Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурный анализ гена С5а пептидазы стерептококков группы В

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структурный анализ гена С5а пептидазы стерептококков группы В"

г>~й од

■¡т

На правах рукописи Шмурыгина И лона Игоревна

СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНА С5а ПЕПТИДАЗЫ СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.00.07 - Микробиология

На правах рукописи

Шмурыгина Илона Игоревна

СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНА С5а ПЕПТИДАЗЫ СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.00.07 - Микробиология

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор А. А. Тотолян

кандидат медицинских наук А. Н. Суворов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор В. С. Гайцхоки

доктор медицинских наук, профессор К. О. Грандстрем

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Защита диссертации состоится «/Д » цЦиОи^01996 года в /_3 часов на заседании диссертащ/онного совета Д 001.23.02 по присуждению ученой степени доктора наук при НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. И. П. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института

Автореферат разослан «_»_1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук

Л. А. Бурова

ВВЕДЕНИЕ

В последние десятилетия работами ведущих микробиологических лабогаторий мира со всей очевидностью продемонстрировало значительное распространение стрептококков группы В (СГВ) среди людей. Около четвертой части населения планеты инфицировано данным микробом независимо от возрастных категорий (Baker С., Barretti F. 1983, Easmon С. 1983, Jelinkova J. 1977). Наиболее остро стоит вопрос о роли стрептококков группы В в патологии беременности и новорожденных. СГВ относятся к наиболее распространеным возбудителям данной патологии. Особую опастность, в качестве источника инфекции, представляют матери-носители. Заражение ребенка происходит либо внутриутробно, либо при прохождении через родовые пути. У детей заболевание протекает в форме менингита и сепсиса и в 20-50% случаев заканчивается летально (Klein J. 1984, Concia Е. et.al 1984, Ferrieri P. 1985).

Борьба с данной патологией, по существу, является борьбой за здоровое материнство и детство. Следовательно, изучение биологии и патогенетических свойств стрептококков группы В актуально не только с научной, но экономической и социальной точек зрения.

Хорошо известно, что вирулентность стрептококков группы В коррелирует с их способностью продуцировать типоспецифиче-скую полисахаридную капсулу (Durham D. 1981). Однако, наряду с полисахаридами СГВ продуцируют на поверхность большую группу веществ белкового происхождения, таких как нук-леазы, протеазы, CAMP фактор, IgA рецепторы и т.п., роль которых в формировании вирулентности изучена недостаточно.

В последнее время среди потенциальных факторов вирулентности стрептококков групп А и В внимание исследователей привлекает белковый агент, вызывающий подавление хемотаксиса полиморфоядерных лейкоцитов (ПМЯл) и макрофагов в очаг инфекции - С5а пептидаза (SCP). С5а пептидаза обладает способностью специфически расщеплять С5а фракцию комплемента, являющуюся главным хемоаттрактантом для макрофагов и поли-морфноядерных лейкоцитов. Это дает стрептококкам возможность избежать фагоцитоза, и, в конечном итоге, способствует их выживанию в макроорганизме, в первую очередь в воротах инфекции.

Несмотря на очевидную медицинскую актуальность патологий, вызываемых стрептококками группы В, генетика этих микроорганизмов практически неисследована. Имеются лишь фрагментарные данные о нескольких генах, кодирующих факторы вирулентности СГВ. В настоящее время в современной научной литературе практически отсутствует информация о гене, кодирующем синтез С5а пептидазы стрептококков группы В. Известно лишь об ограниченной гомологии между пептидазными генами стрептококков групп А и В. Выше сказанным определяется актуальность данного исследования.

Целью настоящего исследования является анализ структуры и функции гена G5a пептидазы стрептококков группы В, для чего планировалось выполнить следующие задачи:

1. Проанализировать широту распространения гена С5а пептидазы среди штаммов стрептококков группы В разных серотипов.

2. Выяснить нуклеотидную последовательность гена С5а пептидазы стрептококков группы В.

3. Осуществить анализ нуклеотидной последовательности scpB гена.

4. Проклонировать ген в гетерологичной системе E.coli с использованием экспрессионного плазмидного вектора.

5. Выделить рекомбинантный белок С5а пептидазы.

6. Проанализировать свойства С5а пептидазы стрептококков группы В биохимическми и иммунологическими методами.

7. Сконструировать изогенные мутанты стрептококков группы В с нарушенной экспрессией гена SCP.

Научная новизна работы состоит в том, что:

1. Впервые показано, что ген С5а пептидазы представлен в хромосомной ДНК всех проанлизированных штаммов стрептококков группы В.

2. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена С5а пептидазы стрептококков группы В.

3. Впервые проклонирован полноразмерный ген С5а пептидазы СГВ в гетерологичной системе E.coli с использованием экспрессионного вектора pGEX.

4. Впервые получен и проанализирован рекомбинантный белок С5а пептидазы стрептококков группы В.

5. Впервые сконструированы инсерционные мутанты стрептококков группы В с нарушенной экспрессией гена С5а пептида-

зы, что позволит в дальнейшем использовать их для получения приоритетных данных о вкладе БСРВ (С5а пептидазы стрептококков группы В) в формирование вирулентного фенотипа СГВ.

6. Впервые показано, что С5а пептидазы стрептококков групп А и В обладают антигенным сходством.

7. Впервые было показано, что гены БСР у стрептококков групп А и В высоко гомологичны.

Теоретическая ценность.

Данная работа носит теоретический характер. Показано, что ген С5а пептидазы высоко консервативен по структуре в пределах вида, что может указывать на важность С5а пептидазы для выживания и стрептококков группы В в организме-хозяине и колонизации инфицированных тканей. В ходе работы было выявлено, что ген С5а пептидазы стрептококков группы В имеет 98% гомологии с соответствующим геном стрептококков группы А се-ротипа М12 и 95% - М49, что может указывать на эволюционную связь стрептококков группы А и В или на возможность генетического обмена между стрептококками разных видов.

Практическая ценность.

Проведенные исследования могут быть использованы для создания штамма-продуцента С5а пептидазы, имеющего биотехнологическое значение. С5а пептидаза как белок, имеющийся у всех штаммов стрептококков группы В, может быть основой для коплексных полисахаридно-белковых вакцин. Не исключено, что БСР может использоваться для лечения некоторых аутоимунных заболеваний и в хирургической практике, но этот вопрос нуждается в доработке.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ген С5а пептидазы стрептококков группы В присутствует во всех клинических штаммах стрептококков этой группы, что указывает на биологическую значимость белка, кодируемого этим геном.

2. Ген С5а пептидазы стрептококков группы В гомологичен гену С5а пептидазы стрептококков группы А, что указывает на общность происхождения этих генов.

3. С5а пептидаза стрептококков группы В по своим биохимическим и иммунологическим характеристикам аналогична ранее изученным С5а пептидазам стрептококков группы А.

Достоверность полученных результатов подтверждается следующим:

1. Высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов исследования (полимеразная цепная реакция, секвенирование, ДНК-ДНК гибридизация, иммуноблотинг и т.д), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные.

2. Применением наиболее современных способов компьютерного анализа данных секвенирования ДНК с привлечением таких банков данных как GENBANK, ЕМВО и т.д.

Апробация работы.

Материалы диссертации опубликованы в 4 научных трудах, доложены на четырех симпозиумах и конференциях: «Новые направления биотехнологии» в 1992 г., «XII международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям им. Ленсфильд» в 1993 г., «Биотехнология Санкт-Петербург-94» 1994 г., «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» 1995 г. Материалы работы докладывались на заседании отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1994, 1995 гг.) и на конференции отдела микробиологии Университета Миннесоты (США) (1995 г.).

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 142 страницах машинописного текста, включающего: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, 6 глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы. Работа проиллюстрирована б таблицами и 26 рисунками. Указатель литературы содержит 156 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали 29 штаммов стрептококков группы В различных серотипов, штамм стрептококка группы А серотипа М12 , штамм золотистого стафилококка, штаммы E.coli: Q358, Q359, LE 392, DH5a, ER 1821. Для создания библиотеки генов применяли фаговый вектор X L 47.1.

Стрептококки культивировали на среде ТНВ (Todd-Hewitt-Broth, Difco, USA). В зависимости от штамма и задач исследования в среду добавляли лошадиную сыворотку (10%), эритромицин (5 мкг/мл), 10% крови барана при изготовлении плотных агаризованных сред. Клетки E.coli выращивали в LB бульоне. При выращивании E.coli, несущих плазмиды с маркерами атни-биотикоустойчивости, в среду добавляли ампицилин (50100 мкг/мл) или эритромицин (300 мкг/мл).

Для идентификации стрептококков группы В, выделенных от больных и носителей использовали CAMP тест; определение серотиповой принадлежности штамма производили в тесте двойной иммунодиффузии между поверхностными антигенами стрептококка и груипо- и типо- специфическими сыворотками.

Выделение хромосомной ДНК. Клетки лизировали добавлением лизоцима 1 мг/мл, EDTA до 10 mM, SDS до 1%. Депро-теинизацию ДНК осуществляли с помощью протеиназы К (0.5 мг/мл). ДНК обрабатывали фенолом и хлороформом, а затем экстрагировали этанолом. Выделение плазмидной ДНК проводили по Birboim (1979). Выделение фаговой проводили по Маниатис Т. с соавт. (1982) с последующей очисткой в градиенте цезия.

Электрофорез ДНК проводили с использованием 0.8-2% агарозного геля, в горизонтальном пластинчатом аппарате с использованием Трис-боратного или Трис-ацетата ого буфера.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по Kawasaki Е. (1990). К 0.1-0.5 мкг хромосомной или плазмидной ДНК добавляли 5-10 пикомолей каждого из специфических праймеров, фланкирующих исследуемую нуклеотидную последовательность, буфер для полимеразы, по 0.2 мМ каждого из де-зоксирибонуклеотидтрифосфатов, объем смеси доводили водой до 50-100 мкл. Смесь кипятили на водяной бане 2-5 минут. Добавляли 0.5-2 ед. термостабил'ьной ДНК полимеразы (Tth или Taq). Температура денатурации 94 °С - 1 минута, температура отжига 48~65 °С - 1 минута, температура синтеза 72 °С - 1-4 минуты. Последовательность циклов повторялась 30 раз.

Гибридизацию ДНК проводили по Southern Е. (1975). ДНК зонд метили дигоксигенином. Участки ДНК-ДНК гибридизации выявляли при помощи щелочной фосфатазы в присутствии субстрата Х-фосфата и красителя NBT. Для всех гибридизационных процедур использовали набор Genius™ (Boehringer Mannhein, Germany).

Нуклеотидная последовательность scpB была определена с помощью ферментативного метода, описанного Sanger F. et.al. (1977). Во всех реакциях использовали набор Sequenase Version 2.0 (USB, USA). Для секвенирования биотинилирован-ных продуктов ПЦР использовали так называемое твердофазное секвенирование (Hultman T. et.al. 1989). Особенностью этого метода является применение магнитных частиц меченых стрепта-видином Dynabeads М280 Streptavidin (Dynalas, Norway) для разделения цепей ДНК.

Трансформацию клеток стрептококка группы В плазмидной ДНК проводили методом электропорации по Suvorov А. N. et.al. (1988). Трансформацию E.coli так же поводили электропораци-ей. Предварительно клетки обрабатывали охлажденным 10% глицерином и осаждали центрифугированием до концентрации Ю10 клеток/мл. Для создания электрошока использовали прибор Gene Pulser (Bio-Rad, USA).

Выделение белка С5а пептидазы с поверхности СГВ проводили с помощью мутанолизина. Рекомбинантный белок (С5а пептидазу) очищали хроматографически.

Электрофорез белков в SDS-полиакриламидном геле проводили по Laemmli U. К. (1970). Перенос белков на нитроцеллю-лозную мембрану проводили по Towbin H. (1979). Иммуноблот перенесенных белков осуществляли с анти SCPA сывороткой против рекомбинантного белка из стрептококка М12 серотипа.

Создание геномной библиотеки штамма 78-471 СГВ осуществляли в фаговом векторе X L. 47.1. Геномную ДНК СГВ рестри-цировали эндонуклеазой Sau ЗА в условиях неполного гидролиза, после чего рестрицированные фрагменты лигировали с ДНК вектора, рестрицированной эндонуклеазой Bam HI. Селекцию рекомбинантных клонов осуществляли на культуре Q359.

Биологическую активность рекомбинатного белка SCPB определяли в тесте на подавление хемотаксиса клеток крови в ответ на стимуляцию зимосан активированной сывороткой, по протоколу описанному Metealf J A et.al. (1985).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ штаммов стрептококка группы В на присутствия гена С5а пептидазы в их хромосомной ДНК. Для выяснения

широты распространения гена С5а пептидазы среди стрептококков группы В, была подобрана коллекция из 29 штаммов, относящихся к основным серотипам I, II, III, IV, V и нетипируемым по полисахаридной капсуле. Часть штаммов была предоставлена нам из коллекции С. Rubens (Seatle, USA), P. Ferrieri (Minneapolis, USA). Основу коллекции составили штаммы К. Б. Грабовской (Санкт-Петербург, Россия) и штаммы, выделенные от больных и носителей в процессе работы. Идентификация штаммов была основана на комплексе морфологических и серологических признаков (характере роста на поверхности плотных питательных сред, морфологии окрашенных по Граму клеток, экспрессии группоспецифического белка CAMP, реакции с сыворотками против типо- и группо- специфических антигенов).

Все штаммы СГВ, вошедшие в коллекцию, анализировали на присутствие в их хромосомной ДНК гена С5а пептидазы. Для выявления гена sep использовали два подхода: полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и ДНК-ДНК гибридизацию. Основываясь на предположении, что гены, кодирующие С5а пептидазу в стрептококках групп А и В имеют гомологию, были синтезированы две пары нуклеотидных праймеров, гомологичных последовательности гена scpA (Chen С. and Cleary P. P., 1990). Первая пара праймеров № 1 и № 2 ограничивает последовательность в 1.2 т.н.п., кодирующую потенциальный каталитический центр фермента С5а пептидазы. Вторая пара праймеров (№ 3 и № 4) позволяла амплифицировать фрагмент sep в 2.1 т.н.п., прилегающий к 3' концу гена. Предположение о гомологии генов scpB (ген С5а пептидазы из стрептококков группы В) и scpA (ген С5а пептидазы из стрептококков группы А) подтвердилось в ходе ПЦР, с праймерами, описанными выше. Хромосомная ДНК всех 29 проанализированных штаммов СГВ, проанализированная в ПЦР, давала амплифицирующиеся фрагменты, ожидаемого размера, равного соответствующим размерам scpA. Исключение составил штамм СГВ № 83/3498 нетипируемого серотипа. ПЦР продукты, на матрице хромосомы этого штамма, при использовании праймеров на scpA, были короче примерно на 100 н.п., чем у всех других штаммов СГВ и контрольного штамма СГА серотипа M12. Рестрикция амплификатов этого штамма разными эндонуклеазами и последующий гибридизационный анализ позволили локализовать эту делецию примерно на участке от 1807 н.п. до 2388 н.п., относительно известной нуклеотидной последо-

вательности гена scpA. Данные гибридизационного анализа подтвердили данные полимеразной цепной реакции о существовании гомологии между генам scpA и scpB. В качестве ДНК зондов использовали описанные выше продукты ПЦР. Гибридизационный анализ позволил, кроме того, подтвердить наличие или отсутствие некоторых рестрикционных сайтов в хромосомной ДНК СГВ в локусе гена scpB по сравнению с геном scpA. При рестрикции хромосомной ДНК СГВ рестриктазой EcoRI, был обнаружен только один фрагмент около 9 т.нл1., гибридизовавшийся с зондом на центральную часть гена. Эти данные позволили предположить, что ген С5а пептидазы представлен единственной копией в хромосоме СГВ.

2. Клонирование гена С5а пептидазы СГВ в векторе X L 47.1. В ходе работы была предпринята попытка проклониро-вать ген С5а пептидазы стрептококков группы в лямбдоидном векторе. Для этого была создана представительная библиотека генов хромосомной ДНК штамма 78-471, серотип П/с, в векторе X L 47.1. Хромосомную ДНК стрептококка рестрицировали в условиях неполного гидролиза эндонуклеазой Sau3A, а ДНК вектора рестрицировали BamHI. После лигирования фрагментов ДНК упаковывали в головку фага X и высевали на газон культуры E.coli Q 359. Было получено приблизительно 1800 независимых фаговых клона, содержащих вставку ДНК штамма 78-471. После проведения гибридизации in situ фаговых бляшек с зондом на центральную часть гена scpB, были отобраны три фаговых клона, дающие устойчивый гибридизационный сигнал. Рест-рикционный анализ ДНК вставок в отобранных клонах показал, что они содержат сайты узнавания для эндонуклеаз Xba I, Hind III, Kpn I, Pvu II, характерные для структурной части гена scpA. Эти данные позволили предположить, что нам удалось проклонировать полноразмерный ген С5а пептидазы стрептококков группы В. Данные по клонированию scpB в фаговом векторе явились дополнительным подтверждением генетического родства С5а пептидаз стрептококков групп А и В.

К сожалению, использовать рекомбинантные фаговые клоны для дальнейшего субклонирования и анализа нуклеотидной последовательности не удалось из-за нестабильности вставки в векторе X L 47.1. Поэтому, для проведения исследований по анализу нуклеотидной последовательности scpB и экспрессии гена в гете-

рологичной системе, было предпринято клонирование ПЦР продукта, содержащего ген scpB.

3. Определение полной нуклеотидной последовательности гена scpB и анализ полученных результатов. Нуклеотидная последовательность гена scpB была определена с помощью ферментативного метода, описанного Sanger et.al. (1977). Структурная часть гена была секвенировна с использованием так называемого твердофазного секвенирования. Этот подход связан с использованием магнитных частиц, меченых стрентавидином для получения однонитевой матрицы из ПЦР продукта, одна из цепей, которого связана с биотипом. Метод твердофазного секвенирования позволял определять до 450 нуклеотидных пар за реакцию. Для секвенирования структурной части гена использовали 16 нуклеотидных праймеров, созданных на основе нуклеотидной последовательности гена scpA (Chen С. and Cleary P., 1990) и гомологичных разным участкам гена. Два из этих праймеров были связаны с биотином. Используя в ПЦР, на матрице хромосомной ДНК СГВ, один биотинилированный, а другой небиотинилиро-ванный праймеры, амплифицировали участк гена scpB, в количестве достаточном для получения однонитевой матрицы для секвенирования. Наличие 16 праймеров позволило секвенировать всю структурную часть гена. Каждый нуклеотид был выверен как минимум в трех независимых реакциях и 50% в двух ориен-тациях. По непонятным причинам секвенирование области хромосомы, прилегающей к 5' концу гена scpB оказалось затруднительным. Для подробного изучения этой области, методом ПЦР был получен фрагмент scpB в 0.6 т.н.п., содержащий 0.3 т.н.п структурной части гена и 0.3 т.н.п. регуляторной области. Этот фрагмент был впоследствии проклонирован в плазмидном векторе pUC 18, а затем секвенирован. Последовательность вставки была секвенирована на 100% в двух направлениях, каждый нуклеотид был выверен, по меньшей мере, в четырех независимых реакциях.

Общее количество определенных нуклеотидных пар scpB составило 3813. Анализ, проведенный с помощью программы PC GENE, регуляторной области scpB позволил выявить две области связывания рибосомы (RBS) и три потенциальных промотора (PI, Р2 и РЗ). Точки начала транскрипции промоторов Р2 и РЗ (+1Р2 и +1РЗ) расположены на расстоянии 28 н.п. и 17 н.п. со-отвертственно до старт кодона scpB, а +1Р1 находится за

217 н.п. до старт кодона БсрВ. Непосредственно перед промотором Р1 находится последовательность, потенциально узнаваемая в стрептококках группы А, регуляторным белком У1г II. Первая область связывания рибосомы - АТЭАОА (ИВБО находится на расстоянии ИЗ н.п. от начала определенной нами нуклеотидной последовательности. На расстоянии 14 н.п. от ЯВ81 расположен старт код он АТО, открывающий короткую (96 н.п.) открытую рамку считывания, заканчивающуюся стоп кодоном ТАА. Вторая последовательность АввАСв (КВ82) находится через 299 н.п. от первого определенного нами нуклеотида БсрВ. Сразу за ИВ82 обнаружен старт кодон, открывающий большую рамку (3450 н.п.) считывания основного белка БСРВ. В ходе анализа регуляторной последовательности удалось выявить два инвертированных повтора. Первый - в области ЫВ81 и второй в области стоп кодона короткой рамки считывания. Второй повтор включает в себя так же промотор Р2 и -35 последовательность промотора РЗ. Расположение описанных выше последовательностей показано на рис. 1.

Р1 ВЬв1

ра'.. ЕЙ шЩ

всрВ

Делеция

шшки

Промоторная область

С повторы

мРНК1 МРНК2

Транскрипция

мРНКЗ --

__________Трансляция

Короткий пептид

С5а пептидаза

Рис. 1. Схема строения гена С5а пептидазы стрептококков группы В. - область присоединения рибосомы. Р - Промоторные области. К - Инвертированные повторы.

Нуклеотидная последовательность гена С5а пептидазы стрептококков группы В на 98% гомологична последовательности подобного гена стрептококков группы А серотипа М12 и на 95% серотипа М49. Общее количество отличающихся нуклеотидных пар в scpB по сравнению с scpA М12 - 112. Главное отличие между этими генами заключается в наличии делении размером в 51 н.п. в 3' конце scpB. Делеция приходится на область так называемых «С» повторов. У СГА их четыре, а у СГВ - три. Нуклеотидная последовательность, кодирующая потенциальные каталитические центры SCPA и SCPB практически идентична. Кроме пептидазных белков СГА, анализируемая последовательность оказалась гомологична последовательностям сериновых протеаз различных микроорганизмов, причем обнаруживаются все три каталитические сайты, характерные для протеаз этого типа. По данным компьютерного анализа, белок, кодируемый геном scpB, имеет лидерную последовательность в 31 а.а., гидрофильный фрагмент связывания с клеточной стенкой (кодируемый выше упомянутыми «С» повторами) и крайне гиброфобный трансмембранный участок, что характерно для поверхностных белков грамположительных бактерий.

4. Получение рекомбинантного белка С5а пептидазы стрептококков группы В и сравнение его иммунологически с подобными белками из стрептококков грппы А.

В работах Bohnsack J. F. с соавт. (1991, 1992 г.) было постулировано, что С5а пептидаза СГВ отличается по своим антигенным свойствам от аналогичных протеаз стрептококков группы А. Нам удалось установить ошибочность данного вывода. В прямых экспериментах по иммуноблотингу с сывороткой против рекомбинантного SCPA белка из штамма СГА М12 серотипа было показано, что рекомбинантный белок С5а пептидазы из стрептококков группы В, белок, выделенный с поверхности СГВ по методу, описанному Bohnsack (1991), и рекомбинантный белок из штамма СГА серотипа М12 (в качестве контроля), одинаково реагировали с сывороткой и имели в SDS электрофорезе в поли-акриламидном геле одинаковую подвижность (Мг всех белков около 120 kDa). Вероятной причиной ошибки американских авторов явился факт использования ими поликлональной сыворотки против SCPA M 49 серотипа. С5а пептидаза из стрептококка группы А серотипа М49 отличается как от SCPA M12, так и от SCPB. Рекомбинантный белок SCPB был получен следующим

образом. Продукт полимеразной цепной реакции, размером в 3.45 т.н.п., содержащий структурную часть гена scpB (от сайта посадки рибосомы до стоп кодона), был проклонирован в экс-прессионный плазмидный вектор pGEX. В результате под инду-цибельным tac промотором оказался слитый ген С5а пептидазы стрептококков группы В и ген глютатион - S - трансферазы. Методом электропорации эта плазмида была трансформирована в штамм E.coli DH5a. Индукция экспресии слитого гена осуществлялась с помощью изопропилтиогалактозидом. После вскрытия ультразвуком клеточный лизат, содержащий слитый белок из SCPB части и глютатион - S - трансферазы, наносили на колонку из сефарозы, связанной с глютатионом. Очищенный ре-комбинантный белок, так же, как белок, экстрагированный с клеточной поверхности СГВ, реагировали в иммуно-блоте с сывороткой против рекомбинантного белка из стрептококков группы А. Кроме способности взаимодействовать с антисыворотками против SCPA М12, рекомбинантный белок оказался функционально активным. В тесте по изучению миграции полиморфноя-дерных лейкоцитов в камере Бойдена препарат рекомбинантной SCPB вызывал полное подавление хемотаксиса при концентрации белка свыше 100 ng/ml и 50% подавление при концентрации 10 ng/ml.

5. Создание интегративных мутантов СГВ, с нарушенной экспрессией С5а пептидазы.

Для выяснения вклада С5а пептидазы в формирование вирулентного фенотипа СГВ, были сконструированы интегративные мутанты с нарушенной экспрессией этого белка. Мутанты были сконструированы следующим образом: центральный фрагмент гена scpB был проклонирован в гетерологичной системе E.coli, с использованием шатлл-вектора pG+host 5, а затем, методом электропорации, эту плазмиду трансформировали в СГВ. Клоны стрептококка, содержащие рекомбинантную плазмиду, выращивали при 30 °С- При этом происходила её независимая репликация. Повышением температуры до 39 °С инициировали встраивание плазмиды в хромосому за счет инактивации начала репликации плазмиды. В условиях постоянного селективного давления эритромицина выжили только те клоны, у которых произошла встройка плазмиды в хромосомную ДНК и уже в составе хромосомы продолжалась экспрессия гена, кодирующего признак эритромицинустойчивости. Наличие в плазмиде последовательно-

сти, гомологичной центральному фрагменту йсрВ, обусловило ее встраивание в хромосому с инактивацией БсрВ гена. Доказательство встраивания в локусе БсрВ было получено посредством по-лимеразной цепной реакции. Праймеры были подобраны так, что амплификация могла произойти только при наличии встройки. Один праймер был гомологичен плазмидной последовательности, а другой хромосомной последовательности БсрВ. В результате такого рода эксперимента были получены фрагменты ДНК ожидаемого размера. Подтверждением того, что генно-инженерные манипуляции действительно привели к нарушению экспрессии целостного белка С5а пептидазы, с поверхности мутаитных стрептококков были выделены белки с помощью мутанолизина. В качестве контроля использовали исходный стрептококковый штамм. После иммуно-блота с сывороткой против БСРА, у мутантного варианта не было обнаружено белкового фрагмента, реагировавшего с сывороткой. Таким образом, был получен стрептококковый клон, не экспрессируюгций С5а пептидазу. Используя в качестве контроля исходный штамм, планируется провести ряд экспериментов на животных, которые помогут ответить на вопрос о месте С5а пептидазы в ряду факторов вирулентности СГВ.

ВЫВОДЫ

1. Ген С5а пептидазы присутствует в хромосоме всех проанализированных штаммов стрептококков группы В. Все гены имеют сходную рестрикционную карту и размеры.

2. Нуклеотидная последовательность гена С5а пептидазы стрептококков группы В на 95-98% гомологична последовательности этого гена у стрептококков группы А.

3. Ген С5а пептидазы стрептококков группы В клонирован в экспрессионном векторе рвЕХ в гетерологичной системе Е.соН. Получен штамм-продуцент белка С5а пептидазы.

4. Получен хроматографически очищенный рекомбинантный белок С5а пептидазы стрептококков группы В, обладающий способностью подавлять хемотаксис фагоцитов.

5. Рекомбинантный белок С5а пептидазы стрептококков группы В обладает общими антигенными детерминантами с белком С5а пептидазы, выделенным непосредственно из стрептокок-

ка группы В, и рекомбинантным белком БСРА стрептококка группы А, серотипа М12, но не серотипа М49.

6. Получены интеграционные мутанты стрептококков группы В с нарушенной экспрессией гена С5а пептидазы, актуальные для более полного изучения роли С5а пептидазы в формировании вирулентного фенотипа микроба.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Суворов А. Н., Шмурыгина И. И., Клери П. П. Клонирование гена С5а пептидазстрептококков группы В // Тезисы докладов V конференции Российской федерации: Новые направления биотехнологии, 18-22 мая 1992 г., Пущино, с. 133.

2. Ilona I. Shmurigina, Patrick P. Cleary, Artem A. Totolian, Alexander N. Suvorov. Analysis of C5a peptidase genes in group В streptococci // In: abstracts of international conference «Biotechnology St.Petersburg-94», September 21-23, St.Petersburg, Russia, p. 87-88.

3. Ilona I. Shmurigina, Patrick P. Cleary and Alexander N. Suvorov. Analysis of C5a peptidase genes in group В streptococci // In: Pathogenic Streptococci: Present and Future (Ed. Totolian A.), Proceedings of the Xllth Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Disseases. St.Petersburg, (1994) Lancer Publication,Russia, p. 249-251.

4. И. И. Шмурыгина, A. H. Суворов, П. Клери, A. A. To-толян. Молекулярная характеристика гена C5a пептидазы стрептококков группы В // Материалы международного симпозиума, посвященного году Пастера: Идеи Пастера в борьбе с инфекциями., 6~10 июня 1995 г., Институт имени Пастера, Санкт-Петербург, Россия, с. 45.