Двухкомпонентная регуляторная система Sak188/Sak189 и ее влияние на свойства Streptococcus agalactiae

Рождественская, Анастасия Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Двухкомпонентная регуляторная система Sak188/Sak189 и ее влияние на свойства Streptococcus agalactiae
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Двухкомпонентная регуляторная система Sak188/Sak189 и ее влияние на свойства Streptococcus agalactiae"

На правах рукописи /

РОЖДЕСТВЕНСКАЯ Анастасия Сергеевна

ДВУХКОМПОНЕНТНАЯ РЕГУЛЯТОРНАЯ СИСТЕМА SAK188/SAK189 И ЕЕ ВЛИЯНИЕ НА СВОЙСТВА STREPTOCOCCUS А GALA CTIAE

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011

2 2 СЕН 2011

4853353

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины СевероЗападного отделения РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Дмитриев Александр Валентинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кокряков Владимир Николаевич

доктор биологических наук, профессор Поспелов Валерий Анатольевич

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки

"Научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии имени Пастера"

Защита диссертации состоится 2011 г. в УЗ часов на

заседании Диссертационного совета ДМ 001.022.01 при НИИЭМ СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН Автореферат разослан 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук ^ Нежинская Г.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Streptococcus agalactias — грамположительный микроорганизм, вызывающий широкий спектр заболеваний, таких как пиелонефрит, артрит, абсцессы, эндокардит, септицемия и др. (Sendi P. et al., 2008). S. agalactiae может приводить к патологии беременности (Larsen J. et al., 2008), вызывать тяжелые формы сепсиса, менингита, пневмонии новорожденных, часто приводящие к летальному исходу (Berardi et al., 2007).

Не менее важное значение S. agalactiae имеет в ветеринарии, поскольку может вызывать хронические маститы у крупного рогатого скота, которые наносят большой экономический ущерб (Keefe G., 1997). При этом многие домашние животные, не только коровы, но и кошки, собаки, лошади, свиньи и др., могут быть бессимптомными носителями S. agalactiae, что обуславливает наличие обширных очагов инфекции.

Использование молекулярно-генетических методов исследования позволяет провести сравнительный анализ штаммов S. agalactiae и предположить потенциальную способность отдельных штаммов вызывать инфекционные процессы в организмах различных хозяев. Так, например, наличие у штамма тех или иных генов патогенности является одной из важных характеристик его потенциальной способности к адгезии, инвазии и подавлению иммунного ответа хозяина. Ряд генов патогенности, таких как cylE, hylB, eft), scaAB присутствуют во всех штаммах S. agalactiae, выделенных как от человека, так и от животных. В то же время, каждый из генов bca, bac и scpB присутствует не у всех штаммов (Dmitriev A. et al, 2002).

Штаммы S. agalactiae способны быстро адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, используя различные регуляторные механизмы. Одним из таких механизмов является регуляция транскрипции генов двухкомпонентными регуляторными системами. Двухкомпонентные системы участвуют в регуляции метаболизма бактерий, включая их способность использовать различные питательные вещества (Gao R. et al., 2009), в регуляции устойчивости к стрессовым воздействиям и действию антибиотиков и др. (Jordan S. et al., 2009). Кроме того, двухкомпонентные регуляторные системы часто контролируют экспрессию генов патогенности, что отражается на взаимодействии микроорганизма и организма хозяина, обеспечивает колонизацию органов и тканей и приводит к патологическим процессам.

соавт., 2005; Грабовская К. Б. с соавт., 2007). Недавно было показано, что ген Ь локализован в пределах "островка" патогенности размером 8992 пл содержащего семь генов, в том числе гены двухкомпонентной системы sak¡88 sak!89, кодирующие сенсорную гистидинкиназу Sakl 88 и ДНК-связываюин белок Sakl 89 (Dmitriev A. et al., 2006). Учитывая близкое расположение эт1 генов, логично предположить участие двухкомпонентной системы Sakl88/Sakl в регуляции транскрипции гена bac и синтеза белка Вас, и, как следствие, формировании вирулентного фенотипа S. agalactiae.

Таким образом, актуальность изучения S. agalactiae, его фактор патогенности, а также механизмов их регуляции и формирования вирулентно фенотипа не вызывают сомнений. Имеющиеся данные о двухкомпонентн регуляторной системе Sakl88/Sakl89, потенциально участвующей формировании вирулентного фенотипа S. agalactiae, открывают перспективн направления исследований. Все вышеизложенное определило цель и зада настоящей работы.

Цель исследования

Изучение роли двухкомпонентной регуляторной системы Sakl88/Sakl89 регуляции метаболизма, транскрипции гена bac и синтеза белка Вас вирулентности S. agalactiae.

Задачи работы

1. Изучить генетическую гетерогенность штаммов S. agalactiae на осно наличия у них генов патогенности и аллели гена sakl92\ выявить штамм содержащие ген bac и гены двухкомпонентной регуляторной систеи Sakl 88/Sakl 89.

2. Инактивировать гены sakl88 и sakI89 у штамма S. agalactiae и провес сравнительный анализ свойств штамма дикого типа и мутантных штаммов использованием методов биохимии, микробиологии и молекулярной биологии.

3. В штамме S. agalactiae, мутантном по генам sakl88 и sakl восстановить экспрессию: а) обоих генов sakl88 и sakl89; б) только гена sakl провести сравнительный анализ полученных штаммов.

4. Выявить штаммы, содержащие неактивные аллели генов sakl88 и/и sakI89; восстановить в них экспрессию генов sakl88 и sakl89 и провес последующий анализ свойств штаммов.

Научная новизна

- обнаружены штаммы S. agalactiae, выделенные от коров, содержащие г bac и другие гены "островка" патогенности, в том числе, гены двухкомпонентн регуляторной системы Sakl 88/Sakl89;

- показано, что штаммы S. agalactiae, выделенные от коров и содержащ ген bac, характеризуются аллелью 1.1 гена sakl92-,

- методом инсерционного мутагенеза создан штамм S. agalacti мутантный по гену sak!88, и штамм, мутантный по обоим ген двухкомпонентной регуляторной системы sakl88 и sakl89;

- выявлено, что одновременная инактивация генов sakl88 и sukl89 приводит к значительному снижению уровня транскрипции гена bac (в 17 раз) и к ингибированию синтеза белка Вас in vitro, в то время как инактивация одного гена sakl88 методом инсерционного мутагенеза не влияет на уровень транскрипции гена bac и экспрессии белка Вас;

- показано, что одновременная инактивация генов sakl88 и sakl89 приводит к повышению вирулентности мутантного штамма по сравнению со штаммом дикого типа при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей, а инактивация одного гена sakl88 методом инсерционного мутагенеза не влияет на вирулентность S. agalactiae;

- показано, что восстановление под контролем природного промотора полноразмерного гена sakl89 в штамме S. agalactiae, мутантном по генам sakI88 и sakl89, приводит к активации синтеза белка Вас;

- обнаружен штамм S. agalactiae, содержащий ген bac, но не экспрессирующий белок Вас вследствие точечной делеции гуанина в положении 439 в гене sakl89\

- выявлено, что восстановление экспрессии полноразмерных генов sakl88 и sak!89 в штамме S. agalactiae, содержащем природную неактивную аллель гена sakl89 приводит к активации экспрессии белка Вас.

Научно-теоретическая и практическая значимость исследования

Показано, что гетерогенность структуры и нуклеотидной последовательности гена sakl92 может быть использована в качестве одного из генетических и эпидемиологических маркеров штаммов S. agalactiae, выделенных как от человека, так и от коров. Характеристика штаммов по аллели гена sakl92 в дополнение к другим методам исследования позволяет эффективно предсказывать их естественную экологическую нишу.

Полученные результаты необходимы для понимания механизма регуляции транскрипции гена патогенности bac S. agalactiae двухкомпонентной регуляторной системой Sakl88/Sakl89. Эти данные открывают новое направление исследований по разработке методов направленного воздействия на регуляторные механизмы экспрессии факторов патогенности с целью влияния на вирулентные свойства микроорганизмов.

Фрагменты ДНК, секвенированные в настоящем исследовании, были депонированы в базе данных GenBank под следующими номерами: EU484325-EU484332, FJ890928, HQ840774.

Положения, выносимые на защиту

1. В геномах штаммов S. agalactiae, выделенных от коров, может присутствовать "островок" патогенности, содержащий ген bac и гены двухкомпонентной регуляторной системы SakI88/Sakl89; штаммы S. agalactiae, выделенные от коров и человека, которые содержат ген bac, характеризуются аллелью 1.1 гена sakl92;

2. Инактивация генов sakl88 и sakl89 в штамме S. agalactiae приводит к уменьшению уровня транскрипции гена bac и экспрессии белка Вас, а также

увеличению вирулентности при внутрибрюшинном заражении лабораторнь мышей;

3. ДНК-связывающий белок Sakl 89 необходим для активации синте белка Вас;

4. Природная делеция гуанина в положении 439 в гене sakl89 приводит потере функциональной активности белка Sakl 89 и нарушению синтеза бел! Вас.

Личный вклад автора включал самостоятельное формулирование зад. работы, проведение большинства исследований, адаптацию ряда метод исследования, а также интерпретацию полученных результатов и i статистическую обработку. Методическая помощь была оказана Mikula I. Jr. п постановке и освоении метода SSCP и к.м.н. Грабовской К.Б., к.б.н. Королев И.В., Зуткис A.A., Ильясовым Ю.Ю. при работе с лабораторными мышами.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 9 научнь работах (из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 6 тезисов) доложены на 5 международных и всероссийских конференциях: XVIIth Lancefie International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, г. Порто-Хел Греция, 2008; 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectio Diseases, г. Хельсинки, Финляндия, 2009; XIII Путинской школе-конференш молодых ученых "Биология - наука XXI века", г. Пущино, 2009; 25* Congress Czechoslovak Society of Microbiologists, г. С. Лесна, Словакия, 201 Всероссийской научной конференции молодых ученых "Пробле биомедицинской науки третьего тысячелетия", г. Санкт-Петербург, 2010.

Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярн микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН в 2007, 2008 и 2011 гг.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены 154 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, 4 гла обзора литературы, описание материалов и методов, 4 главы результат собственных исследований, обсуждение полученных результатов и общ заключение, выводы и список литературы. Работа содержит 9 таблиц и рисунков, указатель литературы содержит 154 источника, в том числе отечественных и 147 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использовали 35 штаммов S. agalactiae, выделенных беременных женщин, 114 штаммов S. agalactiae, выделенных из коровье молока, и по 3 штамма Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalacti Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Штаммы были получены из коллекщ НИИЭМ СЗО РАМН, Пекинского детского госпиталя (г. Пекин, Китай) Университета ветеринарной медицины (г. Кошице, Словакия). Штаммы бы выделены в различных географических регионах в период с 1989 по 2002

Штаммы Е. coli JM109 и DH5a использовали для амплификации плазмидной ДНК.

Культивирование стрептококков и стафилококков осуществляли в жидкой среде Todd-Hewitt (Hi-Media, Индия) и на 1,5% агаризованных средах при температуре 37°С без перемешивания. Для оценки гемолитической активности штаммов в агаризованную среду добавляли эритроцитарную массу до конечной концентрации 5%. Штаммы Е. coli культивировали в бульоне BHI (Gibco, США) при температуре 37°С и перемешивании на качалке роторного типа Sky Line (ELMI, Латвия) или на 1,5% агаризованной среде. Питательные среды готовили в соответствии с прилагаемой к ним инструкцией. Концентрации антибиотических препаратов для культивирования штаммов S. agalactiae и Е. coli составили: эритромицин - 2,5 мкг/мл и 200 мкг/мл соответственно; спектиномицин - 125 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно; ампициллин - 100 мкг/мл (только для Е. coli).

Реакцию коагглютиации осуществляли с использованием набора для экспресс-диагностики стрептококка группы В (АКВАПАСТ, Россия). Определение чувствительности штаммов S. agalactiae к эритромицину осуществляли с помощью диско-диффузионного метода.

Динамику роста штаммов оценивали по изменению оптической плотности при длине волны 600 нм в бульоне Todd-Hewitt.

Трансформацию микроорганизмов осуществляли методом электропорации с использованием Gene Pulser Xcell (Bio-Rad Laboratories, США).

Выделение хромосомной ДНК осуществляли методом фенол/хлороформенной экстракции. Выделение плазмидной ДНК из рекомбинантных штаммов Е. coli осуществляли с помощью коммерческих наборов "AxyPrep Plasmid Miniprep Kit" и "AxyPrep Plasmid Midiprep Kit" (Axygen, США) согласно инструкции производителя.

Выделение ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью коммерческого набора "AxyPrep DNA Gel Extraction Kit" (Axygen) согласно инструкции производителя.

Амплификацию фрагментов ДНК осуществляли методом ПЦР. При проведении мультиплексной ПЦР в одну и ту же реакционную смесь добавляли праймеры на различные гены. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК осуществляли в 1-1,5% агарозном геле в зависимости от их размеров. В качестве маркеров электрофоретической подвижности использовали препараты "100 bp ladder" и "1 kb ladder" (Медиген, Россия).

Гидролиз ДНК рестриктазами £coRI, BamWl (Fermentas, Литва) осуществляли согласно протоколу производителя.

Секвенирующую ПЦР проводили с использованием набора "GenonieLab Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" (Beckman Coulter Inc., США) согласно протоколу производителя. Секвенирование осуществляли с использованием секвенатора GenomeLab GeXP Genetic Analysis System (Beckman Coulter Inc., США).

Выделение тотальной клеточной РНК осуществляли с помощью набо RNeasy Mini Kit (QIAGEN, США) согласно протоколу производител Концентрацию РНК оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000.

Количественную ПЦР с обратной транскриптазой проводили i оборудовании ABI Prism 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CHI с использованием набора Power SYBR® Green RNA-to-CT™ 1-Step Kit (Appli Biosystems) согласно протоколу производителя. Уровни транскрипции каждо1 из анализированных генов нормализовали по отношению к уровня транскрипции гена српбО.

Для идентификации различных аллелей гена sakl92 использовали мет анализа SSCP (анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДН Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 10 полиакриамидном геле при 200 В в течение 35 часов. Окрашивание ге осуществляли 0,2% раствором AgNOj в течение 30 минут в темноте соответствии с опубликованным протоколом (Bassam В., 1991).

Анализ внутриклеточных и поверхностных белков осуществляли помощью электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и метод Western-blot. Для приготовления лизатов осадки клеток суспендировали физиологическом растворе, смешивали с равным объемом буферного раствор содержащего 10% ß-меркаптоэтанола, и кипятили в течение 10 минут.

Для анализа белков с помощью двумерного электрофореза бактериальн культуры в объеме 10 мл выращивали при температуре 37°С в течение пя часов. После этого клетки осаждали центрифугированием, промыв; физиологическим раствором и суспендировали в 150 мкл буферного раствор содержащего 6М мочевину и 2М тиомочевину в деионизованной воде, истечении 20 минут клеточные суспензии трижды обрабатыв; ультразвуковыми импульсами длительностью 15 сек, после чего инкубировали течение 30 минут. Клеточные обломки отделяли центрифугированием при 120 об/мин в течение 15 минут. Концентрации белка в полученных раствор измеряли по методу Мэрион Брэдфорд (Bradford М., 1976).

Для изоэлектрофокусировки белков при двумерном электрофоре использовали стрипы Ready Strip™ IPG Strips 7 см, диапазон pH 4-7 (Bio-R Laboratories), и изоэлектрофокусировку проводили в камере Protean IEF Cell (Bi Rad Laboratories).

Для оценки вирулентности изучаемых штаммов примени внутрибрюшинное заражение лабораторных мышей (самцы, 10-12 нед., вес 14г). Исследуемые штаммы выращивали при 37°С в 40 мл бульона Todd-Hewitt течение ночи, клетки центрифугировали и отмывали физиологически раствором. Отмытые клетки ресуспендировали в физиологическом раствор затем вводили мышам внутрибрюшинно по 0,5 мл микробной суспензии концентрацией возбудителя 108 КОЕ/животное. Животным контрольной групп вводили по 0,5 мл физиологического раствора. Для каждого исследуемо штамма использовали по 15 мышей. Наблюдение вели в течение 10 дней. Д подтверждения гибели животных от стрептококковой инфекции делали счетнь высевы из селезенок.

В работе использовали компьютерные программы и базы данных: Chromas 1.45 (Microsoft) - для анализа нуклеотидных последовательностей, полученных в результате секвенирования; программное обеспечение BLAST и базу данных GenBank - для сравнительного анализа ДНК; программное обеспечение Banklt -для депонирования аллелей исследованных генов в базу данных GenBank; программное обеспечение Expasy translate tool - для транслирования нуклеотидных последовательностей генов; программное обеспечение Protein BLAST - для сравнительного анализа аминокислотных последовательностей; программное обеспечение SWISS-MODEL — для моделирования трехмерных структур белковых молекул.

Статистическую обработку данных при построении кривых роста осуществляли с использованием критерия распределения Стьюдента и программного обеспечения Excel! (Microsoft). Статистическую достоверность различий в вирулентности штаммов при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей определяли с использованием кривых выживаемости Каплана-Мейера, логарифмического рангового критерия и программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Генетическая гетерогенность штаммов S. agalactiae, выделенных от коров

В настоящей работе коллекция штаммов S. agalactiae, выделенных от коров, была проанализирована на наличие генов патогенности bca, bac и scpB, кодирующих а-антиген, белок Вас и С5а пептидазу соответственно. Ген bac, ранее обнаруженный лишь у штаммов, выделенных от человека, был выявлен у 5 (4,4%) из 114 штаммов, выделенных от коров. Гены bca и scpB были обнаружены у 12 (10,5%) и 22 (19,3%) из 114 штаммов соответственно (табл. 1). В целом, у исследованных штаммов было обнаружено 6 различных комбинаций этих трех генов патогенности (табл. 1). Две из них, bac~bca~scpB+ и bacbcascpB\ ранее были обнаружены у штаммов, выделенных от человека (Dmitriev A. et al., 2002), а четыре (bacbcascplf, bac bca sep В', bac bca'scpB и bac bca' scpET) оказались характерными только для штаммов, выделенных от коров. Самой распространенной у проанализированных штаммов была комбинация генов Ьас~ bca~scpB~. Ею характеризовались 82 (71,9%) из 114 штаммов. В то же время, штаммы, одновременно содержащие три анализируемых гена {bca, bac и scpB), выявлены не были. Возможно, роль белка Вас белка, а-антигена и С5а пептидазы в развитии инфекционного процесса или бессимптомной колонизации у коров не столь важна, как у человека, и другие факторы патогенности имеют большее значение для патогенеза заболеваний. В пользу данной гипотезы свидетельствует тот факт, что С5а пептидаза способна инактивировать С5а фракцию комплемента человека, но не у животных (Bohnsack J. et al., 1993).

Таблица 1. Распространенность различных комбинаций генов bac, bca и scpB штаммов S. agalactiae, выделенных от коров

Комбинация генов патогенности Количество штаммов

bac ' bca ~ scpB " 82 (71,9%)

bac ' bca~ scpB * 19 (16,6%)

bac ' bca + sep В ~ 6 (5,3%)

bac " bca " scpB * 2 (1,8%)

bac + bca ~ scpB J 1 (0,9%)

bac + bca + scpB ~ 4 (3,5%)

Всего штаммов: 114 (100%)

Символом "*" отмечены комбинации генов патогенности. обнаруженные ранее у штамм выделенных от человека ШтИпеу А. е1 а1., 2002).

Кроме наличия генов патогенности у исследуемых штаммов бы проанализированы нуклеотидные последовательности гена $ак192. Ранее этот г был использован в качестве маркера для внутривидовой дифференциац штаммов, выделенных от человека (Дмитриев А. В. с соавт., 2006). В данн работе у штаммов 5. aga¡actiae, выделенных от коров, структурная организаш гена 5ак!92 (рис. 1) в целом оказалась аналогичной таковой у штаммо выделенных от человека (Дмитриев А. В. с соавт., 2006). У всех штаммов разм фрагмента гена в области 5'-конца составил 93 п.н. Фрагмент гена в области конца у 108 из 114 штаммов представлял собой идентичную последовательное размером 34 п.н., а у 6 из 114 штаммов - размером 40 п.н. (рис. 1).

Внутренняя область гена оказалась наиболее вариабельной. Ее размер различных штаммов зависел от количества правильно чередующихся прямь повторов размером 16 п.н. и спейсерных последовательностей размером 44 п. Нуклеотидные последовательности прямых повторов были, в основно идентичны, тогда как спейсерные участки отличались гетерогенностью и мог содержать от 2 до 6 точечных нуклеотидных замен. В частности, была выявле неизвестная ранее спейсерная область, условно обозначенная номером 11. целом, с учетом гетерогенности структуры гена вак192, у 114 штаммов agalactiae, выделенных от коров, было обнаружено 8 различных аллелей ге (рис. 1).

1.1 1.3* 1.3 1.6

3.3 5.2

Р. 171

171

177

2.3 231

3.1 291

291

411

№1

1 Г

№9

ZZг

№9

1 Г №11

№1 №4

1 I

№1 №5 №4

LZKdKCZt

№1 №5 №6

№1 №4 №5 №4 №8

5'- 93 п.н. 34 п.н. - 3'

- 93 п.н. фрагменты гена в области 5'-конца, выделенные черным цветом, отличаются одной

нуклеотидной -заменой от таковых, выделенных серым цветом;

- фрагмент гена в области З'-конца, отмеченный символом " ▼ ", содержит делению одного

нуклеогида и изменение рамки считывания; -незаштрихованными и черными стрелками обозначены прямые повторы; - незаштрихованными прямоугольниками обозначены спейсерные области; порядковые номера над ними соответствуют различным спейсерам и присвоены согласно (Дмитриев А. В. с соавт., 2006); — символом "*" отмечены аллели гена 5ак192, обнаруженные ранее у штаммов, выделенных от человека (Дмитриев А. В. с соавт., 2006).

Рисунок 1. Полиморфизм гена sakl92 у штаммов S. agalactiae, выделенных от

коров

Три из восьми аллелей гена sakl92 (аллели 1.1, 1.3 и 3.1), обнаруженные у коровьих штаммов, ранее были обнаружены и у штаммов, выделенных от человека (Дмитриев А. В. с соавт., 2006). В то же время у 44 (38,6%) из 114 штаммов, выделенных от коров, были выявлены аллели 1.5, 1.6, 2.3, 3.3 и 5.2, не обнаруженные у штаммов, выделенных от человека. Таким образом, полиморфизм гена sakl92 в ряде случаев может быть использован для установления естественной экологической ниши штамма.

При комплексном анализе аллели гена sakl92 и наличия генов патогенности у 114 штаммов S. agalactiae, выделенных от коров, было обнаружено 16 различных генетических вариантов (табл. 2). Наиболее распространенные генетические варианты S. agalactiae не содержали гены bac,

bca, scpB и характеризовались аллелями 3.1, 1.3 и 5.2 гена sakl92. К ни принадлежало 28 (24,6%), 20 (17,5%) и 16 (14,0%) из 114 проанализированны штаммов соответственно. Три генетических варианта (№№ 8, 9 и 14) был обнаружены ранее у штаммов, выделенных от человека (Дмитриев А. В. с соав 2006; Dmitriev A. et al., 2002), но большая часть штаммов, а именно, 100 (87,7° из 114, проанализированных в рамках настоящего исследовани характеризовалась генетическими вариантами, не выявленными ранее. К i числу относились и штаммы, содержащие ген bac. Все они, как и изученнь ранее штаммы, содержащие ген bac, характеризовались аллелью 1.1 гена sakl9 однако обладали комбинациями генов патогенности (bac bca'scpB* bac bca scpBT), отличными от таковой для bac штаммов, выделенных человека (bac+bca+ scpB ) (Dmitriev A. et al., 2002). Эти данные согласуются результатами сравнительного анализа штаммов S. agalactiae с использование других методов (Dmitriev A. et al., 1999; Dogan В. et al., 2005; Manning S. et a 2010; Martinez G. et al, 2000; Oliveira I. et al, 2006; Sukhnanand S. et al, 200 свидетельствующими о значительных отличиях между штаммами, выделенным от разных хозяев.

Таблица 2. Распространенность генетических вариантов штаммов S. agalactia выделенных от коров

Генетический вариант Наличие генов патогенности Аллель гена sakl92 Количество штаммов

bac bca scpB

№ 1 - - - 1.3 20

№2 1.5 2

№3 1.6 4

№4 2.3 7

№5 3.1 28

№6 3.3 5

№7 5.2 16

№8 * - - + 1.3 9

№9* 3.1 3

№ 10 2.3 7

№ 11 - + - 1.3 2

№ 12 2.3 3

№ 13 3.1 1

№ 14 * - + + 1.3 2

№ 15 + + 1.1 1

№ 16 + ■ - 1.1 4

Всего штаммов: 114

Символы "-" и "+" обозначают отсутствие или наличие гена соответственно:

символом "*" отмечены генетические варианты, обнаруженные ранее у штаммов, выделеннь

от человека (Дмитриев А. В. с соавт, 2006; Откпеу А. ьЧ а!.. 2002).

Таким образом, предложенный комплексный анализ штаммов на основе наличия генов патогенности и аллели гена sakl92 может быть использован в качестве одного из методов дифференциации штаммов, различающихся по экологической нише, степени филогенетического родства и вирулентности.

Роль двухкомпонентной регуляторной системы Sakl88/Sakl89 в метаболизме, синтезе белка Вас и проявлении S. ngalactiae вирулентных

свойств

Как было показано ранее, ген bac локализован на "островке" патогенности, который содержит семь генов, в том числе гены сенсорной гистидинкиназы sakl88 и ДНК-связывающего белка sakI89 (Dmitriev A. et al., 2006). В рамках настоящего исследования для изучения возможной роли двухкомпонентной системы Sakl 88/Sakl 89 в регуляции транскрипции генов и проявлении вирулентных свойств гены sakl88 и sakl89 были инактивированы у штамма S. agalactiae 168/00 методом инсерционного мутагенеза. С этой целью фрагменты соответствующих генов клонировали с помощью вектора pVA891-2, содержащего ген устойчивости к эритромицину и неспособного к репликации в грамположительных кокках, в результате чего получили две рекомбинантные плазмиды, обозначенные как рНК и pRR. Интеграция каждой из плазмид в геномную ДНК штамма 168/00 приводила к нарушению целостности нуклеотидных последовательностей генов sakl88 (плазмида рНК) и sakl89 (плазмида pRR) и изменению первичных структур соответствующих белков (рис.

2).

-4 - sak№

(

sakISS

геномная ДНК

iCZEZJ---CZ>

sak m

.... -

EmR - ген устойчивости к эритромицину; Р - промотор

Рисунок 2. Инактивация гена яак189 методом инсерционного мутагенеза. Инактивацию гена вак188 осуществляли аналогичным образом

Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей гистидинкиназы и ДНК-связывающего белка в штамме 168/00 и соответствующих белков, потенциально экспрессируемых мутантными штаммами, выявил значительные различия в структурах белковых молекул. В частности, в мутантных штаммах произошла замена 95 а.к. на С-конце гистидинкиназы Sakl88 на 191 а.к., а 51 а.к. на С-конце ДНК-связывающего белка Sakl89 - на 15 а.к. Дальнейший анализ и моделирование трехмерных структур белковых молекул показали, что в штамме, мутантном по гену sakI88, были утрачены сайты связывания АТФ и Mg2+ в белке Sakl88, а в штамме, мутантном по гену sakl89, - домен белка Sakl89, ответственный за связывание с ДНК.

Как известно, без участия АТФ и ионов Mg2+ молекула сенсорной гистидинкиназы не способна к фосфорилированию. В то же время, ДНК-связывающий белок-регулятор ответа при отсутствии в нем эффекторного домена не обладает возможностью взаимодействовать с промоторными областями ДНК и влиять на уровни транскрипции генов (Bourett R., 2010; Gao R. et al., 2007, 2010; Stock A. et al., 2000). Вышеизложенное позволило предположить наличие изменений в функциональных активностях белков Sakl88 и Sakl89.

Использование метода инсерционного мутагенеза для инактивации гена sakl89 привело не только к существенным изменениям в нуклеотидной последовательности этого гена, но и к значительному удалению гена sakl88 от промотора (рис. 2). По данным, опубликованным в литературе, интеграция плазмиды между промотором и геном сенсорной гистидинкиназы вызывает нарушение транскрипции этого гена, что используют для получения мутантов, не экспрессирующих гистидинкиназу (Sugareva V. et al., 2010; Zhuo Ma et al., 2007). Таким образом, инактивация гена sakl89 методом инсерционного мутагенеза приводит к получению двойного мутанта по генам sak!88 и sakl89.

Сравнительный анализ морфологических и культуральных свойств штамма дикого типа 168/00 и штаммов, мутантных по генам sakl88 и sakl88/sakl89, не выявил существенных различий в форме и размере клеток и колоний.

Помимо морфологических и культуральных свойств штамма 168/00 и штаммов, мутантных по генам sakl88 и sakl88/sakl89, была изучена экспрессия внутриклеточных и поверхностных белков в этих штаммах. Сравнительный анализ клеточных лизатов перечисленных штаммов методами SDS-электрофореза, двумерного электрофореза и Western-blot выявил различия в экспрессии белка весом около 150 кДа, который по способности связывать IgA человека был идентифицирован как белок Вас. Соответствующий этому белку бэнд присутствовал в клеточных лизатах штамма 168/00 и штамма, мутантного по гену sakl88, но отсутствовал в клеточном лизате штамма, мутантного по обоим генам sakl88 и sakl89 (рис. 3, 4). Таким образом, инактивация гена sakl88 не оказала влияния на уровень экспрессии белка Вас, а инактивация обоих генов sakl88 и sakl89 привела к ингибированию его синтеза. Полученные данные позволяют предположить, что ДНК-связывающий белок Sakl89 играет ключевую роль в регуляции синтеза белка Вас.

Вас -

1 2 3 4 S В ?

УЁтШЁмШШШ xi, . : №

...... -

М§» «и«»

-250 -150 "100

Вас

1. 4 -штамм 168/00 после двух и пяти часов роста соответственно: 2,5- штамм 168/00 sakI88 после двух и пяти часов роста соответственно; 3,6 — штамм 168/00 sale 188 /sakI89 после двух и пяти часов роста соответственно; 7 - маркер молекулярного веса.

Рисунок 3. Сравнительный анализ экспрессии внутриклеточных и поверхностных белков штаммов методами SDS-электрофореза (А) и Western-blot с IgA человека, меченными пероксидазой хрена (Б)

Значение pi

4 5 6 7 4

ио—vii % / 150 ►

100 —^ -«s® 100 *

Значение pi 5

штамм 168/00

штамм 168/00 sakl88 /sakl89~

Слева расположен маркер молекулярного веса

Рисунок 4. Сравнительный анализ экспрессии внутриклеточных и поверхностных белков методом двумерного электрофореза

Использование метода количественной ПЦР в режиме реального времени позволило выявить, что уровень транскрипции гена bac в штамме, мутантном по гену sak/88, незначительно отличался от такового в штамме 168/00. В то же время, уровень транскрипции гена bac в штамме, мутантном по генам sakl88 и sakl89, оказался примерно в 17 раз ниже, чем в штамме 168/00. Таким образом, регуляция экспрессии белка Вас осуществляется на уровне транскрипции.

Для дальнейшего анализа роли регуляторной системы Sakl88/Sakl 89 в активации синтеза белка Вас была исследована коллекция из 40 штаммов 5. agalactiae, содержащих ген Ьас, методами SDS-электрофореза и Western-blot. В основу этого анализа легло предположение, что штаммы, содержащие ген Ьас, но не экспрессирующие белок Вас, могли обладать неактивными аллелями генов sakl88 и/или sakl89. В результате исследования среди 40 штаммов был выявлен штамм A49V, не экспрессирующий белок Вас. При этом в гене sakl89 была обнаружена делеция одного нуклеотида (соответствующего 439-му нуклеотиду в гене sakl89 штамма 168/00), которая привела к изменению открытой рамки считывания и нарушению аминокислотной последовательности белка Sakl 89. Так, согласно компьютерному анализу, в результате делении произошла замена 72 а.к. на С-конце ДНК-связывающего белка Sakl 89 на 10 а.к, при этом были утрачены все 9 а.к, обеспечивающих связывание ДНК. Сравнительный анализ третичных структур белка Sakl89 в штаммах 168/00 и A49V выявил отсутствие ДНК-связывающего домена в белке Sakl89 в штамме A49V (рис. 5).

Л1г /

S ^Qa**

ДНК-связывающий домен

НОШР®

Ж Щ

Рисунок 5. Модели третичных структур белков вак189 штамма 168/00 (А) и штамма А49У (Б)

Для того, чтобы доказать, что ингибирование экспрессии белка Вас в штамме 168/00, мутантном по генам $ак188 и вак!89, и в штамме дикого типа А49У вызвано нарушением функциональной активности двухкомпонентной 1 регуляторной системы Эак! 88/8ак189, экспрессия обоих генов эак188 и $ак189 [_ была восстановлена в этих штаммах. Для этого на основе вектора рАТ29, содержащего ген устойчивости к спектиномицину и способного к автономной репликации в грамположительных кокках, сконструировали рекомбинантную плазмиду рВ§г!18(Р), содержащую гены зак188 и вак189 под контролем -природного промотора. I

Трансформация штамма 168/00, мутантного по генам эак188 и зак189, и I штамма А49У рекомбинантной плазмидой рВ§гЯ8(Р) привела к восстановлению экспрессии белка Вас в обоих штаммах. Полученный результат убедительно -доказывает участие двухкомпонентной регуляторной системы 8ак188/8ак189 в 7 активации экспрессии белка Вас.

Для подтверждения ключевой роли ДНК-связывающего белка 8ак189 в активации синтеза белка Вас, дополнительно осуществили восстановление

экспрессии одного лишь гена sakl89 в штамме 168/00, мутантном по генам sakl88 и sak!89. Для этого использовали сконструированную на основе вектора рАТ29 рекомбинантную плазмиду pRfull(P), содержащую полноразмерный ген sakl89 под контролем природного промотора. Сравнительный анализ штамма 168/00, штамма, мутантного по генам sakl88 и sakl 89, и штамма, мутантного по генам sakl88 и sak]89, содержащего рекомбинантную плазмиду pRfull(P), методом SDS-электрофореза показал, что восстановление экспрессии ДНК-связывающего белка Sakl89 привело к активации синтеза белка Вас (рис. 6). Таким образом, проведенные эксперименты продемонстрировали, что двухкомпонентная система Sakl 88/Sakl 89 участвует в регуляции транскрипции гена bac и синтеза белка Вас, при этом именно экспрессия ДНК-связывающего белка Sakl 89 при данных условиях является необходимой.

1 2 3 4 5

8W ' " " ' 1

150—> s.......- « - ■ <—Вас

1 - маркер молекулярного веса;

2 -штамм 168/00;

3 - штамм 168/00 sakl88~/sakl89~\ 4 - штамм 168/00 sakl88 /sakl89 с восстановленными генами sakl88 и sakl89;

5 -штамм 168/00 sakl88 /sakl89 с восстановленным геном sakl89.

Рисунок 6. Сравнительный анализ экспрессии внутриклеточных и поверхностных белков методом SDS-электрофореза

Сравнительный анализ вирулентных свойств штамма S. agalactíae 168/00 и штаммов, мутантных по генам sakl88 и sakl88/sak 189

Для того чтобы выяснить, оказывает ли влияние двухкомпонентная система Sakl 88/Sakl 89 на вирулентные свойства штамма S. agalactíae 168/00 in vivo, в рамках настоящего исследования было применено моделирование стрептококковой инфекции на лабораторных мышах. Суспензии штамма 168/00 и мутантных штаммов с концентрацией возбудителя 108 КОЕ/животное вводили внутрибрюшинно. Контрольной группе животных осуществляли инъекцию физиологического раствора. Наблюдения вели в течение 10 дней после заражения. Анализ динамики гибели мышей показал, что заражение штаммом, мутантным по генам sakl88 и sakl89, привело к гибели 87% животных, что существенно больше, чем для штамма 168/00 (47% животных) и штамма, мутантного по гену sakl88 (52% животных) (рис. 7). Таким образом, инактивация

100-

щшщ

i : «í ii

генов двухкомпонентной системы 8ак188/8ак189 привела к повышению вирулентных свойств штамма при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей.

100 i о4- 90 -

0 1 23456789 10 Время, сугии

-•-ISS OO -a-IBSm saklSS/sakl89 -tr-168,00 suklSS -^-контроль

Рисунок 7. Динамика гибели лабораторных мышей при заражении штаммом 168/00 и мутантными штаммами

Этот результат, на первый взгляд, противоречит полученным ранее данным о том, что инактивация генов sakl88 и sakl89 приводит к уменьшению уровня транскрипции гена bac и синтеза белка Вас - признанного фактора патогенности S. agalactiae. Однако известно, что наличие белка Вас коррелирует с г возникновением иммунологической толерантности, предоставляющей возможность S. agalactiae длительно персистировать в организме хозяина и не вызывать выраженный иммунный ответ. При этом, внутрибрюшинное заражение мышей позволяет оценить вирулентность штамма при инвазивном пути инфекционного процесса, поскольку перед возбудителем отсутствуют естественные защитные барьеры, такие как кожные покровы или слизистые, нормальная микрофлора и др. Таким образом, вполне логичным представляется, Г что ингибирование синтеза белка Вас, способствующего бессимптомной колонизации S. agalactiae в организме хозяина, привело к повышению вирулентности при инвазивном пути развития инфекции.

Следует отметить, что S. agalactiae обладает большим количеством , факторов патогенности, транскрипцию которых регулируют ДНК-связывающие белки. Существует высокая вероятность того, что двухкомпонентная система Sakl88/Sakl89 участвует в активации транскрипции и других генов, _ участвующих в формировании вирулентного фенотипа S. agalactiae. Полный |-набор генов, транскрипцию которых регулирует система Sakl88/Sakl89, может ( быть выявлен при использовании микрочиповой технологии, что является одним из основных направлений дальнейших исследований.

Таким образом, результаты проведенного исследования убедительно доказывают, что двухкомпонентная регуляторная система Sakl88/Sakl89 контролирует экспрессию белка Вас и проявление вирулентных свойств S. agalactiae in vivo.

Выводы

1. Штаммы S. agalactiae, выделенные от коров, могут содержать ген bac и гены двухкомпонентной регуляторной системы Sakl 88/Sakl89; аллель 1.1 гена sak!92 является генетическим маркером штаммов S. agalactiae с геном bac, выделенных как от человека, так и от коров.

2. ДНК-связывающий белок Sakl 89 участвует в активации синтеза белка Вас; регуляция экспрессии белка Вас осуществляется на уровне транскрипции.

3. Двухкомпонентная регуляторная система Sakl 88/Sakl 89 контролирует проявление вирулентных свойств S. agalactiae in vivo; инактивация генов sakl88 и sak¡89 приводит к повышению вирулентности штамма при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей.

4. Природная делеция гуанина в положении 439 в гене sakl89 приводит к потере функциональной активности белка Sakl 89 и ингибированию синтеза белка Вас.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Рождественская A.C., M. Bhide, I. Mikula, I. Mikula Jr., A.B. Дмитриев. Использование полиморфизма гена sak0192 Streptococcus agalactiae в качестве молекулярно-эпидемиологического маркера // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2009. - №5. - С. 38-43.

2. Дмитриев A.B., Рождественская A.C., Зуткис A.A., Тотолян A.A. Направленная регуляция патогенных свойств стрептококков // Мед. Акад. Журнал. - 2009. - №9(4). - С. 50-58.

3. Rozhdestvenskaya A.S., Totolian A.A., Dmitriev A.V. Inactivation of DNA-binding response regulator Sakl89 abrogates beta-antigen expression and affects virulence of Streptococcus agalactiae // PLoS ONE. - 2010. - №5(4). - el0212.

Тезисы:

1. Rozhdestvenskaya A.S., A.V. Dmitriev, M. Bhide, I. Mikula, I. Mikula Jr. Structural and sequence polymorphism of sak0192 gene of bovine Streptococcus agalactiae strains as molecular epidemiological marker // Abstracts of XVIIth Lancefield Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Porto-Heli, Greece.-2008.-P. 222.

2. Рождественская A.C. Влияние ДНК-связывающего белка Sakl 89 на транскрипцию генов, метаболизм и вирулентность Streptococcus agalactiae II Аннотации работ победителей конкурса грантов Санкт-Петербурга 2008 года для

студентов, аспирантов, молодых ученых и молодых кандидатов наук. - 2008. - С. 46.

3. Rozhdestvenskaya A., Yu. Ilyasov, I. Mikula, M. Bhide, A. Totolian, A. Dmitriev. Inactivation of DNA-binding response regulator Sakl89 abrogates betaantigen expression and affects virulence of Streptococcus agalactiae И Abstracts of 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Helsinki, Finland.-2009.-P. 1843.

4. Рождественская A.C., Дмитриев A.B. Инактивация ДНК-связывающего белка Sakl89 Streptococcus agalactiae ингибирует экспрессию белка Вас // Тезисы 13 международной Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", г. Пущино. - 2009. - С. 41-42.

5. Zutkis A., Rozhdestvenskaya A., Srivishnupriya A., Chaussee M., Dmitriev A. Transcriptional regulation in Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae I/ Abstract of 25lh Congress of Czechoslovak Society of Micobiologists. -2010. - P. 27.

6. Рождественская A.C. Роль двухкомпонентной регуляторной системы BgrRS в синтезе белка Вас и контроле вирулентных свойств Streptococcus agalactiae II Мел. Акад. Журнал. -2010.-№10(5). - с. 91.

Отпечатано с готового оригинал-макета. ООО «САН-Принт» 197022, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., 54 Подписано в печать 12.08.2011 заказ № 080 от 12.08.2011, тир. 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рождественская, Анастасия Сергеевна

Введение.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Общие сведения о а^а/ас^ае.

1.1.1 & agalactiae и его роль в патологии человека и животных

1.1.2 Микробиологическая и биохимическая характеристика

51. agalactiae

1.1.3 Факторы патогенности Б. agalactiae

1.2 Особенности строения генома 5. а^а1асйае и методы генотипирования

1.2.1 Особенности строения генома 5".

§а1асйае

1.2.2 Методы сравнительного генетического анализа штаммов

5. а§а1асйае

1.2.3 Гетерогенность структуры и последовательности гена $ак192 -генетический маркер штаммов & agalactiae

1.3 Строение и механизм действия двухкомпонентных регуляторных систем

1.3.1 Общие сведения о двухкомпонентных системах

1.3.2 Сенсорные гистидинкиназы: особенности строения и функции

1.3.3 Белки-регуляторы ответа: особенности строения и функции

1.4 Двухкомпонентные регуляторные системы & аца1асйае

1.4.1 Двухкомпонентная система СзгКЭ/СоуЯВ

1.4.2 Другие двухкомпонентные системы & agalactiae

Введение Диссертация по биологии, на тему "Двухкомпонентная регуляторная система Sak188/Sak189 и ее влияние на свойства Streptococcus agalactiae"

Актуальность работы

Streptococcus agalactiae - грамположительный микроорганизм, вызывающий широкий спектр заболеваний, таких как пиелонефрит, артрит, абсцессы, эндокардит, септицемия и др. [1]. S. agalactiae может приводить к патологии беременности [2], вызывать тяжелые формы сепсиса, менингита, пневмонии новорожденных, часто приводящие к летальному исходу [3].

Не менее важное значение S. agalactiae имеет в ветеринарии, поскольку может вызывать хронические маститы у крупного рогатого скота, которые наносят большой экономический ущерб [4]. При этом многие домашние животные, не только коровы, но и кошки, собаки, лошади, свиньи и др., могут быть бессимптомными носителями S. agalactiae, что обуславливает наличие обширных очагов инфекции.

Использование молекулярно-генетических методов исследования позволяет провести сравнительный анализ штаммов S. agalactiae и предположить потенциальную способность отдельных штаммов вызывать инфекционные процессы в организмах различных хозяев. Так, например, наличие у штамма тех или иных генов патогенности является одной из важных характеристик его потенциальной способности к адгезии, инвазии и подавлению иммунного ответа хозяина. Ряд генов патогенности, таких как cylE, hylB, cfb, scaAB присутствуют во всех штаммах S. agalactiae, выделенных как от человека, так и от животных. В то же время, каждый из генов bca, Ьас и scpB присутствует не у всех штаммов [5].

Штаммы S. agalactiae способны быстро адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, используя различные регуляторные механизмы. Одним из таких механизмов является регуляция транскрипции генов двухкомпонентными регуляторными системами. Двухкомпонентные системы участвуют в регуляции метаболизма бактерий, включая их способность использовать различные питательные вещества [6], в регуляции устойчивости к стрессовым воздействиям и действию антибиотиков и др. [7]. Кроме того, двухкомпонентные регуляторные системы часто контролируют экспрессию генов патогенности, что отражается на взаимодействии микроорганизма и организма хозяина, обеспечивает колонизацию органов и тканей и приводит к патологическим процессам.

Одним из генов патогенности S. agalactiae является ген bac, интенсивно изучаемый отделом молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН в последние годы. При этом ген bac присутствует лишь у отдельной субпопуляции штаммов S. agalactiae, которые характеризуются специфическими рестрикционными паттернами ДНК, риботипами и аллелью гена sakl92 [8]. Ген bac кодирует белок Вас, способный связывать IgA человека и фактор H комплемента человека. Вас является перспективным кандидатом в состав вакцинного препарата [9, 10]. Недавно было показано, что ген bac локализован в пределах "островка" патогенности размером 8992 п.н., содержащего семь генов, в том числе гены двухкомпонентной системы sakl88 и sakl89, кодирующие сенсорную гистидинкиназу Sakl88 и ДНК-связывающий белок Sakl89 [11]. Учитывая близкое расположение этих генов, логично предположить участие двухкомпонентной системы Sakl 88/Sakl 89 в регуляции транскрипции гена bac и синтеза белка Вас, и, как следствие, в формировании вирулентного фенотипа S. agalactiae.

Таким образом, актуальность изучения S. agalactiae, его факторов патогенности, а также механизмов их регуляции и формирования вирулентного фенотипа не вызывают сомнений. Имеющиеся данные о двухкомпонентной регуляторной системе Sakl 88/Sakl 89, потенциально участвующей в формировании вирулентного фенотипа S. agalactiae, открывают перспективные направления исследований. Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящей работы.

Цель исследования

Изучение роли двухкомпонентной регуляторной системы Sakl 88/Sakl89 в регуляции метаболизма, транскрипции гена bac и синтеза белка Вас и вирулентности S. agalactiae.

Задачи работы

1. Изучить генетическую гетерогенность штаммов S. agalactiae на основе наличия у них генов патогенности и аллели гена sakl92; выявить штаммы, содержащие ген bac и гены двухкомпонентной регуляторной системы Sakl88/Sakl89.

2. Инактивировать гены sakl88 и sakl89 у штамма S. agalactiae и провести сравнительный анализ свойств штамма дикого типа и мутантных штаммов с использованием методов биохимии, микробиологии и молекулярной биологии.

3. В штамме S. agalactiae, мутантном по генам sakl88 и sakl89, восстановить экспрессию: а) обоих генов sakl88 и sak!89; б) только гена sakJ89; провести сравнительный анализ полученных штаммов.

4. Выявить штаммы, содержащие неактивные аллели генов sak!88 и/или sak!89; восстановить в них экспрессию генов sakl88 и sakl89 и провести последующий анализ свойств штаммов.

Научная новизна

- обнаружены штаммы S. agalactiae, выделенные от коров, содержащие ген bac и другие гены "островка" патогенности, в том числе, гены двухкомпонентной регуляторной системы Sakl88/Sak 189;

- показано, что штаммы S. agalactiae, выделенные от коров и содержащие ген bac, характеризуются аллелью 1.1 гена sakl92\

- методом инсерционного мутагенеза создан штамм S. agalactiae, мутантный по гену sakl88, и штамм, мутантный по обоим генам двухкомпонентной регуляторной системы sakl88 и sakl89;

- выявлено, что одновременная инактивация генов sakl88 и sakl89 приводит к значительному снижению уровня транскрипции гена bac (в 17 раз) и к ингибированию синтеза белка Вас in vitro, в то время как инактивация одного гена sakl88 методом инсерционного мутагенеза не влияет на уровень транскрипции гена bac и экспрессии белка Вас;

- показано, что восстановление под контролем природного промотора полноразмерного гена sakl89 в штамме S. agalactiae, мутантном по генам sakl88 и sakl89, приводит к активации синтеза белка Вас;

- обнаружен штамм S. agalactiae, содержащий ген bac, но не экспрессирующий белок Вас вследствие точечной делеции гуанина в положении 439 в гене sakl89;

- выявлено, что восстановление экспрессии полноразмерных генов sakl88 и sakl89 в штамме S. agalactiae, содержащем природную неактивную аллель гена sakl89 приводит к активации экспрессии белка Вас.

Научно-теоретическая и практическая значимость исследования

Полученные результаты необходимы для понимания механизма регуляции транскрипции гена патогенности bac S. agalactiae двухкомпонентной регуляторной системой Sakl88/Sakl 89. Эти данные открывают новое направление исследований по разработке методов направленного воздействия на регуляторные механизмы экспрессии факторов патогенности с целью влияния на вирулентные свойства микроорганизмов.

Положения, выносимые на защиту

1. В геномах штаммов S. agalactiae, выделенных от коров, может присутствовать "островок" патогенности, содержащий ген bac и гены двухкомпонентной регуляторной системы Sakl 88/Sak 189; штаммы S. agalactiae, выделенные от коров и человека, которые содержат ген bac, характеризуются аллелью 1.1 гена sakl92;

2. Инактивация генов sakl88 и sakl89 в штамме S. agalactiae приводит к уменьшению уровня транскрипции гена bac и экспрессии белка Вас, а также увеличению вирулентности при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей;

3. ДНК-связывающий белок Sakl89 необходим для активации синтеза белка Вас;

4. Природная делеция гуанина в положении 439 в гене sakl89 приводит к потере функциональной активности белка Sakl 89 и нарушению синтеза белка Вас.

Личный вклад автора включал самостоятельное формулирование задач работы, проведение большинства исследований, адаптацию ряда методов исследования, а также интерпретацию полученных результатов и их статистическую обработку. Методическая помощь была оказана Mikula I. Jr. при постановке и освоении метода SSCP и к.м.н. Грабовской К.Б., к.б.н. Королевой И.В., Зуткис A.A., Ильясовым Ю.Ю. при работе с лабораторными мышами.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 9 научных работах (из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 6 тезисов) и доложены на 5 международных и всероссийских конференциях: XVI Ilh Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, г. Порто-Хели, Греция, 2008; 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, г. Хельсинки, Финляндия, 2009; XIII Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", г. Пущино, 2009; 25th Congress of Czechoslovak Society of Microbiologists, г. С. Лесна, Словакия, 2010; Всероссийской научной конференции молодых ученых "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия", г. Санкт-Петербург, 2010.

Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН в 2007, 2008 и 2011 гг.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 154 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, 4 главы обзора литературы, описание материалов и методов, 4 главы результатов собственных исследований, обсуждение полученных результатов и общее заключение, выводы и список литературы. Работа содержит 9 таблиц и 57 рисунков, указатель литературы содержит 154 источника, в том числе 7 отечественных и 147 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Рождественская, Анастасия Сергеевна

Выводы

1. Штаммы S. agalactiae, выделенные от коров, могут содержать ген bac и гены двухкомпонентной регуляторной системы Sakl 88/Sakl 89; аллель 1.1 гена sakl92 является генетическим маркером штаммов S. agalactiae с геном bac, выделенных как от человека, так и от коров.

3. Двухкомпонентная регуляторная система Sakl 88/Sakl 89 контролирует проявление вирулентных свойств S. agalactiae in vivo', инактивация генов sakl88 и sakl89 приводит к повышению вирулентности штамма при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей.

4. Природная делеция гуанина в положении 439 в гене sakl89 приводит к потере функциональной активности белка Sakl89 и ингибированию синтеза белка Вас.

Благодарности

Научному руководителю, д.б.н. Дмитриеву A.B.

Сотрудникам отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН: д.м.н., акад. РАМН Тотоляну A.A., д.м.н., проф. Суворову А.Н. за комментарии и замечания при выполнении и написании диссертации; д.б.н. Гупаловой Т.В., к.м.н. Грабовской К.Б., к.б.н. Королевой И.В. за помощь в освоении новых методов исследования;

Зуткис A.A., Ильясову Ю.Ю. за помощь при работе с лабораторными мышами. д.б.н. Мокроусову И.В. за рецензирование диссертации.

Сотрудникам Университета ветеринарной медицины (г. Кошице, Словакия) за предоставление коллекции штаммов S. agalactiae, выделенных из коровьего молока, и реактивов и оборудования для проведения SSCP анализа.

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

4.1 Генетическая гетерогенность штаммов S. agalactiae, выделенных от коров

4.1.1 Комплексная характеристика штаммов S. agalactiae, выделенных от коров, по наличию у них генов bac, bca, scpB и аллели гена sakl92

S. agalactiae обладает большим количеством факторов патогенности, в число которых входят а-антиген, белок Вас, С5а пептидаза, белок, связывающий ламинин, гемолизин, гиалуронидаза, CAMP фактор, фактор адгезии, кодируемые генами bca, bac, scpB, Imb, cylE, hylB, cfb, scaAB соответственно. Наличие тех или иных генов патогенности определяет потенциальную возможность штамма проявлять вирулентные свойства. Как было показано ранее, ряд генов патогенности, таких как cylE, hylB, cfb, scaAB присутствуют во всех штаммах S. agalactiae, выделенных как от человека, так и от животных. В то же время, каждый из генов bca, bac и scpB присутствует не у всех штаммов [5].

121 штаммов была комбинация bac'bcascpB . Ею характеризовались 82 (71,9%) из 114 штаммов. В то же время, штаммы, одновременно содержащие три анализируемых гена {bac, bca и scpB), выявлены не были. Возможно, роль Вас белка, a-антигена и С5а пептидазы в развитии инфекционного процесса или бессимптомной колонизации у коров не столь важна, как у человека, и другие факторы патогенности имеют большее значение для патогенеза заболеваний. В пользу данной гипотезы служит тот факт, что С5а пептидаза способна инактивировать С5а фракцию комплемента человека, но не у животных [45].

Кроме наличия генов патогенности у исследуемых штаммов были проанализированы нуклеотидные последовательности гена sakl92. Ранее этот ген был использован в качестве маркера для внутривидовой дифференциации штаммов S. agalactiae, выделенных от человека [8]. В данной работе у штаммов, выделенных от коров, структурная организация гена sakl92 (рис. 3.5) в целом оказалась аналогичной таковой у штаммов, выделенных от человека [8]. У всех штаммов размер фрагмента гена в области 5'-конца составил 93 п.н. Фрагмент гена в области З'-конца у 108 из 114 штаммов представлял собой идентичную последовательность размером 34 п.н., а у 6 из 114 штаммов - размером 40 п.н. Внутренняя область гена оказалась наиболее вариабельной. Ее размер у различных штаммов зависел от количества правильно чередующихся прямых повторов размером 16 п.н. и спейсерных последовательностей размером 44 п.н. В целом, с учетом гетерогенности структуры гена sakl92, у 114 штаммов S. agalactiae, выделенных от коров, было обнаружено 8 различных аллелей гена (рис. 3.5).

Три из восьми аллелей гена sakl92 (аллели 1.1, 1.3 и 3.1), обнаруженные у коровьих штаммов, ранее были обнаружены и у штаммов, выделенных от человека [8]. В то же время у 44 (38,6%) из 114 штаммов, выделенных от коров, были выявлены аллели 1.5, 1.6, 2.3, 3.3 и 5.2, не обнаруженные у штаммов, выделенных от человека. Таким образом, полиморфизм гена sak.192 в ряде случаев может быть использован для установления естественной экологической ниши штамма.

При комплексном анализе аллели гена sak.192 и наличия генов патогенности у 114 штаммов S. agalactiae, выделенных от коров, было обнаружено 16 различных генетических вариантов (табл. 3.3). Наиболее распространенные генетические варианты S. agalactiae не содержали гены bac, bca, scpB и характеризовались аллелями 3.1, 1.3 и 5.2 гена sakl92. К ним принадлежало 28 (24,6%), 20 (17,5%) и 16 (14,0%) из 114 проанализированных штаммов соответственно. Три генетических варианта (№№ 8, 9 и 14) были обнаружены ранее у штаммов, выделенных от человека [5, 8], но большая часть штаммов, а именно, 100 (87,7%) из 114, проанализированных в рамках настоящего исследования, характеризовалась генетическими вариантами, не выявленными ранее. К их числу относились и штаммы, содержащие ген bac. Все они, как и изученные ранее штаммы, содержащие ген bac, характеризовались аллелью 1.1 гена sakl92, однако обладали комбинациями генов патогенности (bac+bca~scpB+ и bac+bca+scpB~), отличными от таковой для Ьас+ штаммов, выделенных от человека (bac+bca+ scpB+) [8]. Эти данные согласуются с результатами сравнительного анализа штаммов S. agalactiae с использованием других методов [43, 75, 80, 83, 86, 87], в том числе метода мультилокусного типирования [83, 92], свидетельствующими о значительных отличиях между штаммами, выделенными от разных хозяев.

В настоящее время метод мультилокусного типирования (MLST) часто применяют для того, чтобы получить информацию об эпидемиологическом и филогенетическом родстве штаммов [77, 79, 83, 92-94]. Для того чтобы оценить, существует ли корреляция между MLST типом и аллелью гена sakl92, в данной работе был проведен анализ геномов штаммов S. agalactiae, депонированых в GenBank (все штаммы выделены от человека) [68]. Так, аллель 1.1 гена sakl92 была обнаружена у штаммов Н36В и А909, которые относятся к MLST типам ST-6 и ST-7 соответственно. В этих штаммах также были обнаружены гены bac, bca и scpB. Следует отметить, что штаммы, относящиеся к ST-6 и ST-7, являются филогенетически близкородственными

123 и относятся к одному клонотипу СС-7 [150], что еще раз подтверждает принадлежность Ьас+ штаммов S. agalactiae к отдельной генетической линии.

Кроме аллели 1.1 гена sakl92 в геномах штаммов S. agalactiae, депонированных в GenBank, были выявлены аллели 1.3 (штаммы 515 и NEM316, оба ST-23), 2.2 (СОН1, ST-17), 2.4 (2603V/R, ST-110) и 3.1 (СJB111, ST-1, и 18RS21, ST-19). Что касается генов патогенности, то штаммы CJB111, 18RS21, NEM316, СОН1 и 2603V/R имели генотипы bac bca scpB+, а штамм 515 - bac bca+scpB+. Таким образом, установление аллели гена sakl92 в дополнение к характеристике штаммов по наличию генов патогенности позволяет дифференцировать штаммы различной степени филогенетического родства, в том числе, принадлежащие одному MLST типу.

Известно, что штаммы MLST типов ST-1, ST-19, ST-23 являются высокоинвазивными [151]. И в данной работе 14 из 114 проанализированных штаммов имели аллели гена sakl92 и гены патогенности, сходные с таковыми у штаммов CJB111 (ST-1, генетический вариант № 9, табл. 3.3), 18RS21 (ST-19, генетический вариант № 9), NEM316 (ST-23, генетический вариант № 8) и 515 (ST-23, генетический вариант № 14). Эти данные позволяют предположить существование некоторой связи между такими свойствами, как высокая инвазивность штаммов и потенциальная способность вызывать инфекционные заболевания у различных хозяев.

Таким образом, предложенный комплексный анализ штаммов на основе наличия генов патогенности и аллели гена sakl92 может быть использован как один из методов дифференциации штаммов, различающихся по экологической нише, степени филогенетического родства и вирулентности.

4.1.2 Генетические особенности штаммов S. agalactiae, содержащих ген bac

Как приведено в гл. 3.1, ген bac, обнаруженный до этого лишь у штаммов, выделенных от человека, был выявлен у 5 (4,4%) из 114 штаммов, выделенных от коров. При этом генотипы штаммов, содержащих ген Ьас и выделенных от коров (bac+bca~scpB+ и bac+bca+scpB~) отличались от генотипа штаммов, содержащих ген Ьас и выделенных от человека {bac+bca+scpB+). Учитывая, что ген Ьас расположен на "островке" патогенности, который фланкирован мобильными генетическими элементами (IS 1381 и последовательностью, гомологичной IS7/67 S. pneumoniae [11]), можно предположить, что произошел горизонтальный перенос "островка" патогенное™ от одного штамма S. agalactiae к другому, вызывающему инфекционные процессы в организме другого хозяина.

Согласно опубликованным данным, экспрессия белка Вас может давать штамму дополнительные преимущества при колонизации макроорганизма [58]. Как указывалось ранее, свойствами белка Вас, определяющими его значение как фактора патогенное™ S. agalactiae, является способность связывать Fc фрагменты IgA человека и фактор Н комплемента человека [56]. По этим признакам белок Вас относят к факторам подавления иммунного ответа хозяина. Кроме того, связывание IgA человека и фактора Н комплемента человека может стерически затруднять распознавание поверхностных эпитопов белков и полисахаридов S. agalactiae [21]. По этой причине удельный вес штаммов S. agalactiae, содержащих ген Ьас, мог увеличиться среди общего числа циркулирующих штаммов.

С другой стороны, все Ьас+ штаммы характеризуются аллелью 1.1 гена sakl92, которая не была обнаружена у штаммов, не содержавших ген Ьас. На этом основании можно высказать гипотезу, что один из клонов S. agalactiae, обладавший аллелью 1.1 гена sakl92, получил путем горизонтального генетического переноса "островок" патогенное™, содержавший ген Ьас.

Учитывая вышеизложенные преимущества, которые может давать экспрессия белка Вас, потомки клона, содержащего ген Ьас, распространились не только в уже освоенной экологической нише, но и адаптировались к новой, т.е. стали причиной заболеваний другого хозяина.

При этом новые штаммы могли приобрести новые гены патогенности,

125 которыми не обладал первоначальный клон, или, наоборот, утратить ряд из них. Этим можно объяснить различие в наборах генов патогенности штаммов, выделенных от человека и от коров, а наличие одного предка могло стать вероятной причиной того, что все штаммы, содержащие ген bac, относятся к отдельной генетической линии и обладают сходными признаками [5, 43]. tatg cagttcatattggaagggtatactgtagataaataaaatattggag ga tatcga sak189

77% rH) 6 sah 188

78% hk06 sakm

86% ген гтогегического белка hac

S. agalactiae cbpA

S. pneumoniae

67% tatacagttcatattgaag taatatag iaa ggttaaagaaaaaatatagaag gaaataaa с

Рисунок 4.1 - Схематичное изображение анализируемых фрагментов ДНК S. agalactiae и S. pneumoniae. Приведенные нуклеотидные последовательности соответствуют промоторным областям генов Ьас и cbpA

Для проверки этого предположения и изучения возможной роли двухкомпонентной системы 8ак188/8ак189 в транскрипции генов и проявлении вирулентных свойств 5*. agalactiae в рамках настоящего исследования гены Бак188 и Бак189 были инактивированы у штамма дикого типа 168/00. Использование для этого инсерционного мутагенеза привело к нарушению целостности нуклеотидных последовательностей генов зак!88 и $ак189 и изменению первичных структур соответствующих белков (рис. 3.23). Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей гистидинкиназы и ДНК-связывающего белка штамма 168/00 и соответствующих белков, потенциально экспрессируемых мутантными штаммами, выявил значительные различия в структурах белковых молекул. В частности, в мутантных штаммах произошла замена 95 а.к. на С-конце гистидинкиназы 5ак188 на 191 а.к., а 51 а.к. на С-конце ДНК-связывающего белка 8ак189 - на 15 а.к. (рис. 3.25). Дальнейший анализ и моделирование трехмерных структур белковых молекул показали, что в штамме, мутантном по гену зак188, были утрачены сайты связывания АТФ и М§2" в белке

8ак188, а в штамме, мутантном по гену зак189, - домен белка 8ак189, ответственный за связывание с ДНК (рис. 3.25, 3.26).

Как известно, без участия АТФ и ионов молекула сенсорной гистидинкиназы не способна к фосфорилированию. В то же время, ДНК-связывающий белок-регулятор ответа при отсутствии в нем эффекторного домена не обладает возможностью взаимодействовать с промоторными областями ДНК и влиять на уровни транскрипции генов [99, 100, 101, 105]. Вышеизложенное позволило предположить наличие изменений в функциональных активностях белков 8ак188 и 8ак189.

Использование метода инсерционного мутагенеза для инактивации гена Бак189 привело не только к существенным изменениям в нуклеотидной последовательности этого гена, но и к значительному удалению гена зак188 от промотора (рис. 3.23). По данным, опубликованным в литературе, интеграция плазмиды между промотором и геном сенсорной гистидинкиназы вызывает нарушение транскрипции этого гена, что используют для получения мутантов, не экспрессирующих гистидинкиназу [143, 152]. Таким образом, инактивация гена $ак189 методом инсерционного мутагенеза приводит к получению двойного мутанта по генам Бак188 и зак189.

Сравнительный анализ морфологических и культуральных свойств штамма дикого типа 168/00 и штаммов, мутантных по генам зак188 и $ак188/зак189, не выявил существенных различий в форме и размере клеток и колоний. При этом инактивация генов зак!88 и зак189 привела к некоторому снижению скорости роста штаммов при росте в жидкой питательной среде ТосШ-Не\у1И (рис. 3.27). Проведение дополнительных экспериментов, а именно, анализ динамики роста штаммов в питательных средах с химически определенным составом в условиях недостатка тех или иных компонентов (сахаров, аминокислот) поможет в дальнейшем выявить те метаболические пути, в регуляции которых задействована двухкомпонентная система 8ак188/8ак189. Кроме того, применение современных методик, таких как полногеномный анализ уровня

129 транскрипции генов и количественная ПЦР в режиме реального времени, позволят определить, какие гены, участвующие в процессах метаболизма, входят в состав регулона системы Sakl88/Sakl89.

Помимо морфологических и культуральных свойств штамма 168/00 и штаммов, мутантных по генам sakl88 и sakl88/sakl89, была изучена экспрессия внутриклеточных и поверхностных белков в этих штаммах. Сравнительный анализ клеточных лизатов перечисленных штаммов методами SDS-электрофореза, двумерного электрофореза и Western-blot выявил различия в экспрессии белка весом около 150 кДа, который по способности связывать IgA человека был идентифицирован как белок Вас. Соответствующий этому белку бэнд присутствовал в клеточных лизатах штамма 168/00 и штамма, мутантного по гену sakl88, но отсутствовал в клеточном лизате штамма, мутантного по обоим генам sakl88 и sakl89 (рис. 3.28, 3.29). Таким образом, инактивация гена sakl88 не оказала влияния на уровень экспрессии белка Вас, а инактивация обоих генов sakl88 и sakl89 привела к ингибированию его синтеза. Полученные данные позволяют предположить, что ДНК-связывающий белок Sakl89 играет ключевую роль в регуляции синтеза белка Вас.

Использование метода количественной ПЦР в режиме реального времени позволило выявить, что уровень транскрипции гена Ьас в штамме, мутантном по гену sakl88, незначительно отличался от такового в штамме 168/00. В то же время, уровень транскрипции гена Ьас в штамме, мутантном по генам sakl88 и sakl89, оказался примерно в 17 раз ниже, чем в штамме 168/00. Таким образом, регуляция экспрессии белка Вас осуществляется на уровне транскрипции.

Для дальнейшего анализа роли регуляторной системы Sakl88/Sakl89 в активации синтеза белка Вас была исследована коллекция из 40 штаммов S. agalactiae, содержащих ген Ъас, методами SDS-электрофореза и Western-blot.

В основу этого анализа легло предположение, что штаммы, содержащие ген

Ьас, но не экспрессирующие белок Вас, могли обладать неактивными

130 аллелями генов Бак188 и/или зак!89. В результате исследования среди 40 штаммов был выявлен штамм А49У, не экспрессирующий белок Вас. При этом в гене Бак189 была обнаружена делеция одного нуклеотида (соответствующего 439-му нуклеотиду в гене зак!89 штамма 168/00), которая привела к изменению открытой рамки считывания и нарушению аминокислотной последовательности белка 8ак189. Так, согласно компьютерному анализу, в результате делеции произошла замена 72 а.к. на С-конце ДНК-связывающего белка Эак189 на 10 а.к., при этом были утрачены все 9 а.к., обеспечивающих связывание ДНК. Сравнительный анализ третичных структур белка Эак189 в штаммах 168/00 и А49У выявил отсутствие ДНК-связывающего домена в белке 8ак189 в штамме А49У (рис. 3.38).

Для того, чтобы доказать, что ингибирование экспрессии белка Вас в штамме 168/00, мутантном по генам Бак188 и Бак189, и в штамме дикого типа А49У вызвано нарушением функциональной активности двухкомпонентной регуляторной системы 8ак188/8ак189, экспрессия обоих генов Бак188 и зак189 была восстановлена в этих штаммах. Для этого на основе вектора рАТ29, содержащего ген устойчивости к спектиномицину и способного к автономной репликации в грамположительных кокках, сконструировали рекомбинантную плазмиду pBgrRS(P), содержащую гены 5ак188 и зак189 под контролем природного промотора.

Трансформация штамма 168/00, мутантного по генам Бак188 и зак189, и штамма А49У рекомбинантной плазмидой pBgrRS(P) привела к восстановлению экспрессии белка Вас в обоих штаммах. Полученный результат убедительно доказывает участие двухкомпонентной регуляторной системы 8ак188/8ак189 в активации экспрессии белка Вас.

Для подтверждения ключевой роли ДНК-связывающего белка 8ак189 в регуляции синтеза белка Вас, дополнительно осуществили восстановление экспрессии одного лишь гена зак189 в штамме 168/00, мутантном по генам

Бак 188 и зак189. Для этого использовали сконструированную на основе

131 вектора рАТ29 рекомбинантную плазмиду pRfull(P), содержащую полноразмерный ген sakl89 под контролем природного промотора. Сравнительный анализ штамма 168/00, штамма, мутантного по генам sakl88 и sakl89, и штамма, мутантного по генам sakl88 и sak!89, содержащего рекомбинантную плазмиду pRfull(P), методом SDS-электрофореза показал, что восстановление экспрессии ДНК-связывающего белка Sakl89 привело к активации синтеза белка Вас (рис. 3.35). Таким образом, проведенные эксперименты продемонстрировали, что двухкомпонентная система Sakl88/Sakl89 участвует в регуляции транскрипции гена bac и синтеза белка Вас, при этом именно экспрессия ДНК-связывающего белка Sakl89 при данных условиях является необходимой.

Установление функций сенсорной гистидинкиназы требует проведения дополнительных экспериментов. Для выявления сигналов окружающей среды, воспринимаемых гистидинкиназой, осуществляют культивирование штамма в различных условиях и последующий сравнительный анализ его свойств. В литературе описаны двухкомпонентные регуляторные системы, активность которых зависит от кислотности питательной среды (например, CovRS у S. agalactiae [126]), от концентрации ионов Mg (PhoPQ у Salmonella spp. [153]), присутствия антибиотиков (VraSR у S. aureus [154]) и др. С другой стороны, существует большая вероятность того, что роль сенсорной гистидинкиназы Sakl88 как регуляторной молекулы проявляется в условиях инфекционного процесса, происходящего in vivo, который не может быть достоверно воспроизведен в лабораторных условиях.

Sakl88/Sakl89 является не единственной двухкомпонентной системой,

ДНК-связывающий белок которой в условиях проведения экспериментов выполняет свои функции независимо от экспрессии родственной ему сенсорной гистидинкиназы. Так, при изучении двухкомпонентной системы

HK06/RR06 S. pneumoniae было показано, что делеция гена белка-регулятора ответа ггОб в штамме дикого типа приводит к снижению уровня транскрипции смежно-расположенного гена cbpA, в то время как после

132 делеции гена сенсорной гистидинкиназы hk06 уровень транскрипции гена сЪрА возрастает в пять раз [143]. Вероятно, ДНК-связывающие белки Sakl89 и RR06 используют для фосфорилирования не только молекулы родственных гистидинкиназ, но и иные агенты, такие как другие гистидинкиназы клетки или низкомолекулярные соединения. Более подробное изучение этого вопроса позволит установить факторы, приводящие к переходу белка Sakl89 в фосфорилированное состояние, и тем самым обнаружить возможные механизмы влияния на его функциональную активность.

4.2.2 Сравнительный анализ вирулентных свойств штамма S. agalacíiae дикого типа 168/00 и штаммов, мутантных по генам sakl88 и sakl89

Учитывая важную роль S. agalacíiae как патогена для человека и животных, особый интерес представляет его способность проявлять вирулентные свойства. Вирулентность штамма зависит от наличия генов факторов патогенности, его способности использовать разнообразные питательные вещества, оказывать влияние (как правило, подавлять) на иммунный ответ хозяина и приспосабливаться к изменяющимся условиям окружающей среды.

Для того чтобы выяснить, оказывает ли влияние двухкомпонентная система Sakl88/Sakl89 на вирулентные свойства штамма S. agalacíiae 168/00 in vivo, в рамках настоящего исследования было применено моделирование стрептококковой инфекции на лабораторных мышах. Суспензии штамма о

168/00 и мутантных штаммов с концентрацией возбудителя 10 КОЕ/животное вводили внутрибрюшинно. Контрольной группе животных осуществляли инъекцию физиологического раствора. Наблюдения вели в течение 10 дней после заражения. Анализ динамики гибели мышей показал, что заражение штаммом, мутантным по генам sakl88 и sakl89, привело к гибели 87% животных, что существенно больше, чем для штамма 168/00 (47% животных) и штамма, мутантного по гену sakl88 (52% животных) (рис.

3.33). Таким образом, инактивация генов двухкомпонентной системы Sakl88/Sakl89 привела к повышению вирулентных свойств штамма при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей.

Этот результат, на первый взгляд, противоречит полученным ранее данным о том, что инактивация генов sakl88 и sakl89 приводит к уменьшению уровня транскрипции гена bac и синтеза белка Вас -признанного фактора патогенности S. agalactiae. Однако известно, что наличие белка Вас коррелирует с возникновением иммунологической толерантности, предоставляющей возможность S. agalactiae длительно персистировать в организме хозяина и не вызывать выраженный иммунный ответ. При этом, внутрибрюшинное заражение мышей позволяет оценить вирулентность штамма при инвазивном пути инфекционного процесса, поскольку перед возбудителем отсутствуют естественные защитные барьеры, такие как кожные покровы или слизистые, нормальная микрофлора и др. Таким образом, вполне логичным представляется, что ингибирование синтеза белка Вас, способствующего бессимптомной колонизации S. agalactiae в организме хозяина, привело к повышению вирулентности при инвазивном пути развития инфекции.

Следует отметить, что S. agalactiae обладает большим количеством факторов патогенности, транскрипцию которых регулируют ДНК-связывающие белки. Существует высокая вероятность того, что двухкомпонентная система Sakl88/Sakl89 участвует в активации транскрипции и других генов, участвующих в формировании вирулентного фенотипа S. agalactiae. Полный набор генов, транскрипцию которых регулирует система Sakl88/Sakl89, может быть выявлен при использовании микрочиповой технологии, что является одним из основных направлений дальнейших исследований.

Резюмируя данные, полученные при выполнении настоящей работы, можно заключить, что они обладают несомненной научной новизной. Так, впервые выявлены штаммы S. agalactiae, выделенные от коров, содержащие ген bac, а также другие гены, входящие в состав "островка" патогенности, в том числе гены двухкомпонентной регуляторной системы sakl88 и sakl89. Впервые показано, что двухкомпонентная система Sakl88/Sakl89 участвует в регуляции транскрипции гена bac и экспрессии белка Вас, а также влияет на скорость роста штамма в обогащенной жидкой питательной среде и его вирулентность при внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей. Впервые обнаружено, что восстановление одного лишь sakl89 в штаммах, мутантных по генам sakl88 и sakl89, приводит к активации синтеза белка Вас. Впервые выявлен штамм, нарушение экспрессии белка Вас в котором вызвано природной делецией одного нуклеотида в гене ДНК-связывающего белка Sakl89.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рождественская, Анастасия Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Sendi, P. Invasive group В streptococcal disease in non-pregnant adults: a review with emphasis on skin and soft-tissue infections / P. Sendi, L. Johansson, A. Norrby-Teglund // Infection. 2008. - V. 36. - P. 100-111.

2. Group В streptococcus and pregnancy: a review / J. W. Larsen, J. L. Sever // Am. J. Obstet. Gynecol. 2008. - V. 198. - P. 440-448.

3. Group В streptococcus: early- and late-onset infections / A. Berardi, C. Tzialla, M. Riva et al. // J. Chemother. 2007. - V. 19. - P. 24-27.

4. Keefe, G. P. Streptococcus agalactiae mastitis: a review // Can. Vet. J. -1997,-V. 38.-P. 429-437.

5. Genetic heterogenity of the pathogenic potentials of human and bovine group В streptococci / A. Dmitriev, E. Shakleina, L. Tkacikova et al. // Folia Microb. 2002. - V. 47. - P. 291-295.

6. Biological insights from structures of two-component proteins / R. Gao, A. M. Stock // Annu. Rev. Microbiol. 2009. - V. 63. - P. 133-154.

7. Jordan, S. Cell envelope stress response in gram-positive bacteria / S. Jordan, M. I. Hutchings, T. Mascher // FEMS Microbiol. Rev. 2008. - V. 32. - P. 107-146.

8. Дмитриев, А. В. Ген sak0192 Streptococcus agalactiae содержит прямые повторы и спейсеры генетические маркеры для характеристики штаммов / А. В. Дмитриев, А. Д. Шен, А. А. Тотолян // Мол. Ген. Микроб. Вирусол. - 2007. - Т. 4. - С. 37-41.

9. Экспериментальная оценка рекомбинантных полипептидов как вакцины против стрептококков группы В / Г. Ф. Леонтьева, А. Н. Суворов, JI. Ф. Мерингова и др. // ЖМЭИ. 2005. - Т. 2. - С. 35-40.

10. Протективные свойства некоторых поверхностных белков стрептококков группы В / К. Б. Грабовская, Г. Ф. Леонтьева, Л. Ф. Мерингова и др. // ЖМЭИ. 2007. - Т. 5. - С. 44-50.

11. Adjacent location of bac gene and two-component regulatory system genes within the putative Streptococcus agalactiae pathogenicity island / A. Dmitriev, Y. H. Yang, A. D. Shen, A. A. Totolian // Folia Microbiol. 2006. -V. 51.-P. 229-235.

12. Научно-организационные и методические основы эпидемиологического надзора за стрептококковой инфекцией группы А в условиях крупного города / Н. Н. Филатов, Н. И. Брико, И. Л. Шакханина и др. // ЖМЭИ. -1998.-Т. 1.-С. 40-45.

13. Spellerberg, В. Pathogenesis of neonatal Streptococcus agalactiae infections // Microbes and infections. 2000. - V. 2. - P. 1733-1742.

14. Relation between neonatal pneumoniae and maternal carriage of В streptococci / К. K. Christensen, N. Svenningsen, K. Dahlander et al. // Scand. J. Infect. Dis. 1982. - V. 14. - P. 261-266.

15. Duben, J. Group В streptococci in the female genital tract and nosocomial colonization of newborn / J. Duben, J. Jelinkova, M. Neubauer // Infect. Immun. 1978. - V. 23,- P. 89-94.

16. Ferrieri, P. Epidemiology of group В streptococcal carriage in pregnant women and newborn infants / P. Ferrieri, P. P. Cleary, A. E. Seeds // J. Med. Microb. 1977.-V. 10.-P. 103-114.

17. Bacterial meningitis in the first three months of life / F. A. Riordan, A. P. Thomson, J. A. Sills, C. A. Hart // Postgrad. Med. J. 1995. - V. 71. - P. 3638.

18. Boyer, К. M. Neonatal group В streptococcal infections // Curr. Opin. Pediatr. 1995.-V. 7.-P. 13-18.

19. Тотолян, А. А. Стрептококки группы В в патологии человека / А. А. Тотолян, А. Н. Суворов, А. В. Дмитриев / под общ. ред. А. А. Тотоляна // СПб.: Человек. 2009. - 212 с.

20. Immunochemistry of capsular type polysaccharide and virulence properties of type VI Streptococcus agalactiae (group В streptococci) / C. von Hunolstein, S. D'Ascenzi, B. Wagner et al. // Infect. Immun. 1993 - V. 61. -P. 1272-1280.

21. Structural and immunochemical characterization of the type VIII group В Streptococcus capsular polysaccharide / G. Kogan, D. Uhrin, J. R. Brisson et al. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 8786-8790.

22. Берджи. Краткий определитель бактерий Берджи // М.: Мир. 1980. -С. 269-280.

23. Genome sequence of Streptococcus agalactiae, a pathogen causing invasive neonatal disease / P. Glaser, C. Rusniok, C. Buchrieser et al. // Мої. Microbiol. 2002. - V. 45. - P. 1499-1513.

24. Complete genome sequence and comparative genomic analysis of an emerging human pathogen, serotype V Streptococcus agalactiae / H. Tettelin, V. Masignani, M. J. Cieslewicz et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. -V. 99.-P. 12391-12396.

25. Mickelson, M.N. Glucose degradation, molar growth yields, and evidence for oxidative phosporylation in Streptococcus agalactiae II J. Bacteriol. 1972. -V. 109. - P. 96-105.

26. Growth and amino acid requirements of various strains of group В streptococci / T. W. Milligan, Т. I. Doran, D. C. Straus, S. J. Mattingly // J. Clin. Microbiol. 1978. - V. 7. - P. 28-33.

27. Rajagopal, L. Understanding the regulation of group В streptococcal virulence factors // Future Microbiol. 2009. - V. 4. - P. 201-221.

28. Prevention of C3 deposition by capsular polysaccharide is a virulence mechanism of type III group В streptococci / M. B. Marques, D. L. Kasper,

29. M. K. Pangburn, M. R. Wessels // Infect. Immun. 1992. - V. 14. - P. 39863993.

30. Impaired antibody response to group B streptococcal type III capsular polysaccharide in C3- and complement receptor 2-deficient mice / O. Pozdnyakova, H. K. Guttormsen, F. N. Lalani et al. // J. Immunol. 2003. -V. 170.-P. 84-90.

31. Definition of a bacterial virulence factor: sialylation of the group B streptococcal capsule / M. R. Wessels, C. E. Rubens, V. J. Benedi, D. L. Kasper // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 8983-8987.

32. Group B streptococcal (3-hemolysin/cytolysin promotes invasion of human lung epithelial cells and the release of interleukin-8 /K. S. Doran, J. C. Chang, V. M. Benoit et al. // J. Infect. Dis. 2002. - V. 185. - P. 196-203.

33. Doran, K.S. Group B streptococcal 3-hemolysin/cytolysin activates neutrophil signaling pathways in brain endothelium and contributes to development of meningitis / K. S. Doran, G. Y. Liu, V. Nizet // J. Clin. Invest. 2003. - V. 112.-P. 736-744.

34. Hensler, M. E. Group B streptococcal (3-hemolysin/cytolysin directly impairs cardiomyocyte viability and unction / M. E. Hensler, S. Miyamoto, V. Nizet // PLoS ONE. 2008. - V. 3. - e. 2446.

35. Transport of multidrug resistance substrates by the Streptococcus agalactiae hemolysin trasporter / B. Gottschalk, G. Broker, M. Kuhn et al. // J. Bacteriol. 2006. - V. 188. - P. 5984-5992.

36. Nizet, V. Streptococcal 3-hemolysins: genetics and role in disease pathogenesis // Trends Microbiol. 2002. - V. 10. - P. 575-580.

37. Sword and shield: linked group B streptococcal (3-hemolysin/cytolysin andcarotenoid pigment function to subvert host phagocyte defense / G. Y. Liu, K.141

38. S. Doran, T. Lawrence e al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101. P. 14491-14496.

39. CAMP factor is not essential for systemic virulence of group B streptococcus / M. E. Hensler, D. Quach, C. J. Hsieh et al. // Microb. Pathog. 2008. - V. 44.-P. 84-88.

40. CovS/CovR of group B streptococcus: a two-component global regulatory system involved in virulence / M.-C. Lamy, M. Zouine, J. Fert et al. // Mol. Microbiol. 2004. - V. 54. - P. 1250-1268.

41. A role for C5 and C5-ase in the acute neutrophil response to group B streptococcal infections / J. F. Bohnsack, K. Widjaja, S. Ghazizadeh et al. // J. Infect. Dis. 1997. - V. 175. - P. 847-855.

42. Comparative genetic study of group B streptococcal strains of human and bovine origin / A. Dmitriev, L. Tkacikova, A. Suvorov et al. // Folia Microbiol. 1999. - V. 44. - P. 449-453.

43. Horizontal gene transfer and host specificity of beta-haemolytic streptococci: the role of a putative composite transposon containing scpB and Imb / C. Franken, G. Haase, C. Brandt et al. // Mol. Microbiol. 2001. - V. 41. - P. 925-935.

44. Bohnsack, J. F. Restricted ability of group B streptococcal C5a-ase to inactivate C5a prepared from different animal species / J. F. Bohnsack, J. K. Chang, H. R. Hill. //Infect. Immun. 1993. - V. 61. - P. 1421-1426.

45. Identification of novel adhesions from group B streptococci by use of phage display reveals that C5a peptidase mediates fibronectin binding / C. Beckmann, J. D. Waggoner, T. O. Harris et al. // Infect. Immun. 2002. -V. 70.-P. 2869-2876.

46. The group B streptococcal C5a peptidase is both a specific protease and an invasion / Q. Cheng, D. Stafslien, S. S. Purushothaman, P. Cleary // Infect. Immun. 2002. - V. 70. - P. 2408-2413.

47. Immunization with C5a peptidase or peptidase-type III polysaccharideconjugate vaccines enhances clearance of group B streptococci from lungs of142infected mice / Q. Cheng, S. Debol, H. Lam et al. // Infect. Immun. 2002. -V. 70.-P. 6409-6415.

48. Genetic polymorphisms of group В streptococcus scpB alter functional activity of a cell-associated peptidase that inactivates C5a / J. F. Bohnsack et al. // Infect. Immun. 2000. - V. 68. - P. 5018-5025.

49. Santillan, D. A. Protective immunization in mice against group В streptococci using encapsulated C5a peptidase / D. A. Santillan, M. E. Andracki, S. K. Hunter // Am. J. Obstet. Gynecol. 2008. - V. 198. - 114 el-e6.

50. Рекомбинантные фрагменты консервативных белков СГВ как основа специфической вакцины / А. Н. Суворов, К. Б. Грабовская, Г. Ф. Леонтьева и др. // ЖМЭИ. 2010. - Т. 2. - С. 44-50.

51. Molecular profiles of group В streptococcal surface protein antigen genes: relationship to molecular serotypes / F. Kong, S. Gowan, D. Martin et al. // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40. - P. 620-626.

52. Molecular analysis of clinical group В streptococcal strains by use of a and (3 gene probes / A. Suvorov, A. Dmitriev, I. Ustinovitch et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997. -V. 17. - P. 149-154.

53. Nagano, N. High expression of a C protein (3 antigen gene among invasive strains from certain clonally related groups of type la and lb group B streptococci / N. Nagano, Y. Nagano, F. Taguchi // Infect. Immun. 2002. -V. 70.-P. 4643-4649.

54. Contribution of Mn-cofactored superoxide dismutase (SodA) to the virulence of Streptococcus agalactiae / C. Poyart, E. Pellegrini, O. Gaillot et al. // Infect. Immun.-2001.-V. 69.-P. 5098-5106.

55. Long-range mapping of the Streptococcus agalactiae phylogenetic lineage restriction digest pattern type III-3 reveals clustering of virulence genes / J. F. Bohnsackm, A. A. Whiting, R. D. Bradford et al. // Infect. Immun. 2002. -V. 70.-P. 134-139.

56. Mosaicism in the alpha-like protein genes of group B streptococci / C. S. Lachenauer, R. Creti, J. L. Michel, L. C. Madoff // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 9630-9635.

57. Surface proteins of grampositive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope / W. W. Navarre, O. Schneewind // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. - V. 63. - P. 174-229.

58. Large, identical, tandem repeating units in the C protein alpha antigen gene, bca, of group B streptococci / J. L. Michel, L. C. Madoff, K. Olson et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 10060-10064.

59. Identification of a family of streptococcal surface proteins with extremely repetitive structure / M. Wastfelt, M. Stalhammar-Carlemalm, A. M. Delisse et al. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 18892-18897.

60. Alpha C protein of group B Streptococcus binds host cell surface glycosaminoglycan and enters cells by an actin-dependent mechanism / M. J. Baron, G. R. Bolduc, M. B. Goldberg et al. // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279.-P. 24714-24723.

61. Genome analysis of multiple pathogenic isolates of Streptococcus agalactiae: implications for the microbial "pan-genome" / H. Tettelin, V. Masignani, M. J. Cieslewicz et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2005. - V. 102. - P. 13950-13955.

62. Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes / J. J. Ferretti, W. M. McShan, D. Ajdic et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -2001,-V. 98.-P. 4658-4663.

63. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae / H. Tettelin, K. E. Nelson, I. T. Paulsen et al. // Science. -2001.-V. 293.-P. 498-506.

64. The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. Lactis IL 1403 / A. Bolotin, P. Wincker, S. Mauger et al. // Genome Res. 2001. - V. 11. - P. 731-753.

65. Kreikemeyer, B. Virulence factors regulation and regulatory networks in Streptococcus pyogenes and their impact on pathogen-host interactions / B. Kreikemeyer, K. S. Mclver, A. Podbielski // TRENDS in Microbiol. 2003. -V. 11.-P. 224-232.

66. Aberrations in expression of the ß antigen of Streptococcus agalactiae / B. Lars, O. G. Brakstad, J. A. Maeland et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1997. -V. 418.-P. 999-1001.

67. DNA restriction profiles of nontypable group B streptococcal clinical isolates / P. Ferrieri, D. S. Cho, C. Livdahl et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1997. -V. 418.-P. 343-346.

68. Characterization of Streptococcus agalactiae isolates of bovine and human origin by randomly amplified polymorphic DNA analysis / G. Martinez, J. Harel, R. Higgins et al. // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 71-78.

69. Streptococcus agalactiae pulsed-field gel electrophoresis patterns cross capsular types / P. Pillai, U. Srinivasan, L. Zhang et al. // Epidemiol. Infect.- 2009. V. 137.-P. 1420-1425.

70. Clonal analysis of colonizing group B Streptococcus, serotype IV, an emerging pathogen in the United States / M. J. Diedrick, A. E. Flores, S. L. Hillier et al. // J. Clin. Microbiol. 2010. - V. 48. - P. 3100-3104.

71. Genetic characterization and diversity of Streptococcus agalactiae isolates with macrolide resistance / M. Brzychczy-Wloch, T. Gosiewski, M. Bodaszewska et al. // J. Med. Microbiol. 2010. - V. 59. - P. 780-786.

72. Molecular characterization of erythromycin-resistant Streptococcus agalactiae strains / A. S. Domelier, N. van der Mee-Marquet et al. // J. Antimicrob. Chemoter. 2008. - V. 62. - P. 1227-1233.

73. Chromosomal analysis of group B streptococcal clinical strains; bac genepositive strains are genetically homogenous / A. Dmitriev, Y. Y. Hu, A. D. Shen et al. // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 208. - P. 93-98.

74. Correlation between group B streptococcal genotypes, their antimicrobial resistance profiles, and virulence genes among pregnant women in Lebanon / A. Hannoun, M. Shehab, M. T. Khairallah et al. // Int. J. Microbiol. 2009.- e796512.

75. Association of group B streptococcus colonization and bovine exposure: a prospective cross-sectional cohort study / S. D. Manning, A. C. Springman, A. D. Million et al. // PLoS ONE. 2010. - V. 20. - e8795.

76. Genotyping of Streptococcus agalactiae (group B streptococci) isolated from vaginal and rectal swabs of women at 35-37 weeks of pregnancy / N. A. El Alia, I. Tency, G. Claeys et al. // BMC Infect. Dis. 2009. - V. 11. - P. 153.

77. Prophagic DNA fragments in Streptococcus agalactiae strains and association with neonatal meningitis / N. van der Mee-Marquet, A. S. Domelier, L. Mereghetti et al. // J. Clin. Microbiol. 2006. - V. 44 - P. 1049-1058.

78. Distribution of serotypes and antimicrobial resistance genes among Streptococcus agalactiae isolates from bovine and human hosts / B. Dogan, Y. H. Schukken, C. Santisteban, K. J. Boor // J. Clin. Microbiol. 2005. - V. 43.-P. 5899-5906.

79. Molecular subtyping and characterization of bovine and human Streptococcus agalactiae isolates / S. Sukhnanand, B. Dogan, M. O. Ayodele et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. - V. 43. - P. 1177-1186.

80. Tkacikova, E. Molecular epidemiology of group B streptococcal infections / E. Tkacikova, I. Mikula, A. Dmitriev // Folia Microbiol. (Praha). 2004. - V. 49.-P. 387-397.

81. Analysis of restriction fragment length polymorphisms of the insertion sequence IS7387 in group B streptococci / G. S. Tamura, M. Herndon, J. Przekwas et al. // J. Infect. Dis. 2000. - V. 181. - P. 364-368.

82. Granlund, M. Identification of a novel insertion element, IS1548, in group B streptococci, predominantly in strains causing endocarditis / M. Granlund, L. Oberg, M. Sellin, M. Norgren // J. Infect. Dis. 1998. - V. 177. - P. 967976.

83. Identification of a novel insertion sequence element in Streptococcus agalactiae II B. Spellerberg, S. Martin, C. Franken et al. // Gene. 2000. -V. 241. -P. 51-56.

84. Emergence and global dissemination of host-specific Streptococcus agalactiae clones / U. B. Sorensen, K. Poulsen, C. Ghezzo et al. // MBio. -2010.-V. 1. e00178-10.

85. Radtke, A. Rapid multiple-locus variant-repeat assay (MLVA) for genotyping of Streptococcus agalactiae / A. Radtke, B. A. Lindstedt, J. E. Afset, K. Berg//J. Clin. Microbiol. -2010. -V. 48. P. 2502-2508.

86. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary tract infection in adults / K. B. Ulett, W.H. Jr. Benjamin, F. Zhuo et al. // J. Clin. Microbiol. 2009. - V. 47. - P. 2055-2060.

87. Commonly used molecular epidemiology markers of Streptococcus agalactiae do not appear to predict virulence / F. Lin, V. Sintchenko, F. Kong et al. //Pathology. 2009. - V. 41.-P. 576-581.

88. Signal integration in bacterial two-component regulatory systems / A. Y. Mitrophanov, E. A. Groisman // Genes Develop. 2008. - V. 22. - P. 26012611.

89. Stock, A. M. Two-component signal transduction / A. M. Stock, V. L. Robinson, P. N. Goudreau // Annu. Rev. Biochem. 2000. - V. 69. - P. 183215.

90. Gao, R. Bacterial response regulators: versatile regulatory strategies from common domains / R. Gao, T. R. Mack, A. M. Stock // TRENDS Biochem. Science. 2007. - V. 32. - P. 225-234.

91. Bourett, R. B. Receiver domain structure and function in response regulator proteins // Curr. Oppon. Microbiol. 2010. - V. 13. - P. 142-149.

92. Stress response and signal transuction in Corynebacterium glutamicum / R. Kramer, S. Nicklish, K. Borngen et al. // www.kraemerlab.uni-koeln.de/osmosensing.php

93. Martin, B. Independent evolution of competence regulatory cascades in streptococci? / B. Martin, Y. Quentin, G. Fichant, J.-P. Claverys // TRENDS Microbiol. 2006. - V. 14. - P. 339-345.

94. Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity / R. Gao, A. M. Stock // Curr. Opin. Microbiol. 2010. - V. 13.-P. 160-167.

95. Parkinson, J. S. Communication modules in bacterial signaling proteins / J. S. Parkinson, E. C. Kofoid // Annu. Rev. Genet. 1992. - V. 26. - P. 71-112.

96. Alex, L. A. Protein kinases and signal transduction in prokaryotes and eukaryotes / L. A. Alex, Simon M.I. // TRENDS Genet. 1994. - V. 10. - P. 133-138.

97. Mascher, T. Stimulus perception in bacterial signal-transducing histidine kinases // T. Mascher, J D. Helmann, G. Unden // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2006. V. 70.-P. 910-938.

98. Fassler, J. S. Genetic and Biochemical Analysis of the SLN1 pathway in Saccharomyces cerevisiae / J. S. Fassler, A. H. West // Methods Enzymol. -2010,-V. 471.-P. 291-317.

99. Stock, J. B. Signal transduction in bacteria / J. B. Stock, A. M. Stock, J. M. Mottonen // Nature. 1990. - V. 344. - P. 395-400.

100. Volz, K. Structural conservation in the CheY superfamily // Biochemistry. -1993.-V. 32. P. 11741-11753.

101. Lukat, G. S. Divalent metal ion binding to the CheY protein and its significance to phosphotransfer in bacterial Chemotaxis / G. S. Lukat, A. M. Stock, J. B. Stock // Biochemistry. 1990. - V. 29. - P. 5436-5442.

102. Roles of the highly conserved aspartate and lysine residues in the response regulator of bacterial Chemotaxis / G. S. Lukat, B. H. Lee, J. M. Mottonen et al. // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 8348-8354.

103. Needham, J. V. Novel ion specifity of a carboxylate cluster Mg(II) binding site: strong charge selectivity and weak size selectivity / J. V. Needham, T. Y. Chen, J. J. Falke//Biochemisry. 1993. - V. 32.-P. 3363-3367.

104. Structural basis for methylesterase CheB regulation by a phodphorylation-activated domain / S. Djordjevic, P. N. Goudreau, Q. Xu et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. 1998,-V. 95.-P. 1381-1386.

105. Gardino, A.K. Functional dynamics of response regulators using NMR relaxation techniques / A.K. Gardino, D. Kern // Methods Enzymol. 2007. -V. 423.-P. 149-165.

106. Orientation of OmpR monomers within an OmpR: DNA complex determined by DNA affinity cleaving / P. Harrison-McMonagle, N. Denissova, E. Martinez-Hackert et al. // J. Mol. Biol. 1999. - V. 285. - P. 555-566.

107. The DNA-binding domain of OmpR: crystal structures of a winged helix transcription factor / E. Martinez-Hackert, A. M. Stock // Structure. 1997. -V. 5.-P. 109-124.

108. Dual response regulators (NarL and NarP) interact with dual sensors (NarX and NarQ) to control nitrate- and nitrite-regulated genes expression in Escherichia coli K-12 / R. S. Rabin, V. Stewart // J. Bacteriol. 1993. - V. 175.-P. 3259-3268.

109. Stewart V. Nitrate regulation of anaerobic respiratory gene expression in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1993. - V. 9. - P. 425-434.

110. Varughese, K. I. Conformational changes of SpoOF along the phosphotransfer pathway // J. Bacteriol. 2005. - V. 187. - P. 8221-8227.

111. Jiang, S. M. Regulation of virulence by a two-component system in group B streptococcus / S. M. Jiang, M. J. Cieslewicz, D. L. Kasper, M. R. Wessels // J. Bacteriol.-2005.-V. 187.-P. 1105-1113.

112. Variation in the group B streptococcus CsrRS regulon and effects on pathogenicity / S. M. Jiang, N. Ishmael, J. Dunning Hotopp et al. // J. Bacteriol. 2008. - V. 190.-P. 1956-1965.

113. Regulation of cytotoxin expression by converging eukaryotic-type and two-component signalling mechanisms in Streptococcus agalactiae / L. Rajagopal, A. Vo, A. Silvestroni, C. E. Rubens // Mol. Microbiol. 2006. -V. 62.-P. 951-957.

114. CsrRS regulates group B streptococcus virulence gene expression in response to environmental pH: a new perspective on vaccine development / I. Santi, R. Grifantini, S.-M. Jiang et al. // J. Bacteriol. 2009. - V. 191. - P. 53875397.

115. Regulation of D-alanyl-lipoteichoic acid biosynthesis in Streptococcus agalactiae involves a novel two-component regulatory system / C. Poyart, M. C. Lamy, C. Boumaila et al. / J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 6324-6334.

116. Defects in D-alanyl-lipoteichoic acid synthesis in Streptococcus mutans results in acid sensitivity / D. A. Boyd, D. G. Cvitkovitch, A. S. Bleiweis et al. // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 6055-6065.

117. Regulated expression of the Streptococcus mutans dlt genes correlates with intracellular polysaccharide accumulation / G. A. Spatafora, M. Sheets, R. June et al. // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 2363-2372.

118. Inactivation of DltA modulates virulence factor expression in Streptococcus pyogenes II K. H. Cox, E. Ruiz-Bustos, H. S. Courtney // PLoS ONE. 2009. -V. 4. - e5366.

119. Phylogenetic distribution and membrane topology of the LytR-CpsA-Psr protein family / J. Hubscher, L. Luthy, B. Berger-Bachi, P. S. Meier // BMC Genomics. 2008. - V. 9. - P. 1-16.

120. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide / A. Saizieu, C. Gardes, N. Flint et al. // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 4696-4703.

121. Molecular mechanisms of agr quorum sensing in virulent staphylococci / E. A. George, T. W. Muir // Chembiochem. 2007. - V. 8. - P. 847-855.

122. Knutsen, E. Two separate quorum-sensing systems upregulate transcription of the same ABC transporter in Streptococcus pneumoniae / E. Knutsen, O. Ween, L. S. Havarstein // J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - P. 3078-3085.

123. Domain organization and molecular characterization of 13 two-componentsystems identified by genome sequencing of Streptococcus pneumoniae / R.1521.nge, C. Wagner, A. de Saizieu et al. // Gene. 1999. - V. 237. - P. 223234.

124. Ji, G. Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants / G. Ji, R. Beavis, R. P. Novick // Science. 1997. - V. 276. - P. 2027-2030.

125. Dawid, S. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo / S. Dawid, A. M. Roche, J. N. Weiser // Infect. Immun. 2007. - V. 75. - P. 443-451.

126. Nagarajan, V. Genome-scale transcriptional profiling in Staphylococcus aureus: bringing order out of chaos / V. Nagarajan, M. S. Smeltzer, M. O. Elasri // FEMS Microbiol. Lett. 2009. - V. 295. - P. 204-210.

127. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression / K. Pohl, P. Francois, L. Stenz et al. // J. Bacteriol. 2009. - V. 191.-P. 2953-2963.

128. RR06 activates transcription of sprl996 and cbpA in Streptococcus pneumoniae / Zhuo Ma, Jing-Ren Zhang // J Bacteriol. 2007. - V. 189. - P. 2497-2509.

129. Standish, A. J. The two-component signal transduction system RR06/HK06 regulates expression of cbpA in Streptococcus pneumoniae / A. J. Standish, U. H. Stroeher, J. C. Paton // Proc. Natl. Acad. Sei. 2005. - V. 102. - P. 77017706.

130. Standish, A. J. The pneumococcal two-component signal transduction system RR/HK06 regulates CbpA and PspA by two distinct mechanisms / A. J. Standish, U. H. Stroeher, J. C. Paton // J. Bacteriol. 2007. - V. 189. - P. 5591-5600.

131. Control of streptokinase gene expression in group A&C streptococci by two-component regulators / H. Malke, K. Steiner // Indian J. Med. Res. 1994. -V. 119.-P. 48-56.

132. A pair of mobilizable ahuttle vectors conferring resistance to spectinomycin for molecular cloning in Escherichia coli and in gram-positive bacteria / P.

133. Trieu-Cuot, C. Carlier, C. Poyart-Salmeron, P. Courvalin // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. - P. 4296.

134. Bassam, B. J. Fast and sensitive silver staining of DNA in Polyacrylamide gels / B. J. Bassam, G. Caetano-Anolles, P. M. Gresshoff // Anal Biochem. -1991,- V. 196.-P. 80-83.

135. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

136. Mobile genetic elements provide evidence for a bovine origin of clonal complex 17 of Streptococcus agalactiae / G. Hery-Arnaud, G. Bruant, P. Lanotte et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2007. - V. 73. - P. 4668-4672.

137. Multilocus sequence typing of Swedish invasive group B Streptococcus isolates indicates a neonatally associated genetic lineage and capsule switching / S. Luan, M. Granlund, M. Sellin et al. // J. Clin. Microbiol. -2005.-V. 43.-P. 3727-3733.

138. Serotype- and strain- dependent contribuion of the sensor kinase CovS of the CovRS two-component system to Streptococcus pyogenes pathogenesis / V. Sugareva, R. Arlt, T. Fiedler et al. // BMC Microbiol. 2010. - V. 10. - 34 el-ell.

139. Garcia, V.E. Mg as an extracellular signal: environmental regulation of Salmonella virulence / V.E. Garcia, F.C. Soncini, E.A. Groisman // Cell. -1996.-V. 84.-P. 165-174.

140. Induction kinetics of the Staphylococcus aureus cell wall stress stimulon in response to different cell wall active antibiotics / V. Dengler, P.S. Meier, R. Heusser et al. // BMC Microbiol. 2011. - V. 11. - 16 el-el 1.

Информация о работе

Рождественская, Анастасия Сергеевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Двухкомпонентная регуляторная система Sak188/Sak189 и ее влияние на свойства Streptococcus agalactiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы