильдовский Международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Париж, 1996; "Новые направления в биотехнологии", Международная конференция, Пущино-на-Оке, 1996, Y Нефрологический семинар, Санкт-Петрбург, 1997; Результаты работы докладывались на заседаниях Отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН.
Объем и структура диссертации.
Материалы диссертации изложены на 251 странице, включающих введение, литературный обзор, материалы и методы, собственные исследования и их обсуждение, заключение, выводы и указатель литературы. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 51 рисунком. Список литературы содержит 386 источников, в том числе 12 отечественных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы
В работе были использованы штаммы стрептококков группы А, штамм стрептококков группы G, штаммы стрептококков групп Н и D из коллекции Отдела Молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН. Для геино-инженерных процедур использовались штаммы E.coli JM 109, НВ 101, Q 358, Q 359, Q 48, ВНВ 2688, ВНВ 2690, генетические характеристики которых изложены в руководстве (Maniatis D. et al. 1982).
Стрептококки культивировали на среде ТНВ (Todd-Hewitt-Broth, Difco, USA). В зависимости от штамма и задач исследования в среду добавляли лошадиную сыворотку (10%), эритромицин (5 мкг/мл), 10% крови барана при приготовлении плотных агаризованных сред. Клетки E.coli выращивали в LB среде. При выращивании клеток E.coli, несущих плазмиды с маркерами антибиотикоустойчи-вости, в среду добавляли ампициллин (Ар) (50-100 мкг/мл) или эритромицин (Em) (150 мкг/мл).
Генно-инженерные процедуры, такие, как выделение хромосомной и плаз-мидных ДНК, гидролиз ДНК рестрикционными ферментами, упаковку фаговой ДНК in vitro, приготовление E.coli JM 109 или НВ 101 компетентных клеток и трансформацию, лигирование ДНК, Southern гибридизацию, электрофорез в ага-розных гелях проводили в соответствии с протоколами из руководства (Maniatis
D. et al., 1982). Детекция гибридизующихся ДНК фрагментов осуществлялась с использованием ДНК-зондов, меченных дегоксигенином согласно протоколов к наборам фирмы Boehringer Mannheim Genius DNA Labelling and Hybridization kit.
Трансформацию стрептококков группы H, штамм Challis 57 и его производных проводили согласно рекомендациям (Blanc, 1976) H(Gausted, 1983).
Создание геномных библиотек штамма М 48 стрептококков группы А осуществляли в фаговом векторе Я L. 47.1., а штамма G 148 стрептококка группы G -в фаговом векторе X EMBL ЗА. Геномные ДНК рестрицировали эндонуклеазой Sau ЗА в условиях неполного гидролиза, после чего рестрицированные фрагменты лигировали с ДНК векторов, рестрицированных эндонуклеазой Ваш HL Селекцию рекомбинантных клонов осуществляли на культуре Q 359.
Иммуноблоттинг фаговых и бактериальных клонов выполняли в соответствии с указаниями (Johnson et. al,, 1984) с использованием сывороток, абсорбированных экстрактами клеток E.coli.
Иммунные сыворотки кроликов получали при иммунизации лиофилизиро-ванными фаголизатами рекомбинантных клонов по схеме (Poirier, 1985), кроличьи анти-рер-М сыворотки ссротипов 1, 5, 19, 24 (предоставлены Е. Beachev, США). Опсонизирующую активность иммунных сывороток определяли в непрямом бак-трицидном тесте по (Sramek, 1977). Тест на ингибирование опсонизирующей активности сывороток проводили в соответствии с рекомендациями (Cleary et. al., 1979).
Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводилось в соответствии с методом (Sanger F. et al., 1977) при использовании набора фирмы USA, США.
Выделение рекомбинантных белков из клеток E.coli проводили либо лизисом с 2% SDS с кипячением, либо разрушением ультразвуком три раза по 15 секунд в ультразвуковом дезинтеграторе MSE (Англия). Очистку рекомбинантных белков проводили аффинной хроматографией па колонках с сефарозой, иммобилизованной альбумином или IgG. Элюцию белков проводили 0.1 М глициновым буфером, рН 2.5. Значение рН в элюате немедленно доводили до рН 7.0. Элюаты собирали по фракциям, в которых методом блоттинга проверяли функциональную активность, используя альбумин или IgG, меченные пероксидазой хрена.
Конъюгирование пероксидазы хрена с белками проводили перйодатным методом согласно (Фримель Г., 1987).
Метод блоттинга проводили следующим образом: мембрану с нанесенными пробами помещали в раствор "блотто"(1 часть раствора PBS и 2 части 3% раствора молока) на 30 минут, затем мембрану помещали в раствор "блотто", содержащий соответствующий конъгогат и выдерживали 30 минут. Мембрану отмывали 10 минут раствором "блотто" и три раза по пять минут раствором PBS. Отмытую мембрану подсушивали на воздухе и помещали в раствор субстрата для перокси-дазы (1 мг парафепилендиамина в 1 мл PBS, рН 12.5) с 5 мкл 33% перекиси водорода на 1 мл раствора субстрата. Окрашивание происходило в течение нескольких секунд.
Определение методом иммуноферментного анализа (ИФА) проводили, используя метод гетерогенного конкурентного ИФА, заменив антитела на рекомби-нантные белки.
Электрофорез белков в SDS-полиакриламидном геле проводили по (Laemmli U., 1970). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводили по (Towbin Н. et. al., 1979).
Для определения способности рецепторов связьгвть человеческий IgG и альбумин использовали два варианта твердофазного ИФА: прямой и двуслойный (сэндвич) методы. Определение констант связывания проводили по методу (Friquet В., 1985).
Получение препаратов альбумина и IgG из сыворотки крови человека проводили аффинной хроматографией. Для этого были приготовлены колонки с се-фарозой 4В, связанной с IgG-связывающим рецептором и с сефарозой 4В, связанной с альбуминовым рецептором.
Определение концентрации альбумина в моче проводили методом блоттинга и методом конкурентного связывания ИФА с заменой антител на рекомбинант-ные белки.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Клонирование гена М белка.
Клонирование гена М белка 12 ссротипа в коныогативной плазмцде pVI 101.
С этой целью была использована плазмида pVI 101 - спонтанный делсци-онный дериват плазмиды pEL 1. Как и исходная плазмида, pVI 101 детерминирует резистентность к MJlC-антибиотикам, передается конъюгативно-подобным процессом, как в пределах одной группы стрептококков, так и в межгрупповых скрещиваниях, и стабильно реплицируется с экспрессией MJIC-типа устойчивости в
трансформантах Challis 57. Плазмида pVI 101 содержит один сайт для эндонукле-азы EcoR Г, который был использован для получения гибрида этой плазмиды с плазмидой рРС 124. Цель подобного конструирования заключалась в получении гибридной плазмиды, способной реплицироваться в стрептококках, исследовании экспрессии М белка 12 серотипа в стрептококках и в изучении трансмиссибель-ности гибридной плазмиды.
Плазмиды pVI 101 и рРС 124 были рестрицированы эндонуклеазой EcoR I и лигированы ДНК-лигазой фага Т4. Лигированной смесью была проведена трансформация клеток E.coli штамма НВ 101. Трансформанты генотипа ApR EmR, обозначенные pPCVI, были проверены на экспрессию методом колоний блоттин-га. В большей части pPCVI трансформантов М белок экспрессировался, что свидетельствовало о сохранности последовательности ДНК, кодирующей этот белок в гибридных плазмидах. Из М+ и М трансформантов бьши выделены 16 плазмид-ных ДНК. Для исследования полученных плазмид на способность автономно реплицироваться в стрептококках они были апробированы в трансформации штаммов Challis 57, Challis GS 10.1. Из 16 использованных для трансформации плазмид лишь три приводили к трансформации штамма Challis 57 и все 16 трансформировали штамм Challis GS 10.1.
Встраивание EmR гена в хромосому штамма Challis GS 10.1 происходила, по-видимому, за счет гомологии ДНК штамма-реципиента с ДНК стрептококковых плазмид, содержащих ген EmR. Трансформанты штаммов Challis 57 и GS 10.1 были исследованы на экспрессию М белка. Экспрессия М белка была обнаружена только в трансформаптах, содержащих плазмиды pPCVI-1002 и pPCVI-1004.
По числу исследованных признаков, детерминируемых гибридными ДНК, плазмиды бьши разделены на три группы (таблица 1).
Таблица 1.
Генотип сконструированных гибридных плазмид семейства pPCVI
N Группы Генотип Плазмида
1-я Группа EmRAp*M12+ RepE+ RepS+ 1002, 1004
2-я Группа EmR ApR Ml2- RepE+ RepS+ 1001
3-я Группа EmRApR M12+ RepE+ RepS- 1003, 1005-1016
Плазмиды всех групп содержат маркеры антибиотико-резистентности ApR EmR, плазмиды двух групп (первая и третья в таблице) содержат проклонирован-ную последовательность гена М белка 12 серотипа и одна группа плазмид (третья в таблице) не содержит репликатора для стрептококков.
Поскольку плазмида pVl 101 является трансмиссибельной плазмидой, было интересно выяснить сохранилось ли это ее свойство в гибридных плазмидах. С этой целью была осуществлена попытка переноса плазмид pPCVT-1002 и pPCVI-1004 из трансформантов Challis 57 в стрептококк серогруппы D. В трансконъ-югантах штамма JH2-2 (группа D) была обнаружена экспрессия М белка.
Таким образом, в результате клонирования гена М белка в плазмидном векторе pVI 101, были созданы интегративные векторы, с использованием которых была впервые продемонстрирована экспрессия гена М белка 12 серотипа стрептококка группы А не только в штаммах E.coli, в которых первоначально был про-клонирован этот ген, но и в клетках стрептококков групп Н и D. Учитывая высокую стабильность интегрируемых последовательностей ДНК при клонировании, использование интегративных векторов в биотехнологических целях представляется крайне перспективным.
Опыты по исследованию трансформантов стрептококков группы Н (Challis 57), экспрессирующих М белок, в бактерицидном тесте показали, что синтезируемый в них белок не обладал антифагоцитарной активностью. Этот факт можно объяснить, вероятно тем, что проклонированиый в плазмиде ген М белка 12 типа, не является полноразмерным геном М белка, что было показано в работе (Cleary Р, 1987).
Дальнейшим этапом работы явилось клонирование полноразмерного гена М белка. В соответствии с тем, что выше было сказано о важности изучения М подобных белков OF+ штаммов, для клонирования гена М белка был выбран OF+ штамм стрептококка группы А.
Клонирование пена М белка 48 серотипа.
Был создан банк хромосомных генов стрептококка группы А серотипа М 48 штамма 1/64 в Ecoli в векторе замещения бактериофага X L47.1. Идентификация рекомбинантпых клонов, содержащих ген М белка, была проведена методом гибридизации in situ. В качестве зонда был использован радиоактивномеченый ген М белка 12 серотипа. Теоретическим основанием для использования гена М белка 12 серотипа в качестве зонда послужили литературные данные (Haanes-Frits et al., 1986) о наличии гомологии в нуклеотидной последовательности между генами М
белка ряда серотипов стрептококка группы А. Параллельно с гибридизационным скринингом для идентификации рекомбинантных клонов, продуцирующих М белок, были использованы анти-рер сыворотки, которые перекрестно реагируют с М белками нескольких серотипов, включая М белок М 48 типа. Из 1750 проанализированных клонов только три реагировали с анти-рер сыворотками и гибридизо-вались с радиоактивномеченым ДНК-зондом. Три отобранные фаговые клоны, обозначенные 48-1, 48-2 и 48Б, были проверены в блоттинге на способность связывать фибриноген, меченный пероксидазой. Все клоны показали положительную реакцию.
Приведенные данные позволили предположить, что в этих рекомбинантных фаговых клонах содержится ген М белка 48 серотипа. Из фагового клона 48Б была выделена ДНК, которая гидролизовалась эндонуклеазой Hind III на 5 фрагментов, а 1, Ы, cl, dl и el, для которых были определены молекулярные размеры. Эксперименты по Саузерп гибридизации показали локализацию гена М бейка в третьем cl Hind III фрагменте ДНК фага 48 Б. Фрагмент cl имел молекулярную массу 6.3 т.н. п.
Было проведено гибридизационное картирование вставочного фрагмента ДНК фага 48Б эндонуклеазой Hind Г1Г (рис.1). ДНК фага 48 Б имеет два первых Hind III фрагмента лямдоидного происхождения. Третий фрагмент, в котором локализована последовательность гена М белка 48 серотипа, содержит область гомологии с X L47.1, что указывет на его краевое расположение во вставочном Barn HI-Sau ЗА фрагменте гибрида.
CosL
0,5 т.н.п.
BamHI
В
2,2 т.н.п BamHI
С
CosR
Hind Ш Hind Ш Hiad Ш
al
23.08 т.н.п.
dl el
¡т.н.п. 3.4 т.н.п.
Hindin cl
6.3 т.н.п.
Ы
8.3 т.н.п.
рис. 1. Гибридизационное картирование вставочного фрагмента ДНК фага 48Б,
А, В, С - фрагменты ДНК исходного вектора A. L 47.1, полученные при гидролизе эндонуклеазой Ваш HI. al, bl, cl, dl, el - фрагменты Hind III гидролиза ДНК фага 48Б, содержащего вставку хромосомной ДНК стрептококка.
Далее было проведено клонирование фрагмента cl в векторной плазмиде E.coii PBR 322. Клоны E.coli, ДНК которых интенсивно гибридизовалась в дот-экспериментах, были проверены в иммуноблоттинге с анти-рер Ml сывороткой. Ряд клонов E-coli, содержащих гибридные плазмиды PBR 322 со вставками Hind III фрагментов ДНК фага 48Б, положительно реагировали с анти-рер Ml сывороткой, причем ДНК этих же клонов наиболее интенсивно гибридизовалась с меченой ДНК фага 48Б. Из одного клона была выделена ДНК, вставочный фрагмент которой оказался равен 6 т.н.п. То есть на основании этих данных было сделано заключение, что в гибридных плазмидах клонов E.coli удалось проклонировать фрагмент cl Hind III гидролизата ДНК фага 48Б, содержащего ген М белка 48 се-ротипа.
Наличие гомологии по ДНК-зонду и экспрессии М белка по данным имму-ноблоттинга не позволили утверждать окончательно, что в отобранных фаговых клонах содержится полноразмерный и функционально активный ген М белка. Последнее было проверено в антифагоцитарном тесте с использованием антисывороток к фаголизйтам гибридных клонов. Антисыворотки были получены иммунизацией кроликов лиофилизированными фаголизатами гибридов 48-2 и 48Б. Кровь брали на 6-9 день после последней иммунизации и исследовали в непрямом бактерицидном тесте. Результаты опытов представлены в таблице 2.
и
Результаты опытов выражали в значениях "бактерицидного индекса (БИ), который фактически выражает степень подавления роста инокулюма культуры стрептококка антителами исследуемой сыворотки по отношению к контрольному образцу с Sn (человеческая сыворотка, не содержащая антител к стрептококку данного М серотипа).
Одна из сывороток N 3267, полученная к фаголизату 48В, характеризуется БИ =72-74. Это значение по шкале бактерицидных индексов Столлермана является положительным, что позволяет сделать вывод о наличии в данной сыворотке оп-сонизирующих антител в отношении стрептококка типа М 48. Следовательно, М белок в фаголизате клона 48Б содержит не только общие с другими М белками антигенные детерминанты, что было показано в иммуноблоттинге с анти-рер М сыворотками, но и протективные эпитопы.
Таблица 2.
Исследование опсонизирующей активности сывороток, полученных при иммунизации кроликов фаголизатами рекомбинантных фаговых клонов.
N Сыворотки Материал для иммунизации Разведения сывороток в бактерицидном тесте Бактерицидный индекс пй шкале Столлермана
3649 X 48-2 Цельная 36
1:3 18
3494 X 48-2 Цельная 14
1:3 18
3938 X 48Б Цельная 18
1:3 18
3267 Х.48Б Цельная 72
1:3 74
3988 X L47.1 Цельная 7.2
1:3 9.0
Анти М 48 морской свинки Цельная 720
1:3 144
Примечание: Индекс роста контрольной культуры стрептококка серотипа М 48 имел значение 288.
Для проверки того, что полученные рекомбинантные клоны (содержащие гибридные плазмиды pBR 322 с Hind III фрагментами ДНК фага 48Б) продуцируют функционально полноценный М белок, были выполнены эксперименты по изучению специфического влияния экстрактов этих клонов на опсонизирующую способность сыворотки морской свинки серотипа М 48. Результаты опытов по блокированию опсонизирующей активности анти-М 48 сыворотки морской свинки представлены в таблице 3.
Таблица 3.
Блокирование опсонизирующей активности М 48 антисыворотки озвученными экстрактами E.coli, содержащими рекомбинаптные плазмиды.
Источник получения бактериального экстракта Сыворотка аити - М 48 Выживаемость (%)
Без экстракта - 220
Бе; экстракта + 5.6
Стрептококк гр. А серотип М 48 + 170
Рекомбинантный клон 5 + 103
Рекомбинантный клон 6 + 208
Контроль ( клетки Е.соП, содержащие нативную плазмиду рВ1* 322) + 14.5
Из представленных результатов следует, что экстракты рекомбинантных клонов в E.coli N5 и N6 удаляли опсонизирующие антитела из сыворотки морской свинки, что приводило к росту (отсутствие фагоцитоза) стрептококков типа М 48. Выживаемость стрептококковых клеток составляла 103-208%. Экстракт контрольной культуры E.coli (PBR 322) не удалял опсонизирующие антитела 48 типа, поэтому стрептококки не размножались, а полностью опсонизировались и фагоцитировались при экспозиции в донорской крови. Таким образом, были выявлены протективные свойства антигенов, продуцируемых клетками E.coli, содержащими гибридные плазмиды с Hind III фрагментами ДНК фага 48Б.
На основании вышеизложенного (результаты гибридизации, иммуноскри-нинга, блотгинга и тестов по опсонизации) бьшо сделано заключение, что в ре-комбинантном фаге 48 Б содержится полноценный структурный ген М белка 48 серотипа.
Поскольку один и тот же OF+ штамм стрептококков группы А может экс-прессировать помимо М белка другой М подобный белок, в частности IgG-связывакмций белок, нам представилась возможность выявить в сконструирован-
ной библиотеке хромосомных генов стрептококка М 48 серотипа ген IgG Fc-рецептора, который близко сцеплен на хромосоме с геном М белка. Кроме того, уже давно ряд авторов показал, что уникальные белки на поверхности определенных бактерий способны связываться с высокой аффинностью с Fc-частью иммуноглобулинов ряда млекопитающих и человека. При этом взаимодействие бактериальных Fc-рецепторов с детерминантами константного участка тяжелой цепи мсшекул Ig не влияет на способность антитела узнавать соответствующий антиген. Это свойство придает бактериальным рецепторам особую ценность при использовании их в качестве "метки" для количественного и качественного определения комплексов антиген-антитела. В настоящее время в большинстве исследований такого рода используется белок А стрептококка S aureus, обнаруженный на поверхности или секретируемый многими штаммами этого вида бактерий. Важность белка А в качестве коммерчески доступного и широко применяемого в настоящее время иммунохимического реагента не вызывает сомнений, однако, существуют и некоторые ограничения его использования. Главное из них заключается в том, что белок А не способен связывать подкласс IgG 3 иммуноглобулинов человека.
Именно поэтому, появился интерес к другим бактериальным Fc-рецепторам, в частности, к Fc-рецепторным белкам стрептококков группы А, способных связывать иммуноглобулины человека всех четырех подклассов.
Клонирование гена Fc-рецепторного белка стрептококка группы А М 48 типа способствовало бы, во-первых, подтверждению факта наличия у одного OF+ штамма двух или более eram подобных генов, во-вторых способствовало бы продолжению работ относительно роли IgG Fc-рецепторного феномена в развитии иммунопатологических процессов при заболеваниях стрептококковой этиологии, к настоящему времени еще четко не выявлена корреляция между экспрессией Fc рецепторного белка штаммами стрептококка группы А и выраженностью их патогенных свойств и в третьих, помогло бы в разработке на основе Fc-рецепторного белка новых методов диагностики.
Перечисленные факты явились основанием для исследования генетического детерминирования феномена IgG Fc-рецепции.
В библиотеке хромосомных генов стрептококка М 48 серотипа были выявлены рекомбинантные фаговые клоны, несущие генетические детерминанты FcR белка. При скрининге был использован человеческий IgG, меченный пероксида-зой. Фрагменты одного из рекомбшгантных фаговых клонов, а именно X 2-7 были субклонированы в E.coli в плазмидном векторе pBR 322. Путем клонирования не-
полного Hind Ш перевара ДНК фага X 2-7 в Hind III сайте векторной плазмиды была получена рекомбинантная плазмида р 22, экспрессирующая FcR-беяок. Вставочный фрагмент хромосомной ДНК стрептококка в плазмиде р 22 размером около 5.0 т.н.п. был картирован с использованием ряда эндонуклеаз (рис. 2).
После построения рестрикционной карты плазмиды р 22 возникла необходимость более точного определения размера гена Fc-рецептора. Hind III фрагменты 2.7 и 2.2 т.н.п. были проклонированы в pBR 322 и pUC 8 соответственно. Соответствующие им плазмиды (р210ир211)не вызывали экспрессии FcR белка. Тогда как плазмида р 3101, содержащая только Bgl II фрагмент ( 2.7 т.н.п. ), сконструированная на основе pUC 8 и р 22, экспрессировала FcR белок. Уровень экспрессии в рекомбинантном фаге X 2-7 и в E.coli, содержащей р 22 и р 3101, не менялся. В векторе pUC 8 был проклонирован 1.2 т.н.п. Pst I фрагмент из р 22. Рекомбинантная плазмида, выделенная из одного из клонов, р 4101, содержала 1.2 т.н.п. Pst I фрагмент плазмиды р 22, но уровень экспрессии для этого клона по сравнению с клонами, содержащими плазмиды р 22 и р 3101, был значительно ниже. Вставки плазмид р 3101 (2.7 т.н,п.) и р 4101 (1.2 т.н.п.) были переклонированы в pUC 9. Выделенные рекомбинантяые плазмиды были обозначены как р 3102 и р 4102. Оба клока, содержащие эти плазмиды, дали положительный ответ при проверке экспрессии Fc-рецелторного белка (рис. 2). По уровню экспрессии эти клоны не отличались от клонов, содержащих плазмиды р 3101 и р 4101.
Таким образом, анализ плазмид, полученных переклонированием фрагментов из плазмиды р 22 доказал, что ген Fc-рецепторного белка М 48 типа полностью инактивируется расщеплением во втором Hind III сайте, частично теряет активность при расщеплении в третьем Pst I сайте, и уровень экспрессии не уменьшается при расщеплении в первом Bgl II сайте. Неизменность уровня экспрессии при различной ориентации вставочного фрагмента позволил сделать вывод о том, что проклонированкая последовательность содержит не только полноразмерный ген, но и собственный промотор, который расположен в 1.2 т.н.п. фрагменте.
Для определения молекулярного веса Fc-рецепторного белка, кодируемого плазмидой р 22, был проведен вестерн-блотт анализ лизата культуры E.coli, содержащей р 22. В результате было обнаружено два фрагмента, более интенсивный из них имел молекулярный вес 41 kD, молекулярная масса второго составляла 38 kD. Оба эти фрагмента были проанализированы на способность связывать фибриноген. Ни один из них фибриноген не связывал.
а)
б)
Hind III PstI PstI Pst I Hind III PstI Hind III
i-, i , , i-H-4-—н—,-1
PvuIIBglIIHpaI Pvul Hpa PvuII Bgfll экспрессия
1
3
4
5
6-,-
Рис 2. Рестрикционная карта и структура вставок гена Рс- рецептора
а) рестрикционная карта р 22
б) различные вставки сконструированных плазмид
1- р 210, 2-р 211, 3- р 3102, 4-р3101, 5-р4102, 6-р4101
Полученные результаты подтверждают, что ген, кодирующий Рс-рецепторный белок из стрептококка группы А М 48 типа, может быть клонирован и экспрессирован в Е.соН.
Таким образом, в этой части работы было осуществлено клонирование и анализ генов М белка и М подобного белка в фаговом и плазмидных векторах. Это исследование является важным с теоретической точки зрения, поскольку оно касается изучения генов, принадлежащих к ОР позитивным штаммам стрептококков, которые пока недостаточно изучены. Кроме того, эта работа имеет перспективы для дальнейших исследований. Было бы интересно выяснить истинное расположение генов М белка и Рс-рецептора в гг^а регулоне (группа генов, кодирующая потенциальные факторы патогенпости) стрептококка серотипа М 48, а также осуществить определение нуклеотидной последовательности детерминант, обеспечивающих синтез протективных эпитопов на М или М подобном белке
Рс-рецепторы стрептококков группы А занимают исключительное положение в силу, по-видимому, уникальности стрептококков данной группы, поскольку, именно они являются возбудителями большого числа нозологических форм, специфических в патологии человека. Это и определило необходимость исследований биологических свойств ^О РсЛ А с целью изучения их роли в патогенезе стрептококкового патологического процесса
Кроме того, IgG Fc-рецепторы стрептококков группы Л благодаря своей способности связывать все подклассы IgG человека могут иметь и большое прикладное значение.
Однако, Fc-рецептор стрептококков групп G и С, так называемый G белок, в отличие от Fc-рецепторов стрептококков группы А, обладает большей аффинностью относительно IgG человека и более широким спектром связывания млекопитающих. Кроме того, G белок связывает альбумин. Присутствие на бактериальной клеточной стенке белка с раздельными специфическими сайтами для IgG и альбумина обуславливает значительный интерес к этому белку и с биологической и с прикладной точек зрения. Поэтому с целью получения более активного, обладающего большей аффинностью по сравнению с F-рецепторами стрептококков группы А, IgG-связывающего рецептора, следующей задачей работы явилось клонирование полноразмерного гена G белка.
Клонирование гена G белка.
В работе был про клонирован полноразмерный ген G белка с последующим субклонированием фрагментов гена, ответстветадх за альбумин- и IgG-связывание с целью получения высокоочищенных белков с высокой аффинностью и специфичностью.
Для этого был сконструирован банк хромосомных генов стрептококка группы G штамма G 148, продуцирующего G белок в векторе замещения бактериофага X. EMBL-3A. Для анализа полученного банка генов был использован скрининг методом колоний-блоттинга с использованием IgG, меченного перокси-дазой хрена, позволяющим проводить идентификацию рекомбинантных клонов по экспрессируемому продукту. В результате такого скрининга был отобран фаговый клон, дающий наибольшую экспрессию IgG-связывания. Из положительного клона была выделена ДНК и затем был проведен ряд последовательных этапов субклонирования, чтобы ограничить рамки гена G белка, отвечающего за связывание как IgG, так и за связывание альбумина. В результате был отобран клон G белка - 3G, обладающий обеими связывающими активностями. Из этого клона была выделена рекомбинантная плазмида р 3G. При гидролизе этой плазмиды одновременно двумя рестриктазами Hind III и E.coR I вырезалась вставка в 1.5 т.н.п. Для картирования Pst I сайта в пределах вставочного фрагмента плазмиды был проведен гидролиз ДНК р 3G двумя эндонуклеазами одновременно Pst I -EcoR I и Pst I - Hind III (рис. 3). Вставка плазмиды р 3G (1,5 т.н.п.) была переклонирована в плазмиду pUC 9. Выделенная рекомбинантная плазмида была обозна-
чена, как р ЗС1. Клон, содержащий эту плазмиду связывал как так и альбумин с тем асе уровнем экспрессии, что и клон, содержащий плазмиду р ЗО.
При анализ? структурной карты Б белка и рестрикционной карты гена в белка, оказалось, что этот фрагмент не кодирует сигнальную последовательность и соответствующую промоторную область, (рис. 3).
а)
Ss Е А, В, А2 в2 Аз S С! Di с2 Ъг Сз W M
б)
с)
EcoRI !_
San ЗА Pst I Pst I
i I I
PstI t
Hmdlll
I связывание
-* IgG ЧСА
_1 + +
J
+
Рис. 3 Схема организации молекулы G белка, рестрикционная карта и структура
вставок гена G белка.
а) схема организации молекулы G белка
б) рестрикционная карта 1.5 т.н.п. фрагмента гена G белка
с) структура вставок гена G белка: 1 - 1.5 т.н.п. фрагмент гена G белка;
2 - 0.7 т.н.п. фрагмент гена G белка; 3 - 0,64 т.н.п. фрагмент гена G белка;
Исходя из этого факта, 1.5 т.н.п. фрагмент должен кодировать белок, связывающий IgG, но не альбумин за счет существования дополнительных промоторов, локализованных в структурной части гена G белка.
Однако, проклонированный нами 1.5 т.п.н. фрагмент кодировал G белок, связывающий как IgG, так и альбумин. Молекулярная масса этого беяка, проанализированного в SDS-PAGE и вестерн-блотт анализе, оказалась равной 63 kD. Промотор lac Z р-галахтозидазы в pUC 8 отстоит от рамки считывания на 420 пар нуклеотидов, что сответствует 140 аминокислотам. С учетом этого молекулярный вес белка, кодируемого 1.5 т.н.п. вставкой, и составил 63 kD. В связи с этим было сделано предположение, что белок, кодируемый этой вставкой, является слитым и
состоит из белка G и части ß-галактозидазы. Для доказательства этого было проведено клонирование 1.5 т.н.п. фрагмента в плазмидный вектор р SP64.
В результате клонирования, благодаря свойствам выбранного вектора, та же самая 1.5 т.п.н. вставка кодировала белок меньшего молекулярного веса, который связывал только IgG, но не альбумин. Эти данные указывают на то, что про-клонированный 1.5 т.н.п. EcoR I-Hind III фрагмент гена G белка в векторе pUC 9 кодирует двуфуикциональный белок, являющийся слитым белком. Очевидно, что при этом рамка считывания лактозного оперона в векторе pUC 9 была сохранена, и структурная часть гена транскрибировалась без ее нарушения. Для подтверждения этого участки вставок в плазмндах pSP64 3G1 и р 3GI, прилегающие к поди-линкеру, были секвепированы.
В результате анализа нукяеотидной последовательности вставок обнаружены разные полияинкерные облсати. В плазмиде р SP64-3G1 в отличие от плаз-миды р 3G1 рамка считывания не совпадает с рамкой считывания гена Ь-галактозидазы. Этот факт и обуславливает различия в характере экспрессии белка G, кодируемого двумя указанными плазмидами. SP6 промотор локализован очень близко к вставке, что не позволило инициировать транскрипцию без SP6 полиме-разы. Экспрессия IgG-связывания, кодируемая плазмидой р SP64-3G1, возможно происходит за счет промоторов, локализованных в структурной части гена G белка.
Дальнейшая работа была посвящена клонированию частей гена, ответственных за разные функциональные активности. Часть гена, ответственная за IgG-связывание, была проююнирована в плазмиде pUC 8 с образованием плазмиды р 7G. При гидролизе этой плазмиды двумя рестриктазами Hind III и EcoR I вырезалась вставка в 0.7 т.н.п. Клон, содерщащий эту плазмиду, связывал только IgG. Связывания с альбумином он не показал. Затем была проююнирована часть гена G белка, ответственная за связывание альбумина. В результате был прокло-нирован 0.64 т.н.п. фрагмент, который вырезался рестриктазами Hind III и EcoR I из плазмиды р AI. Клон E.coli, содержащий эту плазмиду связывал только альбумин. Схема клонирования части гена, ответственной за связывание альбумина, представлена на рисунке 4.
Рис. А Схема клонирования фрагмента гена, кодирующего альбуминовый реце
Выделение рецепторных белков.
В результате клонирования гена О белка были получены четыре плазмид-ные ДНК, кодирующие белки с различными функциональными активностями, то есть белок, кодируемый плазмидой р ЗО, связывал и ^О и альбумин, белки, кодируемые плазмидами р ЭРМ-ЗО и р 70, связывал только ^С и белок, кодируемый плазмидой р А1, связывал только альбумин. В результате ряда экспериментов были подобраны условия для извлечения ^О-связьшающих и альбумин-связывающего рецепторных белков из клеток Е.соН, условия максимального синтеза каждого рекомбинантного белка, проведена их очистка аффинной хроматографией. В ходе подбора условий культивирования для максимального выхода изучаемых белков оказалось, что для разных белков эти условия разные, что подтверждает значимость условий культивирования создаваемых рекомбинантных штаммов для достижения высокого уровня продукции чужеродного белка в бактериальной клетке.
Все созданные рекомбинантные штаммы, продуцирующие ТбС- и альбумин-связывающий рецепторы, согласно существующим критериям, являются штаммами-продуцентами, причем самый большой выход белка из клеток Е.соИ был достигнут для монофункционального 1§0-связынающего белка 7С. Примеры очистки рецепторных белков представлены в таблицах 3 и 4.
Таблица 3.
Данные по очистке ^О-связывающих рецепторных белков.
Белок Стадия очистки Объем (мл) Суммарный белок (мг/мл) в белок (мг/мл) Специфическое количество суммарного белка (мг/мл) Выход :(%)
Зв Лизат с 1л культуы 20 25 1 40 100
Элюат 10 1.5 1.5 1000 75
ю Лизат с 1л культуры 20 20 2 100 100
Элюат 12 2.5 2.5 1000 75
8Р64-36 Лизат с 1л культуры 20 1.8 0.5 28 100
Элюат 8 0.85 0.85 1000 68
Таблица 4.
Данные по очистке альбумин-связывающего белка
Стадия Объем Суммарный Альбуминовый Специфическое Выход
очистки (мл) белок(мг/мл) рецептор (мг/мл) количество сум- С/о)
марного белка
(мг/мл)
Лизат с 1л 20 22 0,7 31 100
культуры
Элюат 10 1 1 1000 71
Характеристика способности редепторных белков связывать и альбумин человека.
Препараты очищенных рецепторных белков были исследованы на способность связывать иммуноглобулины и альбумин человека. Было показано, что монофункциональный и двуфункциональный белок О связывает все четыре подкласса в то время как А белок третий подкласс не связывает, причем полученные данные позволили заключить, что все препараты О белка связывают 1^(3 1, 1§£г 2, ^С 4 и поликлональный более эффективно, чем белок А. Исследование способности О белка связывать, помимо 1|>0 человека, ^О различных млекопитающих показало, что й белок обладает поливидовой активностью и с большой аффинностью связывает кролика, козы, овцы, морской свинки, свиньи, лошади, собаки и не связывает только ^О кошки и птиц.
Белок А успешно используется в иммунохимии, в том числе и в иммунофер-ментном анализе. Белок А стабилен в растворимом и лиофилизированном состоянии, что позволило на его основе получить "универсальные" конъюгаты с пе-роксидазой и щелочной фосфатазой и использовать их анологично меченым антн-видовым (вторичным) антителам. Проведенные многочисленные исследования позволили сделать заключение,что конъюгат белка А может быть использован как заменитель антиглобулиновых антител во всех основных вариантах ИФА: при определении антител в прямых и непрямых тестах, индикации антигенов в имму-ноблоттинге, при работе с растворимыми и фиксированными на клетках антигенами. Главным требованием для такой взаимозаменяемости явилось использование в тест-системе заведомо реагирующих с белком А иммуноглобулинов.
В исследованиях по изучению гуморального иммунного ответа в сероэпи-демиологии и серодиагностике ИФА с меченым белком А способен давать хоро-
шо воспроизводимые и сравниваемые результаты. В этой сфере исследований белок А обладает и рядом преимуществ перед мечеными антителами - меньшими значениями "фоновых" реакций, более высокой чувствительностью и большей экономичностью (на 1 стандартное исследование ИФА требуется не более 20 нг конъюгата). Однако белок А реагирует не со всеми подклассами в одинаковой степени и не связывает третий подкласс lgG и, кроме того, его поливидоная активность ограничена, так как он активно связывает только ^С кролика и свиньи. Использование О белка вместо А белка благодаря его явным преимуществам: связывание всех четырех подклассов ^О человека с большей аффинностью и Г£0 гораздо больших видов животных, позволит повысить чувствительность тест-систем.
Способность альбуминового рецепторного белка связывать помимо альбумина человека альбумины различных млекопитающих была проверена методом блоттинга. Было показано, что альбуминовый рецептор эффективно связывал альбумин человека, мыши, крысы и морской свинки, слабо реагировал с альбумином лошади и совсем не связывал кроличий, бычий и яичный альбумины. При проверке рецепторных белков связывать плазменные белки человека было показано, что альбуминовый рецептор специфичен лишь в отношении альбумина человека, в то время, как 1дО-связывающие белки связывали только Равновесные константы связывания были определены по методу (Fгiquet, 1985). Их значения приведены в таблице 5.
Таблица 5.
Константы равновесия реакций между белком О и 1«С человека и между альбуминовым рецептором и ЧСА
Белок Константы равновесия Ю'М
Двурецепторный белок в Монорецепторный белок О Альбуминовый рецептор
Пул 1цО 8,55 16,5
4,5 12,4
4,42 21,02
ЧСА 4,5
Использование рецепторных белков.
Высокая аффинность полученных рецепторных белков позволила найти возможность использования их в биотехнологии. Были созданы аффинные колонки. В качестве сорбента использовали сефарозу 4В. К ней присоединяли как альбуминовый рецептор, так и монофункциональный в белок. Полученные препараты альбумина и выделенные из плазмы крови на аффинных колонках с соответствующим лигандом, показали высокую степень чистоты, они не уступали по степени очистки коммерческим препаратам, которые выпускают зарубежные фирмы.
Высокая степень специфического связывания альбуминового рецептора только с альбумином сыворотки крови человека позволила использовать его для создания тест-системы.
Проблема диагностики микроальбуминурии в повседневной клинической практике в нашей стране до сих пор не решена. Были разработаны два варианта тест-системы для определения микроальбуминурии, используя метод блогтинга для скринингового обследования больных и метод гетерогенного конкурентного ИФА с заменой антител на альбуминовый рецептор.
Чувствительность предлагаемых тест-систем позволяет выявлять количество альбумина в моче в пределах, включающих экскрецию альбумина в норме от 1 до 20 мкг/мл, и экскрецию альбумина в пределах микроальбуминурии в диапозо-не 20-200 мкг/мл.
Разработанные тест-системы на основе альбуминового рецептора апробированы уже во многих клиниках Санкт-Петербурга. С помощью количественной тест-системы ведется определение микроальбуминурии у больных сахарным диабетом в процессе лечения, что является необходимым условием контроля течения болезни.
Данный метод позволяет выявлять микроальбуминурию у больных, у которых она не была выявлена при определении общего белка существующими методами.
Два варианта тест-системы для определения микроальбуминурии при сахарном диабете могут быть рекомендованы для проведения программы скрининга диабетической нефропатии. С помощью метода блоттинга можно очень быстро выявить среди больных сахарным диабетом группу риска развития диабетической нефропатии. Затем у выделенной группы больных с достоверной микроальбуминурией проводить количественные определения, которые необходимы на этапах
проведения лечения микроальбуминурии в целях предотвращения прогрессирова-ния диабетичекой нефропатии.
5. ВЫВОДЫ
1. Осуществлено клонирование гена М белка 12 серотнпа в конъюгативной плазмиде рУГ 101. Создана группа двурепликонных плазмид, позволяющих клонировать гены стрептококков в клетках Е.соН и в стрептококке группы Н. Трансмиссибельность гибридных плазмид позволила осуществить конъюгативный перенос гена М белка стрептококка группы А в стрептококк группы Б, в клетках которого показана экспрессия М белка.
2. Осуществлено клонирование гена М белка 48 серотипа ОТ7 позитивного штамма стрептококка группы А в фаговом и плазмидном векторах. Проклониро-ванный в рекомбинантном фаге, ген М белка 48 типа, кодирует антифагоцитарные детерминанты, а соответствующий экспрессирующийся М белок содержит протек-тивные эпитопы.
3. Проведено клонирование второго ешт подобного гена ОИ позитивного штамма М 48 типа стрептококка группы А, гена Рорецентора, в системе Е.соИ, где показано наличие функционально активного белка. Построена физическая карта полученной рекомбинантной плазмиды, уточнены размеры гена Рс-рецептора переклонированием делеционпых вариантов.
4. Осуществлено клонирование гена в белка стрептококка группы в в фаговом и плазмидном векторах. Путем клонирования 1,5 т.п.н. фрагмента гена, кодирующего полноразмерный белок С в вектор р ЭР64 доказано, что полученный белок является слитым белком с р-галактозидазой и обладает двумя функциональными активностями.
5. Проведено клонирование отдельных фрагментов гена, ответственных за альбумин-и 1цО-снячынание в Е.соН, где продемонстрировано наличие функционально активных белков.
6. Созданы штаммы-продуценты двуфункционалыюго в белка, 1«0-связывающего монофункционального О белка и альбумин-связывающего белка. Подобраны оптимальные условия для синтеза рекомбинантных белков и проведена их очистка аффинной хроматографией.
7. В результате аффинной хроматографии, лигандами для которой служили полученные рекомбинантные белки, как монофункциональный G белок, так и альбуминовый рецептор, выделены из плазмы человека препараты альбумина и IgG в высокоочищенном состоянии.
8. Впервые созданы высоко специфичные тест-системы для определения микроальбуминурии на основе альбуминового рецептора.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Голубков В.И., Гупалова Т.В., Ионтова И.И., Колесниченко Т.Г., Тотолян А.А. Введение ДНК лямдоидного фага X L. 47.1 в хромосому стрептококков группы Н, пути использования для клонирования, Пущино на Оке: Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", 1984, С. 43.
2. Голубков В.И., Гупалова Т.В., Колесниченко Т.Г., Тотолян А.А. Встраивание генома фага К L. 47.1 в хромосому стрептококка группы Н, Москва: Тезисы докладов IX Всесоюзного совещания "Гибридные плазмиды и экспрессия плазмид-ных генов", 1984, С. 204-205.
3. Голубков В.И., Гупалова Т.В., Бойцов А.С., Тотолян А.А. Гетерологичная трансформация плазмидами стрептококка и стафилококка. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1984, 4, С.7-10.
4. Голубков В.И., Гупалова Т.В., Суворов А.Н., Ионтова И.И., Колесниченко Т.Г., Тотолян А.А. Система для введения гетерологичных ДНК в хромосому стрептококка группы Н: Молекулярная генетика, микробиология, вирусология, 1985, 3, С.30-34.
5. Golubkov V.I., Gupalova T.V., Suvorov A.N., Totolian А.А. Insertion of phage X L.47.1 DNA into the streptococcus sanguis chromosomal DNA in molecular cloning experiments. : Proceedings of the IX International symposium on streptococci and streptococcal diseases. Ed.Y. Kimura, Reedboors, 1985, P.238-239.
6. Totolian A .A., Gupalova T.V., Suvorov A.N., Golubkov V.I., Cleary P.P., Nesterchuk L.B. Cloning of group A streptococcal genes in heterologous and homologous streptococcal species: II ASM conference on Streptococci and Streptococcal Diseases, Florida, USA, 1986, P. 14.
7. Голубков В.И., Суворов A.H., Гупалова T.B., Нестерчук Л.Б., Тотолян А.А. Система для введения клонированных генов в хромосому стрептококка группы Н,
Пущино на Оке: Тезисы Всесоюзной конференции "Новыуе подходы биотехнологии", 1986, С. 104-105.
8. Гупалова Т.В., Нестерчук Л.Б., Голубков В.И., Суворов А.Н., Тотолян А.А. Клонирование гена М белка 12 серотипа стрептококка группы А гетерологичных системах, Пущино на Оке: Тезисы докладов XI Всесоюзного совещания по проблеме "Плазмида, 1986, С.68.
9. Голубков В.И., Гупалова Т.В., Нестерчук Л.Б., Суворов А.Н., Тотолян А.А. Клонирование гена М белка в интегративных векторах, Лешшград:"Стратегия возбудителя в организме хозяина", 1987, С.72-79.
10. Нестерчук Л.Б., Гупалова Т.В., Колесниченко Т.Г., Суворов А.Н., Тотолян А.А. Создание и анализ банка хромосомных генов стрептококка группы А: Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1989, 2, С.42-46.
11. Golubkov V.I., Nesterchuk L.B., Gupalova T.Y., Duchin A.,Totolian А.А. Cloning of immunoglobulin G Fc reccptor protein of streptococcus pyogenes type M48, Washington DC: Genetics and molecular biology of streptococci, lactococci and enterococci. Edited G.Dunny, P.Cleaiy, l.l.McKay. ASM., 1991, P.230-232.
12. Gupalova T.V., Golubkov V.I., Suvorov A.N., Totolian A.A. Construction of the E.coli strains expressing IgG binding and albumin binding proteins: XII Lanceficld International Symposium on Streptococci and Streptococcal diseases, 1993, P.98.
13. Gupalova T.V., Orlova S.N., Suvorov A.N., Ustinovich I.A., Totolian A.A. Biotechnological approaches to developing receptors for the different classes of immunoglobulins: Biotechnology, St.Petersburg, 1994, P39-40.
14. Suvorov A.N., Savelieva I.A., Dmitriev A.V., Gupalova T.V., Totolian A.A. IgA receptor genes in group В streptococci, Santa Fe, USA: Abstracts of the 4th International Conference on Streptococcal Genetics, 1994, P33.
15. Gupalova T.V., Golubkov V.I., Suvorov A.N., Totolian A.A. Construction of the E.coli strain expressing IgG binding and albumin binding proteins: Pathogenic streptococci: present and future td. A. Totolian, St.Petersburg, Russia, 1994, P.252-253.
16. Гупалова T.B., Суворов A.H., Устинович И.А., Тотолян А.А. Биотехнологические подходы к созданию рецепторов к различным классам иммуноглобулинов, Пущино на Оке: "Биотехнология", Всесоюзная конференция, 1995, Р75.
17. Гупалова Т.В., Орлова С.Н., Палагнюк В.Г., Тотолян А.А. Использование ре-комбинантных белков - рецепторов стрептококка человека группы G для определения альбумина и IgG в биологических жидкостях человека, Москва: Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике, 1995, С.78.
18. Gupalova T.V., Parchomenko T.V., Orlova S.N. Fluoriscent analysis of albumin from serum of patients after affinity chromatography with albumin receptor. Amsterdam: III Congress of EDTA Europien renal association, 1995, P. 132.
19. Gupalova T.V., Palagnuk V.G., Borovoy S.G., Orlova S.N., Totolian A.A. Evaluation of albumin and IgG in urine with the help of recombinant receptor proteins of group G streptococci, Amsterdam: III Congress of the EDTA Europien renal association, 1995, P. 156.
20. Gupalova T.V., Orlova S.N., Palagnuk V.G., Totolian A.A.. Usage of recombinant receptors of group G streptococcal for evaluation of albumin and IgG in biological liquids, Russia, Proceedings of III Annual St.Petersburg, Nephrology Seminar, 1995, P. 271.
21. Гупалова T.B., Тотолян A.A. Рекомбинантный IgG связывающий белок стрептококка. Патент на изобретение N 2056859, 1996.
22 Гупалова Т.В., Голубков В.И, Суворов А.Н.,Тотолян А.А. Получение и свойства рекомбинантного белка G: Вестник Академии Медицинских наук, 1996, 3, С. 44-49.
23. Гупалова Т.В., Орлова С.Н., Тотолян А.А. Рекомбинантный HSA рецептор стрептококка группы G. Патент на изобретение N 2065746, 1996.
24. Орлова С.Н., Гупалова Т.В., Палагнюк В.Г., Кузьмина М.С., Тотолян А.А. Рецептор человеческого альбумина: клонирование, получение и характеристика очищенного препарата: Биотехнология, 1996, 8, С. 13-21.
25. Orlova S.N., Gupalova T.V., Palagnuk V.G., Volchek NA, Totolian A .A. New method of evaluation of microalbuminuria., Kosice: International symposium on novel methods and standartisation in microbiology, 1996, P. 28.
26. Gupalova T.V., Orlova S.N., Palagnuk V.G., Totolian A.A. Usage of recombinant receptor proteins in clinical diagnostic, Kosice: International symposium on novel methods and standartisation in microbiology, 1996, P.25.
27. Гупалова T.B., Орлова C.H., Палагнюк В.Г., Тотолян А.А. Создание рекомбинантного альбуминового рецептора и его использование в медицине, Москва: Тезисы докладов V конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии", 1996, С.116.
28. Gupalova T.V., Orlova S.N., Totolian А.А. Albumin receptor of group G streptococcus: cloning, expression and characterization: XIII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal diseases, 1996, P. 140.
29. Orlova S.N., Gupalova T.V., Palagnuk V.G., Totolian А.Л. Streptococcal Recombinant Receptors as a Diognostic Tool: XIII Lanciield International Symposium on Streptococci and Streptococcal diseases, 1996, P. 85.
30. Гупалова T.B., Орлова C.H., Палагнкж В.Г., Тотолян А.А. Определение микроальбуминурии с применением рекомбинацтного альбумин связывающего рецептора стрептококка у больных сахарным диабетом: Нефрологичсский семинар 96, Сборник трудов IV ежегодного Санкт-Петербургского нефрологического семинара, 1996, С. 270-272.
31. Gupalova T.V., Orlova S.N., TotolianA.A. Albumin receptor of group G streptococcus: cloning, expression and characterization: In: Advances in experimental medicine and biology: Streptococci and the host, edited by Th. Horand et al., 1997, 418, P. 753-755.
32. Orlova S.N., Gupalova T.V., Palagnuk V.G., Totolian A.A. Streptococcal recombinant receptor as Diagnostic Tool: In: Advances in experimental medicine and biology: Streptococci and the host, edited by Th. Horand et al., 1997, 418, P.593-596.
33. Гупалова T.B., Орлова C.H., Палагнкж В.Г., Волчек Н.А., Тотолян A.A. Определение микроальбуминурии с помощью стрептококкового альбуминового рецептора: Клиническая лабораторная диагностика, 1997, 2, С. 14-18.
34. Tennikova Т.В., Meringova L.F., Gupalova T.V., Totolian A.A., Kasper С., Freitag R. Abstracts, 1997.
35. Палагнкж В.Г., Гупалова T.B., Орлова C.H., Тотолян A.A. Программа скрининга диабетической нефропатии в Санкт-Петербурге: Нефрологический семинар 97, Сборник трудов V ежегодного Санкт-Петербургского нефрологического семинара, 1997, Р. 83-87.
36. Аниконова Л.И., Крючкова З.В., Гупалова Т.В., Команденко М.С Мониторинг микроальбуминурии у больных сахарным диабетом на фоне лечения козааром: Нефрологический семинар 97. Сборник трудов V ежегодного Санкт-Петербургского нефрологического семинара, 1997, С. 115-116.
37. Палагнкж В.Г., Гупалова Т.В., Орлова С.Н., Тотолян А.А. О программе скрининга диабетической нефропатии: IV Национальный конгресс по профилактической медицине и валеологии,. Издательский дом "Здоровый мир", С. 120-121,1997
38. Gupalova Т, Orlova S., Palagnuk V., Volchek N-, Kuzmina M., Totolian A. Usage of recombinant receptor proteins in clinical diagnosis., Folia Veterinaria, 1997, 41, 3-4: P. 81-83.
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Гупалова, Татьяна Витальевна, Санкт-Петербург
' It
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ
на правах рукописи
ГУПАЛОВА ТАТЬЯНА ВИТАЛЬЕВНА
РЕЦЕПТОРНЫЕ БЕЛКИ СТРЕПТОКОККОВ: КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВ,
ЭКСПРЕССИРУЕМЫХ В Е.соИ
Специальность 03.00.04 - Биохимия
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант - академик РАМН Тотолян А. А.
СОДЕРЖАНИЕ
стр.
Список сокращений и условных обозначений..........................................................7
Введение ....................................................................................................................9
1. Литературный обзор .............................................................................................18
1.1. Общие сведения о стрептококках и их классификация ...................................18
1.2. Стрептококки, как возбудители заболеваний человека .................................. 22
1.3. Факторы вирулентности стрептококков группы А ......................................... 24
1.3.1. Факторы вирулентности, ассоциированные с клеточной стенкой .............. 24
1.3 .2. Экстрацеллюлярные продукты ...................................................................... 26
1.3.3. М белок ............................................................................................................28
1.3.4. Семейство М подобных белков ......................................................................34
1.4. Взаимодействие стрептококков с сывороточными белками человека ........... 38
1.5. Иммуноглобулины: структура и функция ........................................................ 40
1.6. Альбумин: структура и функция ....................................................................... 43
1.7. Бактериальные Бс-рецепторы, реагирующие с человека и млекопитающих ..................................................................................................... 47
1.7.1. Стафилококковый белок А ........................................................................... 47
1.7.2. Связывание стрептококковыми рецепторами 1§0 человека и млекопитающих ....................................................................................................... 49
1.7.3. Стрептококковый белок О ............................................................................ 51
1.8. Связывание сывороточного альбумина стрептококками групп А, С и в .... 56
1.9. Использование рецепторных белков стрептококка и необходимость создания их продуцентов.................................................................................. 62
1.10. Актуальность тест-диагностических систем на основе рекомбинантных
белков ..........................................................................................................................64
1.10.1. Протеинурия. Клиническое значение микроальбуминурии .........................64
1.10.2. Метод блоттинга ............................................................................................67
1.10.3. Иммуноферментный анализ ..........................................................................69
1.11. Заключение обзора ...........................................................................................71
2. Материалы и методы ............................................................................................73
2.1. Бактерии, фаги, плазмиды .................................................................................73
2.2. Культуральные среды и условия роста .............................................................73
2.3. Пассирование бактериофагов ............................................................................75
2.4. Титрование бактериофагов ................................................................................76
2.5. Выделение ДНК из лямбдоидных фагов ...........................................................76
2.6. Выделение плазмидной ДНК из стрептококков ...............................................76
2.7. Выделение плазмидной ДНК из Е.соН ..............................................................76
2.8. Выделение хромосомной ДНК из стрептококков ............................................76
2.9. Рестрикция и лигирование ДНК .......................................................................77
2.10. Трансформация стрептококков группы Н ......................................................77
2.11. Трансформация Е.соИ ......................................................................................78
2.12. Упаковка фаговой ДНК т укго .......................................................................78
2.13. Ультразвуковая дезинтеграция стрептококков ..............................................78
2.14. Электрофорез ДНК ..........................................................................................79
2.15. Элюция фрагментов ДНК из гелей .................................................................79
2.16. Гибридизация фаговых бляшек и бактериальных колоний ...........................79
2.17. Гибридизационный анализ ДНК .....................................................................80
2.18. Секвенирование ДНК ......................................................................................81
2.19. Методы лизиса клеток Е.соН для выделения рекомбинантных белков .........81
2.20. Определение динамики синтеза 1§С- и ЧСА-связывающих рецепторных белков ...............................................................................................82
2.21. Выделение и очистка рекомбинантных белков ..............................................83
2.22. Электрофорез белков .......................................................................................84
2.23. Электроперенос белков из полиакриламидного геля ....................................84
2.24. Метод колоний-блотт ......................................................................................85
2.25. Метод конъюгирования пероксидазы хрена с белками .................................85
2.26. Радиоактивное мечение фрагментов ДНК .....................................................86
2.27. Иммунизация животных, получение антисывороток ....................................86
2.28. Определение белка ..........................................................................................87
2.29. Бактерицидный тест ........................................................................................87
2.30. Определение способности рецепторов связывать человеческий ^О
и альбумин ............................................................................................................. 88
2.31. Определение количеств 1§0 или альбумина, которое может связать соответствующий рецепторный белок ...................................................................89
2.32. Определение констант связывания ..............................................................90
2.33.Определение взаимодействия рецепторных белков в и А с ^О, 1§М
и легкими цепями ^ человека ................................................................................91
2.34. Определение молекулярного веса рецепторных белков ................................92
2.35. Получение альбумина из сыворотки крови ....................................................92
2.36. Получение из сыворотки крови ...............................................................93
2.37.Проверка чистоты полученного препарата альбумина и идентификация полученных препаратов человеческого сывороточного альбумина ......................93
2.38. Приготовление аффинных колонок ................................................................94
2.39. Определение концентрации альбумина в моче методом блоттинга ..............95
2.40. Определение концентрации альбумина в моче методом конкурентного
связывания ................................................................................................................95
3. Результаты и обсуждение .....................................................................................97
3.1. Клонирование гена М белка ..............................................................................97
3.1.1. Клонирование гена М белка 12 серотипа в плазмиде pVI 101 .....................97
3.1.2. Клонирование гена М белка 48 серотипа в фаговом и плазмидном векторах ....................................................................................................................108
3.1.3. Получение антисывороток к рекомбинантным фаговым клонам и их
исследование в тестах по опсонизации ..................................................................119
3 .2. Клонирование и экспрессия гена иммуноглобулинового
Fe- рецепторного белка ...........................................................................................124
3.3. Клонирование и экспрессия гена G белка .......................................................132
3.3.1. Создание банка генов стрептококка группы G в фаговом векторе .............132
3.3.2. Идентификация рекомбинантных фаговых клонов .....................................133
3.3.3. Клонирование гена G белка в плазмидном векторе pUC 8 .........................134
3.3.4. Клонирование 1.5 т.н.п фрагмента гена G белка в плазмидном
векторе р SP64 .........................................................................................................140
3.3.5. Клонирование части гена, ответственного за IgG-связывание ...................145
3.3.6. Клонирование части гена, ответственного за связывание альбумина ........147
3.4. Выделение белков, кодируемых проклонированными частями гена ............150
3.5. Определение динамики синтеза рецепторных белков ...................................152
3.6. Очистка двуфункционального и монофункциональных белков ...................156
3. .7. Определение молекулярного веса белков .....................................................162
3.8. Характеристика связывающих свойств белков .............................................163
3.8.1. IgG-связывающие белки ..............................................................................163
3.8.2. Альбумин-связывающий белок ...................................................................168
3 .8.3. Определение количества IgG или альбумина, которое может
связать соответствующий рецепторный белок ...................................................168
3 .8.4. Взаимодействие G белка с IgG различных млекопитающих, с различными классами иммуноглобулинов и белками Бэнс-Джонса ........................................170
3.8.5.Взаимодействие альбуминового рецептора с альбуминами
различных млекопитающих ...................................................................................172
3.8.6. Взаимодействие G белка и альбуминового рецептора с плазменными белками человека ...................................................................................................172
3.8.7. Определение констант связывания .............................................................172
3.9. Стабильность препаратов рецепторных белков ............................................178
3.10. Использование полученных белков в качестве лигандов для
аффинной хроматографии ..................................................................................178
3.10.1. Получение альбумина из сыворотки крови ..............................................178
3.10.2. Проверка чистоты полученного препарата альбумина ............................179
3.10.3. Выделение препарата IgG из сыворотки крови ........................................179
3.11. Создание тест-систем для определения микроальбуминурии ....................183
3.12. Результаты клинической апробации метода ...............................................191
4. Заключение ........................................................................................................194
5. Выводы ..............................................................................................................211
6. Благодарности ...................................................................................................213
7. Список литературы ................................... ........................................................214
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СГА - стрептококк группы А
IgA - иммуноглобулин А
IgM - иммуноглобулин М
IgG - иммуноглобулин G
М - типоспецифический белок СГА
SCP - С5а пептидаза стрептококков
scp - ген С5а пептидазы
ешш - ген М белка
т.н.п. - тысячи нуклеотидных пар
kD - тысячи дальтон
Трис-НС1 - гидроксиметил-аминометан солянокислый ТЕ - 10 мМ Трис-HCl буфер, рН = 8.0, 1 мМ ЭДТА ЭДТА - этилен-диамин-тетрауксусная кислота SDS - додецил сульфат натрия
SDS - PAGE - SDS электрофорез белков в полиакриламидном геле PBS - забуференный физиологический раствор ELISA - иммуноферментный анализ
OF - Opacity Factor - фактор, гидролизующий А1 липопротеиды крови, "блотто" - буфер на основе обезжиренного молока
BHI, ТНВ - Brain Heart Infusion, Todd Hewitt Broth, ( коммерческие жидкие питательные
среды для приготовления культур стрептококков
LB - Luria Bertani ( бульон для выращивания штаммов Escherichia coli)
GS 10.1 - Challis GS 10.1 - штамм-реципиент для интегративного клонирования
( стрептококк группы Н)
TetR, APR,EmR - гены устойчивости к антибиотикам, соответственно, тетрациклину,
ампициллину, эритромицину
Lac Z - ген ß-галактизидазы E.coli
MLSr ( МЛС ) - резистентность к макролидам, линкозамидам, стрептограмину В SSC - натрий-цитратный буфер
pPCVI - группа бирепликонных плазмид, сконструированных на основе стрептококковой плазмиды pVI 101 и плазмиды E.coli рРС 124
IgG FcR А - рецепторный белок стрептококка группы А, способный неиммунно связывать Fe часть иммуноглобулина G
F ( ab ) и Fe - структурные части молекулы иммуноглобулина G
FcR - рецепторный белок стрептококка, способный связывать Fe часть молекулы
иммуноглобулина G
ЧСА - человеческий сывороточный альбумин
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы.
Изучение патогенных стрептококков и вызываемых ими заболеваний продолжает оставаться одной из актуальных задач теоретической медицины и практического здравоохранения. Это объясняется весьма широким распространением стрептококкового носи-тельства и стрептококковых заболеваний практически во всех странах мира, как в форме первичных инфекций, так и их осложнений токсической, септической, аллергической и иммунологической природы.
Стрептококки разных серогрупп занимают лидирующее положение в инфекционной патологии, вызываемой бактериями. Они вызывают такие распространенные заболевания, как ангины, фарингиты, скарлатина, сепсис, стрептодермии, ревматическая лихорадка, ревматическое заболевание сердца, острый гломерулонефрит, менингит, хорея, а также гнойные поражения органов и тканей. Клиническое разнообразие форм стрептококковых заболеваний варьирует в зависимости от биологических особенностей возбудителя, условий формирования очага инфекции и состояния организма инфицированного хозяина. Распространенность перечисленных заболеваний в большинстве стран и связанная с ними хроническая патология и инвалидизация части населения представляют не только медицинский, но и экономический интерес.
В настоящее время накоплена значительная информация о структуре клеток стрептококка, о биологических свойствах их антигенов, токсинов и энзимов. Большое развитие получили исследования по идентификации клеточных компонентов данных микроорганизмов, по клинической и эпидемиологической иммунологии и иммунопатологии стрептококковых заболеваний. Однако наши знания относительно механизмов патогенности и вирулентности стрептококков нуждаются в дальнейшем накоплении и развитии, так как прогресс в понимании молекулярных основ их патогенности, безусловно, отстает по сравнению с большин-
ством других бактериальных систем. В связи с изложенным актуальность углубленного изучения стрептококков не может вызывать сомнений.
Как и в случае всех инфекционных заболеваний, патогенез стрептококковых инфекций является итогом взаимодействия биологических систем организма хозяина и микроба. К числу биологически активных веществ патогенных стрептококков в первую очередь следует отнести многие вещества белковой природы, секретируемые микробной клеткой или входящие в состав ее клеточной стенки.
Хорошо известно, что вирулентность стрептококков групп А, С и О коррелирует с их способностью продуцировать на поверхности ряд белков. Однако роль всех стрептококковых белков в патогенезе, не исключая таких хорошо известных белков, как М белок стрептококков групп А, С, и О до сих пор недостаточно' хорошо изучена. Более того, знания о стрептококках и механизмах их вирулентности, которые казались совсем недавно очевидными, сейчас подвергаются сомнению.
Еще совсем недавно считалось, что поверхностные фибриллы вирулентных штаммов стрептококков представлены исключительно М белком, однако в составе клеточной стенки уже сейчас обнаружены разнообразные структуры белков и ферментов. С самим же М белком, входящим в состав группы М подобных белков наиболее вероятно связана способность связывать фибриноген организма хозяина. При этом уменьшается диспозиция СЗЬ на бактериальной поверхности. Это свойство помогает стрептококку избежать фагоцитоза.
Кроме классического М белка большая группа белков, гомологичных по своей структуре М белкам, в частности, ^О-связывающие белки, относятся к семейству М подобных белков. Штаммы стрептококков группы А могут экспрессировать один, два или три М подобных белка, гены которых локализованы последовательно на стрептококковой хромосоме. На настоящий момент принято разделение всех штаммов СГА по характеру организации генетической области, прилежащей к етш, на два класса. Фенотипически эти классы
различаются по способности экспрессировать OF белок. OF" штаммы обычно имеют только один emm подобный ген, и для этих штаммов продукт этого гена имеет антифагоцитарные свойства. OF штаммы экспрессируют два или три M подобных белка и разделение антифагоцитарной функции между ними не всегда является легкой задачей.
Практически все исследования, связанные с клонированием генов M белков CFA, выполнены на OF" штаммах. В силу того, что OF+ и OF" штаммы стрептококка различаются по структуре клеточной стенки, антигенности M белка, по количеству emm подобных генов, очевидно, что данные, полученные для OF" штаммов, не могут быть автоматически распространены на группу OF" штаммов.
IgG Fc-евязывание известно не только для СГА, но и для стрептококков групп С и G. Большинство штаммов стрептококков групп С и G экспрессируют белок G - IgG-связывающий белок. Он связывает, в отличие от стафилококкового белка А, все подклассы человеческого IgG, IgG многих видов млекопитающих и человеческий альбумин. Роль IgG Fc-евязывающих рецепторных белков в патогенезе стрептококковых инфекций еще не очень понятна. Однако благодаря своей способности связывать плазменные белки человека, как Fc-рецепторные белки СГА, так и G белок, имеют большое прикладное значение.
Таким образом, помимо изучения структуры и функции конкретных генов, изучения их роли в патогенезе стрептококков той или иной группы, большую роль приобретает получение биологически активных белков, кодируемых данными генами, которые являются высоко актуальными для клиники и диагностики, для целей иммунологии, иммунохимии и биотехнологии.
Все выше сказанное определило цели и задачи настоящего исследования.
Целью настоящей работы явилось изучение разных типов рецепторных белков патогенных стрептококков, как относящихся к вирулентности штаммов разных серогрупп, так и актуальных для клинико-лабораторной практики и биотехнологии.
Для этого планировалось выполнить следующие задачи:
1. Осуществить клонирова
-
Гупалова, Татьяна Витальевна
-
доктора биологических наук
-
Санкт-Петербург, 1998
-
ВАК 03.00.04
- Генетическая характеристика патогенных стрептококков групп А и В
- Альбуминовый рецептор стрептококка группы G: клонирование, характеристика и практическое использование
- Изучение G белка в клинических изолятах стрептококков групп C и G и его использование в биотехнологии
- Изучение области связывания IgA на рекомбинантном белке Bac стрептококка группы B
- Генетическая характеристика стрептококков группы В; картирование генома
