Поверхностные сериновые протеазы SCPB и CSPA в качестве кандидатов для создания вакцин против Streptococcus Agalactiae

Дуплик, Надежда Владленовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поверхностные сериновые протеазы SCPB и CSPA в качестве кандидатов для создания вакцин против Streptococcus Agalactiae
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Поверхностные сериновые протеазы SCPB и CSPA в качестве кандидатов для создания вакцин против Streptococcus Agalactiae"

11-4 1663

ДУПЛИК Надежда Владленовна

ПОВЕРХНОСТНЫЕ СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕАЗЫ SCPB И CSPA В КАЧЕСТВЕ КАНДИДАТОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ STREPTOCOCCUS AGALACT1AE

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 20II

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (НИИЭМ СЗО РАМН).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор СУВОРОВ Александр Николаевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

КОРОЛЮК Александр Михайлович,

Ведущее учреждение: Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России

Защита диссертации состоится "СРЦЯ<£ч_ЛГ 2011 г. в /? часов на заседании Диссертационного совета ДМ 001.022.01 в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ

доктор биологических наук МОКРОУСОВ Игорь Владиславович

СЗО РАМН.

Автореферат разослан ^_2011

г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук

Нежинская Г.И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Патогенные стрептококки относятся к наиболее распространенным возбудителям бактериальных инфекций человека. В последние десятилетия заболевания, вызываемые стрептококками серогруппы В (СГВ) или Streptococcus agalactiae, в большинстве стран мира рассматриваются в качестве важной социально-экономической и медицинской проблемы. Известно, что СГВ является естественным обитателем прямой кишки человека, способного вызывать инфекции уро-генитальной системы у женщин. Наряду с этим, СГВ может вызывать различные патологии беременности, в том числе выкидыши, внутриутробное поражение плода, преждевременные роды. СГВ могут вызывать серьезные инфекции у новорожденных, такие как сепсис, пневмония и менингит. Особо опасны инфекции, вызываемые СГВ у детей не старше десяти дней, протекающие в форме молниеносного сепсиса и приводящие к смертности в высоком проценте случаев.

Заболевания, вызываемые СГВ, как правило, лечат антибиотиками [Страчунский JI.C. 2002, Поляк М.С. 2003]. Препаратами выбора при лечении СГВ инфекций являются антибиотики бета-лактамного ряда (бензилпенициллин, ампициллин [Семина H.A. 2004], ампициллин в комбинации с сульбактамом [Бурбелло А.Т. 2003]); макролиды (эритромицин, кларитромицин, рокситромицин, азитромицин) и ванкомицин [Зуева Л.П. 2004].

В целях профилактики инфекций, вызванных СГВ, используют такие антибиотики, как бензатин бензилпенициллин, эритромицин и ампициллин с сульбактамом [Бурбелло А.Т. 2003].

Антибиотики, широко применяемые для профилактики и лечения, нередко оказываются неэффективными в силу увеличения числа антибиотикоустойчивых штаммов. Другим недостатком антибиотикотерапии является возникновение побочных эффектов для здоровья людей. К ним относятся аллергические реакции, негативное воздействие на центральную нервную и сердечно-сосудистую системы, и на некоторые внутренние органы человека. Кроме того, применение антибиотиков может приводить к нарушению микробиоценоза организма, что приводит к дисбиозам и, как следствие, к уменьшению устойчивости организма к другим инфекционным агентам, в первую очередь микоплазмам, хламидиям и грибам рода Candida.

В этой связи очевидна необходимость поиска новых средств и способов профилактики, в том числе специфической профилактики инфекций, вызываемых СГВ, посредством создания вакцинных препаратов.

В настоящее время большое число лабораторий мира работает над созданием вакцины против СГВ. Основными аргументами в пользу

целесообразности создания такой вакцины, помимо низкой эффективности антибиотиков или невозможности их применения для профилактики, является возможность четкого выделения основных контингентов лиц, подлежащих вакцинации. В первую очередь - это носительницы СГВ с осложненной первой беременностью, планирующие рождение второго ребенка, а также здоровые женщины - будущие матери, нуждающиеся в профилактике СГВ инфекций. Потенциально объектами для иммунизации могут рассматриваться лица пожилого возраста, учитывая высокий уровень СГВ заболеваний в этой возрастной группе.

Одним из новых направлений при создании вакцин является использование в качестве её компонентов рекомбинантных полипептидов, полученных на основе поверхностных белковых факторов патогенности СГВ. Выбор рекомбинантного полипептида или оптимальной комбинации полипептидов при создании вакцины должен определяться рядом условий, в число которых входят распространенность, консервативность, иммуногенность и протективность исходных поверхностных белков СГВ, на основе которых конструируются рекомбинантные полипептиды.

Среди поверхностных белковых факторов патогенности СГВ перспективными кандидатами для создания вакцины рассматриваются и сериновые протеазы. Последние способствуют выживанию СГВ в организме хозяина, так как они участвуют в расщеплении белков в качестве источников энергии или с целью подавления иммунных реакций организма. Важной особенностью некоторых сериновых протеаз является их способность расщеплять хемоаттрактанты. Так, например, С5а пептидаза, или БсрВ, специфически расщепляет С5а компонент комплемента человека, мобилизующий полиморфноядерные лейкоциты; а протеаза СБрА гидролизует ряд хемокинов СХС семейства, а именно ОКО-а!рЬа. СЯО-Ь^а, СЯО^атта, пептид, активирующий нейтрофилы ^АР-2), и гранулоцитарный хемотаксический белок 2 (ССР-2). С5а компонент комплемента и перечисленные хемокины обладают свойствами анафилотоксинов и стимулируют привлечение в очаг инфекции полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов, поэтому их инактивация способствует подавлению факторов врожденного иммунитета. Указанные свойства сериновых протеаз БсрВ и СврА указывают на их физиологическую значимость для СГВ.

В силу изложенного, получение иммуногенных и протективных рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы и протеазы СэрА позволит использовать их в качестве компонентов при создании вакцинного препарата против СГВ.

Все вышесказанное определило цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования - получение рекомбинантных полипептидов на основе сериновых протеаз S. agaluctiae С5а пептидазы и протеазы CspA для вакцинной профилактики заболеваний, вызываемых стрептококками группы В.

Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

1. Анализ вторичной структуры С5а пептидазы и протеазы CspA для выявления потенциально иммуногенных участков данных белков.

2. Изучение распространенности и консервативности гена cspA, кодирующего протеазу CspA, в штаммах СГВ.

3. Получение очищенных препаратов рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы и протеазы CspA.

4. Изучение иммуногенности рекомбинантных полипептидов и протективные свойств антител, полученных к рекомбинантным полипептидам, в опытах in vivo и in vitro.

5. Изучение вклада различных частей С5а пептидазы и протеазы CspA в индукцию гуморального иммунного ответа в организме человека.

6. Исследование токсичности рекомбинантных полипептидов в опытах in vivo.

Научная новизна работы.

1. Впервые продемонстрирована распространенность гена cspA, кодирующего сериновую протеазу CspA среди штаммов СГВ различных серотипов. Доказана консервативность участков гена cspA, кодирующих N-терминальную и С-терминальную части протеазы CspA.

2. Просеквенированные фрагменты гена cspA десяти штаммов СГВ различных серотипов депонированы в банк данных GenBank NCBI и им присвоены следующие номера: HQ849568, HQ849569, HQ849570, HQ849571, HQ849572, HQ849573, HQ849574, HQ849575, HQ849576 и HQ849577.

3. Впервые изучен вклад различных участков С5а пептидазы и протеазы CspA в формирование протективного иммунитета к стрептококку группы В и показано, что наличие во вторичной структуре полипептида а-спиральных структур способствует повышению иммуногенности и протективности.

4. Впервые проклонированы определенные фрагменты генов, кодирующие различные участки на С5а пептидазе и протеазе CspA, и получены соответствующие им рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа, Pb4a, Csp2 и Csp3.

5. Впервые продемонстрировано, что полипептиды малых размеров (73 + 85 аминокислотных остатков) на основе С5а пептидазы и протеазы CspA способны индуцировать синтез специфических антител с протективными свойствами не только против 5. agalactiae, но и против S. pyogenes.

Теоретическая значимость работы.

Продемонстрирована распространенность гена cspA, кодирующего поверхностную сериновую гтротеазу CspA, как в референс-штаммах, так и в клинических изолятах СГВ различных серотипов. Доказана консервативность фрагментов гена cspA, кодирующих N-терминальную и С-терминальную части протеазы CspA, в штаммах СГВ различных серотипов. Изучен вклад различных частей С5а пептидазы и протеазы CspA в формировании гуморального иммунного ответа к СГВ. Показано, что индукция синтеза специфических и протективных антител зависит от процентного содержания а-спиральных структур в молекуле белка.

Практическая значимость работы.

Созданы штаммы-продуценты Е. coli рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы (Pbla, РЬЗа и РЬ4а) и протеазы CspA (Csp2 и Csp3). Доказано, что высокоочищенные рекомбинантные полипептиды Pbla, РЬЗа и Csp3 обладают иммуногенностью и способностью формировать образование протективных антител к СГВ. Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3 рассматриваются как перспективные компоненты вакцины против СГВ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ген cspA, кодирующий протеазу CspA, присутствует во всех референс-штаммах и клинических изолятах СГВ; степень гомологии фрагментов гена cspA (csp2 и csp3) в различных штаммах - 98^100%.

2. Проклонированы фрагменты гена С5а пептидазы и протеазы CspA, которые кодируют рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа, Pb4a, Csp2 и Csp3.

3. Участки С5а пептидазы на N-терминальном конце с 96 по 169 аминокислотный остаток и в центральной области с 496 по 570 аминокислотный остаток, а также участок с 1247 по 1332 аминокислотный остаток на С-терминальном конце протеазы CspA, содержат детерминанты, отвечающие за индукцию специфических антител, эффективно опсонизирующих СГВ.

4. Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3, содержащие высокий процент a-спиральных структур, обладают высокой иммуногенностью, а антитела, полученные к ним, проявляют протективную и опсонизирующую активность in vitro и in vivo.

5. Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3 на основе С5а пептидазы и протеазы CspA, соответственно, могут быть рекомендованы для дальнейшего использования при создании вакцин против СГВ.

Личный вклад автора в проведенное исследование.

Личный вклад автора заключался в самостоятельном формулировании задач работы, проведении микробиологических, молекулярно-генетических, биохимических, иммунологических исследований, а также в статистической обработке и анализе полученных данных, обобщении и интерпретации результатов.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе один патент и четыре статьи в изданиях, рекомендованных ВАК России. Материалы исследований были представлены на нескольких отечественных и международных научных конференциях и симпозиумах (на Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», г. Санкт-Петербург, Россия, 2007; 11-ой Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», г. Пущино, Россия, 2007; «XVII международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям им. Ленсфильд», г. Порто Хели, Греция, 2008; 3-м Конгрессе европейских микробиологов, г. Гетерборг, Швеция, 2009; III Международном молодежном медицинском Конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2009», г. Санкт-Петербург, Россия, 2009; 20-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям «20th ECCM1D», г. Вена, Австрия, 2010; на конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», г. Санкт-Петербург, Россия, 2010).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 153 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, общее заключение, выводы, список литературы. Работа проиллюстрирована 28 рисунками и 16 таблицами. Список литературы включает 179 источников, из них 12 отечественных и 167 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали штаммы Streptococcus agalactiae различных серотипов, референс штамм Streptococcus pyogenes Ml серотипа SF370 и штамм Escherichia coli Ml5 из микробиологической коллекции Национального центра ВОЗ по изучению стрептококков и стрептококковых заболеваний (Санкт-Петербург, Россия). Для культивирования стрептококков использовали среду

THB (Todd Hewitt Broth, Difco, США). Для культивирования E. coli использовали среду BHI (Brain Heart Infusion Broth, Gibco, США) с добавлением канамицина до конечной концентрации 25 мкг/мл. В ходе получения рекомбинантных полипептидов трансформанты Е. coli выращивали на среде Terrific Broth с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и канамицина (25 мкг/мл).

Для выделения хромосомной ДНК клетки лизировали добавлением лизоцима в концентрации 1 мг/мл, ЭДТА до концентрации 10 мМ, SDS до конечной концентрации 1% и РНК-зы до концентрации 20 мкг/мл. Депротеинизацию ДНК выполняли с помощью протеиназы К (0,5 мг/мл). Окончательную очистку ДНК от белков, углеводов и липидов осуществляли обработкой фенолом, смесью фенола с хлороформом (1:1) и хлороформом, а затем экстрагировали этанолом.

Выделение плазмидной ДНК осуществляли с использованием коммерческого набора "QlAprep Spin Miniprep Kit" (Qiagen, США) согласно прилагаемой инструкции.

Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в горизонтальном аппарате «Hoefer НЕ 33» (Pharmacia, Швеция). Для расчета молекулярных масс исследуемых фрагментов ДНК использовали ДНК-маркер 100 п.н. (Сибэнзим, Россия).

Выделение ДНК из агарозного геля осуществляли с использованием коммерческого набора "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen, США) согласно прилагаемой инструкции.

Полимеразную цепную реакцию проводили на термоциклере с активным регулированием «Терцик» (ДНК-Технология, Россия).

Секвенирование проводили на секвенаторе Beckman CEQ 2000 (Beckman Coulter, США) согласно протоколу фирмы.

Рестрикцию ПЦР-продуктов проводили эндонуклеазами фирмы Fermentas (США) согласно протоколу фирмы.

Лигирование фрагмента ДНК и ДНК-плазмиды pQE проводили с использованием лигазы, выделенной из фага Т4 (Медиген, Россия), согласно протоколу фирмы.

Трансформацию клеток Е. coli Ml 5 проводили по Darget (1979).

Выделение рекомбинантных полипептидов из культуры штамма-продуцента Е. coli Ml 5 проводили трехкратным разрушением клеток ультразвуком по 20 секунд (с перерывом в 40 сек) в ультразвуковом дезинтеграторе (УЗДН-1У4.2, Россия). Лизат клеток центрифугировали при 13400 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость пропускали через 0,2 мкм фильтры (Millipore, США). Очистку рекомбинантных полипептидов осуществляли методом аффинной хроматографии на колонке с Ni-сефарозой (Amersham, США), согласно протоколу фирмы.

SDS-электрофорез полипептидов проводили в 14% полиакриламидном геле (PAGE) в вертикальном пластинчатом аппарате Mini-PROTEAN 11 (BioRad, США). Молекулярную массу (М.М.) рекомбинантных полипептидов оценивали в SDS-PAGE, сравнивая их подвижность с подвижностью белков с известными молекулярными массами (М.М. = 10 + 250 кДа, «Précision Plus Protein Standards», Bio-Rad, США) на одной и той же пластинке геля. Количественное определение белка в растворах проводили по методу Лоури (1982).

Гуморальный иммунный ответ к рекомбинантным полипептидам изучали на беспородных белых мышах (самцах массой 16. + 18 г) и кроликах, полученных из питомника «Рапполово», РАМН. Иммунизацию проводили двукратно и подкожно с гидроокисью алюминия в качестве адъюванта (Pierce, США). В эксперименте использовали по тридцать мышей и по три кролика, которым вводили по 0,2 мл и по 0,5 мл каждого полипептида с адъювантом в соотношении объемов 1:1, соответственно. Для мышей конечная концентрация полипептида при 1-ой инъекции составляла 100 мкг/мл и при второй инъекции -50 мкг/мл; инъекции проводили на 1-й и 20-й дни, соответственно. Для кроликов в 1-ой инъекции конечная концентрация полипептида была 240 мкг/мл и 120 мкг/мл во второй инъекции, которые делали на 0 и 22 дни, соответственно. Наличие сывороточных специфических IgG антител к полипептидам определяли, используя пул сывороток от 3-х животных методом иммуноферментного анализа, как описано у Меринговой (1986). Для детекции IgG антител использовали белок А стафилококка, ковалентно связанный с пероксидазой хрена, в концентрации 10" моль/л.

Для визуализации реакции использовали о-фенилендиамин в концентрации 0,5 мкг/мл в 150 мМ фосфатно-цитратном буфере (рН = 5,0) с добавлением 30% перекиси водорода. Реакцию регистрировали при длине волны 492 нм с помощью прибора Anthos 2010 (Anthos, Австрия).

Опсонизирующую активность антител к полипептидам изучали на суточном монослое мышиных перитонеальных макрофагов, как описано у Грабовской (2007). Стрептококковую суспензию в концентрации 1*107 КОЕ/мл после предварительной инкубации (при 37°С, 30 мин, 5% С02) с сыворотками (в разведении 1:50) добавляли к макрофагам (при 37°С, 30 мин, 5% С02). При микроскопии окрашенного монослоя макрофагов исследовали не менее 100 макрофагов в каждой из трех параллельных пробах. Статистическую обработку результатов проводили по методу Стьюдента-Фишера.

Исследование протективных свойств антител к полипептидам проводили в опытах генерализованной СГВ инфекции мышей. Мышам предварительно подкожно вводили физиологический раствор (рН = 7,4 (PBS)) или исследуемый полипептид (контрольная и опытные группы, соответственно) по схеме иммунизации, как описано выше. В эксперименте использовали по 30 мышей (самцов массой 16 -М 8 г) в контрольной и опытных группах. Всем группам

мышей внутрибрюшинно вводили СГВ штамм 5/70 lac серотипа в дозе LD50 = 5,0х 10 КОЕ/мл. Оценку протективности мышиных антител к полипептидам проводили путем определения количества СГВ в селезенке на разных сроках развития инфекции (по 3 мыши на каждый срок), высевая на чашки с кровяным агаром серию десятикратных разведений каждого гомогената селезенки, как описано у Грабовской (2007).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Компьютерный анализ первичной и вторичной структур С5а пептидазы и

протеазы CspA

Начальным этапом создания рекомбинантных полипептидов стал анализ аминокислотных последовательностей белков С5а пептидазы и протеазы CspA СГВ штамма 78-471 серотипа II с использованием данных «GenBank NCBI» и программ «ExPASy». При выборе фрагментов на аминокислотных последовательностях белков учитывали следующие критерии: положение фрагментов на аминокислотной последовательности, отсутствие активного центра белка, а-спиральность фрагмента и наличие гипотетических антигенных детерминант.

Проведенный компьютерный анализ первичной и вторичной аминокислотных структур позволил выбрать три фрагмента на аминокислотной последовательности С5а пептидазы и два фрагмента на аминокислотной последовательности протеазы CspA с целью получения рекомбинантных полипептидов, содержащих эти участки. Выбранные фрагменты белков содержали различный процент а-спиральных структур. На N-терминальном конце ScpB выбран фрагмент РЫа, содержащий 28% а-спиральных структур; в центральной области молекулы выбран фрагмент РЬЗа с содержанием а-спиральных структур - 41%; на С-терминальном участке, непосредственно прилегающем к клеточной стенке, выбран фрагмент РЬ4а с содержанием си-спиральных структур - 19%. На С-терминальном конце молекулы протеазы CspA выбран фрагмент Csp3, содержащий 69% а-спиральных структур. Для сравнительного исследования влияния а-спиральных структур на иммуногенность и протективность полипептида выбрали второй фрагмент Csp2 с меньшим содержанием а-спиральных структур (17%), но большего размера, что гарантировало содержание одной и более антигенных детерминант. С целью изучения антигенных свойств протеазы CspA фрагмент Csp2 выбран так, чтобы ему соответствовала большая часть N-терминального конца молекулы.

Анализ штаммов стрептококков группы В на присутствие гена cspA

Для исследования распространенности гена cspA была изучена коллекция, состоящая из 85 штаммов СГВ различных серотипов. Были исследованы референс штаммы из Чехии (10 штаммов) и клинические изоляты из России (20 штаммов), Китая (33 штамма), Швеции (10 штаммов) и США (12 штаммов).

Все штаммы СГВ, составившие коллекцию, анализировали на присутствие в их хромосомной ДНК гена cspA с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

943п.н

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Рисунок 1. Электрофорез продуктов ПЦР, полученных в результате амплификации ДНК. выделенной из различных штаммов СГВ.

1 - ДНК-маркер (100+1000 п.н. + 1500 п.н.);

2-19 - продукт ПЦР ДНК. выделенной из различных штаммов;

20 — отрицательный контроль.

Проведенный анализ показал образование ПЦР-продукта (943 п.н.) во всех исследованнных образцах. Эти эксперименты доказали, что ген cspA присутствует во всех исследованных штаммах СГВ (Рис. 1). Наличие гена cspA во всех исследованных образцах ДНК СГВ свидетельствало о том, что данный ген широко распространен среди штаммов СГВ различных серотипов. Распространенность данного гена среди штаммов СГВ указывает на высокую вероятность того, что вакцина, включающая протеазу CspA, кодируемую геном cspA, будет вызывать образование антител, распознающих эпитопы на молекуле протеазы CspA всех серотипов СГВ. Следовательно, продемонстрированная распространенность гена cspA, кодирующего поверхностную сериновую протеазу CspA СГВ, доказывает целесообразность получения рекомбинантных полипептидов на основе этой протеазы, с целью их использования в качестве компонентов вакцины против СГВ.

Изучение гомологии фрагментов гена cspA: csp2 и csp3 среди СГВ различных серотипов

Для изучения гомологии фрагментов csp2 и csp3 провели секвенирование этих фрагментов, полученных на матрицах ДНК, выделенных из десяти штаммов СГВ с последующим сравнительным анализом полученных

нуклеотидных последовательностей с помощью пакета компьютерных программ «BLAST».

В результате секвенирования фрагментов csp2 и csp3 десяти штаммов СГВ: 090R (серотипа 1а), 1/82 (IV), 1/92 (VIII), 2/86 (VI), 4/89 (VII), 8/66 (1а), 10/84 (V), 13/63 (III), 59/59 (lab) и 60/59 (II) получены нуклеотидные последовательности, соответствующие данным фрагментам. Полученные нуклеотидные последовательности фрагментов гена cspA были депонированы в банк данных GenBank NCBI и им присвоены следующие номера: HQ849568, HQ849569, HQ849570, HQ849571, HQ849572, HQ849573, HQ849574, HQ849575, HQ849576 и HQ849577.

Нуклеотидные последовательности фрагментов csp2 и csp3 из исследуемых штаммов СГВ различных серотипов сравнивали между собой и с полногеномными последовательностями трех штаммов СГВ, имеющихся в базе данных «GenBank NCBI». Проведенный сравнительный анализ фрагментов csp2 и csp3 показал высокую степень гомологии (98-100%) этих фрагментов в штаммах СГВ различных серотипов, что доказывает консервативность исследуемых фрагментов. Полученный результат позволяет рассматривать рекомбинантные полипептиды Csp2 и Csp3, кодируемые фрагментами csp2 и csp3. перспективными для использования в качестве компонентов вакцины против СГВ.

Получение рекомбинантных полипептидов РЫ а, РЬЗа, Pb4a, Csp2 и Csp3

Для получения рекомбинантных полипептидов, соответствующих выбранным фрагментам на аминокислотных последовательностях полноразмерных белков С5а пептидазы и протеазы CspA, провели клонирование рЫа, рЬЗа, pb4a, csp2 и csp3 в систему экспрессионных векторов pQE. С помощью полимеразной цепной реакции получили необходимые фрагменты: рЫа (251 п.н.), рЬЗа (196 п.н.), рЬ4а (255 п.н.), csp2 (1524 п.н.) и csp3 (260 п.н.). Фрагменты рЫа, рЬЗа, pb4ci, csp2 и csp3 были встроены в экспрессионный вектор pQE с последующей трансформацией в Е. coli Ml5. Рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа, Pb4a, Csp2 и Csp3 выделили и очистили с помощью аффинной хроматографии на Ni-сефарозе. Таким образом, получили пять хроматографически очищенных рекомбинантных полипептидов и создали штаммы-продуценты этих полипептидов, три полипептида на основе С5а пептидазы с приблизительно одинаковой молекулярной массой: РЫа (12 кДа), РЬЗа (II кДа) и РЬ4а (18 кДа), но разным процентным содержанием а-спиралей и два полипептида - на основе протеазы CspA: Csp2 (44 кДа) и Csp3 (12 кДа) (Рис. 2). Необходимо подчеркнуть, что молекулярная масса Csp3 в 3.5 раза меньше Csp2, а процентное содержание a-спиралей в 4 раза больше в Csp3 по сравнению с Csp2.

8 кДа

12 кДа

11 кДа

75 кДа

Б)

Рисунок 2. 14% 808-РЛСЕ очищенных рекомбинантных полипептидов: А) РЫа, РЬЗа. РЬ4а: Б) Сяр2, СврЗ.

1 — маркер М.М.;

2 - препарат РЫа (А) и препарат Свр2 (Б):

3 - препарат РЬЗа (А) и препарат СврЗ (Б):

4 - препарат РЬ4а.

Изучение индукции специфических антител в крови лабораторных животных на введение рекомбинантных полнпептидов РЫа, РЬЗа, РЬ4а,

Свр2 и СэрЗ

Для оценки иммуногенности рекомбинантных полипептидов РЫа, РЬЗа, РЬ4а, Сзр2 и СБрЗ провели иммунизацию лабораторных животных (мышей и кроликов) каждым полипептидом в отдельности с гидроокисью алюминия в качестве адъюванта.

