Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внеклеточные пептидазы грибов, образующих биотические связи с насекомыми

ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Внеклеточные пептидазы грибов, образующих биотические связи с насекомыми"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

СЕМЕНОВА Татьяна Александровна

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПЕПТИДАЗЫ ГРИБОВ, ОБРАЗУЮЩИХ БИОТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ С НАСЕКОМЫМИ

03.02.12-микология 03.01,04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011

4857574

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета и в отделе функциональной биохимии биополимеров Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (ВИЗР)

Защита состоится 11 ноября 2011 года в 15 час. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 501.001.46 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, аудитория М-1, тел./ факс (495) 939-39-70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Отзывы (в двух экземплярах) просим направлять по адресу: 119991 Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ, Биологический факультет, Кафедра физиологии растений, ученому секретарю Диссертационного совета Д 501.001.46. Факс (495) 939-39-

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Дунаевский Яков Ефимович кандидат биологических наук, доцент Белякова Галина Алексеевна доктор химических наук, профессор Руденская Галина Николаевна кандидат биологических наук, с.н.с. Озерская Светлана Михайловна

Официальные оппоненты:

70.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гетеротрофный тип питания, характерный для грибов, определяет их способность к образованию биотических связей с представителями самых разных царств живых организмов (Encyclopedia of entomology, 2008). Экологические взаимоотношения грибов и насекомых включают как взаимовыигрышные системы, например, «грибные сады», в которых различные виды муравьев трибы Aliini выращивают гриб Leucoagaricus gongylophorus, так и эксплуатационные, как например, паразитизм энтомопатогенных грибов на насекомых-хозяевах. Многие виды грибов не образуют облигатных связей с насекомыми, однако используются насекомыми-микофагами в качестве пищевого субстрата и экологической ниши.

Гидролитические ферменты, секретируемые грибами, играют важную роль в поддержании указанных биотических связей. В мутуалистических системах гидролитические ферменты гриба расщепляют субстраты, недоступные для собственного ферментативного аппарата насекомых; в паразитических системах внеклеточные гидролазы грибов-энтомопатогенов контролируют процессы патогенеза. Особая роль как в расщеплении пищевых субстратов, так и в процессах патогенеза отмечается для внеклеточных пептидаз грибов (St. Leger, 1995).

Синтез и секреция пептидаз клетками гриба является энергоемким процессом, что обуславливает образование ферментов, максимально адаптированных к условиям обитания мицелия. Поэтому различия в спектре пептидаз, секретируемых мицелием, развивающимся в составе разнообразных систем с насекомыми, косвенно отражают экологические и метаболические особенности грибов. Несмотря на то, что из грибов выделено и охарактеризовано несколько тысяч пептидаз, исследований, посвященных поиску связей между различными экологическими и таксономическими группами грибов и спектром секретируемых ими пептидаз, ранее не проводилось.

Цель работы: провести сравнительное изучение физико-химических, биохимических и функциональных свойств внеклеточных пептидаз грибов, принадлежащих к различным таксономическим и трофическим группам. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение корреляций между спектром секретируемых пептидаз и таксономическим положением и типом питания у грибов г.

2. Изучение внеклеточных пептидаз грибного симбионта Leucoagaricus $оп&1оркоги$ в системе «грибного сада» по сравнению с близкородственным свободноживущим видом Agaricus Ыярогш. Определение адаптивных изменений в спектре внеклеточных пептидаз, вызванных переходом грибов к обитанию с насекомыми.

3. Проведение сравнительного анализа свойств наиболее представленных пептидаз грибов СоЫусерз тШшт, Agancus Ызрогт и Ьеисоа^апсив зопцуЬэркогш.

Научная новизна и практическая значимость. Определена способность мицелиальных грибов к росту на агаризованных средах, содержащих различные источники азота и углерода. Показано, что штаммы грибов-патогенов, в целом, обладают более широкими адаптивными возможностями, т.е. способны к росту на средах, содержащих белок как единственный источник азота и углерода.

Впервые показано распределение внеклеточной протеолитической активности мицелиальных грибов по каталитическим классам: выявлено, что наибольшее число видов аскомицетов секретирует сериновые пептидазы со щелочным рН-оптимумом, в то время как виды базидиомицетов преимущественно секретируют металлопротеиназы с оптимумом активности более близким к нейтральному. Выявлены определенные корреляции между экологическими особенностями (паразитическим или сапротрофным образом жизни) и субстрат-специфичной протеолитической активностью некоторых мицелиальных грибов. Показано, что трипсиноподобная активность может служить маркером патогенности, а относительная аминопептидазная - сапротрофности.

Впервые изучена класс-специфичная протеолитическая активность в мутуалистической системе грибов и насекомых - «грибном саду». Показано, что спектр внеклеточных пептидаз грибного симбионта зависит от степени эволюционной прогрессивности видов муравьев, поддерживающих «грибной сад». Впервые показано, что обитание совместно с муравьями приводит к изменению рН-оптимума активности пептидаз грибного симбионта от 6.0 до 5.2 (рН, поддерживаемый в «грибном саду»), В смывах мицелия из «грибного сада» обнаружены выраженные буферные свойства, которые могут являться одним из факторов, поддерживающих стабильность функционирования этой мутуалистической системы.

Выявлены и идентифицированы пептидазы, секретируемые энтомопатогенным грибом СоЫусерь тШшпз (сериновая, субтилизиноподобная) и грибом-сапротрофом Agaricus Ыхрогиз (металлопротеиназа). Получены высокоочищенные препараты исследуемых ферментов, определены их важнейшие физико-химические и биохимические свойства.

Полученные данные могут найти практическое применение в разработке новых методов биологической борьбы с насекомыми-вредителями сельского хозяйства, для диагностики патогенных микроорганизмов, изучения механизмов патогенеза энтомопатогенных грибов и регуляции продукции внеклеточных пептидаз грибами на уровне синтеза и секреции.

Апробация работы. Основные положения изложены на I (XI) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006 г.), VI Международном симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 2007 г.), Международной конференции «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2007), II Съезде Микологов России (Москва, 2008), Nordic Network for Social Evolution (Финляндия, Oulu, 2008), I (IX) Международной конференции молодых ученых «Ломоносов» (2010), а также заседаниях кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов, методов и результатов работы, выводов. Диссертация изложена на -границах, содержит ^-^иллюстраций

(рисунки, таблицы). Список литературы включает ^^¿источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

В обзоре литературы приведены сведения по систематике, экологии и биологии грибов, образующих биотические связи с насекомыми, представлены данные о роли внеклеточных пептидаз в поддержании систем насекомых и грибов, приведена классификация протеолитических ферментов, а также данные о практическом применении внеклеточных пептидаз микроорганизмов.

Глава 2. Материалы и методы исследований

Объекты исследования. Основными объектами исследования служили виды грибов, образующих биотические связи с насекомыми: энтомопатогенный гриб Cordyceps militaris (L.) Link, Leucoagaricus gongylophorus (Möller) R. Heim - гриб, выращиваемый муравьями трибы Attini в системе «грибного сада», а также Agaricus bisporus (J.E. Lange)

Imbach - не образующий облигатных биотических связей, но являющийся потенциальным пищевым субстратом для насекомых.

Для интерпретации полученных результатов были также использованы виды аско-и базидиомицетных грибов - патогенов насекомых и растений, а также сапротрофов, служащих пищевым субстратом для насекомых - Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill, Fusarium graminearum Schwabe, Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin, Humicota grísea Traaen, Paecilomyces carneus (Duché & Heim) A.H.S.Br. & G.Sm., Pénicillium nalgiovense Laxa, Pénicillium vulpinum (Cooke & Massee) Seifert & Samson, Trichurus spiralis Hasselbr, Trichoderma saturnisporum Hammiii, Coprinus comatus (O.F.Müll.) Pers., Marasmius oreades (Bolton) Fr., Pholiota aurivella (Batsch) P. Kumm. и Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm.

Культивирование проводили на агаризованных и жидких средах, содержащих различные источники азота и углерода с целью определения способности грибов к росту на указанных средах, а также повышения выхода исследуемых внеклеточных пептидаз.

Протеолитические ферменты L. gongylophorus изучали в водных вытяжках мицелия, взятого непосредственно из 28 используемых в работе «грибных садов», выращиваемых муравьями, относящимися к различным родам и видам трибы Attini.

Определение протеолитической активности проводили как по белковым (азоказеин, желатина), так и синтетическим п-нитроанилидным субстратам (Erlanger at al., 1961). Класс-специфичную активность определяли с использованием ингибиторов, специфичных для различных классов пептидаз: EDTA для металлопротеиназ, PMSF, TLCK, ТРСК для сериновых пептидаз, Е-64 для цистеиновых пептидаз и пепстатин для аспартильных пептидаз. Для определения субстрат-специфичной активности использовали синтетические п-нитроанилидные субстраты, специфичные для определенных групп внеклеточных пептидаз - Glp-AAL-pNa, Suc-AAPF-pNa, Bz-R-pNa, Glp-AAQ-pNa, L-pNa, Y-pNa, R-pNa. Оптимум активности в зависимости от pH определяли в 0.5М универсальном буфере для диапазона pH 3.0 - 9.0.

Определение буферных свойств водных вытяжек из «грибных садов» проводили по стандартной методике. Буферную емкость определяли на рН-метре как объем раствора (мкл) IM NaOH, который необходимо было добавить к 1 мл экстракта для изменения значения его pH на единицу.

Построение филогенетического древа проводили на основе анализа последовательностей генов LSU рРНК и фактора элонгации 1 а. Выделение ДНК проводилось стандартным методом с использованием хелатирующего агента Chelex (Walsh et al., 1991). Для амплификации участка LSU рРНК длиной около 920 пар нуклеотидов были использованы праймеры LR0R 5'-АСС CGC TGA ACT TAA GC-3' и 6

LR5 5'-TCC TGA GGG AAA CTT CG-3'. Для амплификации участка гена, кодирующего фактор элонгации 1 а протяженностью около 850 пар нуклеотидов, использовали праймеры EFla-F 5'-GTT GCT GTC AAC AAG ATG GAC ACT AC-3' (Mikheyev et al., 2006) и EFla-R5 5'-CAG GCA ATG TGG GCT GTG TGA CAA TC-3'. Полученные нуклеотидные последовательности представлены в базе данных GenBank под номерами HQ191224-HQ191277. Полученные последовательности выравнивали при помощи программы Clustal W (Thompson et al., 1994). Для полученных выровненных последовательностей строили филогенетическое древо методом максимального правдоподобия PhyML-aLRT (Guindon & Gascuel, 2003) с использованием GTR модели (Tavaré, 1986). Итоговые филогенетические деревья анализировали методом объединения соседних нуклеотидных пар (BIONJ) с использованием непараметрической Shimodaira-Hasegawa aLRT статистической модели.

Выделение и очистка ферментов С. militaris и A. bisporus проводилась на препаратах культуральной жидкости грибов, выращенных на среде Чапека, модифицированной соответственно добавлением желатины и казеина. Для очистки сериновой субтилизиноподобной пептидазы из С. militaris использовали методы аффинной хроматографии на бацитрацин-силохроме и гель-хроматографии на Superdex G75. Металлопротеиназу из A. bisporus очищали методом ионообменной хроматографии на DEAE Sephadex А-50 (batch-процедура) и на колонке Mono Q в режиме FPLC.

При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали средние значения и значение стандартного отклонения. Все эксперименты проводили не менее чем в трех повторностях. Достоверность полученных данных проверяли двухвыборочным t-тестом для выборок с различающимися дисперсиями.

Результаты и обсуждение

Глава 3. Определение корреляций между спектром секретируемых пептидаз и таксономическим положением или принадлежностью к определенным трофическим

группам у грибов

Методом ингибиторного анализа было установлено, что в препаратах культуральной жидкости исследованных мицелиальных грибов преимущественно содержатся пептидазы, относящиеся к двум классам - сериновых и металлопротеиназ. Анализ распределения активности между этими двумя классами (рис. 1) показал, что пептидазы, секретируемые грибами, преимущественно принадлежат к одному из классов,

80

50 40 30 20 10 0

В.Ьазз/апа . Н.дпзеа Р М.атюрНае

О Р.сатеив

О

Р.дгат/пеагит

Р.па!дюуепве

£

Т. 5э1игт$рогит р О Т.8р{гаИ$

О С.т/Ма/гё.

# Р. оз!геа{из

Р. уи1ршт О Могеаёе5

Р.аитеНа _•

ф 1.допду!орЬогиз А.Ызрогиз

40

60 70 80 90 100 Активность металлопротеиназ, %

Рис.1. Класс-специфичная активность внеклеточных пептидаз мицелиальных грибов Виды аскомицетов выделены желтым цветом, виды базидиомицетов - зеленым.

5 250

8" 200

ж

5 О 150

н

о. с 100

о

50

н

2 0

= ч

о. Ч

1000 800 600 400 -200 О

фМ. огеаёез

QP. уи1ртит

^.Ызрошз ос.тшалз

£с«(геа/и5 • Р-аигтИа

I С. сотаШв

8 9 10

рН оптимум металлопротеиназ

В.Ьазз/апэ

О М.алгёор//ае Т. 5а1ит1зрогит Т^р/гаНэ

00 О Р.дгат1пеагит

0 ^ Р.па1дюче юе С.тИПапв

-Р.о&геаШ V Рсагпеиз

5 6 7 8 9 10

рН оптимум еериновых пептидаз

Рис. 2. рН оптимумы наиболее представленных пептидаз исследованных мицелиальных грибов.

Виды аскомицетов выделены желтым цветом, виды базидиомицетов - зеленым. Красными линиями выделены интервалы значений рН-оптимумов пептидаз исследованных грибов.

при этом группу грибов с наиболее представленной активностью сериновых пептидаз составляли виды аскомицетов; виды базидиомицетов преимущественно секретировали металлопротеиназы. На основании полученных данных было сделано предположение о существовании корреляции между класс-специфичной активностью пептидаз и таксономическим положением грибов.

Сравнение оптимумов рН активности наиболее представленных пептидаз показало, что внеклеточные сериновые пептидазы грибов наиболее активны в диапазоне рН 7.6 -9.0, а металлопротеиназы - при рН 5.5 - 7.1 (рис. 2).

Изучение субстратной специфичности внеклеточных пептидаз выявило корреляции между секрецией некоторых групп ферментов и принадлежностью грибов к трофическим группам (табл. 1).

Таблица 1. Субстратная специфичность пептидаз исследуемых мицелиальных грибов

Экологическая группа Протеолитическая активность, рассчитанная на г. мицелия, ед.*102/ г

Субстраты, специфичные для эндопептидаз Субстраты, специфичные для экзопептидаз

Вг-Я-рЫа ар-ААЬ-р№ 01р-АА(3-р№ Ь-рЫа У-рКа

Патогены растений и насекомых 13 533 1426 61 99 84

Сапротрофы как ассоциированные, так и не связанные с насекомыми 0 143 333 41 146 28

Степень достоверности наблюдаемых различий в значениях активности 13=9.0 р = 2.6*10"3 112=4.6 р < 0.001 13=0.9 р = 0.42 14=0.78 р = 0.48 1,3=0.66 р = 0.52 14=1.98 р = 0.12

Примечание: для определения степени достоверности полученных результатов использовали двухвыборочный 1:-тест с различными дисперсиями. 1(Н-рассчитанное значение ^статистики для определенного числа степеней свободы (<И). Значение р определяет вероятность принадлежности всех полученных данных к одной выборке. Розовым и сиреневым цветами, соответствующими использованным на рис. 3, выделены значения активности трипсиноподобных ферментов и аминопептидаз. Синим цветом выделены значения активности, определенные по субстрату С1р-АА1_-рЫа, специфичному для субтилизиноподобных ферментов.

Активность по синтетическому субстрату Bz-R-pNa была отмечена у видов патогенных грибов и отсутствовала у сапротрофов, за исключением вида Т. saturnisporum. Субстрат Bz-R-pNa является специфичным для трипсиноподобных пептидаз, и, по-видимому, секреция пептидаз этого семейства может служить маркером патогенности. Анализ доступных геномов грибов показал, что 95% видов, в геномах которых были обнаружены последовательности, сходные с трипсином, оказались патогенами (Hu, Leger, 2004; Dubovenko et al., 2010).

Сравнение активности препаратов культуральной жидкости мицелиальных грибов по субстрату GLP-AAL-pNa, специфичному для эндопептидаз субтилизинового типа, показало, что эта активность присутствует у большинства исследованных грибов, хотя виды грибов-патогенов значительно интенсивнее секретировали пептидазы, активные по этому субстрату, чем виды сапротрофных грибов.

Вместе с тем, активность пептидаз по другим использованным субстратам, достоверно не различалась (табл.1), и, таким образом, относительная активность по субстратам L-pNa, Y-pNa и R-pNa, специфичным для аминопептидаз, у сапротрофов заметно превышала значение относительной активности этих ферментов, определенной у видов грибов-патогенов.

Величины относительной аминопептидазной и трипсиноподобной активности, определенные в препаратах культуральной жидкости исследованных мицелиальных грибов, представлены на рис. 3.

Как следует из приведенных данных, активность трипсиноподобных ферментов отрицательно коррелировала с величиной относительной активности аминопептидаз, при этом наличие этих активностей строго соответствовало типу питания грибов -патогенности и сапротрофности. Возможно, сравнительно высокая секреция экзопептидаз связана с сапротрофным образом жизни, так как, по-видимому, основную роль в расщеплении белков в почве играют бактерии (Watanabe, Hayano, 1994), эндопептидазы которых образуют короткие пептиды. Обитание в микробном сообществе позволяет грибам секретировать только экзопептидазы, расщепляющие свободные короткие пептиды, образованные эндопептидазами бактерий.

Активности пептидаз обеих групп регистрировались лишь в случае гриба Т. saturnisporum, что, по-видимому, объясняется мощными ферментными системами, известными для грибов этого рода.

н ¡t

О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 <

Вид гоиба*

□ относительная активность аминопептидаз

□ активность трипсиноподобных пептидаз

Рис. 3. Относительная аминопептидазная и трипсиноподобная активность пептидаз некоторых мицелиальных грибов

*1-А. bisporus, 2-В. bassiana, 3-С. comatus, 4-С. militaris, 5-F. graminearum, 6-Н. grísea, 7-М. oreades, 8-М. anisopliae, 9-Р. carneus, 10-Р. nalgiovense, 11-Р. vulpinum, 12-Р. aurivella, 13-Р. ostreatus, 14-Т. spiralis, 15-Т. saturnisporum.

Таким образом, были выявлены определенные корреляции между спектром внеклеточных пептидаз, с одной стороны, и таксономическим положением или принадлежностью к определенной трофической группе у грибов, с другой.

Глава 4. Изучение внутривидовой изменчивости протеолитической активности у грибов на примере системы «грибной сад»

«Грибные сады» представляют собой мутуалистическую систему муравьев, принадлежащих к разным родам и видам трибы Attini, и гриба L. gongylophorus. «Грибные сады», образованные разными видами муравьев, различаются как морфологически, так и по привносимому муравьями в «сад» субстрату, что должно оказывать влияние на спектр секретируемых грибом соединений.

Таким образом, на примере «грибных садов», выращиваемых различными видами муравьев, возможно оценить изменчивость в спектре внеклеточных пептидаз под влиянием различных условий обитания гриба.

Анализ класс-специфичной активности показал, что в исследуемых колониях муравьев, прежде всего, секретируются пептидазы двух классов - сериновые и металлопротеиназы (рис. 4). Грибы-симбионты «низших муравьев» обладали низкой общей активностью пептидаз, с преобладанием металлопротеиназной активности. Симбионты «высших муравьев» секретировали преимущественно сериновые пептидазы, и только для трех колоний была отмечена более высокая относительная активность металлопротеиназ.

350

300 250 200 150 100

©

©

© ~ © © ©

• Колонии низших

муравьев О Колонии высших

муравьев О Колонии муравьев-

листорезов О Agaricus Ыарогш

50

50 100 150 200 250 300 350

Активность металлопротеиназ, ед* 103

Рис. 4. Класс-специфичная активность пептидаз грибного симбионта в «грибных садах»

* номера соответствуют номерам колоний муравьев, приведенным на рис.6: точкам синего цвета соответствуют профили активности, определенные в колониях низших муравьев, точкам зеленого цвета - активности, определенные в колониях высших муравьев, точкам красного цвета - активности сериновых и металлопротеиназ, определенные для Ь. £оп£у1орЬогт из колоний муравьев-листорезов. Точке голубого цвета соответствует профиль активности, полученный для свободноживущего, филогенетически родственного Ь. gongylophorus гриба А. Ызрогия в погруженной культуре.

Грибы-симбионты муравьев-листорезов обладали наиболее высокой секреторной протеолитической активностью, с преобладанием металлопротеиназной активности. Таким образом, величина общей активности пептидаз грибных симбионтов коррелировала с уровнем эволюционной прогрессивности видов муравьев, выращивающих данный

грибной симбионт. При этом класс-специфичная активность (преобладание активности сериновых или металлопротеиназ) пептидаз грибного симбионта коррелировала с основными таксономическими группами муравьев, выращивающих L. gongylophorus.

В водных вытяжках мицелия грибного симбионта были обнаружены выраженные буферные свойства. Результаты экспериментов по определению буферной емкости образцов из «грибных садов» в сравнении с чистыми культурами L. gongylophorus и свободноживущих грибов приведены в табл 2.

Из приведенных данных следует, что значения буферной емкости, определенные в образцах из «грибных садов», значительно превышают значения, полученные для свободноживущих грибов или наблюдаемые в природных системах - почве (2.2 мэкв/Л) (Yong, 2001), и морской воде (2.4 мэкв/JI) (Mitchell & Rakestraw, 1993).

Таблица 2. Буферные свойства в системе «грибного сада»

Вид гриба (Семейство) Чистая культура/ колония «грибного сада» Буферная емкость, мэкв/JI

Свободноживущие грибы

Agaricus bisporus (Agaricaceae) Чистая культура 9.6±1.1

Pleurotus ostreatus (Pleurotaceae) Чистая культура 5.0±0.7

Pleurotus pulmonaríus (Pleurotaceae) Чистая культура 3.1±0.1

Lentinula edades (Marasmiaceae) Чистая культура 2.0±0.1

Грибной симбионт

Leucoagarícus gongylophorus (Agaricaceae) Чистая культура (из колонии Acech 322) 16.2±2.0

L. gongylophorus Myrmicocrypta ednaella (Myred2) 21.9±3.1

Mycocephurus smithii (Mycsmi32) 21.9±2.2

Trachymyrmex cornetzi (Trcorl) 20.6±0.7

Sericomyrmex amabilis (Serama7) 16.7±1.1

Acromyrmex echinator (Acech322) 17.9±1.S

Aeromyrmex octospinosus (Acoctl) 16.8±3.3

Atta colombica (Atcoll) 17.6±3.4

Atta cephalotes (Atcepl) 22.2±2.1

При этом величина буферной емкости, определенная в «грибных садах», сходна со значением, известным для крови человека - 37 мэкв/Л (Ellison et al., 1958), что позволяет сделать вывод о важной роли поддержания pH в системе «грибного сада».

По-видимому, сохранение рН на уровне 5.2 в исследуемой системе приводит, с одной стороны, к снижению скорости размножения паразитических бактерий, а с другой -обеспечивает условия для роста собственного грибного симбионта.

Значение рН является одним из важнейших факторов, влияющих на функционирование системы «грибного сада», поэтому были проведены эксперименты по измерению зависимости активности внеклеточных пептидаз Ь. %огцгу1орЬоги5 от рН (рис. 5).

250 АсесЬ322,

5 О АсосН, АКо11

а X 200

5 0)

н о СХ С 150 ^сог10 0 А.Ызрогш

0 Ч 1 100 ^ Су1оп1? В-. МусвгтнЭ л ^ Тгсог4

и ОТгаеО О ТгерЗ-З

л в 50 О Бегата! О Мугес! 1

о к Сусоз9

£ 0 1 ' 1

< 4,5 5,5 6,5 7,5

рН оптимум активности металлопротеиназ

300 _____________________

О

3 щ 250 - СГ О Тгг^З '"О ТгерЗ-З

Ё О с 200 - О Эегата!

X 3 са 150 - АсесЬ322,

о X АсосИ, А(со11 О

X а 100 ■

4> и

№ Н О о 50 ■ О Мугес! 1

а я

Е 1

С 4,5 5,5 6,5 7,5

рН оптимум активности сериновых пептидаз

Рис.5. рН оптимумы наиболее представленных пептидаз Ь. gongylophorus в «грибных садах»

* Точкам синего цвета соответствуют значения рН оптимумов активности, определенные для пептидаз грибного симбионта Ь. ¡>оп%у1ор1гоги5 в колониях низших муравьев: СурИотугтех Ып^ясарт (колония Су1оп12), Мусосеригих ¡тНИИ (МусБгшЭ), Мугт'юосгурга ес1пае11а (Мугес! 1), точкам зеленого цвета - оптимумы активности, определенные в колониях высших муравьев: ТгасИутугтех согпе1г1 (Тгсог4, ТгсогЮ),

Trachymyrmex sp. 3 (Trsp3-3), Trachymyrmex zeteki (Trzet3), Sericomyrmex amabilis (Seramal) точкам красного цвета - значения pH оптимумов активности сериновых и металлопротеиназ, определенные для L. gongylophorus из колоний муравьев-листорезов: Acromyrmex echinator (Acech322), Acromyrmex octospinosus (Acoctl), Atta colombica (Atcoll). Точке голубого цвета соответствует значение pH-оптимума активности, полученное для свободноживущего, филогенетически родственного L. gongylophorus гриба А. bisporus в погруженной культуре. Пунктирными линиями показаны значения рН-оптимумов пептидаз в колониях Trsp3-3 и Тгсог4, для которых было отмечено два пика активности протеолитических ферментов грибного симбионта. Красными линиями выделены интервалы значений рН-оптимумов пептидаз L. gongylophorus в исследованных колониях муравьев.

Как следует из приведенных данных, оптимум активности как сериновых, так и металлопротеиназ несколько сдвинут в нейтральную область по сравнению со значениями pH-оптимума, определенного для свободноживущих грибов (рис. 2), и составляет 5.2 -7.5 для сериновых и 5.0-6.0 для металлопротеиназ, что, по-видимому, отражает адаптацию ферментативного аппарата L. gongylophorus к обитанию в более кислых условиях.

При этом, для некоторых колоний муравьев рода Trachymyrmex были отмечены дополнительные пики активности сериновых пептидаз при pH 5.2, что, в целом, нетипично для этого класса ферментов, однако согласуется с представлением об адаптивных изменениях в спектре внеклеточных ферментов L. gongylophorus, произошедших при переходе к обитанию в условиях «грибного сада».

Для грибных симбионтов, взятых из различных колоний муравьев, было построено филогенетическое древо (рис. 6), на которое были нанесены профили pH-зависимости общей и класс-специфичной активности внеклеточных пептидаз L. gongylophorus. Согласно приведенным данным, филогения грибного симбионта строго совпадала с филогенетическим положением видов муравьев, выращивающих данный симбионт.

Симбионты, выращиваемые муравьями Т. cornetzi, формировали на филогенетическом древе сестринскую ветвь к группе грибных симбионтов из колоний Sericomyrmex amabilis, Trachymyrmex sp3 и Т.sp.f zeteki, но секретировали спектр протеолитических ферментов, сходный с пептидазами симбионтов из колоний муравьев-листорезов - Acromyrmex и Atta. Симбионты Т. cornetzi (колония Тгсог4) занимали промежуточное положение на филогенетическом древе между группами симбионтов с преимущественной активностью сериновых и металлопротеиназ и секретировали приблизительно равные количества пептидаз, принадлежащих к двум классам.

Профили активности, полученные для симбионтов «низших муравьев», практически полностью совпадали с данными, полученными для близкородственных свободноживущих грибов -А. bisporus и С. comatus.

Рис. 6. Филогенетическое положение и рН оптимумы общей и класс-специфичной активности грибного симбионта из «грибных садов»*

♦Приведенные профили протеолитической активности включают общую активность (сплошные линии), активность металлопротеиназ (штриховые линии) и сериновых пептидаз (пунктирные линии). Вертикальные линии на графиках отражают значение рН в «грибном саду» (5.2) и нижнюю границу области оптимального функционирования щелочных пептидаз (7.0). Красным цветом выделены колонии муравьев-листорезов, в смывах из которых преимущественно регистрировалась активность металлопротеиназ. Зеленым цветом выделены колонии высших муравьев, с наиболее представленной активностью сериновых пептидаз грибного симбионта. Синим цветом выделены колонии низших муравьев, грибной симбионт которых преимущественно секретировал металлопротеиназы. Профиль активности, полученный для родственного свободноживущего гриба Agaricus bisporus, выделен голубым цветом. Грибной симбионт муравьев Trachymyrmex cornetzi, секретирующий приблизительно равные количества сериновых и металлопротеиназ и занимающий промежуточное положение на филогенетическом древе, выделен коричневым цветом. Профиль активности симбионта колонии Apterostigma collare, относящегося к другому семейству -Pteruïaceae, выделен серым цветом. Филогенетическое древо построено на основе анализа последовательностей генов LSU рРНК и фактора элонгации гена 1а, за исключением образцов 20 и 23, для которых были использованы только последовательности генов LSU рРНК. Статистическая проверка достоверности полученных данных проводилась по критерию отношения правдоподобия, показаны значения, превышающие 0.5.

Согласно проведенным молекулярно-филогенетическим исследованиям (Mueller et al., 1998; Vo et al., 2009; Mikheyev et al., 2010), низшие муравьи трибы Attini выращивают в своих «садах» парафилетическую группу симбионтов, включающую также близкородственные виды свободноживущих грибов. Сходство полученных профилей активности А. bisporus и С. comatus (рис. 1, рис. 6) с результатами, полученными для симбионтов низших муравьев, может быть, таким образом, обусловлено филогенетическим родством этих грибов.

Сходство спектров соединений, секретируемых симбионтами низших муравьев трибы Attini и родственными свободноживущими грибами, было также показано De Fine Lichtetal. (2010).

Рис. 6. Филогенетическое положение и рН оптимумы общей и класс-специфичной активности грибного симбионта из «грибных садов»

Сопоставление профилей рН-зависимости активности грибных симбионтов низших, высших муравьев и муравьев-листорезов выявило смещение оптимума общей и класс-специфичной активности от рН 6.0 до 5.2, соответствующего рН «грибного сада».

Согласно полученным результатам, преимущественная секреция металлопротеиназ, по-видимому, является признаком, характерным для симбионтов предковых и наиболее примитивных групп муравьев. рН-оптимум как общей, так и металлопротеиназной активности симбионтов «низших муравьев» составлял 6.0, и был близок к предполагаемому рН почвы, в которой обитали свободноживущие предки грибных симбионтов «грибных садов». Возможно, в процессе эволюции произошло смещение рН-оптимума секретируемых ферментов от 6.0, соответствовавшего рН почвы, до 5.2 - значению рН, которое поддерживается муравьями в «грибном саду» (Orthius-Lechner et al„ 2000; Bot et al., 2002).

Данные по изучению субстратной специфичности пептидаз L. gongylophorus в колониях «грибных садов» приведены в табл. 3.

Согласно представленным данным, грибные симбионты колоний Sericomyrmex amabilis, Trachymyrmex zeteki и Trachymyrmex sp3, с преимущественной активностью сериновых пептидаз, проявляли активность по п-нитроанилидным субстратам Glp-AAL-pNa и Suc-AAPF-pNa, специфичным для субтилаз, но не расщепляли специфичные субстраты соответственно для трипсинов и химотрипсинов, Bz-R-pNa и Glp-F-pNa. Ингибиторным анализом было показано, что активность этих пептидаз снижалась в присутствии общего ингибитора сериновых протеиназ PMSF, но не TLCK и ТРСК (ингибиторов трипсина и химотрипсина) (Proteolytic enzymes, 2001), что указывает на возможную принадлежность сериновых пептидаз грибного симбионта к семейству субтилизина.

Полученные данные о субстратной специфичности, в целом, согласуются с представлением о сапротрофной природе предков грибного симбионта (Schultz et al., 2005). Вместе с тем, грибные симбионты демонстрировали сравнительно высокие значения активности внеклеточных эндопептидаз и обладали низкой относительной активностью экзопептидаз, что отличалось от данных, полученных для свободноживущих сапротрофных грибов (табл. 2). Возможно, это связано с тем, что микробное сообщество «грибного сада» значительно отличается от почвенного, так как муравьи удаляют бактерии и несимбиотические грибы из колонии, и поэтому белки не расщепляются предварительно бактериальными эндопептидазами, тем самым определяя высокую активность эндопептидаз самого грибного симбионта.

Таким образом, изучение внутривидовой изменчивости протеолитической активности у грибов на примере системы «грибной сад» подтвердило наличие корреляции между класс-специфичной активностью пептидаз и филогенией.

Таблица 3. Субстрат-специфичная активность пептидаз L. gongylophorus в системе «грибного сада»

Колония муравьев, выбранная для изучения пептида] грибного симбионта Класс-специфичная активность по азоказеину, % Протеолитическая активность, ед.

Субстраты эндопептидаз Субстраты экзопептидаз

Металло-протеиназы Сериновые пептидазы Glp-AAL-pNa Bz-R-pNa Suc-AAPF-pNa F-pNa L-pNa Y-pNa

Apterostigma coliare (Apcoll) 94.1 0.27 9 0.02 11 0.04 0.08 0

Mycocepurus smitkii (Mycsm¡9) 88.6 4.6 3 0 5 0.01 0 0

Cyphomyrmex costatus (Cycos9) 77.3 5.4 5 0.01 7 0 0.01 0.02

Myrmicocrypta ednaclla (Myredl) 89.9 5.6 15 0 26 0 0 0

Sericomyrmex amabilis (Seramal2) 13.8 73.7 187 0 427 0.01 0 0

Trachymyrmex cometí (TrcorlO) 85.1 5.0 5 0 8.1 0 0 0

Trachymyrmex zeteki (Tnet3) 8.3 92.6 121 0 214 0.06 0.02 0.04

Trachymyrmex sp3 (Trsp3-3) 17.4 76.1 209 0.05 356 0 0 0.03

Acromyrmex echinator (Acech322) 70.4 20.6 15 0 24 0 0.07 0

Сопоставление профилей активности gongylophorus в колониях низших, высших муравьев и муравьев-листорезов выявило адаптивные изменения в спектре секретируемых пептидаз гриба, вызванные переходом к обитанию в системе с насекомыми.

Глава 5. Сравнительный анализ свойств наиболее представленных пептидаз грибов Cordyceps militaris, Agarícus bisporus и Leucoagarícus gongylophorus

Наиболее активные ферменты из трех основных объектов исследования -сериновая пептидаза из энтомопатогенного гриба С. militaris, металлопротеиназа из гриба-сапротрофа - A. bisporus и металлопротеиназа из L. gongylophorus (симбионта колонии муравьев Acromyrmex echinator) представляли интерес с точки зрения сравнения био- и физико-химических свойств. Для очистки пептидаз С. militaris и A. bisporus использовали культуральную жидкость качалочной культуры грибов. Результаты экспериментов по подбору среды культивирования, обеспечивающей максимальный выход исследуемых пептидаз, показали, что оптимальной средой для культивирования С. militaris является среда Чапека, модифицированная добавлением желатины, а для A. bisporus - эта же среда, с казеином. Сериновая пептидаза из С. militaris расщепляла как белковые, так и трех- и четырехчленные синтетические субстраты; препарат металлопротеиназы из A. bisporus проявлял активность по одночленным субстратам, а также азоказеину и желатине.

Методами аффинной хроматографии на бацитрацин-силохроме и гель-хроматографии на Superdex G75 был получен элекгрофоретически гомогенный препарат сериновой пептидазы из С. militaris с выходом 15% и степенью очистки 99 раз. Металлопротеиназа из A. bisporus была получена в виде высокоочищенного препарата методами ионообменной хроматографии на DEAE Sephadex А-50 и ионообменной хроматографии на колонке Mono Q с выходом 0.71% и степенью очистки 60 раз.

Результаты экспериментов по проведению сравнительного анализа свойств наиболее представленных пептидаз грибов С. militaris, A. bisporus и L. gongylophorus приведены в табл. 4.

Таблица 4. Физико-химические свойства наиболее представленных пептидаз исследуемых мицелиальных грибов

Вид гриба t°C оптимум t°C стабильность рН оптимум рН стабильность

C.militaris 35-55 до 50°C 7-9 4.8-9.3

A.bisporus 35-40 до 50°C 6.0 4.5-9.0

L. gongylophorus 35-40 до 50°C 5.2 4.5-9.0

Как следует из приведенных данных, исследуемые пептидазы значительно различались зависимостью активности от рН. При этом щелочной оптимум активности, наблюдаемый в случае С. тИНат, соотвествовал рН внутренней среды насекомого,

оптимум активности металлопротеиназы из L. gongylophorus совпадал с pH, поддерживаемым в «грибном саду», а оптимум активности пептидазы А. bisporus, возможно, отражает адаптацию к функционированию ферментов в почвенных местообитаниях.

Внеклеточные пептидазы энтомопатогенных грибов, преимущественно относящиеся к классу сериновых, оказались более эффективными для расщепления покровов насекомых, чем ферменты сапротрофных грибов, принадлежащие, в основном, к классу металлопротеиназ. Результаты экспериментов по расщеплению белков кутикулы насекомых сериновой пептидазой С. militaris и металлопротеиназой А. bisporus представлены в табл. 5.

Таблица 5. Действие сериновой пептидазы Согласно приведенным данным,

C.militaris и металлопротеиназы A.bispoms пептидаза гриба-энтомопатогена в два раза на белки кутикулы Nauphoeta cinerea бодее эффективно расщепляла белки покровов

насекомого, чем металлопротеиназа гриба-сапротрофа А. bisporus, что, по-видимому, отражает большую приспособленность ферментативного аппарата энтомопатогенов к деградации специфичных для этих грибов субстратов.

Сравнительный анализ спектров внеклеточных пептидаз, секретируемых грибами, образующими биотические связи с насекомыми, выявил следующие корреляции (рис. 7 а,б): виды базидиомицетов, к которым относились грибы, являющиеся пищевым субсгратом для насекомых, в основном секретировали металлопротеиназы и обладали сравнительно низкой активностью субтилизиноподобных пептидаз.

Виды аскомицетных грибов, к которым относятся многие грибы-энтомопатогены, преимущественно секретировали сериновые пептидазы и обладали высокой активностью субтилизиноподобных ферментов.

Класс-специфичная активность, таким образом, коррелировала с таксономическим положением грибов как на уровне больших таксономических единиц, так и на уровне штаммов одного вида (что было показано при изучении системы «грибного сада»).

Вид гриба Деградация белков кутикулы, %

Cordyceps militaris 18±6

Agaricus bisporus 9±3

Рис. 7. а. Корреляция между внеклеточной протеолитической активностью и таксономическим положением исследованных мицелиальных грибов.

Желтым цветом выделены виды аскомицетов, зеленым - базидиомицетов. Синим цветом отражена величина активности субтилизиноподобных пептидаз, при этом величина активности пропорциональна интенсивности цвета. Розовым цветом отмечены виды грибов с преобладающей активностью сериновых пептидаз, красным -металлопротеиназ. Вид Р. ояКеШт с приблизительно равными величинами этих активностей выделен обоими цветами.

б. Корреляция между внеклеточной протеолитической активностью и экологическими особенностями исследованных мицелиальных грибов.

Красным цветом выделены виды грибов-патогенов, серым - сапротрофов. Желтым цветом показано наличие трипсиноподобной активности, площадь выделения пропорциональна величине активности. Оттенками синего отражена величина аминопептидазной активности, при этом интенсивность цвета пропорциональна величине этой активности.

Активность по некоторым субстратам совпадала с принадлежностью грибов к определенным трофическим группам: виды грибов-патогенов расщепляли субстрат Вг-Я-р№, специфичный для трипсиноподобных пептидаз. Сапротрофные грибы обладали более высокой относительной активностью аминопептидаз, однако вклад этих ферментов в деградацию белковых субстратов зависел от состава микробного сообщества: он был большим у почвенных грибов, и практически незначительным у штаммов Ь. gongylophorus в системе «грибного сада».

Аскомицеты

Трипсиноподобная активность

Сапротрофы

Рис. 7. а, б Корреляция между внеклеточной протеолитической активностью и/ или таксономическим положением исследованных мицелиальных грибов.

Выводы

1. Выявлена корреляция между спектром секретируемых протеолитических ферментов и таксономическим положением мицелиальных грибов: изученные виды аскомицетов секретируют преимущественно сериновые пептидазы со щелочным рН-оптимумом 7.6 - 9.0, а виды базидиомицетов - металлопротеиназы с рН оптимумом 5.5 - 7.1.

2. Показана связь между субстратной специфичностью секретируемых пептидаз и принадлежностью грибов к определенным трофическим группам. Высокая трипсиноподобная активность показана для грибов - энтомо- и фитопатогенов, в то время как аминопептидазная активность может служить маркером сапротрофности.

3. В водных вытяжках мицелия грибного симбионта, полученного из «грибных садов», обнаружены выраженные буферные свойства. Оптимум активности пептидаз, секретируемых грибным симбионтом, совпадает с рН, поддерживаемым в «грибном саду», что обеспечивает максимальную эффективность деградации белков в этой системе. Переход к обитанию в системе с насекомыми приводит к изменению рН оптимума активности пептидаз Ь. §оп&1оркоги5 с рН 6.0 до 5.2 (рН «грибного сада»),

4. Анализ высокоочищенных препаратов пептидаз из С. тИИат, А. Ы.чрогих и Ь. gongylophoms показал, что исследуемые ферменты отличаются рН оптимумом активности. Пептидаза из энтомопатогенного гриба С. тНИапз эффективнее расщепляла кутикулу насекомых по сравнению с пептидазой сапротрофного гриба А. Ызрогиз.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных положений по теме диссертации.

1. Семенова ТА, Белозерский МА, Белякова ГА, Борисов БА, Семенова СА, Дунаевский ЯЕ. Сектретируемая протеиназа энтомопатогенного гриба Cordyceps militaris: подбор состава среды и разработка метода очистки. Микология и фитопатология, 2011. 44(6). 535-541.

2. Семенова ТА, Белозерский МА, Белякова ГА, Борисов БА, Семенова СА, Дунаевский ЯЕ. Сектретируемая протеиназа энтомопатогенного гриба Cordyceps militaris: энзиматические свойства и адсорбция на кутикуле насекомых. Микология и фитопатология, 2011. 45 (1). 64-69.

3. Semenova ТА, Hughes DP, Schiott М, Boomsma JJ. Evolutionary patterns of proteinase activity in attine ant fungus gardens, (in English). BMC Microbiology, 2011.11:15.

Тезисы, материалы конференций.

1. Семенова ТА, Белозерский МА, Белякова ГА, Борисов БА, Семенова СА, Дунаевский ЯЕ. Протеиназа из энтомопатогенного гриба Cordyceps sp. I(XI) Международная конференция молодых ботаников, Санкт-Петербург, Май, 21-25, 2006.

2. Семенова ТА, Белозерский МА, Белякова ГА, Борисов БА, Семенова СА, Дунаевский ЯЕ. Секретируемая протеиназа из энтомопатогенного гриба Cordyceps militaris (Fr.) Link. VI Международный Симпозиум «Химия протеолитических ферментов», Москва, апрель 22-26, 2007.

3. Семенова ТА, Белозерский МА, Белякова ГА, Борисов БА, Семенова СА, Дунаевский ЯЕ. Секретируемая протеиназа энтомопатогенного гриба Cordyceps militaris (L.) Link", Перспективы и проблемы современной ботаники, Новосибирск, Октябрь, 17-21, 2007

4. Семенова ТА, Белозерский МА, Белякова ГА, Борисов БА, Семенова СА, Дунаевский ЯЕ. Секретируемые протеиназы и ингибиторы пептидаз энтомопатогенных грибов. II Съезд Микологов в России, Москва, Апрель, 16-18, 2008.

5. Semenova ТА, Schiott М, Boomsma JJ, Hughes DP. Fungal-ant interactions as models for solving evolutionary questions Nordforsk Meeting on Social Insect Biology (Nordic Network in Social Evolution), Oulanka, Finland, December 8-11, 2008.

6. Семенова ТА. Протеолитическая активность грибного симбионта в системе «грибной сад». 1(1Х) Конференция молодых ученых «Ломоносов», Апрель 11-14, 2010.

Заказ № 07-П/08/2011 Подписано в печать 04.08.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,18

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семенова, Татьяна Александровна

Список сокращений

Введение

Глава 1 Обзор литературы

1.1. Биотические связи грибов и насекомых

1.1.1. Типы экологических взаимоотношений грибов и насекомых

1.1.2. Микофагия насекомых

1.1.3. Паразитические взаимодействия грибов и насекомых: энтомопатогенные грибы

1.1.3.1. Энтомофторовые грибы

1.1.3.2. Лабульбениевые грибы

1.1.3.3. Энтомопатогенные клавиципитальные грибы

1.1.4. Взаимовыигрышные системы грибов и насекомых

1.1.4.1. Взаимоотношения септобазидиевых грибов и насекомых

1.1.4.2. Взаимодействия офиостомовых грибов с жуками-короедами

1.1.4.3. Биотические связи грибов и общественных насекомых: термиты и ТегтНотусез яр.

1.1.4.4. Биотические связи грибов и общественных насекомых: «грибной сад»

1.2. Секретируемые протеолитические ферменты грибов 24 1.2.1. Определение и классификация протеолитических ферментов

1.2.1.1. Аспартильные пептидазы

1.2.1.2. Сериновые пептидазы

1.2.1.3. Металлопротеиназы

1.2.1.4. Цистеиновые пептидазы

1.2.1.5. Треониновые пептидазы

1.2.1.6. Глутаминовые пептидазы

1.2.1.7. Экзопептидазы грибов

1.3. Влияние условий культивирования на секрецию протеолитических ферментов

1.3.1. рН среды

1.3.2. Влияние источников азота на величину внеклеточной протеолитической активности

1.3.3. Влияние источников углерода на величину внеклеточной протеолитической активности

1.3.4. Влияние совместного культивирования in vitro на внеклеточную протеолитическую активность

1.4. Протеолитические ферменты в системах, образованных грибами и насекомыми

1.4.1. Внеклеточные пептидазы энтомопатогенных грибов

1.4.2. Адсорбция пептидаз энтомопатогенных грибов на кутикуле насекомых

1.4.3. Зависимость субстратной специфичности внеклеточных пептидаз от экологических особенностей грибов

1.4.4. Связь ферментативной активности и вирулентности патогенных грибов

1.5. Экология и систематика вида Cordyceps militaris

1.6. Протеолитические ферменты сапротрофных грибов в системах in vitro

1.7. Систематика и экология рода Agaricus и вида Agaricus bisporus

1.8. Секретируемые пептидазы AMsporus

1.9. Секретируемые гидролитические ферменты симбиотических грибов в «грибных садах»

Глава 2 Материалы и методы

2.1. Виды грибов, использованные в экспериментальной работе

2.2. Культивирование грибов

2.3. Определение буферных свойств 53 2.4 Определение протеолитической активности

2.4.1. Определение протеолитической активности грибов по п-нитроанилидным субстратам

2.4.2. Определение активности по желатине

2.4.3. Определение протеолитической активности по азоказеину 55 2.4.3.1. Определение класс-специфичной активности пептидаз методом ингибиторного анализа

2.5. Определение хитинолитической активности С. militaris

2.6. Очистка сериновой пептидазы из С. militaris и металлопротеиназы из A. bisporus

2.6.1. Очистка пептидазы из С. militaris: аффинная хроматография на бацитрацин-силохроме

2.6.2. Очистка пептидазы из С. militaris: гель — хроматография на Superdex G75 в режиме FPLC

2.6.3. Очистка пептидзы из А. bisporus: осаждение сульфатом аммония

2.6.4. Очистка пептидазы из А. bisporus: batch-процедура на

DEAE Sephadex А

2.6.5. Очистка пептидазы из А. bisporus: ионообменная хроматография на Mono Q в режиме FPLC

2.6.6. Очистка пептидазы из А. bisporus: гель-хроматография на Superdex-G75 в режиме FPLC

2.7. Электрофоретическое исследование полученных препаратов

2.7.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях

2.7.2. Электрофорез с окраской по активности 60 "

2.8. Определение физико-химических и кинетических свойств ферментов

2.8.1. Определение рН-оптимумов ферментов

2.8.2. Определение pH стабильности ферментов

2.8.3. Определение температурного оптимума ферментов

2.8.4. Определение температурной стабильности ферментов

2.9. Адсорбция сериновой пептидазы из С. militaris на кутикуле

N. cinerea в зависимости от pH

2.10. Воздействие препарата пептидаз из С. militaris на кутикулу

N. cinerea

2.11 Молекулярно - филогенетический анализ грибных симбионтов

Результаты и обсуждение

Глава 3. Определение корреляций между спектром секретируемых пептидаз и таксономическим положением или принадлежностью к определенным трофическим группам грибов

3.1. Изучение способности мицелиальных грибов к росту на агаризованных средах, содержащих белок как единственный источник углерода и/или азота

3.2. Изучение влияния состава среды на внеклеточную активность мицелиальных грибов в погруженной культуре

3.3. Определение класс-специфичной активности пептидаз в культуральной жидкости мицелиальных грибов

3.4. Определение рН-оптимумов общей и класс-специфичной активности' пептидаз в культуральной жидкости мицелиальных грибов

3.5. Экзо- и эндопептидазная активность исследуемых мицелиальных грибов

Глава 4. Изучение внутривидовой изменчивости протеолитической активности у грибов на примере системы «грибной сад»

4.1. Определение общей и класс-специфичной активности пептидаз

Ь. gongylophorus в водных смывах мицелия из «грибных садов»

4.2. Определение буферных свойств смывов мицелия Ь. gongylophorus из «грибных садов» и мицелия чистых культур грибов 85т'

4.3. Определение рН-оптимумов общей и класс-специфичной активности пептидаз в водных вытяжках мицелия Ь. gongylophorus из «грибных садов»

4.4. Корреляция между спектрами внеклеточных пептидаз и филогенетическим положением Ь. gongylophorus

4.5. Определение субстратной специфичности пептидаз штаммов

Ь. gongylophorus в «грибных садах»

Глава 5. Сравнительный анализ свойств наиболее представленных пептидаз грибов С. тИИапз, А. Ыярогт и Ь. gongylophorus

5.1. Изучение влияния состава среды на внеклеточную протеолитическую активность С. тИМаггз и А.Ыьрогия

5.2. Очистка пептидазы, секретируемой С. т И Наг ¿я

5.3. Очистка пептидазы, секретируемой А. Ыярогт

5.4. Определение физико-химических и кинетических свойств пептидаз С. тИМапя, А Ызрогиз и Ь. gongylophorus

5.4.1 .Температурный оптимум ферментов

5.4.2. Температурная стабильность ферментов

5.4.3. Определение рН оптимумов ферментов

5.4.4. Определение pH - стабильности ферментов

5.5. Определение субстратной специфичности ферментов

5.6. Адсорбция сериновой пептидазы С. militaris на кутикуле

N. cinerea в зависимости от pH

5.7. Воздействие сериновой пептидазы С. militaris и препарата металлопротеиназы А. bisporus на белки кутикулы N. cinerea

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внеклеточные пептидазы грибов, образующих биотические связи с насекомыми"

Гетеротрофный тип питания, характерный для грибов, определяет их способность к образованию биотических связей с представителями самых разных царств живых организмов (Encyclopedia of entomology, 2008). Экологические взаимоотношения грибов и насекомых разнообразны и включают как взаимовыигрышные, так и эксплуатационные системы. Наиболее изученными взаимовыигрышными системами грибов и насекомых являются «грибные сады», в которых различные виды муравьев трибы Attini выращивают грибной симбионт из семейств Agaricaceae и Pterulaceae, или симбиоз термитов с видами грибов рода Termitomyces. К эксплуатационным взаимодействиям относится, например, паразитизм энтомопатогенных грибов на насекомых-хозяевах. Многие виды грибов не образуют облигатных связей с насекомыми, однако используются насекомыми-микофагами в качестве пищевого субстрата и экологической ниши.

Поддержание биотических связей грибов и насекомых, в значительной степени, определяется функционированием различных химических соединений, и, в частности, пептидаз, секретируемых грибами. Во взаимовыигрышных системах расщепление белковых субстратов внеклеточными пептидазами обеспечивает питание мицелия, и, как следствие, насекомого-симбионта; во многих мутуалистических системах гидролитические ферменты гриба расщепляют субстраты, недоступные для собственного ферментативного аппарата насекомых. Ключевая роль протеолитических ферментов показана и в процессах патогенеза насекомых: так, введение дополнительных генов, кодирующих внеклеточные протеиназы, резко повышает патогенные свойства штаммов грибов (St. Leger, 1995).

Синтез и секреция пептидаз клетками гриба является энергоемким процессом, что обуславливает образование ферментов, максимально адаптированных к условиям обитания мицелия. Поэтому различия в спектре пептидаз, секретируемых мицелием, развивающимся в составе разнообразных систем с насекомыми, косвенно отражают экологические и метаболические особенности грибов.

Несмотря на то, что из грибов выделено и охарактеризовано несколько тысяч пептидаз, исследований, посвященных поиску связей между различными экологическими и таксономическими группами грибов и спектром секретируемых ими пептидаз, ранее не проводилось.

Цель настоящей работы состояла в проведении сравнительного изучения физикохимических, биохимических и функциональных свойств внеклеточных пептидаз грибов, 8 принадлежащих к различным таксономическим и трофическим группам. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение корреляций между спектром секретируемых пептидаз или таксономическим положением и типом питания у грибов

2. Изучение внеклеточных пептидаз грибного симбионта Leucoagaricus gongylophorus в системе «грибного сада» по сравнению с близкородственным свободноживущим видом Agaricus Ызрогю. Определение адаптивных изменений в спектре внеклеточных пептидаз, вызванных переходом грибов к обитанию с насекомыми.

3. Проведение сравнительного анализа свойств наиболее представленных пептидаз грибов Согйусерз тНИаггз, Agaricus Ыхрогиз и Leucoagaricus gongylophorus.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Семенова, Татьяна Александровна

Выводы

1. Выявлена корреляция между спектром секретируемых протеолитических ферментов и таксономическим положением мицелиальных грибов: изученные виды аскомицетов секретируют преимущественно сериновые протеиназы со щелочным рН-оптимумом 7.6 — 9.0, а виды базидиомицетов — металлопротеиназы с рН оптимумом 5.5 — 7.1

2. Показана связь между субстрат-специфичной активностью секретируемых пептидаз и принадлежностью грибов к определенным трофическим группам. Высокая трипсиноподобная активность показана для грибов — энтомо- и фитопатогенов, в то время как аминопептидазная активность может служить маркером сапротрофности

3. В водных вытяжках мицелия грибного симбионта, полученного из «грибных садов», обнаружены выраженные буферные свойства. Оптимум активности протеиназ, секретируемых грибным симбионтом, совпадает с рН, поддерживаемым в «грибном саду», что обеспечивает максимальную эффективность деградации белков в этой системе. Переход к обитанию в системе с насекомыми приводит к изменению рН оптимума активности пептидаз Ь. gongylophorus с рН 6.0 до 5.2 (рН «грибного сада»).

4. Анализ высокоочищенных препаратов пептидаз из С. тИНапв, А. Ыярогт и Ь. gongylophorus показал, что исследуемые ферменты отличаются рН оптимумом активности. Пептидаза из энтомопатогенного гриба С. тИНапя эффективнее расщепляла кутикулу насекомых по сравнению с пептидазой сапротрофного гриба А. Ыврогш.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семенова, Татьяна Александровна, Москва

1. Астапович Н.И., Ермолицкий В.Н. Факторы, определяющие образование кислой протеазы микромицетом Aspergillus foetidus. // Микология и фитопатология, 1987, 4, 318322.

2. Белякова Г.А., Дьяков Ю.Т., Тарасов K.JI. Ботаника: в 4 т. Т. I. Водоросли и грибы: учебник для студ. высш. учеб. заведений, 2006. М.: Издательский центр «Академия», 320 с.

3. Билай Т.И. Термофильные грибы и их ферментативные свойства. Киев: Наукова думка, 1985, 150с.

4. Борисов Б.А., Серебров В.В., Новикова И.И, Бойкова И.В. Энтомопатогенные аскомицеты и дейтеромицеты. // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты. Под ред. В.В.Глупова. М.: Круглый год, 2001, стр. 352-427.

5. Вассер С.П. Флора грибов Украины. Агариковые грибы. Киев: Наукова думка, 1980, 345с.

6. Воронина Э.Г., Леднев Г.Р., Мукамолова Т.Ю. Энтомофторовые грибы. // в кн. Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты под ред. В.В. Глупова. 2001. стр. 271 -351.

7. Гарибова JI.B. Биологические особенности различных штаммов культивируемого шампиньона и их связь с урожайностью. Автореф. Дис, Канд. биол. наук. М: 1964, 22с.

8. Гарибова JI.B. Род Agaricus. Сиситематика. Экология. Особенности развития. // Новое в систематике и номенклатуре грибов. Москва. 2003, 495 с.

9. Дунаевский Я.Е., Белякова Г.А., Павлюкова Е.Б., Белозерский М.А. Влияние условий культивирования на образование и секрецию протеаз грибами A. alternata и F. oxysporum. //Микробиология, 1995, Т. 64. № 3. С. 327-330.

10. Дунаевский Я.Е., Гурбань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Влияние состава среды на количественный и качественный состав внеклеточных протеиназ микромицетов. //Микробиология, 1999, 68, 3, 324-329.

11. Дунаевский Я.Е., Дун Чжан, Матвеева А.Р., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Деградация белковых субстратов ксилотрофными базидиомицетами. // Микробиология, 2006, 75, 1,46-51.

12. Евлахова A.A. Энтомопатогенные грибы. Систематика, биология, практическое значение. 1974. Изд-во «Наука», Ленингр. отд., Л., 260 стр.

13. Егоров Н.С., Лория Н.С., Ландау Н.С. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз, под ред. Имшенецкого A.A., М.: Наука, 1979, С. 146-244.

14. Кипятков В.Е. Мир общественных насекомых. Л.: Изд-во Ленинградского ун-та, 1991,408с.

15. Коваль Э.З. Определитель энтомофильных грибов СССР. Киев: Наукова думка, 1974, 260с.

16. Котлова Е.К., Иванова Н.М., Юсупова М.П., Воюшина Т.Л., Иванушкина Н.Е., Честухина Г.Г. Сериновая тиолзависимая протеиназа Paecilomyces lilacinus: выделение и свойства. // Биохимия, 2007. Т. 72. В. I. С. 137-144.

17. Кретович В.Л. Введение в энзимологию. М.: Наука, 1974, С. 226-238.

18. Лессо Т. Грибы: Определитель, М.: ООО "Издательство ACT": ООО "Издательство Астрель", 2003, 304 с.

19. Лобарев Л.С., Степанов В.М. Карбоксильные протеазы плесневых грибов. // Успехи биологической химии. М.: Наука., 1978. Т.19. С. 83-105.

20. Павлюкова Е.Б., Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е. Внеклеточные протеолитические ферменты мицелиальных грибов. // Биохимия, 1998, Т. 63, вып. 8. С. 1059-1089.

21. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. // М.:Мир, 1987. С. 61-66.

22. Руденская Г.Н. Аффинная хроматография протеиназ. // Биоорганическая химия, 1994, Т. 20 (3). С. 213-229.

23. Сидорова И.И. Макросистема грибов: методология и изменения последнего десятилетия. // Новое в систематике и номенклатуре грибов. 2003. М. С. 7-16.

24. Степанов В.М. Эволюция структуры и функции протеолитических ферментов // «Химия протеолитических ферментов». Материалы всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов. Вильнюс. 15-17 мая 1973. С. 7-11.

25. Alicja S. Towards an integrated management of Dendrolimus pini L. // Proceedings: Population dynamics, impacts, and integrated management of forest defoliation insects. USDA forest service general technical report NE-247, 1998. P. 129-142.

26. Ball A.M., Ashby A.M., Daniels M.J., Ingramo D.S., Johnstone K. Evidence for the requirement of extracellular protease in the pathogenic interaction of Pyrenopeziza brassicae with oilseed rape. //Physiol. Mol. Plant Pathol., 1991. V. 38. P. 147-161.

27. Benjamin R.K. Introduction and supplement to Roland Thaxter's contribution towards a monograph of the Laboulbeniaceae. Bibliotheca Mycol., 1971. V. 30. P. 1-155.

28. Benjamin R.K. Laboulbeniomycetes. In: The fungi, an advanced treatise, 1973. P. 223246. 4A: Eds. G. C. Ainsworth, F. K. Sparrow and A. S. Sussman. New York & London.

29. Bidochka M.J., Khachatourians G.G. Protein hydrolysis in grasshopper cuticles by entomopathogenic fungal extracellular proteases. // J. of Invertebrate Pathology, 1993. V. 63. P. 7-13.

30. Bidochka M.J., Khachatourians G.G. Basic proteases of entomopathogenic fungi differ in their adsorbtion properties to insect cuticle. // J. of Invertebrate Pathology, 1994. V. 64. P. 26-32.

31. Bidochka M.J., St. Leger R.J., Stuart A., Gowanlock K. Nuclear rDNA phylogeny in the fungal genus Verticillium and its relationship to insect and plant virulence, extracellular proteases and carbohydrases. // Microbiology, 1999. V. 145. P. 955-963.

32. Bignell E., Negrete-Urtasun S., Calcagno A.M., Haynes K., Arst H.N.Jr., Rogers T. The Aspergillus pH-responsive transcription factor PacC regulates virulence. // Mol. Microbiol., 2005. V. 55. P. 1072-1084.

33. Borm S.V., Billen J., Boomsma J.J. The diversity of microorganisms associated with Acromyrmex leafcutter ants. // BMC Evol. Biol. 2002. V 2:9.

34. Bot A.N.M., Ortius-Lechner D., Finster K., Maile R., Boomsma J.J. Variable sensitivity of fungi and bacteria to compounds produced by the metapleural glands of leaf cutting ants. // Insectes Sociaux, 2002. V. 49. P. 363-370.

35. Boyd N.D., Martin M.M. Fecal proteinases of the fungus growing ant Atta texana: properties, significance and possible origin. // Insect Biochemistry, 1975a. V. 5. P. 619-635.

36. Boyd N.D., Martin M.M. Fecal proteinases of the fungus growing ant Atta texana: their fungal origin and ecological significance. // J. Insect Physiol., 1975b. V. 21. P. 1815-1820.

37. Braga G.U.L., Destefano R.H.R., Messias C.L. Protease production during growth and autolysis of submerged Metarhizium anisopliae cultures. // Revista de Microbiologia, 1999. V. 30. P. 107-113.

38. Brouta F., Descamps F., Fett F., Losson B., Gerday C., Mignon B. Purification and characterization of a 43.5 kDa keratinolytic metalloprotease from Microsporium canis. //Med. Mycol., 2001. V. 39. P. 269-275.

39. Bultman T.L., Mathews P.L. Mycophagy by a millipede and its possible impact on an insect-fungus mutualism. // Oikos, 1996. V. 75. P. 67-74.

40. Burton K.S., Love M.E., Smith. J.F. Biochemical changes associated with mushroom quality in Agaricus spp. //Enzyme Microb. Technol., 1993. V. 15 P. 736-741.

41. Burton K.S., Smith J.F., Wood D.A., Thurston C.F. Extracellular proteinases from the mycelium of the cultivated mushroom Agaricus bisporus. II Mycol. Res., 1997. V. 101.,P. 13411347.

42. Buxton P.A. British dipteral associated with fungi III. Flies of all families reared from about 150 species of fungi. // Entomol. Mon. Mag., 1960. V. 96. P. 61-94.

43. Caracuel Z., Casanova C., Roncero M.I.G., Di Pietro A., Ramos J. pH response transcription factor pacC controls sant stress tolerance and expresión of the P-type Na+-ATPase Enal in Fusarium oxysporum. II Eukaryot. Cell, 2003. V. 2 P. 1246-1252.

44. Cooney N.M., Bruce S.K. Fungal adaptation to the mammalian host: it is a new world, after all. II Curr. Opin. Microbiol., 2008. V. 11. P. 511-516.

45. De Fine Licht H.H., Schiott M., Mueller U.G., Boomsma J.J. Evolutionary transitions in enzyme activity of ant fungus gardens. // Evolution, 2010. V. 64. P. 2055-2069.

46. Dong X., Shi W., Zeng Q., Xie L. Roles of adherence and matrix metalloproteases in growth patterns of fungal pathogens in cornea. // Curr. Eye. Res., 2005. V. 30 (8). P. 613-620.

47. Dubovenko A.G., Dunaevsky Y.E., Belozersky M.A., Oppert B., Lord J.C., Elpidina E.N. Trypsin-like proteins of the fungi as possible markers of pathogenicity. // Fungal Biol., 2010. V. 114(2-3). P. 151-159.

48. Eilenberg J. Biology of fungi from the order Entomophthorales with emphasis on the genera Entomophthora, Strongwellsea and Erynopsis. A contribution to insect pathology and biological control, 2002. D.Sc.Thesis. 408 pp.

49. Ellison G., Straumfjord JrJ.V., Hummel J.P. Buffer capacities of human blood and plasma. // Clinical Chemistry, 1958. V.4. P. 452-461.

50. Encyclopedia of entomology. Edited by John L. Capinera. // Springer Science + Business Media B.V., 2008. 1644 p.

51. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. //Arch. Biochem. Biophys., 1961. V. 95. (2). P. 271-278.

52. Froeliger E.H., and Carpenter B.E. NUT1, a major nitrogen regulatory gene in Magnaporthe grísea, is dispensable for pathogenicity. // Mol. Gen. Genet., 1996. V. 251. P. 647656.

53. Fukamizo T., Speirs R. D., Kramer K. J. Comparative biochemistry of mycophagous and non-mycophagous grain beetles, chitinolytic activities of foreign and sawtoothed grain beetles. // Comp. Biochem. Physiol., 1985. V. 81. P. 207-209.

54. Fungal-Insect relationships: perspectives in Ecology and Evolution. Edited by Wheeler Q. & Blackwell M. // Columbia University Press, New York. 1984. 514 p.

55. Gonzalez-Lopez C.I., Szabo R., Blanchin-Roland S., Gaillardin C. Genetic control of extracellular protease synthesis in the yeast Yarrowia lypolytica. II Genetics, 2002. V. 160. P. 417-427.

56. Guindon S., Gascuel O. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. // Systematic Biology, 2003. V. 52. P. 696-704.

57. Gupta S.C., Leathers T.D., Galal N.E., IgnofFo C.M. Insect cuticle degrading enzymes from entomopathogenous fungus Beauveria bassiana. H Experim. Mycol., 1992. V. 16. P. 132— 137.

58. Gupta S.C., Leathers T.D., Galal N.E., Ignoffo C.M. Relationships among enzyme activities and virulense parameters in Beauveria bassiana infections of Galleria melonella and Trichoplusia ni. II J. of Invertebrate Pathology, 1994. V. 64. P. 13-17.

59. Habeeb T.S. Determination of free aminogroups in proteins by trinitrobenzensulfonic acid. //Analyth. Biochem., 1966. V. 14. P. 328-336.

60. Hanley R.S., Goodrich M.A. Review of Mycophagy, host relationships and behavior in the new world Oxyporinae (Coleoptera: Staphylinidae). // The Coleop. Bull., 1995. V. 49(3). P. 267-280.

61. Hackman W., Meinander M. Diptera feeding as larvae on miacrofiingi in Finland. // Ann. Zool. Fennici, 1979. V. 16. P. 50-83.

62. Hattori M., Isomura S., Yokoyama E., Ujita M., Hara A. Extracellular Trypsin-like Proteases Produced by Cordyceps militaris. II J. of Bioscience and Bioengineering, 2005. V. 100 (6). P. 631-636.

63. Hawksworth D.L., Kirk P.M., Sutton B.C., Pegler D.N. // Ainsworth & Bisby's Dictionary of the Fungi, 1995. Eight Edition, CAB International, 616 pp.

64. Holliday J., Cleaver M. On the trail of the yak: ancient Cordyceps in the modern world. //Encyclopedia of Dietary Supplements, 2005. V.ll. 63 p.

65. Hu G., St. Leger R.J. A phylogenomic approach to reconstructing the diversification of serine proteases in fungi. // J. Evol. Biol., 2004. V. 17. P. 1204-1214.

66. Hulanicki A. Reactions of Acids and Bases in Analytical Chemistry. Ed. by Masson, M.R. Horwood, 1987. 308 pp.

67. Ievleva E.V., Revina T.A., Kudryavtseva N.N., Sofm A.V., Valueva T.A. Extracellular proteinases from the phytopathogenic fungus Fusarium culmorum. II Prikl. Biokhim. Microbiol. 2006. V/42(3). P. 298-303.

68. Jensen K., 0stergaard P.R., Wilting R., Lassen S.F. Identification and characterization of a bacterial glutamic peptidase. // BMC Biochemistry, 2010. V. 11:47.

69. Katsivela E., Kleppe F., Wagner S., Wagner F. Ustilago maydis lipase I.Hydrolysis and ester-syntgesis activities of crude enzyme preparation. // Enz. Microb. Technol., 1995. V. 17 (8). P. 739-745.

70. Kiers E.T., Rousseau R.A., West S.A., Denison R.F. Host sanctions and the legume-rhizobium mutualism. //Nature, 2003. V 425. P. 78-81.

71. Kim J.S., Sapkota K., Park S.E., Choi B.S., Kim S., Hiep N.T., Kim C.S., Choi H.S., Kim M.K., Chun H.S., Park Y., Kim S.G. A Fibrinolytic enzyme from the Medicinal Mushroom Cordyceps militaris. //J. of Microbiology, 2006. V. 44(6). P. 622-631.

72. Kimura M.T. Evolution of food preferences in fungus-feeding Drosophila: an ecological study. //Evolution, 1980. V. 34. P. 1009-1018.

73. Koelsch G., Tang J., Loy J., Monod M., Jackson K., Foundling S., Lin X. Enzymic characteristics of secreted aspartic proteases of Candoda albicans. // Biochim. Biophys., 2000. V. 1480. P. 117-131.

74. Kucera M.J. Protease inhibitor of Galleria mellonella acting on the toxic protease from Metarhizium anisopliae. //J. of Invert. Pathol., 1980. V. 35. P. 304-310.

75. Kudryavtseva O.A., Dunaevskii Ya.E., Kamzolkina O.V., Belozerskii M.A. Fungal proteolytic enzymes: features of the extracellular proteases of xylotrophic Basidiomycetes. // Microbiology, 2008. V. 77(6). P. 643-653.

76. Lapeyrie F. Oxalate synthesis from soil bicarbonate by the mycorrhizal fungus Paxillus involutus. II Plant Soil, 1988. V. 110 (1). P. 3-8.

77. Lawrence J.F. & Milner RJ. Associations between Arthropods and Fungi. // Fungi of Australia IB., 1996. P. 137-202.

78. Leake J.R., Read D.J. Proteinase activity in mycorrhizal fungi III. // New Phytol., 1991. V. 117. P. 309-317.

79. Lee H., Kim Y.J., Kim H.W., Lee D.H., Sung M.K., Park T. Induction of Apoptosis by Cordyceps militaris through Activation of Caspase-3 in Leukemia HL-60 Cells. // Biol. Pharm. Bull., 2006. V. 29 (4). P. 670-674.

80. Lilly W.W., Stajich J.E., Pukkila P.J., Wilke S.K., Inoguchi N. Gathman A.C. An expanded family of fungalysin extracellular metallopeptidases of Coprinopsis cinerea. // Mycol. Res., 2007. V. 112. P. 389-398.

81. Maccheroni W.J., Araujo W.L., Azevedo L.J., Ambient pH regulated enzyme secretion in endophytic and pathogenic isolates of the fungus genus Colletotrichum II Sci. Agr., 2004. V. 61 (3). P. 298-302.

82. Madzak C.S., Blanchin-Roland R.R., Cordero O., Gaillardin C. Functional analysis of upstream regulating regions from the Yarrowia lipolytica XPR2 promoter. // Microbiology, 1999. V. 145. P. 75-87.

83. Marzluf G.A. Genetic regulation of nitrogen metabolism in the fungi. // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1997. V. 61. P. 17-32.

84. Mc Henry J.Z., Christeller J.T., Slade E.A., Laing W.A. The major extracellular proteinases of the silverleaf fungus, Chondrostereum purpureum, are metalloproteinases. // Plant. Pathol., 1996. V. 45. P. 552-563.

85. North M.J. Comparative biochemistry of the proteinases of eukaryotic microorganisms. // Microbiological reviews, 1982. V. 46. P. 308-340.

86. Nehls U., Bock A., Einig W., Hampp R. Excretion of two proteases by the ectomycorrhizal fungus Amanita muscaria. II Plant, Cell and Environment, 2001. V. 24. P. 741747.

87. Olding-Smee J., Laland K., Feldman M. Niche Construction: The Neglected Process in Evolution. // Princeton University Press, 2003.468p.

88. Oliveira A.S., Xavier-Filho J., Sales M.P. Cysteine proteinases and cystatins. // Brazil. Arch. Biol. Technol., 2003. V. 46 (1). P. 91-104.

89. Ortius-Lechner D., Maile R., Morgan E.D., Boomsma J.J. Metapleural gland secretion of the leaf-cutter ant Acromyrmex octospinosus: New compounds and their functional significance. //J. Chem. Ecol., 2000. V. 26 (7). P. 1667-1683.

90. Ortoneda M., Guarro J., Madrid M.P. Fusarium oxysporum as a multihost model for the genetic dissection of fungal virulence in plants and mammals. // Infect. Immun., 2004. V. 72. P. 1760-1766.

91. Park B.T., Na K.H., Jung E.C., Park J.W., Kim H.H. Antifungal and Anticancer Activities of a Protein from the Mushroom Cordyceps militaris. // Korean J. Physiol. Pharmacol., 2009. V. 13 (1). P. 49-54.

92. Paterson L.C., Charnley K.A., Cooper R.M., Clarkson J.M. Specific induction of a cuticle degrading protease of the insect pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. II Microbiology, 1994. V. 140(1). P. 185-189.

93. Penalva M.A., Tilburn J., Bignell E., Arst H.N.J. Ambient pH gene regulation in fungi: making connections. // Trends. Microbiol., 2008. V. 16 (6). P. 291-300.

94. Polgar L. Common future of the four types protease mechanism. // Biol.Chem. Hoppe-Seyler, 1990. V. 371, Suppl. P. 327-331.

95. Proteolytic enzymes. A practical approach. Edited by Beynon R.J., Bond J.S. Oxford University Press. 2001. 341 p.

96. Protein purification techniques: a practical approach. Ed. by Roe S. Oxford University Press, 2001. 262 pp.

97. Rawlings N.D., Morton F.R., Kok C.Y., Kong J., Barrett A.J. MEROPS: the peptidase database. //Nucl. Ac. Res., 2008. V. 36. P. 320-325.

98. Rawlings N.D., Barrett A.J. Evolutionary families of peptidases. // Biochemical Journal, 1993. V. 290. P. 205-218.

99. Rohini G., Murugeswari P., Prajna N.V., Lalitham P., Muthukkaruppan V. Matrix metalloproteases (MMP-8, MMP-9) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP-1, TIMP-2) in patients with fungal keratits. // Cornea, 2007. V. 26 (2). P. 207-211.

100. Ronhede S., Boomsma J.J., Rosendahl S. Fungal enzymes transferred by leaf-cutting ants in their fungus gardens. // Mycol. Res., 2004. V. 108. P. 101-106.

101. Rouland-Lefevre C., Inoue T., Johjima T. Termitomyces / termite interactions. // In: Konig H, Varma A, eds. Intestinal microorganisms of soil invertebrates. 2006. Springer-Verlag. P 335-350.

102. Ruchel R., Boning B., Borg M. Characterization of a secretory proteinase of Candida parapsilosis and evidence for the absence of the enzyme during infection in vitro. II Infect. Immun., 1986. V. 53. P. 411-419.

103. Sabotic J., Trcek T., Popovic T., Brzin J. Basidiomycetes harbor a hidden treasure of proteolytic diversity. // J. Biotechnol., 2006. V. 128. P. 297-307.

104. St. Leger R.J., Cooper R.M., Charnley A.K. Cuticle-degrading enzymes of Entomopathogenic Fungi: Cuticle Degradation in Vitro by Enzymes from enthomopathogens.// J. of Invertebrate Pathology, 1986b. V. 47. P. 167-177.

105. St. Leger R.J., Cooper R.M., Charnley A.K. Cuticle-degrading enzymes of entomopathogenic fungi: mechanisms of interaction between pathogen enzymes and insect cuticle.//J. of Invertebrate Pathology, 1986c. V. 47. P. 295-302.

106. St. Leger R.J., Joshi L., Roberts D. Ambient pH is a major determinant in the expression of cuticle-degrading enzymes and hydrophobin by Metarhizium anisopliae.U Appl Environ Microbiol., 1998. V.64, (2). P. 709-713.

107. St. Leger R.J., Nelson J.O., Screen S.E. The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae alters ambient pH, allowing extracellular protease production and activity. Microbiology, 1999. V. 145. P. 2691-2699.

108. Sumantha A., Sandhya C., Szakacs G., Soccol S.R., Pandey A. Production and partial purification of a neutral metalloprotease by fungal mixed substrate fermentation. // Food Technol. Biotechnol., 2005. V. 43. P. 313-319.

109. Tavare L. Some probabilistic and statistical problems on the analysis of DNA sequences. Lectures Mathematics Life Sciences, 1986. V.17. P. 57-86.

110. Tavares I.I. The Laboulbeniales and their arthropod hosts. // In: Insect-fungus symbiosis: nutrition, mutualism, and commensalism (BATRA L. R., Ed.).-John Wiley and Sons, New York, USA. 1979. P. 229-258.

111. Tavares, I.I. Laboulbeniales (Fungi, Ascomycetes). // Mycologia Memoir., 1985. V.9. P. 1-627.

112. Terashita Т., Inoue Т., Nakaie Y., Yoshikawa K., Shishiyama J. Isolation and characterization of extra- and intra-cellular metal proteinases in the spawn-running process in of Hypsizygus marmoreus. // Mycoscience, 1997. V. 38. P. 243-245.

113. Terachita Т., Nakaie Y., Yoshikawa K., Shishiyama J. Purification and some protperties of an isoform of metal proteinases from Hypsizygus marmoreus grown on sawdust culture. // Mycoscience, 1998. V. 39 (4). P. 471-474.

114. Thaxter R. Contribution towards a monograph of the Laboulbeniaceae. II Mem. Amer. Acad. Arts Sci., 1896. V. 12. P. 187-429.

115. Thaxter R. Contribution towards a monograph of the Laboulbeniaceae. Part II. // Mem. Amer. Acad. Arts Sci., 1908. V. 13 P. 217-469.

116. Thaxter R. Contribution towards a monograph of the Laboulbeniaceae. Part III. // Mem. Amer. Acad. Arts Sci., 1924. V. 14. P. 309-426.

117. Thaxter R. Contribution towards a monograph of the Laboulbeniaceae. Part IV. // Mem. Amer. Acad. Arts Sci., 1926. V. 15. P. 427-580'.

118. Thaxter R. Contribution towards a monograph of the Laboulbeniaceae. Part V. // Mem. Amer. Acad. Arts Sci., 1931. V. 16. P. 1^135.

119. Thomas K.C., Hynes S.H., Ingledew W.M. Influence of medium buffering capacity on inhibition of Saccharomyces cerevisiae growth by acetic and lactic acids. // Appl Environ. Microbiol., 2002. V. 68 (4). P. 1616-1623.

120. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. //Nucl. Ac. Res. 1994. V. 22. P. 4673-4680.

121. Togni G., Sanglard D., Falchetto R., Monod M. Isolation and nucleotide sequence of the extracellular acid protease gene (ACP) from the yeast Candida tropicalis. II FEBS Lett., 1991. V. 286. P. 181-185.

122. Tudzynski B., Liu S., Kelly J.M. Carbon catabolite repression in plant pathogenic fungi: isolation and characterization of the Gibberella fujikuroi and Botrytis cinerea ere A genes. // FEMS Microbiology Letters, 2000. V. 184. P. 9-15.

123. Ueda M., Kubo T., Miyatake K., Nakamura T. Purification and characterization of fibrinolytic alkaline protease from Fusarium sp. // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007. V. 74(2). P. 331-338.

124. Urtz B.E., Rice W.C. Purification and characterization of a novel extracellular protease from Beauveria bassiana. II Mycological Reseach, 2000. V. 104. P. 180-186.

125. Vellinga E.C. Ecology and distribution of Lepiotaceous fungi (Agaricaceae) — A rewiew. Nova Hedwigia, 2004. V. 78. P. 273-299.

126. Vo T.L., Mueller U.G., Mikheyev A.S. Free-living fungal symbionts (Lepiotaceae) of fungus-growing ants (Attini: Formicidae). // Mycologia, 2009. V. 101(2). P. 206-210.

127. Walsh P.S., Metzger D.A., Higuchi R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. //BioTech. 1991. V.10. P. 506-513.

128. Watanabe K., Hayano K. Estimate of the source of soil protease in upland fields. // Biol. Fertil. Soils, 1994. V. 18. P. 341-346.

129. Wiebe M.G. Stable production of recombinant proteins in filamentous fungi problems and improvements. //Mycologist, 2003. V. 17. P. 140-144

130. Wlodawer A. Proteasome: a complex protease with a new fold and a distinct mechanism. // Curr. Biol., 1995. V. 3. P. 417-420.

131. Xu F, Huang J.B., Juang L., Xu J., Mi J. Amelioration of cyclosporin nephrotoxicity by Cordyceps sinensis in kidney transplanted recipients.// Nephrol. Dial. Transplant., 1995, V. 10, №1, P. 142-143.

132. Xu J., Baldwin D., Kindrachuk C., Hegedus D.D. Comparative est analysis of a Zoophthora radicans isolate derived from Pieris brassicae and an isogenic strain adapted to Plutellaxylostella. //Mycrobiol., 2009. V. 155 (1). P. 174-185.

133. Yong R.N. Geoenvironmental engineering, contaminated soils, pollutant fate, and mitigation. CRS Press, 2001. 307 pp.

134. Yoo H.S., Shin J.W., Cho J.H., Son C.G., Lee Y.W., Park S.Y., Cho C.K. Effects of Cordyceps militaris extract on angiogenesis and tumor growth. // Acta Pharmacol. Sin., 2004. V. 25(5). P. 657-665.