Изучение G белка в клинических изолятах стрептококков групп C и G и его использование в биотехнологии

Волчек, Наталья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение G белка в клинических изолятах стрептококков групп C и G и его использование в биотехнологии
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение G белка в клинических изолятах стрептококков групп C и G и его использование в биотехнологии"

На правах рукописи

од

1 7 ИР" 2000

ВОЛЧЕК Наталья Александровна

ИЗУЧЕНИЕ С БЕЛКА В КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТАХ СТРЕПТОКОККОВ ГРУПП СИСИ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Научно - исследовательском Институте Экспериментальной Медицины Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Гупалова Т.В.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Гуревич B.C.

Доктор биологических наук Занкина H.A.

Ведущее учереждение:

Санкт-Петербургский Институт Эпидемиологии и Микробиологии им. Пастера Минздравмедпрома РФ

Защита диссертации состоится 30" мая 2000 г. в 13 часов на заседании Диссертационного Совета К084.63.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Санкт-Петербургской Химико-фармацевтической Академии

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке института

Автореферат разослан преля 2000 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук

Н.В. Кириллова

ВВЕДЕНИЕ

Заболевания, вызванные стрептококками различных серологических групп, продолжают оставаться одними из самых распространенных в современном здравоохранении. В последнее время участились случаи заболеваний, вызванные условно - патогенными стрептококками и патогенами животных, к ним относятся и стрептококки серологических групп Сив. Ежегодно десятки миллионов людей, преимущественно детей и лиц репродуктивного возраста, страдают от стрептококковых заболеваний, которые часто переходят в хроническую форму. Совершенствование подходов для их диагностики, профилактики и терапии становится возможным только на основе современных знаний о природе возбудителя, механизмов его воздействия на организм человека, а также при наличии новых высоко чувствительных и специфичных средств диагностики, в том числе и экспрессных. Особая роль в решении вышеупомянутых задач отводится генно - инженерным и биотехнологическим методам исследования.

Большинство штаммов стрептококков групп Сив экспрессируют на своей поверхности Рс рецепторный белок, так называемый белок в. Он связывает все подклассы человеческого иммуноглобулина в ^С многих видов млекопитающих, человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) и а2-макроглобулин (а2М). Изучение в белка выявило в нем наличие повторяющихся как альбумин, так и связывающих доменов. Количество доменов обоих типов варьируется от штамма к штамму. Каждый штамм стрептококков групп Сив экспрессирует только какую - либо одну форму молекулы О белка. Способность в белка связывать с высокой аффинностью ЧСА и может обеспечить бактериям дополнительную защиту в организме хозяина и, в частности, защиту от воздействий иммунной системы.

Существующая классификация стрептококков основана исключительно на их антигенных различиях, в частности, на свойствах груп-поспецифического полисахаридного антигена или типоспецифическо-го поверхностного белка. Генетический же анализ может явиться дополнением к идентификации штаммов групп С и в по наличию и типу

гена в белка. Кроме того, не исключено, что для оценки вклада в белка в патогенность этих стрептококков, следует определять не только форму белка, но и уровень его экспрессии.

Интересным с точки зрения формирования вирулентного фенотипа стрептококков групп Сив, является тот факт, что в белок связывает а2М, основной ингибитор иротеиназ, в том числе и экзогенных. Однако область связывания а2М белком в не определена. Имея в руках рекомбинантные белки в с различной структурой, можно определить область связывания а2М. В дальнейшем, можно будет получить ре-комбинантный рецептор к самому а2М в чистом виде. Применение такого рецептора в качестве лиганда в аффинной хроматографии, в свою очередь, создаст условия для получения чистого препарата а2М из донорской плазмы.

Роль в белка в патогенезе стрептококковых инфекций еще не ясна, однако благодаря своей способности связывать плазменные белки человека, он имеет большое прикладное значение. Высокая аффинность 1цС связывающей части в белка позволяет использовать его в качестве лиганда в аффинной хроматографии для получения чистых препаратов ^С из плазмы донора. С этой целью используются новейшие хромато-графические технологии, которые сочетают в себе методы высокоэффективной жидкостной лиганд - обменной хроматографии с новыми полимерными мембранными носителями. Высокая специфичность в белка позволяет использовать его для определения 1»С в биологических жидкостях в диагностических тест - системах при замене антител на хорошо стандартизируемый рецепторный белок, а также для повышения чувствительности существующих тест — систем на основе антител и Рс рецепторного стафилококкового белка А.

Таким образом, помимо изучения структуры и функции конкретного гена С белка, изучения его роли в патогенности стрептококков групп С и в, большую роль приобретает получение, кодируемого данным геном, активного белка, который является высоко актуальным для клиники и диагностики, для целей иммунологии, иммунохимии и биотехнологии.

Все выше сказанное определило цели и задачи настоящего исследования.

Целью настоящей работы явилось определение области связывания в белка с а2- макроглобулином, характеристика в белка и кодирующего его гена в различных изолятах человеческого происхождения

стрептококков групп С и О, а также практическое использование ^О связывающего фрагмента й белка в мембранной биотехнологии. Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

1. Выявить область связывания молекулы в белка с а2-макроглобулином;

2. Определить распространенность гена в белка среди штаммов стрептококков групп Сий;

3. Провести сравнительный генетический анализ клинических изолятов стрептококков групп С и в по маркеру гена в белка;

4. Получить рекомбинантные белки с одним, двумя и тремя - связывающими доменами клонированием - связывающих

фрагментов гена й белка из различных изолятов стрептококков групп Сив;

5. Использовать рекомбинантный монорецепторный ^С - связывающий О белок в качестве лиганда в высокоэффективнойной мембранной хроматофафии для выделения чистого препарата ^О;

Научная новизна работы состоит в том, что:

1. Впервые установлена локализация области связывания О белка с а2-макроглобулином;

2. Впервые показана возможность идентификации по маркеру гена в белка не

только групповой С и й принадлежности штаммов, но и видовой ( для штаммов группы С) принадлежности стрептококков;

4. Впервые показана возможность определения молекулярно - генетическими

методами количества - и альбумин - связывающих доменов в молекуле в белка;

5. Впервые получен высокоочищенный препарат из сыворотки крови с использованием - связывающего фрагмента О белка в качестве лиганда в высокоэффективной мембранной хроматофафии.

Теоретическая ценность работы. Работа носит преимущественно теоретический характер. Показано, что генетический анализ позволяет идентифицировать штаммы стрептококков фупп Сив, выделенные от людей, по наличию гена в белка, а также определять их фупповую и видовую принадлежность на основании типа присутствующего гена в белка. Для оценки потенциальной роли различных форм О белка в

формировании вирулентного фенотипа стрептококков групп С и в *

следует определять не только ту или иную форму О белка, но и уровень его экспрессии.

Практическая ценность. Отработаны условия получения вы-сокоочищенного препарата методом высокоэффективной мембранной хроматографии, где вперЕ!ые в качестве лиганда был использован рекомбинантный - связывающий фрагмент в белка.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Область связывания в белка с а2-макроглобулином локализована перед альбумин - связывающими доменами молекулы, вероятно в области Е;

2. Для штаммов стрептококков групп С и в характерна различная организация структуры гена О белка. Благодаря этим различиям можно определять групповую и видовую принадлежность по маркеру гена в белка;

3. Альбумин и связывающие активности рекомбинантных в белков стрептококков групп С и О различных видов зависят от количества альбумин - и - связывающих доменов в их структуре;

4. Использование рекомбинантного монорецепторного - связывающего белка в качестве лиганда в высокоэффективной мембранной хроматографии позволяет получать чистый препарат из донорской плазмы за минимальное время хроматографического процесса.

Достоверность полученных результатов подтверждается высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов исследования (ДНК-ДНК гибридизация, секвенирование ДНК, иммунологические методы анализа и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные результаты.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 18 работ. Результаты диссертационного исследования были представлены и доложены на различных симпозиумах и конференциях: "Первая медико - биологическая конференция молодых ученых С. - Петербурга" (1997г.), "Всероссийская конференция молодых ученых" (Москва, 1998г.), "Международный симпозиум по новым методам в микробиологии" (Словакия, 1996г.), "Международный конгресс по клинической химии и лабораторной медицине" (Флоренция, 1999), "XIV Международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям" (Новая Зеландия, 1999), а также на научных конференциях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 128 страницах, включающих введение, литературный обзор, материалы и методы, собственные исследования и их обсуждение, выводы и указатель литературы. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 26 рисунками. Список литературы содержит 123 источника, в том числе, 13 на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе были использованы штаммы стрептококков групп А, 21 клинический изолят стрептококков групп С и G, 8 референс - штаммов, принадлежащих к разным видам стрептококка группы С, 3 референс — штамма стрептококка группы G, штаммы Escherichia coli. Клетки E.coli выращивали в LB среде. При выращивании клеток E.coli, несущих плазмиды с маркерами антибиотикоустойчивости, в среду добавляли ампициллин (Ар) 50 - 100 мг/мл и канамицин (Km) 25 мг/мл. Стрептококки групп А, С и (3 выращивали в среде Todd-Hewitt Broth ( ТНВ, Difco, Laboratories, Detroit, USA) или в жидких и агаризо-ванных средах, содержащих BHI ( Brain Heart Infusion) с добавлением дрожжевого экстракта (0,1% Yeast exstract Difco, USA). Все бактериальные штаммы выращивались в условиях термостатирования при 37°С.

В работе были использованы плазмиды pUC8, pQE3 l(QIAGENE).

При выделении плазмидной ДНК из рекомбинантных клонов E.coli использовали методику Бирнбойма. Также для быстрого выделения плазмидной и хромосомной ДНК использовали протокол Q1AGENE.

Трансформацию клеток E.coli проводили по Darget (1979). Выделение хромосомной и плазмидной ДНК проводили по Маниатис (1984).

Были составлены олигонуклеотидные праймеры при помощи компьютерной программы Oligo на полноразмерную IgG связывающую область, на область, кодирующую один IgG связывающий домен, на полноразмерную ЧСА связывающую область, на область, кодирующую один ЧСА связывающий домен.

ПЦР проводили на термоциклере Perkin - Elmer Cetus (США) с использованием термостабилыюй ДНК полимеразы (Ampli Tag, Perkin -Elmer Cetus) согласно протоколу Perkin - Elmer Cetus.

Рестрикция, лигирование и электрофорез ДНК проводились по Маниатис (1984).

ДНК фрагменты и амплификаты выделяли из агарозного геля согласно протоколу QIAGEN.

Гибридизацию с дигоксигениновым зондом проводили в соответствии с протоколом фирмы "Boehringer Mannheim" набора "DNA Labeling and Detection Kit Nonradioactive

В культурах штаммов, содержащих рекомбинантные белки определяли активность связывания с IgG и с ЧСА двумя методами, методом блоттинга и количественно - методом ИФА, описанными Гупаловой (1998).

Электрофоретическое разделение белковых молекул и электроперенос проводили по Laemmli (1970).

Конъюгирование пероксидазы хрена с белками проводили перйо-датным методом, согласно Фриммелю (1987). Очистку рекомбинант-ных белков проводили аффинной хроматографией на колонке с сефа-розой.

Определение белка в растворах проводили по методу Лоури (1982).

CIM диски и трубки промывали метанолом и дистиллированной водой. После промывания, диски помещали на 1 - 2 часа в 20 мМ карбонатный буферный раствор pH 9.3. Затем диски помещали в 1.5 мл 20 мМ карбонатного буферного раствора pH 9.3, содержащего 5-7 мг белка G. Реакция протекала в течение 18 часов при температуре 30°С. Свободные эпоксигруппы диска блокировались IM этанолами-ном при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем С1М диск помещали в раствор PBS, и после нескольких смен буфера, в нем хранили готовый коныогированный диск при температуре 5°С.

Хроматографию проводили с использованием перистальтического насоса, УФ детектора и регистрирующего устройства (LKB, Sweden). Пробы различной концентрации наносились на диск и трубку в PBS. Несвязавшиеся белки смывались также PBS. IgG элюировали с дисков и трубки 0.1 М HCl pH 2.0. В элюатах немедленно доводили значение pH до 7.5 NaOH. Препарат IgG диализовали против PBS.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Определение области связывания G белка с а2 - макроглобулином

Все исследуемые штаммы стрептококков группы G тестировали на способность связывать нативный а2М. Клетки стрептококков группы G инкубировали с донорской плазмой. Стрептококки группы G связы-

вают три плазменных белка: альбумин, IgG и а2М. Определение области связывания G белком а2М проводили с использованием реком-бинантных белков различных конструкций, а в качестве метода детекции результатов был использован SDS - PAGE. Рекомбинантные белки были получены в отделе молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (рис.1). Полноразмерный рекомбинантный G белок связывает как ЧСА, так и IgG, содержит область Е и кодируется 4 т.п.н. полноразмерным геном G белка. Двурецепторный G белок связывает как ЧСА, так и IgG и кодируется 1.5 т.п.н. фрагментом гена G белка. Мо-норецепторный белок связывает только IgG и кодируется 0.7 т.п.н. фрагментом гена G белка.

а)

Ss Е А1 01 А2 132 A3 S С1 D1 С2 D2 СЗ W м

б)

Hindlll

EcoRI 1_

PstI Sau3A PstI

_J_!_!_

PstI

Hindlll

Рис. 1 Схема организации молекулы О белка, рестрикционная карта и структура вставок гена в белка.

а) схема организации молекулы О белка; б) структура вставок гена С белка

1 - полноразмерный 4 т.н.п. ген; 2 - 1.5 т.п.н. фрагмент гена, кодирующий двурецепторный ЧСА и связывающий белок; 3 - 0.7 т.п.н. фрагмент гена, кодирующий монорецепторный ^О связывающий белок; 4 - 0.6 т.п.н. фрагмент гена, кодирующий ЧСА связывающий белок.

С этими белками были приготовлены аффинные колонки, и на них последовательно наносили раствор а2М. Анализ смывов и элюатов показал, что а2М взаимодействует только с полноразмерным G белком. В этом случае а2М был получен в элюате. Во всех остальных случаях а2М был обнаружен только в смывах, т.е ни двурецепторный г*

ни монорецепторный ^О - связывающий белки не способны взаимодействовать с а2М (рис.2). Также, в экспериментах с нанесением на колонки сыворотки, в элюате с колонки с полноразмерным белком, были получены три плазменных белка: ЧСА, ^С и а2М (рис.2). Результаты проведенного нами эксперимента доказывают, что только полноразмерный белок в, имеющий область Е, способен связывать а2М и область связывания находится перед ЧСА - связывающими доменами. Полученные нами данные расходятся с результатами 5]оЬгш§, который обнаружил связывание а2М в - связывающих доменах в белка.

цт" : -!

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 2 Связывание рекомбинантных рецепторных белков с а2 - макроглобулином

1- маркер молекулярных масс: 205 кД, 116 кД, 82 кД, 47 кД

2- несвязавшийся с двурецепторным G белком а2-макроглобулин (смыв)

3- несвязавшийся с монорецепторным IgG связывающим G белком а2-макроглобулин (смыв)

4- элюат с колонки с монорецепторным G белком

5- элюат а2-макроглобулина с колонки с полноразмерным G белком (нанесение на колонку плазмы донора)

6,7 - элюат а2-макроглобулина с колонки с полноразмерным G белком

Однако, работы по изучению поверхностных белков стрептококков групп С и G, выделенных от животных MIG и MAG (S. dysgalactiae) и ZAG (S. zooepidemicus), выявили наличие области связывания с а2М также перед альбумин - связывающими доменами. Эти поверхностные

стрептококков группы в, экспрессирующих в белок с двумя ^О -связывающими фрагментами, амплификациоиный фрагмент имел размер 409 п.н.. Для штаммов стрептококков группы С, амплификациоиный фрагмент имел размер 450 п.н.. Для контрольных штаммов стрептококков группы С - 8.гооер1с1ет1*си5 и К.еяш амплификационных фрагментов получено не было. Размер амшшфикационного фрагмента для контрольных штаммов Б.(3у5§а1асиае отличался от размера ампли-фикационного фрагмента Б.еяшзнпШз, которые обычно выделяются отчеловека.

При анализехромосомных ДНК, выделенных из исследуемых штаммов, с праймерами на полноразмерпую ЧСА - связывающую часть, было получено два типа амплификационных фрагментов. Для штаммов, экспрессирующих в белок с тремя ЧСА - связывающими фрагментами, амплификациоиный фрагмент имел размер 500 п.н.. Для остальных штаммов стрептококков групп С и в, экспрессирующих в белок с двумя ЧСА - связывающими фрагментами, амплификациоиный фрагмент имел размер 400 п.н.. Для штаммов стрептококков группы С третьей группы амплификационных фрагментов получено не было.

Таким образом, методами ДНК - ДНК гибридизации и ПЦР показана возможность определения как групповой принадлежности стрептококков групп С и в, а также видовой принадлежности стрептококка группы С, выделенных отчеловека.

Рис.3 ДНК - ДНК гибридизация НшЛИ рестрикционных фрагментов хромосомных ДНК штаммов стрептококков групп С и О с 1.5 т.п.н.

зондом

1 - ДНК фага X. дикого типа + НшсПИ • ЕсоЮ; 2- С148; 3- 04223; 401; 5- 6- 03; 7- в4; 8- 068А; 9- 0166В; 10- С4540; 11-С4; 12-С5; 13-С6; 14-С7; 15-С8; 16-С1; 17- СЗ; 18-С895.

белки по структуре и функциям аналогичны G белку. Таким образом, область связывания а2М с G белком совпадает с областью связывания а2М поверхностными белками стрептококков, выделенных от животных. То есть связывание а2М является общей функцией N концевой части многих IgG - связывающих поверхностных белков.

Анализ коллекции стрептококков групп С и G обнаружил гетерогенность штаммов в зависимости от экспрессируемого G белка. Были обнаружены белки с различными молекулярными массами и ЧСА - и IgG - связывающими активностями, причем каждый штамм мог экс-прессировать только одну форму G белка. Кроме того, поскольку форма G белка является индивидуальной характеристикой штамма, изучение как самого белка, так н гена его кодирующего, может дать возможность дополнить идешпфикацию штаммов стрептококков групп С и G. Получив различия в молекулярных массах и ЧСА - и IgG -связывающих активностях, мы рассмотрели это явление на уровне организации гена молекулы G белка. Было показано, что в нашей коллекции существует три формы молекулы G белка (табл 1). Молекула первой формы G белка содержит 3 ЧСА - и 3 IgG - связывающих домена. Вторая форма G белка содержит 2 ЧСА - и 2 IgG - связывающих домена. Третья форма обладает только 2 IgG - связывающими доменами. Количество связывающих доменов были получены исходя из ДНК -ДНК гнбридизационного анализа (рис.3) и метода ПЦР на отдельные фрагменты гена G белка. Гнбрилизующийся фрагмент для гена G белка для стрептококков группы G с тремя IgG связывающими доменами составил 4 т.и.н., с двумя - 1.8 т.п.н., в то время как для стрептококков группы С, гибридизующийся фрагмент составил 2 т.п.н.. Трех IgG связывающих доменов G белка для стрептококков группы С обнаружено не было. Хромосомная ДНК, выделенная из контрольных штаммов стрептококков группы С - S.equisimilis С895 и С896 гибридизовалась также в области 2 т.п.н.. Хромосомная ДНК, выделенная из контрольных штаммов стрептококков группы С - S.dysgalactiae С715 и С907 гибридизовалась в области 3.8 и 1.4 т.п.н. соответственно. Хромосомная ДНК, выделенная из кош рольных штаммов стрептококков группы С - S.zooepideinicus и S.equi не гибридизовалась с 1.5 т.п.н. зондом. При анализехромосомных ДНК, выделенных из исследуемых штаммов, с праймерами на полнора (мерную IgG - связывающую часть, было получено три типа амплификационных фрагментов. Для штаммов, экспрессирующих G белок с тремя IgG - связывающими фрагментами, амплификационный фрагмент имел размер 600 п.н.. Для штаммов

Существующая классификация стрептококков основана в настоящее время на серологических методах исследования. Молекулярно — генетические подходы классификации рассматриваются только для стрептококков групп А и В. Таким образом, предложенный нами метод идентификации по маркеру гена в белка позволит дополнить существующие в настоящее время способы диагностики стрептококков групп С и й. Различная организация молекулы в белка определяет степень связывающей активности и может быть связана с тяжестью течения заболеваний, вызываемых данными штаммами.

Таблица 1

Распределение штаммов стрептококков групп С и в в зависимости от молекулярной массы и количества экспрессируемого ими в белка

Штамм Группа Молекулярная масса О белка ГкД) Количество [ёв связывающего белка (мкг) Количество ЧСА связывающего белка (мкг) Размер гибрид. фрагмента (Т.11.Н.) амплиф. фрагм. (п.н.) ЧСА амплиф. фрагм. (п.н.)

0148 О 65 900 + 73 900 + 60 4.0 600 500

С4223 в 65 1000+ 78 1200 + 81 4.0 600 500

068А О 65 980 + 71 960 + 70 4.0 600 500

С1 в 65 800 + 68 700 + 73 4.0 600 500

СЗ о 65 920 + 73 800 + 91 4.0 600 500

в4 в 65 600 + 52 400 + 61 4.0 600 500

в 65 590 + 64 400 + 55 4.0 600 500

в2 О 58 400 + 60 300 + 31 1.8 409 500

о 58 350 + 33 260 + 25 1.8 409 400

С166В в 58 300 +28 220 + 24 1.8 409 400

вб в 58 280 + 27 200 + 20 1.8 409 400

С4540 с 58 450 + 52 300 + 31 2.0 450 400

С1 с 58 280 + 28 250 + 21 2.0 450 400

С2 с 58 300 + 22 240 + 21 2.0 450 400

СЗ с 58 260+ 18 80 + 9 2.0 450 400

Б^ШБ 1 с 58 310 + 26 180+ 17 2.0 450 400

З.сдшз 2 с 58 280+ 19 120+ 19 2.0 450 400

(¡7 в 45 200+ 16 0 1.8 450 -

в8 с 45 180 + 22 0 1.8 450 -

Далее, нами была предпринята попытка более детального изучения той части гена в белка, которая кодирует 1«С - связывающий белок. Для этого были проклонированы фрагменты гена в белка из штаммов

с различным количеством связывающих доменов, а также фрагмент гена, кодирующий один связывающий домен, поскольку природного штамма с подобной характеристикой обнаружено не было. Амплификационные фрагменты 600 п.н., 409 п.н. для фрагмента гена в белка с трехдоменной структурой и двухдоменной структурой штаммов стрептококков группы в соответственно, 450 п.н. для фрагмента гена в белка с двухдоменной структурой стрептококка группы С и 300 п.н. для фрагмента гена, кодирующего один связывающий домен, были клонированы в векторную систему рС>Е. В качестве хромосомных матриц были использованы хромосомные ДНК штаммов С4540, в 148 и 20. Амплификационные фрагменты были выделены из легкоплавкой агарозы, гидролизованы эндонуклеазами НшсПП и ВашН1, поскольку в нуклеотидной последовательности праймеров были заложены соответствующие сайты рестрикции, а затем клонировались в векторную плазмиду рС?ЕЗ 1 по этим же сайтам. Рекомбинант-ные клоны, отобранные на чашках с ампициллином (50мг/мл) и кана-мицином (25 мг/мл) проверялись на способность экспрессировать связывающий белок. Полученные рекомбинантные белки были изучены, и показана зависимость - связывающей активности от количества доменов, содержащихся в белке (рис. 4).

100

* 50

о а

100

1000

С белок добавле!

нный (нг)

-а— СрС148 -*— СрС4540 —•—СрС2 —•— врЗОО

Рис. 4 Кривые ингибирования рекомбинантных белков

Помимо изучения структуры и функции G белка, а также гена его кодирующего, в настоящее время приобрело большое значение получение этого белка в чистом виде. Поэтому дальнейшая работа была посвящена выделению и практическому использованию рекомбинант-ного IgG связывающего белка.

В настоящее время человеческий IgG получают из сыворотки и плазмы доноров спиртовым осаждением по методу Кона. Наличие измененных форм препаратов IgG, влияющих на его иммунологические свойства, а также соосаждение посторонних белков плазмы побудили к переходу на более современную хроматографическую технологию. Этот метод включает в себя 5-6 последовательных стадий очистки на хроматографических колонках. Одной из возможностей уменьшения трудоемкомти хроматографического процесса, является использование аффинной хроматографии, в которой в качестве лиганда используется рекомбинантный IgG связывающий G белок. Для этой цели была приготовлена колонка G белок - сефароза 4В. Полученный препарат IgG, выделенный из донорской плазмы на этой колонке показал высокую степень чистоты.

Успешное использование полимерных CIM (Convective Interaction Media) дисков и трубок с макропоровой структурой для разделения экспериментальной смеси белков, а также коньюгации их с IgG и ЧСА уже описаны в литературе. Наша задача состояла в том, чтобы смоделировать возможность получения на этих мембранах, использованных вместо аффинных колонок, чистого препарата IgG из донорской плазмы и сравнить полученный препарат IgG с коммерческими и с препаратом, полученным на обычной аффинной колонке. Коньюгирование мембран с G белком и стабильность при хранении являются большим преимуществом по сравнению с обычной аффинной колонкой. Был проведен ряд экспериментов на мембранах и трубках с различными скоростями нанесения растворов IgG, человеческой и кроличей плазм. Было показано, что использование полимерных мембран и трубок позволяет уменьшить время хроматографии в сотни раз. Так, за несколько минут из плазмы можно получить 1 - 2 мг чистого препарата IgG на аналитическом CIM диске и 5 - 6 мг IgG на полупрепаративной CIM трубке. Полученные препараты IgG как на аффинной колонке с IgG связывающим белком, так и на CIM мембране с тем же лигандом идентичны и не уступают по чистоте и антигенным свойствам коммерческим препаратам.

ВЫВОДЫ

1. Установлена область связывания молекулы G белка с а2 - макроглобулином.

2. Показано, что ген G белка присутствует в хромосомных ДНК всех проанализированных штаммов стрептококков групп С и G, для которых характерна различная организация его доменной структуры.

3. Молекулярно — генетическими методами показана возможность определения числа доменов G белка, связывающих иммуноглобулин G и человеческий сывороточный альбумин в любом клиническом изоляте стрептококков групп С и G.

4. Разработан молекулярно - генетический подход для групповой идентификации стрептококков серологических групп С и G и видовой идентификации стрептококков серологической группы С.

5. Осуществлено клонирование фрагментов гена G белка с одним, двумя и тремя IgG -связывающими доменами из различных клинических изолятов стрептококков групп С и G. Показано, что интенсивность связывания иммуноглобулина G зависит от числа иммуноглобулин - связывающих доменов.

6. Получен хроматографически очищенный IgG - связывающий ре-комбинантный белок, который использован в качестве лиганда в высокоскоэффективной мембранной хроматографии.

7. Получен высокоочищенный препарат IgG из донорской плазмы с использованием рекомбинантного IgG - связывающего белка в качестве лиганда в аффинной и высокоэффективной мембранной хроматографии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Orlova S.N., Gupalova T.V., Palagnuk V.G., Volchek N.A., Totolian A.A., New method of evaluation of microalbuminuria., Kosice: International symposium on novel methods and standartisation in microbiology, 1996, p. 28.

2. Gupalova T.V., Orlova S.N., Palagnuk V.G., Volchek N.A., Totolian A. A., Usage of recombinant receptor proteins in clinical diagnostic, Kosice: International symposium on novel methods and standartisation in microbiology, 1996, p.25.

3. Orlova S.N., Gupalova T.V., Palagnuk V.G., Volchek N.A., Totolian A.A., Streptococcal Recombinant Receptors as a Diognostic Tool: XIII

Lancfield International Symposium on Streptococci and Streptococcal diseases, 1996, p. 85.

4. Гупалова T.B., Орлова C.H., Палагнкж В.Г., Тотолян А.А., Определение микроальбуминурии с применением рекомбинантного альбумин связывающего рецептора стрептококка у больных сахарным диабетом: Нефрологический семинар 96, Сборник трудов IV ежегодного Санкт-Петербургского нефрологического семинара, 1996, с. 270-272.

5. Orlova S.N., Gupalova T.V., Palagnuk V.G., Volchek N.A., Totolian A.A., Streptococcal recombinant receptor as Diagnostic Tool: In: Advances in experimental medicine and biology: Streptococci and the host, edited by Th. Horand et al., 1997,418, p.593-596.

6. Гупалова T.B., Орлова C.H., Палагнюк В.Г., Волчек Н.А., Тотолян А.А., Определение микроальбуминурии с помощью стрептококкового альбуминового рецептора: Клиническая лабораторная диагностика, 1997,2, с. 14-18.

7. Gupalova Т, Orlova S., Palagnuk V., Volchek N., Kuzmina M., Totolian A., Usage of recombinant receptor proteins in clinical diagnosis., Folia Veterinaria, 1997,41, 3-4: p. 81-83.

8. Волчек H.A., Гупалова Т.В., Характеристика G белка, экспрессируе-мого человеческими стрептококками групп С и G, Материалы 1 - й медико - биологической конференции молодых ученых Санкт - Петербурга, ноябрь, 1997, с. 17.

9. Волчек Н.А., Гупалова Т.В., Характеристика Fc-рецепторных белков стрептококков групп С и G и их применение: Материалы конференции "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 1998, с. 194-195.

10. Volchek N.A., Gupalova T.V., Fe - receptor proteins of group С and G Streptococci, International Medical Conference for Students and Young Doctors, Lublin, Poland, April, 1998, p. 64.

11. Volchek N.A., Gupalova T.V., Characterisation of group С and G Streptococci G proteins, 9th European Students Conference of the Charite for Students and Young Doctors, Berlin, Germany, October, 1998, p. 139.

12. Gupalova T.V., Palagnuk V.G., Volchek N.A., Totolian A.A., Usage of receptor proteins of streptococci in laboratory medicine: 17 International and 13 European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 1 International Congress of Clinical Molecular Biology, Firenze,Italy, 1999, p. 517.

13. Гупалова Т.В., Палагнюк В.Г., Волчек Н.А., Тотолян А.А., Хрома-тографический метод получения иммуноглобулина G из плазмы чело-

века с применением рекомбинантного G белка: Научно-практическая конференция "Производственная трансфузиология на рубеже XXI века, Москва, 1999, с. 34.

14. Волчек H.A., Гупалова Т.В., Тотолян A.A., Сравнительная характеристика изолятов стрептококков групп С и G, выделенных от человека, по гену G белка. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1999, в печати.

15. Gupalova T.V., Voltchek N.A., Totolian A.A., Identification of Human Group С and G Streptococcus Strains on the Basis of Protein G Gene. XIV Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Abstracts, Neu-Zeland, 1999, p. 364.

16. Gupalova T.V., Voltchek N.A., Totolian A.A., Characterization of Clinical Isolates of Group С and G Streptococci on the Basis of Protein G Gene. Folia Microbiologia, 2000,40, p. 35 - 37.

17. Gupalova T.V., Voltchek N.A., Totolian A.A., Protein G, Expressed by Human Group С and G Streptococci: Cloning of Gene and Protein Binding Properties. Folia Microbiologia, 2000,40, p. 86 - 88.

18. Gupalova T.V., Voltchek N.A., Totolian A.A., Identification of Human Group С and G Streptococcus Strains on the Basis of Protein G Gene. Proceedings of the XIV Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Neu-Zeland, 1999, p. 679.

Подписано к печати 11.14 кп. Формат 60 х84 7„_

Типография ВМедА

Заказ i i Т~ Объем i пл.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волчек, Наталья Александровна

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Общие сведения о стрептококках и их классификация

1.2. Взаимодействие стрептококков с сывороточными белками человека

1.3. Бактериальные И с -рецепторы, реагирующие с человека и млекопитающих

1.3.1. Стафилококковый белок А

1.3.2. Стрептококковые Бс-рецепторы

1.3.3. Стрептококковый белок О

1.4. Взаимодействие стрептококков групп А, С и О с а2М

1.5. Характеристика плазменных белков, взаимодействующих с в белком

1.5.1. Иммуноглобулин в О^О): структура и функции

1.5.2. Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА): структура и функции

1.5.3. а2 - макроглобулин: структура и функции

1.6. Использование рецепторных белков стрептококка

1.7. Применение новейших хроматографических технологий для получения белковых препаратов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение G белка в клинических изолятах стрептококков групп C и G и его использование в биотехнологии"

Заболевания, вызванные стрептококками различных серологических групп, продолжают оставаться одними из самых распространенных в современном здравоохранении. Патологии респираторного тракта, кожные заболевания, постинфекционные осложнения (ревматический миокардит, постстрептококковый гломерулонефрит), такие опасные состояния как генерализованный септический и токсический синдромы, патология беременности и новорожденных; - вот далеко неполный перечень заболеваний, связанных со стрептококками. В последнее время участились случаи заболеваний, вызванные условно - патогенными стрептококками и патогенами животных. Эти микроорганизмы, а к ним относятся и стрептококки серологических групп С и О, вызывают такие серьезные системные заболевания как тонзиллиты, импетиго, септицемия, эндокардиты, септические артриты, целлюлиты. Присоединение стрептококковой инфекции часто осложняет течение бронхо- легочных заболеваний вирусной этиологии. Ежегодно, десятки миллионов людей, преимущественно детей и лиц репродуктивного возраста, страдают от стрептококковых заболеваний, которые часто переходят в хроническую форму.

Таким образом, лечение и профилактика стрептококковых заболеваний имеют не только медицинское, но и важное социально - экономическое значение для всех стран мира. Совершенствование подходов для их диагностики, профилактики и терапии становится возможным только на основе современных знаний о природе возбудителя, механизмов его воздействия на организм человека, а также при наличии новых высоко чувствительных и специфичных средств диагностики, в том числе и экспрессных. Особая роль в решении вышеупомянутых задач отводится генно - инженерным и биотехнологическим методам исследования.

В связи с тем, что поверхностные рецепторные белки патогенных стрептококков способны подавлять фагоцитоз, индуцировать синтез анти - иммуноглобулинов, преодолевать иммунные механизмы защиты, маскируя микроорганизм под белки хозяина, многие исследователи рассматривают их в качестве факторов вирулентности.

Патогенез стрептококковых инфекций обусловлен взаимодействием биологических систем организма хозяина и микроба. К числу биологически активных веществ патогенных стрептококков в первую очередь следует отнести многие вещества белковой природы, секретируемые микробной клеткой или входящие в состав ее клеточной стенки. Хорошо известно, что вирулентность стрептококков групп А, С и О коррелирует с их способностью продуцировать на поверхности клетки ряд белков. Недавно охарактеризованы гены М и М - подобных белков стрептококков групп А, С и которые кодируют поверхностные рецепторы, способные реагировать с Рс частью иммуноглобулинов О и А в сочетании со связыванием других сывороточных белков хозяина. Эти Рс рецепторные белки относятся к семейству М подобных белков и рассматриваются в качестве основных факторов патогенности.

Большинство штаммов стрептококков групп С ив экспрессируют на своей поверхности Рс рецепторный белок, так называемый белок О. Он связывает все подклассы человеческого 1§Ст, ^О многих видов млекопитающих, человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) и ос2-макроглобулин. Изучение О белка выявило в нем наличие повторяющихся как альбумин, так и связывающих доменов. Количество доменов обоих типов варьирует от штамма к штамму. Каждый штамм стрептококков групп Сив экспрессирует только какую - либо одну форму молекулы О белка. Способность О белка связывать с высокой аффинностью ЧСА и может обеспечить бактериям дополнительную защиту в организме хозяина и, в частности, защиту от воздействий иммунной системы. Благодаря способности О белка связывать участок ответственный за связывание с компонентом комплемента, можно допустить его роль в формировании вирулентного фенотипа стрептококков групп С и О.

Существующая классификация стрептококков основана исключительно на их антигенных различиях, в частности, на свойствах группоспецифического полисахаридного антигена или типоспецифического поверхностного белка. Генетический же анализ может явиться дополнением к идентификации штаммов групп С и О по наличию и типу гена О белка. Кроме того, не исключено, что для оценки вклада О белка в патогенность этих стрептококков, следует определять не только форму белка, но и уровень его экспрессии.

Интересным, с точки зрения формирования вирулентного фенотипа стрептококков групп С и О, является тот факт, что в белок связывает а2-макроглобулин, основной ингибитор протеиназ, в том числе и экзогенных. Однако область связывания а2-макроглобулина белком О не определена. Имея в руках рекомбинантный белок О, кодируемый полноразмерным геном, а также рекомбинантные белки либо с ^О -связывающей функцией, либо альбумин -связывающей активностью, можно попытаться определить область связывания а2-макроглобулина. В дальнейшем, можно будет получить рекомбинантный рецептор к самому а2-макроглобулину в чистом виде. Применение такого рецептора в качестве лиганда в аффинной хроматографии в свою очередь создаст условия для получения чистого препарата а2- макроглобулина из донорской плазмы.

Роль в белка в патогенезе стрептококковых инфекций еще не ясна, однако благодаря своей способности связывать плазменные белки человека, он имеет большое прикладное значение. Высокая аффинность связывающего О белка позволит использовать его в качестве лиганда в аффинной хроматографии для получения чистых препаратов ^С из плазмы донора. С этой целью используются новейшие хроматографические технологии, которые сочетают в себе методы высокоэффективной жидкостной лиганд - обменной хроматографии с новыми полимерными мембранными носителями. Высокая специфичность в белка позволит использовать его для определения в биологических жидкостях при замене антител на хорошо стандартизируемый рецепторный белок, а также для повышения чувствительности существующих тест -систем ныне сконструированных на основе антител и Бс рецепторного стафилококкового белка А.

Таким образом, помимо изучения структуры и функции конкретного гена в белка, изучения его роли в патогенности стрептококков групп СиБ, большую роль приобретает получение, кодируемого данным геном, активного белка, который является высоко актуальным для клиники и диагностики, для целей иммунологии, иммунохимии и биотехнологии.

Все выше сказанное определило цели и задачи настоящего исследования.

Целью настоящей работы явилось определение области связывания О белка с а2-макроглобулином, характеристика в белка и кодирующего его гена в различных клинических изолятах человеческого происхождения стрептококков групп С и С, а также практическое использование связывающего фрагмента в белка в мембранной биотехнологии.

Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

1. Выявить область связывания молекулы О белка с а.2-макроглобулином;

2. Определить распространенность гена О белка среди штаммов стрептококков групп С и О;

3. Провести сравнительный генетический анализ клинических изолятов стрептококков групп С и С по маркеру гена О белка;

4. Клонированием !цО - связывающих фрагментов гена С белка из различных изолятов стрептококков групп С и О получить рекомбинантные белки с одним, двумя и тремя щО - связывающими доменами;

5. Использовать рекомбинантный монорецепторный 1цСг - связывающий О белок в качестве лиганда в высокоэффективной мембранной хроматографии для выделения чистого препарата

Научная новизна.

Научная новизна работы состоит в том, что:

1. Впервые установлена локализация области связывания О белка с а2-макроглобулином;

2. Впервые показана возможность идентификации по маркеру гена О белка не только групповой С и О принадлежности штаммов, но и видовой (для штаммов группы С) принадлежности стрептококков;

Впервые показана возможность определения молекулярно - генетическими методами количества ТиО - и альбумин - связывающих доменов в молекуле О белка;

4. Впервые получен высокоочищенный препарат ГцСт из сыворотки крови с использованием - связывающего С белка в качестве лиганда в высокоэффективной мембранной хроматографии

Теоретическая ценность работы.

Работа носит преимущественно теоретический характер. Показано, что генетический анализ позволяет идентифицировать штаммы стрептококков групп С и С, выделенные от людей, по наличию гена О белка, а также определять их групповую и видовую классификации на основании типа присутствующего гена О белка. Для оценки потенциальной роли различных форм О белка в формировании вирулентного фенотипа стрептококков групп С и О, по видимому, следует определять не только ту или иную форму О белка, но и уровень его экспрессии.

Практическая ценность.

Отработаны условия получения высокоочищенного препарата (цО методом высокоскоростной мембранной хроматографии, где впервые в качестве лиганда был использован рекомбинантный 1§С - связывающий О белок.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Область связывания О белка с а2-макроглобулином локализована перед альбумин - связывающими доменами молекулы, вероятно в области Е;

2. Для штаммов стрептококков групп С и О характерна различная организация структуры гена О белка. Благодаря этим различиям можно определять групповую и видовую принадлежность по маркеру гена О белка;

3. Альбумин - и ¡цО - связывающие активности рекомбинантных О белков стрептококков групп С и О различных видов зависят от количества альбумин и связывающих доменов в их структуре;

4. Использование рекомби наш но го монорецепторного 1§С - связывающего белка в качестве лиганда в высокоэффективной мембранной хроматографии позволяет получать чистый препарат щО из донорской плазмы за минимальное время хроматографического процесса.

Апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 18 работ. Результаты диссертационного исследования были представлены и доложены на различных симпозиумах и конференциях: "Первая медико - биологическая конференция молодых ученых С. -Петербурга" (1997г.), "Всероссийская конференция молодых ученых" (Москва, 1998г.), "Международный симпозиум по новым методам в микробиологии" (Словакия, 1996г.), "Международный конгресс по клинической химии и лабораторной медицине" (Флоренция, 1999), "XIV Международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям" (Новая Зеландия, 1999), а также на научных конференциях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 128 страницах, включающих введение, литературный обзор, материалы и методы, собственные исследования и их обсуждение, выводы и указатель литературы. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 26 рисунками. Список литературы содержит 123 источника, в том числе 13 на русском языке.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Волчек, Наталья Александровна

5. ВЫВОДЫ

1. Установлена область связывания молекулы G белка с а2 - макроглобулином.

3. Молекулярно - генетическими методами показана возможность определения числа доменов G белка, связывающих иммуноглобулин G и человеческий сывороточный альбумин в любом клиническом изоляте стрептококков групп С и G.

6. Получен хроматографически очищенный IgG - связывающий рекомбинантный белок, который использован в качестве лиганда в высокоскоэффективной мембранной хроматографии.

11.5

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Резюмируя данные, приведенные в обзоре, можно отметить следующее. Количество информации о стрептококковом белке О, полученной в последнее время в связи с бурным развитием генной инженерии довольно велико. Осуществлено клонирование гена О белка и отдельных его фрагментов, кодирующих альбумин и 1§0 связывающие белки. Проведено секвенирование гена О белка, определена аминокислотная последовательность О белка, охарактеризованы его физико - химические свойства и специфическое связывание. Созданы штаммы - продуценты 1»0 связывающнго белка. Однако до сих пор не определена область связывания О белка с а2 - макроглобулином и, как было сказано выше, существуют различные мнения по этому вопросу. Имея в руках рекомбинантные белки с различными связывающими функциями, можно определить область связывания О белка а2 - макроглобулина. Поскольку а2 - макроглобулин является основным ингибитором протеаз, изучение этого взаимодействия может оказаться интересным с точки зрения формирования вирулентного фенотипа стрептококков групп С и в. В связи с этим, одна часть работы посвящена определению области связывания в белком а2 - макроглобулина.

Роль О белка в патогенезе стрептококковой инфекции не ясна и не исключено, что для оценки его вклада в патогенность стрептококков групп С и О следует определять не только какое количество связывающих доменов имеет О белок в том или ином клиническом изоляте (т.е. форму экспрессируемого белка), но и уровень его экспрессии, в зависимости от количества доменов. Поэтому изучению этой проблемы посвящена следующая часть работы.

Определение присутствия и типа гена О белка в стрептококках групп С и О могло бы оказаться существенным дополнением к общепринятой серологической юссййсха» | 41 даУДА^твенл^! * А идентификации этих микробов. Эта тема обсуждается в следующей части данной работы.

И, наконец, наличие штамма - продуцента рекомбинантного Рс рецептора позволило наработать достаточное количество в белка для того, чтобы продемонстрировать большие преимущества метода получения чистого препарата 1^0 из донорской плазмы с использованием специфического - связывающего в белка в качестве ли-ганда в высокоэффективной мембранной хроматографии. Этот раздел вошел в заключительную часть настоящей работы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2. 1. Бактерии, фаги и плазмиды

В работе были использованы штаммы стрептококков групп А, С и G, штаммы Escherichia coli. Характеристика бактериальных штаммов, использованных в работе, дана в таблице 2.1. Для создания библиотеки генов применяли фаговые векторы А, L47.1 и A, EMBL-3A. Перечень плазмид, использованных в работе, представлен в таблице 2.2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волчек, Наталья Александровна, Санкт-Петербург

1. Беляков В.Д., Ходырев А П., Тотолян A.A. Стрептококковая инфекция. М. Медицина, 1978, 294

2. Бурова Л.А., Тотолян A.A., Кристенсен П., Шален К. Иммуноглобулиновая Fc-рецепция стрептококков и ее участие в постстрептококковых осложнениях. ЖМЭИ, 1984,10, 12-20.

3. Гупалова Т.В., Голубков В.И., Суворов А.Н., Андреев A.C., Дмитриев A.B., Тотолян A.A., Получение и свойства рекомбинантного белка G., Вестник Академии Наук, 1996, 44 50

4. Джонсон ДР., Каплан Э.Л., Срамек Я., Бикова Р., Гавличек И., Гавликова Г., Мот-лова И., Криз П., Лабораторная диагностика инфекций, вызванных стрептококком группы А, Всемирная организация здравоохранения, Женева, 1998

5. Кочетов Г А. Практическое руководство по энзимологии. М., 1971

6. Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология, М. Высшая школа, 1985, 287 с.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.

8. Ройд А.,Основы иммунологии, М., Мир, 1991

9. Степанов В.М., Молекулярная биология. Структура и функции белков, М., Высшая школа, ¡996

10. Стыскин Е.Л., Ициксон Л. Б., Брауде Е.В., Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография, М., Химия. 1986

11. П. Рыбчин ВН., Основы генетической инженерии, Санкт Петербург, издательство СПбГТУ, ¡999

12. Фримель Г. Иммунологические методы, пер. с нем., М. Медицина, 1987, 438-439.

13. Щелкунов С.Н. Конструирование гибридных молекул ДНК. Новосибирск. Наука, 1994.

14. Abrahmsen L., Moks Т., Nilsson В., Helitnan U., Uhlen M. Analysis of the secretion in the staphylococcal protein A gene. EMBO J., 1985, 4, 3901 -3906.

15. Akerstrom В. Lindavist A. Lindahl G. Bindii Щ D! OOei ii6S Oi protein Aio, a bact

16. V/F/~v1 ,Пгл1 1 OQ 1 ^ А ППi ^v^uiui , Ivxv^i, iiiJiiitiilvJi,, i s s i, J/j—tKJKJ,

17. Akerstrom В., Bjorck L., A Physicochemical study of protein G, a molecule with unique immunoglobulin G-binding properties. J. Biol. Chem., 1986, 261, 10240-10247.

18. Akerstrom В., Nielsen E., Bjorck L., Definition of the IgG- and the albumin-binding regions of streptococcal protein G . J. Biol. Chem., 1987, 262, 13388-13391.

19. Akerstrom В., Brodin Т., P.eis K. Biorck L. Protein G a power ful too! for binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies. J. Immunol., 1985. 135. 2589-2592.

20. Armstrong G. Blevins A. Louria D.B., Henkel J.S. Moddv M.D. Sukanv M. Group В. С and G streptococcal infections in a cancer hospital. Ann. N. Y. Axad. ScL 1970, 174, 511522

21. Barnham M., Thornton T.j., Lange K. Nephritis caused by Streptococcus zooepidemicus. Lancet, 1983, 1, 945-948.

22. Bateman A.C., Ramsay A.D., Pallett A.P. Fatal infection associated with group С Streptococci. J. Clin. Pathol., 1993, 46, 965-967.

23. О О Dprcmin T С п*у\г\п\аА r\f T Рлглапч/^а p D о r-o « о 1 X? ririin m i or Praivamo A/f D ai i тп С

24. XJfCl jJUixxpOV/U-OA J., V/Vi V^Ciid^W X>CLia-iCJ, J. IVUUi I I^uCi "V/X i-Vi., i-jyjilz^u, X-s.

25. Birnboim H.C., Dolv J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant DNA . Nucl. Acid. Res., 1979:7,1513 1523

26. Bisno A.L., Craven D.E., McCabel W.R. M proteins of group G streptococci isolaied from bacterimic human infection. Infect. Immun., 1986, 26, 1171-1176.

27. Bisno A.L., Campo R.E., Collins C.M. Pathogenic streptococci: present and future . Pro

28. Aiaa/^inrtp tha T T on/»atiairl Tn+Qmo+iAMoi VTrmnniPiiim /"**■» Ctror^f m/iv/x Iw /vii .Liaiiuwiiwiu axxiCi nat-iv/xxal uyniMl^miii uu tJUwpLuuuv/vi axiu Ouv/pwvuwwai

29. Diseases. St-Petersburg, Russia, 225-227.

30. Bjorck L., Kronvall G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent. J. Immunol., 1984, 133, 969-974.

31. Bjorck L., Akerstrom B., Streptococcal protein G, in M.13.P. Boyle ( ed.), Bacterial immu-noglobulin-binding proteins: microbiology, chemistry and biology. Academic Press Inc. San-Diego., 1990, 113-126.

32. Bjorck L., Kastem W., Lindahi G., Wideback K. Streptococcal protein G. expressed by streptococci or by E. coli, has separate binding sites for human albumin and IgG. Mol. Imi QCT O/i it rm rlo k/THD Wait. V T Unr'IratAa't 17 ^

33. J. V iw X Vi.iy .X XVWiJ X^. J . X-f (IwLWX xcxi i W X WVCyiUX 1». L* IV/LWVIl) iUIUKy, i y \J I . U „ KJ y i — ! \J 3 .

34. Chateau M., Bjorck L. Protein PAB, a mosaick albumin-binding bacterial protein representing the first contemporary example of module shu filing. j. Biol.Chem., 1994, 269, 12147-12151

35. Chhatvval G., Albohn G„ Blobel H., Nov! complex formed between a nonproteolytic cell wall protein of group A streptococci and a2-macroglobulin., 1987, 169 (8), 3691 3695.

36. Chhatwai G., Muiler G., Blobel H. Characterization of binding of human a2 -macroglobulin to group G Streptococci. Infect.Immun., 47, 959-964.

37. Cleary P.!*., Peterson J. Chen €. Nelson C. Virulent numan strains or group G streptococci express C 5a peptidase enzyme similar to that produced by group A streptococci. Infect. Immun., 1991, 59, 2305-2310.

38. Cunningham A. J., Elliott S-F., James K., A simple method for isolating a2-macroglobulin cytokine complex., 1993, Journal of Immunological Methods, 169, 287 292.

39. Darget M., Erlich S.D., Prolonged incubated in calcium chloride improves the competence1. Oz-vli i rana I 070 As O

40. Ji E/Viiviiviiiu vvjii vv^lio. VJvuv/, O, z.J-^0.

41. Devriese L.A., Hommer j., Kilper-Balz R., Schleifer K.H. Streptococcus canis sp. nov: a species of group G streptococci from animals, inter. J. Syst. Bacteriol., 1986, 12, 422-425.

42. Dunna R.L., Wienberg A.N., Medrek T.F., Kunz L.J. Streptococcal infections. Medicine, 1969, 48, 87-127.

43. Dutra J.S., Chhatwal G.S., Blobel H. Binding of aggregated b2-microglobulin to streptococci of serological group A, B, C and G. In "Bacteria and the host" ( eds.) Rye. M., Frank j Avicenus Czechoslovak Medical Press., Prague, 107-109.

44. Efstration A. Outbreaks of human infections caused by pyogenic streptococci ofLancefieid group C and G, J. Med. Microbiol, 1989, 29, 207-219.

45. Efstration A., Teare E.L., McOhie D , Coiman G. The presence of M proteins in outbreaks strains of Streptococcus equisimilis T-type 204. J.Infect., 3989, 19, 105-111.

46. Elliasson M. Streptococcal protein G. Structure and function. Thesis Royal Institute of Technology, Stockholm, 1990.

47. Elliasson M., Olsson A., Palmkrautz E., Wiberg KInganas M., Guss B., Lindberg M., Uhlen M. Chimeric IgG binding receptors engineered from staphylococcal protein A and streptococcal protein G. J. Biol. Chem., 1988, 263, 4323-4327.

48. Endresen C. The binding to protein A of immunoglobulin G and of Fab and Fe fragments. Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. C, 1979, 87, 185-189.

49. Ernteli M„ Myhre E., Sjobring U., Bjorck L. Streptococcal G protein has affinity for both Fab and Fc fragments of human IgG. Moi.Immunol., 1988, 25, 121-126.

50. Facklam R., Beall B., Fischetti V., . emm typing and validation of provisional M types for group A Streptococci, 1999, Emerging infectious Diseases, 5,2, 247 253.

51. Fahnestock S.R., Alexander P., Nagle J., Fipula D., Gene for immunoglobulin binding protein from a group G streptococcus, Journal of Bacteriology, 1986, 870-880.

52. Fiingold D.S., Wienberg A.N., Ivledrek T.F., Kunz L.J. Extra-respiratory streptococcal infections. Importance of various serological groups. N. Engl. J. Med., 1966, 275, 356-361.

53. Gomi II., Hozumi T., Hattori C , Tagawa C, Kishimonto F., Bjorck L. The gene sequence and some properties of protein H. A novel IgG binding protein. J" Immunol. 1990, 144, 4046-4052.

54. Goward C.R., Murphy J.P., Atkinson T., Barstow D.A. Exspression and purification of a truncated recombinant streptococcal Protein G. Biochem,, 1990, 267, 171-177.

55. Graun J.W., Gray B.M., Griffith F.M., Desmuke W.E. Acute glomerulonephritis following group G streptococci infection. J.infect. Dis.; ¡987, 156, 411-412.

56. Graunt P.N., Seal D.V. Group G streptococcal infections. J.infect., 1987, 15, 5-20.

57. Grubb A.O., Grubb R.E., Christensen P.B., Shalen C., Isolation and some properties of an IgG binding protein from group A streptococci type 15., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 1982, 67, 369-376.

58. GussB., Eliasson M., Olsson A., Uhlen M., Frej A.K., Jornvall H , Flock J., Lindberg M. Structure of the IgG binding regions of streptococcal protein G. EMBQ J., 1986, 5, 15671575.

59. Hall P., Roberts R., Physical and chemical properties of human plasma a2-macrog1 obulin, 1978, Biochem. J., 171, 27-38.

60. Hackett S.P., Stevens D.L. Stretococcai toxic shock syndrome synthesis of tumor necrosis factor and interleukin-1 by monocytes stimulated with pyrogenic exotoxin A and streptolysin O. J.infect. Dis., 1992, 165, 879-885.

61. Heath D.G., Geary P.P. , Cloning and expression og gene foran immunoglobulin G Fc-receptor -protein from a group A streptococci. Infection and Immunity, 1987, 55, 12331238.

62. Kasper €., Meringova L., Freitag R., Tennikova T., Fast isolation of protein receptors from streptococci G by means of macroporous affinity discs., 1998, Journal of Chromatography A., 65 72.

63. Katerov V.E., Schalen C., Totolian A.A. Sequencing of genes within the regulon of Streptococcus pyogenes type Ml5 an opacity factor positive serotype with low opasity factor expression. Mol. Gen. Genetic., 1994, 18, 525-530.

64. Kato K., Lian L.Y., Barsukov I.L., Derrick J.P., Kim H., Tanaka R. Model for the complex between protein G and an antibody Fe fragment in solution. Faculty pharm. Sciences, 1995, 3, 79-85.

65. Kohler K.W. Streptococcal toxic shock syndrome. Zbl.Bact. 1990, 272, 257-264.

66. Kronvall G. A surface component on group A, C and G streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin G. J.Immunol, 1973, ill, 1401-1406.

67. Kronvall G. Mvhre E., Biorck L., Berggard J. Binding of aggregated human beta-2-microglobulin to surface protein structure in group A, C and G streptococci. Infect. Immun., 1978, 22, 136=142.

68. Kronvall G, Simmous A., Myhre E.B, Johnson S. Specific absorbtion of human serum albumin, immunoglobulin A and immunoglobulin G with selected strains of group A and G streptococci, infect. Immun., 1979, 25, 1-10.

69. Kuszewski J., Gore G.M., Gronenborn A.M. Fast folding of a prototypic polypeptides: the immunoglobulin binding domain of streptococcal protein G. Ppotein Sci, 1994, 3, 19451952.

70. Kyhse-Andersen J. Elektroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid tranfer of proteins from polyacrilamid to nitrocellulose. J.Biochem. Biophys. Met., 1984, 10, 203-209.

71. Laemmii U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature.(London),. 1970, 227, 680-686.

72. Lancefield R.C, A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci, J.Exp. Med, 1933, 57, 571-595.

73. Lancefield R.C. Current knowledge of type-specific M antigens of group A streptococci. J.Immunol, 1962, 89, 307-313.

74. Lee S.M., Essig N.Z, Lee T.K. Process development for the recovery and purification of recombinant protein G. J.Biotechn, 1992, 26, 213-219.

75. Legres L, Pochon F, Evidence for the binding of a biologically active Interleukin 2 to human a2-macroglobulin, 1995, Journal of Biological Chemistry, 270 (15), 8381 - 8384.

76. Leuven V, Human a2-macroglobulin: structure and function, 1982, Trends Biochem. Sci, 7, 185-187.

77. Lowry O.H.: Rosenbraugh N.J., Ferr A.L., Randail R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J.Mol. Biol., 1957, 193, 265-273.

78. Myhre E.B., Kronvall G. Heterogenity on nonimmune immunoglobulin Fe reactivity among Gram-positive cocci: Description of three major types of receptors for human immunoglobulin G. Infect, immun., 1977, 17, 475-482.

79. Myhre E.B., Kuusela P. Binding of human fibronectin to group A. C and G streptococci. Infect, immun., 1983, 40, 29-34.

80. Myhre E.B., Kronvall E.B. Demonstration of specific binding sites for human albumin in group C and G streptococci. Infect.Immun., 1980, 27, 6-14.

81. Myhre E.B., Kronvall G. Immunoglobulin binding to group A, C and G streptococci. In Parker M. (ed.), Pathogenic streptococci. Reedbooks Ltd., Surrey, 1979, 76-78.

82. Myhre F. B , Kronvall G. Immunoglobulin specificities of defined types of streptococci Ig receptors. In: Basic concepts of streptococci and streptococcal diseases. S.Holm and P. Christensen (eds.), Reedbooks., Ltd., Surrey, 1981, 209-210.

83. Myhre E.B. Nonimmune binding of immunoglobulin G to Gram-positive cocci. Description of different types of immunoglobulin receptors with defined specificities for mammalian IgG subclasses. Thesis, Lund, 1981, 127.

84. Nohigard C, BjorklundA., Hammar H. Group G streptococcal infections on dermatológica! ward. Act Derm. Vnereol. Stockholm, 1992. 72, 172-176.

85. Nygren P.A., Eliasson M., Abrahmsen L., Uhlen M. Analysis and use of the serum albumin domains of streptococcal protein G. J. ofMolec. Recognition, 1988, 1, 69-74.

86. Glsson A., Eliasson M., Guss B . Niisson B., Heliman U., Llndberg M., Uhlen Ivi. Structure and evolution on the repetitive gene encoding streptococcal protein G. J.Eur. Chem., 1987, 168, 319-324.

87. OTooie P., Stenberg L., Rissler M., Lindahl G. Two major classes in the M protein family in group A streptococci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Microbiology, 1992, 89, 8, 86618665.

88. Otten Roland A., Boyle Michael D.P. Characterization of protein G expressed by human group C and G streptococci., 1991, J. Microbiol. Method, 185 200.

89. Pack T.D., Podbielski A., Boyle M.D.P. Identification of an amino acid signature sequence predictive of protein G inhibitable IgG3-binding activity in group A streptococcal IgG binding proteins. Gene, 1996, 24, 65-70.

90. Podbielski A. Three different types of organization of the VIR regulon in group A streptococci. Mol. Gen. Genet., 1993, 237, 287-300.

91. Podbielski A., Hawlitzkv I, Pack T.D., Fiosdorf A., Boyle M.D.P. Astreptococcai Enn protein potentially resulting from intergenomic recombination exibits atypical immunoglobulin binding characteristic. Mol. Microbiol., 1994, 12, 725-736.

92. Raeder R, Boyle M.D.P. Association between expression of immunoglobulin G binding proteins by group streptococci and virulence in a mouse skin infection model. Infect. Immun., 1993a, 63, 1378-1384.

93. Raeder R., Boyle M.u.P. Association of type immunoglobulin G-binding protein expression and survival of group A streptococci in human blood. Infect. Immun., 1993b, 61, 3696-3702.

94. Reid H.F.M., Bassed D.C.J., Poon-King T., Read S.F. Group G streptococci in healthy school children and patients with glomerulo nephritis in Trinidad. J.Hyg. Camb., 1985, 94, 61-68.

95. Reis K.J., Avoub E., Boyle M.D.P. Streptococcal! Fc receptors. 1.Isolation and partial characterization of the receptor from a group C streptococcus. J.Immunol., 1984, 132, 3091-3097.

96. Reis K.J., Boyle M.D.P., Ayoub E.M. Identification of distinct Fc receptor molecules on streptococci and staphylococci. J.Clin. Lab. Immunol., 1983, 13, 75-80.

97. Reis K.J., Salpeter J., Boyle M.D.P. Type IV bacterial immunoglobulin binding proteins. In Boyle M.D.P. (ed ), Bacterial immunoglobulin binding protein. Academic Press. Inc., San Diego. Calif,1990, 1, 149-154.

98. Reis K.J., von Mering G.O., Karis M.A., Faulmann EX., Lottenberg R., Boyle M.D.P. Enzyme-labeled type III bacterial Fc receptors- a versatile tracer for immunoassay. J.Immunol. Methods, 1988, 107, 273-280.

99. Sanger F,. Coulson A.R., Barell B.G., Smith A.S.N., Roe B.A. Cloning in single-standed bacteriophage as an aid to rapid D.NA sequencing. J.Mol. Biol., 1980, 143, 161178.

100. Sauer-Erikson A.E., Klevwegt G.J., UhlenM., Jones T.A. Crystal structure of C2 fragment of streptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG. Structure,1995, 3, 265-278.

101. Schalen C., Christensen P., Grubb A.M., Samuelsson G., Svensson M.L. Demonstration of separate regions for human IgA and IgG in group A streptococci type 4. Acta Path. Microbiol. Scand. Sect C, 1980, 88, 77-82.

102. Simpson W.J., Robbinson J.C., Cleary P.P. Evidence for group A related M protein genes in human but not animal-associated group G spreptococcal pathogens. Microbiol, Pathog., 1987, 3. 339-350.

103. Simpson W.A., Musser J.M., Cleary P.P. Evidence consistent with gorizontal transfer of the gene (emml2) encoding serotype Ml2 protein between group A and group G pathogenic streptococci. Infect. Immun., 1992, 6u, 1890-1893.

104. Sjobring U., Bjorck L., Kastern W. Proteins G genes: structure and distribution of IgG-binding and albumin-binding domains. Mol. Microbiol., 1989, 3, 319-327.

105. Sjobring u'., Falkenberg C., Nielsen E., Akerstrom B., Bjorck L. Isolation and characterization of a 14-kDa albumin-binding fragment of streptococcal protein G. j.Immun., 1988, 140, 1595-1599.

106. Sjobring U., Trojnar J., Grubb A., Akerstrom B., Bjorck L. Ig-binding bacterial proteins also bind proteinase inhibitors. J. Immunol., 1989, 143, 2948-2954.

107. Talav S.R., Grammel M.P., Chatwal G.S., Structure of a group C streptococcal protein that binds to fibrinogen, albumin and immunoglobulin G via overlapping modules., 1996, 315 (2), 577 582.127

108. Tennikov M, Gazdina N, Tennikova T., Svec F, Effect of porous structure of macro-porous polymer supports on resolution in high perfomance membrane chromatography of proteins. Journal of Chromatography A. 1998, 55 -64.

109. Vasi J, Svensson J, Frick i-M., Muiler H-P, Five homologous repeats of protein G-reiated protein MIG cooperate in binding to goat Immunoglobulin G, 1999, Infection and immunity, 67 (1), 413 416.

110. Wideback K, Kronvall G. Surface receptors for serum albumin in group C and G streptococci show three different types of albumin specificity, infect. Immun, 1982, 38, 1154-1163.

111. Wideback K, Kronvall G. Isolation of a specific albumin receptor from a group G streptococcal strain. Acta Pathol. Microbiol. Immonol. Scand. Sect.B, 1987, 95, 203-210.

112. Wideback K, Seal U, Kronvall G. Receptor in group C and G streptococci detects albumin structures present in mammalian species. Infect. Infect, 1982, 36, 469-475,

113. Winkelhake J. Immunoglobulin structure and effector functions, fmmunochemistry, 1978, 15, 695-714.1281. БЛАГОДАРНОСТИ

114. Выражаю глубокую и искреннюю благодарность руководителю отдела молекулярной микробиологии Тотоляну Артему Акоповичу за организацию исследований и руководство работой, а также за моральную поддержку.

115. Благодарю всех сотрудников отдела, моих друзей и коллег за внимательное и доброжелательное отношение.

116. Особую благодарность мне хочется выразить моим родителям за возможность приобщиться к прекрасному миру науки.

Информация о работе

Волчек, Наталья Александровна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.07

Диссертация

Изучение G белка в клинических изолятах стрептококков групп C и G и его использование в биотехнологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы