Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Совершенствование средств и способов профилактики и лечения мастита у коров

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование средств и способов профилактики и лечения мастита у коров"

На правах рукописи Тагирмирзоев Багир Маилович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ И СПОСОБОВ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ МАСТИТА У КОРОВ

06.02.02 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Курск-2015

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова»

Научный руководитель

доктор ветеринарных наук, профессор Евглевский Анатолий Алексеевич

Официальные оппоненты:

Скворцов Владимир Николаевич,

доктор ветеринарных наук, профессор, Белгородский филиал ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Р.Л. Коваленко», директор

Ведущая организация

Шевцов Илларион Андреевич,

кандидат ветеринарных наук, ОБУ «Курская городская станция по борьбе с болезнями животных», руководитель

ФГБОУ ВО «Белгородский государственный аграрный университет имени В.Я. Горина»

Защита состоится «18» мая 2015 г. в «10-00» часов на заседании диссертационного совета Д 220.040.03 при ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» по адресу: 305021, г. Курск, ул. К.Маркса, 70. Тел. (4712) 53-13-30, факс (4712) 58-50-49.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» и на сайге www.kgsha.ru

Автореферат разослан 2015 г.

Учвный секретарь

диссертационного совета Рыжкова Галина Фёдоровна

РОГХИИС.КЛ'.! ос;удл!';'. > шпиля

ЬИЬЛИО! f-КЛ .

/ч\:> 1. С

БЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследований. Многообразие видов и свойств стафилококков, стрептококков, E.coli, коринебактерий, Ps. aeruginosa, микоплазмы, плесневые грибы и поражения ими органов, тканей и в частности молочной железы коров являются одной из сложных проблем, стоящих перед наукой и практикой.

Получение качественного молока зависит от породы крупного рогатого скота, условий содержания, кормления, доения, соблюдения комплексной программы борьбы с маститом (гр. mastos - грудь, сосок) с использованием эффективных экологически безопасных средств профилактики и лечения больных коров.

Импорт дешевого сухого молока и его заменителей (пальмовое, кокосовое масло), низкий технологический и технический уровень многих предприятий молочного скотоводства, превалирующий поток импортных диагностических, профилактических и терапевтических препаратов способствуют сокращению срока использования коров, снижению качества и увеличению себестоимости молока.

Соблюдение общепринятых нормативных показателей содержания в молоке до 500 тыс / мл соматических клеток и бактериальной обсемененности не более 150 тыс / мл способствует получению доброкачественного молока и молочных продуктов.

Для диагностики субклинических форм мастита с определением концентрации соматических клеток в основном используют два препарата, содержащие поверхностно-активные вещества - димастин с индикатором фенолрот и мастидин с бромкрезолпурпуром с использованием молочно-контрольных пластинок и подсчет соматических клеток под микроскопом.

Для профилактики инфицирования вымени у коров в сухостойный период используют интрацистернальное введение антибиотиков для закрытия отверстия соска и защиты проникновения микроорганизмов в вымя до 100 дней.

Изучено, что к основным антибиотикам проявляется резистентность у S.aureus до 60-70 %. Использование одних антибиотиков с другими, внесение в их состав клавулановой кислоты, органических кислот, Трилона-Б, аргинина, колистина, пиперазинового радикала, фтора не обеспечивает качественного прорыва в преодолении антибактериальной резистентности микроорганизмов.

Степень ее разработанности. В исследованиях ряда авторов доказано, что необходимы иные научно обоснованные подходы повышения биоцидной и лечебной эффективности антибиотиков (Поздеев O.K., 2010; Податская E.H., 1998).

В связи с запретом наличия антибиотиков в молоке возникает необходимость разработки биоцидных и лечебных средств без антибиотиков и соответствующих биопрепаратов.

С учетом воздействия внешних факторов на биологические и эволюционно сложившиеся свойства микроорганизмов целесообразно использовать инактивированные стафилококковые или стафилострептококковые анатоксин-вакцины с выращиванием микроорганизмов на синтетических питательных средах вместо МПГБ и эффективных детоксикаторов и полимеризаторов комплекса токсино-аллергенов вместо канцерогенного формальдегида и

ртутьсодержащего консерванта - мертиолята и повышения эффективности антибиотиков (Безгин В.М., 2011; Самуйленко А .Я., 2005,2007; Воробьев А.А., 1999).

Исходя из актуальности, были определены цель и задачи исследований.

Цели и задачи работы. Целью научных исследований явилось совершенствование жидкой минеральной питательной среды для выращивания стафилококков, изыскание новых детоксикаторов и полимеризаторов при изготовлении стафилококковой анатоксин-вакцины и повышения биоцидных и лечебных свойств тетрациклина и офлоксацина для профилактики и лечения коров, больных маститом.

Для достижения поставленной цели были определены и решены следующие задачи:

- усовершенствовать жидкую и плотную с 2,5 % агаром минеральную питательную среду для выращивания и способов выделения ¿.аигедо;

- разработать рациональную технологию получения стафилококковой анатоксин-вакцины;

- определить способы применения стафилококковой анатоксин-вакцины для профилактики и лечения коров, больных маститом;

- изучить биоцидные и лечебные свойства глутарового альдегида с алкилдиметилбензиламмония хлоридом отдельно и с тетрациклином и офлоксацином в отношении З.аигеиБ и коров, больных маститом.

Научная новизна исследований. Впервые повышено биоцидное и лечебное действие тетрациклина и офлоксацина в отношении лабораторных и свежевыделенных Б.аигеиз от коров, больных маститом.

Определена терапевтическая эффективность экспериментальных тетрациклина и офлоксацина при лечении коров, больных разными формами маститов. Повышение биоцидного действия антибиотиков достигнуто полимеризацией 0,2 % формальдегидом или 0,1 % глутарового альдегида с 0,1 % алкилдиметилбензиламмония хлоридом, а на вазелиновой основе эффективность лечения коров, больных маститом.

В последующем на основе биоцидных свойств глутарового альдегида с алкилдиметилбензиламмония хлоридом были изготовлены и успешно апробированы мази, гели без антибиотиков с учетом того, что глутаровый альдегид при биоразложении составляет более 90 % и обладает повышенными биоцидными свойствами.

Приоритет новизны научных исследований подтвержден получением патента №246078 от 27.11.2012 г., докладами на 3-х международных научно-практических конференциях (2012, 2013, 2014 гг.) и публикациями 6 статей в журнале «Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии», который рекомендован ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертации.

Теоретическая и практическая значимость работы. Определен мониторинг $.аигеи5 на чувствительность к антибиотикам, выделенных из молока и пораженных сосков вымени у коров, больных маститом, и лабораторных и свежевыделенных Б.аигеив в регионе с повышенным геомагнитным полем.

Установленная повышенная устойчивость $.аигеи5 к температуре, хлорамину и чувствительность к глутаровому альдегиду, алкилдиметилбензил-

аммония хлориду целесообразно учитывать при терапии больных животных и проведении ветеринарно-санитарных мероприятий.

На основе детоксицирующих и полимеризирующих свойств глутарового альдегида, формальдегида с алкилдиметилбензиламмония хлоридом изготовлены и апробированы в молочных комплексах и на ферме учхоза «Знаменское» «Курская ГСХА» ряд экспериментальных серий стафилококковой анатоксин-вакцины для профилактики и лечения коров, больных маститом. Установленная биоцидная эффективность стафилококковой анатоксин-вакцины явилась обоснованием использования ее лечебных свойств.

Использование биоцидных и полимеризирующих свойств глутарового альдегида отдельно и с четвертичным аммониевым соединением позволило повысить биоцидные и лечебные свойства антибиотиков на мазевой основе при лечении коров, больных маститом, а в последующем эффективной лекарственной формы без антибиотиков. Полученные результаты научных исследований создают перспективу в решении комплексной программы борьбы с маститом коров, увеличения сроков использования коров и получение доброкачественной молочной продукции и здоровых телят.

Методология и методы исследования. В ходе выполнения диссертации использовались клинический, эпизоотологический, бактериологический, биохимический и другие методы исследований.

Клинические признаки маститов у коров изучали путем наблюдения за больными животными непосредственно на фермах. Для диагностики коров, больных маститом, использовали клинические, лабораторные исследования с мастидином.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютера с процессором Intel Соге 2 Quad, пакета программного обеспечения Microsoft Office 2007 и Statistica 7.0 с применением корреляционного однофакторного дисперсионного анализа по качественным показателям.

Полученные цифровые результаты обрабатывали статистически граничные значения, которые определяли по показателю Стьюдента для 5 % и 1% уровня значимости в зависимости от числа степеней свободы.

Эффективность используемых концентраций дозы стафилококковой анатоксин-вакцины и экспериментальных антибиотиков определяли по следующим показателям: суммарная продолжительность лечения животных -80-100 % - высокоактивная доза, 40-80 % активная доза и менее 40 % слабоактивная доза, разница срока лечения и биоцидного действия производственных и экспериментальных тетрациклина и офлоксацина.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты разработки и апробации жидкой и плотной минеральной питательной среды для выделения и выращивания S.aureus;

2. Материалы изыскания рациональной технологии получения и применения стафилококковой анатоксин-вакцины;

3. Результаты терапевтической эффективности стафилококковой анатоксин-вакцины;

4. Биоцидные и лечебные свойства глутарового альдегида с алкилдиметилбензиламмония хлоридом отдельно и с тетрациклином или офлоксацином в отношении S.aureus и коров, больных маститом.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные положения диссертации были изложены на трех международных научно-практических конференциях (с публикацией материалов) и получили положительную оценку.

По материалам диссертации опубликовано 11 научных статей, из них 6 в журналах ВАК РФ, получен 1 патент на изобретение.

Материалы диссертации изложены на 116 страницах в компьютерном исполнении, включают общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы содержит 218 источников, в том числе 95 зарубежных авторов и приложения. Диссертация содержит 11 таблиц и 7 рисунков.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И. И. Иванова». Экспериментальные исследования проводили на базе учхоза «Знаменское», молочном комплексе «Надежда», Курской областной ветеринарной лаборатории.

Объектом исследований послужили лабораторные и свежевыделенные золотистые стафилококки - S.aureus выделенные от коров больных маститом, экспериментально зараженных морских свинок и мышей.

Пять штаммов S.aureus были выделены из пораженных сосков вымени коров учхоза «Знаменское» и из гнойных ран. Лабораторные штаммы S.aureus использовали из Курской областной ветеринарной лаборатории, Жуковской ветеринарной лаборатории Калужской области. Штаммы стафилококков выращивали и хранили на мясоглицериновом агаре (МГА), мясоглицериновом бульоне (МГБ), минеральном агаре и в жидкой синтетической питательной среде. При этом в МПБ и жидкой синтетической питательной среде штаммы S.aureus продуцировали золотистый пигмент, коагулировали кроличью плазму, через два часа давали положительную реакцию с кроличьей плазмой на стекле, обладали гемолитической активностью.

Лабораторные и свежевыделенные S.aureus изучали на устойчивость к амоксициллину, тетрациклину, эритромицину, энрофлоксацину, линкоспектину, к фенолу, формальдегиду.

Клинические признаки маститов у коров и диспепсии телят изучали путем наблюдения за больными животными непосредственно на фермах учхоза «Знаменское» и молочном комплексе «Надежда». Для диагностики коров, больных маститом, использовали клинические, лабораторные исследования с мастидином.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютера с процессором Intel Соге 2 Quad, пакета программного обеспечения Microsoft Office 2007 и Statistica 7.0 с применением корреляционного однофакторного дисперсионного анализа по качественным показателям.

В целом исследования проводили по следующим разделам, представленным на рисунке 1.

Рисунок 1 - Схема проведения исследований

Отдельные материалы и методы исследований изложены в семи разделах собственных исследований.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Результаты изыскания рационального состава синтетической питательной среды для выращивания стафилококков

В настоящее время биофабричное производство стафилококковой анатоксин-вакцины базируется на выращивании золотистого стафилококка на мясогидролизатном или казеиногидролизатном глицериновом бульоне в биобутылях с подачей углекислого газа и проведение детоксикации и полимеризации комплекса токсинов 0,5-0,7 % формальдегидом. Основными недостатками технологии является слабое накопление стафилококков при выращивании на мясогидролизатном бульоне до 3-4 млрд/мл и использование формальдегида и ртутьсодержащего консерванта, обладающие канцерогенными свойствами.

После многократных контрольных испытаний был определен оптимальный состав синтетической питательной среды, обеспечивающей максимальное накопление стафилококков и концентрацию экзо- и эндотоксинов. Оптимальный состав синтетической жидкой питательной среды, рост стафилококков в 2-х литровых биобутылях с объемом 1 литр, накопление стафилококков и концентрация комплекса токсинов представлено в таблицах 1 и 2.

Таблица 1 - Оптимальный состав жидкой синтетической питательной среды для выращивания стафилококков при получении анатоксин-вакцин

№ п/п Наименование компонентов Количество в граммах

1 Лимонная кислота 5

2 Фосфорнокислый калий 2-х замещенный 3

3 Фосфорнокислый натрий 2-х замещенный 3

4 Хлористый натрий 2

5 Сернокислый цинк 0,3

6 Сернокислый магний 1,0

7 Сернокислое железо 0,5

8 Глицерин 30 мл

9 Дистиллированная вода До 1 литра

Реакция среды устанавливается 5 % аммиака до 7,4-7,6 перед автоклавиро-ванием. Полученные результаты культивирования микроорганизмов представлены в таблице 2.

Из полученных данных следует, что максимальное накопление лабораторных и свежевыделенных З.аигеиБ при выращивании на жидкой синтетической среде составляет 9-11 млрд/мл, а концентрация экзо- и эндотоксинов после автоклавирования достигает 0,8 мг/мл. В то же время при выращивании З.аигеив на МПГБ концентрация биомассы и комплекса токсинов после автоклавирования составляет 3-4 млрд/мл и 0,4 мг/мл, соответственно, что практически более чем вдвое меньше показателей при использовании синтетической питательной среды.

Таблица 2 - Рост и накопление S.aureus

№ п/п Наименование микроорганизмов Сроки выращивания (суток) Синтетическая среда Мясопептонгидроли-затный глицериновый бульон

концентрация S.aureus, млрд/мл содержание экзо- и эндотоксина, мг/мл концентрация S.aureus, млрд/мл содержание экзо-и эндотоксина, мг/мл

1 Лабораторный штамм S.aureus 5 4-5 0.4 1-2 0,2

10 9-11 0,9 3-4 0,3

2 Свежевыделен-ный штамм S.aureus 5 4-5 0,4 1-2 0,2

10 9-11 0,9 3-4 0,3

С учетом нестабильного состава мясогидролизатнопептонного глицеринового бульона и низкой концентрации $.аигеи$ по сравнению с предложенной синтетической жидкой питательной средой были приготовлены плотные среды с 2,5 % агара для ускоренного выделения стафилококков. В сравнительном аспекте были изготовлены и апробированы два варианта плотной среды с 2,5 % агара при разведении минеральной среды 1:1 и 1:2 при выращивании $.аигеи$ в пробирках со скошенным агаром. После выращивания лабораторных и свежевыделенных Б.аигеиз был установлен ускоренный рост на плотной питательной среде при разведении жидкой синтетической среды в

соотношении 1:1. Состав плотной минеральной среды с 2,5 % агара представлен в таблице 3.

Таблица 3 - Состав плотной синтетической среды с 2,5 % агара для

выделения и поддержания стафилококков

№ п/п Наименование солевых компонентов Количество в граммах

1 Лимонная кислота 2.5

2 Фосфорнокислый калий 2-х замещенный 1.5

3 Фосфорнокислый натрий 2-х замещенный 1,5

4 Хлористый натрий 2

5 Сернокислый цинк 0.2

6 Сернокислый магний 0,5

7 Сернокислое железо 0,25

8 Агар 2,5

9 Глицерин 15 мл

10 Дистиллированная вода До 1 литра

Нейтрализацию питательной среды с 2,5 % агара проводили 5 % аммиаком до 7,4-7,5 перед автоклавированием. После посева 5.аигеи5 пастеровской петлей из суспензии бульонной культуры происходило полное покрытие поверхности агара в пробирках в течение 3-4 суток. Полученные результаты роста $.аигеи8 на плотной питательной среде были использованы для выделения чистой культуры стафилококков и определения чувствительности к антибиотикам.

3.2. Результаты получения и применения стафилококковой анатоксин-вакцины

Для лечения животных от стафилококкозов впервые Н. Олштейн в 1936 году получил и применил анатоксин. Подкожные введения и примочки пораженных участков кожи анатоксином ускоряли прекращение нагноения, сокращали продолжительность болезни и обеспечивали выздоровление.

Наличие в препарате анатоксинов и обезвреженных автоклавированием стафилококков не отражало истинную трактовку, название препарата -анатоксином. Правомерным является предложенное название анатоксин-вакцина.

Использование мясогидролизатного пептонного глицеринового бульона не обеспечивало максимального накопления стафилококков, а 0,5-0,7 % формальдегид не приводил к полной детоксикации токсинов и, следовательно, превращение их в полноценный анатоксин.

В последнее время установлено, что полноту детоксикации стафилококковых и стрептококковых токсинов обеспечивает этоний и другие четвертичные аммониевые соединения.

С учетом того, что многие альдегиды способны алкилировать аминосульфидрильные, карбоксильные группы белков и низкомолекулярные органические соединения возникло биотехнологическое обоснование повышения активности стафилококковой анатоксин-вакцины путем выращивания микроорганизмов на синтетических питательных средах и

подборы более эффективных, доступных и экологически безопасных детоксикаторов и полимеризаторов комплекса токсинов.

В основе получения стафилококковой анатоксин-вакцины использовали синтетическую жидкую питательную среду для выращивания стафилококков. В сравнительном аспекте использованы более эффективные детоксикаторы и полимеризаторы стафилококковых токсинов глутаровый альдегид с алкилдиметилбензиламмония хлоридом или формальдегидом. Обеспечение полной детоксикации и инактивации стафилококковых токсинов - аллергенов получено с помощью глутарового альдегида с этонием и глутаровым альдегидом с алкилдиметилбензиламмония хлоридом. В целом этоний и алкилдиметилбензиламмония хлорид являются четвертичными аммонийными соединениями и проявляют сходные биоцидные, дезинфицирующие и лечебные свойства.

Сравнительная оценка полноты детоксикации и инактивации стафилококковых токсино - аллергенов не выявила различий между эффективностью глутарового альдегида с этонием или глутарового альдегида с алкилдиметилбензиламмония хлоридом. В то же время при детоксикации стафилококковых токсино-аллергенов 0,3%; 0,5%; 0,7% и 1,0 % формальдегида установлена незавершенность полноты инактивации аллергенных и токсических свойств комплекса стафилококковых токсинов. Совместимость глутарового альдегида с алкилдиметилбензиламмония хлоридом, промышленный их выпуск, экологичность и экономическая доступность определили технологическую обоснованность изготовления стафилококковой анатоксин-вакцины.

Проведенные способы изготовления и применения определили технологическую схему получения стафилококковой анатоксин-вакцины, представленную на рисунке 2.

Рисунок 2 - Схема изготовления стафилококковой анатоксин-вакцины

Учитывая широкое распространение маститов кокковой этиологии было проведено испытание стафилококковой анатоксин-вакцины. С этой целью было отобрано 340 коров, больных катаральным и гнойно-катаральным маститом стафилококковой этиологии, которые были разделены на 2 группы по 170 животных.

В первую группу входили 170 коров, в молоке которых при бактериологическом исследовании было выделено две культуры S. aureus, Е. coli и S. epidermidis.

Для лечения коров, больных маститом, использовали стафилококковую анатоксин-вакцину, которую вводили ежедневно больным животным интрацистернально - по 5 мл в течение 2-3 дней. Через десять дней проводили исследование секретов вымени с мастидином и на бактериологическую обсемененность. После лечения коров, больных маститом, CAB реакция с мастидином сохранялась у 4 животных, в секрете вымени которых обнаружено культуры S aureus и Е. coli. Выздоровело 100 коров (80%).

Во вторую группу было включено 170 коров, которых лечили мастисаном в дозах согласно наставлению по его применению. Выздоровело 85 животных (50 %). Следует отметить, что мастисан в своем составе содержит антибиотики и сульфаниламиды (бензилпенициллин, стрептомецин, тетрациклин, сульфадимезин), которые длительное время - до 10-15 дней выделяются с молоком.

Перед лечением из секрета вымени коров выделены культуры S aureus, Е. coli и S. epidermidis. Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Лечебная эффективность стафилококковой анатоксин-вакцины и мастисана при катаральном и субклиническом мастите у коров

Группы животных Количество коров Препарат Выздоровело

1 170 Стафилококковая анатоксин-вакцина 155 коров (90%)

2 170 Мастисан-А в течение 4-5 суток 115 коров (67%)

Из данных, представленных в таблице 4, следует, что эффективность лечения коров, больных субклиническим и катаральным маститом, САВ составило 90 %, а мастисаном-А - 67%, т.е. на 23 % меньше.

Результаты лечения коров, больных гнойно-катаральным маститом, приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Сводные данные лечения коров, больных гнойно-катаральным маститом _

№ Кол-во Сроки Наличие S.aureus Выздо-

п/п коров Вид препарата лечения до после ровело

лечения лечения

1 30 Стафилококковая 2-3 S.aureus Не 28

анатоксин- суток у 30 коров выделены

вакцина

2 30 Мастисан-А 4-5 S.aureus Выделены 20

суток у 30 коров у 18 коров

Из данных, представленных в таблицах 4 и 5, следует, что наиболее эффективным при лечении коров, больных гнойно-катаральным маститом, является стафилококковая анатоксин-вакцина. Из-за наличия в препарате 0,3 % глутарового альдегида и 0,3 % алкилдиметилбензиламмония хлорида проявлялось биоцидное действие на микрофлору практически у всех коров, используемых в опыте.

Особую практическую ценность стафилококковая анатоксин-вакцина проявила при лечении коров, больных гнойно-катаральным маститом. Исследования проводили в молочном комплексе «Надежда» и учхозе «Знаменское».

В этих хозяйствах исследования коров на мастит проводят согласно ветеринарному законодательству через 1-1,5 месяца.

Изучено, что гнойно-катаральный мастит проявляется как осложнение катарального мастита, травмированием тканей канала соска и сосковой цистерны с поражением в 2-3-х долей вымени. При этом пораженная доля вымени не уменьшается после сдаивания из-за того, что молочные ходы заполнены густым экссудатом.

В исследовании использовано 180 коров с положительной пробой с 10 % раствором мастидина по образованию слабого или плотного сгустка. В пробах молока выявлены стафилококки, стрептококки, кишечная палочка, тетракокки. Для лечения перед отелом коров, больных маститом, использовали стафилококковую анатоксин-вакцину и мастисан-А. Сводные данные о мастите и секрете вымени коров, больных маститом, перед отелом представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Микрофлора секрета вымени коров, больных маститом перед отелом _

№ Количество Состояние Микрофлора

п/п коров вымени коров S. aureus Е. coli

1 180 Субклинический Выделены Выделены

и катаральный S.aureus Е. coli

мастит V всех коров у 40 коров

2 180 Гнойно- Выделены Выделены

катаральный S. aureus Е. coli

мастит у всех коров у 15 коров

Из данных, представленных в таблице 6, следует, что секрет вымени коров перед отелом содержал S. aureus и Е. coli у 360 коров, больных маститом.

После лечения коров мастисаном-А отмечено, что у 38 животных из секрета вымени изолировано 28 культур золотистого стафилококка. Лечебная эффективность составляла - 50 %, т.е. выздоровело 90 животных, а после интрацистернального введения в течение 2-3 суток выздоровело 150 коров (80%).

Таким образом, сравнивая лечебное действие стафилококковой анатоксин-вакцины и мастисана-А следует отметить неоспоримое преимущество при мастите стафилококковой анатоксин-вакцины, превосходящей на 30 % терапевтическую эффективность мастисана, содержащего антибиотики и сульфаниламиды.

Установленная экологическая безвредность, лечебная эффективность и преимущество стафилококковой анатоксин-вакцины при лечении коров,

больных маститом, целесообразно использовать испытанный препарат не только с лечебной, но и с профилактической целью.

Проблема мастита у коров связана с потерей молока, снижением его качественных показателей, состоянием здоровья новорожденных телят, т.к. молозиво является кроме основного источника питательных веществ, но еще и носителем защитных иммуноглобулинов, поступающих к новорожденному.

Изучено, что молодняк, выпаиваемый молоком от больных маститом коров, плохо развивается, заболевает диспепсией и погибает. Однако до сих пор не определена этиологическая связь между бактериальным маститом у коров и диспепсией новорожденных телят.

В связи с вышеизложенным возникла необходимость изучить этиологическую связь между маститом у коров стафилококковой этиологии и заболеваемостью диспепсией телят, полученных от этих коров.

Для исследования использовано 75 коров, которые распределены по 25 животных в каждой группе и, соответственно, количество, полученных телят. Коров, больных субклиническим и катаральным маститом, в первой группе лечили мастисаном-А, во второй группе стафилококковой анатоксин-вакциной, а третья группа 25 коров, больных маститом, оставлена в качестве контроля, т.е. без лечения.

У выделенных S.aureus и E.coli выявлена антибиотикочувствитель-ность с использованием стандартных дисков с антибиотиками. При этом установлена устойчивость к полимиксину, гентамицину, неомицину, канамицину, амоксициллину и энрофлоксацину. В связи с полученными результатами было предложено соответствующее лечение.

Результаты проведенных исследований дают основание считать, что молозиво от больных маститом коров отрицательно влияло на состояние желудочно-кишечного тракта новорожденных телят, способствовало развитию у них диарей, тогда как у коров, леченных стафилококковой анатоксин-вакциной, заболеваемость молодняка не проявлялась. По-видимому, решающее значение в развитии болезни у новорожденных телят имеют низкие иммунные показатели молозива от больных маститом коров и загрязненность S. aureus и Е. coli.

Заболевание характеризовалось частой дефекацией, жидким водянистым поносом, гнилостным запахом с примесью слизи. От всех заболевших телят до начала лечения были взяты пробы кала и направлены в лабораторию для бактериологического исследования. Во всех случаях были выделены патогенные S. aureus и Е. coli.

Успешная детоксикация и полимеризация стафилококковых экзо- и эндотоксинов глутаровым альдегидом с ал кил диметил бензил аммония хлорида и лечебная и биоцидная эффективность стафилококковой анатоксин-вакцины использовано, а для изучения биоцидной активности линкоспектина, тетрациклина, офлоксацина и получения вазелиновой мази для лечения коров, больных маститом.

3.3. Результаты повышения биоцидной эффестивности тетрациклина и офлоксацина при лечении коров, больных маститом

В настоящее время антибактериальные препараты разделены на природные и полусинтетические, синтезированные бактериями, грибами, растениями и синтетические, химические. В зависимости от источника получения различают

6 видов антибиотиков. Из 10000 различных антибиотиков в гуманной и ветеринарной медицине используют 150-200 препаратов, не считая дженериков и «кормовых» антибиотиков. В целом «кормовые» антибиотики в странах ЕС запрещены, а в США и ряде других стран 80% свиней, 50% индеек, цыплят и 10 % крупного рогатого скота выращиваются с применением антибиотиков. Обычно через 1-3 года после применения нового поколения антибиотика появляются устойчивые микроорганизмы, а «кормовые» антибиотики формируют полирезистентность.

Установлено, что более 80 % бактериальной устойчивости обеспечивают ферменты, разрушающие антибиотики.

В настоящее время преодоление бактериальной резистентности проводится с помощью сочетания разных групп, создание новых более сильных препаратов с клавулановой кислотой, полученной в 1976 году из продукта метаболизма гриба Streptomyces clavuligeris в Словении, не получило желаемого успеха.

Комплекс коммерческих химических антибиотиков из группы хинолонов, содержащие атом фтора в положении 6 цикла гетероциклической системы хинолона объединены общим названием фторхинолоны. Следует отметить, что 1 мг/л фтора способен вызвать ожоги слизистых кожи. Рекламированная зубная паста с фтором из-за противопоказаний изъята из производства, а для повышения биоцидного действия в состав фторхинолонов ввели трилон-Б, аргинин, колистин. Однако на фоне повышенной токсичности и дозы фторхинолоны не обеспечивают должного биоцидного и лечебного действия.

Впервые повышение ряда анатоксин-вакцин и антибиотиков, в том числе левомецитина, метронидазола, энрофлоксацина, офлоксацина, было достигнуто Ан.А. Евглевским и Д.А. Евглевским с помощью детоксикации и полимеризацией вначале 0,2-0,3 % формальдегида или 0,1-0,3 % глутарового альдегида с 0,2-0,5 % этония, а затем с 0,3 % алкилдиметилбензиламмония хлорида. Однако канцерогенные свойства формальдегида, бета - пропилактона и дефицитность этония вызвали необходимость изыскания новых детоксикаторов и полимеризаторов бактериальных токсинов и антибиотиков.

Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение обеспечения стабильной и полной детоксикации и полимеризации стафилококковых токсинов позволили испытать способ повышения биоцидного и лечебного действия антибиотиков.

Положительные результаты биоцидного и лечебного действия стафилококковой анатоксин-вакцины с помощью глутарового альдегида и алкилдиметилбензиламмония хлорида были использованы для повышения биоцидного действия офлоксацина и тетрациклина, снижения дозы антибиотиков и изготовления мази для лечения коров, больных маститом.

Исходя из результатов исследований был определен способ получения экспериментальных тетрациклина и офлоксацина с помощью 0,1 % глутарового альдегида и алкилдиметилбензиламмония хлорида вместо дефицитного этония. Технология изготовления препаратов представлена на рисунке 3.

Рисунок 3 - Способ изготовления экспериментальных тетрациклина и офлоксацина

Испытание экспериментальных тетрациклина и офлоксацина на безвредность.

Изучение токсичности экспериментальных антибиотиков проводили на 16 белых мышах путем подкожного введения ежедневно по 0,1 мл в течение 3-х суток.

Результаты исследований показали, что практически белые мыши на введение экспериментальных тетрациклина или офлоксацина с 0,1 % глутаровым альдегидом и 0,1 % ал килдиметил бензил аммония хлорида остались живы и на месте введения не было некротических поражений. В то же время 75 % белых мышей погибло на введение контрольных тетрациклина и офлоксацина с 0,2 % формальдегида и 0,1 % алкилдиметилбенз ил аммония хлорида.

3.4. Мониторинг чувствительности стафилококков к производственным и экспериментальным тетрациклину и офлоксацину

Определение чувствительности Б. аигеив проводили в отношении повышенной до 10000/мл микроорганизмов. Результаты изучения биоцидных свойств экспериментальных и производственных тетрациклина и офлоксацина представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Оценка биоцидного действия в мкг/мл экспериментальных и производственных тетрациклина и офлоксацина в отношении 1000/мл стафилококков__

№ п/п Наименование антибиотика 10000/мл S. aureus выделенных от коров, больных гнойно-катаральным маститом

1 Производственный тетрациклин 15-17 мкг/мл

2 Экспериментальный тетрациклин с 0,1 % ГА и 0,1 % АДБАХ 9-11 мкг/мл

3 Производственный офлоксацин 15-17 мкг/мл

4 Экспериментальный офлоксацин с 0,1 % ГА и 0,1 % АДБАХ 9-11 мкг/мл

5 Раствор 0.1 % ГА с 0.1 % АДБАХ 12-13 мкг/мл

где ГА - глутаровый альдегид и АДБАХ - алкилдиметилбензиламмония хлорид.

Из данных, представленных в таблице 7, следует, что экспериментальные тетрациклин и офлоксацин проявили бактерицидное действие на суспензию 10000 мл стафилококков в диапазоне 9-10 мкг/мл, а производственные проявили активность в' пределах 5-17 мкг/мл. Установленное повышенное биоцидное действие 0,1 % ГА с 0,1 % АДБАХ на Б.аигеш явилось основанием изготовления крем-эмульсии без антибиотиков. Исходя из полученных положительных результатов по повышению биоцидных свойств экспериментальных тетрациклина и офлоксацина был определен способ получения и испытания крем-эмульсии с тетрациклином, офлоксацином с 0,1 % глутаровым альдегидом и 0,1 % алкилдиметилбензиламмония хлорида. Способы изготовления крем-эмульсии представлены на рисунке 4.

Рисунок 4 - Способ изготовления мази с тетрациклином

С учетом высокой биоцидной эффективности глутарового альдегида превышающей в 2-3 раза формальдегид, и при биоразложении 90 % были изготовлены мази без антибиотиков. Полученные препараты были использованы для лечения коров, больных маститом.

Лечение коров, больных маститом, проводили путем дву- и трехкратного интрацистернального введения коровам после доения с помощью шприца 10 мл крема-эмульсии с экспериментальными антибиотиками в каждый сосок и смазывание кожи вымени в течение 2-3 суток обеспечивало полное прекращение истечения из сосков вымени и заживление трещин на поверхности сосков и вымени. В то же время двух-трехкратное интрацистернальное введение коровам после доения с помощью шприца 510 мл крема-эмульсии и смазывание кожи вымени производственным офлоксацином или тетрациклином обеспечивало прекращение истечений из сосков и заживление трещин на поверхности сосков и вымени через 5-6 суток, а у отдельных коров процесс лечения протекал до 9-11 суток. Сводные данные лечения коров, больных маститом, представлены в таблице 8.

Из представленных в таблице 8 результатов следует, что мази с экспериментальными тетрациклином и офлоксацином с 0,1% глутаровым альдегидом и 0,1 % алкилдиметилбензиламмония хлорида и мази без антибиотиков с 0,1% глутаровым альдегидом и 0,1 % алкилдиметилбензиламмония хлорида практически обладали равным терапевтическим действием при лечении коров, больных маститом. В то же время при равном

Таблица 8 - Результаты лечения коров, больных маститом

№ п/п Название препарата Кол-во коров, больных катаральным и гнойно-катаральным маститом Сроки лечения (сутки) Выздоровели

1 Тетрациклиновая мазь с ГА и АДБАХ 75 2-3 60

2 Офлоксациновая мазь с ГА и АДБАХ 75 2-3 60

3 Мазь с ГА и АДБАХ без антибиотиков 75 2-3 55

4 Мазь с тетрациклином без ГА и АДБАХ 45 6-7 30

где ГА - глутаровый альдегид;

АДБАХ - алкиддиметилбензиламмония хлорид.

терапевтическом эффекте мази при лечении коров, больных маститом, с 0,1% глутаровым альдегидом и 0,1 % алкилдиметилбензиламмония хлорида без антибиотиков обеспечивают выпуск молока без ограничения срока.

Из результатов исследований следует, что повышение биоцидного и лечебного действия крем - эмульсии, мази с тетрациклином и офлоксацином достигнуто детоксикацией и полимеризацией 0,15±0,05 % ГА с 0,15±0,05 % АДБАХ при 38-40 °С в течение 2-3 суток с последующим внесением в 80 мл расплавленного вазелина и 10 мл растительного масла.

Полученные результаты по изготовлению и применению мази с экспериментальным тетрациклином и офлоксацином обеспечивают устранение трещин сосков, шероховатость кожи вымени и сокращение срока лечения коров, больных маститом.

В отличие от существующих линиментов (limier - втирать) мазей, крема -эмульсии предложенные препараты с усовершенствованием антибиотиками путем полимеризации 0,1 % глутаровым альдегидом и 1 % АДБАХ в 2-3 раза повышают лечебную эффективность.

Полученные результаты исследований позволили разработать рациональный состав жидкой и плотной синтетической питательной среды для выращивания и выделения стафилококков при получении стафилококковой анатоксин-вакцины и способ и средства выделения чистой культуры. Проведенная полимеризация стафилококковых токсино-аллергенов с помощью 0,2-0,3 % глутарового альдегида с 0,2-0,3 % алкнлдиметилбензиламмония хлорида повысила биоцидные и лечебные свойства стафилококковой анатоксин-вакцины, антибиотиков и лекарственных средств в форме мази, крем-эмульсии без антибиотиков при лечении коров, больных маститом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных исследований сделаны следующие итоговые выводы:

1. Для выращивания стафилококков разработана синтетическая жидкая питательная среда, содержащая в 1 литре дистиллированной воды следующие солевые компоненты в граммах: лимонная кислота - 5; фосфорнокислый калий 2-х замещенный - 3; фосфорнокислый натрий 2-х замещенный - 3; хлористый натрий - 2; сернокислый цинк - 0,3; сернокислый магний - 1,0; сернокислое

железо - 0,5; глицерин - 30 мл. Реакция среды устанавливается 5 % аммиаком до 7,4-7,5 перед автоклавированием.

2. После 11-13-суточного выращивания в 2-х литровых бутылях с объемом среды равной 1 литру, концентрация стафилококков достигает 9-11 млрд/мл.

3. Детоксикация и полимеризация комплекса стафилококковых токсинов с автоклавированными стафилококками 0,2-0,3 % глутарового альдегида с 0,20,3 % алкилдиметилбензиламмония хлорида при 40°С в течение 2-3 суток обеспечивает получение стафилококковой анатоксин-вакцины, обладающей повышенным биоцидным действием к стафилококкам и эффективностью лечения коров, больных маститом.

4. Экспериментальная стафилококковая анатоксин-вакцина проявляет терапевтическую эффективность до 80 % при лечении коров, больных маститом, и позволяет использовать молоко без ограничений.

5. Стафилококковая анатоксин-вакцина обеспечивает выздоровление коров после 2-3 кратного введения, а при лечении коров мастисаном-А продолжительность лечения составила от 4 до 8 дней.

6. Полимеризация тетрациклина и офлоксацина 0,1 % глутаровым альдегидом с 0,2 % алкилдиметилбензиламмония хлорида при 40°С в течение 2-3 суток повышает биоцидные свойства в отношении 10000/мл стафилококков.

7. Мази, приготовленные с экспериментальными антибиотиками, и мази с 0,1 % глутаровым альдегидом и 0,3-1 % алкилдиметилбензиламмония хлорида без антибиотиков сокращают на 3-5 суток сроки лечения коров, больных маститом.

РЕКОМЕНДАЦИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ I

РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

1. Разработанную жидкую синтетическую питательную среду целесообразно использовать для выращивания стафилококков и получения стафилококковой анатоксин-вакцины, а плотную - с 2,5 % агара на основе синтетической питательной среды в разведении 1:1 или 1:2 для оперативного изучения чувствительности к антибиотикам.

2. Предложенный способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины позволяет лечить коров, больных маститом, без антибиотиков.

3. Предлагаем использовать полученную экспериментальную стафилококковую анатоксин-вакцину и модифицированные антибиотики с помощью 0,10,3 % глутарового альдегида и 0,2-0,3 % алкилдиметилбензиламмония хлорида и мази без антибиотиков для лечения коров, больных маститом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в российских рецензируемых научньгх журналах 1. Физиологические свойства стафилококков, сальмонелл и кишечной палочки, подвергнутых магнитному воздействию / Д.А. Евглевский, С.И. Худяков, А.Г. Беляев и др. // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - № 6. - С.74-75.

2. Евглевский, Д.А. Создание биологической аллергии к стафилококковому аллергену / Д.А. Евглевский, Б.М. Тагирмирзоев // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - №5. - С.74-75.

3. Евглевский, Д.А. Разработка и апробация средств и способов аллергической диагностики, специфической профилактики и терапии стафилококкозов у животных / Д.А. Евлевский, Б.М. Тагирмирзоев // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - №5. - С.75-76.

4. Евглевский, Д.А. Основы повышения эффективности стафило-стрептококковых биопрепаратов / ДА. Евглевский, A.B. Поздеев, Б.М. Тагирмирзоев // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. -2012. - №4. -С.60-61.

5. Биологические свойства стафилококков и повышение специфической и антибактериальной профилактики и терапии болезней животных / Д.А. Евглевский, H.H. Жеребилов, Б.М. Тагирмирзоев, Е.А. Стебловский // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. -№9. - С.70-71.

6. Евглевский, Ан.А. Биотехнологическое обоснование средств и способов профилактики и терапии коров, больных маститом / Ан.А. Евглевский, Б.М. Тагирмирзоев // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. -2015. -№1. -С.69-70.

Статьи в научных сборниках

1. Евглевский, Д.А. Получение и применение стафилококкового аллергена / Д.А. Евглевский, Б.М. Тагирмирзоев // Научное обеспечение агропромышленного производства (Материалы Международной научно-практической конференции, 25-27 января 2012 г., г. Курск, часть 3). - Курск: Изд-во Курск, гос. с.-х. ак„ 2012.-С.201-202.

2. Евглевский, Д.А, Эффективность стафилококковой анатоксин-вакцины и модифицированных полимеризацией антибиотиков при лечении коров, больных маститом / Д.А. Евглевский, A.B. Поздеев, Б.М. Тагирмирзоев // Научное обеспечение агропромышленного производства (Материалы Международной научно-практической конференции, 25-27 января 2012 г., г. Курск, часть 3). -Курск: Изд-во Курск, гос. с.-х. ак., 2012. - С.231-232.

3. Тагирмирзоев, Б.М. Совершенствование средств и способов профилактики и лечения коров, больных маститами / Б.М. Тагирмирзоев // Актуальные проблемы агропромышленного производства (Материалы Международной научно-практической конференции, 23-25 января 2013 г., г. Курск). - Курск: Изд-во Курск, гос. с.-х. ак., 2013. - С.202.

4. Тагирмирзоев, Б.М. Комплексный подход профилактики и лечения маститов у коров / Б.М. Тагирмирзоев // Научное обеспечение агропромышленного производства (Материалы Международной научно-практической конференции, 29-31 января 2014 г., г. Курск, часть 2). - Курск: Изд-во Курск, гос. с.-х. ак., 2014.-С.283.

Патент

1. Способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины / Евглевский Ан.Ал., Евглевский Д.А., Худяков С.И., Поздеев A.B., Тагирмирзоев Б.М. // № 2468078 от 23.06.2012 г.

Формат 60x84 1/16. Бумага для множительных аппаратов.

Печать на копировальном аппарате КГСХА. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №45.

5 1 83

2010017075