Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков возбудителей мастита коров в хозяйствах Ленинградской области

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков возбудителей мастита коров в хозяйствах Ленинградской области"

На правах рукописи

ш

КРЮКОВА ВЕРА ВАЛЕНТИНОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПАТОГЕННЫХ СТРЕПТОКОККОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МАСТИТА КОРОВ В ХОЗЯЙСТВАХ ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ

06.02.02- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург 2010

4842816

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Научный руководитель:

Сухинин Александр Александрович, доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Борисенкова Адель Наумовна, доктор ветеринарных наук, профессор; Макавчик Анатолий Анатольевич; кандидат ветеринарных наук

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет».

Защита диссертации состоится "03" февраля 2011 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, д. 5, тел./факс (812) 3883631.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины». Автореферат разослан "28" декабря 2010 г. и размещён на сайте академии ("http ://spbgavm .ru)

Учёный секретарь диссертационного совета

Л.М.Белова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одним из факторов, ухудшающих качество молока и снижающих продуктивность молочного скотоводства, является мастит коров. Несмотря на проводимые профилактические мероприятия, данная патология отмечается у 60 - 75 % коров (Париков В.А., 1990; Батраков А.Я., 2001; Андреев А.В., 2003; Васильев В.Г., 2003; Кузьмин Г.Н., 2004; Архипов А.А., 2008; Акназаров Б.К., 2009; Sartory R., 2002; Tanja Lehtolainen 2004; Maarit Haverti 2008; Submer I., Valerian F., 2010).

Мастит возникает в результате сочетанного воздействия на организм микробного и предрасполагающих факторов, главнейшими из которых являются, нарушение правил кормления, содержания и доения коров, неудовлетворительное проведение на фермах профилактических мероприятий, нарушение техники доения (недодаивание или передой, перевод на машинное доение неподобранного стада коров; неисправные доильные аппараты и установки, не обеспечивающие необходимый уровень вакуума, изношенная резина доильных стаканов и т.д.). Это приводит к раздражению, травмированию слизистой оболочки сосков и паренхимы вымени, а проникновение в поврежденные ткани вымени различных видов микроорганизмов вызывает ее воспаление (Болгов А.Е., Карманов Е.П., Муравья Л.П., 1996; Рубцов В.И., 2006; Васильев В.В., 2008; Горлов И.Ф., 2008; Chaves C.J., Tirante L., Pol M., 2001). Данный процесс вызывают микроорганизмы рода Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Bacillus, также представители сем. Enterobacteriaceae, дрожжеподобные грибы и т.д. ( Ивашура А.И., Карташова В.М., 1988; Батраков А.Я., 2001; Erskine R.J. et al., 2002 ).

Развитие современной микробиологии неразрывно связано с совершенствованием методов идентификации патогенных микроорганизмов. Успехи в этой области, достигнутые в последние десятилетия, обеспечены в первую очередь фундаментальными исследованиями в области химии, иммунологии и генетики. На смену серологическим

методам, выявляющим специфические антитела и антигены, приходят методы, позволяющие проводить исследование генетического аппарата микроорганизмов. Использование молекулярно-генетических методов объясняется необходимостью расшифровки последовательностей генов-вирулентности, кодирующих факторы-патогерности с последующим созданием на их основе перспективных методов внутривидовой идентификации патогенных стрептококков (Гинцбург А.Л., 1998; Бондаренко В.М., 1999; Дмитриев A.B., 2004).

Очевидно, что изучение особенностей организации генома патогенных стрептококков и разработка на этой основе комплекса стандартизированных молекулярных методов может лечь в основу их комплексной диагностики, дать более полную картину вирулентных свойств и помочь усовершенствовать способы лечения и профилактики стрептококкозов.

Учитывая вышеизложенное цель работы: провести молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков, возбудителей мастита коров и определить антибактериальную эффективность препарата «Тимукотин».

Задачи исследований:

- Провести анализ заболеваемости коров маститом в хозяйствах Ленинградской области;

- Изучить видовой состав, морфологические и культурально-биохимические свойства патогенных микроорганизмов;

- Подобрать праймеры, изучить распространенность генов вирулентности cft>, bac, scpB, Imb, cylE и определить гетерогенность популяции стрептококков группы В, выделенных от коров больных маститом;

- На клиническом материале апробировать метод ПЦР - для экспресс-диагностики S.agalactiae;

- Определить антимикробную активность препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов патогенных стрептококков.

Научная новизна: Впервые проведено исследование клинических изолятов Streptococcus agalactiae, выделенных от больных маститом коров в хозяйствах

Ленинградской области, на наличие генов-вирулентности (cjb, Ъас, scpB, ¡mb, cylE). Получены новые данные о гетерогенности популяции данного возбудителя на территории Ленинградской области. Определена антимикробная активность препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов патогенных стрептококков и эффективность при лечении коров больных маститом кокковой этиологии.

Практическая значимость исследований: Предложенный метод экспресс-диагностики мастита коров стрептококковой этиологии с помощью ПЦР, основанной на использовании в качестве специфических маркеров сконструированные праймеры на гены-вирулентности cfb и cylE, позволяет ветеринарным специалистам в короткие сроки определить спектр выделяемой микрофлоры. Полученные данные вошли в методические рекомендации по лабораторной диагностике стрептококков (одобрены и утверждены научным координационным Советом по животноводству и ветеринарии СевероЗападного научно-методического центра Россельхозакадемии). Результаты производственных испытаний нового антибактериального препарата «Тимукотин» были использованы фирмой-производителем ООО «НВЦ Агроветзащита С.-П.» (ООО «Ареал - Медикал») для расширения инструкции по применению препарата. Основные положения диссертации используются в качестве информационного материала в учебном процессе курса «Ветеринарная микробиологии и иммунология» на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГАВМ. Основные положения, выносимые на защиту:

- Молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков, выделенных от больных маститом коров в хозяйствах Ленинградской области;

- Антимикробная активность препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов патогенных стрептококков и при лечении коров больных маститом кокковой этиологии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на конференции профессорско-преподавательсвого состава

СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2008-2010), на 64-й научной конференции молодых ученых и студентов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2009); на международной конференции посвященной 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии (Самара, 2009); на международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию кафедры органической и биологической химии СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2009); на научно-практической конференции, посвященной 80-летию Вятской государственной сельскохозяйственной академии и 45-летию подготовки биологов-охотоведов (Вятка, 2010); на международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина-теория, практика, обучение» (Санкт-Петербург, 2010).

Проведено производственное испытание применения препарата «Тимукотин» в 2-х хозяйствах Ленинградской области. От ветеринарной службы хозяйств получены акты, подтверждающие его эффективность. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 работы в журнале, рекомендованном ВАК для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций. В них изложены основные положения диссертации.

Внедрение. Материалы исследований вошли в «Рекомендации по лабораторной диагностике стрептококков» (одобрены и утверждены научным координационным Советом по животноводству и ветеринарии СевероЗападного научно-методического центра Россельхозакадемии). Результаты исследований и испытания препарата «Тимукотин» используют в практической работе ветеринарные врачи в хозяйствах Ленинградской области при диагностике и этиотропном лечении коров, больных маститом. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 122 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 155

источника, в том числе 77 зарубежных авторов. Материал иллюстрирован 15 таблицами и 5 рисунками.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в течение 2008 -2010 г. на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО "Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины".

Обследовано 598 коров айширо-фризской и голштино-фризской породы. Для лабораторного исследования были отобраны пробы молока от коров больных маститом из хозяйств Ленинградской области: ЗАО «Племенное хозяйство им.Тельмана» (Тосненский район), СПК ПЗ «Детскосельский» (Пушкинский район), ферма «Старо-Паново» ЗАО «Предпортовый» (Красносельский район), ЗАО «Заречье» (Кировский район), СПК «Дальняя Поляна» (Волховский район), ФГУП « Племхоз Мыслинский» (Волховский район), СПК «Матросово» (Выборгский район).

При выполнении работы были использованы эпизоотологический, клинический и лабораторный методы исследования.

Анализ уровня заболеваемости коров маститами и процент их выбраковки в хозяйствах и в целом по Ленинградской области проводили на основании отчетов хозяйств и Управления ветеринарии по Ленинградской области за период 2002-2009 гг.

Диагностику маститов проводили согласно «Наставления по диагностике, терапии и профилактике мастита у коров» (Утверждено Департаментом ветеринарии РФ от 30.03.2000 г.).

Бактериологические исследования видового состава микрофлоры молока проводили согласно методического указания по диагностики стрептококкоза животных и методических рекомендации по микробиологическому исследованию молока и секрета вымени коров дня диагностики мастита.

Серологическое типирование стрептококков проводили в реакции коагглютинации с использованием наборов НПП « АКВАПАСТ» согласно прилагаемой инструкции.

Антибиотикочувствительность стрептококков определяли методом диффузии антибиотика в агар с использованием стандартных бумажных дисков (производства «НИЦФ», Санкт-Петербург), согласно инструкции по применению.

Молекулярно-генетический анализ стрептококков.

А). Выделение ДНК из чистой культуры Streptococcus spp (экспресс-анализ). Несколько колоний (8-15) культуры переносили в пробирку, содержащую 50 мкл стерильной воды. Ресуспендировали в 100 мкл 1%- раствора Triton Х-100. Суспензию инкубировали при 98° С в течение 10-15 мин. Центрифугировали при 2500 оборотах в течение 10 минут.

Б). Выделение ДНК Streptococcus spp. непосредственно из молока проводили по методу предложенному R. Boom, et al., 1990 г. для выделения ДНК Гр+ микрофлоры.

При постановке полимеразной цепной реакции учитывали рекомендации Дмитриева A.B. (2004). К 0,1-0,5 мкг геномной ДНК добавляли 5-10 пикомолей каждого из специфических праймеров, фланкирующих исследуемую последовательность (10 мМ р-р) - 0,5+0,5 мкл; 10хбуфер для Taq ДНК полимеразы-2,5мкл и по 1 мкл рабочего раствора дезокси-рибонуклеотидтрифосфатов ( dNTP).

Затем добавляли 0,5 мкл Taq ДНК полимеразы (5 еа/мкл) и 0,5 мкл MgCl2 (100 мМ р-р). Объем реакционной смеси доводили стерильной дистиллированной водой до 25 мкл.

Полимеразную цепную реакцию проводили, начиная с предварительной инкубации проб при 95 °С - 3 мин, а затем повторяли следующие этапы в течение 34 циклов ( амплификация): денатурация 95 ° С - 30 сек; отжиг ( 5060 0 С в зависимости от Г-Ц состава праймеров) - 30 сек; синтез новых цепей 72 ° С - 1 мини 72 °С- 10 мин.

Праймер AGA использовали в качестве основного контроля групповой принадлежности (Дмитриев А.В. и соавт., 2000).

Сравнительный анализ остальных нуклеотидных последовательностей ДНК (генов-вирулентности) проводили с использованием программы "BLAST" (http://vvww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Последовательности праймеров для Г1ЦР были сконструированы с помощью этой же программы на основании соответствующих нуклеотидных последовательностей, доступных через базу данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/).

Электрофорез ПЦР - продуктов проводили в 1,5 % агарозном геле с добавлением 0,5 х буфера ТВЕ при условиях: 110 В, 105 мА. Бромистый этидий добавляли уже после завершения разделения (0,5 мкг/мл).

Результаты электрофореза учитывали в ультрафиолетовом свете с различной длиной волны (длина зависит от используемого праймера) на приборе «Трансиллюминатор».

Для апробации метода ПЦР брали молоко в количестве 50 мл. В качестве положительного контроля вносили музейный штаммом S. agalactiae из коллекции отдела молекулярной микробиологии ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАН», из расчета 1x10s мк.кл/мл (по оптическому стандарту мутности). Проводили серию десятикратных разведений пробы молока до минимальной концентрации S. agalactiae 1 х102 мк.кл/мл. Далее с каждым разведением ставили ПЦР, используя в качестве специфических-нуклеотидных последовательностей сконструированные праймеры на гены-вирулентности cylE и cfb.

Антимикробную активность чистого действующего вещества препарата «Тимукотин» - тиамулина фумарата, изучали методом серийных разведений для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) (Ковалев Ф.М. и соавт., 1988) в отношении изолятов стрептококков, выделенных от коров в ходе основного микробиологического исследования, и музейного штамма Staphylococcus aureus 209-Р. Изоляты были типированы по морфологическим, культурально - биохимическим, серологическим и

молекулярно-генетическим свойствам.

Производственное испытание антибактериального препарата «Тимукотин» проводили в хозяйствах Ленинградской области. Препарат инъецировался внутримышечно 1 раз в день в течение 4-х дней. Животным делали новокаиновую блокаду наружных срамных нервов по А.Я. Башкирову, массаж вымени и частое сдаивание. Состояние молочной железы определяли с помощью клинического обследования и лабораторных методов исследования.

В динамике на 3, 5, 7,10 дни после окончания курса применения препарата проводили клиническое обследование животных; подсчет соматических клеток в пробах молока (с помощью вискозиметрического анализатора); микробиологическое исследование, в молоке определяли количество ингибирующих веществ (остаточное количество антибиотиков) согласно (ГОСТ 51600-2000) с индикатором бромкрезолпурпуром / «Delvotest SP-NT.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методом математической статистики, предложенную Лакиным Г.Ф. (1990), с помощью программы OpenOffice Cale. Цифровой материал диссертации обработан по Стьюдентудля проверки достоверности различий.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для выяснения распространенности мастита коров в хозяйствах Ленинградской области были проанализированы данные отчетов Управления ветеринарии агропромышленного и рыбохозяйственного комплекса Ленинградской области за период 2002 - 2009 гг.

Согласно проведенного анализа на протяжении последних лет заболеваемость маститами в Ленинградской области составляет в среднем 13% в год. Выбраковка коров по причине мастита - 1% от общего поголовья. Учитывая, что в отчете фиксируются только клинические формы мастита, а сведения по субклиническим формам мастита отсутствуют, эти цифры должны быть значительно выше.

2.2.1. Диагностика мастита коров Обследовано 598 коров в основном 2-3 отелов в 7 хозяйствах Ленинградской области. Выявлено 100 случаев мастита (16,7%). Из которых, 40 клинической формы (5,7%) и 60 субклинической (11%). Субклинических форм мастита в 1,5 раза больше чем клинических (Таблица 1). Животных находящихся на лечении или больных хроническим маститом для исследования не использовали.

Таблица 1

Результаты диагностирования маститов в хозяйствах Ленинградской области.

№ п/п Наименование хозяйства Количество обследованных коров Выявлено больных маститом Всего

Клиническая форма Субклиническая форма

1 ЗАО «Плем.хоз.им. Тельмана» 90 5 10 15

2 СПКПЗ «Детскосельский» 84 8 10 18

3 ЗАО «Предпортовый» 63 4 2 6

4 ЗАО «Заречье» 90 10 9 19

5 СПК «Дальняя Поляна» 85 3 6 9

6 ФГУП « Племхоз Мыслинский» 89 5 8 13

7 СПК «Матросово» 97 5 15 20

Всего: 598 40 60 100

Все пробы молока исследовали на наличие маститогенной микрофлоры. Было отобрано 106 проб из пораженных четвертей вымени. Воспаление наблюдалось, как правило, в одной четверти вымени. Лишь у нескольких животных были поражены 2 четверти и более.

2.2.2. Видовой состав и антибиотикочувствительность патогенной микрофлоры В рамках проведенного обследования коров в хозяйствах Ленинградской области на заболеваемость маститом было определено следующее соотношение микроорганизмов: Staphylococcus spp.,- 43%; Streptococcus gr.A,B,C,E - 29 %; Escherichia coli - 22% ; Streptococcus gr. D ( Streptococcus faecalis)-0,l %; род Bacillus - 3%; дрожжеподобные грибы - 2%.

Полученные нами данные согласуются с официальными данными

бактериологических исследований молока коров больных маститом по Ленинградской области.

30% выделенных нами патогенных микроорганизмов по морфологическим, культурально-биохимическим и серологическим свойствам было отнесено к роду Streptococcus и Enterococcus.

Установлено, что в большинстве случаев выделяется S.agalactiae (32%). S.faecalis причиной мастита является у 19% коров, S.dysgalactiae - 10%, S. uberis - 7%, S.pyogenes - 3%. 29% отнесены к нетипируемым.

При определении антибиотикочувствительности установлено, что патогенные стрептококки наиболее чувствительны к ампициллину - 87 %, бензилпенициллину - 87%, амоксициклину - 100 % и эритромицину - 93 %, то есть к b-лактамам (класс: пенициллины) и аминогликозидам.

2.2.3.Результаты Г1ЦР на наличие генов-вирулентности S. agalactiae и апробация предложенного метода на клиническом материале

Изоляты Streptococcus spp., были происследованы с помощью ПЦР на наличие видоспецифичных генов, потенциально участвующих в формировании вирулентного фенотипа стрептококков группы В. В качестве таких генов у микроорганизмов в настоящее время известны следующие: Ьса - кодирующий а- антиген; bac -кодирующий ß- антиген; sсрВ- кодирующий С5а пептидазу; Imb - кодирующий ламинин, связывающий белок; cyl Е - ß-гемолизин; А^/Л-гиалуронидазу; с/Ь-САМРфактор; .scaß-фактор адгезии; gln.4-глутаминсинтетазу (Lachenauer С.S., Creti R., Michel J.L., 2000; Madoff L.C., Paoletti L.C., Tai J.Y., 1992; Beckmann С. et al., 2002; Gase К., Ozegowski J., Malke., 1998; Hassan A. et al., 2000). В нашей работе мы определяли наличие 5 потенциальных генов вирулентности s срВ, cfb, Imb, bac, cyl E, так как в литературе сообщается о их наличии у штаммов стрептококков группы В, выделенных от животных (Jensen. N.E., Aarestrup F.M., 1996; Estuninguish S., 2002; Дмитриев A.B., Ткачикова M., Bhide I., 2000). Подобранные праймеры,

используемые в нашей работе, приведены в таблице 3.

Таблица 3

Гены и праймеры, использованные в работе.

№ п/п Гены Последовательность праймера, ориентация(5' -3' ) Т ПЛ.,"С

1 AGA(Kancyju>H ый белок С ) -CGTCGTGGTATTGAAACAGCTGTT -GGATATACGGATTCTCAAGTTCAGAG- 50

2 scpB -CACGGCACACACGTGTCAGGA--CCGCTGCAGGTGTCCCAACC- 57,4

3 cfb -TGGAACTCTAGTGGCTGGTGCAT--ACTGTCTCAGAGTTGGCACGCA- 56,0

4 lmb -TGTGGCAGCTATTTATGACGCGGA--TGCCGTGTGTTGCGTCACGA- 57,4

5 bac -ACACCGCAGGCTCCAGACAC--GAACACGCGGTGCTTCTGGG- 57,4

6 суЖ -TCGAAAAGTCGTAGTGGACAGGCA--AGGCTAGGGTGAGCCCTCGT- 56,0

Для подтверждения бактериологического и серологического типизирования изоляты проверяли на наличие капсульного белка стрептококков группы В с помощью праймера АвА (Рис. 1).

10 11 12 13 14 15 16 17 M 18 19 20 21 22 23 24 25 - +

Рисунок 1. ПЦР анализ Streptococcus spp., на наличие группового генаСГВ AGA.

М-Маркер молекулярного веса lOObp ladder; нужный фрагмент должен быть размером порядка 310 п.н.; трек «-» - отрицательный контроль (изолят

E.Coli); трек «+» - положительный контроль (музейный штамм S. agalactiae из коллекции ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАН»); треки 20,23,24,25-изоляты S. agalactiae; треки 10,11,12,14 -сомнительные; треки 13,16,17,18,19,21,22 - изоляты стрептококков иных серологических групп. Изоляты № 1,3,4,5,6,7 не вошедшие в рисунок 1 были также специфичны по гену AGA.

Общая картина распространенности генов вирулентности следующая: cfb присутствовал у 90% изолятов; cylE присутствовал у всех изолятов (100%); гены scpB, Imb не были обнаружены; ген bac присутствовал у 30 % изолятов, а в 10 % случаев реакция была - сомнительной.

Полученные данные формируют картину о гетерогенности популяции стрептококков группы В, возбудителей мастита коров Ленинградской области.

Апробацию метода ПЦР основанного на использовании в качестве специфических маркеров стрептококков группы В праймеров на гены вирулентности cfb и cyl Е проводили на молоке содержащем S.agalactiae. Результаты были положительными. Предложенный метод является экспресс-методом диагностики S. agalactiae, позволяющим обнаружить возбудитель в течение короткого времени.

2.2.4. Антимикробная активность и эффективность препарата «Тимукотин» при лечении коров больных маститом «Тимукотин» это комплексный препарат, в его состав которого входят 2 действующих антибактериальных вещества: тиамулина фумарат, действующий против грамположителъной микрофлоры и колистина сульфат - против грамотрицательной микрофлоры.

В качестве критерия оценки антимикробной активности тиамулина фумарата рассматривали величину его минимальной ингибирующей концентрации в отношении изолятов стрептококков, выделенных из

секрета вымени коров больных маститом в ходе основного исследования, и музейного штамма Staphylococcus aureus- 209 P.

Эффективность применения препарата испытывали в хозяйствах ЗАО «Племхоз, им. Тельмана» (родильное отделение) и СПК «Матросово» (дойное стадо). Были сформированы подопытная и контрольная группы из коров больных маститом в основном 2-3 отела. Здоровые животные служили в качестве чистого контроля.

На момент испытания препарата были выявлены животные с клиническим маститом серозной формы и субклиническим. Воспалительный процесс наблюдался в основном в одной - двух долях железы у каждой коровы.

Препарат инъецировали внутримышечно в течение 4-х дней. В качестве патогенетической терапии проводили новокаиновую блокаду наружных срамных нервов по Б.А. Башкирову, молоко из всех четвертей вымени коров сдаивали 3 раза в день. В первые три дня инъекций проводили массаж вымени. Контрольную группу лечили по схеме принятой в хозяйствах.

Установлено, что температура тела, частота пульса, количество дыхательных движений, сокращение рубца в динамике во время лечения у животных подопытной и контрольной групп оставались в пределах физиологической нормы.

После окончания лечения был проведен подробный клинический и лабораторный осмотр животных подопытной и контрольной групп.

У коров подопытной группы с клинически выраженным воспалением молочной железы местная температура симметричных четвертей вымени нормализовалась; надвыменные лимфатические узлы по консистенции, подвижности и величине соответствовали норме.

Реакция с 5 % димастином была отрицательной как у коров с клиническим, так и с субклиническим маститом. Количество соматических клеток у этих животных было на уроне 450 000±250,8 на мл молока. При бактериологическом посеве молока роста патогенной кокковой микрофлоры не наблюдалось.

выводы

1. Молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков возбудителей мастита коров в хозяйствах Ленинградской области проведен методом полимеразной цепной реакции, включающей использование праймеров на диагностически значимые гены вирулентности sсрВ, cjb, Imb, bac, cyl Е.

2. Распространенность мастита у коров в хозяйствах Ленинградской области в последние годы остается в среднем 13 %. Среди выделяемой патогенной микрофлоры Staphylococcus spp. составляют 43%; Streptococcus gr. А,В, С, Е - 29 %; Escherichia coli- 22%; Streptococcus gr. D-0,1%; род Bacillus-3%; дрожжеподобные грибы - 2%.

3. Род Streptococcus представлен следующими возбудителями: S.agalactiae -32%; S.faecalis - 19%; S.dysgalactiae -10%; S.uberis - 7 %; S. pyogenes - 3 %. К нетипируемым микроорганизмам отнесено 29 % изолятов.

4. Подобраны, сконструированы и синтезированы праймеры на анализируемые гены вирулентности sсрВ, cjb, Imb, bac, cyl E. Определена гетерогенность популяции стрептококков группы В. Ген вирулентности cjb содержат 90% изолятов; ген cylE - 100% изолятов; гены scpB, Imb отсутствуют; ген bac присутствовал у 30% изолятов, давал сомнительную реакцию в 10 % случаев.

5. Апробирован метод прямого обнаружения S. agalactiae в молоке с помощью полимеразной цепной реакции с использованием специфических нуклеотидных последовательностей генов вирулентности, рекомендуемый в качестве экспресс-диагностики мастита коров стрептококкой этиологии с целью видовой идентификации возбудителя.

6. Установлена высокая эффективность антибактериального препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов стрептококков и при лечении коров, больных маститом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложен метод экспресс-диагностики мастита коров стрептококковой этиологии с помощью полимеразной цепной реакции, основанной на использовании в качестве специфических маркеров сконструированных праймеров на гены-вирулентности ф и су1Е.

2. Разработаны методические рекомендации по лабораторной диагностике стрептококков (одобрены и утверждены научным координационным Советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии).

3. Результаты производственных испытаний нового антибактериапьного препарата «Тимукотин» при лечении коров больных субклиническим и серозным маститом кокковой этиологии были использованы фирмой-производителем ООО «НВЦ Агроветзащита С.-П.» (ООО «Ареал-Медикал») для расширения инструкции по применению препарата.

4. Материалы диссертационной работы используются в практической работе ветеринарными врачами Ленинградской области при диагностике и комплексном лечении мастита коров.

5. Результаты молекулярно-генетического анализа патогенных стрептококков используются в качестве информационного материала в учебном процессе курса «Ветеринарная микробиология и иммунология» на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГАВ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крюкова В.В. Выделение и определение антибиотикочувствительности патогенных стрептококков, возбудителей мастита коров/ В.В. Крюкова// Материалы международной конференции посвященной 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии. - Самара, 2009.-С.239-242.

2. Крюкова B.B. Состояние молочного скотоводства Ленинградской области по заболеваемости маститами/В.В.Крюкова//Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии.- СПб.-2009.-№ 3.-С.78-80.

3. Крюкова В.В. Патогенные стрептококки, возбудители мастита коров, и их анитбиотикочувствительность/В .В .КрюковаУ/Материалы международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ-С-Пб., Изд-во: ФГОУ ВПО «СПбГАВМ», 2010.-С.55-56.

4. Крюкова В.В. Идентификация стрептококков гр. В по генам-вирулентности/ В.В. Крюкова// Материалы ежегодной научной конференции молодых ученых и студентов СПбГАВМ № 64.-С-П6., Изд-во: ФГОУ ВПО «СПбГАВМ»,- 2010.- С.54-56.

5. Сухинин A.A., Крюкова В.В. Использование ПЦР для идентификации патогенных стрептококков/А. А.Сухинин, В.В.Крюкова//Вопросы нормативно -правового регулирования в ветеринарии.- С-Пб.- 20Ю.-№2.-С.13-15.

6. Крюкова В.В. Новое в диагностике патогенных стрептококков, возбудителей мастита коров/ В.В. Крюкова// Материалы научно-практической конференции, посвященной 80-летию Вятской государственной сельскохозяйственной академии и 45-летию подготовки биологов-охотоведов. - Вятка, 2010.- С.148-149.

7. Крюкова В.В. Изучение активности препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов патогенных стрептококков/ В.В. Крюкова// Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии.- С-П6.-2010,- № 4,-С.107-110.

Отпечатано в ООО « Анонс» С-Пб.ул. Розенштейна,21 Тел: 445-27-41 Подписано в печать: 27.12.2010 Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Крюкова, Вера Валентиновна

Введение.

1. Обзор литературы

1.1. Мастит коров.

1.2. Роль стрептококков в этиологии мастита.

1.3. Морфологические, культурально-биохимические и биологические свойства стрептококков.

1.4. Антигенная структура и основные факторы патогенности стрептококков группы В

1.5. Обзор лабораторных методов диагностики стрептококков на примере стрептококков группы В

1.6. Чувствительность 8. а^аЫсНае к антибиотикам.

1.7. Лечение коров, больных маститом

2. Материалы и методы.

3. Результаты собственных исследований и их обсуждение

3.1. Состояние молочного животноводства Ленинградской области по заболеваемости маститами.

3.2. Диагностика маститов.

3.2.1. Лабораторная диагностика маститов.

3.3. Видовой состав и соотношение патогенной микрофлоры, выделяемой от коров, больных маститом, в хозяйствах Ленинградской области.

3.4. Дифференциальная диагностика выделенных стрептококков по морфологическим, культурально-биохимическим свойствам и в реакции коагглютинации.

3.5. Антибиотикочувствительность выделенных изолятов стрептококков.

3.6. Факторы патогенности и гены — вирулентности Б.

§а1асйае

3.7. Результаты ПЦР на наличие генов вирулентности стрептококков группы В

3.8. Апробация на клиническом материале метода ПЦР - диагностики 8^а1асйае.

3.9. Производственное испытание АБП «Тимукотин»

3.9.1. Характеристика препарата.

3.9.2. Характеристика хозяйств, где проводилось испытание препарата

3.9.3. Эпизоотология маститов в хозяйствах.

3.9.4. Антимикробная активность действующего вещества «Тимукотина» - тиамулина фумарата в отношении изолятов стрептококков

3.9.5. Эффективность применения АБП «Тимукотин» при лечении коров, больных маститом

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков возбудителей мастита коров в хозяйствах Ленинградской области"

Актуальность темы. Одним из факторов, ухудшающих качество молока и снижающих продуктивность молочного скотоводства, является мастит коров. Несмотря на проводимые профилактические мероприятия, данная патология отмечается у 60 - 75 % коров (Париков В.А., 1990; Батраков А.Я., 2001; Андреев А.В., 2003; Васильев В.Г., 2003; Кузьмин Г.Н., 2004; Архипов А.А., 2008; Акназаров Б.К., 2009; Sartory R., 2002; Tanja Lehtolainen, 2004; Maarit Haverti, 2008; Submer I., Valerian F., 2010).

Мастит возникает в результате сочетанного воздействия на организм микробного и предрасполагающих факторов, главнейшими из которых являются следующие: нарушение правил кормления, содержания и доения коров, неудовлетворительное проведение на фермах профилактических мероприятий, нарушение техники доения (недодаивание или передой, перевод на машинное доение неподобранного стада коров; неисправные доильные аппараты и установки, не обеспечивающие необходимый уровень вакуума, изношенная резина доильных стаканов и т.д.). Это приводит к раздражению, травмированию слизистой оболочки сосков и паренхимы вымени, а проникновение в поврежденные ткани вымени различных видов микроорганизмов вызывает ее воспаление (Болгов А.Е., Карманов Е.П., Муравья Л.П., 1996; Рубцов В.И., 2006; Васильев В.В., 2008; Горлов И.Ф., 2008; Chaves C.J., Tirante L., Pol M., 2001). Данный процесс вызывают микроорганизмы рода Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Bacillus, также представители сем. Enterobacteriaceae, дрожжеподобные грибы и т.д. (Ивашура А.И., Карташова В.М., 1988, Батраков А.Я., 2001; Erskine R.J. et al., 2002 ).

Развитие современной микробиологии неразрывно связано с совершенствованием методов идентификации патогенных микроорганизмов.

Успехи в этой области, достигнутые в последние десятилетия, 5 обеспечены в первую очередь фундаментальными исследованиями в области химии, иммунологии и генетики. На смену серологическим методам, выявляющим специфические антитела и антигены, приходят методы, позволяющие проводить исследование генетического аппарата микроорганизмов. Использование молекулярно-генетических методов объясняется необходимостью расшифровки последовательностей генов вирулентности, кодирующих факторы патогенности с последующим созданием на их основе перспективных методов внутривидовой идентификации патогенных стрептококков (Гинцбург А. Д., 1998; Бондаренко В.М., 1999; Дмитриев A.B., 2004).

Очевидно, что изучение особенностей организации генома патогенных стрептококков и разработка на этой основе комплекса стандартизированных молекулярных методов могут лечь в основу их комплексной диагностики, дать более полную картину вирулентных свойств и помочь усовершенствовать способы лечения и профилактики стрептококкозов. Изложенное выше определило цели и задачи исследования. Цель работы: провести молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков, возбудителей мастита коров и определить антибактериальную эффективность препарата «Тимукотин». Задачи исследований:

1. Провести анализ заболеваемости коров маститом в хозяйствах Ленинградской области;

2. Изучить видовой состав, морфологические и культурально-биохимические свойства патогенных микроорганизмов;

3. Подобрать праймеры, изучить распространенность генов вирулентности cfb, bac, scpB, Imb, cylE и определить гетерогенность популяции стрептококков группы В, выделенных от коров, больных маститом;

4. На клиническом материале апробировать метод ПЦР - для экспресс-диагностики S.agalactiae;

5. Определить антимикробную активность препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов патогенных стрептококков. Научная новизна: Впервые проведено исследование клинических изолятов Streptococcus agalactiae, выделенных от больных маститом коров в хозяйствах Ленинградской области, на наличие генов вирулентности (cfb, bac, scpB, Imb, cylE). Получены новые данные о гетерогенности популяции данного возбудителя на территории Ленинградской области. Определена антимикробная активность препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов патогенных стрептококков и эффективность при лечении коров, больных маститом кокковой этиологии.

Практическая значимость исследования: Предложенный метод экспресс-диагностики мастита коров стрептококковой этиологии с помощью ПЦР, основанный на использовании в качестве специфических маркеров сконструированных праймеров на гены вирулентности cfb и cylE, позволяет ветеринарным специалистам в короткие сроки определить спектр выделяемой микрофлоры. Полученные данные вошли в методические рекомендации по лабораторной диагностике стрептококков (одобрены и утверждены научным Координационным Советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии). Результаты производственных испытаний нового антибактериального препарата «Тимукотин» были использованы фирмой-производителем ООО «НВЦ Агроветзащита С.-П.» (ООО «Ареал-Медикал») для расширения инструкции по применению препарата. Основные положения диссертации используются в качестве информационного материала в учебном процессе курса «Ветеринарная микробиологии и иммунология» на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГАВМ.

Основные положения, выносимые на защиту:

Молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков, выделенных от больных маститом коров в хозяйствах Ленинградской области;

Антимикробная активность препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов патогенных стрептококков и при лечении коров, больных маститом кокковой этиологии.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на конференции профессорско-преподавательского состава СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2008-2010), на 64-й научной конференции молодых ученых и студентов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2009); на международной конференции, посвященной 80-летию Самарской НИВ С Россельхозакадемии (Самара, 2009); на международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию кафедры органической и биологической химии СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2009); на научно-практической конференции, посвященной 80-летию Вятской государственной сельскохозяйственной академии и 45-летию подготовки биологов-охотоведов (Вятка, 2010); на международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина - теория, практика, обучение» (Санкт-Петербург, 2010).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 работы в журнале, рекомендованном ВАК для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Личный вклад соискателя. Автором непосредственно выполнены исследования по молекулярно-генетическому анализу патогенных стрептококков, возбудителей мастита коров, и проведено испытание антибактериального препарата «Тимукотин».

Объем и структура диссертации: Диссертационная работа изложена на

122 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора 8 литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 155 источника, в том числе 77 - зарубежных авторов. Материал иллюстрирован 15 таблицами и 5 рисунками.

1. Обзор литературы

1.1. Мастит коров

Молоко и молочные продукты являются одним из основных продуктов питания человека. Конкуренция на рынках, требующая постоянной интенсификации производства, привела за последние годы в экономически развитых странах к резкому подъему молочной продуктивности коров. Благодаря широкому применению искусственного осеменения генетический прогресс ее нарастал небывалыми темпами. Так, например, в США молочная продуктивность коров за полвека с 1940 по 1990 выросла более чем в три раза, с 2600 до 8000 кг молока за лактацию (Sartory R. et al., 2002). Чрезмерная интенсификация одной функции у животных, в данном случае лактогенной, не проходит бесследно для других систем организма, в частности для воспроизводительной функции - между ними очевидна обратная связь (Silva Е. et al., 2007). Второе отрицательное явление, сопутствующее росту молочной продуктивности коров, - сокращение их продуктивной жизни до 2-3-х л актаций. Эти выводы подтверждают данные публикаций на протяжении двух последних десятилетий (Десятое В.Г., Мамонтов Н.И., Алинкин В.Н., 1991; Слободяник В.И., 2009; Grohn Y. et al., 2004).

Основные причины раннего выбытия коров в нашей стране: нарушение воспроизводительной функции - 30-40 %; низкая продуктивность — 30-35 %; болезни вымени и другие патологии - 25-40 % (Медведева М.А., Сошенко А.П., Молчанова И.А., 2003).

Мастит — это воспаление молочной железы. Возникает под влиянием неблагоприятных факторов внешней среды: механических, биологических, физических, химических. Различают клинически выраженные и скрытые (или субклинические) маститы («Наставление по диагностике, терапии и профилактике мастита у коров» Утвержд. департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 марта 2000 г.).

Наибольшую хозяйственно-экономическую проблему представляет скрыто протекающий субклинический мастит, который встречается в 4-5 раз чаще, чем клинически выраженный (Олейник A.B., 2009; Barrett D.J., Healy A.M., Leonard F.C., 2005).

Для клинически выраженного мастита характерно воспаление одной или нескольких долей вымени (Панков Б.Г., 1994). Как и любая воспалительная реакция клиническая форма мастита сопровождается 5 признаками: color, dolor, tumor, ruber and function laese (от лат, «нарушение функции») (Георгиевский В.И., 1990). Нарушение функции вымени выражается в прекращении молокоотдачи и изменении качества молока, в частности, его консистенции. Такое молоко в праве называться секретом. В нем могут появляться хлопья, сгустки, тяжи разной величины (отмершие тканевые клетки), лейкоциты, нити фибрина и т.д. (Урбан В.П., Бацанов Н.П., Давыдов В.У., 1999). Оно должно выбраковываться и не должно поступать в молокопровод при машинном доении. За этим следят доярки и операторы доильных цехов.

По клиническим признакам, отражающим характер воспалительного процесса, мастит дифференцируют по общепринятой классификации А.П. Студенцева (Слободяник В.И., 2009).

Субклинический мастит протекает по типу серозного, катарального, гнойного или смешанного воспаления с поражением отдельных альвеол или долек и проявляется только одним клиническим признаком — нарушением функции, т.е. снижением секреции молока (Анюлис Э., Япертас С., Рудеевене Ю., 2009). Его можно диагностировать только лабораторными методами (подсчет соматических клеток, проба с 5 % -димастином, мастидином, мастотестом «Воронежским» и т.д.). Наиболее частыми возбудителями субклинического мастита являются стрептококки и стафилококки (Кузьмин Г.Н., 1995; Коренник И., 2010).

Молоко от коров, больных маститом, имеет повышенное количество соматических клеток: лейкоцитоз (80-85 % от общего числа), эритроцитоз, а также повышение количества клеток плоского, цилиндрического, кубического эпителия и его измененные физико-химические свойства: pH, содержание лактозы, муромидазы (лизоцима), опсоно-фагоцитарное число и т. д. (Племяшов К.В., Андреев Г.М., 2000).

Количество соматических клеток у коров варьируется в зависимости от генетики, физиологического периода и от состояния вымени, стадии лактации и ряда других факторов (Карташова В.И., Ивашура А.И., 1988, Ruegg PL., 2002; Barkema H.W. et al., 2005).

В 1979 г. согласно Международной молочной конвенции, было принято решение считать нормой здоровья пороговый уровень содержания соматических клеток < 500 000 в 1 мл сборного молока (Anonymous, IDF, 1981). Уровень соматических клеток от 5x105 и выше в мл молока указывает на развитие патологического процесса в вымени (Kunkel J.J., 1989; Павлюшенко Т.А., Тарасевич Л.Ф., 1990) .

Согласно «Техническому регламенту на молоко и молочную продукцию» от 12.06.2008 г. № 88-ФЗ, предельное содержание соматических клеток в

3 6

1 см молока второго сорта не должно превышать 1x10 , а в молоке высшего сорта 2x105'. Этот показатель сильно занижен по сравнению с таковым в

11 предыдущем действующем нормативном документе (ГОСТ 23453-90), что заставляет ветеринарных врачей хозяйств особенно тщательно следить за уровнем соматических клеток в молоке.

22. 07.2010 г. выпущен новый Федеральный закон № - 163 (<0 внесении изменений в « Технический регламент на молоко и молочную продукцию» № 88 - ФЗ», в котором уровень соматических клеток для высшего сорта молока определен 4><105.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Крюкова, Вера Валентиновна

Выводы

1. Молекулярно-генетический анализ патогенных стрептококков возбудителей мастита коров в хозяйствах Ленинградской области проведен методом полимеразной цепной реакции, включающей использование праймеров на диагностически значимые гены вирулентности scpB, cfb, Imb, bac, cyl E.

2. Распространенность мастита коров в хозяйствах Ленинградской области в последние годы остается неизменной и составляет в среднем 13 % от общего числа зарегистрированных болезней. Среди выделяемой патогенной микрофлоры Staphylococcus spp. составляют 43%; Streptococcus gr. А, В, С, Е - 29 %; Escherichia coli — 22%; Streptococcus gr. D - 0,1 %; род Bacillus - 3%; дрожжеподобные грибы - 2%.

3. Род Streptococcus представлен следующими возбудителями: S.agalactiae -32%; S.faecalis - 19%; S.dysgalactiae -10%; S.uberis - 7 %; S. pyogenes - 3 %. К нетипируемым микроорганизмам отнесено 29 % изолятов.

4. Подобраны, сконструированы и синтезированы праймеры на анализируемые гены вирулентности sсрВ, cfb, Imb, bac, cyl E. Определена гетерогенность популяции стрептококков группы В. Ген вирулентности cfl) содержат 90% изолятов; ген cylE - 100% изолятов; гены scpB, Imb отсутствуют; ген bac присутствовал у 30% изолятов, давал сомнительную реакцию в 10 % случаев.

5. Апробирован метод прямого обнаружения S. agalactiae в молоке с помощью полимеразной цепной реакции с использованием специфических нуклеотидных последовательностей генов вирулентности, рекомендуемый в качестве экспресс-диагностики мастита коров стрептококкой этиологии с целью видовой идентификации возбудителя.

6. Установлена высокая эффективность антибактериального препарата «Тимукотин» в отношении клинических изолятов стрептококков (МИК=17,5 мг/мл.) и при лечении коров, больных маститом.

Практические предложения

1. Предложен метод экспресс-диагностики мастита коров стрептококковой этиологии с помощью полимеразной цепной реакции, основанной на использовании в качестве специфических маркеров сконструированных праймеров на гены вирулентности cfb и cylE.

2. Разработаны методические рекомендации по лабораторной диагностике стрептококков (одобрены и утверждены научным Координационным Советом по животноводству и ветеринарии Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии).

3. Результаты производственных испытаний нового антибактериального препарата «Тимукотин» при лечении коров больных субклиническим и серозным маститом кокковой этиологии были использованы фирмой-производителем ООО «НВЦ Агроветзащита С.-П.» (ООО «Ареал-Медикал») для расширения инструкции по применению препарата.

4. Материалы диссертационной работы используются в практической работе ветеринарными врачами Ленинградской области при диагностике и комплексном лечении мастита коров.

5. Результаты молекулярно-генетического анализа патогенных стрептококков используются в качестве информационного материала в учебном процессе курса «Ветеринарная микробиология и иммунология» на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГАВМ.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Крюкова, Вера Валентиновна, Санкт-Петербург

1. Андреев A.B. Эффективность комплексного лечения эндометритов у коров/ A.B. Андреев// Материалы международной науч.- практ. конф. ( 2325 сент. 2002 г. Воронеж)- Воронеж.,2002.-С. 70.

2. Андросов Ф.З. Справочник ветеринарного лаборанта/Андросов Ф.З и др.//-М:Колос, 1981-248 с.

3. Архипов A.A. Адекватное лечение при острых маститах залог благополучия стада/ А.А.Архипов, А.Т. Столляр //Ветеринария. -2008.-№11.-С.15-17.

4. Батраков А.Я. Разработка и совершенствование профилактических и лечебных мероприятий при воспроизводстве крупного рогатого скота с высокой молочной продуктивностью: дис. в форме науч. докл. д-ра вет. наук / А.Я.Батраков. Воронеж, 1991.- 52 с.

5. Батраков А.Я. Профилактика и лечение маститов у коров/ А.Я. Батраков СПБ: Петролазер, 2001.- 104 с .

6. Беляков В.Д. Патогенные бактерии, общие для человека и животных/ Беляков В.Д. и др.. Л.: Медицина, 1994. - 23 с.

7. Бережная Л.Н. Микробиологическая диагностика стрептококкозов/ Л.Н.Бережная// Ветеринария сельскохозяйственных животных.- 2008.-№8,-С.20-28.

8. Бойко A.B. Маститы комплексный подход к лечению и профилактике/А.В.Бойко, М.Н. Волкова//Ветеринария сельскохозяйственных животных.- 2007-.№5.-С.47-48.

9. Болгов А.Е. Повышение резистентности крупного рогатого скота к маститу/ Болгов А.Е., Карманова Е.П., Муравья Л.Н Петрозаводск: ПетрГУ.-1996.-182 с.

10. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса/В.М Бондаренко //ЖМЭИ. -1999.-№5.-С.34-39.

11. Брагина Э.П. Биологические свойства стрептококков, выделенных от больных маститом коров: автореф.дис. . канд.вет.наук/ Брагина Э.П.Самарканд., 1981.-17 с.

12. Брико Н.И. Лабораторная диагностика стрептококковой инфекции / Н.И. Брико, A.C. Ещина, Л.А. Рянис // М.: Хризостом, 2005. 64 с.

13. Булгакова Т.Н. Стрептококки группы В в патологии человека/Т.Н. Булгакова, К.Б.Грабовская, А.А.Тотолян // ЖМЭИ. -1983.-№8.-С.7-17.

14. Василевский В.И. Молочное животноводство (данные Росстата)/ В.И. Василевский//Экономика и организация производства в агропромышленном комплексе.-№ 3.-2009.-С. 15-28.

15. Васильев B.B. Профилактика мастита у коров/В.В. Васильев//Ветери-нария.-2004.-№9.-С.37-39.

16. Вашакидзе М.Р. Основные биологические свойства и серотипизация возбудителя стрептококкоза нутрий: автореф. дис. . канд. вет. наук/ Вашакидзе М.Р.-МВА.Д990.-16 с.

17. Гасанов Н.Г. Взаимосвязь между маститом и эндометритом у коров/ Н.Г.Гасанов, Д.А Черепахин, Яре Кассум// рукопись деп. ВНИИ ТЭ-Нагропром.- Деп.- М./ MB А., 1988. №6. - С.89.

18. Георгиевский В.И. Физиология сельскохозяйственных животных/ Георгиевский В.И. //М:Агропромизд., 1990.-С.89-94.

19. Гинцбург A.JI. Генодиагностика инфекционных заболеваний /А.Л. Гинцбург // ЖМЭИ.-1998.- №3.-С.86-95.

20. Горлов И.Ф. Комплексное лечение коров при маститах / И.Ф.Горлов, О.С.Юрина, М.И. Сложенкина//Ветеринария.-2008.-№ 2.-С. 37-39.

21. Григорьева Т.Е. Микрофлора матки у коров в послеродовой период/ Т.Е. Григорьева, И.А. Алексеев//Тезисы докл. на науч.- произв. конф. по актуальным вопросам ветеринарии.- Горький., 1983. -С. 39.

22. Грязнева Т. Определение видового состава и антибиотико-чувствительности микрофлоры, выделенной из молока коров, больных маститом/Т. Грязнева, В. Родионова, А .Балышев//Ветеринария сельскохозяйственных животных.-2008.№9.С. 40-41.

23. Десятое В.Г. Интенсификация молочного скотоводства/ Десятое В.Г., Мамонтов Н.И., Алинкин В.Н. М.: Росагропромиздат, 1991.- 53 с.

24. Дмитриев A.B. Факторы и генетика патогенности стрептококков группы В/ A.B. Дмитриев, М. Кантикова, И. Микула, А. Тотолян //Журн. Микробиол.-2000.-№5.-С.92-97.

25. Дмитриев A.B. Геномный полиморфизм стрептококка группы В-возбудителя заболеваний человека и животных: автореф. дис. . доктора, биол. наук/ Дмитриев A.B.- СПБ.,2004.-34 с.

26. Есепёнок В.А. Современная классификация возбудителей стрепто-коккозов. /В.А. Есепёнок, Б.М. Авакаянц, Х.С. Горбатова// Ветеринарный консультант. 2002. - № 20.- С. 17-18.

27. Ивашура А.И. Система мероприятий по борьбе с маститами коров/Ивашура А.И.- М.: Росагропромиздат, 1991.- 239 с.

28. Каасен М.Х. Диагностирование, профилактика и лечение маститов у коров на молочных комплексах: автореф.дис. . канд.вет.наук/ Каасен М.Х.-Тарту.,1989.-13с.

29. Камышанов A.C. Мастит у высокопродуктивных молочных коров в пе риод лактации и их воспроизводительная функция: автореф. дис. . канд. вет. наук/ Камышанов A.C.- Воронеж: Воронеж, госагроуниверситет им. К.Д. Глинки.,- 2000.- 20 с.

30. Карликова Г.Г. Бактериальная загрязненность молока коров/ Г.Г. Карликова //Ветеринария. -2006.-№10.-С.46.

31. Карташова В.М. Маститы коров/ Карташова В.М., Ивашура А.И. -М.: Агропромиздат,1988.- 256 с.

32. Климов Н.Т. Роль микробного фактора в возникновении и развитии мастита у коров/ Н.Т. Климов, В.А. Париков, В.И. Слободяник//Вете-ринария.-2008.-№ 7.- С.ЗЗ- 38.

33. Ковалев В.Ф. Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны в ветеринарии: справочник/Ковалев В.Ф. и др.. М:Агропром-издат,1988.-23 с.

34. Коренник И. К вопросу о контроле содержания в молоке соматических клеток/ И. Коренник //БИО.- сентябрь 2010.- с.31-33.

35. Кузьмин Г.Н. Мастит кокковой этиологии у коров и рациональные способы его терапии и профилактики: автореф. дис. . д-ра вет. наук/ Кузьмин Г.Н Воронеж: Воронеж, госагроуниверситет им. К.Д. Глинки, 1995.-44 с.

36. Куриленко А.Н. Стрептококкоз. Лечение сельскохозяйственных животных при инфекционных болезнях. /Куриленко А.Н., Крупальник В.Л. // М.: Агропромиздат, 1986. 156-159

37. Лабинская A.C. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований.- учебное пособие/ Лабинская А.С.-М; Медицина, 2005.-599 с.

38. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов / Лакин Г.Ф.- 4-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.

39. Матвеев A.B. Диагностика и специфическая профилактикастрептококкоза собак: автореф. дис.канд. вет. наук / Матвеев А.В.1. МВА.-2008.-20 с.

40. Маянский А.Н. Патогенетическая микробиология: руководство/ Маянский А.Н. -Н-Новг: изд-во Н-гор ГМА ,2006.-520 с.

41. Медведев М.А. Опыт применения иммунокоррективной терапии при лечении эндометритов у коров/ М.А Медведев и д.р.//Вестник российского университета дружбы народов, серия: сельскохозяйственные науки, животноводство.-2003.-№ 10.-С.125-127.

42. Методические указания по лабораторной диагностике стрептококкоза животных/ утверждены зам. начальника Гл. управления ветеринарии от 09. 1990г.- Изд. офиц.- М., 1991.-10 с.

43. Молоко. Методы определения количества соматических клеток: ГОСТ 23453-90/Госстандарт России. — Изд. офиц., переизд. с измен. М.: ИПК Изд-во стандартов, 2001.-19 с.

44. Молоко. Методы определения антибиотиков: ГОСТ 51600-2000/Госстандарт России.-Изд. офиц., переизд. с измен.- М.:ИПК Изд-во стандартов,2001.-23 с.

45. Наставление по диагностике, терапии и профилактике мастита у коров: Утвержд. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 марта 2000 г., № 13-5-2 /1948/Госстандарт России.- Изд. офиц., переизд. с измен.-М., 2000.- 27 с.

46. Олейник A.B. Противомаститная программа Шеринг-Плау -Интервет/А.В. Олейник//Ветеринария.-2008.-№10.-С. 18-20.

47. Олейник A.B. Маститы у высокопродуктивных коров/А.В. t Олейник//Ветеринария.-2009.-№5.-С.9-12.

48. Определитель бактерий Берджи. в 2 т./под ред. Дж. Н. Хоулт , Н. М. Криг-9-oe изд., перераб., и доп.- М: Мир. 1997, 2 т. 799 с.

49. Орлова Э.П. Характеристика микрофлоры при маститах у коров молочных комплексов: автореф. дис. . канд. вет. наук/ Орлова Э.П.-Л.,1987.-15с.

50. Павлюшенко Т.А. Методические рекомендации по контролю числа соматических клеток в молоке при селекции на устойчивость к маститу и качеству молока/ Павлюшенко Т.А., Тарасевич Л.Ф.-Л: ВНИИРГЖ.-1990.-32 с.

51. Панков Б.Г. Технология профилактики патологических родов и послеродовых заболеваний у коров на молочных фермах/ Б.Г. Панков // Проблемная лекция. М.: МВА, 1994. 28 с.

52. Париков В.А. Разработка и совершенствование методов диагностики, терапии и профилактики мастита у коров: дис. в форме научного доклада. д-ра вет. наук/ Париков В.А.- Воронеж: ВНИВИПФиТ, 1990.-52 с.

53. Перес Куевас А. Комплексные лекарственные средствапри бактериальных инфекциях/А. Перес Куевас //Ветеринария.-2006.-№3.- С.6-9.

54. Племяшов К.В. Профилактика мастита у коров/ Племяшов К.В., Андреев Г.М.//Научные и практические проблемы увеличения производства молока в Северо-западном регионе РФ: материалы конференции.-СПб.- Пушкин, 2000 .С.40-50.

55. Племяшов К.В. Морфология, физиология и биохимические аспекты лактогенеза: научно методич. рекомендации/ Племяшов К.В. и др.. -СПб : Изд-во СП6ГАВМ.-2007.-30 с.

56. Покровский В.И. Стрептококки и стрептококкозы/Покровский В.И. Брико Н.И., Ряпис Л.А.-М: ГЭОТАР,2006.-544 с.

57. Прокуратова А. Мастит коров /А. Прокуратова//Молока и корма. менеджмент.-2007.-№ 15.- С.12-23.

58. Рабинович М.И. Химиотерапевтические средства: справочник-//Рабинович М.И.- М,2004.-350 с.

59. Рубцов В.И. Профилактика и лечение мастита коров/ В.И.Рубцов //Ветериария.-2006.-№9.-С.32-35.

60. Савостин А.Н. Антимикробные препараты и мастит коров/А.Н. Савостин //Ветеринария.- 1983.-№ 11.-С.52-53.

61. Скородумов Д.И. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных: справочник/ Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А.- М: Изограф,2005.- 656 с.

62. Слободяник В.И. Иммунологические аспекты физиологии и патологии молочной железы коров: научное издание/ под ред. В.И. Слободяника и др.. Таганрог: изд.центр ТГПИ.-2009.-207 с.

63. Слободяник A.A. Методические рекомендации по микробиологическому исследованию молока и секрета вымени коров для диагностики мастита /Слободяник А.А.-М: изд-во -РАСХНД 994.-52 с.

64. Смирнов A.M. Стрептококковые инфекции. Микробиологические основы диагностики инфекционных заболеваний/Смирнов A.M., Подлевский А.Ф. // Л.: Медицина, 1979. 89-110 с.

65. Смирнова Л.И. Санитарно-микробиологические исследования молока и молочных продуктов: методич. указания/ Смирнова Л.И. и др..-СПб: Изд-во СПБГАВМ, 2009.-54 с.

66. Смирнова Л.И. Современные методы выделения и идентификации стрептококков у животных: методическое пособие/Смирнова Л.И. и др. .СПб: изд-во СПбГАВМ,2006.-37с.

67. Терешенков A.C. Профилактика и лечение акушерско-генеко-логических заболеваний коров /Терешенков A.C. Минск: Ураджай, 1990 ,-215 с.

68. Урбан В.П. Ветеринарно-санитарные и противоэпизоотические i мероприятия при маститах животных: методич. пособие / Урбан В.П. идр. .-СПб: СПбГАВМ, 1999.-32 с.

69. Хабриев Р.У. Справочник лекарственных средств / Хабриев Р.У., Чучалин А.Г.- Выпуск З.-М: ГЕОТАР-Медиа, 2006. 802 с.

70. Черепахина Л.А. Эпизоотология инфекционного мастита коров/Л.А. Черепахина//Ветеринария.-2007.-№2.-С.7-8.

71. Шакиров О.Ф. Противомаститная программа компании «Байер»/О.Ф. Шакиров//Ветеринария.-2007.-№3 .-С.9-12.

72. Яхнюк С.В. Племенные животные и современные технологии/ С.В. Яхнюк//Информационный бюллетень Министерства сельского хозяйства Российской Федерации .-2009.-№12.-С.36-38.

73. Alouf J.E. Staphylococcal and streptococcal superantigens: molecular, biological and clinical aspects/J.E. Alouf, H.Muller- Alouf// Int. J. Med. Microbiol.-2001.-Y.292. P. 429-440.

74. Anonymous. International Dairy Federation. Laboratory methods for use in the mastitis work. IDF bulletin 132 IDF.- Geneve, Switzerland .-1981.- 23 pages.

75. Anonymous. Recommendations for the use of antimicrobial agents in the treatment of the most significant infectious diseases in animals. Memorandum 3.- Ministry of Agriculture and Forestry, Helsinki, Finland, 2003. 53 pages.

76. Arpin C. Presence of mefA и mef E genes in Streptococcus agalactiae/ C. Arpin et al.,//Antimicrob. Agents. Chemother.-1999.-№43.-P.944-946.

77. Arvidson S. Extra cellular enzymes. In: Gram-positive pathogens/S. Arvidson, V.A.R. Fischetti, P. Novick JJ//American Society for Microbiology, Washington, DC.- 2000.- P. 379-385.

78. Baker C. J. Group В streptococcal infections/ C. J. Baker// Clin. Perinatol.-1997.-№ 24.- P. 59 70.

79. Barkema H.W. Quarter-milk somatic sell count at calving and the first six milkings after calving/ H.W. Barkema et al.,// Prev. Vet. Med. 2005,- V.38. P. 1-9.

80. Barrett D.J. Prevalence of pathogens causing subclinical mastitis in 15 dairy herds in the Republic of Ireland. Irish/D.J. Barrett , A.M. Healy , F.C. Leonard//J. Vet.-2005.- V. 58. P. 333-337.

81. Becker I.D. Bactericidal capacity of newborn phagocytes against group B beta hemolytic streptococci/ I.D. Becker et al., //Inf. Immun.- 1981.-V.34 P.535-539.

82. Beckmann C. Identification of novel adhesions from group B streptococci by use of phage display reveals that C5a pepridase mediates fibronectin binding/C. Beckmann et al.,//Infect. Immun.-2002.-№70.-P.2869-2876.

83. Bengtsson B. Antibiotic susceptibility of bacteria isolated from clinical and subclinical mastitis// B. Bengtsson // Sweden. In : Report from Nordic Meeting on Mastitis Diagnostics 1-3 October 2003./ Uppsala.- Sweden.,2003,- 13 pages.

84. Benson K.D. Pulsed field fingerprinting of vaginal group B streptococcus in pregnancy/ K.D. Benson, J.B Luchansky, J.A. Elliott //Obstet. Gynecol.-2002.-V. 100.-P. 545-551.

85. Boom R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids/ R. Boom at al.,//J. Clin. Microbiol.-1990.-N28.-P.495-503.

86. Chaves C.J. Prevalence of intramammary infections in 74 dairy herds located in Argentina/ C.J Chaves, L. Tirante, M.Pol// 40th Annu. Meet. Nantl. Mastitis Council./ Reno.- Nevada.-2001- P. 205-206.

87. Chmouryguina I.I. Conservation of C5a-peptidase genes in group and B streptococci/ I.I. Chmouryguina, A.N. Suvorov , P. Ferrieri // Infect.Immun.-1996.- V.64.-P2387-2390.

88. Cumming C.G. Group B streptococcal cell surfaces/C.G Cumming//J.Med.Microbial.-l 984.-V. 18.-P. 151-155.

89. D'Ascenzi S. Characterization of group B Sterptococcus infections/S. D'Ascenzi et al.,//In: New perspectives on streptococci and streptococcal infections/editited by Orefici G. Stuttgard Jena.- New York: Gustav Fischer.-1992.-P. 458-460.

90. Denning D.V. Restriction endonucleases analysis of human and bovine group B streptococcus for epidemiological study/ D.V. Denning, C.J. Bacer , N.J Troup//J. Clin. Microbiol.- 1989.-№. 27.-P. 1352-1356.

91. DiFabrio J.L. Structure of the capsular polysaccaride antigen of type IV group B Streptococcus/ J.L. DiFabrio et al.,// Can.J.Chem.-1989.-№ 67.-P.877-882.

92. Erskine R.J. Trends in antibacterial susceptibility of mastitis pathogens during a seven year period/ R.J. Erskine et al.,//J. Dairy Sci.-2002.- V. 85.P. 1111-1118.

93. Estuninguish S. Studies on Streptococcus agalactiae isolated from bovine mastitis in Indonesia/ S. Estuninguish// J.Vet.Med.-2002.-№ 49.-P. 185-187.

94. Fasola E. Molecular analysis of multiple isolates of the major serotypes of group B streptococci/E. Fasola, C. Livdahl, P J. Ferrieri//Clin. Microbiol.-1993 .-№31.-P. 2616-2620.

95. Fitzgerald J.R. Evolutionary genomics of pathogenic bacteria/J.R. Fitzgerald, J.M. Musser//Trends. Microbiol.-2001.- V. 9. P. 547-553.

96. Franken C. Horizontal gene transfer and host specificity of beta-hemolytic streptococci: the role of a putative composite transposon containing scpB and lmb/ C. Franken et al.,// Mol. Microbiol.- 2001.-№ 41.-P. 925-935.

97. Gaillot O. Molecular characterization and expression analysis of the superoxide dismutase gene from Streptococcus agalactiae/O. Gaillot et al.,//Gene.- 1997.- № 204.-P. 213-218.

98. Gase К. Identification, cloning and expression of the CAMP factor gene (cfa) of group A streptococci/K. Gase, J.J Ferretti, C. Primeaux//Infect. Immun. 1999.- № 67.-P. 4725-4731.

99. Gase К. The Streptococcus agalactiae hylB gene encoding hyaluronate lyase : completion of the sequence and expression analysis/ K. Gase, J. Ozegowski, Malke// H.Biochem. Biophys.Acta.-1998.-V.1398.-P.86-98.

100. Glaser P. Genome sequence of Streptococcus agalactiae, a pathogen causing invasive neonatal disease/P. Glaser, С. Rusniok,C.Buchrieser//Mol.Microbiol.-2002.- V.45.-P.1499-1513.

101. Gordillo M. E. Typing of group В streptococci: comparison of pulsedfield gel electrophoresis and conventional electrophoresis/ M. E. Gordillo et al.,// J. Clin. Microbiol.- 1993,- № 31.- P. 1430 1434.

102. Grohn Y. Effect of pathogen-specific clinical mastitis on milk yield in dairy cows/Y. Grohn et al.,//J.Dairy. Sci.-2004.- V. 87. P. 3358-3374.

103. Gustaffson I. Bacteria with increased mutation frequency and antibiotic resistance are enriched in the commensal flora of patients with high antibiotic usage/I. Gustaffson//J. Antimicrob. Chemother.-1999.- V. 52.P. 645-650.

104. Gutler V. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23SrDNA spacer region/V. Gutler, V.A. Stanisich// Microbiology. 1996. - №142.- P. 3-16.

105. Hassan A. Identification of streptococci isolated from various sources by determination of cfb gene and other CAMP-factor genes/ A. Hassan et al.,// Can. J. Microbiol.- 2000.- №46.- P. 946 951.

106. Hogan J. Occurrence of clinical and subclinical environmental mastitis. Udder health management for environmental streptococci/J. Hogan//Guelph. ON.- 2000.- V. 97.P. 36-41.

107. Honkanen-Buzalski T. Sampling technique, transportation and history/T. Honkanen-Buzalski, M. Sandholn, L. Kaartinen//In: The Bovine Udder and Mastitis.- Jyvaskyla Finland: Gummerus Press, 1998.- P. 111-1114.

108. Jennings H.J. Structure of the native polysaccharide antigens of type la and lb group B Streptococcus/H.J. Jennings et al.,//Biochemistry.-1983.-V.22.-P.1258-1263.

109. Jensen N.E. Epidemiological aspects of group B streptococci of bovine and human origin/N.E. Jensen., F.M. Aarestrup//Epidem. Infect.- 1996.- №117.-P. 417-422.

110. Jerlstrom P.J. The IgA binding b antigen of the c protein complex of group B streptococci: sequence determination of its gene and detection of two binding regions/P.J. Jerlstrom, G.S. TChhatwal, K.N. Timmis// Molec. Microb.-1991 .-№5 .-P.843-849.

111. Keef G. P. Streptococcus agalactiae mastitis: a review/G. P Keef//Can. Vet. J.-1997.- №38.-P. 429-437.

112. Kitchen B.J. Review of the progress of dairy science:bovine mastitis: milk compositional changes and related diagnostic tests/ B.J. Kitchen// J. Dairy Res.-1981.- V. 46. P. 88-167.

113. Kong F. Molecular profiles of group B streptococcal surface protein antigen genes: relationship to molecular serotypes/ F. Kong// J.Clin.Microbiol.-2002.-№40.- P.620-626.

114. Kraus R.M. The streptococcal cell relationship of structure function and pathogenesis/ R.M. Kraus //Streptococci and streptococcal disease. London, 1972.-P. 3-10.

115. Kunkel J.J. Subclinical mastitis and effect of environmental organisms /J.J. Kunkel //Proc.89 Armu. Meet. US Anim., Assn.-1989.- P. 222-225.

116. Lachenauer C.S. Mosaicism in the alpha-like protein genes of group B streptococci/C.S. Lachenauer, R. Creti, J.L. Michel/ZProc.Natl.Acad.Sci.Usa.-2000.- № 97.-P.9630-9635.

117. Laura Haltia. A study of bovine mastitis, milking procedures and management practices on 25 Estonian dairy herds/ Haltia Laura et al.,// Mol. Biotechnol.- 1999,- V.8.- P. 139-145

118. Leigh S.A. St. uberis: a permanent barrier to the control of bovine mastitis/S.A. Leigh//J. Vet.- 1999.V.157 P. 1023-1056.

119. Li J. Inactivation of the C protein antigen gene, bca, by a novel shuttle/suicide vector results in attenuation of virulence and immunity in group B Streptococcus/J. Li et al.,//Proc. Natl.Acad.Sci.USA.-1997.-V.94.-P.13251-13256

120. Maarit Haverti. Staphylococcus aureus in bovine intramammary infection : molecular, clinical and epidemioilogical characteristics: academic dissertation/Haverti Maarit.- Helsinki, Fac. of vet. Med.-2008.-150 pages.

121. Madoff L.C. Maternal immunization of neonatal mice from group B streptococcal infection by maternal immunization with beta C protein/ L.C. Madoff, L.C. Paoletti, J.Y.Tai//Infect.Immun.-1992.-№60.-P.4989-4994.

122. Martinez G. Specific detection by PCR of Streptococcus agalactiae in milk/G.Martinez., J. Harel, M . Gottschalk//Can. J. Vet. Res.-2001.-№ 65.-P. 68 72.

123. Martinez G. Characterization of Streptococcus agalactiae isolated of bovine and human origin by randomly amplified polymorphic DNA analysis/ G. Martinez et al.,//J. Clin. Microbiol.- 2000.-V. 38 P. 71 78.

124. Mileham A.J. Identification of microorganisms using random primed PCR/ A.J. Mileham// Mol. Biotechnol.- 1997.- V.8.- P. 139-145.

125. Moroni P. Antimicrobial susceptibility patterns of streptococci isolated from bovine mastitis/P. Moroni/ZMastitis control from science to practice-. Niderland.-2008.-P.313.

126. Myllys V. Association of changes in the bacterial ecology of bovine mastitis with changes in the use of milking machines and antibacterial drugs/ V. Myllys et al., // Acta.vet. scand. -1994.- V. 35. P. 363-369.

127. Nizet V. Pathogenic mechanisms and virulence factors of Group B streptococci/V. Nizet, C.E. Rubens//In: Gram-positive pathogens.- Washington D.C: American Society for Microbiology Press.-2000.- P.125-136.

128. Pitkala A. Identification and Antimicrobial Resistance of Streptococcus uberis and Streptococcus parauberis isolated from Bovine Milk Samples/ A. Pitkala, J. Koort, J. Bjorkroth // J.Dairy.Sci.- №91.- P.4075-4081.

129. Poyart C. Contribution of Mn cofactorated superoxide dismutase (SodA)ito ,.tlie virulence of Streptococcus agalactiae/ C. Poyart et al., // Inf. Immun.-2001.- V.69 .-P.5098-5106.

130. Regan J.A. Colonization with group B streptococci in pregnancy adverse outcome.VIP Study Group/ J.A. Regan, M.A. Klebanoff //Am.J. obstet .Gyn-ecol.-1996.- №174.- P.1354-1360.

131. Rubens C.E. Transposon mutagenesis of type III group B Streptococcus: correlation of capsule expression with virulence/ C.E. Rubens et al.,//Proc.Natl.Acad.Sci.Usa.-1987.- V.84.- P.7208-7212.

132. Ruegg PL. Milk quality and mastitis tests/PL. Ruegg, DJ. Reinemann//Bovine Pract .-2002 .-№ 36.-P.41-54.

133. Rüssel H. Isolation and characterization of Streptococcus agalactiae bacteriophage/H. Rüssel, N.L. Norcross, D.E. Kahn // J. Gen. Virol.- 1969.-№5.-P.315-317.

134. Saad A.M. Studies of bovine mastitis: doctor dissertation/A.M. Saad -Uppsala., 1989.-P.5-130.

135. Sartory R. Fertilization and early embryonic development in heifers and lactating cows in summer and lactating and dry cows in winter/ R. Sartory et al.,//J.,Dairy Sci.-2002.-V.84.n.7.-P. 2803-2812.1.113

136. Silva. E. Effect of treatment with prostaglandin F2a before synchronization of ovulation on fertility of lactating dairy cows /E. Silva et al.,//J. Dairy Sei.-2007.-V.90.n. 12.-P.5509-5517.

137. Stringer J. The development of a phage -typing system for group B streptococci/ J. Stringer// J. Med. Microbiol. (England).- 1980.- № 13.-P 133/143.

138. Submer I. Reproductive performance, udder health, and antibiotic resistance in mastitis bacteria isolated from Norwegian Red cows in conventional and organic farming/1. Submer, F. Valerian// Acta.vet. Scandinavia.- 2010 Feb.- №

139. Suvorov A.N. C5a peptidase gene form group B streptococci /A.N. Suyorov, P.P. Cleary, P. Ferrieri//In: Genetics and Molecular Biology of

140. Gl Lindahl // J. Exp. Med.- 1993.- V.177.- P. 1593-1603.8.-P.5:ll.

141. Lehtolainen Tanja. Escherichia coli mastitis: academic dissertation/ Tanja1.jitolainen.- Helsinki.- 2004. P. 10-20

142. Wastfeld M. Identification of a family of streptococcal surface proteins with extremely repetitive structure/ M. Wastfeld et al.,// J.Biol.Chem.-1996.-V.271.- P. 18892-18897.

143. Wibavan I. W. Properties and type antigen patterns of group B streptococcal isolates from pigs and nutrias/ I. W. Wibavan, C.Lammler, J. Smola// J. Clin. Microbial. 1993.- V. 31.- P. 762 - 764.