Результаты иммунизации показали наличие выраженного гуморального иммунного ответа на введение рекомбинантных полипептидов РЫа и РЬЗа. Наличие антител выявляли уже после первичного введения РЫ и РЬЗа. Повторное введение полипептидов резко усиливало выработку специфических антител. Полипептид РЬЗа характеризовался более высокой иммуногенностью по сравнению с РЫа как при нарастании титра, так и при достижении максимальных значений. Полипептид РЬ4а не проявил иммуногенной активности (максимальное значение титра мышиных анти-РЬ4а антител -1:200). Максимальные значения титров мышиных антител к полипептидам РЫа (1:12,8х 10Э) и РЬЗа (1:25,6x103) наблюдали на 40 день от начала иммунизации. По мере снижения титра антител после иммунизации лабораторных мышей отмечалась более длительная циркуляция анти-РЬЗа антител по сравнению с

анти-РЫ а антителами, что также подтверждает более высокую иммуногенность РЬЗа. При подкожной иммунизации кроликов рекомбинантный полипептид РЬЗа вызывал более быстрое нарастание титра антител с максимумом на 63 день (1:1,6x105) по сравнению с РЫа (шах = 1:0,4x105).

Результаты эксперимента по иммунизации лабораторных животных позволили сделать вывод, что антигенные детерминанты, отвечающие за развитие гуморального иммунного ответа, располагаются преимущественно в центральной и М-терминальной частях молекулы С5а пептидазы.

Результаты иммунизации лабораторных мышей рекомбинантными полипептидами на основе протеазы СэрА показали наличие выраженного гуморального иммунного ответа на введение обоих полипептидов Свр2 и СзрЗ. Максимальное значение титра мышиных анти-Сзр2 антител (1:12,8x103) на 40 день от начала иммунизации было сопоставимо с максимумом титра анти-СзрЗ антител (1:12,8x103). Тем не менее, отмечалось более медленное снижение титра мышиных анти-СБрЗ антител по сравнению с анти-Сзр2 антителами.

При иммунизации лабораторных кроликов титры антител к обоим полипептидам были достаточно близкими, а именно 1:1,0x105 для Сэр2 и 1:0,8х105 для СврЗ, что свидетельствует об одинаковой иммуногенной активности этих полипептидов.

Анализ результатов исследований по иммунизации лабораторных животных полипептидами СБр2 и СБрЗ, позволил утверждать, что Ы-терминальная и С-терминальная части СэрА протеазы содержат детерминанты, ответственные за индукцию гуморального иммунного ответа. Одинаковая иммуногенность СврЗ с Сзр2 может быть связана с его а-спиральной структурой. Так, СэрЗ содержит 69% а-спиралей при молекулярной массе 12 кДа, а Свр2 с молекулярной массой 42 кДа содержит 17% а-спиралей.

В ходе экспериментов по иммунизации лабораторных животных была продемонстрирована одинаковая иммуногенность полипептидов СБр2 и СврЗ; самым иммуногенным оказался полипептид РЬЗа, полипептид РЬ4а оказался не иммуногенным. Таким образом, в представленной диссертационной работе показано, что процентное содержание а-спиральных структур в молекуле полипептида, использованного для вакцинации, существенно влияет на уровень выработки специфических иммуноглобулинов. Более того, впервые изучены иммуногенные свойства различных участков С5а пептидазы и протеазы СБрА.

Определение специфических антител к рекомбинантным полипептидам РЫа, РЬЗа, РЬ4а, Свр2 и СврЗ в сыворотках от женщин-носительниц СГВ

Для получения дополнительных доказательств участия поверхностных белков СГВ С5а пептидазы и протеазы СзрА в развитии патологического процесса были исследованы сыворотки от женщин-носительниц СГВ на

наличие специфических антител к рекомбинантным полипептидам РЫа, РЬЗа, РЬ4а, и Сзр2, СэрЗ (Рис. 3). Сыворотки были любезно предоставлены из НИИ акушерства и гинекологии имени Д.О. Отта СЗО РАМН (г. Санкт-Петербург).

*анти-РЫа ■ анти-РЬЗа » анти-РЬ4а * анти-Сэр2 ж анти-СэрЗ

25 -

* 20 Н

о 15

е- ю

♦♦wn WM»» ■■■■■■■■

*«v *

"Iff

анти-РЫа анти-РЬЗа анти-РЬ4а aHTH-Csp2 анти-СэрЗ

Рисунок 3. Титр специфических антител в сыворотках от женщин-носительниц СГВ к рекомбинантным полипептидам РЫа, РЬЗа. РЬ4а, Csp2 и Csp3 (Др<0,05).

Результаты тестирования показали, что в большинстве сывороток женщин-носительниц СГВ были обнаружены антитела к РЫа, РЬЗа, Csp2 и Csp3, кроме РЬ4а (Рис. 3). Такой результат можно объяснить тем, что область на аминокислотной последовательности полноразмерной С5а пептидазы, гомологичная РЬ4а, располагается рядом с клеточной стенкой бактерии. В результате при формировании гуморального иммунного ответа на СГВ синтеза специфических антител к данной области поверхностной сериновой протеазы ScpB практически не происходит или же синтезируемые антитела просто не могут связаться с этой труднодоступной областью.

Таким образом, было продемонстрировано, что в организме человека в ходе формирования гуморального иммунного ответа на СГВ инфекцию индуцируются специфические антитела к различным участкам молекул С5а пептидазы и протеазы CspA.

Так как рекомбинантный полипептид РЬ4а оказался не иммуногенным, то дальнейшие исследования с ним не проводились.

Изучение опсонизирующей активности мышиных анти-РЫа, анти-РЬЗа, aHTH-Csp2 и aiiTH-Csp3 антител in vitro

Опсонизирующую активность антител, стимулированных введением рекомбинантных полипептидов, изучали на монослое мышиных макрофагов, преинкубированных в присутствии суспензии стрептококков, заранее обработанных контрольными и опытными иммунными (от ранее

проиммунизированных лабораторных животных) сыворотками. В качестве контроля использовали сыворотку неиммунизированных животных той же линии. Подсчитывали процентную долю макрофагов, с захваченными стрептококками, и среднее число кокков на одну клетку. Степень опсонизации оценивали по фагоцитарному индексу, который представляет собой произведение обоих показателей.

□ анти-Сэрг □анти-СэрЗ □анти-РЬ1а Оанти-РЬЗа

Рисунок 4. Кратность увеличения фагоцитарного индекса при обработке стрептококков сыворотками, полученными после иммунизации мышей рекомбинантными полипептидами (Др<0,05).

Кратность увеличения фагоцитарного индекса при обработке стрептококков иммунной мышиной сывороткой по сравнению с фагоцитарным индексом при обработке стрептококков нормальной сывороткой свидетельствовала о опсонизирующей активности антител, полученных к рекомбинантным полипептидам (Рис. 4). Исследование, проведенное с различными серотипами СГВ и одним из М серотипов СГА показали, что наибольшей опсонизирующей активностью обладают антитела к полипептидам РЫа, РЬЗа и СврЗ (Рис. 4). Антитела к полпептиду СБр2 достоверно опсонизировали только стрептококки группы В серотипа IV и стрептококки группы А.

Изучение протективных свойств анти-РЫа, анти-РЬЗа, анти-С$р2 и анги-СэрЗ антител на мышах, инфицированных СГВ

Протективную активность антител, полученных после иммунизации рекомбинантными полипептидами РЫа, РЬЗа, Свр2 и СврЗ, также изучили на мышиной модели генерализованной инфекции. Лабораторных мышей предварительно иммунизировали подкожно одним из исследуемых рекомбинантных полипептидов (опытные группы). Контрольной группе

животных подкожно вводили PBS с гидроокисью алюминия в качестве адъюванта. На сроке максимальной выработки специфических антител мышам внутрибрюшинно вводили сублетальную дозу СГВ (штамм 5/70 серотипа lac, LD50= 7,1 х 107 КОЕ/мл) для индукции генерализованной инфекции. Динамику развития инфекции, вызванной СГВ, определяли на разных сроках от начала заражения путем высева стрептококков из гомогенатов селезенок на среду с кровяным агаром (Рис. 5).

Контроль РЫа —*г-РЬЗа ......Csp2 .....**.....Csp3

Рисунок 5. Динамика развития инфекции, вызванной СГВ lac серотипа (5/70), в селезенках мышей, предварительно иммунизированных рекомбинантными полипептидами РЫа. РЬЗа, Csp2 и Csp3 (Др<0,05).

Результаты, полученные в ходе экспериментов по исследованию протективной активности антител in vivo, свидетельствовали о том, что циркулирующие в организме мышей анти-РЫа, анти-РЬЗа и aHTH-Csp3 антитела эффективно вовлекаются в процесс элиминации стрептококков из макроорганизма при развитии генерализованной инфекции. Эксперименты in vivo полностью подтвердили результаты опсонофагоцитарного теста, в котором протективная активность анти-РЫа, анти-РЬЗа и анти-СврЗ антител была доказана на примере усиления фагоцитирующей способности макрофагов. Антитела, синтезируемые в организме лабораторных мышей при введении рекомбинантного полипептида Csp2, не обладали протективной активностью, что было подтверждено в экспериментах in vivo и in vitro. Таким образом, среди антител, синтезируемых ко всем полипептидам, только антитела к рекомбинантному полипептиду Csp2, содержащему наименьшее количество а-спиралей (17%), не оказались протективными. Полученные данные свидетельствуют о влиянии вторичной структуры полипептида на протективные свойства синтезируемых антител.

Исследование токсичности рекомбинантных полипептидов РЬЗа и Csp3

Среди требований, предъявляемых к компонентам вакцин, безопасность вводимого препарата занимает одно из основных мест. Поэтому, необходимо было изучить токсичность рекомбинантных полипептидов РЬЗа и Csp3.

Для исследования токсичности полученных полипептидов двум группам мышей внутрибрюшинно вводили десятикратные дозы (по сравнению с профилактической дозой) РЬЗа и Csp3. Контрольной группе мышей вводили PBS. Массу тела, а также ряд показателей, характеризующих жизненную активность мышей, определяли в течение 14 дней. После введения полипептидов наблюдалось постоянное и равномерное нарастание веса животных и не отмечались какие-либо отклонения по сравнению с контрольной группой мышей. Таким образом, эксперименты подтвердили безопасность РЬЗа и Csp3 полипептидов для организма животных.

ВЫВОДЫ

1. Ген cspA, кодирующий сериновую протеазу CspA, присутствует во всех исследованных штаммах СГВ; фрагменты csp2 и csp3, кодирующие N и С-терминальные участки CspA, имеют высокую степень гомологии (98100%) среди СГВ различных серотипов.

2. Получены, выделены и очищены рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа и РЬ4а на основе С5а пептидазы и Csp2, Csp3 на основе протеазы CspA, и созданы штаммы-продуценты этих полипептидов.

3. На модели лабораторных животных продемонстрировано, что рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа и Csp3 содержат антигенные детерминанты, ответственные за индукцию специфических антител, опсонизирующих СГВ и СГА; рекомбинантный полипептид Csp2 не индуцирует антител, опсонизирующих СГВ.

4. Установлено, что участки С5а пептидазы и сериновой протеазы CspA с большим содержанием а-спиральных структур (РЬЗа и Csp3, соответственно) являются наиболее выраженными индукторами гуморального иммунного ответа.

5. Продемонстрировано, что в организме человека в ходе формирования гуморального иммунного ответа на СГВ инфекцию индуцируются специфические антитела ко всем исследованным пептидам на основе молекул С5а пептидазы и протеазы CspA.

6. Два рекомбинантных полипептида на основе С5а пептидазы и протеазы CspA, обладающие выраженной а-спирализованностью и обеспечивающие выработку протективных антител (РЬЗа и Csp3,

соответственно) могут быть рекомендованы в качестве компонентов вакцин против СГВ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Патент РФ:

Патент РФ на изобретение № 2378374: «Рекомбинантная ДНК, обеспечивающая получение рекомбинантного белка РВ1, обладающего протективными свойствами в отношении Streptococcus pyogenes и Streptococcus agalactiae». Авторы изобретения: Королева И.В., Дуплик Н.В.. Суворов А.Н. 2008г.

Статьи:

1. Дуплик Н.В.. Королева И.В., Суворов А.Н. Клонирование, экспрессия и изучение иммунологических свойств рекомбинантного полипептида на основе С5а пептидазы стрептококков группы В // Медицинская иммунология. 2009. Т. ll.№ 1. С. 7-14.

2. Суворов А.Н., Грабовская К.Б., Леонтьева Г.Ф., Мерингова Л.Ф., Королева И.В., Дуплик Н.В.. Тотолян А.А.. Рекомбинантные фрагменты консервативных белков стрептококков группы В как основа специфической вакцины //ЖМЭИ. 2010. №2, С. 44-50.

3. Суворов А.Н., Леонтьева Г.Ф., Ермоленко Е.И., Грабовская К.Б., Мерингова Л.Ф., Королева И.В., Дуплик Н.В.. Гупалова Т.В., Коржуева А.С., Елисеев Е.В., Бочкарева А.Н., А.А. Тотолян. Рекомбинантные вакцины и пробиотики как возможные средства защиты от стрептококковых заболеваний // Медицинский академический журнал. 2010. Т. 10, №2, С: 32-39.

