Использование биологического ресурса энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae (Metch.) Sor. для регуляции численности колорадского жука

Малярчук, Анастасия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование биологического ресурса энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae (Metch.) Sor. для регуляции численности колорадского жука
ВАК РФ 03.00.32, Биологические ресурсы

Автореферат диссертации по теме "Использование биологического ресурса энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae (Metch.) Sor. для регуляции численности колорадского жука"

oü3463925 На правах рукописи

Малярчук Анастасия Александровна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО РЕСУРСА ЭНТОМОПАТОГЕННОГО ГРИБА METARHIZIUM ANISOPLIAE (МЕТСН.) SOR. ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ ЧИСЛЕННОСТИ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА

03.00.32 - биологические ресурсы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2009

003463925

Работа выполнена на кафедре биологической защиты растений в ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет»

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Штерншис Маргарита Владимировна

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Коробов Виктор Александрович

Новосибирский государственный аграрный университет

доктор биологических наук Данилова Альбина Афанасьевна

Сибирский научно-исследовательский инсти"п , земледелия и химизации СО РАСХН

Ведущая организация: Томский государственный университет

Защита состоится «г/ » ^т^ии 2009 г. в Ж. часов на заседании диссертационного совет^ Д 220.048.04 при Новосибирском государственном аграрном университете по адресу: 630039, Новосибирск, ул. Добролюбова, 160.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» (www.nsau.edu.rj).

Автореферат разослан

¿6

; 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Среди природных ресурсов регуляции численности вредных видов насекомых, повреждающих сельскохозяйственные и лесные культуры, особого внимания заслуживают энтомопато-генные грибы. Они обитают в почве, на растениях, в телах насекомых. Периодически эти биологические агенты вызывают вспышки массовых заболеваний насекомых, что приводит к резкому подавлению их численности, сохраняя урожай. Однако возникновение эпизоотий в большой степени зависит от абиотических и биотических факторов внешней среды и случается не столь часто, как это требуется для подавления численности насекомых-фитофагов, являющихся конкурентами человека в потреблении растительной пищи. Поэтому более важна интродукция выделенных из природы энтомопатогенных грибов в агроценозы с целью сохранения урожая от фитофагов. Первым в мире энтомопатогенный гриб Metarhizium anisopliae (Metch.) Sor. выделил из природы и предложил размножить для внесения в агроценозы известный российский ученый И.И.Мечников (1902). Этим было положено начало микробиологическому методу регуляции численности насекомых, распространившемуся по всему миру. Впоследствии энтомопа-тогенные грибы, относящиеся к отделам Deuteromycota и Zygomycota, стали основой биопрепаратов, предложенных для биологического контроля насекомых в разных странах. На основе природных штаммов энтомопатогенных грибов в нашей стране были разработаны биопрепараты Боверин на основе гриба Beauveria bassiana Bals. Vuil., Вертициллин на основе Ver-ticillium lecanii Nees. (LecaniciHium sp.), Пириформин на основе Ento-mophthora piryformis (Petch) Hall et Bell (Conidiobolus thromboses) и другие.

Таким образом, энтомопатогенные грибы являются биологическим ресурсом, вовлекаемым в хозяйственную деятельность, поддерживающим биосферный баланс и имеющим оздоровительное значение (замена токсичных синтетических инсектицидов на биологические, основанные на изъятых из природы агентов). Современная трактовка понятия «биологические ресурсы» ставит задачи расширения биоресурсной базы и развития биотехнологий, оптимизирующих управление ресурсами природных и искусственно созданных биосистем.

Что касается препарата на основе гриба Metarhizium anisopliae, предложенного И.И.Мечниковым, то его производство было прекращено в начале XX в. и с тех пор в России нет энтомопатогенного препарата на основе этого гриба. К возможным причинам неудач при разработке и применении препарата относятся недооценка изменчивости штаммов, отсутствие методов повышения биоресурса гриба как путем усиления вирулентности, так и преодоления негативного влияния факторов окружающей среды. В то же время реализация биологического ресурса Metarhizium anisopliae актуальна для подавления численности особо опасных вредителей сельского хозяйства. Среди особо опасных фитофагов в последние годы в Сибири широкое распространение получил колорадский жук. Подавление численности этого вредителя биологическими препаратами, безопасными для окружающей среды, является чрезвычайно актуальной задачей. По-

этому исследования по биоресурсному потенциалу гриба, включающие селекцию природных штаммов, оценку вирулентности гриба и его продуктивности, необходимы для разработки биопрепарата на его основе.

Цель работы - изучить возможности повышения биоресурсного потенциала гриба Metarhizlum anisopliae и его рационального использования как основы для разработки биопрепарата, подавляющего численность колорадского жука.

Задачи исследований:

1. Изучить гетерогенность популяций природных штаммов гриба Metarhizium anisopliae по культуральным, морфологическим, биохимическим и вирулентным признакам.

2. Оценить вирулентность природных и полученных методом селекции на основе спонтанной изменчивости штаммов гриба по отношению к насекомым.

3. Определить продуктивность штаммов в разных условиях выращивания биомассы.

4. Оценить устойчивость исходных штаммов и морфоваров гриба к абиотическим факторам (температуре и ультрафиолетовому облучению).

5. Выявить защитный эффект антиоксидантов при хранении и ультрафиолетовом облучении гриба М.anisopliae.

6. Определить эффективность энтомопатогенного гриба в подавлении численности колорадского жука в полевых условиях.

Защищаемые положения:

1. Наличие спонтанной изменчивости природных изолятов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae позволяет получать высокоактивные и стабильные формы гриба путем отбора по признакам вирулентности и ферментативной активности.

2. Повышение биоресурса гриба обеспечивается методами его селекции, оптимизации условий культивирования, учетом влияния абиотических факторов, в первую очередь ультрафиолетового облучения.

3. Штамм гриба М. anisopliae р-72-1, обладающий наиболее высокими показателями протеазной, эстеразной, липазной, амилазной и хитиназ-ной активностей и наибольшей биологической активностью может быть использован в качестве основы препарата для биологического контроля колорадского жука.

Научная новизна. Впервые детально изучено влияние спонтанной изменчивости природных штаммов энтомопатогенного гриба М.anisopliae, выделенных из двух видов насекомых: колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say.) и реликтового усача (CaHipogon relictus Saw.), на морфологические (структура, скорость роста колоний, размер конидий) и биохимические (ферментативная активность) признаки. Наличие спонтанной изменчивости у природных штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-б9р служит базовым фактором управления их биоресурсом. Установлены критерии оценки высоковирулентных и продуктивных штаммов, основанные на биотестах и определении их ферментативной активности. Определено влияние абиотических факторов - температуры и ультрафиолетового света - на сохранность и биологическую эффективность штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-

69р и их морфологических вариантов в процессе длительного хранения биомассы. Продемонстрировано негативное влияние ультрафиолетового облучения на биоресурс гриба М. апторНае. Разработана технология производства биомассы энтомопатогенного гриба Metarh¡zium ап'^орНае (штаммов р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов) с целью дальнейшего использования биологического ресурса гриба в открытых экосистемах в качестве агента регуляции численности насекомых-фитофагов. Для рационального использования биологического ресурса гриба отобран штамм Metarhizium апкорНае р-72-1, оптимизированный по показателям продуктивности, ферментативной активности, вирулентности по отношению к колорадскому жуку - опасному вредителю картофеля.

Практическая значимость. Для селекции высокоактивных и стабильных форм из естественной популяции гриба М. ашБорИае предложен метод ступенчатого отбора из моноспоровых рассевов энтомопатогена. Отбор штамма по морфологическим и биохимическим критериям позволяет повысить биологический ресурс гриба как агента биологической регуляции насекомых. Рекомендуется использовать штамм Metarh¡z¡um апкорНае р-72-1 как основу биопрепарата для биологического контроля колорадского жука.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены:

- на Международной научно-практической конференции молодых ученых, (Новосибирск, 2006);

- на Международной научно-практической конференции (Костин-брод, Болгария, 2006);

- на 40 коллоквиуме по патологии насекомых и микробному контролю (Квебек, Канада, 2007);

- на Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений, перспективы и роль в фитосанитарном оздоровлении агроценозов и получении экологически безопасной сельскохозяйственной продукции (Краснодар, 2008).

Публикации по теме диссертации. Всего по теме диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, из них 4 в изданиях, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, списка литературы и приложения. Работа изложена на 132 страницах, содержит 14 рисунков, 15 таблиц. Список литературы включает 205 источников, из них 107 - на иностранном языке.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, доктору биологических наук, профессору М.В. Штерншис, директору ООО Научно-производственная фирма «Исследовательский центр» А. И. Леляк за предоставление лабораторной базы для проведения опытов и ценные замечания, а также кандидату биологических наук В. В. Сереброву за помощь в проведении экспериментов и в обсуждении работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований

В работе были использованы природные штаммы энтомопа.тогенного гриба Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. p-72 и 85-69p. Штаммы были получены из коллекции культур Института систематики и экологии животных СО РАН.

В качестве тест-объектов для оценки биологической эффективности штаммов М. anisopliae в лабораторных условиях использовали гусениц пчелиной огневки Gallería melonella лабораторной популяции и личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata природной популяции..

С целью наработки спорово - мицелиальной массы гриба использовали методы глубинного культивирования и культивирования на стерильном плотном субстрате (пшене).

В экспериментах по определению сроков хранения биомассы и изучению влияния ультрафиолетового облучения (УФО) были использованы антиоксиданты ионол и тирозол, предоставленные Институтом органической химии СО РАН.

Для селекции гриба использовали метод спонтанной изменчивости. Для оценки стабильности морфоваров их культивировали в течение пяти вегетативных пассажей. Морфологию вновь полученных изолятов оценивали по окраске и форме колоний, размерам колоний и скорости роста мицелия на питательных средах. Кроме этого, в качестве показателей изменчивости изучали изменения ферментативной активности полученных морфологических вариантов и их вирулентности.

Для проведения пассажей штаммов р-72 и 85-б9р энтомопатогенного гриба М. anisopliae через живой организм использовали гусениц пчелиной огневки Gallería mellonella.

Эстеразную активность штаммов гриба определяли спектрофотомет-рическим методом. Протеазную активность оценивали по гидролизу казеина на среде, содержащей 0,5% стерильного обезжиренного молока. Ами-лазную активность оценивали по гидролизу водорастворимого крахмала на среде, содержащей 0,2% данного субстрата. Для определения липазной активности использовали две среды: с твином - 80 и оливковым маслом. Хитиназную активность оценивали на среде с коллоидным хитином.

Для оценки антиоксидантов как протекторов от УФО в нативную суспензию спор гриба добавляли ионол и тирозол в количестве, необходимом для получения концентрации 0,15%. Облучение вели в стационарном состоянии в темном боксе ультрафиолетовым светом. О влиянии УФО на каждый штамм и о защитных свойствах добавленных антиоксидантов судили по выживаемости спор. Для определения сроков хранения экспериментальных препаратов на основе М. anisopliae использовали две препаративные формы: жидкую биомассу и сухой споровый порошок. В качестве возможных защитных соединений, способных увеличить сохранность штаммов р-72 и 85-69р энтомопатогенного гриба М. anisopliae и их морфологических вариантов, использовали антиоксиданты ионол и тирозол. Образцы хранили при температурах: -20 °С, +6 °С, +20 °С. Частоту высевов кор-

ректировали в соответствии с получаемыми результатами. Определяли жизнеспособность спор и биологическую активность препаратов. Заражение производили путем нанесения суспензии спор гриба исследуемых концентраций на личинок. Учет гибели насекомых проводили ежедневно, начиная с первых суток после инокуляции.

Для оценки биологического ресурса гриба M. anisopliae как агента биологического контроля численности колорадского жука проводили полевые опыты на посадках картофеля в хозяйстве ЗАО "Шигаевское" Сузун-ского района Новосибирской области в 2005 - 2007 гг. В полевом эксперименте использовался картофель сорта Романо и водные суспензии конидий энтомопатогенного гриба M. anisopliae в двух концентрациях: 1х107 и 5х107 КОЕ/мл. Ловторность 4-кратная. Площадь учетной делянки 100 м2. Учет гибели личинок колорадского жука проводили на 3, 5, 7 и 10 сутки. Биологическую эффективность оценивали по формуле Аббота.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Факторы вирулентности энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae, определяющие его биологический ресурс

Энтомопатогенные грибы как природные агенты регуляции численности насекомых - фитофагов являются важным биологическим ресурсом, обеспечивающим сохранение биоразнообразия как в естественных биоценозах, так и при использовании их как биологического средства защиты растений в агроценозах. Для рационального использования энтомопатогенного гриба M. anisopliae требуются исследования, которые позволят повысить его ресурс как природного агента регуляции численности фитофагов. В этом отношении обращает на себя внимание явление спонтанной изменчивости, наблюдаемое у энтомопатогенных грибов. В ряде работ было показано, что одним из возможных механизмов, обусловливающих изменение вирулентных свойств энтомопатогенных грибов, может быть спонтанная изменчивость (Алешина и др., 1972; Хашимова; Тансыкбаева, 1985; Митина и др., 1997; Огарков, Огаркова, 2000; Гештовт, 2002; Frigo, Azevedo, 1986). Изучение этого явления необходимо для разработки методологических основ селекции штаммов и способов сохранения их свойств в течение длительного времени. С другой стороны, процессы спонтанной изменчивости происходят и в природных агроценозах, поэтому изучение спонтанной изменчивости может приблизить нас к пониманию механизмов возникновения эпизоотий в популяциях насекомых, во время которых наиболее ярко проявляется биологический ресурс гриба, играющего важную роль в сохранении биоразнообразия.

В связи с этим нами были проведены эксперименты по изучению в лабораторных условиях морфологических, биохимических и вирулентных свойств природных штаммов энтомопатогенного гриба M. anisopliae с целью разработки критериев отбора наиболее вирулентных изолятов для управления этим биоресурсом.

1.1 Выделение первичных спонтанных изолятов и изучение их морфологии

Для подтверждения существования спонтанной изменчивости у эн-томопатогенного гриба М. anisopliae мы провели клоновый отбор изолятов от двух природных штаммов: р-72 и 85-69р. Полученные варианты были разделены по морфологии колоний при росте на питательных средах Са-буро и Чапека на несколько групп. В ходе работы нами выделено и изучено 230 моноспоровых изолятов штамма р-72 и 250 моноспоровых изолятов штамма 85-б9р. Анализ культурально - морфологических особенностей выделенных изолятов показал, что штаммы энтомопатогенных грибов дифференцируются на два типа морфоваров. Морфовары исходного штамма р-72 обозначены нами как р-72-1 и р-72-2, штамма 85-69р как 85-б9р-1 и 85-69р-2.

Штамм р-72-1 - поверхность колонии порошисгая, цвет воздушного мицелия темно - зеленый с идущими от центра колонии к периферии кольцами зелено - желтого цвета, цвет субстратного мицелия - желто -зеленый, .воздушный мицелий развит слабо, граница колонии ровная, центр приподнятый в виде бугорка мицелия пепельно - серого цвета. Спо-роношение обильное.

Штамм р-72-2 - поверхность колонии шероховатая, пушистая, по периферии порошистая, консистенция мягкая, цвет воздушного мицелия желтовато - бледно - серый, воздушный мицелий развит хорошо, колония пушистая, граница колонии ровная, центр колонии плоский. Спороноше-ние слабое.

Штамм 85-б9р-1 - колонии зеленовато-серые или желтовато-серые, поверхность порошистая, с обильным спороношением.

Штамм 85-69р-2 - поверхность колонии полностью покрыта белым или желтоватым ватообразным мицелием. Таким образом, было выделено два основных типа колоний - с пушистой и порошистой структурой.

Было показано, что 55% моноспоровых изолятов штамма р-72 принадлежит к типу р-72-1, а 45% - к типу р-72-2. Соотношение морфоваров для штамма 85-69р составило 46 и 54%, соответственно. Все морфовары оказались стабильными и сохраняли исходные характеристики при многократных пересевах на питательных средах. Таким образом, выделенные варианты различались структурой, цветом колоний и интенсивностью спо-роношения. Подобные данные были получены рядом авторов, изучавших спонтанную изменчивость энтомопатогенных и фитопатогенных грибов (Кузнецов, Новикова, 1967; Лохвицкая, 1968; Шмотина, Горленко, 1970; Рудакова, Лепихова, 1974).

В качестве критериев для дальнейшего изучения изолятов были выбраны: размер конидий, скорость роста на различных питательных средах, а также ферментативная активность.

Результаты определения размеров конидий на питательных средах представлены на рисунке 1.

Для большинства морфологических вариантов штаммов р-72 и 85-69р не было отмечено статистически достоверных различий между сред-

ними размерами конидий. Однако конидии морфовара р-72-1 достоверно отличались от родительского штамма р-72 по длине и ширине.

При оценке различий в скорости роста колоний наибольшей интенсивностью роста обладал вариант р-72-1, в то время как родительский штамм р-72 и второй вариант р-72-2 отставали в росте в среднем на 6 ■ дней. Среди вариантов штамма 85-69р наибольшей скоростью роста облагал вариант 85-69р-2, от которого родительский штамм отставал по времени на 4 дня.

Таким образом, среди отобранных морфологических вариантов наиболее быстрорастущими оказались варианты р-72-1 (исходный штамм р-72) и 85-69р-2 (исходный штамм 85-б9р).

И Ширина конидии SДлина конидии

размер конидии, мкм

Рисунок 1. Размер конидий штаммов и морфовароз М. anisopliae

1.2 Ферментативная активность изолятов

Рядом авторов показано, что вирулентность энтомопатогенных грибов тесно связана с ферментативной активностью (Павлюшин, 1979; Пав-люкова с соавт., 1998; Rosato, Messias, Azevedo, 1989; McHenry, 1996;). Этот биохимический критерий важен для оценки штаммов и морфоваров энтомопатогенного гриба как биологического ресурса.

Нами была изучена ферментативная активность отобранных вариантов и исходных штаммов энтомопатогенного гриба М.anisopliae. Результаты представлены в таблице 1.

Результаты показали, что морфологически разные варианты отличаются и по ферментативной активности. Среди них есть морфовары как с повышенной по отношению к родительским штаммам, так и с пониженной ферментативной активностью. Так, например, более высокие показатели по всем видам ферментативной активности оказались у варианта р-72-1 по сравнению с р-72: протеолитическая активность превышала аналогичную родительского штамма в 2,4 раза, эстеразная активность - в 2,1 раза, ли-пазная - в 3,7 раза, амилазная - в 1,4 и хитиназная - в 1,3 раза. Следует отметить, что штаммы и морфовары с большей ферментативной активностью

оказались более вирулентными нежели те, ферментативная активность которых была ниже, что подтверждает важную роль ферментов в патологическом процессе, вызываемом М. атворНае. Корреляционный анализ показал наличие высокой (с коэффициентом выше 80) положительной корреляции эстеразной, амилазной и хитиназной активностей с вирулентностью изученных штаммов и средней (с коэффициентами 66 и 73) положительной корреляции липазной и протеазной активностей с вирулентностью. Так, морфовар р-72-1, вызывающий наибольший процент смертности личинок колорадского жука, обладал максимальной среди проанализированных штаммов продукцией экстрацеллюлярных ферментов изученных групп. Штамм 85-69 и его морфовары 1 и 2 имели промежуточные по числовому значению показатели ферментативной активности, равно как и уровень вирулентности, находившийся в пределах 41 - 47,4%.

Таблица 1. Ферментативная активность штаммов и морфологических вариантов М. ап1БорНае

Штамм Смертность личинок колорадского жука, % Фе рментативная активность

Протеаз-ная* Эстераз-ная** Липаз-ная* Амилаз-ная* Хитиназ-ная**

Р-72 90 5 0,381 3 17 61

р-72-1 97 12 0,784 11 24 80

р-72-2 52 4 0,107 3 8 • 23

85-69р 47 4 0,082 3 10 25

85-69р-1 41 7 0,079 6 12 20

85-69р-2 4В 4 0,049 4 9 21

HCPos 47,4 2,900 0,052 2,800 3,700 18,500

г - 73 92 66 89 97

Примечание: * - зона лизиса специфического субстрата, мм; ** - единицы активности в 1 мл культуральной жидкости.

1.3 Влияние абиотических факторов на жизнеспособность культуры гриба M. anisopliae

Энтомопатогенные грибы, являясь компонентом природных биоценозов, подвергаются влиянию различных абиотических факторов окружающей среды (температуры, влажности, солнечной радиации и др.). Для повышения биологического ресурса микроорганизмов, используемых в качестве регуляторов численности насекомых, необходимо защищать их от отрицательного влияния факторов окружающей среды, таких, как солнечное излучение и окислительные процессы (Зенков с соавт., 2001, David et al., 1986).

1.3.1 Жизнеспособность культуры гриба при хранении в жидком и сухом виде

Для изучения сохранности культур гриба М. атворНае в жидком и сухом виде при различных температурных условиях использовали морфологический вариант р-72-1, показавший наибольшую ферментативную активность. Учитывая отсутствие постоянных оптимальных температур в полевых условиях для выживания энтомопатогенного гриба М. ат'БорНае при изучении сохранности в лабораторном эксперименте были взяты граничные положительные и отрицательные температурные значения +20 °С и -20 °С, а также промежуточная средняя температура +6 °С. В качестве контроля использовали жидкую и сухую культуру гриба, размноженную на питательных средах. Общий срок хранения культур при заданных температурах составил 20 месяцев. Для изучения возможности продления срока хранения в качестве защитных компонентов использовали антиоксиданты ионол и тирозол.

В результате показано, что ионол и тирозол в концентрациях 0,15 и 0,30% перспективны для использования в качестве веществ, позволяющих сохранить жизнеспособность спор гриба М. ап/ворНае в суспензии в условиях низких отрицательных температур (-20 °С). При хранении суспензии спор гриба в условиях комнатной (+20 °С) температуры наиболее эффективным для сохранения жизнеспособности спор на первоначальном (до хранения) уровне оказалось добавление тирозола в концентрации 0,30%.

В отличие от суспензии, споры в сухом виде имеют большую жизнеспособность. Так, в процессе хранения образцов сухой споровой массы при температурах +6, - 20 и +20 °С их жизнеспособность оставалась на одном уровне в контроле и опытных вариантах. Следовательно, добавление антиоксидантов нецелесообразно, если препарат предполагается хранить при указанных температурах в сухом виде.

1.3.2 Выживаемость спор гриба под действием УФ-облучения

Солнечная радиация, главным образом ультрафиолетовое излучение, самый мощный фактор инактивации энтомопатогенных грибов при сохранении их во внешней среде. Результаты опытов по влиянию ультрафиолетового облучения на выживаемость конидий М. ап^орНае показали, что при жестком модельном УФО жизнеспособность конидий природных штаммов и их морфоваров резко снижается. Так, через 1 мин после УФО осталось около 60% жизнеспособных конидий для штамма 85-б9р и его морфоваров (рис. 2) и около 80% жизнеспособных конидий для штамма р-72 и его морфоваров. Через 3 мин в первом случае произошло снижение жизнеспособности конидий не менее чем в 5 раз, а во втором - не менее чем в 2,5 раза по сравнению с исходными значениями. Почти не осталось жизнеспособных спор через 5 и 7 мин соответственно для штаммов 85-б9р и р-72. Это означает, что восприимчивость к УФО более высока для штамма 85-б9р и его морфоваров по сравнению с р-72 с соответствующими морфоварами. С другой стороны, выявились некоторые различия в устойчивости исходных штаммов и морфоваров с разной структурой колоний.

13 5 7

время облучения, мин

Рисунок 2. Выживаемость конидий М. ат'ворНае при облучении суспензии ультрафиолетовыми лучами без добавок

1 3 5 7 10

время облучения, мин

Рисунок 3. Выживаемость конидий М. апкорНае при облучении суспензии ультрафиолетовыми лучами с добавлением 0,1 5% тирозола

Так, через 1 мин после УФО осталось 80% жизнеспособных конидий морфовара р-72-1 с пушистой структурой и лишь 63% морфовара р-72-2 с порошистой структурой.

В случае со штаммом 85-69р и его морфоварами эти различия несущественны. Полученные данные позволили сделать заключение о том, что восприимчивость к ультрафиолетовому свету более высока для штамма 85-69р и его морфоваров по сравнению со штаммом р-72 с соответствующими морфоварами. Это явление можно объяснить тем, что конидии штамма р-72 и его морфоваров насыщены темным меланиновым пигментом, что, как известно, является основной причиной высокой устойчивости пигментированных микроорганизмов к ультрафиолетовому излучению.

При добавлении в суспензию антиоксиданта наблюдали полный или частичный защитный эффект от УФО. Так, для М. ат'БорНае 85-69р (рис.2, 3) через 1 мин облучения без антиоксиданта осталось 60% жизнеспособных спор, а при добавлении тирозола наблюдали практически полное сохранение жизнеспособности спор. Для р-72-1 с добавлением антиоксиданта через 7 мин после УФО сохранялось в 10 раз больше спор, чем при облучении без добавления антиоксиданта.

Таким образом, тирозол и ионол в концентрации 0,15% одновременно могут выполнять две функции: не только увеличивать срок хранения энтомопатогенного гриба М. ап1эорИае, но и служить протекторами от УФ-облучения.

2. Воспроизводство и рациональное использование энтомо-патогенного гриба М. ап1зорИае как агента регуляции численности колорадского жука

2.1 Оптимизация наработки биомассы гриба как основы биологического препарата

Воспроизводство энтомопатогенных грибов предполагает разработку способов их культивирования (Огарков, 1979; Третьяков, 1995). Нами проведено сравнение двух способов получения биомассы: жидкостной ферментации на питательной среде и выращивания культуры гриба на стерильной смеси пшена с отрубями.

В результате проведенных экспериментов установлено, что метод культивирования на пшене не уступает методу глубинного культивирования гриба М. ат'БорНае по продуктивности спорово - мицелиальной массы и титру жизнеспособных конидий, хотя является более трудозатрэтным. Однако при разработке технологии производства инсектицидных биопрепаратов на основе грибов наиболее значимым параметром является сохранение жизнеспособности действующего начала препарата и его биологической активности в течение определенного времени хранения. Спорово -мицелиальная масса, полученная методом жидкостного культивирования, имеет весьма низкую сохранность и быстро (в течение 3 месяцев) снижает свою биологическую активность на 2 - 3 порядка. В связи с чем второй апробированный способ культивирования (на стерильном растительном субстрате) является более целесообразным для наработки биомассы энто-мопатогенного гриба М. ап/БорНае.

2.2 Оценка инсектицидной активности природных штаммов и мор-фоваров М. ап'/эорНае

Рациональное использование биологического ресурса М. ап1зорНае в качестве природного регулятора численности фитофагов требует оценки его инсектицидной активности. Для отбора наиболее вирулентного изолята нами была проведена серия экспериментов по скринингу полученных путем спонтанной изменчивости морфоваров и исходных родительских штаммов в лабораторных условиях. Оценивали также инсектицидную активность коллекционных штаммов и их морфоваров после хранения через определенные промежутки времени.

Результаты экспериментов по оценке исходных штаммов и морфоваров представлены в таблице 2.

Показано, что энтомоцидную активность проявляют все использованные в опыте культуры гриба. Наибольшая биологическая эффективность наблюдалась в варианте с обработкой гусениц суспензией спор мор-фовара р-72-1, гибель от которого составила 100% по сравнению с контролем. Самую низкую эффективность (35%) показал морфовар р-72-2.

Для штамма 85-69р и его морфологических вариантов более эффективными оказались морфоварианты 85-69р-1 и 85-69р-2, исходный штамм 85-69р уступал им на 15 и 16% соответственно при титре 5х107 КОЕ/г.

Таблица 2. Биологическая эффективность исходных штаммов и морфологических вариантов М. апкорНае в лабораторном опыте на 9-й день

Штаммы Биологическая эффективность штаммов в лабораторном опыте, %

гусеницы пчелиной огневки личинки коло эадского жука

1х107, КОЕ/мл 5x10', КОЕ/мл 1x10', КОЕ/мл 5x10', КОЕ/мл

р-72 50 70 68 73

р-72-1 100 100 95 99

р-72-2 20 35 20 43

85-69р 50 75 64 79

85-69р-1 85 90 56 78

85-69р-2 70 89 55 71

Смена тест-объекта от гусениц пчелиной огневки к личинкам колорадского жука не повлияла на полученные результаты показателя биологической эффективности, которые оказались сходными в обоих вариантах опыта. Так, при титре рабочей суспензии 1х107 КОЕ/г наиболее вирулентным, как и в случае оценки на гусеницах пчелиной огневки, был морфовар р-72-1. Самая низкая эффективность, как и в предыдущем эксперименте, была у морфовара р-72-2 (20%). Аналогично ранее полученным данным, при титре 5х107 КОЕ/мл наиболее эффективным оказался морфовар р-72-1 (98,7%). Таким образом, наиболее активными против личинок колорадского жука оказались штамм р-72 и его морфологический вариант р-72-1. Это дало основание для использования М. аШзорНае в качестве агента контроля численности колорадского жука в полевых условиях.

Оценку биологической активности суспензий определяли также после хранения их при разных температурах как дополнит&льный критерий к определению жизнеспособности спор.

Результаты показали, что антиоксиданты ионол и тирозол в концентрации 0,15% не только позволяют сохранить жизнеспособность конидий гриба в процессе хранения суспензии при комнатной (+20 °С) температуре, но и аналогичным образом предотвращают потерю биологической активности хранящейся культуры, не оказывая на нее негативного влияния. При температурах хранения -20 и +б °С антиоксиданты ионол и тирозол не оказали положительного влияния на сохранение биологической активности, которая снизилась до нулевого значения после 5 месяцев хранения суспензии конидий при -20 °С и после 9 месяцев хранения суспензии конидий при +6 °С.

Биологическая активность культуры М. апяорНае при хранении в сухом виде не зависела от добавления в нее антиоксиданта.

В связи с актуальностью сохранения биологической активности культуры гриба М. атворНае при хранении становится важным поиск решения, которое позволит быстро восстановить уровень вирулентности длительно хранящейся культуры до первоначального. Одним из таких методов является проведение пассажей штаммов энтомопатогена через организм восприимчивого насекомого-хозяина.

Проведенные нами исследования показали эффективность такого метода повышения биологической активности культуры в отношении штаммов р72 и 85-69р М. ат'5орНае и их морфологических вариантов (табл.3).

Таблица 3. Биологическая эффективность штаммов гриба М. ап'!5орНае и их морфоваров после проведения пассажей на гусеницах С. теНопеНа в зависимости от титра конидий

Штамм 1 пассаж 2 пассаж 3 пассаж

5x10s lxlO7 5x10« 7 х 7 О7 5x106 1x10'

р-72 30 91 44 92 97 100

р-72-1 50 98 63 98 96 100

р-72-2 30 76 33 78 91 95

85-69р 23 93 57 93 86 98

85-69р-1 23 81 53 86 83 88

85-69р-2 15 83 46 88 80 90

Видно, что при пассажах происходит вытеснение неактивных клонов из популяции гриба, за счет чего численное значение вирулентности увеличивается при увеличении количества вирулентных клонов. Для увеличения вирулентности всех изученных штаммов их морфоваров достаточно было провести один, пассаж через восприимчивое насекомое. Метод пассирования можно считать одним из эффективных и доступных для сохранения и увеличения вирулентности длительно хранящихся культур энтомопа-тогенных грибов, что подтверждено рядом авторов (Павлюшин, 1998; Огарков, Огаркова, 2000).

3. Полевые испытания

Биологический ресурс энтомопатогенного гриба М. anisopliae позволяет считать его перспективной основой биологического ппепарата для подавления численности колорадского жука Leptinotarsa decemUneata Say. В настоящее время среди фитофагов, поражающих картофель, это наиболее вредоносный объект в России и в частности, в Сибири. Полученные в ходе лабораторных экспериментов данные достоверно указывают на эффективность некоторых штаммов культуры гриба М. anisopliae против личинок этого вредителя. Это позволило осуществить отбор изолятов для дальнейшего проведения полевых опытов по изучению рационального использования биологического ресурса гриба М. anisopliae в отношении колорадского жука, повреждающего картофель.

Учет заселенности растений картофеля личинками колорадского жука проводили в полевом эксперименте в сезоны 2005 - 2007 годов по фенологическим фазам растения: массовая бутонизация, массовое цветение, окончание цветения. Оценка велась путем подсчета количества личинок, не зависимо от возраста (Горбунов, Цветкова, 2001). Для принятия решения о необходимости обработки растений использовали показатель эконо-

мического порога вредоносности, который составлял для перечисленных выше фаз 10, 15 и 20% соответственно.

На рисунке 4 представлены средние данные по трем годам по оценке биологической эффективности природных и полученных селекционным путем штаммов энтомопатогенного гриба М. ат'БорНае. В таблице 4 представлены данные по урожайности картофеля (по годам и средние трехлетние) при его обработке против личинок колорадского жука.

Из рисунка 4 видно, что в условиях 100% заселенности кустов картофеля личинками колорадского жука биологическая эффективность энто-мопатогенных препаратов зависит от вирулентности штамма и титра спор, что подтверждает значимость селекции штаммов, направленной на отбор вариантов с повышенной вирулентностью. Соответственно, в связи с меньшей поврежденностью растений, урожайность во всех опытных вариантах превосходит урожайность в контроле (табл. 4).

Анализ трехлетних данных показал, что наибольшей биологической эффективностью обладает культура штамма р-72-1 энтомопатогенного гриба М. ат'БорНае. Для этого образца биологическая эффективность при максимальном титре спор в рабочей суспензии 5х107 КОЕ/г составляла 85, 86 и 91% соответственно для 2005, 2006 и 2007 гг.

10 млн.

50 млн.

□ р-72 Ор-72-1 Шр-72-2 Ш85-68р Ш85-69р-1 Ш 85-69р-2

тнтр спор гриба М. ашворПае, КОЕ/мл рабочего раствора

Рисунок 4. Биологическая эффективность экспериментальных препаратов на основе гриба М. ап'^орНае (ЗАО "Шигаевское", Новосибирская область, Сузунский район), средние данные 2005 - 2007 гг.

Наиболее высокая урожайность картофеля также получена при обработке растений культурами штаммов р-72 и р-72-1 (табл. 4).

Данные полевых опытов подтвердили данные лабораторных экспериментов и доказали эффективность отбора вирулентных изолятов с целью дальнейшего их применения в качестве природного биологического ресурса для регуляции численности колорадского жука.

Таблица 4. Урожайность картофеля при его обработке против личинок колорадского жука

Урожайность, Урожайность, Урожайность, Урожайность,

Штамм т/га (2005 т/га (2006 т/га (2007 т/га (средняя

год) год) год) за три года)

Контроль 8,10 7,90 8,75 8,25

Р 72 16,30 15,00 11,80 14,4

Р72-1 19,90 20,35 12,55 17,6

Р72-2 13,20 12,70 11,00 12,3

85-69 11,10 12,85 11,25 11,7

85-69-1 12,95 13,00 10,90 12,3

85-69-2 13,20 13,40 9,85 12,2

HCPos 2,90 4,70 1,20 2,90

ВЫВОДЫ

1. Выявлена гетерогенность популяций природных штаммов р-72 и 85 - 69р гриба Metarhizium anisopSiae. Из изученных 230 моноспоровых изолятов штамма р-72 и 250 моноспоровых изолятов штамма 85-69р путем отбора получены два морфологических варианта каждого природного штамма с пушистой и порошистой структурой колоний, стабильных по культуральным и морфологическим свойствам при многократных пассажах на питательных средах. Установлены отличия по размеру (длине и ширине) конидий для штамма р-72 и его морфоваров. Конидии морфовара р-72-1 достоверно превосходили конидии штаммов р-72 и р-72-2 по длине.

2. Критериями отбора высоковирулентных штаммов энтомопатоген-ного гриба Metarhizium anisopliae из природных изолятов являлись показатели ферментативной активности и вирулентности гриба в отношении модельных насекомых (тест-объектов). Найдена высокая положительная корреляционная зависимость между ферментативной активностью и вирулентностью изученных штаммов энтомопатогенного гриба Met'jrhizium anisopliae р-72 и 85-б9р и их морфологических вариантов (Р-72-1 и 2, 85 -б9р-1 и 2) (г =97 для хитиназы, 89 - для амилазы, 66 - для липазы, 92 -для эстеразы, 73 - для протеазы).

3. Пассирование штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов через восприимчивое насекомое - хозяина позволяет увеличить вирулентность исходных штаммов и их морфоваров более, чем в два раза за три пассажа.

4. Продолжительность хранения штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-б9р и их морфологических вариантов зависит от температуры и препаративной формы. При температуре + 20 °С сухая и жидкая биомасса могут храниться без потери биологической ак-

тивности и жизнеспособности в течение 12 месяцев. При температуре + б °С жидкая и сухая формы сохраняют жизнеспособность в течение 12 месяцев, однако жидкая биомасса к окончанию срока хранения снижает биологическую активность до нулевого значения. Выявлена положительная роль введения антиоксидантов ионола и тирозола при длительном хранении биомассы штаммов энтомопатогенного гриба Ме1аг1пШит атворИае р-72 и 85-69р и их морфоваров, которая проявляется в стабилизации количества живых спор и показателя биологической эффективности. При хранении суспензии спор гриба в условиях комнатной (+20 °С) температуры наиболее эффективным для сохранения жизнеспособности спор на первоначальном (до хранения) уровне в течение 12 месяцев оказалось добавление тирозола в концентрации 0,30%.

5. Ультрафиолетовое облучение является наиболее сильным негативным фактором влияния на биоресурс гриба М.апкорНае, снижающим его жизнеспособность в модельном лабораторном эксперименте до нуля в течение 10 минут. Наиболее устойчивым к действию ультрафиолетового света среди изученных штаммов и их морфологических вариантов оказался морфовар р-72-1, что может быть связано с пигментацией его конидий. Антиоксиданты, использованные для сохранения жизнеспособности спор в процессе длительного хранения, могут также служить протекторами от ультрафиолетового излучения для повышения биоресурса гриба.

6. Среди изученных способов наработки спорово - мицелиальной массы гриба наиболее рациональным оказался способ культивирования на плотном стерильном растительном субстрате (разваренном пшене с добавлением отрубей). Такой метод культивирования важен для воспроизводства биологического ресурса гриба М.ап'&орИае, поскольку позволяет получить биомассу, стабильную по количеству жизнеспособных конидий, которая может длительное время храниться без потери биологической активности.

7. При оценке в лабораторных условиях все изучаемые штаммы и их морфовары проявляли энтомоцидную активность, при этом наибольшая биологическая активность отмечена для морфовара р-72-1, гибель тест-объектов (личинок колорадского жука) от которого составила 100% по сравнению с контролем. Более низкая биологическая эффективность (70%) получена для родительского штамма р-72.

8. Обработка растений картофеля в фазу окончания бутонизации -начала массового цветения суспензией спор энтомопатогенного гриба МеСаг/и'г/ит атэорНае обеспечивает снижение численности личинок колорадского жука на картофеле. Трехлетние полевые испытания показали его высокую биологическую эффективность (до 90%). При этом сохранность урожая средняя по трем годам составила 17,6 т/га (в 2,1 раза больше по отношению к показателю урожайности в контроле).

9. Для рационального использования биологического ресурса гриба отобран штамм Д/е^эгЛ/г/'ит ап'яорНае р-72-1, оптимизированный по показателям продуктивности, ферментативной активности, вирулентности по отношению к колорадскому жуку - опасному вредителю картофеля, который может служить основой препарата для биологического контроля фитофага.

список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Серебров В.В. Влияние энтомопатогенных грибов на активность детокси пирующих ферментов гусениц пчелиной огневки Galleria mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) и роль детоксицирующих ферментов при формировании резистентности насекомых к энтомопатогенным грибам / В.В. Серебров, О.Н. Гербер, А.А. Малярчук, В.В. Мартемьянов, А.А. Алексеев, В.В. Глупов // Изв. РАН. Сер. Биол. - 2006. - № б. - С. 712 - 718.

2. Малярчук А.А. Возможность использования энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae против колорадского жука / А.А. Малярчук // Сиб. вестн. с.-х. науки. - 2007. - № 8. - С. 113 - 115.

3. Крюков В.Ю. Перспективы использования энтомопатогенных ги-фомицетов (Deuteromycota, Hyphomycetes) против колорадского жука в условиях Юго - Восточного Казахстана / В.Ю. Крюков, В.В. Серебров, А.А. Малярчук, Б.К. Копжасаров, И.С. Мухамедиев, А.К. Орынбаева, В.П. Ходырев // Сиб. вестн. с.-х. науки. - 2007. - № 4. - С. 52 - 60.

4. Штерншис М.В. Изучение энтомопатогенного гриба M.anisopliae как биологического ресурса для биоконтроля насекомых - фитофагов / М.В. Штерншис, А.А. Малярчук, В.В. Гулий // Вестник Томского государственного университета. 2008. - №313. - С. 232 - 236.

5. Малярчук А.А. Оценка биологической эффективности экперимен-тальных препаратов на основе изолятов энтомопатогенного гриба M.anisopliae против колорадского жука / А.А.Малярчук // Тезисы Международной научно-практич. конф. молодых ученых. Новосибирск, НГАУ, 2006. - С. 104.

6. Maljarchuk A. Evaluation of M.anisopliae morphotypes after UV-radiation and storage / A. Maljarchuk, M. Shternshis, V. Gouli // 40th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology and 1st International forum on Entomopathogenic Nematodes and Symbiotic Bacteria, Quebec City - Universite Laval. Quebec, Canada. - 2007. - P.66.

7. Serebrov V.V. Spontaneous Variability of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. Strains as an Approach for Enhancement of Insecticidal Activity / V.V. Serebrov, A.A. Maljarchuk, M.V. Shternshis// Plant Sci. (Sofia). 2007. V.44. P.236-238.

8.Малярчук А.А. Оптимизация использования энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae против колорадского жука / А.А. Малярчук, В.П. Цветкова, М.В. Штерншис // Биологическая защита растений - основа стабильности агроэкосистем.- Краснодар, 2008. - Вып. 5. - С. 306 - 309.

Подписано в печать 2009. Тираж 100 экз. Печ. л. 1,0. Заказ 17. Отпечатано в ООО НПФ «Исследовательский центр». 630559, Новосибирская обл., Новосибирский район, р.п.Кольцово, промзона, корп. 200.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малярчук, Анастасия Александровна

ВВЕДЕНИЕ

АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

1. Энтомопатогенные грибы как биоресурс контроля 9 численности насекомых - фитофагов

2. Биологические особенности монилиевых грибов и их 13 продуктивность

3. Влияние факторов окружающей среды на энтомопатогенные 22 грибы

4. Использование грибных препаратов в защите растений как 26 реализация биологического ресурса энтомопатогенных грибов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИСЛЕДОВАНИЙ

1. Объекты исследований

2. Методы исследований

2.1. Культивирование энтомопатогенного гриба М. anisopliae

2.2. Методы селекции грибаМ anisopliae

2.3. Методы определения вирулентности гриба М. anisopliae

2.4. Изучение ферментативной активности гриба М. anisopliae

2.5. Изучение влияния ультрафиолетового света на '40 выживаемость конидий гриба М. anisopliae

2.6. Методика определения сохранности гриба М. anisopliae при 41 различных режимах хранения

2.7. Методы полевых экспериментов

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ ЭНТОМОПАТОГЕННОГО

ГРИБА МЕТА RHIZIUM ANISOPLIAE, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИЙ РЕСУРС

1.1. Выделение первичных спонтанных изолятов и изучение их 46 морфологии

1.2. Ферментативная активность изолятов

1.3. Влияние абиотических факторов на жизнеспособность 60 культуры гриба М. anisopliae

1.3.1. Жизнеспособность культуры гриба при хранении в 60 жидком и сухом виде

1.3.2. Выживаемость спор гриба под действием УФ-облучения 66 2. ВОСПРОИЗВОДСТВО И РАЦИОНАЛЬНОЕ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭНТОМОПАТОГЕННОГО ГРИБА

METARHIZIUM ANISOPLIAE КАК АГЕНТА РЕГУЛЯЦИИ ЧИСЛЕННОСТИ ФИТОФАГОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ

2.1. Оптимизация наработки биомассы гриба как основы 71 биологического препарата

2.2. Оценка инсектицидной активности природных штаммов и морфоваров М. anisopliae

2.3. Полевые испытания

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование биологического ресурса энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae (Metch.) Sor. для регуляции численности колорадского жука"

Актуальность темы. Среди природных ресурсов регуляции численности вредных видов насекомых, повреждающих сельскохозяйственные и лесные культуры, особого внимания заслуживают энтомопатогенные грибы. Они обитают в почве, на растениях, в телах насекомых. Периодически эти биологические агенты вызывают вспышки массовых заболеваний насекомых, что приводит к резкому подавлению их численности, сохраняя урожай. Однако возникновение эпизоотий в большой степени зависит от абиотических и биотических факторов внешней среды и случается не столь часто, как это требуется для подавления численности насекомых-фитофагов, являющихся конкурентами человека в потреблении растительной пищи. Поэтому более важна интродукция выделенных из природы энтомопатогенных грибов в агроценозы с целью сохранения урожая от фитофагов. Первым в мире энтомопатогенный гриб Metarhizium anisopliae (Metch.) Sor. выделил из природы и предложил размножить для внесения в агроценозы известный российский ученый И.И.Мечников (1902). Этим было положено начало микробиологическому методу регуляции численности насекомых, распространившемуся по всему миру. Впоследствии энтомопатогенные грибы, относящиеся к отделам Deuteromycota и Zygomycota, стали основой биопрепаратов, предложенных для биологического контроля насекомых в разных странах. На основе природных штаммов энтомопатогенных грибов в нашей стране были разработаны биопрепараты Боверин на основе гриба Beauveria bassiana Bals. Vuil., Вертициллин на основе Verticillium lecanii Nees. (Lecanicillium sp.), Пириформин на основе Entomophthora piryformis (Petch) Hall et Bell (Conidiobolus thromboides) и другие.

Цель работы - изучить возможности повышения биоресурсного потенциала гриба Metarhizium anisopliae и его рационального использования как основы для разработки биопрепарата, подавляющего численность колорадского жука.

Задачи исследований:

3. Определить продуктивность штаммов в разных условиях выращивания биомассы.

4. Оценить устойчивость исходных штаммов и морфоваров гриба к абиотическим факторам (температуре и ультрафиолетовому облучению)^

5. Выявить защитный эффект антиоксидантов при хранении и ультрафиолетовом облучении гриба М.anisopliae.

Защищаемые положения:

3. Штамм грибаМ anisopliae р-72-1, обладающий наиболее высокими показателями протеазной, эстеразной, липазной, амилазной и хитиназной активностей и наибольшей биологической активностью может быть использован в качестве основы препарата для биологического контроля колорадского жука.

Научная новизна. Впервые детально изучено влияние спонтанной изменчивости природных штаммов энтомопатогенного гриба M.anisopliae, выделенных из двух видов насекомых: колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say.) и реликтового усача (Callipogon relictus Saw.), на морфологические (структура, скорость роста колоний, размер конидий) и биохимические (ферментативная активность) признаки. Наличие спонтанной изменчивости у природных штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р служит базовым фактором управления их биоресурсом. Установлены критерии оценки высоковирулентных и продуктивных штаммов, основанные на биотестах и определении их ферментативной активности. Определено влияние абиотических факторов -температуры и ультрафиолетового света — на сохранность и биологическую эффективность штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов в процессе длительного хранения биомассы. Продемонстрировано негативное влияние ультрафиолетового облучения на биоресурс гриба М. anisopliae. Разработана технология производства биомассы энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae (штаммов р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов) с целью дальнейшего использования биологического ресурса гриба в открытых экосистемах в качестве агента регуляции численности насекомых-фитофагов. Для рационального использования биологического ресурса гриба отобран штамм Metarhizium anisopliae р-72-1, оптимизированный по показателям продуктивности, ферментативной активности, вирулентности по отношению к колорадскому жуку - опасному вредителю картофеля.

Практическая значимость. Для селекции высокоактивных и стабильных форм из естественной популяции гриба М. anisopliae предложен метод ступенчатого отбора из моноспоровых рассевов энтомопатогена. Отбор штамма по морфологическим и биохимическим критериям позволяет повысить биологический ресурс гриба как агента биологической регуляции насекомых. Рекомендуется использовать штамм Metarhizium anisopliae р-72-1 как основу биопрепарата для биологического контроля колорадского жука.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены: на Международной научно-практической конференции молодых ученых, (Новосибирск, 2006); на Международной научно-практической конференции (Костинброд, Болгария, 2006); на 40 коллоквиуме по патологии насекомых и микробному контролю (Квебек, Канада, 2007); на Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений, перспективы и роль в фитосанитарном оздоровлении агроценозов и получении экологически безопасной сельскохозяйственной продукции (Краснодар, 2008).

Публикации по теме диссертации. Всего по теме диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, из них 4 в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, собственных исследований, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 128 страницах, содержит 14 рисунков, 15 таблиц. Список литературы включает 200 источников, из них 105 - на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Биологические ресурсы", Малярчук, Анастасия Александровна

выводы

1. Выявлена гетерогенность популяций природных штаммов р-72 и 85 - 69р гриба Metarhizium anisopliae. Из изученных 230 моноспоровых изолятов штамма р-72 и 250 моноспоровых изолятов штамма 85-69р путем отбора получены два морфологических варианта каждого природного штамма с пушистой и порошистой структурой колоний, стабильных по культуральным и морфологическим свойствам при многократных пассажах на питательных средах. Установлены отличия по размеру (длине и ширине) конидий для штамма р-72 и его морфоваров. Конидии морфовара р-72-1 достоверно превосходили конидии штаммов р-72 и р-72-2 по длине.

2. Критериями отбора высоковирулентных штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae из природных изолятов являлись показатели ферментативной активности и вирулентности гриба в отношении модельных насекомых (тест-объектов). Найдена высокая положительная корреляционная зависимость между ферментативной активностью и вирулентностью изученных штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов (Р-72-1 и 2, 85 - 69р-1 и 2) (г =0,97 для хитиназы, 0,89 - для амилазы, 0,66 -для липазы, 0,92 - для эстеразы, 0,73 - для протеазы).

3. Пассирование штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов через восприимчивое насекомое — хозяина позволяет увеличить вирулентность исходных штаммов и их морфоваров более чем в два раза за три пассажа.

4. Продолжительность хранения штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов зависит от температуры и препаративной формы. При температуре + 20 °С сухая и жидкая биомасса могут храниться без потери биологической активности и жизнеспособности в течение 12 месяцев. При температуре + 6 °С жидкая и сухая формы сохраняют жизнеспособность в течение 12 месяцев, однако жидкая биомасса к окончанию срока хранения снижает биологическую активность до нулевого значения. Выявлена положительная роль введения антиоксидантов ионола и тирозола при длительном хранении биомассы штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфоваров, которая проявляется в стабилизации количества живых спор и показателя биологической эффективности. При хранении суспензии спор гриба в условиях комнатной (+20 °С) температуры наиболее эффективным для сохранения жизнеспособности спор на первоначальном (до хранения) уровне в течение 12 месяцев оказалось добавление тирозола в концентрации 0,30%.

5. Ультрафиолетовое облучение является наиболее сильным негативным фактором влияния на биоресурс гриба М.anisopliae, снижающим его жизнеспособность в модельном лабораторном эксперименте до нуля в течение 10 минут. Наиболее устойчивым к действию ультрафиолетового света среди изученных штаммов и их морфологических вариантов оказался морфовар р-72-1, что может быть связано с пигментацией его конидий. Антиоксиданты, использованные для сохранения жизнеспособности спор в процессе длительного хранения, могут также служить протекторами от ультрафиолетового излучения для повышения биоресурса гриба.

6. Среди изученных способов наработки спорово - мицелиальной массы гриба наиболее рациональным оказался способ культивирования на плотном стерильном растительном субстрате (разваренном пшене с добавлением отрубей). Такой метод культивирования важен для воспроизводства биологического ресурса гриба M.anisopliae, поскольку позволяет, получить биомассу, стабильную по количеству жизнеспособных конидий, которая может длительное время храниться без потери биологической активности.

8. Обработка растений картофеля в фазу окончания бутонизации — начала массового цветения суспензией спор энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae обеспечивает снижение численности личинок колорадского жука на картофеле. Трехлетние полевые испытания показали его высокую биологическую эффективность (до 90%). При этом сохранность урожая средняя по трем годам составила 17,6 т/га (в 2,1 раза больше по отношению к показателю урожайности в контроле).

9. Для рационального использования биологического ресурса гриба отобран штамм Metarhizium anisopliae р-72-1, оптимизированный по показателям продуктивности, ферментативной активности, вирулентности по отношению к колорадскому жуку - опасному вредителю картофеля, который может служить основой препарата для биологического контроля фитофага.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малярчук, Анастасия Александровна, Новосибирск

1. Абрамова Ж.И. / Человек и противоокислительные вещества // Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Л.: Наука, 1985. - 230 с.

2. Алешина О.А. Биологические особенности энтомопатогенных грибов и возможности промышленного получения боверина / Алешина О.А., Кононова Э.В., Покидова Н.В. // Микробиологические средства защиты растений и бактериальные препараты. М., 1978. - С. 40 - 44.

3. Андреева И.В. Штамм гриба Verticillium lecanii для получения акарицидного и энтомопатогенного препарата / Андреева И.В., Штерншис М.В., Степанова Е.В., Репин В.Е. // Патент (19) RU (11) 2120756 (13) С1. -1995.

4. Андросов Г.К. Энтомопатогенные грибы таежных биогеоценозов как агенты биологической борьбы с вредными насекомыми: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. М., 1986. - 45 с.

5. Басова Л.П. Изучение энтомофторозов насекомых Куйбышевской области с целью их практического использования: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Куйбышев, 1971. - 22 с.

6. Бегляров Г.А. Опыт практического применения гриба Verticillium lecanii Zimm. для борьбы с тлями в защищенном грунте / Бегляров Г.А., Пономарева И.А., Назарова В.А. // Производство и применение грибных энтомопатогенных препаратов. М., 1985.

7. Беккер З.Э. Физиология грибов и их практическое использование. -М., 1963.-268 с.

8. Билай В.И. Фузарии. Киев, 1977. - 443 с.

9. Борисов Б.А. Энтомопатогенные аскомицеты и дейтеромицеты / Борисов Б.А., Серебров В.В., Новикова И.И., Бойкова И.В. // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты (ред.В.В.Глупов). -2001. М.: Круглый год. С.352 - 427.

10. Вейзер Я. Микробиологические методы борьбы с вредныминасекомыми. М., 1972. - 638 с.

11. Велицкая И.С. Применение препарата боверин в борьбе с кукурузным мотыльком // Бюллетень ВИЗР. JL, 1969. - Вып. 4 (12). - С. 18 -19.

12. Воронина Э.Г. Грибы сем. Entomophthoraceae, вызывающие болезни гороховой тли / Воронина Э.Г. // Ботанический журнал, 1966. Т.51. - №7. - С. 985-989.

13. Воронина Э.Г. Эпизоотии энтомофтороза гороховой тли Acyrthosiphonopisum Harris (Homoptera, Aphidoidea) // Энтомол. обозрение. — 1971.-№4.-С. 781 -799.

14. Воронина Э.Г. Биологические средства защиты растений. М., 1974.-С. 347-395.

15. Воронина Э.Г. Интегрированная защита зерновых культур. М., 1981.-С. 101-111.

16. Воронина Э.Г. // Информационный бюллетень ВПС МОББ. 1989. -№27.-С. 30-68.

17. Воронина Э.Г. Способ получения инсектицида из энтомофторовых грибов. / Воронина Э.Г., Гинак А.И., Гиндина Г.М., Олейникова Г.А., МитинаГ.В.// Патент (19) SU(ll) 1459231 (13) Al. 1995.

18. Воронина Э.Г. Штамм гриба Entomopthora taxteriana для получения препарата против сосущих насекомых и клещей. / Воронина Э.Г., Новикова И.И., Мукамолова Т.Ю., Гинюк А.И., Олейникова Г.А. // Патент (19) SU (11) 1658432 (13) А1. 1995.

19. Воронина Э.Г., Леднев Г.Р., Григорьева Т.А., Шереметьева Т.Б. Эпизоотии энтомофторозов сосущих вредителей // Защита и карантин растений. 1998. - № 11. - С. 12 - 17.

20. Воронина Э.П. Способ получения инсектицидного препарата «ЭНТОКС". / Воронина Э.П., Мукамолова Т.Ю. // Патент (19) RU (11) 2105476 (13) С1.- 1998.

21. Воронина Э.Г. Штамм гриба Entomopthora taxteriana N19-11 (ВИЗР) для получения биопрепарата МИКОАФИДИН Т. / Воронина Э.Г., Мукамолова Т.Ю. // Патент (19) RU (11) 2150836 (13) С1. 2000.

22. Воронина Э.Г. Энтомофторовые грибы / Воронина Э.Г., Мукамоолова Т.Ю. // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты (ред.В.В.Глупов). М.: Круглый год. - 2001.- С. 352 - 427.

23. Гольдберг A.M. Энтомофтороз комаров Culex pipiens L. (сем. Culicide, Diptera) в Подмосковье: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М. -1970. - 21 с.

24. Гораль В.М. Биологические особенности энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana в условиях глубинного культивирования: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Киев. - 1970. - 24 с.

25. Горбунов Н.Н. Фитосанитарный контроль за вредителями и сорняками сельскохозяйственных культур в Сибири / Горбунов Н.Н., Цветкова В.П. // Учебное пособие. Новосибирск. 2001. - 146 с.

26. Горшков Н.В. Звездчатый пилильщик ткач в сосновых лесах Читинской области // Вредители леса и плодовоягодных культур Забайкалья. - Улан-Удэ, 1962. - С. 68 - 74.

27. Громовых Т.И. Энтомопатогенные грибы в защите леса. — Новосибирск, 1982. 80 с.

28. Гукасян А.Б. Некоторые итоги и перспективы применения микробиологического метода борьбы с сибирским шелкопрядом в Западной Сибири / Гукасян А.Б. // Известия АН СССР, серия биологическая. 1961. -№5. - С. 777.

29. Гулий В.В. Микроорганизмы, полезные для биометода. / Гулий В.В, Теплякова Т.В, Иванов Г.М. // Новосибирск: Наука. 1982. - 272 с.

30. Евлахова А.А. Энтомофторовые грибы и вызываемые ими заболевания насекомых // Научные труды института энтомологии и фитопатологии. Киев, 1950. - С. 309 - 327.

31. Евлахова А.А. Развитие гриба Empusa grylli (Fres.) Nowak в теле итальянской саранчи // Микробиология. 1954. - Т.23. - Вып. 2. - С. 185 — 189.

32. Евлахова А.А, Швецова О.И. Значение болезней совки гаммы для прогноза // Защита растений от вредителей и болезней, 1961. № 7. - С 43 -44.

33. Евлахова А.А, Велицкая И.С. Методические указания для приготовления препаратов из энтомопатогенных грибов для испытания на насекомых. — J1, 1961.-28 с.

34. Евлахова А.А. Массовое выращивание энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana в нестерильных условиях / Евлахова А.А, Пайкин Д.М, Тарасов Л.Г. // Микология и фитопатология. М, 1968. - Т. 2. - № 2. - С. 141 - 143.

35. Евлахова А.А. Энтомопатогенные грибы. Л, 1974. - 254 с.

36. Жуковский А.В. Факторы, обусловливающие снижение численности вредной черепашки в 1941 г. в Воронежской области // Труды Воронежской СТАЗР. 1946. - Вып. 13. - С. 3 - 28. :

37. Иващенко И.И. Грибная композиция для борьбы с почвенными вредителями. / Иващенко И.И., Ярошенко В.А., Кощаев А.Г. // Патент (19) RU (11) 2308191 (13) С1. 2007.

38. Иващенко И. И. Микробиологическая композиция для борьбы с личинками жуков щелкунов. / Иващенко И. И., Ярошенко В. А., Кощаев А. Г. // Патент (19) RU (11) 2311773 (13) С1. - 2007.

39. Исакова С.А. Экологическое и эпизоотическое значение слепней (Diptera, Tabanidae) и возможности применения биологических методов борьбы с ними: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Алма-Ата, 1991. - 21 с.

40. Кальвиш Т.К. Энтомопатогенные грибы вредных насекомых Сибири и Казахстана // Итоги исследований живой природы Сибири. -Новосибирск, 1973. С. 254 - 263.

41. Кальвиш Т.К. Применение грибных препаратов для защиты растений / Кальвиш Т.К., Санжимитупова Р.Д., Шарапов В.М., Андращук В.В. // Тез. 7 съезда Всесоюз. микробиол. общества. Сельскохозяйствен, микробиол. 1985. - Т. 7. - С. 27.

42. Кальвиш Т.К. Морфофизиологические особенности нового для флоры СССР энтомопатогенного гриба Tolypocladium niveum (О. Rostr.) Bissett (Deuteromycotina: Moniliales) // Микология и фитопатология. 1990. -Т. 24.-№3.-С. 210-215.

43. Карабаш Ю.А. Опыт применения биопрепарата боверина в сочетании с гексахлораном в борьбе с яблонным плодовым пилильщиком (Haplocampa testudinaea Klug.) // Защита растений. Киев, 1967. - Вып. 4. - С. 24-28.

44. Кирсанова В.А. Физиологическая изменчивость энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana (Bals) Vuill., индуцированная физическими и химическими мутагенами // Микология и фитопатология. -1968.-Т. 2. №3. - С. 183 - 193.

45. Коваль Э.З. Определитель энтомофильных грибов. Киев, 1974. - 257 с.

46. Кузнецов В.Д. Изменчивость продуцента канамицина -Actinomyces kanamyceticus — при сохранении в лабораторных условиях./ Кузнецова В.Д., Новикова Н.Д. // Антибиотики. 1967. - т.12. - В.4. - С. 458 -463.

47. Куликов Н.С. Грибные болезни массовых вредителей сельскохозяйственных растений на Сахалине и возможности их использования в биологической борьбе: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -Л., 1977.-22 с.

48. Лавренюк Н.И. К изучению энтомофильных грибов, поражающих двукрылых на территории УССР / Лавренюк Н.И. // Патология членистоногих и биологические средства борьбы с вредными организмами. — Киев, 1974. С. 103 - 104.

49. Лохвицкая М.Ф. Изменчивость Aspergillus oryzae, применяемого в производстве ферментных препаратов: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -М., 1971.-26 с.

50. Малярчук А.А. Возможность использования энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae против колорадского жука / А.А. Малярчук // Сиб. вестн. с.-х. науки. 2007. - № 8. - С. 113 - 115.

51. Махова Н.М. Штамм гриба Entomopthora pyriformis THOIS 78-2 ЦМПМ-Р-183 для изготовления биологического препарата против вредных членистоногих. / Махова Н.М.; Ракшаина М.Ц. // Патент (19) SU (11) 1086573 (13) А1. 1994.

52. Миронова М.К. Биологический контроль численности западного цветочного трипса // Защита и карантин растений. 1996. - №10. - С. 28-30.

53. Митина Г.В. Энтомоцидные токсины гриба Verticillium lecanii -продуцента биопрепарата вертициллин: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -С.-Петербург, 1992. 18 с.

54. Митина Г.В. Способ получения инсектицида./ Митина Г.В., Павлюшин В.А., Новикова И.И., Конюхов В.П. // Патент (19) RU (11) 2005378 (13) С1.- 1994.

55. Михайлова Р.В. / Михайлова Р.В., Жуковская JI.A., Лобанок А.Г. Изучение спонтанной изменчивости Penicillium adametzii ЛФ F-2044 -продуцента глюкозооксидазы // Прикладная биохимия и микробиология. -2007. Т. 43. - № 2. - С. 229-233.

56. Ованесян Т.Т. Жизнеспособность белой мускардины // Инфекционные и протозойные болезни полезных и вредных насекомых. М., 1956.-С. 393-398.

57. Огарков Б.Н. Местные штаммы энтомопатогенных грибов и перспективы их использования в Восточной Сибири: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Иркутск, 1972. - 32 с.

58. Огарков Б.Н. Особенности изменчивости природных штаммов мускардиновых грибов / Огарков Б.Н., Огаркова Г.Р., Голубых Е.Т. // Микология и фитопатология. 1976. - Т. 10. - Вып. 1. - С. 19-22.

59. Огарков Б.Н. Использование энтомопатогенных микроорганизмов для защиты растений защищенного грунта / Огарков Б.Н., Огаркова Г.Р. // Производство и применение грибных энтомопатогенных препаратов. М., 1985. - С. 19 - 21.

60. Огарков Б.Н. Энтомопатогенные бактерии и грибы в защите растений. Иркутск, 1985. - С. 111-118.

61. Огарков Б.Н. Биологическое обоснование способов создания и использования грибных препаратов для борьбы с насекомыми: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Л., 1990. - 44 с.

62. Б.Н. Огарков, Г.Р. Огаркова. Энтомопатогенные грибы Восточной Сибири. Иркутск, 2000. - 134 с.

63. Огарков Б.Н., Огаркова Г.Р., Самусенок Л.В. Грибы защитники, целители и разрушители. Иркутск, 2008. - 248 с.

64. Павлюкова Е.Б. Внеклеточные протеолитические ферменты мицелиальных грибов. //Биохимия. 1998. - Т. 63. Вып. 8. - С. 1059-1089.

65. Павлюшин В.А. Факторы вирулентности гриба Beauveria bassiana и патогенез мускардиноза насекомых: Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Л., 1979. 24 с.

66. Павлюшин В.А. Научные основы использования энтмопатогенов и микробов антагонистов в фитосанитарной оптимизации тепличных агробиоценозов: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. - С. — Петербург, 1998. -44 с.

67. Пахтуев А.И. Штамм гриба Beauveria bassiana ВКМ F-3732D, используемый для получения энтомопатогенных препаратов. / Пахтуев А.И., Прилепский Б.В., Чегодаев Ф.Н. // Патент (19) RU (11) 2172588 (13) С1. -2001.

68. Плешанова Г.И. Энтомопатогенный гриб Paecilomyces farinosus (Dicks, ex Fr.) Brown et Smith и возможности использования его против вредителей леса: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Иркутск. 1970. - 26 с.

69. Полтев В.И. Микрофлора насекомых. / Полтев В.И., Гриценко И.Н., Егорова А.И. и др. // Новосибирск, 1969. 272 с.

70. Поспелов В.П. Развитие мускардинных грибов у свекловичного долгоносика // HayicoBi пращ Инст. ентом. та фггопат. АН УССР. Киев, 1950.-№ 1. - С.12-21.

71. Рудаков О.Л. Внутривидовая морфолого — физиологическая дифференциация грибов Ascochyta pisi и A. pinodes / Рудаков О.Л, Лепихова P.M. // Микология и фитопатология 1974. - Т.8. - В.5. - С. 407 - 412.

72. Соколова З.Г. Естественная изменчивость по биосинтезу антибиотика в связи с процессами морфогенеза у Actinomyces chromogenes var. trienicus. / Соколова З.Г, Ефременкова Л.М, Виноградова Л.М, Силаев А.Б. // Генетика, т.Х1, №8. 1975. - С. 115 - 121.

73. Соловей Е.Ф. Гетерогенность популяции Verticillium lecanii II Микология и фитопатология. 1980. - Т. 14. Вып. 5. - С. 400 - 404.

74. Суздальская М.В. Белая мускардина вредной черепашки // Труды ВИЗР. 1958. -Вып. 9.-С. 341 -361.

75. Тарунина Т.А. / Внутривидовая изменчивость Verticillium albo-atrum — возбудителя увядания хлопчатника // Ботанический журнал. 1966. -Т. LI. - №6.

76. Третьяков А.П. Штамм микромицета Verticillium lecanii для производства инсектицидного препарата. / Третьяков А.П, Щербаков Г.Я, Стирманова Н.И. // Патент (19) RU (11) 2034470 (13) С1. 1995.

77. Третьяков А.П. Штамм микромицета Beauveria bassiana для производства энтомопатогенного препарата. / Третьяков А.П, Лиховидов В. Е, Стирманова Н. И. // Патент (19) RU (11) 2034469 (13) С1. 1995.

78. Филипчук О.Д. Способ защиты табака от почвообитающих вредителей. // Патент (19) RU (11) 2195819 (13) С2. 2003.

79. Фут Ф. / Фотосенсибилизированное окисление и синглетный кислород. Биологические следствия // Свободные радикалы в биологии. М., 1979.-Т. 2. - С. 96- 150.

80. Шарапов В.М. Данные к экологии грибов рода Beauveria / Шарапов В.М., Кузьмин B.C. // Известия СО АН СССР. 1970. - № 10. - С. 143- 145.

81. Шмотина Г.Е. Культурально — морфологическая изменчивость микросклероциальной и дауэрмицелиальной формы Verticillium albo-atrum. / Шмотина Г.Е., Горленко В.М. // Микология и фитопатология 1970. - № 5. -С. 412 - 418.

82. Штейнхауз Э. Патология насекомых. 1952. - 560 с.

83. Штерншис М.В. Регуляция численности вредителей сельскохозяйственных культур с помощью энтомопатогенов. // Новосибирск. -1991.-60 с.

84. Штерншис М.В. Повышение эффективности микробиологической борьбы с вредными насекомыми. // Новосибирск. -1995. 194 с.

85. Штерншис М.В. Биологическая защита овощных культур в защищенном грунте / Штерншис М.В., Андреева И.В. // Производство экологически безопасной продукции растениеводства. Пущино. 1995. - С. 207-213.

86. Штерншис М.В. Биологический контроль численности насекомых // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты (ред.В.В.Глупов). М.: Круглый год. - 2001. - С. 562-610.106 ;

87. Штерншис М.В. Изучение энтомопатогенного гриба М.anisopliae как биологического ресурса для биоконтроля насекомых фитофагов / М.В. Штерншис, А.А. Малярчук, В.В. Гулий // Вестник Томского государственного университета. - 2008. - №313. — С. 232 - 236.

88. Ярошенко В. А. Комопозиция для борьбы с личинками жуков -щелкунов. / Ярошенко В. А., Кощаев А. Г., Иващенко И. И., Шевченко Л.П. // Патенты (19) RU (11) 2311029 (13) С1, (19) RU (11) 2311774 (13) С1. 2007.

89. Ячевский А.А. Определитель грибов. II гр., 1917. - Т.2. Несовершенные грибы.

90. Alves R.T. Effect of simulated solar radiation on conidial germination of Metarhizium anisopliae in different formulations/ Alves R.T., Bateman R.P., Prior C., Leather L.// Crop Protection. 1998. - V.17. - P.675-679.

91. Anderson R.M. Infectious Diseases and Population Cycles of Forest Insects / Anderson R.M., May R.M. // Science. 1980. - V. 210. - №. 4470. - P. 658 -661.

92. Andersen S.O. Insect cuticular proteins / Andersen S.O., Hojrup P., and Roepstorff P. // Insect Biochem. Mol. Biol. 1995. - V. 25. - P. 153 - 176.

93. Andrade Z.A. Nasal Granuloma Caused by Entomophthora Coronata / Andrade Z.A., Paula J.A., Italo A.S., Cheever A.W. // American J. Tropical Medicine Hyg. 1967. - V. 16.-№ 1.-P. 31-33.

94. Brobyn P.J. Invasive and developmental processes of Entomophthora species infecting aphids / Brobyn P.J., Wilding N. // Trans. Brit. Mycol. Soc. -1977. V. 69. - № 3. - P. 349 - 366.

95. Brobyn P.J. The persistence of infectivity of conidia of the aphid pathogen Erynia neophidis on leaves in the field / Brobyn P.J., Wilding N., Clark S. // Ann. Appl. Biol. 1985. - V. 107. - №3. - P. 365 - 370.

96. Carruthers R.I. The effect of solar radiation on the survival of Entomophaga grylli (Entomophthorales: Entomophthoraceae) conidia / Carruthers R.I., Feng Z., Ramos M.E., Soper R.S. // J. Invert. Pathol. 1988. - V. 52. - № 1. -P. 154 - 162.

97. Carruthers R.I. Influence of thermal ecology on the mycosis of a rangeland grassopper / Carruthers R.I., Larkin T.S., Firtencel H., Feng Z. // Ecology. 1992. - V 73. - P. 190 - 204.

98. Carruthers R.I. Simulation of insect disease dynamic: an application of Serb to a rangeland ecosystem / Carruthers R.I., Larkin T.S., Soper R.S. // Simulation. 1988. - V. 51. - P. 101 - 109.

99. Claus L. / Untersuchungen uber die Chitinasewirkung des insektentotenden Pilzes Beauveria bassiana II Arch. Mikrobiol. 1961. - V. 40. -P. 17-46.

100. Coudron T.A. Levels of chitinolytic activity during development of three entomopathogenic fungi / Coudron T.A., Kroha M.J., and Ignoffo C.M. // Сотр. Biochem. Physiol. 1984. - 79B. - P. 339 - 348.

101. Dean G.J. Entomophthora infecting the cereal aphids Metapolophium dirhodum and Sitobion avenae / Dean G.J., Wilding N. // J. Invert. Pathol. 1971. -V. 18. -№2. - P. 169-176.

102. Dean G.J. The natural enemies of cereal aphids // Ann. Appl. Biol. -1975.-V. 80.-№ l.-P. 130-132.

103. Dimbi S. Effect of constant temperatures on germonation, radial growth and virulens ofM anisopliae to three species of African tephritid fruit flies / Dimbi S., Maniania N.K., Lux S.A., Mueke J. M. // BioControl. 2004. - V. 49. - P. 83 - 94.

104. Ekesi S. Effect of temperature on germination, radial growth and virulens of M. anisopliae and Beauveria bassiana on Megalurothrips sjostedti. / Ekesi S., N.K. Maniania, J.C. Delmas // Biocontrol Sci. Technol. 2002. - V.12. -P. 7- 17.

105. Eilenberg J. Ultrastructural studies of primary spore formation and discharge in the genus Entomophthora / Eilenberg J., Kresciana I., Latge J.P. // J. Invert. Pathol. 1986. - V. 48. - P.318-324.

106. El Sayed G.N. Chitinolytic activity and virulence associated with native and mutant isolates of an entomopathogenic fungus Nomurea rileyi / El — Sayed G.N., Coudron T.A., and Ignoffo C.M. // J. Invert. Pathol. - 1989. - V. 54. -P. 394 - 403.

107. Fargues J. Effects of temperature, humidity and inoculation method on susceptibility of Schistocerca gregaria to Metarhizium flavoviridae / Fargues J., A. Ouedraogo, M. Goettel and C. Lommer. I I Biocontrol Sci. Technol. 1997. -V.7.-P. 346-356.

108. Fargues J. Effect of temperature on vegetative growth of Beauveria Bassiana isolates from different origins / Fargues J., Goettel M.S., Smits N., Ouedraogo A., Rougier M. // Mycologia. 1997. - V. 89 "(3). - P. 383 - 392.

109. Fargues J. Effect du rayonnement solaire sur la persistence des conidiospores de hyphomycete entomopathogana, Nomurea riley / Fargues J., Rougier M., Joujet R., Itier B. // Entomophaga. 1988. - V.33. - P. 357 - 370.

110. Fujilie Azusa. Method for controlling insect pest. / Fujiliie Azusa, Yokoyama Tomoko, Sawada Masaaki, Hasegawa Makoto, Kai Masaaki // Abstract of JP6166607.- 1994.

111. Gabriel B.P. Enzymatic activities of some entomophthorous fungi // J. Invert. Pathol. 1968. - V. 11. - № 1. - P. 70-81.

112. Goettel M.S. The role of fungi in the biological control of grasshoppers / Goettel M.S., Johnon D.L., Inglis G.D. // Can. J. Bot. 1995. - V. 73.-P. 71-75.

113. Goettel M.S. Fungi: Hyphomicetes in "Manual of Techniques in Insect Pathology" / Goettel M.S., Inglis G.D. // Manuel of techniques in Insect. Pathol. Academic Press. 1997. - P. 213-249.

114. Hajek A.E. Food consumption of hymantria dispar (Lepidoptera: Limantriidae) larvae infected // Environ. Entomol. 1989. - V. 18. - P. 723 - 727.

115. Hajek A.E. Interactions between fungae pathogens and insect hosts whis Entomophaga maimaiga (Zygomycetes: Entomophthorales) / Hajek A.E., Leger R.I. //Ann Rev Entomol. 1994. - V. 39. - P. 293 - 322.

116. Hall I.M. Entomophthorous fungi parasitic on the spotted alfalfa aphid /Hall I.M., Bell J.V. //J. of Insects Pathol. 1961. - V. 4. - № 2. - P.224 -228.

117. Hall R.A. Control of apeds in glasshouses whis the fungus, Verticillium lecanii / Hall R.A., Burges H.D. // Ann. Appl. Biol. 1979. - V. 93. -№3. - P. 235-246.

118. Havukkala I. Induction and purification of Beauveria bassiana chitinolytic enzymes / Havukkala, I., Mitamura, С, Hara, S., Hirayae, K., Nishizawa, Y, andHibi, T. // J. Invertebr. Pathol. 1993. - V. 61. - P. 97-102.

119. Hawksworth D.L. Dictionary of the Fungi, 7-th Edition. The systematic arrangement of fungal genera as suggested in Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi. / Hawksworth D.L., Sutton B.C., Ainsworth G.C., Ainsworth & Bisbys // 1983. P.445.

120. Hawksworth D.L. Dictionary of the Fungi, 8-th Edition. The systematic arrangement of fungal genera as suggested in Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi. / Hawksworth D.L., Sutton B.C., Ainsworth G.C., Ainsworth & Bisbys // 1995. P. 147 - 148.

121. Hawksworth D.L. Dictionary of Fungi. Inter. Mycol. Inst. CAB International. Wallingford. / Hawksworth D.L., Kirc P.M., Sutton B.C., Pegler D.N.// 1995.-616 p.

122. Huber J. Research on physiology of Entomopathogenic Fungus / Huber J. // Arch. Mikrobiol. 1958. - V. 29. - P. 257 - 276.

123. Ignoffo C.M. Environmental factors affecting persistance of entomopathogens //Florida Entomol. 1992. - V. 75. - P.516-524.

124. Inglis G.D. Infleunce of Ultraviolet Light Protectants on Persistence of the Entomopathogenic Fungus, Beauveria bassiana / Inglis G.D., Goettel M.S., Jonson D.L. // Biological control. 1995. - V. 5. - P. 581 - 590.

125. Inglis G.D. Effects of Temperature and Sunlight on Mycosis {Beauveria bassiana) (Hyphomycetes: Sympodulosporae) of Grasshoppers Under

126. Field Conditions. / Inglis G.D, Johnson D.L, Goettel M.S. // Environ. Entomol. -1997. -V. 8. P. 400-409.

127. Kang S. C. Purification and Characterization of a Novel Chitinase from the Entomopathogenic Fungus, Metarhizium anisopliae / Sun Chul Kang, Sanggyu Park, Dong Gyu Lee // J. Invert. Pathol. 1999. - V. 73. - P. 276 - 281.

128. Keller S. The Fungus Zoophthora elateridiphaga as an Important Mortality Factor of the Click Beetle Agriotes sputator II J. Invert. Pathol. 1994. -V. 63.-№ 1.-P.90-91.

129. Krejzova R. Submegred cultivation of Entomophthora virulenta Hallet Dunn. // Ceslca mykologie. 1970. - V. 24. - № 2. - P.87 - 94.

130. Krejzova R. Submerse kultivation der insektenpathogenen Pilzarten Entomophthora thaxeteriana (Petch) Hall et Bell und Entomophthora destruens Weiseret Batko // Ceska mykologie. 1971a. - V. 25. - № 2. - P. 118 - 124.

131. Krejzova R. Resistance adn germinability of resting spores of some species of the genus Entomophthora II Ceska mykologie. 1971b. - V. 25. - № 4. -P.231 - 238.

132. Kuranda M. J. Chitinase is required for cell separation during growth of Saccharomyces cerevisiae / Kuranda M. J, Robbins P. W. // J. Biol. Chem. -1981.-V. 266. P. 19758-19767.

133. Lachema J. / Quantitative Estimation of Chitinase and Several Other Enzymes in the Fungus Beauveria bassiana II J. Invert. Pathol. 1970. - V. 15. -P. 34 - 42.

134. Leger R.J. Role of extracellular chymoelastase in the virulence of Metarhizium anisopliae for Manduca sexta / R. J. St. Leger, P. K. Durrands, A. K. Charnley, R. M. Cooper // J. Invertebr. Pathol. 1988. - V. 52. - P. 285 - 293.

135. Leger R.J. St. Ambient pH Is a Major Determonant in the Expression of Cuticle Degrading Enzymes and Hydrophobin by Metarhizium anisopliae / Leger R.J. St., Joshi L., Roberts D. // Appl. Environ. Microbiology. - 1998. - P. 709-713.

136. Leger R.J. St. The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae alters ambient pH, allowing extracellular protease production and activity / Leger R.J. St., Nelson J.O., Screen S. // Microbiology. 1999. - V. 145. - P. 2691 -2699.

137. Lomer C.J. Biological control of locusts and grasshoppers / Lomer C.J., Bateman R.P, Johnson D.L., Langewald J., Tomas M. // Ann. Rev. Entomol. -2001.-V.46.-P. 667-702.

138. Lord J.C. / Dessicant Dusts Synergize the Effect of Beauveria bassiana on Stored Grain Beetles // J. Econ. Entomol. - 2001. - V. 94 (2). - P. 367-372.

139. Lynch R.E. Fungi associated with eggs and first-instar larvae of the European corn borer / Lynch R.E., Lewis L.C. // J. Invert. Pathol. 1978. - V. 32. -P.6-11.

140. Maninia N.K. Effect of species, age, and sex of tsetse on response to infection by Metarhizium anisopliae / Maninia N.K. and Odulaja A. // Biocontrol. 1998. -V. 43. - P. 311 -323.

141. Milner R.J. Pathogens (Phycomycetes: Entomophthoraceae) of the blue-green aphid Acyrthosiphon kondoi Shinji and other aphids in Australia / Milner R.J., Teakle E.E., button G.G., Dare F.M. // Austral. J. Bot. 1980. - № 28.-P. 601-619.

142. Milner R.J. The effect of humidity on Germonation and Infection of Termites by the Hyphomycete, Metarhizium anisopliae / Milner R.J., Staples J.A., button G.G. // J. Invertebr. Pathol. 1997. - V. 69. - P. 64 - 69.

143. Muller-Kogler E. Insect Pathology and Microbiological control. -1967.- 339 p.

144. Ohkawa A. Fine structure of resting spore formation and germination in Entomophthora virulenta / Ohkawa A., Aolci J. // J. Invert. Pathol. 1980. - V. 35. - № 3. - P.279 - 289.

145. Otsuka Takano. Arterialization inhibitor containing FR 125756 substance and OR FR 125035 substance and production thereof / Otsuka Takano, Morikawa Noriyuki, Shibata Toshihiro, Terano Hiroshi, Okuhara Masakuni // Abstract of JP3047120. 1991.

146. Pegg G. F. Purification and characterization of chitinase enzymes from healthy and Verticillium alboutrum-infected tomato plants and from V. alboutrum / Pegg G. F., Young D. H. //Physiol. Plant Pathol. 1982. - V.21. - P. 389-409.

147. Perry D.F. Gennination of Erynia bullata resting spores // J. Invert. Pathol. 1988. - V. 51. - № 2. - P.161 - 162.

148. Perry D.F. Dormancy and germonation of Conidiobolus obscurus azygospores / Perry D.F., Latge J.P. // Trans. Brit. Mycol. Soc. 1982. - V. 78. -№22. - P. 221 -229.

149. Remaudiere G. Ecologie comparee des entomophthoracees pathogens de pucerons en France littorale et continentale / Remaudiere G., Latge J.P., Michel M.F. // Entomophaga. 1981. - V.26, № 2. - P. 157 - 178.

150. Roberts D.V. Stability of entomopathogenic fungi. / Roberts, D.V., A.S. Campbell // Ent. Soc. Amer. 1977. - V.10. - P. 19-76.

151. Roy H.E. Bizarre interactions and endgames: entomopathogenic fungi and their arthropod hosts / Roy H.E., Steinkraus D.C., Eilenberg J., Hajek A.E., Pell J.K. //Annu. Rev. Entomol. 2006. - V.51. - P.331-357.

152. Samuels K. D. Z. Characteristics relating to the pathogenicity of Metarhizium anisopliae toward Niaparvata lugens. / Samuels K. D. Z., Heale J. В., Llewellyn M. //J. Invertebr. Pathol. 1989. -V. 53. - P. 25-31.

153. Selhime A.G. Biology of Entomophthora floridana attacking Eutetranychus banksi / Selhime A.G., Muma M. // Fla. Entomologist. 1966. - V. 49.-№3.-P. 161-168.

154. Serebrov V.V. Spontaneous Variability of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. Strains as an Approach for Enhancement of Insecticidal Activity / V.V. Serebrov, A.A. Maljarchuk, M.V. Shternshis // Plant Sci. (Sofia). 2007. -V.44. P. 236-238.

155. Shah P.A. Natural Incidance of Metarhizium flavoviricle Infection in Two Grasshopper Communities in Notherh Benin / Shah P.A., Gbongboui C., Godonou I., Hossou A., Lomer C.J. // Biocontrol Sci. Technology. — 1998a. V. 8. P. 335-344.

156. Shapiro-Ilan David I. Methods and materials for control of insects such as pecan weevils. / Shapiro-Ilan David I., Gardner Wayne A., Wood В., Fuxa J.R. // Astract of US2004101516. 2004.

157. Shimizu S. Serological classification of Beauveria bassiana / Shimizu S., Aizawa K. //J. Invertebr. Pathol. 1988. - V. 52. - P. 348-353.

158. Shimizu S. Electrophoretic karyotype of Metarhizium anisopliae / Shimizu S., Arai Y., Matsumoto T. // J. Invertebr. Pathol. 1992a. - V. 60. - P. 185-187.

159. Shimizu S. Purification and properties of an extracellular protease from Beauveria bassiana / Shimizu S., Tsuchitani Y., and Matsumoto T. // J. Seric Sci. Jpn. 1992b. - V. 61. - P. 421-428.

160. Shimizu S. Serology and Substrate Specificity of Extracellular Proteases from Four Species of Entomopathogenic Hyphomycetes / Shimizu S., Tsuchitani Y., Matsumoto T. // J. Invert. Pathol. 1993. - V. 61. - P. 192 - 195.

161. Soper R.S. Massospora levispora. A new species of funguspathogenic to the cicada, Okanagana rimosa // Can. J. of Botany. 1963. V. 41. - P. 975 - 878.

162. St. Leger R. J. Cuticle-degrading enzymes of entomopathogenic fungi: Regulation of production of chitinolytic enzymes / St. Leger R. J., Cooper R. M., Charnley A. K. //J. Gen. Microbiol. 1986a. - V. 132. - P. 1509-1517.

163. St. Leger R. J. Cuticle-degrading enzymes of entomopathogenic fungi: Cuticle degradation in vitro by enzymes from entomopathogens / St. Leger R. J., Cooper R. M., Charnley A. K. // J. Invertebr. Pathol. 1986b. - V. 47. - P. 167-177.

164. Thoizon G. A key to species of Entomophthora infecting aphids // Ann. Soc. entomol. France. 1970. - V. 6. - № 3. - P. 517 - 562. 1

165. Watson D.W. Behavioral fever response of Musca domestica (Diptera: Muscidae) to infection by Entomophthora muscae (Zygomecetes: Entomophthorales) / Watson D.W., Mullens B.A., Petersen J.J. // J. Invert. Pathol. 1993.-V. 61.-№ 1.-P.10- 16.

166. Wilding N. Effect of humidity on the sporulation of Entomophthora aphidis and E. thaxteriana II Trans. Brit. Mycol. Soc. 1969. - V. 53. - № 16. - P. 126- 130.

167. Wilding N. Discharge of Conidia of Entomophthora thazteriana Petch. from pea Aphid Acyrthosiphon Pisurn Harris 11 J. Gen. Microbiology. 1971. - V. 69. - P. 417 - 422.

168. Wilding N. The survival of Entomophthora spp. in mummitied aphids at different temperature and humidities // J. Invert. Pathol. 1973. - V. 2. - № 3. -P. 303 - 311.

169. Wilding N. Entomophthora species infecting pea aphids // Trans. Brit. Mycol. Soc. 1975. - V. 127. - № 2. - P. 171 - 183.

170. Wolfram Andersch. Agents for combating pests and plant treatment agents / Andersch Wolfram, Hartwig J, Homeyer B, Stenzelc K. // Abstract of CA1335659. -1995.

171. Wright M.S. A strain of the Fungus Metarhizium anisopliae for controlling Subterranear Termotes / Wright M.S., Raina A.K, Lax A.R. // Biologycal and Microbial control. 2005. - V. 98 (5). - P. 1451 - 1458.

172. Zacharuk R.Y. Fine structure of the fungus Metarrhizium anisopliae infecting three species of larval Elateridae (Coleoptera): I. Dormant and germinating conidia// J. Invertebr. Pathol. 1970a. - V. 15. - P. 63 - 80.

173. Zacharuc R.Y. Fine structure of the fungus Metarrhizium anisopliae infecting three species of larval Elateridae (Coleoptera) II. Conidial Germ tubes and appressoria// J. Invertebr. Pathol. 1970b. - V.l 5. - P. 81 - 91.

Информация о работе

Малярчук, Анастасия Александровна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2009
ВАК 03.00.32

Диссертация

Использование биологического ресурса энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae (Metch.) Sor. для регуляции численности колорадского жука - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы