Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена"

На правах рукописи

Гуляева Анастасия Юрьевна

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ИНТРАЦИСТЕРНАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ НА ОСНОВЕ ЭНРОФЛОКСАЦИНА И КЕТОПРОФЕНА

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 / НАР 2014

Москва - 2014

005546468

005546468

Работа выполнена в отделе качества и стандартизации фармакологических лекарственных средств федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, доцент

Виолин Борис Викторович

Официальные оппоненты: Новик Тамара Самуиловна

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина Россельхозакадемии (ГНУ ВИГИС)

Желто в Василий Алексеевич

доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт ветеринарной санитарии, гигиены и

экологии» Россельхозакадемии (ГНУ

ВНИИВСГЭ)

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ).

Защита состоится «24» апреля 2014 года в 11°° ч на заседании диссертационного совета Д. 220.011.01 на базе ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ВГНКИ».

Автореферат разослан «^Н» марта 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

_ Н.К. Букова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Анализ структуры заболеваний крупного рогатого скота в молочном скотоводстве показывает, что развитию отрасли существенно препятствуют инфекционные и незаразные болезни лактирующих коров, среди которых наиболее серьёзный ущерб наносит мастит (Роман JI. Г., Полянцев Н. И., 2008; Слободняк, В.И., 1999).

Экономический ущерб, связанный с маститом, складывается из снижения удоев и качества молока, потери молочной продуктивности и преждевременной выбраковки коров до завершения генетически заложенного лактационного периода (Слободняк, В.И.,1999; Кузьмин Г. Н., 1995; Tollersrud Т., Kenny К., Reitz Jr. A.J. and Lee J.C., 2000). Помимо экономического ущерба, мастит представляет серьезную опасность для здоровья людей, в связи с возможным попаданием в молоко патогенных для человека микроорганизмов и их токсинов (Модин А. Н., Климов Н. Т., Ефанова JI. И., 2010). Предрасполагающими факторами развития мастита являются нарушение условий содержания, кормления и доения, а также гинекологические заболевания и изменение обмена веществ, что в комплексе снижает общую резистентность организма и способствует ослаблению барьерной функции тканей вымени. На этом фоне создаются благоприятные условия для внедрения и распространения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в паренхиме вымени, что вызывает воспаление молочной железы - мастит.

Наиболее что при маститах выделяют монокультуру или ассоциации микроорганизмов, таких как стрептококки - Str. agalactias, Str. dysgalactiae, Str. pyogenes, Str. uberis; стафилококки — Staph. pyogenes, Staph, aureus, Staph, citreus, Staph, albus, а также Escherichia coli и Pseudomonas aemgenosa (Jones G.M., Bailey T.L., Roberson J.R.,1998).

Несмотря на большое количество, используемых противомаститных препаратов, их эффективность постоянно снижается, вследствие широкого распространения а птибиоти ко резистентных штаммов микроорганизмов. Поэтому разработка новых противомаститных препаратов активных в отношении устойчивых к антибиотикам патогенов продолжает оставаться актуальной и важной для ветеринарной практики проблемой (Париков В.А., Климов Н.Т., Романенко А.И., 2000).

Одним из путей воздействия на антибиотикорезистентные микроорганизмы является применение новых соединений, к которым у бактерий еще не сформировались механизмы устойчивости. К таким соединениям относятся фторхинолоны, механизм действия которых заключается в ингибировании активности ферментов ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, приводящей к нарушению синтеза ДНК бактериальной клетки, что обеспечивает отсутствие перекрестной резистентности с другими антибактериальными соединениями, сульфаниламидами и нитрофуранами (Altreuhter Р., 1987; Anadon А., 1992).

Поэтому на основании собственных исследований и литературных данных в качестве антибактериального компонента в состав нового противомаститного препарата был включен энрофлоксацин из группы фторхинолонов, ранее не использовавшийся в лекарственных средствах для интрацистернального введения при лечении мастита. Энрофлоксацин обладает широким спектром действия в

отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, хорошей биодоступностью из места введения, а также малотоксичен для теплокровных животных (Kanemaki N., Matsuura К., Yashiro N., Takasu К., Ushuruda H., 1995; Abd el-Aziz M.I., Aziz M.A., Soliman F.A., Afify N.A., 1997).

Хотя основным этиотропным фактором в развитии мастита являются инфекционные агенты, патогенез болезни во многом основан на развитии воспалительных процессов в паренхиме вымени, приводящих к появлению боли и отеков, что осложняет течение болезни и увеличивает сроки выздоровления.

Поэтому важной составляющей успешной терапии мастита, помимо этиотропного компонента, воздействующего на причину болезни -микроорганизмы, является применение фармакологических средств, обладающих противовоспалительным действием и снижающих болевую реакцию, то есть, воздействующих на патогенез и симптомы заболевания (Anderson K.L., Kindahl H., Petroni A., Smith A.R., Gustafsson B.K.,1985). Применяемые в противомаститных препаратах глюкокортикоиды (преднизолон, дексаметазон), несмотря на выраженный противовоспалительный эффект, обладают рядом нежелательных побочных реакций, например, таких как снижение местного иммунитета. Поэтому в последнее время широкое применение в медицине и ветеринарии нашли нестероидные противовоспалительные соединения (НПВС), которые обладают выраженным противовоспалительным, анальгезирующим и жаропонижающим действием, при этом практически не оказывают побочного действия на макроорганизм. Среди НПВС одним из наиболее сильных обезболивающих соединений является кетопрофен, широко применяемый у нас в стране и за рубежом в различных лекарственных формах. Поэтому в качестве противовоспалительного компонента в состав нового противомаститного препарата дополнительно был включен кетопрофен.

Учитывая, что до настоящего времени в зарубежной и отечественной ветеринарной практике лекарственный препарат для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина с кетопрофеном не использовался, представлялось актуальным изучить его фармако-токсикологические свойства и терапевтическую эффективность при лечении мастита бактериальной этиологии у лактирующих коров.

Цели и задачи исследований.

Изучить фармако-токсикологические свойства и терапевтическую эффективность нового лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена при лечении мастита у лактирующих коров.

В задачи исследований входило:

- определить антибактериальную активность энрофлоксацина в опытах in vitro на изолятах микроорганизмов, выделенных из молока коров больных маститом, в сравнении с другими группами антибактериальных средств, широко используемыми при лечении мастита у коров;

- изучить фармако-токсикологические свойства лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена на лабораторных животных;

- изучить раздражающее действие на паренхиму вымени лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена;

- изучить фармакокинетику и установить сроки выведения остаточных количеств энрофлоксацина, ципрофлоксацина и кетопрофена с молоком лактирующих коров после интрацистернального введения лекарственного препарата;

- установить оптимальную терапевтическую дозу и разработать схему применения лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена для лечения мастита бактериальной этиологии у коров в период лактации;

- оценить терапевтическую эффективность и безопасность применения лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена при мастите дойных коров в условиях производства.

Научная новизна.

Впервые изучены фармако-токсикологические свойства нового лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена для интрацистернального введения. Установлены особенности распределения, накопления в тканях паренхимы вымени и сроки выведения остаточных количеств кетопрофена, энрофлоксацина и его метаболита ципрофлоксацина с молоком. В условиях животноводческих хозяйств обоснована эффективность применения противомаститного препарата в ветеринарной практике.

Практическая значимость работы.

На основании результатов исследований доказана возможность безопасного и эффективного использования лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена в ветеринарной практике. Экспериментально обоснованы оптимальная терапевтическая доза (300 мг энрофлоксацина и 50 мг кетопрофена в шприце-дозаторе 7,5 мл), схема применения (трехкратно с интервалом 12 ч) и сроки возможного использования молока (через 1 сутки) в пищевых целях после интрацистернального введения препарата дойным коровам.

Лпробаиия работы. Материалы диссертационной работы доложены на:

- IV съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» Москва, 2013 г.;

- Заседании ученого совета ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» в 2012,2013 гг.

Личный вклад соискателя.

Диссертационная работа является результатом научной работы в период с 2009 по 2013 гг. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно и выполнен при научно-методической и консультационной помощи кандидата ветеринарных наук Б.В. Виолина.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- результаты изучения антибактериальной активности энрофлоксацина;

- характеристика фармако-токсикологических свойств лекарственного препарата для интрацистернального введения по результатам доклинических исследований;

- результаты изучения фармакокинетики и динамики выведения остаточных количеств кетопрофена, энрофлоксацина и ципрофлоксацина с молоком коров после интрацистернального введения нового противомаститного препарата;

- результаты клинических исследований лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена при лечении мастита коров в условиях производства;

- практические предложения по применению лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена в ветеринарной практике.

Публикаиии.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, 4 из них в изданиях, рекомендованных ВАК России.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 173 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, приложение. Работа иллюстрирована 33 таблицами, 8 рисунками, 6 графиками. Список литературы содержит 292 источников, в том числе 187 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в течение 2009-2013 гг. в отделе качества и стандартизации фармакологических лекарственных средств ФГБУ «ВГНКИ», в виварии ГНУ ВИГИС, ОНО «Московская селекционная станция» (Московская область, Серебряно-Прудский район), ИЛЦ «Фармбиомед» и в животноводческих хозяйствах Саратовской области: СПК «Колхоз « Красавский», ЗАО «Племзавод «Трудовой», ЗАО Агрофирма «Волга», КФХ «Возрождение».

В доклинических исследованиях было использовано 40 беспородных белых мышей обоего пола массой 18-20 г, 73 белых крысы массой 180-230 г и 13 коров массой 500-550 кг 3-4 лактации.

Клиническое испытание препарата в производственных условиях проведено на 258 коровах черно-пестрой породы массой 500-550 кг 3-4 лактации.

Объектом исследования был лекарственный препарат на основе энрофлоксацина и кетопрофена в форме геля (далее по тексту противомаститный препарат) опытной серии 050210, расфасованный в шприцы-дозаторы по 7,5 мл, в которых содержалось 300 мг энрофлоксацина и 50 мг кетопрофена и вспомогательные вещества (L-аргинин, карбонол, трилон Б, калия гидроксид и вода очищенная), произведенный фирмой ООО «АЛВИС» (Россия).

Определение антибактериальной активности. Изучение антимикробной активности эрофлоксацина в опытах in vitro проводили на мясо-пептонном агаре (МПА) методом серийных разведений в плотной питательной среде (Навашин С.М., Фомина И.П., 1982). В качестве тест-культур использовали полевые изолятов микроорганизмов, выделенные из молока коров, больных маститом и типированные

по морфологическим, тинкториальным, культуральным и фементативным свойствам. Морфологические и тинкториальные свойства изучали путем окрашивания бактериологических препаратов по Граму с последующей микроскопией под иммерсией ("90). Ферментативные свойства энтеробактерий изучали с помощью СИБов (системы индикаторные бумажные). Ферментативные свойства выделенных грамположительных микроорганизмов изучали с помощью Streptotest 16, Staphylotest 16, Ps.aeroginosa - оксидного теста (положительный). Идентифицировали штаммы микроорганизмов в соответствии с «определителем бактерий Берджи» (1997). Определение антибактериальной активности и минимальных подавляющих концентраций энрофлоксацина в отношении Staphylococcus aureus (n=48), Streptococcus spp. (n=16), E. coli (n=36), Klebsiella (n=10), Salmonellas spp. (n=4), Proteus mirabilis (n=4), Serratia (n=2) и Ps.aeroginosa (n=2), проводили в сравнении с другими представителями группы фторхинолонов (ципрофлоксацин, норфлоксацин, флюмеквин), а также с антибактериальными средствами других групп, широко используемыми при лечении мастита у коров, включая тетрациклины (доксициклин), аминогликозиды (гентамицин), полусшггетические пенициллины (амоксициллин), линкозамиды (клиндамицин), хлорамфениколы (левомицетин), цефалоспорины (цефтиофур, цефалексин).

За минимальную подавляющую концентрацию (МПК) принимали наименьшую концентрацию антибиотиков, обеспечивающую полную задержку роста микроорганизмов на поверхности агара.

Изучение местно-раздражающего действия. Местно-раздражающее действие на паренхиму вымени изучали после однократного интрацистернального введения препарата 5 лактирующим коровам голштино-фризской породы массой 500-550 кг 3-4 лактации. В качестве показателя возможного раздражающего действия препарата определяли содержание соматических клеток в молоке, увеличение количества которых свидетельствует о воспалительной реакции в вымени.

До начала опыта у коров отбирали контрольные пробы молока из задней правой (опытной) и задней левой (контрольной) четвертей. После этого в заднюю правую четверть вымени однократно вводили содержимое шприца-дозатора противомаститного препарата. Пробы молока отбирали через 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21 и 24 ч после введения препарата из опытной и контрольной четвертей вымени всех коров. Первые порции молока сдаивали и отбрасывали. Содержание соматических клеток в молоке определяли на вискозиметрическом анализаторе «Соматос» (Россия) (ГОСТ 54077-2010).

Изучение местно-раздражающего действия препарата после многократного интрацистернального введения проводили на 8 коровах, разделенных на две группы: 5 коровам I группы в заднюю правую (опытную) четверть вымени после доения вводили содержимое одного шприца-дозатора (терапевтическая доза) пятикратно с интервалом 12 ч.; 3 коровам II группы вводили содержимое трех шприцев-дозаторов (трехкратная терапевтическая доза) в заднюю правую (опытную) четверть вымени - пятикратно с интервалом 12 ч.

В течение 6 плановых доек после последнего введения препарата отбирали пробы молока из опытных и контрольных (задние левые) четвертей вымени. В

пробах молока определяли количество соматических клеток на анализаторе молока «Fossomatic» серия 400/2000/5000 (Дания).

Одновременно проводили оценку раздражающего действия тестируемого препарата путем клинического осмотра вымени всех подопытных.животных в сравнении с контрольными.

Изучение токсикологических свойств противомаститного препарата.

Острую токсичность препарата при внутрижелудочном введении изучали на 40 беспородных белых мышах массой 18-20 г и 24 белых крысах массой 180200 г., разделенных по принципу аналогов на 4 группы.

Препарат в 1% растворе крахмала вводили перорально однократно в утренние часы на голодный желудок через зонд в дозах: 2500; 5000; 8000 и 10000 мг/кг. Каждую дозу препарата испытывали на 10 белых мышах и 6 крысах. Ежедневно в течение 14 суток вели наблюдение за клиническим состоянием животных после введения препарата. В ходе опыта оценивали клиническое состояние грызунов, особенности поведения, прием корма и воды, двигательную активность и состояние шерстного покрова.

Изучение ульцерогенного действия проводили на 9 крысах (массой 180-230 г), разделенных на три группы, каждой из которых вводили препарат в желудок в дозах 5000; 8000 и 10000 мг/кг однократно. На следующие сутки всех животных подвергали эвтаназии и визуально исследовали состояние желудочно-кишечного тракта. Оценку ульцерогенного эффекта проводили по 4-бальной шкале: 0 -отсутствие повреждений; 0,5 - гиперемия, 1 - единичные незначительные повреждения (1 или 2 точечных кровоизлияния); 2 - множественные повреждения (эрозия, точечные кровоизлияния); 3 — значительные и множественные повреждения слизистой оболочки (эрозии, кровоизлияния); 4 - грубые повреждения, охватывающие всю поверхность слизистой оболочки (массивные кровоизлияния, эрозии, перфорации) («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», Москва, 2005).

Субхроническую токсичность препарата изучали на 40 белых крысах-самцах с начальной массой тела 170-179 г, из которых по принципу аналогов сформировали 3 опытных и 1 контрольную группу по 10 животных в каждой. Ежедневно в течение 21 суток препарат в 1% растворе крахмала вводили в желудок крысам с помощью зонда в следующих дозах: I группе - 1000 мг/кг (1/5 от минимальной дозы, вызывающей ульцерогенное действие 5000 мг/кг), II группе - 500 мг/кг (1/10 от 5000 мг/кг), III группе - 250 мг/кг (1/20 от 5000 мг/кг). Крысам IV (контрольной) группы вводили 1 % раствор крахмала. В течение всего периода введения препарата вели наблюдение за общим состоянием, поведением животных и видимыми физиологическими функциями, учитывали количество потребляемого корма и воды. Изменение массы тела крыс определяли на 1, 3, 7, 10, 14 и 21 сутки опыта. Через сутки после последнего введения препарата всех крыс убивали декапитацией и отбирали пробы крови для определения гематологических и биохимических показателей.

Морфологические показатели периферической крови крыс исследовали на гематологическом анализаторе «ACT-Diff» (США), биохимические показатели -на биохимическом анализаторе «Clima-15» (Испания).

Для проведения макро- и микроскопического исследования органов (печени, легких, почек, сердца, селезенки, желудка и тонкого кишечника) отбирали пробы органов у 5 крыс из каждой группы, материал фиксировали в 10% формалине и заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием программы «Student 200».

Изучение фармакокинетики энрофлоксацина, ципрофлоксаиина и кетопрофена в молоке и в плазме крови упактирующш коров.

Фармакокинетику энрофлоксацина и кетопрофена в молоке коров после однократного введения препарата изучали на 5 клинически здоровых лактирующих коровах голштино-фризской породы 3-4 лактации. Животные находились на привязном содержании в одинаковых условиях и в течение 14 дней до опыта и на протяжении опыта не получали никаких лекарственных препаратов.

Препарат вводили однократно из шприца-дозатора в заднюю правую (опытную) четверть вымени. Образцы молока отбирали из опытной и контрольной четвертей вымени до введения и через 1, 3, б, 9, 12, 15, 18, 21 и 24 ч после введения противомаститного препарата. Пробы молока замораживали и хранили до начала анализа при минус 20°С.

Фармакокинетику энрофлоксацина, ципрофлоксацина и кетопрофена в плазме крови коров после 5-кратного введения препарата изучали на 5 клинически здоровых лактирующих коровах голштино-фризской породы массой 500-550 кг 3-4 лактации. Всем животным в опытную четверть вымени после доения вводили по одному шприцу-дозатору с препаратом пятикратно с интервалом 12 ч. До введения и в течение 8 плановых доек (через каждые 12 ч) после последнего введения препарата отбирали из опытной и контрольной четвертей вымени пробы молока, а из яремной вены отбирали в пробирки с антикоагулянтом кровь, из которой для исследований получали плазму. Пробы молока и плазмы крови хранили при минус 20°С до проведения исследований.

Определение остаточных количеств энрофлоксаиина. иипрофлоксаиина и кетопрофена в молоке коров после многократного интраиистерналъного введения препарата.

Определение остаточных количеств энрофлоксацина, ципрофлоксацина (основной метаболит энрофлоксацина) и кетопрофена в молоке проводили на 5 клинически здоровых лактирующих коровах голштино-фризской породы массой 500-550 кг 3-4 лактации после 5-кратного введения препарата с интервалом 12 ч. Образцы молока из опытных и контрольных четвертей вымени отбирали до введения препарата, затем в течение 4 суток (8 плановых доек через каждые 12 ч) после последнего введения препарата.

Полученные пробы молока при изучении остаточных количеств, а также пробы плазмы крови и молока при изучении фармакокинетики препарата анализировали на содержание энрофлоксацина (ципрофлоксацина) и кетопрофена методом ВЭЖХ.

Определение энрофлоксацина и ципрофлоксацина в биосубстратах проводили методом ВЭЖХ с использованием флуоресцентного детектора, а кетопрофена - с использованием УФ-детектора. Для расчётов использовали методом абсолютной калибровки. Предел обнаружения (ЭЬ) энрофлоксацина и ципрофлоксацина в молоке и плазме крови составил 1,5 нг/мл и для кетопрофена - 16 нг/мл; предел количественной оценки (С^Ь) для энрофлоксацина и ципрофлоксацина в молоке и плазме крови - 5 нг/мл и для кетопрофена - 50 нг/мл

На основе полученных результатов рассчитывали фармакокинетические параметры энрофлоксацина, ципрофлоксацина и кетопрофена в молоке и плазме крови, которые были подвергнуты математической статистической обработке с помощью программы «^айвйса у.5.5».

Для расчетов фармакокинетических параметров был использован модельно-независимый метод с использованием программы «М-ШЕ>».

Определение оптимальной терапевтической дозы препарата.

Определение оптимальной дозы противомаститного препарата проводили на 57 дойных коровах, больных маститом, разделенных на 3 группы по принципу аналогов (по возрасту, массе, тяжести течения болезни, периоду лактации). Животным препарат вводили интрацистернально в пораженные четверти вымени 3-5- кратно с интервалом 12 ч в шприце-дозаторе (7,5 мл) в следующих дозах: первой группе (п=20) - 250 мг энрофлоксацина + 50 мг кетопрофена, второй группе (п=19) - 300 мг энрофлоксацина + 50 мг кетопрофена и третьей группе (п=18) - 350 мг энрофлоксацина + 50 мг кетопрофена.

За коровами вели ежедневное клиническое наблюдение, при этом учитывали общее состояние животных, дозу препарата на четверть вымени, количество введений за курс лечения, количество вылеченных долей. Основными критериями оценки выздоровления являлось исчезновение клинических признаков мастита и отрицательные результаты исследования молока с 2% раствором мастидина и пробой отстаивания.

Изучение терапевтической эффективности противомаститного препарата у лактирующах коров в условиях производства.

Терапевтическую эффективность противомаститного препарата, содержащего 300 мг энрофлоксацина и 50 мг кетопрофена в одном шприце-дозаторе изучали на коровах в период лактации при лечении мастита в сравнении с зарубежными и отечественными лекарственными средствами: Тетра-дельта ("РЙБег", США), Мастилекс («ГпуеБа», Испания), Ваккамаст (ЗАО НПП "Агрофарм") и Эроксимаст (ЗАО НПП "Агрофарм"), используемыми для лечения патологии молочной железы и зарегистрированными в Российской Федерации. Исследования проводили в животноводческих хозяйствах Марксовского и Лысогорского районов Саратовской области.

Животные в хозяйствах по принципу аналогов были разделены на две группы (опытную и контрольную) с учетом возраста, массы тела, тяжести заболевания, периода лактации.

Опытной группе коров вводили противомаститный препарат интрацистернально в каждую пораженную четверть вымени с интервалом 12 ч в течение 1-2 суток. Животным контрольной группы вводили один из препаратов

сравнения в соответствии с утвержденными Россельхознадзором инструкциями по их применению.

За коровами вели ежедневное клиническое наблюдение, при этом учитывали общее состояние коров, кратность введения, количество введений за курс лечения, количество вылеченных долей вымени. Терапевтическую эффективность оценивали по исчезновению клинических признаков мастита и отрицательным результатам исследования молока с 2% раствором мастидина и пробы отстаивания (Наставление по диагностике, терапии и профилактике мастита у коров // Министерство сельского хозяйства и продовольствия РФ от 20 марта 2000 г.).

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики, используя руководство Ю.С. Малеты и В.В.Тарасова (1982).

2.2. Результаты исследований

Изучение антибактериальной активности знрофлоксаиина in vitro.

Результаты наших исследований в опытах in vitro показали, что энрофлоксацин в сравнении с другими соединениями группы фторхинолонов, проявил максимальную антибактериальную активность в отношении стафилококков, и его МПК50 составила 0,25 мкг/мл, что соответственно в 4, 10 и 20 раз ниже, чем у ципрофлокацина (1 мкг/мл), норфлоксацина (2,5 мкг/мл) и флюмеквина (5 мкг/мл).

Все стафилококки были устойчивы к действию флюмеквина - МПК50 10 мкг/мл, при этом к норфлоксацину 64% проявили умеренную чувствительность (МПК50 2,5 мкг/мл) и 36% были резистентны (МПК>5мкг/мл).

Среди других групп антибактериальных соединений сопоставимую активность с энрофлоксацином в отношении стафилококков проявили гентамицин (МПК50 0,1 мкг/мл) и доксициклин (МПК50 0,25 мкг/мл). Несмотря на то, что МПК50 амоксициллина и цефтиофура была всего в 0,6 раз выше, чем у энрофлоксацина (МПК50 0,25 мкг/мл), у 16% чувствительных к энрофлоксацину изолятов уже сформировалась резистентность к действию этих антибиотиков.

В отношении стрептококков активность (МПК5о 0,5 мкг/мл) ß-лактамных антибиотиков (амоксициллин, цефтиофур) и доксициклина была соответственно в 2 и 5 раза выше чем у гентамицина (М1Ж50 1,0 мкг/мл) и энрофлоксацина (МПК5о 2,5 мкг/мл). К остальным изученным антибактериальным соединениям -клиндамицину, левомицетину и цефалексину, норфлоксацину и флюмеквину стрептококки были устойчивы (МПК5о составила соответственно 50, 5, 5, 10 и >100 мкг/мл).

Среди энтеробактерий наибольшая чувствительность к энрофлоксацину отмечалась у Escherichia coli, Proteus mirabilis и Salmonella (МПК- 0,01-0,5 мкг/мл). В 13% Е. coli и 100% Proteus mirabilis, Salmonella spp. и Serratia spp. были устойчивы к действию флюмеквина. МПК флюмеквина для 36% Е. coli, проявивших умеренную чувствительность к действию фторхинолоиа, была в 5-25 раз больше, чем у энрофлоксацина, ципрофлоксацина и норфлоксацина (в пределах 1-2,5 мкг/мл). Устойчивые к флюмеквину (МПК50 10 мкг/мл) изоляты Serratia, были также

резистентны к норфлоксацину (МПК50 5 мкг/мл), при этом сохраняли чувствительность к энрофлоксацину и ципрофлоксацину (МПК501 мкг/мл). 30% изолятов Klebsiella были резистентны к флюмеквину (МПК 5-10 мкг/мл), оставаясь умеренно чувствительными к норфлоксацину (МПК 1-2,5 мкг/мл) и чувствительными (МПК 0,05-1 мкг/мл) к энрофлоксацину и ципрофлоксацину. Наибольшую активность в отношении изолятов Ps.aeroginosa проявил ципрофлоксацин и его МГПС50 была в два раза ниже, чем у энрофлоксацина, норфлоксацина и флюмеквина (МПК50 1 мкг/мл).

Среди представителей других групп соединений, только цефтиофур был активен в отношении всех исследованных грамотрицательных микроорганизмов, за исключением Proteus mirabilis. При этом МПК50 цефтиофура в отношении чувствительных к нему Salmonella spp., Е. coli и Klebsiella была соответственно в 2,25 и 25 раз выше МПК50 энрофлоксацина.

Большинство изолятов энтеробактерий были резистентны к амоксициллину, доксициклину, левомицетину и линкомицину, для которых МПК50 находилась в пределах от 5 до 100 мкг/мл. Гентамицин при высокой активности в отношении Serratia (МПК50 0,25 мкг/мл), был умеренно активен в отношении Е. Coli (МПК5а 1,25 мкг/мл) и Salmonella spp.,(MnK50 1 мкг/мл), Proteus mirabilis (МПК50 1 мкг/мл) и не эффективен в отношении Ps. Aeroginosa (МПК50 5 мкг/мл) и Klebsiella (МПК50 10 мкг/мл).

Полученные нами результаты во многом согласуются с данными Яковлева С. В. (2005), который также установил преимущественную активность фторхинолонов в отношении семейства Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Proteus spp., Klebsiella spp., Shigella spp., Salmonella spp., Enterobacter spp., Serratia marcescens, Citrobacter spp.). Многие исследователи отмечают, что за последние 20 лет МПК энрофлоксацина в отношении грамотрицательных микроорганизмов практически не изменилась и составляет для Е. coli 0,06 мкг/мл, Klebsiella 0,06-0,5 мкг/мл, Serratia 0,06-0,25 мкг/мл, Salmonella 0,03-0,12 мкг/мл, Proteus mirabilis 0,06-0,25 мкг/мл, Ps. aeroginosa 0,25-4 мкг/мл, что согласуется с результатами наших опытов, и дает возможность констатировать, что к фторхинолонам у энтеробактерий развитие резистентности происходит медленно. (Schröder J., 1989; Watts J.L., Salmon S.A., Yancey R.J., Weaver L.J., Holmberg C„ Pankey J.W., Fox L.K., 1995).

Согласно литературным данным (Сидоренко С. В., Колупаев В. Е„ 1999; Страчунского JI.C., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н., 2000; Piddock L.J.V. , 1995; Brown S.A., 1996; Vancutsem P.M., Babish J.G., Schwark W.S., 1990) среди соединений класса фторхинолонов отмечается тенденция к развитию перекрестной резистентности, однако в наших исследованиях во многих случаях мы не наблюдали такой перекрестной резистентности, и устойчивые к действию флюмеквина и норфлоксацина микроорганизмы сохраняли чувствительность к энрофлоксацину и ципрофлоксацину.

Таким образом, наши исследования показали, что наибольшей антибактериальной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов обладают энрофлоксацин и цефтиофур. При этом к цефтиофуру количество резистентных штаммов достигает 15-18% в зависимости от вида микроорганизма, а к энрофлоксацину количество устойчивых бактерий не превышает 7-9%.

Учитывая высокую антибактериальную активность энрофлоксацина в отношении бактерий, выделенных от больных маститом коров, и незначительное количество микроорганизмов устойчивых к нему в состав противомаститного препарата был включен энрофлоксацин.

Изучение местно-раздражающего действия противомаститного препарата.

Изучение раздражающего действия препарата на паренхиму вымени показало, что через три часа после его однократного интрацистернального введения в молоке из опытной четверти вымени отмечается кратковременное увеличение количества соматических клеток (406,6+102,92 тыс./см3), характеризующее наличие воспалительного процесса, которое через 6 ч снижается до сопоставимых значений (211,4+26,06 тыс./см3), установленных до введения препарата (181,6+24,58 тыс./см3). Вероятно, повышение количества соматических клеток, является ответной реакции ткани вымени на введение препарата. В этот же период времени в молоке отмечались максимальные концентрации энрофлоксацина (678,74 мкг/мл) и кетопрофена (436,73 мкг/мл), а через 6 ч, концентрация этих веществ резко снижалась до 7,58 и 0,67 мкг/л соответственно. Таким образом, при однократном интрацистернальном введении препарат не оказывает существенного раздражающего действия на ткани вымени.

При пятикратном интрацистернальном введении было установлено, что после последнего введения препарата количество соматических клеток в молоке из опытных четвертей вымени в первую дойку достоверно (Р< 0,05) повышалось у коров I группы (терапевтическая доза) и II группы (трехкратная терапевтическая доза) и достигало максимальных значений соответственно 998,8+97,32 и 1150,33+267,01 тыс./см3 по сравнению с 178,20+75,43 и 106,00+52,00 тыс./см3 до введения препарата. Тем не менее, уже через 12 ч (вторая дойка), отмечалось достоверное (Р< 0,05) снижение уровня соматических клеток в опытных четвертях вымени до 235,60+99,83 тыс./см3 и 226,33+50,96 тыс./см3 соответственно в I и II группах, что было сопоставимо с количеством клеток в контрольных четвертях вымени.

Количество соматических клеток в молоке контрольной четверти вымени у коров в течение всего опытного периода не подверглось статистически значимым изменениям.

Таким образом, интрацистернальное введение противомаститного препарата оказывает кратковременное раздражающее действие на паренхиму вымени. Восстановление молочной железы до физиологической нормы происходит через 6 ч после однократного введения препарата в терапевтической дозе и через 24 ч после пятикратного введения препарата в трехкратной терапевтической дозе.

Изучение острой и субхронической токсичности противомаститного препарата на лабораторных животных.

С целью установления токсикологических параметров и класса опасности противомаститного препарата были проведены исследования его острой и субхронической токсичности на лабораторных животных.

Однократное введение в желудок крысам и мышам препарата в максимально возможных объёмах (дозы от 2500 до 10000 мг/кг массы) не привело

к гибели подопытных животных. Максимально переносимая доза, не вызвавшая гибели крыс и мышей - ЛДо составила 10000 мг/кг. В соответствии с общепринятой гигиенической классификацией (ГОСТ 12.1.007-76), препарат по степени токсичности может быть отнесен к 4 классу опасности («вещества малоопасные» с ЛД50 > 5000 мг/кг).

Исследования ульцерогенного действия при введении препарата в желудок крысам показали, что лекарственное средство способствует образованию дефектов слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, вероятно, за счет одного из компонентов препарата - кетопрофена, относящегося к классу нестероидных противовоспалительных веществ, обладающих

гастротоксичностью. Так, при введении препарата в дозах 8000 и 10000 мг/кг наблюдались множественные эрозии и кровоизлияния на слизистой желудка, что соответствовало 3 баллам. В минимальной испытанной дозе 5000 мг/кг ульцерогенное действие было менее выражено, отмечались точечные кровоизлияния, которые оценивались в 1-2 балла.

Результаты изучения субхронической токсичности на крысах показали, что двадцатиоднодневное пероральное введение препарата в дозах 1/10 (500 мг/кг) и 1/20 (250 мг/кг) от установленной минимальной дозы, оказывающей ульцерогенное действие (5000 мг/кг), не вызывали функциональных изменений в организме лабораторных животных. В этих группах не наблюдали изменений общего состояния и поведения крыс, а также достоверных различий (Р>0,05) по результатам клинических и биохимических исследований крови в сравнении с контрольной группой (таблица 1 и 2). Поэтому дозу препарата 500 мг/кг можно считать недействующей.

В группе животных, получавших максимальную дозу препарата 1000 мг/кг, отмечали недостоверное (Р>0,05) увеличение массовых коэффициентов некоторых органов: печени - 37,53±0,84 (36,71±0,84 в контроле); почек -7,25+0,23 (6,83+0,26 в контроле); селезенки - 4,25+0,26 (3,93±0,15 в контроле). Гематологические показатели крыс после окончания опыта находились в пределах физиологической нормы (таблица 1.)

Таблица 1. Гематологические показатели крыс после введения противомаститного препарата в течение 21 суток_

Показатели Группы животных, доза препарата, мг/кг массы

I 1000 II 500 III 250 IV контроль

Гемоглобин, г/л 140,70+3,25 139,80±3,13 148,80±4,48 140,20+3,83

Эритроциты, Ю'^/л 6,90+0,16 7,32+0,26 7,29+0,18 7,30+0,20

Тромбоциты, 10ч/л 829,20+42,74 794,30+37,51 883,00+29,85 778,20+81,61

Лейкоциты, Ю^/л 10,18+0,92 10,69+0,73 9,31+0,34 9,75+0,71

Лейкоцитарная формула, % Нейтрофилы 26.20+3,55 22,40+2,71 25,40+3,37 23,50+1,59

Моноциты 2,60+0,52 2,10+0,35 2,20+0,29 3,00+0,37

Эозинофилы 0,60+0,27 0,40+0,16 0,80+0,44 0,40+0,22

Лимфоциты 70,60±3,27 75,10+2,71 71,60+3,12 73,10+1,48

Все биохимические показатели крови крыс, получавших максимальную дозу противомаститного препарата, за исключением креатинина не отличались от

контрольной группы и находились в пределах физиологической нормы (таблица 2). Наблюдаемое дозозависимое снижение уровня ЛДГ в опытных группах, было статистически не достоверно (Р>0,05) и находилось в пределах физиологической нормы.

Согласно полученным результатам единственным статистически достоверным изменением биохимических показателей было снижение уровня креатинина (49,20+1,76 мкмоль/л против 62,50+1,35 мкмоль/л в контроле)в группе крыс, получавших препарат в максимальной дозе - 1000 мг/кг массы. Следовательно, дозу препарата 1000 мг/кг массы можно считать пороговой.

Таблица 2. Биохимические показатели крови крыс после введения противомаститного препарата в течение 21 суток_

Показатели Группы животных, доза препарата, мг/кг массы

I II III IV

1000 500 250 контроль

АЛТ, Ед/л 137,90+5,66 127,80+ 4,43 131,00+5,30 142,10+4,79

ACT, Ед/л 288,30±16,14 277,70±12,10 282,40+10,18 306,40±5,76

ЛДГ Ед/л 2705,80+321,43 2857,50+231,28 3131,7+169,29 3561,50+245,97

Мочевина, мкмоль/л 8,02+0,33 8,80+0,43 9,07+0,58 7,95+0,14

Креатшшн, мкмоль/л 49,20+1,76* 61,30+2,81 59,30+1,85 62,50+1,35

Мочевая кислота, мкмоль/л 311,80+15,67 292,30±13,68 272,30+9,02 278,20+8,64

* Различие по данному показателю статистически достоверно между опытной и контрольной

группами (р < 0,05 при 1критаческом = 2,10)

Отмеченные у подопытных животных изменения имели функциональный характер и не вызывали морфологических изменений структуры внутренних органах, что было подтверждено при патологоанатомическом вскрытии и гистологических исследованиях. Исходя из этого, можно констатировать, что длительное введение препарата в высоких дозах не вызвало гибели животных, клинических признаков отравления, функциональных и морфологических изменений внутренних органов.

Фармакокинетическими исследованиями было установлено, что после однократного введения в опытную четверть вымени препарата в терапевтической дозе, энрофлоксацин быстро поступал в молоко коров, где через 1 ч достигал максимальных концентраций 678,74 мкг/мл. В дальнейшем его уровень резко снижался, достигая через 6 ч концентрации 7,58 мкг/мл и через 21ч- 0,01 мкг/мл; через 24 ч содержание энрофлоксацина в молоке было ниже предела количественного определения метода (< 0,005 мкг/мл).

Кинетика выведения энрофлоксацина из контрольной четверти вымени была аналогична кинетике его выведения с молоком из опытной четверти вымени (график 1.). Максимальная концентрация энрофлоксацина в молоке была отмечена через 1 ч и составила 39,50 мкг/мл, что более чем 17 раз ниже, чем в молоке из опытной четверти вымени, а через 24 ч в молоке были обнаружены следовые количества энрофлоксацина.

Энрофлоксацин достаточно быстро метаболизируется и его активный в антибактериальном отношении метаболит ципрофлоксацин в образцах молока из опытной и контрольной четвертей вымени был обнаружен уже через 1 ч после интрацистернального введения препарата в концентрациях 8,05 мкг/мл и 3,44 мкг/мл соответственно. Динамика изменения его содержания в молоке носила схожий характер с энрофлоксацином (график 1).

График 1.Усредненные фармакокинетические профили энрофлоксацина и ципрофлоксацина в молоке из опытной и контрольной четвертей вымени

1000,0

6 9 12 15 18 21

время, прошедшее после введениям

- Энрофлоксацин (опытная четверть вымени) —■— Энрофлоксацин (контрольная четверть вымени)

- Цнлрофлоксацнн (опытная четверть вымени) Ципрофлоксацин (контрольная четверть выьсни)

Начиная с 9 ч и в последующие сроки исследования, концентрация ципрофлоксацина в молоке была выше уровня энрофлоксацина, и через 24 ча, когда энрофлоксацин в молоке коров практически отсутствовал, количество ципрофлоксацина еще находилось на уровне 0,02±0,06 мкг/мл. Такая фармакокинетика энрофлоксацина и его метаболита ципрофлоксацина обеспечивает активные антибактериальные концентрации в паренхиме вымени на протяжении не менее чем 12 ч.

На основании результатов проведенных исследований по изучению фармакокинетики энрофлоксацина и ципрофлоксацина были рассчитаны основные фармакокинетические параметры для фторхинолонов в молоке коров опытной и контрольной четвертей вымени (таблица 3).

Согласно полученным данным для энрофлоксацина характерна быстрая элиминация - период полувыведения составил 1,28+0,13 ч и длительность присутствия в молоке (MRT) - 2,01±0,18 ч. Совокупность этих двух показателей позволяет отнести энрофлоксацин к препаратам с коротким периодом существования в молоке. Энрофлоксацин плохо всасывается из молочной железы и практически не поступает в системный кровоток, циркулируя в основном в тканях вымени, о чем свидетельствует очень низкие значения объема распределения - Vz (менее 1 мл), а также результаты изучения фармакокинетики энрофлоксацина в

плазме крови после многократного введения препарата, в которой фторхинолон обнаруживался на уровне предела определения метода (<5,00 пг/мл).

Таблица 3. Фармакокинетические параметры энрофлоксацина и ципрофлоксацина в молоке коров после однократного интрацистерналыюго введения противомаститного препарата__

Фармакокинетические параметры Энрофлоксацин Ципрофлоксацин

Опытная четверть вымени Контрольная четверть вымени Опытная четверть вымени Контрольная четверть вымени

AUCo-и, мкг/мл*ч 2138,06 103,32 35,02 13,14

tmax, Ч 1 1,4 1 2,8

Cmai, МКГ/МЛ 678,7 39,67 8,05 3,66

С1м, л/ч 0,0005 0,0126 - -

kd, ч" 0,5452 0,4013 0,2831 0,2385

tin, Ч 1,28 1,81 2,47 2,95

MRT, ч 2,01 3,24 3,44 4,88

Уг, л 0,0009 0,0371 - -

Поскольку ципро< шжеацин - метаболит энрофлоксацина, образующийся в

организме животного, то рассчитать его дозозависимые параметры, такие как клиренс и кинетический объем распределения, не представляется возможным. При этом ципрофлоксацин по сравнению с исходным соединением имеет статистически достоверно больший период полусуществования в молоке (tia) -2,47-2,95 ч, а энрофлоксацин - 1,28-1,81 ч. Длительность пребывания в молоке (MRT) для энрофлоксацина и ципрофлоксацина соответственно составили 2,01+0,18 ч и 3,44±0,52 ч.

Энрофлоксацин и ципрофлоксацин являются «концентрация-зависимым» антибактериальными соединениями, определяющим для них является не столько период их полувыведения, сколько максимальные концентрации, создаваемые в патологическом очаге (Джекобе М., 2004; Prescott JF, Yielding KM., 1990). Поэтому основным фармакокинетическим/фармакодинамическим параметром (ФК/ФД), определяющим терапевтическую эффективность таких соединений и возможность снижения риска развития резистентности, является соотношение между площадью под фармакокинетической кривой (ПФКга) и минимальной подавляющей концентрацией (МПК) - ПФК24/МПК, которое, согласно литературным данным, для грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов должно быть на уровне или выше 50 и 125 соответственно. (Париков В.А., Н.Т. Климов, Новиков О.Г., 2000; EFSA Scientific report 2009; EMEA/CVMP/SAGAM/62464/2009).

В наших исследования отношения ПФК24/МПК энрофлоксацина было от 855,2 до 4276 для грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, что позволяет утверждать о потенциальной высокой терапевтической эффективности противомаститного препарата и значительном снижении возможности развития резистентности у микроорганизмов при его применении (Струкова Е.Н., 2010; Otero J.L., Mestorino N„ Errecalde J.O., 2009).

Согласно полученным результатам суммарная концентрация энрофлоксацина и ципрофлоксацина в молоке в течение 9-12 ч находилась на уровне 0,2-2,0 мкг/мл. В связи с тем, что показатель ПФК24/МГЖ в этот отрезок времени многократно превышал минимально эффективный уровень, то для достижения терапевтического эффекта при лечении мастита бактериальной этиологии у лактирующих коров лекарственный препарат необходимо вводить интрацистерналыю с интервалом 12 ч.

Фармакокинетика кетопрофена (второго активного компонента препарата) показала, что его максимальные концентрации, также как и энрофлоксацина в молоке опытной четверти вымени достигаются через 1 ч после введения противомаститного препарата, затем через 6 ч концентрация резко снижается с 21,00 мкг/мл до 0,67 мкг/мл, и через 9 ч его следы обнаруживаются в пробах молока только у двух животных из пяти. Кетопрофен, также как энрофлоксацин, быстро элиминирует из молока, период его полувыведения составляет 1,15+0,39 ч, что позволяет отнести его к соединениям с коротким периодом существования (таблица 4). Полученные данные по скорости элиминации кетопрофена во многом соответствуют данным других исследователей, полученным при его энтеральном и парентеральном введениях. (AlKatheeri N.A., LA. Wasti, М„ 2001; EMEA/MRL/020/95; Sams R„ Gerken D.F., Ashcraft S.M., 1995 ).'

Таблица 4. Фармакокинетические параметры кетопрофена в молоке коров из опытной четверти вымени____

Показат ель Параметры

AUCO-24 мкг/млхч tmax, Ч Сщах, мкг/мл С1„. л/ч kelV 1ш,Ч MRT.4

*±SD 210,64±+214,05 1,00 64,54+53,12 0,00 0,68+0,27 1 1,15+0,39 2,49+0,33 0,0017+0,002

Малые значения объема распределения (Уг) и отсутствие во все сроки исследования кетопрофена в крови свидетельствуют о том, что вещество плохо распределяется по внутренним органам и тканям, а циркулирует в молочной железе и, вероятно, оказывает только местное противовоспалительное и обезболивающее действие.

Определение остаточных количеств энрофлоксацина. иипрофлоксаиина и кетопрофена в молоке после многократного интраиистернального введения противомаститного препарата.

В результате проведенных исследований установлено, что энрофлоксацин после пятикратного введения противомаститного препарата достаточно быстро выводиться с молоком. Максимальная концентрация (41,56 ±6,45 нг/мл) была установлена через 12 ч и уже через 24 ч снижалась более чем в два раза (16,39+2,37 нг/мл), спустя 36 ч содержание энрофлоксацина было на уровне предела количественного определения метода (5,00 нг/мл). Через 48 ч энрофлоксацин не обнаружили ни в одном из исследованных образцов молока. Энрофлоксацин в молоке из контрольной четверти вымени в первые сутки определили в следовых количествах (6,13 нг/мл) только у одной коровы из пяти. Спустя сутки энрофлоксацин не обнаружили ни в одном образце молока.

Максимальная концентрация ципрофлоксацина в молоке, также как и энрофлоксацина, достигалась через 12 ч после последнего введения противомаститного препарата (65,78+4,80 нг/мл), через 24 ч снижалась в 3 раза (20,01+4,60 нг/мл) и к 36 ч

была на уровне 15,46+1,07 нг/мл. При этом концентрация из контрольной четверти вымени была сопоставима с концентрацией из опытной четверти вымени (от 64,20+10,31 нг/мл через 12 ч после введения препарата до 17,10+3,36 нг/мл через 36 ч). В последующие периоды исследований ципрофлоксацин в молоке из опытной и контрольной четвертей вымени обнаруживали в следовых количествах (< 5,00 нг/мл).

Учитывая, что ципрофлоксацин в образцах молока из контрольной и опытной четвертей вымени, обнаруживался примерно в одинаковых концентрациях, можно предположить, что энрофлоксацин незначительно всасывается в кровь (5,16-11,43 нг/мл) из тканей молочной железы, в дальнейшем метаболизируется в печени до ципрофлоксацина, который в свою очередь, как липофилыюе соединение, создает более высокие концентрации в молоке по сравнению с кровью. Поэтому содержание ципрофлоксацина в опытной и контрольной четвертях вымени через 12 ч после последнего введения препарата было практически одинаково (~ 65 нг/мл). Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что фторхинолоны при многократном интрацистерналыюм введении противомаститного препарата всасываются в кровь незначительно, следовательно, практически не будут поступать и накапливаться в органах и тканях животного.

Второй компонент - кетопрофен после многократного введения препарата уже через 12 ч не был обнаружен во все сроки исследований в молоке и плазме крови, что дает возможность говорить о том, что он практически не поступает в системный кровоток и не аккумулируется в организме. Полученные нами результаты согласуются с данными ЕМЕА, согласно которым, сроки использования животноводческой продукции после применения кетопрофена не устанавливаются, так как он быстро выводится из организма животного (ЕМЕА/МЫЛ)20/95).

Результаты исследований показали, что через 24 ч после последнего интрацистерналыюго введения препарата максимальная суммарная концентрация энрофлоксацина и ципрофлоксацина в пробах молока составила 0,055 мкг/мл, что не превышает установленный в странах ЕС и членах Таможенного союза МДУ (энрофлоксацин + ципрофлоксацин - 0,1 мкг/мл), а кетопрофен в молоке не обнаруживался. В связи с этим молоко может быть использовано в пищевых целях не ранее чем через 24 ч после последнего применения противомаститного препарата.

Определение оптимальной дозы противомаститного препарата.

При выборе оптимальной дозы противомаститного препарата было установлено, что применении лекарственного средства в дозе 250 мг энрофлоксацина+50 мг кетопрофена в шприце-дозаторе при мастите у коров недостаточно эффективно и обеспечивает выздоровление только 78,5% животных (таблица 5). Увеличение доз препарата до 300 мг энрофлоксацина+50 мг кетопрофена в шприце-дозаторе и до 350 мг энрофлоксацина+50 мг кетопрофена в шприце-дозаторе повышает эффективность лечения до 92,0% и 92,5% соответственно. Исходя из того, что средняя и максимальная дозы по эффективности достоверно (Р>0,05) не отличались, с экономической точки зрения более целесообразно использовать лекарственное средство в дозировке 300 мг энрофлоксацина+50 мг кетопрофена в шприце-дозаторе, которую в дальнейших исследованиях в производственных условиях приняли за терапевтическую дозу.

Таблица 5. Определение оптимальной терапевтической дозы противомаститного препарата у коров в период лактации_

Показатели Противомаститный препарат на основе энрофлоксацина и кетопрофена

Группы I П Ш

Доза препарата на четверть вымени шприц-дозатор 7,5 мл: 250 мг энрофлоксацина + 50 мг кетопрофена шприц-дозатор 7,5 мл: 300 мг энрофлоксацина + 50 мг кетопрофена шприц-дозатор 7,5 мл: 350 мг энрофлоксацина + 50 мг кетопрофена

Количество животных, голов 20 19 18

Количество четвертей вымени с признаками мастита 28 25 27

Кратность введения 1 раз с интервалом 12 ч 1 раз с интервалом 12 ч 1 раз с интервалом 12ч

Количество введений за курс лечения 4,1+1,2 2,9+0,25 2,7+0,46

Количество вылеченных четвертей вымени 22 23 25

Терапевтическая эффективность, % 78,5 92,0 92,5

Подтверждением того, что выбранная терапевтическая доза является оптимальной, служили установленные суммарные антибактериальные концентрации энрофлоксацина и ципрофлоксацина (0,2-2,0 мкг/мл), создаваемые в паренхиме вымени на протяжении 9-12 ч после введения противомаститного препарата. Фармакокинетическое распределение фторхинолонов с учетом уровня антибактериальных концентраций в тканях вымени явилось основанием для рекомендации применения препарата с интервалом 12 ч.

Изучение терапевтической эффективности препарата в условиях производства.

Изучение терапевтической эффективности противомаститного препарата в выбранной терапевтической дозе 300 мг энрофлоксацина + 50 мг кетопрофена в шприце-дозаторе (7,5 мл) проводили в сравнении с отечествешшми и зарубежными лекарственными средствами широко применяемыми для лечения мастита бактериальной этиологии у лактирующих коров (таблица 6). Согласно полученным результатам опытный препарат обладает высокой терапевтической эффективностью при лечении катарального и серозного мастита коров соответственно 91,3% и 90,9%, не уступает в эффективности зарубежным аналогам (Тетра-Дельта и Мастилекс) и более эффективен, чем аналогичные отечественные лекарственные средства (Вахкамаст и Эроксимаст).

- Полученные результаты клинических испытаний, проведенные на 201 лактирующей корове в производственных условиях, доказывают высокую эффективность трехкратного применения с интервалом 12 ч противомастштюго препарата с содержанием в шприце-дозаторе 300 мг энрофлоксацина и 50 мг кетопрофена при лечении катарального и серозного мастита бактериальной этиологии.

Таблица 6. Сравнительная эффективность противомаститных препаратов для интрацистернального введения при мастите бактериальной этиологии у коров в период лактации ____

Показатели Препарат на основе энрофлоксацина и кетопрофена Тетра-Дельта Мастилекс Ваккамаст Эроксимаст

Количество животных, голов 103 19 31 35 13

Количество четвертей вымени с признаками: катарального мастита серозного мастита 117 И 26 23 20 37 18

Доза препарата на четверть вымени, шприц-дозатор 1 1 1 1 0,5

Кратность введения 2 раза в сутки 2 раза в сутки 2 раз в сутки 1 раз в сутки 1 раз в сутки

Количество введений за курс лечения при: катаральном мастите серозном мастите 2,76+0,73 2,8+0,21 3 3 3 3,3+0,23 3,6+0,83

Количество вылеченных четвертей вымени при: катаральном мастите серозном мастите 107 10 24 21 18 32 15

Терапевтическая эффективность при: катаральном мастите,% серозном мастите,% 91,3±1,12 90,9 92,3 91,3 90,0 86,5 83,3

ВЫВОДЫ

1. На основании результатов экспериментальных исследований дано научное обоснование для внедрения в ветеринарную практику нового противомаститного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена.

2. В опытах in vitro установлено, что энрофлоксацин обладает выраженной антибактериальной активностью в отношении основных возбудителей мастита - стафилококков, стрептококков и энтеробактерий (МПК от 0,01 до 2,5 мкг/мл) и превосходит по активности, применяемые в ветеринарии фторхинолоны (норфлоксацин и флюмеквин), тетрациклины (доксициклин), полусинтетические пенициллины (амоксициллин), линкозамиды (клиндамицин), хлорамфениколы (левомицетин), цефалоспорины (цефалексин) и сопоставим по своей активности с ципрофлоксацином, цефтиофуром и гентамицином.

3. Высокая антибактериальная эффективность противомаститного препарата при интрацистернальном введении подтверждается взаимосвязью фармакодинамических и фармакокинетических показателей энрофлоксацина, характеризующихся коэффициентом отношения площади под фармакокинетической кривой к минимальной подавляющей концентрации, который в зависимости от микроорганизма, находился в пределах от 855,2 до 4276.

4. Препарат на основе энрофлоксацина и кетопрофена для интрацистернального введения по степени воздействия на организм относится к веществам «малоопасным» (4 класс опасности согласно ГОСТ 12.1.007-76): максимально переносимая доза для белых мышей и крыс при однократном введении в желудок составляет более 10000 мг/кг массы.

5. По параметрам установленным в субхроническом опыте доза противомаститного препарата 1000 мг/кг/сутки при ежедневном введении в желудок в течение 21 суток является для крыс пороговой (вызывает достоверное снижение креатинина в сыворотке крови), доза 500 мг/кг/сутки - недействующая (не вызывают функциональных изменений в организме животных).

6. Однократное и пятикратное интрацистернальное введение лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена в терапевтической и трехкратной терапевтической дозах не оказывает раздражающего действия на паренхиму вымени коров.

7. Противомаститный препарат на основе энрофлоксацина и кетопрофена для интрацистернального введения обеспечивает в молочной железе быстрое создание (через 1ч- 678,74 мкг/мл) и длительное поддержание эффективных антибактериальных (через 12 ч - 0,2 мкг/мл) и противовоспалительных и анальгетических (до 9 ч) концентраций и практически не всасываются в системный кровоток.

8. Фармакокинетические параметры энрофлоксацина и кетопрофена подтверждают их быструю элиминацию, о чем свидетельствует период полувыведения - (1,28+0,13 ч и 1 ч соответственно), длительность обнаружения в молоке (2,01+0,18 ч и 2,49+0,33 ч соответственно), объем распределения (0,0009 л и 0,0017+0,0020 л соответственно), что позволяет отнести действующие вещества

противомаститного препарата к соединениям с коротким периодом существования в молоке. Активный метаболит ципрофлоксацин имеет больший период существования в молоке по сравнению с исходным соединением энрофлоксацином, период его полувыведения составляет 2,47-2,95 ч, длительность пребывания в молоке - 3,44±0,52 ч.

9. Через 24 ч после последнего интрацистерналыюго введения препарата дойным коровам кетопрофен в молоке не обнаруживался, а максимальное суммарное содержание энрофлоксацина и ципрофлоксацина (0,036 мкг/мл) было более, чем в два раза ниже МДУ (0,1 мкг/мл), установленного в странах - членах Таможенного союза, что позволяет использовать молоко в пищевых целях через сутки после окончания курса лечения.

10. Результаты клинических испытаний лекарственного препарата в условиях производства показали высокую терапевтическую эффективность препарата при лечении катарального и серозного мастита, составившую соответственно 91,3 и 90,9%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предложен противомаститный препарат для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена, предназначенный для лечения мастита бактериальной этиологии у коров в период лактации.

В результате проведенных исследований лекарственный препарата на основе энрофлоксацина и ципрофлоксацина рекомендован для лечения мастита бактериальной этиологии у коров в период лактации в дозе 300 мг энрофлоксацина и 50 мг кетопрофена в шприце-дозаторе (7,5 мл) трехкратно с интервалом 12 ч.

Полученные результаты исследований будут включены в проект инструкции по применению лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена при лечении мастита бактериальной этиологии у коров в период лактации и войдут в состав регистрационного досье в разделы по доклиническим и клиническим исследованиям.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лобова, П.С. Чувствительность полевых изолятов стафилококков к антибиотикам / П.С. Лобова, A.B. Морозова, В.Е. Абрамов, А.Ю. Гуляева, Н.И. Тягнибедина // «Аграрная наука». - 2009. - №11. - С.26-28.

2. Панин, А.Н. Чувствительность стафилококков и стрептококков к антибактериальным соединениям / А.Н. Панин, А.Ю. Гуляева, П.С. Лобова, Н.И. Тягнибедина, В.Б. Муравьева, Б.В. Виолин // «Аграрная наука». - 2010. - №11. -С.27- 29.

3. Гуляева, А.Ю. Фармакокинетика энрофлоксацина и его метаболита ципрофлоксацина в молоке коров после однократного интрацистернального введения энрофлоксацина / А.Ю. Гуляева, Б.В. Виолин, С.И. Чукина, С.И. Авчук // «Аграрная наука». - 2014. - №2. - С. 31 -33

4. Гуляева, А.Ю. Возможность использования диско-диффузного метода для оценки чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в ветеринарии / А.Ю. Гуляева, Б.В. Виолин, В.Б. Муравьева // «Ветеринарный врач». - 2013. - №6. - С. 2226.

5. Гуляева, А.Ю. Изучение устойчивости стафилококков и стрептококков к различным группам антибактериальных соединений / А.Ю. Гуляева, Б.В. Виолин II Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации: Материалы IV съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России. - М.: ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. - 2013. - С. 180-182.

Подписано в печать:

12.03.2014

Заказ № 93 91 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wwvv.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Гуляева, Анастасия Юрьевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ»

На правах рукописи

04201456841

Гуляева Анастасия Юрьевна

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ИНТРАЦИСТЕРНАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ НА ОСНОВЕ ЭНРОФЛОКСАЦИНА И КЕТОПРОФЕНА

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, доцент Виолин Б.В.

Москва - 2014

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВЕДЕНИЕ.......................................................................... 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................... 10

1.1. Мастит крупного рогатого скота....................................... 10

1.2. Резистентность и механизмы ее развития............................. 17

1.3. Фторхинолоны.............................................................. 29

1.4. Кетопрофен.................................................................. 42

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................. 48

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................. 48

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.................................... 67

2.2.1 Результаты изучения антибактериальной активности

энрофлоксацина............................................................ 67

2.2.2. Результаты изучения острой токсичности противомаститного препарата в опытах на лабораторных животных..................... 77

2.2.3. Результаты изучения субхронической токсичности противомаститного препарата в опытах на лабораторных животных...................................................................... 79

2.2.4. Результаты изучения местно-раздражающего действия на паренхиму вымени после однократного и многократного интрацистернального введения противомаститного препарата... 82

2.2.5. Результаты изучения фармакокинетики энрофлоксацина,

ципрофлоксацина и кетопрофена в молоке и плазме крови коров.......... 86

2.2.6. Результаты определения остаточных количеств энрофлоксацина, ципрофлоксацина и кетопрофена в молоке коров после многократного введения противомаститного препарата............ 90

2.2.7. Результаты определения оптимальной дозы противомаститного препарата...................................................................... 92

2.2.8. Результаты изучения терапевтической эффективности

противомаститного препарата в условиях производства........................93

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................................99

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................128

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..............................................................................130

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................131

ПРИЛОЖЕНИЕ А..............................................................................................................................156

ПРИЛОЖЕНИЕ Б..............................................................................................................................163

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Анализ структуры заболеваний крупного рогатого скота в молочном скотоводстве показывает, что развитию отрасли существенно препятствуют различные инфекционные и незаразные болезни лактирующих коров, среди которых наиболее серьёзный ущерб наносит мастит (41, 79, 91, 269).

Экономический ущерб, связанный с маститом, складывается из снижения удоев и качества молока, потери молочной продуктивности и преждевременной выбраковки коров до завершения генетически заложенного лактационного периода. Помимо экономического ущерба, мастит представляет серьезную опасность для здоровья людей, в связи с возможным попаданием в молоко патогенных для человека микроорганизмов и их токсинов (52, 86).

Предрасполагающими факторами развития мастита являются нарушение условий содержания, кормления и доения, а также различные гинекологические заболевания и изменение обмена веществ, что в комплексе снижает общую резистентность организма и способствует ослаблению барьерной функции тканей вымени. На этом фоне создаются благоприятные условия для внедрения и распространения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в паренхиме вымени, что вызывает воспаление молочной железы - мастит (52).

Наиболее часто при маститах выделяют монокультуры или в различных сочетаниях такие микроорганизмы, как стрептококки - Str. agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. pyogenes, Str. uberis; стафилококки — S. pyogenes aureus, S. citreus, S. Albus, а также Escherichia coli и Pseudomonas aerugenosa (53,182).

Несмотря на большое количество, используемых в настоящее время противомаститных препаратов, вследствие широкого распространения антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, их эффективность

постоянно снижается. Поэтому разработка новых противомаститных препаратов активных в отношении устойчивых к антибиотикам патогенов продолжает оставаться актуальной (65).

Одним из путей воздействия на антибиотикорезистентные микроорганизмы является применение новых соединений, к которым у бактерий еще не сформировались механизмы резистентности. К таким соединениям относятся фторхинолоны, механизмом действия которых заключается в ингибировании активности ферментов ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, приводящей к нарушению синтеза ДНК бактериальной клетки, что обеспечивает отсутствие перекрестной резистентности с другими антибиотиками, сульфаниламидами и нитрофуранами (111, 114).

Поэтому на основании собственных исследований и литературных данных в качестве антибактериального компонента в состав нового противомаститного препарата был включен фторхинолон энрофлоксацин, ранее не использовавшийся в лекарственных средствах для интрацистернального введения. Энрофлосацин в низких концентрациях обладает широким спектром действия в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, хорошей биодоступностью из места введения, а также малотоксичен для теплокровных животных, ввиду отсутствия у них фермента ДНК-гиразы, мишени для фторхинолонов в клетках микроорганизмов (107, 188).

Хотя основным этиотропным фактором в развитии мастита являются инфекционные агенты, патогенез болезни во многом основан на развитии воспалительных процессов в паренхиме вымени, приводящим к появлению боли и отеков, что осложняет течение болезни и увеличивает сроки выздоровления (115).

Поэтому важной составляющей успешной терапии мастита, помимо этиотропного компонента, воздействующего на причину болезни -микроорганизмы, является применение соединений, обладающих противовоспалительным действием и снижающих болевую реакцию, то есть,

воздействующих на патогенез и симптомы заболевания (115). Такими компонентами, используемыми в противомаститных препаратах для интрацистернального введения, являются глюкокортикоиды (преднизолон, дексаметазон). Несмотря на выраженный противовоспалительный эффект эти препараты обладают рядом нежелательных побочных реакций, например, таких как снижение местного иммунитета. Учитывая побочное действие глюкокортикоидов, в последнее время широкое применение в медицине и ветеринарии нашли нестероидные противовоспалительные соединения (НПВС), которые обладают выраженным противовоспалительным, анальгезирующим и жаропонижающим действием, при этом практически не оказывают побочного действия на макроорганизм. Среди НПВС одним из наиболее сильных обезболивающих соединений является кетопрофен, широко применяемый у нас в стране и за рубежом в различных лекарственных формах. Механизм действия кетопрофена связан с угнетением активности циклооксигеназы (ЦОГ) - основного фермента метаболизма арахидоновой кислоты, являющейся предшественницей простагландинов, которые играют главную роль в патогенезе воспаления, боли и лихорадки (31,101).

Поэтому в качестве противовоспалительного компонента в состав нового противомаститного препарата дополнительно был включен кетопрофен.

Учитывая, что до настоящего времени в зарубежной и отечественной ветеринарной практике лекарственный препарат для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина с кетопрофеном не использовался, представлялось актуальным изучить его фармако-токсикологические свойства и терапевтическую эффективность при лечении мастита бактериальной этиологии у лактирующих коров.

Для решения вопроса о возможности использования противомаститного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена в ветеринарной практике и доказательства его безопасности и эффективности

при лечения мастита у коров в период лактации были проведены исследования по изучению антибактериальной активности; острой и субхронической токсичности в опытах на лабораторных животных; раздражающего действия на ткани молочной железы коров; фармакокинетики энрофлоксацина и кетопрофена и определению сроков выведения остаточных количеств действующих веществ препарата из организма коров, а также по изучению его терапевтической эффективности.

Цели и задачи исследований.

Изучить фармако-токсикологические свойства и терапевтическую эффективность нового лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена при лечении мастита у лактирующих коров.

В задачи исследований входило:

- определить антибактериальную активность энрофлоксацина в опытах in vitro на изолятах микроорганизмов, выделенных из молока коров больных маститом, в сравнении с другими группами антибактериальных средств, широко используемыми при лечении мастита у коров;

изучить фармако-токсикологические свойства лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена на лабораторных животных;

изучить раздражающее действие на паренхиму вымени лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена;

- изучить фармакокинетику и установить сроки выведения остаточных количеств энрофлоксацина, ципрофлоксацина и кетопрофена с молоком лактирующих коров после интрацистернального введения лекарственного препарата;

- установить оптимальную терапевтическую дозу и разработать схему применения лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и

кетопрофена для лечения мастита бактериальной этиологии у коров в период лактации;

- оценить терапевтическую эффективность и безопасность применения лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена при мастите дойных коров в условиях производства.

Научная новизна.

Впервые изучены фармако-токсикологические свойства нового лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена для интрацистернального введения. Установлены особенности распределения, накопления в тканях паренхимы вымени и сроки выведения остаточных количеств кетопрофена, энрофлоксацина и его метаболита ципрофлоксацина с молоком. В условиях животноводческих хозяйств обоснована эффективность применения противомаститного препарата в ветеринарной практике.

Практическая значимость работы.

На основании результатов исследований доказана возможность безопасного и эффективного использования лекарственного препарата для интрацистернального введения на основе энрофлоксацина и кетопрофена в ветеринарной практике. Экспериментально обоснованы оптимальная терапевтическая доза (300 мг энрофлоксацина и 50 мг кетопрофена в шприце-дозаторе 7,5 мл), схема применения (трехкратно с интервалом 12 ч) и сроки возможного использования молока (1 сутки) в пищевых целях после интрацистернального введения препарата дойным коровам.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены

на:

- IV съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» Москва, 2013 г.;

- Заседании ученого совета ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» в 2012,2013 гг.

Личный вклад соискателя.

Диссертационная работа является результатом научной работы в период с 2009 по 2013 гг. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно и выполнен при научно-методической и консультационной помощи кандидата вет. наук, доцента Б.В. Виолина.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- результаты изучения антибактериальной активности энрофлоксацина;

- характеристика фармако-токсикологических свойств лекарственного препарата для интрацистернального введения по результатам доклинических исследований;

- результаты изучения фармакокинетики и динамики выведения остаточных количеств кетопрофена, энрофлоксацина и ципрофлоксацина с молоком коров после интрацистернального введения нового противомаститного препарата;

- результаты клинических исследований лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена при лечении мастита коров в условиях производства;

- практические предложения по применению лекарственного препарата на основе энрофлоксацина и кетопрофена в ветеринарной практике.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, 4 из них в изданиях, рекомендованных ВАК России.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Мастит крупного рогатого скота

С момента, когда человек одомашнил животных с целью получения молока, возникла проблема заболевания вымени - маститы. За тысячелетия развития молочного скотоводства ситуация существенно не изменилась в лучшую сторону, маститы, даже на фоне сбалансированного кормления, остаются основным ограничивающим фактором в полной реализации генетического потенциала коров по молочной продуктивности и качеству молока. Сегодня в зависимости от региона и страны мира клинической и скрытой формами мастита болеют в среднем от 17 до 20 % коров, а в отдельных регионах - 50% (19, 20, 91, 93, 98,140, 229, 278).

В России скорее всего из-за неорганизованного сбора информации по животным, заболевшим маститом, ситуация выглядит несколько иначе. По данным Иноземцева В.П., (1999 г.) в 1995 году в России более 10% маточного поголовья переболело маститом (28, 29). При этом в 1995 - 1997 годах мастит был диагностирован в зависимости от области у 10,4 - 36,3% животных; по России в среднем 8,3 - 9,8%. Наибольший процент поражения коров маститом отмечен в хозяйствах Вологодской (27,3 - 36,3%) и Кировской (23,9 - 30,0%) областей, несколько реже заболевание встречается в Свердловской (18,9 - 25,6%) и Ульяновской (16,2 - 17,5%) областях; низкий уровень зарегистрирован в Воронежской области (10,3 - 13,8%) и Приморском крае (10,4 -13,8%) (25, 26, 37, 93).

Экономический ущерб, наносимый маститами, складывается из снижения удоев и качества молока, потери молочной продуктивности и выбраковки коров (37).

Помимо экономического ущерба, мастит бактериальной этиологии представляет серьезную опасность для здоровья человека в связи с возможным попаданием в молоко патогенных для людей микроорганизмов и их токсинов. Так стафилококковые энтеротоксины, не разрушающиеся даже при кипячении и пастеризации молока, вызывают тяжелые пищевые

отравления, часто с летальным исходом. Патогенные стрептококки в молоке могут приводить к эндокардитам, менингитам новорожденных, ангинам и пищевым расстройства. Молоко, содержащее токсины кишечной палочки, может вызывать тяжело протекающие энтериты (47).

Мастит - заболевание молочной железы, возникающее в результате воздействия факторов внешней и внутренней среды и характеризующееся типичными признаками воспалительного процесса: покраснение, болезненность, отек, повышение местной температуры и нарушение секреторной деятельности молочной железы (99).

Маститы диагностируются во все циклы развития молочной железы: запуска, сухостоя, сразу после отела, но наиболее часто возникают в лактационный период (37, 98).

По данным разных авторов, во время лактации маститы встречаются у 36,3% животных, при запуске — у 22,6%, в сухостойный период - у 15,8% и в первые дни после отела — у 25,3% (27, 33, 37, 41, 51, 63, 68, 91, 98, 205, 285). Ведущая роль в этиопатогенезе маститов принадлежит бактериям, грибам и вирусам, причем доля бактериальных маститов превышает 80% (13, 30, 33, 41, 83).

Микроорганизмы могут быть непосредственной причиной развития мастита или осложнять воспалительный процесс, вызванный другими факторами, как например, травмированием тканей вымени, при неудачно выбранном режиме доения. Маститы возникают, как под влиянием микрофлоры, проникающей в вымя из внешней среды (через сосковый канал или при повреждении кожи вымени), так и вследствие развития условно-патогенной микрофлоры в результате снижения резистентности организма (37, 60).

Анализируя спектр микроорганизмов, выделяемых при маститах, установлено, что основную роль играют стрептококки — Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis; стафилококки — Staphylococcus aureus, Staphylococcus citreus,

Staphylococcus albus; кишечная палочка — Escherichia coli; синегнойная палочка — Pseudomonas aerugenosa (53). В исследовании, проведенном Jones G.M., Bailey, T.L, Roberson JR (1998) было показано, что кишечная палочка выделена в 28,2% случаев, стафилококки - в 26,9%, стрептококки - в 25% случаев (183).

В Корее в 2008 г было установлено, что количество коагул