4. Дуплик Н.В., Королева И.В., Грабовская К.Б., Суворов А.Н. Рекомбинантные полипептиды на основе С5а пептидазы как потенциальные компоненты вакцин против стрептококка группы В // Медицинская иммунология. 2011. Т. 13, № 1. С. 41-48.

Тезисы:

1. Duplik N.V.. Koroleva I.V., Suvorov A.N. The study of immunological properties of recombinant protein SCPB1 as potential vaccine component against Streptococcus agalactiae И European Journal of Medical Research. V. 12. №4. 2008. P: 55-56.

2. Duplik N. Koroleva 1, Suvorov A. Development of C5a peptidase and CspA based recombinant polypeptides as vaccine components against group В streptococci // Clinical Microbiology and Infection. 2010. V. 16. Suppl. № 2, P: S34.

3. Suvorov A.N., Leontieva G.F., Grudinin M., Stukova M., Shaldzhyan A., Romanko E., Grabovskaya K., Meringova L., Koroleva I., Duplik N.. Korjueva A., Gupalova Т., Totolian A., Kiselev O. Recombinant group В streptococcal peptides as protection against broad range of pathogens // Clinical Microbiology and Infection. 2010. V. 16. Suppl. № 2, P: S600.

4. Дуплик Н.В.. Королева И.В., Суворов А.Н. Получение рекомбинантного полипептида SCPB1 в качестве возможного компонента вакцины против стрептококков группы В // Сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». МАПО, г. С-Пб, Россия, 2007. С: 68-69.

5. Дуплик Н.В.. Королева И.В., Суворов А.Н. Изучение иммунного ответа рекомбинантных белков с целью дальнейшего их применения для создания вакцины против стрептококков группы В // Сборник тезисов 11-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века», г. Пущино, Россия, 2007. С: 198.

6. Duplik N.. Koroleva I., Berlov M., Suvorov A. Differences in GAS C5a-peptidase result in unequal susceptibility to certan human proteases // Abstract book. XVII Lancefield - international symposium on Streptococci and streptococcal diseases. Porto Heli, Greece. 2008. P: 245.

7. Дуплик H.B. Получение и изучение рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы с целью использования в качестве компонентов вакцины против стрептококков группы В. Тринадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. Аннотации научных работ победителей конкурса грантов Санкт-Петербурга 2008 года для студентов, аспирантов, молодых ученых и молодых кандидатов наук. -СПб.: Фонд «ГАУДЕАМУС», 2008. С: 34.

8. Leontieva G., Grabovskaya К., Meringova L., Koroleva I., Gupalova Т., Ditina M., Korjueva A., Duplick N.. Totolian A., Suvorov A. Streptococcal recombinant peptide vaccine as an alternative to conjugate vaccine development // Abstract book. Lamaca, Cyprus, 2009. P: 5.

9. Duplik N.V.. Koroleva I.V. and Suvorov A.N. New C5a peptidase based recombinant polypeptides as potential vaccine candidates against Streptococcus agalactiae И Abstract book. 3d FEMS 3d Congress of European Microbiologists. Gothenburg, Sweden, 2009. P: 125.

10. Дуплик H.B.. Королева И.В., Суворов А.Н. Создание новых полипептидных компонентов вакцин против Streptococcus agalactiae на основе поверхностных сериновых протеаз // III Международный молодежный медицинский Конгресс "Санкт-Петербургские научные чтения-2009", 2009. С: ИЗ.

11. Koroleva I., Duplik N.. Suvorov A. Certain parts of CspA molecule possess immunogenic and protective properties that may be useful in vaccine development against GBS // Current advances in the diagnosis, management and treatment of neonatal group В streptococcal infections. London, United Kingdom, 2010. P: 68.

Отпечатано с готового оригинал-макета. ООО «САН-Принт» 197022, Санкт-Петербург. Камснноостровскнй пр., 54 Подписано в печать 12.08.2011 заказ № 079 от 12.08.2011, тир. 100 экз.

it" 15317

2011159341

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дуплик, Надежда Владленовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1 Общие сведения о роде Streptococcus.

1.2 Streptococcus agalactiae (СГВ).

1.3 Поверхностные белки Streptococcus agalactiae, определяющие его патогенность.

1.3.1 Факторы адгезии СГВ к эпителиальным поверхностям организма человека.

1.3.2 Факторы инвазия СГВ через эпителиальные барьеры организма человека.

1.3.3 Факторы защиты от белков врожденного иммунитета человека.

1.4 Ферменты Streptococcus agalactiae.

1.4.1 Сериновые протеазы Streptococcus agalactiae.

1.4.1.1 С5апептидаза.

1.4.1.2 CspA протеаза.

1.4.2 Сериновые протеазы, обладающие шаперонной активностью.

1.4.2.1 Протеаза HtrA (DegP).

1.4.2.2 Протеаза ClpP.

1.5 Вакцины в профилактике инфекционных заболеваний.

1.5.1 История развития вакцинных технологий.

1.5.2 Вакцины для профилактики инфекций, вызванных СГВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поверхностные сериновые протеазы SCPB и CSPA в качестве кандидатов для создания вакцин против Streptococcus Agalactiae"

Актуальность работы.

Патогенные стрептококки относятся к наиболее распространенным возбудителям бактериальных инфекций человека. В последние десятилетия заболевания, вызываемые стрептококками серогруппы В (СГВ) или Streptococcus agalactiae, в большинстве стран мира рассматриваются в качестве важной социально-экономической и медицинской проблемы. Известно, что СГВ является естественным обитателем прямой кишки человека, способного вызывать инфекции уро-генитальной системы у женщин. Наряду с этим, СГВ может вызывать различные патологии беременности, в том числе выкидыши, внутриутробное поражение плода, преждевременные роды. СГВ могут вызывать серьезные инфекции у новорожденных, такие как сепсис, пневмония и менингит. Особо опасны инфекции, вызываемые СГВ у детей не старше десяти дней, протекающие в форме молниеносного сепсиса и приводящие к смертности в высоком проценте случаев.

Антибиотики, широко применяемые для профилактики и лечения, нередко оказываются неэффективными в силу увеличения числа антибиотикоустойчивых штаммов. Другим недостатком антибиотикотерапии является возникновение побочных эффектов для здоровья людей. К ним относятся аллергические реакции, негативное воздействие на центральную нервную и сердечно-сосудистую системы, и на некоторые внутренние органы^ человека. Кроме того, применение антибиотиков может приводить к нарушению микробиоценоза организма, что приводит к дисбиозам и, как следствие, к уменьшению устойчивости организма к другим инфекционным агентам, в первую очередь микоплазмам, хламидиям и грибам рода Candida.

В настоящее время большое число лабораторий мира работает над созданием вакцины против СГВ. Основными аргументами в пользу целесообразности создания такой вакцины, помимо низкой эффективности антибиотиков или невозможности их применения для профилактики, является возможность четкого выделения основных контингентов лиц, подлежащих вакцинации. В первую очередь — это носительницы СГВ с осложненной первой беременностью, планирующие рождение второго ребенка, а также здоровые женщины - будущие матери, нуждающиеся в профилактике СГВ инфекций. Потенциально объектами для иммунизации могут рассматриваться лица пожилого возраста, учитывая высокий уровень СГВ заболеваний в этой возрастной группе.

Среди поверхностных белковых факторов патогенности СГВ перспективными кандидатами для создания вакцины рассматриваются и сериновые протеазы. Последние способствуют выживанию СГВ в организме хозяина, так как они участвуют в расщеплении белков в качестве источников энергии или с целью подавления иммунных реакций организма. Важной особенностью некоторых сериновых протеаз является их способность расщеплять хемоаттрактанты. Так, например, С5а пептидаза, или 8срВ, специфически расщепляет С5а компонент комплемента человека, мобилизующий полиморфноядерные лейкоциты; а протеаза СэрА гидролизует ряд хемокинов СХС семейства, а именно ОКО-а1рЬа, ОШЭ-Ье1а, С1Ю^атта, пептид, активирующий нейтрофилы (ХАР-2), и гранулоцитарный хемотаксический белок 2 (ОСР-2). С5а компонент комплемента и перечисленные хемокины обладают свойствами анафилотоксинов и стимулируют привлечение в очаг инфекции полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов, поэтому их инактивация способствует подавлению факторов врожденного иммунитета. Указанные свойства сериновых протеаз ЯсрВ и Сэр А указывают на их физиологическую значимость для СГВ.

В силу изложенного, получение иммуногенных и протективных рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы и протеазы С эр А позволит использовать их в качестве компонентов при создании вакцинного препарата против СГВ.

Все вышесказанное определило цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования - получение рекомбинантных полипептидов на основе сериновых протеаз 5. agalactiae С5а пептидазы и протеазы СэрА для вакцинной профилактики заболеваний, вызываемых стрептококками группы В.

Для этого планировалось выполнить следующие задачи:

2. Изучение распространенности и консервативности гена cspA, кодирующего протеазу CspA, в штаммах СГВ.

3. Получение очищенных препаратов рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы и протеазы CspA.

6. Исследование токсичности рекомбинантных полипептидов в опытах in vivo.

Научная новизна работы.

3. Впервые изучен вклад различных участков С5а пептидазы и протеазы CspA в формирование протективного иммунитета к стрептококку группы В и показано, что наличие во вторичной структуре полипептида а-спиральных структур способствует г повышению иммуногенности и протективности.

5. Впервые продемонстрировано, что полипептиды малых размеров (73 85 аминокислотных остатков) на основе С5а пептидазы и .протеазы CspA способны индуцировать синтез специфических антител с протективными свойствами не только против S. agalactiae, но и против S. pyogenes.

Теоретическая значимость работы.

Продемонстрирована распространенность гена cspA, кодирующего поверхностную сериновую протеазу CspA, как в референс-штаммах, так и в клинических изолятах СГВ различных серотипов. Доказана консервативность фрагментов гена cspA, кодирующих N-терминальную и С-терминальную части протеазы CspA, в штаммах СГВ различных серотипов. Изучен вклад различных частей С5а пептидазы и протеазы CspA в формировании гуморального иммунного ответа к СГВ. Показано, что индукция синтеза специфических и протективных антител зависит от процентного содержания а-спиральных структур в молекуле белка.

Практическая значимость работы.

Созданы штаммы-продуценты Е. coli рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы (Pbla, РЬЗа и РЬ4а) и протеазы CspA (Csp2 и Csp3). Доказано, что высокоочищенные рекомбинантные полипептиды Pbla, РЬЗа и Csp3 обладают иммуногенностыо и способностью формировать образование протективных антител к

СГВ. Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3 рассматриваются как перспективные компоненты вакцины против СГВ.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Проклонированы фрагменты гена С5а пептидазы и протеазы CspA, которые кодируют рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа, РЬ4а, Csp2 и Csp3.

4т Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3, содержащие высокий процент a-спиральных структур, обладают высокой иммуногенностью, а антитела, полученные к ним, проявляют протективную и опсонизирующую активность in vitro и in vivo.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе один патент и четыре статьи в изданиях, рекомендованных ВАК России. Материалы исследований доложены автором и обсуждены на многих отечественных и международных научных конференциях и симпозиумах (на Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», г. Санкт-Петербург, Россия, 2007; 11-ой Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», г. Пущино, Россия, 2007; «XVII международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям им. Ленсфильд», г. Порто Хели, Греция, 2008; 3-м Конгрессе европейских микробиологов, г. Гетерборг, Швеция, 2009; III Международном молодежном медицинском Конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2009», г. Санкт-Петербург, Россия, 2009; 20-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям «20л ЕССМГО», г. Вена, Австрия, 2010; на конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», г. Санкт-Петербург, Россия, 2010).

Структура и объем диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Дуплик, Надежда Владленовна

выводы

1. Ген сврА, кодирующий сериновую протеазу Сэр А, присутствует во всех исследованных штаммах СГВ; фрагменты сзр2 и сярЗ, кодирующие N и С-терминальные участки СэрА. имеют высокую степень гомологии (98-100%) среди СГВ различных серотипов.

2. Получены, выделены и очищены рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа и РЬ4а на основе С5а пептидазы и СБр2, СэрЗ на основе протеазы СярА, и созданы штаммы-продуценты этих полипептидов.

3. На модели лабораторных животных продемонстрировано, что рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа и СэрЗ содержат антигенные детерминанты, ответственные за индукцию специфических антител, опсонизирующих СГВ и СГА; рекомбинантный полипептид Сир2 не индуцирует антител, опсонизирующих СГВ.

4. Установлено, что участки С5а пептидазы и сериновой протеазы Сэр А с большим содержанием а-спиральных структур (РЬЗа и СэрЗ, соответственно) являются наиболее выраженными индукторами гуморального иммунного ответа.

5. Продемонстрировано, что в ' организме человека в ходе формирования гуморального иммунного ответа на СГВ инфекцию индуцируются специфические антитела ко всем исследованным пептидам на основе молекул С5а пептидазы и протеазы СэрА.

6. Два рекомбинантных полипептида на основе С5а пептидазы и протеазы СэрА, обладающие выраженной а-спирализованностью и обеспечивающие выработку протективных антител (РЬЗа и СэрЗ, соответственно) могут быть рекомендованы в качестве компонентов вакцин против СГВ.

БЛАГОДАРНОСТИ

Научному руководителю проф., д.м.н. Суворову А.Н.

Сотрудникам отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН: д.м.н., акад. РАМН Тотоляну A.A. д.б.н. Дмитриеву A.B. д.б.н. Гупаловой Т.В. к.б.н. Королевой И.В. к.м.н. Грабовской К.Б. к.б.н. Леонтьевой Г.Ф.

Руководителю лаборатории общей иммунологии отдела иммунологии проф., д.м.н. Назарову П.Г.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Более 35 лет инфекции, вызываемые стрептококками группы В, остаются одними из наиболее опасных для новорожденных и их матерей. Известно, что СГВ экспрессирует разнообразные поверхностные белки, участвующие в развитии инфекционного процесса в организме хозяина. Инфекционный процесс представляет собой комплексное воздействие на организм хозяина ряда факторов патогенности микроорганизма: адгезинов, инвазинов, других агрессивных факторов. Пусковым механизмом развития инфекционного процесса является процесс адгезии микроорганизма к эпителиальным клеткам хозяина. В процессе адгезии СГВ участвуют следующие поверхностные белки: фибриноген связывающие белки (FbsA, FbsB), ламинин связывающий белок (Lmb), поверхностный иммуногенный белок (Sip), липопротеин ScaAB, лейцин богатый белок (LrrG), белок BibA, белок spBl, белки SspBl и SspB2, глутамин синтетаза (GS) и пили. Следующим этапом развития инфекционного процесса является процесс инвазии. Многие из перечисленных выше белков-адгезинов также участвуют в процессе инвазии - FbsA, FbsB, Lmb. Кроме того, в процессе инвазии принимают участие такие факторы патогенности СГВ как белки Alp семейства (а-антиген, белки Rib, R, А1р2, R28 (А1рЗ) и ß-антиген (белок Вас). В процессе пенетрации и уклонения от защитных факторов иммунной системы хозяина участвуют такие поверхностные факторы патогенности как адгезии BibA, инвазии ß-антиген, C5av пептидаза и протеаза CspA. Белок BibA обладает способностью специфически связывать С4 связывающий белок человека, который относится к классическому пути активации комплемента, а ß-антиген обладает способностью связывать IgA и фактор Н комплемента, который относится к альтернативному пути активации комплемента. С5а пептидаза и протеаза CspA обладают ферментативной активностью и способны расщеплять хемоаттрактанты организма хозяина [Santi I. 2007, Jerlstrom P.G. 1991, Takahashi S 1999, Bryan J.D 2009]. Таким образом, перечисленные выше поверхностные белковые факторы 1

124 патогенности стрептококковой клетки, взаимодействуют с организмом на разных стадиях течения инфекционного процесса.

Одним из подходов к профилактике инфекций, вызываемых стрептококками группы В, является создание специфических вакцин, а именно, создание генно-инженерных вакцин на основе поверхностных структур СГВ. Конструирование вакцин против СГВ началось с создания препаратов на основе полисахарида капсулы [Baker С. 2003, Davies H 2001]. Вакцинные препараты на основе капсульного полисахарида хорошо переносились беременными женщинами, а специфические антитела против полисахарида длительно циркулировали в крови беременных женщин [Baker С J 1976]. Однако основными недостатками таких вакцин является большое серологическое разнообразие СГВ в мире, слабая* иммуногенность полисахаридов капсулы и тот факт, что полисахариды относятся к Т-независимым антигенам, что сказывается на отсутствии иммунологической памяти после иммунизации. Перечисленные недостатки удалось частично устранить в конъюгированных белково-полисахаридных вакцинах против СГВ [Kasper DL 1996, Paoletti LC 2001, Yang HH 2008, Мерингова ЛФ 2007, Madoff LC 1994, Yang HH 2007]. Ковалентное связывание полисахарида с белком носителем позволило увеличить иммуногенность и- протективность препаратов, но остальные недостатки препаратов на основе полисахаридов капсул сохранялись. Этим вызвано появление альтернативного подхода конструирования вакцин против СГВ - создание вакцин на основе поверхностных белковых факторов патогенности стрептококка. Как уже было описано в литературном обзоре, в настоящее время ведутся разработки вакцин на основе С5а пептидазы, белка Вас, антигена а, белков Sip, ScaAB, LrrG, PI-1, PI-2 и Sap [Cheng QB

2001, Cheng QB'2002, Santillan D. 2008, Suvorov 2004, Yang 2007, Yang H. 2008, Martin D.

2002, Rioux S. 2001, Vorobieva, Meringova 2005, Seepersaud 2005, Maisey 2007, Rosini 2006, Santi 2008, Gourlay LJ 2009]. Критериями выбора определенного поверхностного белка в качестве компонента вакцины против СГВ являются его распространенность среди штаммов вида, консервативность, иммуногенность, протективность и безопасность. В связи с этим не все из перечисленных выше белков являются оптимальными кандидатами. Так антиген а слабо иммуногенен и, следовательно, его необходимо сочетать с более иммуногенными белками, белок Вас присутствует только у 25-40% штаммов СГВ. Последнее означает, что моновакцина на его основе будет эффективна только против штаммов СГВ, которые экспрессируют данный белок.

Наиболее перспективным кандидатом в качестве компонента вакцины является С5а пептидаза. Известно, что ген, кодирующий С5а пептидазу, присутствует во всех штаммах СГВ и является консервативным [Takahashi S. 1999, Chmourigina I.I. 1996]. Следовательно, вакцина, созданная на основе С5а пептидазы, будет иметь широкий спектр действия против всех штаммов СГВ. Изучение различных свойств С5а пептидазы ведутся с 1991 года, т.е. с момента ее обнаружения у СГВ [Bohnsack, 1991]. С тех пор проводились исследования иммуногенных и протективных свойств рекомбинантных полипептидов соответствующих полноразмерной С5а пептидазе [Cheng 2002, Cleary РР 2004; Park HS 2005, Xue G 2010]. В перечисленных исследованиях была доказана иммуногенность С5а пептидазы и протективность антител против- С5а пептидазы. Однако недостатками рекомбинантного полипептида, соответствующего полноразмерной С5а пептидазе в качестве компонента вакцины, являются наличие протеазной активности в отношении С5а фракции комплемента, а также большая молекулярная масса полипептида, затрудняющая его использование в составе поликомпонентной вакцины.

Отметим, что при конструировании рекомбинантных вакцин против СГВ на основе t поверхностных белков патогена ни один из перечисленных выше исследователей не учитывал особенности первичной и вторичной структур полноразмерной молекулы белка. В настоящее время появляются работы по созданию компонентов вакцины против СГА с учетом вторичной структуры выбранного компонента. Австралийские коллеги в работе по созданию вакцины против СГА показали, что только при наличии а-спиралей во вторичной структуре рекомбинантного полипептида на основе M белка СГА его эпитоп проявлял как иммуногенные, так и протективные свойства [Georgousakis ММ 2009]. Другая группа австралийских исследователей, также работающая над созданием вакцины против СГА, получила пять синтетических пептидов, обладающих иммуногенными свойствами, только в случае если они образовывали а-спиральные структуры [Wei Zhong 2009]. Еще одна группа ученых получила вакцинный эпитоп против СГА, размером в 55 аминокислотных остатков и содержащий 33% а-спиральных структур, способный индуцировать клеточный и гуморальный иммунные ответы [Guilherme L 2010]. Таким образом, современные вакцинные разработки направлены на конструирование полипептидов с учетом не только их первичной, но и вторичной структуры.

В представленной) диссертационной работе впервые при конструировании s рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы учитывались особенности их первичной и вторичной структур. Были получены три рекомбинантных полипептида, соответствующие трем участкам С5а пептидазы, а именно, аминокислотным остаткам с 96 по 169 (РЫа), с 496 по 570 (РЬЗа) и с 1247 по 1332 (РЬ4а). Эти участки содержали различный процент а-спиральных структур. Так, наибольшее содержание а-спиральных структур имело место в рекомбинантном полипептиде РЬЗа (41%), а наименьшее — в рекомбинантном полипептиде РЬ4а (19%). В ходе экспериментов по иммунизации лабораторных животных было продемонстрировано, что самым иммуногенным являлся полипептид РЬЗа, а полипептид РЬ4а оказался не иммуногенным. Результаты тестирования сывороток от женщин-носительниц СГВ показали наличие специфических антител в высоком титре ко всем полипептидам, кроме РЬ4а. Эти результаты свидетельствуют о том, что среди специфических антител, синтезированных ко всей стрептококковой клетке, обнаруживались антитела к полипептидам РЫа и РЬЗа. Полученные данные могут служить косвенным доказательством иммуногенности рекомбинантных полипептидов РЫа и РЬЗа. Таким образом, из трех рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы с одинаковой молекулярной массой, полипептид с наименьшим содержанием альфа-спиралей (РЬ4а) оказался не иммуногенным.

В представленном исследовании впервые в качестве перспективного кандидата в компоненты вакцины против СГВ рассмотрена и другая сериновая протеаза — CspA. Протеаза CspA была обнаружена у СГВ в 2003 году [Harris ТО 2003]. С тех пор на сайте информационного ресурса PubMed появилось только две работы, направленные на изучение свойств данной протеазы [Bryan J.D 2009, Shelver D 2008]. Обе работы посвящены исследованию ферментативных свойств CspA и связаны с определением ее вклада в патогенность СГВ. Было продемонстрировано, что протеазный домен CspA гомологичен протеазному домену С5а пептидазы на 45%, и для развития патологического процесса, вызываемого СГВ, протеаза CspA более значима, чем С5а пептидаза [Harris ТО 2003, Shelver D 2008]. Изучение иммуногенных свойств полноразмерной протеазы CspA, а тем более, иммуногенных свойств отдельных участков ее молекулы, не проводились. С целью получения доказательств о целесообразности конструирования рекомбинантных полипептидов на основе протеазы CspA в настоящей работе впервые было проведено исследование распространенности гена cspA, кодирующего протеазу CspA. Анализ коллекции, состоящей их 10 референс-штаммов и 75 клинических изолятов СГВ различных серотипов из России, Европы, США и Китая, подтвердил наличие в их хромосомной ДНК гена cspA. Анализ нуклеотидных последовательностей участков гена cspA (csp2 и csp3) 13 штаммов СГВ различных серотипов доказал их высокую консервативность (98-100%). Таким образом, проведенные исследования доказали распространенность и консервативность гена cspA среди штаммов СГВ различных серотипов. Проведенные исследования подтвердили целесообразность дальнейшего получения рекомбинантного полипептида Csp2, соответствующего участку протеазы CspA с аминокислотного остатка 139 по 506, и рекомбинантного полипептида Csp3, соответствующего аминокислотным остаткам протеазы CspA с 1247 по 1332. Данные участки на молекуле CspA были выбраны с учетом особенностей ее первичной и вторичной структуры, как и в случае с участками на молекуле С5а пептидазы. Были получены два рекомбинантных полипептида с различной молекулярной массой и разным содержанием a-спиральных структур. Так, полипептид Csp3 по молекулярной массе был в 3,5 раза меньше полипептида Csp2 и содержал в 4 раза больше a-спиральных структур чем полипептид Csp2. В ходе экспериментов по иммунизации лабораторных животных была продемонстрирована одинаковая иммуногенность полипептидов Csp2 и Csp3. Известно, что иммуногенность белка возрастает с увеличением его молекулярной массы. Таким образом, одинаковая иммуногенность Csp3 с Csp2 может быть связана с его а-спиралыюй структурой. Так, Csp3 содержит 69% a-спиралей при молекулярной массе 12 кДа, a Csp2 с молекулярной массой 42 кДа содержит 17% a-спиралей. Результаты тестирования сывороток от женщин-носительниц СГВ показали наличие специфических антител в высоком титре к обоим полипептидам. Эти результаты свидетельствуют о том, что среди специфических антител, синтезированных ко всей стрептококковой 1 клетке, обнаруживались антитела к полипептидам Csp2 и Csp3. Полученные данные также могут служить косвенным доказательством иммуногенности рекомбинантных полипептидов Csp2 и Csp3.

Таким образом, в представленной диссертационной работе показано влияние а-спиральных структур на иммуногенность рекомбинантных полипептидов. Более того, впервые изучены иммуногенные свойства различных участков С5а пептидазы и протеазы CspA.

Следующим этапом настоящего исследования стало изучение опсонизирующей активности и протективности антител к рекомбинантным полипептидам Pbla, РЬЗа, Csp2 и Csp3 в опытах in vitro и in vivo. Так как рекомбинантный полипептид РЬ4а оказался не иммуногенным, то дальнейшие исследования с ним не проводились. В ходе опсонофагоцитарного теста была доказана опсонизирующая активность антител к рекомбинантным полипептидам Pbla, РЬЗа и Csp3. Антитела к рекомбинантному полипептиду Csp2 не проявили опсонизирующей активности. Изучение протективных свойств антител к рекомбинантным полипептидам РЫа, РЬЗа, Csp2 и Csp3 проводили на мышиной модели генерализованной инфекции. Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о протективных свойствах антител к рекомбинантным полипептидам Pbla, РЬЗа и Csp3. Антитела к рекомбинантному полипептиду Csp2 не проявили протективной активности. Результаты опыта in vivo полностью коррелируют с результатами опсонофагоцитарного теста и доказывают протективную активность анти-Pbla, анти- РЬЗа и анти-СэрЗ. Таким образом, среди антител, синтезируемых ко всем полипептидам, только антитела к рекомбинантному полипептиду Csp2, содержащему наименьшее количество а-спиралей (17%), не оказались протективными. Полученные данные свидетельствуют о влиянии a-спиральных структур полипептида на протективные свойства синтезируемых антител.

В результате проведенного исследования были получены рекомбинантные полипептиды на основе сериновых протеаз ScpB и CspA. Исследованы отдельные участки полноразмерных сериновых протеаз. Продемонстрирована широкая распространенность гена cspA, кодирующего протеазу CspA и высокая консервативность фрагментов гена cspA. Показана иммуногенность отдельных фрагментов сериновых протеаз, соответствующих рекомбинантным полипептидам. Pbla, РЬЗа, Csp2 и Csp3, а введение-рекомбинантных полипептидов,РЫа, РЬЗа и Csp3'стимулировало синтез протективных антител, что было продемонстрировано в опытах in vitro и in vivo. Показано, что введение рекомбинантных полипептидов РЬЗа, Csp2 и Csp3 обеспечивает синтез длительно циркулирующих специфических антител. На лабораторных мышах продемонстрирована безопасность и отсутствие токсичности рекомбинантных полипептидов РЬЗа и Csp3. Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3 предложены в качестве перспективных компонентов различного типа вакцин против СГВ.

Практическая значимость настоящего исследования состоит в получении трех иммуногенных рекомбинантных полипептидов РЫа, РЬЗа и Csp3, индуцирующих синтез специфических антител с протективной активностью. Преимуществом полученных полипептидов перед полноразмерными С5а пептидазой и протеазой CspA является отсутствие у них протеазной активности, так как они были сконструированы таким образом, чтобы в их структуре не содержался каталитический центр, характерный для полноразмерных сериновых протеаз. Более того, малые размеры этих полипептидов (7385 аминокислотных остатков) открывают дополнительные перспективы их использования в составе мультивалентной вакцины против СГВ.

Так, на основе рекомбинантных полипептидов РЬЗа и Csp3 может быть создан вакцинный препарат, включающий смесь этих полипептидов. В литературе недавно появились данные о применении смеси полноразмерных рекомбинантных полипептидов Sip и ScpB в качестве интраназальной мультикомпонентной вакцины против СГВ [Xue G 2010]. Напомним, что это решение не является оптимальным, поскольку полноразмерный белок ScpB обладает ферментативной активностью в отношении С5а фракции комплемента, а свойства белка Sip плохо изучены.

Другим возможным применением полученных результатов является получение гибридного полипептида, кодируемого фрагментами рЪЗа и csp3. В результате «сшивания» фрагментов рЬЗа и csp3, клонирования их в экспрессионный вектор с последующей трансформацией в штамм Е. coli, предполагается получение штамма-продуцента гибридного полипептида, состоящего из полипептидов РЬЗа и Csp3. В настоящее время еще не получено ни одной гибридной вакцины против СГВ, однако гибридные вакцины против ряда других возбудителей активно разрабатываются и широко исследуются в мире. Среди новейших разработок представлены гибридные вакцины в качестве меры профилактики против таких заболеваний как рак простаты [Perez SA 2010], воспаление легких, вызванное Yersinia pestis [Tinker JK 2010], диарея, вызванная энтеротоксигенной кишечной палочкой [Tobias J 2010], малярия [Xue X 2010, Singh В 2010], ВИЧ [Lapelosa М 2010], энцефалит [Kenney JL 2010] и сибирская язва [Wu G 2010].

Еще одним современным направлением использования рекомбинантных иммуногенных полипептидов является создание «живой» вакцины с использованием пробиотического микроорганизма (например, Lactococcus lactis) в качестве средства доставки антигена на вагинальный эпителий беременных или женщин, планирующих беременность. Такой препарат был получен на основе белка пилей СГВ PI-1 [Buccato S 2006]. Однако, несмотря на то, что компоненты пилей долгое время рассматривались в качестве потенциальных компонентов вакцины против СГВ, вакцины на их основе не оказались эффективными, что связано с большим разнообразием белковых структур пилей в разных штаммах СГВ [Rinaudo C.D. 2009].

В результате настоящего исследования сконструированы штаммы-продуценты пяти рекомбинантных полипептидов: трех на основе С5а пептидазы и двух на основе протеазы CspA. Фундаментальная значимость работы состоит в том, что впервые в качестве вакцинных кандидатов исследованы различные участки С5а пептидазы и протеазы CspA. Доказана распространенность гена cspA и консервативность его фрагментов. Продемонстрировано, что содержание а-спиралей во вторичной структуре полипептидов влияют на их иммуногенность и протективность. В качестве перспективных кандидатов в компоненты вакцины против СГВ из пяти созданных полипептидов выбраны три полипептида (два на основе С5а пептидазы и один на основе протеазы CspA), обладающие наибольшей иммуногенностью и протективной активностью. Отобранные полипептиды отвечают всем требованиям, предъявляемым к кандидатам в компоненты вакцин. Отсутствие к настоящему времени вакцины против СГВ подчеркивает ценность проведенного исследования, открывшего перспективы создания отечественной рекомбинантной вакцины против СГВ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дуплик, Надежда Владленовна, Санкт-Петербург

1. Бурбелло А.Т. и др. Соврем. Лекар. Средства. 2003. СПб: Нева, 332.

2. Воробьева Е.И. Молекулярно-генетическая характеристика белка ScaAB стрептококков группы В: диссер. на соискание уч. ст. канд. биол. наук. — СПб. -2006. -212с.

3. Доброгорская Я.И., Немухин A.B. Моделирование реакции ацилирования субстрата в активном центре сериновых протеаз // Вестник Московского Университета, сер.2, Химия. 2003. - Т.44, N2. С: 103-107.

4. Зациорская С.Л., Оганян К.А., Мартикайнен З.М. и др. Колонизация урогенитального тракта женщин стрептококками группы В, содержащими гены sspB семейства // Журнал акушерства и женских болезней. 2006. - Том IV.

5. Зуева Л.П., Поляк М.С. и др. Микробиологический мониторинг, СПб: Медицинский информационно-аналитический центр, 2004. Стр: 1- 72.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.

7. Определитель бактерий Берджи/ Под редакцией Дж. Хоута, Г Крига, П Снита и др.-В двух томах. М.: «Мир», 1997.

8. Поляк М.С. Основы антибиотикотерапии. 2003. СПб: НИЦФ, 1-53.

9. Семина H.A., Сидоренко C.B. и др. Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. 2004. Т. 6, № 4. Стр: 306-359.

10. Страчунский Л.С., Козлов С.Н. Соврем. Антимикроб. Химиотер. 2002. М.: Боргес, 1-432.

11. Тотолян A.A., Суворов А.Н., Дмитриев A.B. Стрептококки группы В в патологии человека. СПб: Человек. 2009. 212 с.

12. Adderson Е.Е., Takahashi S., Wang Y. et al. Subtractive Hybridization Identifies a Novel Predicted Protein Mediating Epithelial Cell Invasion by Virulent Serotype III Group В Streptococcus agalactiae //Infect Immun. 2003, V. 71, № 12, P: 6857-6863.

13. Ahn S.-J., Lemos J. A. C. and Burne R. A. Role of HtrA in growth and competence of Streptococcus mutans UA159 // J. Bacteriol. 2005. V.l87, № 9. P.: 3028-3038.

14. Anthony B.F., Okada D.M., Hobel C.J. Epidemiology of group В Streptococcus: longitudinal observations during pregnancy // J. Infect. Dis. 1978. V. 137. P: 524—530.

15. Baker C.J. and M.S. Edwards. Group В streptococcal conjugate vaccines. // Arch. Dis. Child. 2003. V. 88. P: 375-378.

16. Baker C. J. and D.L. Kasper. Correlation of maternal antibody deficiency with susceptibility to neonatal group В streptococcal infection // N. Engl. J. Med. 1976. V. 294. P: 753-756.

17. Baker С J., Barrett F.F. Transmission of group В streptococci among parturient women and their neonates // J. Pediatr. 1973. V. 83. P: 919-925.

18. Baker C.J. et al. Vaginal colonization with group В Streptococcus: a study in college women// J. Infect. Dis. 1977. V. 135. P: 392-397.

19. Baker CJ, Rench MA, Edwards MS et al. Immunization of pregnant women with a polysaccharide vaccine of group В streptococcus //N Engl J Med. 1988. V. 319, № 18. P: 1180-1185.

20. Barcaite E. et al. Prevalence of maternal group B streptococcal colonisation in European countries //Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2008. V. 87. P: 260-271.

21. Baron M.J. et al. Identification of a glycosaminoglycan binding region of the alpha C protein that mediates entry of group B streptococci into host cells // J Biol Chem. 2007. V. 282. P: 10526-10536.

22. Bayer AS, Chow AW, Anthony BF, Guze LB. Serious infections in adults due to group B streptococci. Clinical and serotypic characterization // Am J Med. 1976. V. 61, № 4. P: 498-503.

23. Beckmann C. et al. Identification of novel adhesins from Group B streptococci by use of phage display reveals that C5a peptidase mediates fibronectin binding // Infect Immun. 2002. V. 70. P: 2869-2876.

24. Bergseng H., Rygg M., Bevanger L. et al. Invasive group B streptococcus (GBS) diseasein Norway 1996-2006 // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2008. V. 27. P: 11931199.

25. Berlanda Scorza F, Doro F, Rodríguez-Ortega MJ et al. Proteomics characterization of outer membrane vesicles from the extraintestinal pathogenic Escherichia coliAtolR IHE3034 mutant. // Mol Cell Proteomics. 2008. V. 7. P: 473^85.

26. Biswas S. and Biswas I. Role of HtrA in surface protein expression and biofilm formation by Streptococcus mutans // Infection and immunity. 2005, V. 73, № 10. P.: 6923-6934.

27. Bohnsack J.F., Mollison K.W., Buko A.M. et al. Group B streptococci inactivate complement C5a by enzymic cleavage at the C-terminus // Biochem J. 1991. V. 273. P: 635-640.

28. Bohnsack J.F., Chang J.K., Hill H.R. Restricted ability of group B streptococcal C5a-ase to inactivate C5a prepared from different animal species // Infect Immun. 1993. V. 61, № 4. P: 1421-1426.

29. Bolduc G.R. and Madoff L.C. The group B streptococcal alpha C protein binds alphalbetal- integrin through a novel KTD motif that promotes internalization of GBS within human epithelial cells // Microbiology. 2007. V. 153. P: 4039-4049.

30. Bolduc G.R. et al. The alpha C protein mediates internalization of group B Streptococcus within human cervical epithelial cells I I Cell Microbiol. 2002. V. 4. P: 751-758.

31. Brown CK, Gu ZY, Matsuka YV et al. Structure of the streptococcal cell wall C5a peptidase // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. V. 102. P: 18391-18396.

32. Bryan J.D., Shelver D.W. Streptococcus agalactiae CspA is a serine protease that inactivates chemokines // J. Bacterid. 2009,191(6), 1847-1854.

33. Campbell J.R. et al. Group B streptococcal colonization and serotype-specific immunity in pregnant women at delivery // Obstet Gynecol. 2000. V. 96. P: 498-503.

34. Carlin A.F. et al. Group B streptococcal capsular • sialic acids interact with siglecs(immunoglobulin-like lectins) on human leukocytes // J Bacteriol. 2007. V. 189. P: 1231-1237.

35. Cavard D., C. Lazdunski, and S. P. Howard. The acylated precursor form of the colicin A lysis protein is a natural substrate of the DegP protease // J. Bacteriol. 1989. № 171. P:6316-6322.

36. Chaffin D.O., L. M. Mentele, and C. E. Rubens. Sialylation of Group B Streptococcal capsular polysaccharide is mediated by cpsK and is required for optimal capsule polymerization and expression // J. Bacteriology. 2005, 187, 4615-4626.

37. Chastanet A., Prudhomme M., Claverys J. P. & Msadek T. Regulation of Streptococcus pneumoniae clp genes and their role in competence development and stress survival // J Bacteriol. 2001. V. 183, P.-7295-7307.

38. Cheng Q, Carlson B, Pillai S et al. Antibody against surface-bound C5a peptidase is opsonic and initiates macrophage killing of group B streptococci // Infect Immun. 2001. V. 69. № 4. P: 2302-2308.

39. Cheng Q., D. Stafslien, S. S. Purushothaman et al. The group B streptococcal C5a peptidase is both a specific protease and an invasin // Infect. Immun. -2002. -Y70, №5. -P. 2408-2413.

40. Cheng Q., Debol S., Lam H. et al. Immunization with C5a Peptidase or Peptidase-Type III Polysaccharide Conjugate Vaccines Enhances Clearance of Group B Streptococci from Lungs of Infected Mice // Infection and Immunity. 2002. V. 70, №. 11. P. 64096415.

41. Chmouryguina I, Suvorov A, Ferried P, Cleary PP. Conservation of the C5a peptidase genes in group A and B streptococci // Infect Immun. 1996. V. 64, № 7. P: 2387-2390.

42. Cleary PP, Matsuka YV, Huynh T et al. Immunization with C5a peptidase from either group A or B streptococci enhances clearance of group A streptococci from intranasally infected mice // Vaccine. 2004. V. 22. P: 4332-4341.

43. Cole J.N., Aquilina J.A., Hains P.G. et al. Role of group A Streptococcus HtrA in the maturation of SpeB protease // Proteomics. 2007. V. 24, № 7. P.: 4488-4498.

44. Corpet F. "Multiple sequence alignment with hierarchical clustering" // Nucl. Acids Res. 1988. V.16, № 22. P: 10881-10890.

45. Cumming C.G. Group B streptococcal cell surfaces //J.Med.Microbiol.,1984, 18, P: 151155.

46. Curtis S.N., Krause R.M. Identification of rhamnose as an antigenic determinant of group B streptococci carbohydrate. Federation Proceeding, 1964, 23, P: 151-155.

47. Davies H.D. et al. Antibodies to capsular polysaccharides of group B Streptococcus in pregnant Canadian women: relationship to colonization status and infection' in the neonate // J. Infect. Dis. 2001. V. 184. P: 285-291.

48. Devi AS, Ponnuraj K Cloning, expression, purification and ligand binding studies of novel fibrinogen-binding protein FbsB of Streptococcus agalactiae // Protein Expr Purif. 2010 №2. P: 148-55.

49. Dillon H.C. et al. Anorectal and vaginal carriage of group B streptococci during pregnancy//J. Infect. Dis. 1982. V. 145. P: 794-799.

50. Dramsi S., E. Caliot, I. Bonne et al. Assembly and role of pili in group B streptococci II Mol. Microbiol. 2006, 60, 1401-1413

51. Facklam R.R., Washington J.A. Streptococcus and related catalase-negative grampositive cocci. In: Manual of Clinical Microbiology, edited by Balows A., Hausler W.Jr. and Herrmann K.L. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1991, p. 238239.

52. Facklam R. What happened to the streptococci: overview of taxonomic and nomenclature changes // Clin. Microbiol. Rev. 2002. V. 15. P: 613-630.

53. Ferrieri P. GBS infection in the newborn infant: diagnosis and treatment // Antibiot. Chemoter. 1985, 35, p. 211-215.

54. Franciosi R.A., Knostman J.D., Zimmerman R.A. Group B streptococcal neonatal and infant infections // J.Pediatr., 1973, 82, p. 707-710.

55. Gaillot O., Bregenholt S., Jaubert F., Di Santo J. P. & Berche P. Stress-induced ClpP serine protease of Listeria monocytogenes is essential for induction of listeriolysin O-dependent protective immunity // Infect Immun. 2001. V. 69, P:4938^943.

56. Gallagher P.G., Wataaanakunakorn C. Group B streptococcal endocarditis; report of seven cases and review of the literature 1962-1985 // Rev. Infect. Dis., 1986, № 8, P: 175-188.

57. Georgousakis MM, Hofmann A, Batzloff MR et al. Structural optimisation of a conformational epitope improves antigenicity when expressed as a recombinant fusion protein // Vaccine. 2009. V. 27, № 48. P: 6799-6806.

58. Geouijon C, Deleage G. SOPMA: significant improvements in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments // Comput Appl Biosci. 1995. V6,№11.P: 681-684.

59. Gibson R.L., Nizet V. and Rubens C.E. Group B streptococcal b-hemolysin promotes injury of lung microvascular endothelial cells // Pediatr Res. 1999. V. 45. P: 626-634.

60. Gourlay LJ, Santi I, Pezzicoli A et al. Group B streptococcus pullulanase crystal structures in the context of a novel strategy for vaccine development // J Bacteriol. 2009 V. 191, № 11. P: 3544-3552.

61. Guilherme L, Alba MP, Ferreira FM et al. Anti-group A streptococcal vaccine epitope: structure, stability and its ability to interact with HLA class II molecules // J Biol Chem. 2010. Epub.

62. Harris T.O. et al. A novel streptococcal surface protease promotes virulence, resistance to opsonophagocytosis, and cleavage of human fibrinogen // J Clin Invest. 2003. V. 111. P: 61-70.

63. Heather C. Maisey, Kelly S. Doran and Victor Nizet. Recent advances in understanding the molecular basis of group B Streptococcus virulence // Cambridge University Press. 2008. V. 10. P: 1-16.

64. Hensler M.E. et al. Virulence role of group B Streptococcus b-hemolysin/cytolysin in a neonatal rabbit model of early-onset pulmonary infection // J Infect Dis. 2005. V. 191, P: 1287-1291.

65. Hidalgo-Grass C., Mishalian I., Dan-Goor M. et al. A streptococcal protease that degrades CXC chemokines and impairs bacterial clearance from infected tissue // EMBO J. 2006, 4, 25, 4628-37.

66. Hopp T.P., Woods KR. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1981. V. 78. P: 3824-3828.

67. Hull JR, Tamura GS, Castner DG. Interactions of the streptococcal C5a peptidase with human fibronectin // Acta Biomater. 2008. V. 4. № 3. P: 504-513.

68. Ibrahim Y.M., Alison R. Kerr A.R., McCluskey J., Mitchell T.J. Role of HtrA in the Virulence and competence of Streptococcus pneumoniae II Infection and immunity, 2004, V. 72, № 6. P. 3584-3591.

69. Jarva H. et al. The group B streptococcal beta and pneumococcal Hie proteins are structurally related immune evasion molecules that bind the complement inhibitor factor H in an analogous fashion // J Immunol. 2004. V. 172. P: 3111-3118.

70. Jenkins PJ, Clement ND, Gaston P et al. Invasive group B streptococcal disease in an orthopaedic unit // J Hosp Infect. 2010. V. 76. № 3. P: 231-233.

71. Jerlstrom P.G., Chhatwal G.S. and Timmis K.N. The IgA-binding beta antigen of the c protein complex of Group B streptococci: sequencedetermination of its gene and detection of two binding regions // Mol Microbiol. 1991. V. 5. P: 843-849.

72. Jones A.L. et al. Penicillin-binding proteins in Streptococcus agalactiae: a novel mechanism for evasion of immune clearance // Mol. Microbiol. 2003. V. 47. P: 247-256.

73. Jones C.H., Bolken T.C., Jones K.F. et al. Conserved DegP Protease in Gram-Positive Bacteria Is Essential for Thermal and Oxidative Tolerance and Full Virulence in Streptococcus pyogenes II Infection and immunity. -2001. -V 69, № 9/ P: 5538-5545.

74. Kaplan E.L., Johnson D.R., Kuritsky J.N. Rectal colonization by group B-hemolytic streptococci in a geriatric population // J. Infect. Dis. 1983. V. 148. P: 1120-1125.

75. Keefe G.P. Streptococcus agalactiae mastitis: a review // Can.Vet. 1997, 38, p.429-437.

76. Kenney JL, Adams AP, Weaver SC. Transmission potential of two chimeric western equine encephalitis vaccine candidates in Culex tarsalis // Am J Trop Med Hyg. 2010. V. 82. № 2. P: 354-359.

77. Ko TJ, Hsieh WS, Hsueh PR. Late-onset group B streptococcal meningitis in a neonate with early antibiotic prophylaxis // Pediatr Neonatol. 2010. V. 51. № 4. P: 242-244.

78. Koenig J. and Keenan W. Group B Streptococcus and Early-Onset Sepsis in the Era of Maternal Prophylaxis // Pediatr Clin North Am. 2009. V. 56. № 3. P: 689-708.

79. Kogan G. et al. Structural and immunochemical characterization of the type VIII group B Streptococcus capsular polysaccharide // J Biol Chem. 1996. V. 271. P: 8786-8790.

80. Kogan G. et al. Structural elucidation of the novel type VII group B Streptococcus capsular polysaccharide by high resolution NMR spectroscopy // Carbohydr Res. 1995. V. 277. P: 1-9.

81. Kolmar H., P. R. H. Waller, and R. T. Sauer. The DegP and DegQ periplasmic endoproteases of Escherichia coli: specificity for cleavage sites and substrate conformation. J. Bacteriol. 1996. № 178. P:5925-5929.

82. Koroleva I.V., Efstratiou A., Suvorov A.N. Structural heterogeneity of the streptococcal C5a peptidase gene in Streptococcus pyogenes // J Bacteriol. 2002. V. 184, № 22. P: 6384-6386.

83. Krishnan V. et al. An IgG-Iike domain in the minor pilin GBS52 of Streptococcus agalactiae mediates lung epithelial cell adhesion // Structure. 2007. V. 15. P: 893-903.

84. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head ofbacteriophage T4 // Nature. London. -1970.

85. Lambertsen L., Ekelund K., Skovsted I. C. Characterisation of invasive group B streptococci from adults in Denmark 1999 to 2004 // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2010. V. 29. P: 1071-1077.

86. Lancefield R.C. A serological differentiation of specific type of bovine hemolytic streptococci (group B) // J. Exp. Med. 1934. -№59. - P. 441-458.

87. Lantz M.S. Are bacterial proteases important virulence factors? // J periodontal res. 1997. V. 32. P: 126-132.

88. Lapelosa M, Arnold GF, Gallicchio E et al. Antigenic characteristics of rhinovirus chimeras designed in silico for enhanced presentation of HIV-1 gp41 epitopes // J Mol Biol. 2010. V. 397, № 3. P: 752-766.

89. Lauer P., Rinaudo C.D., Soriani M. et al. Genome analysis reveals pili in Group B Streptococcus //Science 2005, V. 309, P: 105.

90. Lee B. K., Song Y. R., Kim M. Y. et al. Epidemiology of group B streptococcus in Korean pregnant women // Epidemiology and Infection. 2010. V. 138. P: 292-298.

91. Levchenko I., Smith C. K., Walsh N. P., R. T. Sauer, and T. A. Baker. PDZ-like domains mediate binding specificity in the CLP/HSP100 family ofchaperones and protease regulatory subunits // Cell. 1997. № 91. P:939-947.

92. Levine MM, Robins-Browne R. Vaccines, global health and social equity // Immunol Cell Biol. 2009. V. 87, № 4. P: 274-278.

93. Lipinska B., M. Zylicz, and C. Georgopoulos. 1990. The HtrA (DegP) protein, essential for Escherichia coli survival at high temperatures, is an endopeptidase // J. Bacterid. № 172. P:1791-1797.

94. Liu G.Y. et al. Sword and shield: linked group B streptococcal |3-hemolysin/ cytolysin and carotenoid pigment act synergistically to subvert host phagocyte defenses // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. V. 101. P: 14491-14496.

95. Lyon W.R., Caparon M.G. Role for serine protease HtrA (DegP) of Streptococcus pyogenes in the biogenesis of virulence factors SpeB and the hemolysin streptolysin S // Infection and immunity. 2004. V. 72. № 3. P.: 1618-1625.

96. Magalhaes V. et al. Interaction with human plasminogen system turns on proteolytic activity in Streptococcus agalactiae and enhances its virulence in a mouse model // Microbes Infect. 2007. V. 9. P: 1276-1284.

97. Maisey H.C. et al. A group B streptococcal pilus protein promotes phagocyte resistance and systemic virulence // FASEB. J. 2008.

98. Maisey H.C., Hensler M., Nizet V. et al. Group B streptococcal pilus proteins contribute to adherence to and invasion of brain microvascular endothelial cells // J. Bacteriol. 2007, 189, 1464-1467.

99. Marques M.B. et al. Prevention of C3 deposition by capsular polysaccharide is a virulence mechanism of type III group B streptococci II Infect Immun. 1992. V. 60. P: 3986-3993.

100. Martin D, Rioux S, Gagnon E et al. Protection from group B streptococcal infection in neonatal mice by maternal immunization with recombinant Sip protein // Infect Immun. 2002. V. 70, № 9. P: 4897-4901.

101. Nair S., Frehel C., Nguyen L., Escuyer V., Berche, P. ClpE, a novel member of the HSP100 family, is involved in cell division and virulence of Listeria monocytogenes // Mol Microbiol. 1999. V. 31. P: 185-196.

102. Nair S., Poyart C., Beretti J. et al. Role of the Streptococcus agalactiae ClpP serine protease in heat-induced stress defence and growth arrest // Microbiology. 2003. V. 149. P: 407-417.

103. Navarre W. W. and Schneewind O. Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. №63. P: 174-229.

104. Nizet V. et al. Group B streptococcal b-hemolysin expression is associated with injury of lung epithelial cells // Infect Immun. 1996. V. 64. P: 3818-3826.

105. Nizet V.et al. Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection //Nature. 2001. V. 414. P: 454-457.

106. Offit PA. Thimerosal and vaccines—a cautionary tale // N Engl J Med. 2007. V. 357, № 13. P: 1278-1279.

107. Pallen M. J., and B. W. Wren. The HtrA family of serine proteases // Mol. Microbiol. 1997. № 26. P:209-221.

108. Paoletti L.C. and L.C. Madoff. Vaccines to prevent neonatal GBS infection // Semin. Neonatol.2002. V. 7. P: 315-323.

109. Paradiso P. R. Maternal immunization: the influence of liability issues on vaccine development // Vaccine. 2001. V. 20. Suppl 1, S73-S74.

110. Perez SA, Kallinteris NL, Bisias S et al. Results from a phase I clinical study of the novel Ii-Key/HER-2/neu(776-790) hybrid peptide vaccine in patients with prostate cancer // Clin Cancer Res. 2010. V. 16. № 13. P: 3495-3506.

111. Phares CR, Lynfield R, Farley MM et al. Epidemiology of invasive group B streptococcal disease in the United States, 1999-2005 // JAMA. 2008. V. 299. P: 20562065.

112. Pietrocola G, Visai L, Valtulina V et al. Multiple interactions of FbsA, a surface protein from Streptococcus agalactiae, with fibrinogen: affinity, stoichiometry, and structural characterization // Biochemistry. 2006. V. 45. № 42. P: 12840-12852.

113. Podbielski A, Flosdorff A, Weber-Heynemann J. The group A streptococcal virR49 gene controls expression of four structural vir regulon genes // Infect Immun. 1995. V. 63, № l.P: 9-20.

114. Poquet I., V. Saint, E. Seznec, N. Simoncs, A. Bolotin, and A. Grass. HtrA is the unique surface housekeeping protease in Lactococcus lactis and is required for natural protein processing // Mol. Microbiol. 2000. № 35. P: 1042-1051.

115. Poyart C. et al. Contribution of Mn-cofactored superoxide dismutase(SodA) to the virulence of Streptococcus agalactiae II Infect. Immun. 2001. V. 69. P: 5098-5106.

116. Pulendran B, Li S, Nakaya HI. Systems vaccinology // Immunity. 2010. V. 33. № 4. P: 516-529.

117. Ragunathan P, Spellerberg B, Ponnuraj K. Structure of laminin-binding adhesin (Lmb) from Streptococcus agalactiae II Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2009. V. 65. P: 1262-1269.

118. Regan J.A. et al. The epidemiology of group B streptpcoccal colonization in pregnancy//Obstet. Gynecol. 1991. V. 77. P: 604-610.

119. Rinaudo C., Telford J., Rappuoli R.et al. Vaccinology in the genome era // J. Clin. Invest 2009. V. 119. P: 2515-2525.

120. Rioux S, Martin D, Ackermann HW et al. Localization of surface immunogenic protein on group B Streptococcus // Infect Immun. 2001. V. 69, № 8. P: 5162-5165.

121. Rocchetti TT, Marconi C, Rail VL et al. Group B streptococci colonization in pregnant women: risk factors and evaluation of the vaginal flora // Arch Gynecol Obstet. 2010. P: 1-5.

122. Rodriguez-Ortega M.J., Norais N., Bensi G. et al. Characterization and identification of vaccine candidate proteins through analysis of the group A Streptococcus surface proteome //Nat. Biotechnol. 2006. V. 24. P: 191-197.

123. Rosini R. et al. Identification of novel genomic islands coding for antigenic pilus-like structures in Streptococcus agalactiae // Mol Microbiol. 2006. V. 61. P: 126-141.

124. Samen U, Eikmanns BJ, Reinscheid DJ et al. The surface protein Srr-1 of Streptococcus agalactiae binds human keratin 4 and promotes adherence to epithelial HEp-2 cells // Infect Immun. 2007. V. 75. P: 5405-5414.

125. Santi I., Scarselli M., Mariani M. et al. BibA: a novel immunogenic bacterial adhesin contributing to group B Streptococcus survival in human blood // Mol. Microbiol. 2007, 63, 754-767.

126. Santillan DA, Andracki ME, Hunter SK. Protective immunization in mice against group B streptococci using encapsulated C5a peptidase // Am J Obstet Gynecol. 2008. V. 198, № l.P: 114-120.

127. Sassoon N., Arie J. P. and Betton J. M. PDZ domains determine thenative oligomeric structure of the DegP (HtrA) protease // Mol. Microbiol. 1999. № 33. P:583-589.

128. Sauer F.G. et al. Bacterial pili: molecular mechanisms of pathogenesis // Curr Opin Microbiol. 2000. V. 3. P: 65-72.

129. Schräg SJ, Zywicki S, Farley MM et al. Group B streptococcal disease in the era of intrapartum antibiotic prophylaxis // N Engl J Med. 2000. V. 342. P: 15-20.

130. Schubert A., K. Zakikhany G., Pietrocola et al. The fibrinogen receptor FbsA promotes adherence of Streptococcus agalactiae to human epithelial cells // Infect. Immun. 2004, 72, 6197-6205.

131. Seepersaud R, Hanniffy SB, Mayne P. Characterization of a novel leucine-rich repeat protein antigen from group B streptococci that elicits protective immunity // Infect Immun. 2005. V. 73. № 3. P: 1671-1683.

132. Seifert K.N. et al. Characterization of group B streptococcal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: surface localization, enzymatic activity, and protein-protein interactions // Can J Microbiol. 2003. V. 49. P: 350-356.

133. Sendi P., Johansson L., Norrby-Teglund A. Invasive Group B Streptococcal Disease in Non-pregnant Adults // Infection. 2008. V. 36. № 2. P: 100-111.

134. Seoud M, Nassar AH, Zalloua P. Prenatal and neonatal Group B Streptococcus screening and serotyping in Lebanon: incidence and implications // Acta Obstet Gynecol Scand. 2010. V. 89. № 3. P: 399-403.

135. Sette A, Rappuoli R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics // Immunity. 2010. V. 33, № 4. P: 530-541.

136. Shelver D, Bryan JD. Expression of the Streptococcus agalactiae virulence-associated protease CspA in a soluble, active form utilizing the Gram-positive host, Lactococcus lactis // J Biotechnol. 2008. V. 136. P: 129-134.

137. Skoff TH, Farley MM, Petit S et al. Increasing burden of invasive group B streptococcal disease in nonpregnant adults 1990-2007 // Clin Infect Dis. 2009. V. 49. P: 85-92.

138. Slotved H.C. et al. Serotype IX, a proposed new Streptococcus agalactiae serotype // J Clin Microbiol. V. 45. P: 2929-2936.

139. Slotved H.C., Kong F., Lambertsen L et al. Serotype IX, a Proposed New Streptococcus agalactiae Serotype // J Clin Microbiol. 2007, 45, P: 2929-2036.

140. Spellerberg B., Rozdzinski E., Martin S. et al. Lmb, a protein with similarities to the Lral adhesin family, mediates attachment of Streptococcus agalactiae to human laminin // Infect. Immun., 1999, 67, P: 871-878.

141. Spiess C., Beil A., and Ehrmann M. A temperature-dependent switchfrom chaperone to protease in a widely conserved heat shock protein // Cell. 1999. № 97. P:339-347.

142. St. Gerne J. W. Ill and Grass S. Secretion of the Haemophilus influenzae HMW1 and HMW2 adhesins involves a periplasmic intermediate and requires the HMWB and HMWC proteins // Mol. Microbiol. 1998. № 27. P:617-630.

143. Stoll B.J., Schuchat A. Maternal carriage of group B streptococci in developing countries // Pediatr. Infect. Dis. J. 1998. V. 17. P: 499-503.

144. Strus M, Pawlik D, Brzychczy-Wloch M et al. Group B streptococcus colonization of pregnant women and their children observed on obstetric and neonatal wards of the University Hospital in Krakow, Poland // J Med Microbiol. 2009. V. 58. P: 228-233.

145. Suvorov A.N., Ferretti J J. Construction of a GBS-GAS DNA subtraction library allows discovery of previously unidentified GBS genes and rapid location of unique regions on the GBS chromosome // J. Basic Microbiol. 2004. - 2. - P: 64-74.

146. Suvorov A., Grabovskaja K., Savicheva A. and others. Determination of group B streptococcal genes encoding putative adherence factors in GBS clinical strains // International Congress Series 1289. 2006. - P: 227-230.

147. Takahashi S. et al. Capsular sialic acid limits C5a production on type III group B streptococci // Infect Immun. 1999. V. 67. P: 1866-1870.

148. Tazi A., Disson O., Bellais S. et al. The surface protein HvgA mediates group B streptococcus hypervirulence and meningeal tropism in neonates // J. Exp. Med. 2010. V. 207. № 11. P: 2313-2322.

149. Teixeira C.F. et al. Cytochemical study of Streptococcus agalactiae and macrophage interaction//Microsc. Res. Tech. 2001. V. 54. P: 254-259.

150. Tenenbaum T. et al. Streptococcus agalactiae invasion of human brain microvascular endothelial cells is promoted by the lamininbinding protein Lmb // Microbes Infect. 2007. V. 9. P: 714-720.

151. Terao Y. et al. Multifunctional glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of Streptococcus pyogenes is essential for evasion from neutrophils // J Biol Chem. 2006. V. 281. P: 14215-14223.

152. Tinker JK, Davis CT, Arlian BM. Purification and characterization of Yersinia enterocolitica and Yersinia pestis LcrV-cholera toxin A(2)/B chimeras // Protein Expr Purif. 2010. V. 74. № 1. P: 16-23.

153. Tobias J, Sveimerholm AM, Holmgren J et al. Construction and expression of immunogenic hybrid enterotoxigenic Escherichia coli CFA/I and CS2 colonization fimbriae for use in vaccines // Appl Microbiol Biotechnol. 2010. V. 87. № 4. P: 13551365.

154. Vorobieva E.I., Meringova L.F., Leontieva G.F. et al. Analysis of recombinant group B streptococcal protein ScaAB and evoluation of its immunogenicity // Folia Microbiol (Praha). 2005. V. 50, № 2. P: 172-176.

155. Wessels M.R. et al Isolation and characterization of type IV group B Streptococcus capsular polysaccharide // Infect Immun. 1989. 57. 49. P: 1089-1094.

156. Wessels MR et al. Immunogenicity in animals of a polysaccharide-protein conjugate vaccine against type III group B Streptococcus // J Clin Invest. 1990. V. 86, № 5. P: 1428-1433.

157. Wu G, Hong Y, Guo A et al. A chimeric protein that functions as both an anthrax dual-target antitoxin and a trivalent vaccine // Antimicrob Agents Chemother. 2010. V. 54. № 11. P: 4750-4757.

158. Xue G, Yu L, Li S, Shen X. Intranasal immunization with GBS surface protein Sip and ScpB induces specific mucosal and systemic immune responses in mice // FEMS Immunol Med Microbiol. 2010. V. 58, № 2. P: 202-210.

159. Xue X, Ding F, Zhang Q et al. Stability and potency of the Plasmodium falciparum MSP1-19/AMA-1(III) chimeric vaccine candidate with Montanide ISA720 adjuvant//Vaccine. 2010. V. 28. № 18. P: 3152-3158.

160. Yang HH, Mascuch SJ, Madoff LC and Paoletti LC. Recombinant group B Streptococcus alpha-like protein 3 is an effective immunogen and carrier protein // Clin Vaccine Immunol. 2008. V. 15, № 7. P: 1035-1041.

161. Zhong W, Skwarczynski M and Toth I. Development of Conformational Mimetics of Conserved Streptococcus Pyogenes Minimal Epitope as Vaccine Candidates // Current Drug Delivery. 2009. V. 6, № 5. P: 520-527.

Информация о работе

Дуплик, Надежда Владленовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Поверхностные сериновые протеазы SCPB и CSPA в качестве кандидатов для создания вакцин против Streptococcus Agalactiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы