Доменная организация IgA1-специфичной протеазы Neisseria meningitidis

Казеева, Тамара Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Доменная организация IgA1-специфичной протеазы Neisseria meningitidis
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Доменная организация IgA1-специфичной протеазы Neisseria meningitidis"

На правах рукописи

0G3448905

КАЗЕЕВА Тамара Николаевна

ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ IgAl-СПЕЦИФИЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ NEISSERIA MENINGITIDIS

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 он

т ¿cm

Москва - 2008

003448905

Работа выполнена во временном научном коллективе «Биохимия мышц» Института биохимии им А.Н Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук А.Б. Шевелев

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, проф. Л.Д. Румш кандидат биологических наук A.B. Жердев

Ведущая организация:

Химический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 30 октября 2008 г. в 14 ч 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002 247.01 при Институте биохимии им А.Н Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д 33, корп. 1.

Автореферат разослан «Z&» сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к*1

кандидат биологических наук / А Ф Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность_проблемы. Протеазы, расщепляющие

иммуноглобулины A1 (IgAl) человека, представляют собой высокоспецифичные ферменты, действующие на строго определенные пептидные связи в шарнирном регионе субстрата. Продукция IgAl-протеаз характерна для таких удаленных в систематическом отношении бактериальных патогенов человека, как Neisseria meningitidis, N gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, S. sanguis, которые вызывают у человека ряд опасных заболеваний: менингит, синусит, отит, бронхит, пневмонию, венерические заболевания и др. Ряд косвенных данных позволяет рассматривать эти ферменты в качестве одного из факторов патогенности микроорганизмов (Mistry et. al, 2006) Общепринятой является точка зрения, что их роль сводится к расщеплению секреторных IgAl, которые в больших количествах присутствуют на слизистых оболочках и обеспечивают первую линию защиты от бактериальных патогенов. Деградация антител IgAl-протеазами, таким образом, ослабляет иммунитет слизистых, что приводит к адгезии бактерий на стенках эпителия и колонизации ими слизистых. Однако активность IgAl-протеаз была экспериментально выявлена в таких биологических средах, как кровь, цереброспинальная жидкость и др., взятых от пациентов с соответствующими заболеваниями, что не позволяет рассматривать расщепление секреторных антител в качестве единственной функции этих ферментов (Vitovski et. al., 2002).

Работа по исследованию IgAl-протеаз осложнена, в первую очередь, отсутствием эффективных подходов, позволяющих получать функционально активный фермент в необходимом количестве. В результате до настоящего времени не установлена пространственная структура ферментов данного типа. Выделение IgAl-протеаз из природных источников связано с рядом трудностей: работа с патогенными микроорганизмами, подбор сред сложного состава для их культивирования, низкий уровень продукции фермента. Таким образом, для изучения функций IgAl-протеаз в патогенезе, особенностей фермент-субстратных взаимодействий и разработки эффективных ингибиторов требуется создание рекомбинантных продуцентов, позволяющих получать достаточные количества фермента и его мутантных производных. Однако эта техническая проблема до настоящего времени остается нерешенной

субстрата. Эта гипотеза имеет теоретическую значимость, позволяя планировать эксперименты в области изучения ферментативной кинетики и субстратной специфичности IgAl-протеаз Она важна и с точки зрения разработки ингибитора этих ферментов, который традиционно рассматривается в качестве перспективного агента для терапии перечисленных бактериальных инфекций. Наконец, расчленение IgAl-протеазы на изолированные домены могло бы оказаться удобным средством для создания рекомбинантных продуцентов фермента в условиях, когда продукция полноразмерного фермента в существующих системах экспрессии затруднена.

Цель и задачи исследования. В качестве цели работы рассматривалась экспериментальная проверка впервые выдвинутой нами гипотезы о двухдоменной организации сериновых IgAl-протеаз на примере фермента из N. meningitidis, что обусловливает наличие в их структуре двух центров взаимодействия с субстратом: каталитического и некаталитического субстрат-связывающего.

В экспериментальные задачи работы входило:

1 Определение границ предполагаемых каталитического и некаталитического субстрат-связывающего доменов путем сопоставления аминокислотных последовательностей различных сериновых протеаз и IgAl-протеазы менингококка; клонирование выбранных фрагментов генов, соответствующих доменам, с помощью ПЦР и разработка систем экспрессии рекомбинантных белков в Е. coll.

2. Разработка систем очистки и ренатурации полученных белков-доменов.

3. Изучение субстратной специфичности изолированного каталитического домена и сопоставление показанной активности с активностью нативного фермента из культуральной жидкости менингококка.

4. Разработка критериев оценки выхода нативного продукта при ренатурации изолированного некаталитического субстрат-связывающего домена

5. Изучение специфичности и аффинности распознавания белков-лигандов изолированным некаталитическим субстрат-связывающим доменом.

Научная новизна и практическая значимость работы1. В рамках данной работы впервые выдвинуто предположение о существовании у IgAl-

1 Список сокращений а о - аминокислотный остаток, БСА - бычий сывороточный альбумин, ДСН - додецилсульфат натрия, ДТТ - дитиотрейтол. КТД - каталитический домен, НСД - некаталитический субстрат-связываюший домен, ПЛАТ - полиакриламидиый гель; п н -пара иуклеотидов, тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ, ТХУ - трихлоруксусная кислота, Ig - иммуноглобулин, NCA - Na-карбонатный буфер, PBS - фосфатно-солевой буфер, PBSTw - фосфатно-солевой буфер с Твин-20, S-IgA - секреторный иммуноглобулин А

протеазы N. meningitidis как минимум двух доменов, выполняющих различные функции. N-концевая часть полипептидной цепи, включающая в себя типичный для сериновых протеаз каталитический сайт (VLGDSGSPLF), отвечает за протеолитическую активность фермента, формируя каталитический домен Другая же, большая С-концевая часть молекулы ответственна за специфичное распознавание и связывание субстрата (в виде IgA человека) - некаталитический субстрат-связывающий домен В ходе работы нам удалось осуществить раздельную экспрессию белков, моделирующих каждый из двух предполагаемых доменов, и исследовать их функциональную активность in vitro. Каталитический домен сохранил способность расщеплять IgAl человека - единственный природный субстрат полноразмерного фермента, обладающий высокой устойчивостью к протеолизу неспецифическими протеазами. Также была подтверждена способность С-концевого домена связывать IgA человека. Нам впервые удалось показать, что полученный белок образует комплексы как с сывороточными, так и секреторными IgA, причем аффинность в отношении IgA2 оказалась несколько выше, чем в отношении IgAl Обнаруженные свойства данного белка-домена позволят создать на его основе сорбенты для препаративного выделения IgA из природных источников, а также разработать высокоспецифичные иммунореагенты для детекции IgA в различных вариантах иммуноферментного анализа. Полученные данные о функциональных особенностях lgAI-протеазы в дальнейшем могут быть использованы при уточнении роли этого фермента в развитии менингококковой инфекции.

Положения, выносимые па защищу:

1. IgAl-протеаза N. meningitidis содержит два функциональных домена: каталитический и некаталитический субстрат-связывающий

2. Каталитический домен сохраняет способность к расщеплению IgAl человека - природного субстрата полноразмерного фермента

3. Изолированный некаталитаческий субстрат-связывающий домен обладает способностью к избирательному высокоаффинному связыванию сывороточных IgAl и IgA2 человека, а также секреторных IgA человека.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Biocatalysis - 2005: fundamentals and applications» (St.Petersburg, 2005); Юбилейных Научных Чтениях, посвященных 110-летию со дня рождения проф. Н.А.Преображенского (Москва, 2006) и 17-ом Европейском конгрессе «Clinical Microbiology and Infectious Diseases ICC», (Germany, Munich, 2007).

Публикации. По теме работы опубликовано 5 печатных работ (статей в рецензируемых журналах - 2, тезисов конференций - 3).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 151 страницах машинописного текста и включает 25 рисунков и 4 таблицы. Работа состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, который содержит 183 ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы н методы

1.1. Штаммы Е. coli и N. meningitidis. Векторные плазмиды. Клинические и биологические материалы. Для клонирования, получения плазмидной ДНК и получения биомассы рекомбинантных продуцентов использовался штамм Е. coli NM522 (thi, supE, F'proAB, lac\4 ZAM15)

Для экспрессии фрагментов гена IgAl-протеазы использовали вектор pQE30 (Invitrogen), несущий промотор фага Т5 и предназначенный для продукции белков с N-концевым 6His-TaroM. При экспрессии каталитического домена IgAl-протеазы в этот вектор дополнительно вводили полноразмерный ген зеленого флуоресцентного белка (ECFP1, Clontech, кат. № 6901-1), таким образом, чтобы на N-конце кодируемого белка оказывался 6His, а на 3'-конце открытой рамки считывания - ген предполагаемого каталитического домена IgAl-протеазы.

Штаммы М9 и А208 N meningitidis серогруппы А, вызвавшие эпидемические вспышки в 1979 и 1984 гг., получены из коллекции Государственного института стандартизации и контроля им. JI.A. Тарасевича РАМН. Геномная ДНК и культуральные жидкости этих штаммов, обладающие активностью IgAl-протеазы, предоставлены Государственным научным центром промышленной микробиологии (г. Оболенск, Московская область).

Использовались образцы плазмы крови больных миеломой, обогащенные моноклональными IgAl или IgA2 (Гематологический научный центр им. А.А. Богданова РАМН), и плазмы крови здоровых доноров (МГЦ «СПИД»)

1.2. Получение биомассы рекомбинантных продуцентов на базе Е. coli. Для получения рекомбинантных белков в виде телец включения использовали посевной материал, представляющий собой смыв колоний с чашек Петри после трансформации. Клеточную суспензию, полученную с одной 90 мм чашки, вносили в две колбы Эрленмейера (750 мл), содержащие 30 мл среды LBS (10 г/л пептон (Difco), 5 г/л дрожжевой экстракт (Difco), 20 г/л NaCl, 100 мг/л ампициллин) и инкубировали в течение 9 часов при аэрации со скоростью 250 g при 30°С. Выращенную биомассу собирали центрифугированием, клетки ресуспендировапи в 40 мМ буфере Трис-НС1, рН 8.0, охлаждали до 0°С и проводили многократную дезинтеграцию с помощью ультразвукового диспергатора, не допуская нагревания свыше

15°С. Тельца включения отделяли от растворимых клеточных белков центрифугированием при 1500 g и хранили при -20°С.

1.3. Очистка it ренатурация белков

1.3.1. Солюбилизация телец включения некаталитического субстрат-связывающего домена (белок Q-M2B) в окислительных условиях - сульфирование). Сульфирование препарата телец включения белка Q-M2B общей массой 2 г проводили смесыо реагентов, состоящей из 50 мМ безводного бисульфита натрия (NaHS03) и 50 мМ тетратионата калия (K206S4) с добавлением сухой мочевины до 8 М. Солюбилизацию телец включения проводили в течение 12 часов при 37°С в общем объеме реакционной смеси 10 мл, используя в качестве буферного раствора 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0. Выход сульфированного препарата после отделения нерастворимого осадка оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях.

1.3.2. Солшбилизация телец включения каталитического домена (белок QG-A2C) в восстановительных условиях. В качестве исходного материала для дальнейшей очистки и ренатурации белка QG-A2C служил препарат телец включения. В одном эксперименте использовали 20 мг данного препарата, солюбилизируя его в растворе 8 М мочевины в присутствии 50 мМ ß-меркаптоэтанола. Объем реакционной смеси доводили дистиллированной водой до 10 мл и инкубировали на микробиологической качалке в течение 2-6 часов при комнатной температуре

1.3.3. Анионообменная хроматография белков на DEAE Toyo Pearl в денатурирующих условиях. Хроматографическую колонку Pharmacia с двумя адаптерами (высота 50 см, объем 50 мл) уравновешивали, пропуская 50 мл исходного буфера Трис-HCl, pH 8.8, для белка Q-M2B, либо pH 8.2 для QG-A2C. После этого наносили целевой белок в объеме 50-250 мл раствора с конечной концентрацией мочевины в нем 4Mb буфере того же состава, которым уравновешивали колонку. Элюцию связавшегося на колонке материала проводили, подавая на нее градиент NaCl в буфере для нанесения от 0 до 1 М Профиль хроматографии регистрировали, измеряя А280 с помощью проточного ультрафиолетового детектора. Для фракций, по данным определения А280 содержащих значительные количества сухого вещества, при помощи денатурирующего электрофореза в ПААГ исследовали качественный состав белков. При необходимости собранные фракции, содержащие очищенные рекомбинантные белки в денатурированной форме, концентрировали в 2-10 раз с помощью центрифужного ультрафильтрационного патрона Tosoho с пределом пропускания 10 кДа.

1.3.4. Подбор условий ренатурации белков методом разбавления. К

апиквотам белка, очищенного хроматографией в денатурирующих условиях, с концентрацией 2—3 мг/мл, объемом 500 мкл каждая прибавляли равный объем одного из 15 буферов из панели, рекомендованных Athenaes Protein Refolding Manual. Непосредственно перед использованием в каждый из буферов добавляли свежеприготовленный раствор восстановителя - ДТТ или восстановленного глутатиона - до конечной концентрации 2 мМ. Разбавленные таким образом аликвоты белка инкубировали в течение 1В ч при 4°С, после чего отделяли агрегировавший белок центрифугированием на настольной центрифуге при 8000 g в течение 20 мин. Выход ренатурации предварительно оценивали как долю белка, оставшегося в растворе по окончании описанной процедуры.

1.4. Изучение активности белка QG-A2C методом Вестерн-блоттинга. Электрофоретическому разделению в ПААГ подвергались аликвоты образцов общим объемом 300 мкл каждая, содержащие 40 мкг IgAl в составе плазмы миеломного больного, 30 мкл ренатурированного белка QG-A2C (содержание общего белка 0.7 мкг) либо культуральной жидкости менингококка того же объема и 270 мкл PBS (10 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCl, рН 7.4) В качестве отрицательного контроля использовали необработанную ферментами плазму. Для проведения протеолитической реакции образцы инкубировали при 30°С в течение 24 часов, после чего вносили в каждую лунку ТХУ до конечной концентрации 7% с целью остановки реакции и осаждения белков. Для обессоливания сформировавшиеся осадки промывали 50% водным ацетоном.

Осажденные и высушенные образцы белков солюбилизировапи в денатурирующих условиях в буфере Лэммли (100 мМ Трис-глицин, 1% ДСН, 0.01% бромфеноловый синий, рН 8.6), содержащем или не содержащем восстановитель (100 мМ p-меркаптоэтанол). Для проведения одного электрофоретического теста использовали 1/5 объема реакционной смеси, описанной в предыдущем абзаце: содержание IgA без учета потерь - 8 мкг на одну дорожку.

Полусухой перенос разделенных в ПААГ рекомбинантных белков на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли в течение 2.5 ч при плотности тока 1.3мА/см2 поверхности мембраны. Перенесенные на мембрану белки окрашивали в растворе 1% PonceauS, приготовленного на 10% уксусной кислоте, в течение 1-3 мин при покачивании. Для удаления фона обесцвечивали мембрану, промывая ее в нескольких сменах воды; расположение полос молекулярно-массового стандарта отмечали карандашом. Далее оставляли мембрану в растворе для блокирования неспецифической сорбции (1% БСА, приготовленный на PBS) при покачивании в течение 60 мин при 25°С. В случае электрофореза в восстанавливающих условиях визуализацию фрагментов IgA на мембране осуществляли при помощи антивидового пероксидазного конъюгата против

а-цепей Ig человека pGAH-Iaa (ЗАО «Имтек») в разведении Г1000. При электрофорезе в невосстанавливающих условиях для визуализации ожидаемых Fab фрагментов IgA использовали вторичные антитела против к/А.-цепей иммуноглобулинов человека, конъюгированных с пероксидазой хрена в разведении 1:1000 (ЗАО «Амеркард»). Реакцию с вторичными антителами проводили в течение 1 часа при комнатной температуре. Ферментативную реакцию на пероксидазу с образованием окрашенного нерастворимого продукта проводили в буфере PBS с использованием в качестве субстрата Г^ДЧ'-диаминобензидина в концентрации 20 мкг/мл и Н202 в концентрации 0.03%. Реакцию останавливали, перенося мембрану в раствор 10% уксусной кислоты.

1.5. Получение препарата S-IgA. В качестве источника S-IgA служили образцы слюны четырех здоровых доноров по 2 5 мл каждого. Собранный материал разбавляли в два раза PBS, центрифугировали при 12 000g в течение 30 мин. Супернатант собирали и осаждали IgA высаливанием (NH4)2S04, доводя его концентрацию до 50% от насыщения. Осадок собирали центрифугированием и растворяли в 0.5 мл PBS. Полученный препарат анализировали с помощью ДСН-ПААГ. Концентрацию белка в образцах определяли с помощью модифицированного метода Лоури с бицинхониновым реагентом.

1.6. Твердофазный нммуноферментный анализ (тИФА)

использовался для исследования Ig-связывающей способности белка Q-M2B: 1) при оценке эффективности его ренатурации и 2) для определения его сродства к различным природным белкам-лигандам. В качестве источника Ig служили плазмы больных миеломой, содержащие моноклональные IgAl или IgA2; суммарные иммуноглобулины плазмы кролика; частично обогащенные S-IgA препараты слюны человека и очищенные до гомогенности IgA2, IgG и IgM человека, предоставленные ЗАО «Имтек».

Ренатурированный Q-M2B сорбировали на полистироловые 96-луночные плоскодонные планшеты (Costar) средней сорбционной емкости Для этого раствор белка с концентрацией 10 мкг/мл в буфере NCA (100 мМ карбонат-бикарбонат Na, pH 9.6) разносили в лунки по 100 мкл в каждую и инкубировали в течение 12 ч при +4"С. Далее вносили раствор для блокирования неспецифической сорбции (1% БСА в буфере NCA) в количестве 100 мкл в каждую лунку и инкубировали 60 мин на шейкере Biosan при +20°С. Промывали лунки несколько раз PBSTw (10 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCl pH 7.4, 0 05% Твин-20). Для исследования связывающей способности Q-M2B в отношении выбранного лиганда изготавливали серию разведений препарата, содержащего данный лиганд, в буфере PBS в 7 лунках 8-луночного ряда планшета с сорбированным ранее Q-M2B. Концентрация общего белка в первой точке составляла 20 мг/мл, в последней - 0 027 мг/мл. Титрование проводили с шагом 3 раза так, что в последнюю лунку каждого

8-луночного ряда лиганд не вносился, что позволяло определить фоновый сигнал, величина А4д2 которого вычиталась из абсолютных величин А4щ экспериментальных точек.

В некоторых экспериментах наряду с источником Ig-лиганда в реакционную смесь вносили разведенную 1:1000 плазму здорового донора, белки которой служили в качестве конкурента при взаимодействии целевого субстрата с Q-M2B. В этом случае разведенная плазма заменяла буфер PBS и вносилась во все лунки с серийными разведениями Ig в одинаковой концентрации.

Для связывания лиганда с сорбированным белком Q-M2B планшет инкубировали 60 мин на шейкере при +20°С, после чего трижды отмывали PBSTw. Для визуализации связывания лигандов на подложке использовались вторичные антитела различных типов, конъюгированные с пероксидазой хрена (ЗАО «Имтек»,). Их вносили во все лунки ряда планшета, включая последнюю, в стандартном разведении 1:1000 в буфере PBS. Для выявления сывороточных IgAl и IgA2, а также S-IgA использовали козьи поликлональные антитела против а-цепей Ig человека (pGAH-Iaa), IgM -кроличьи антитела против ц-цепей Ig человека (pRAH-Imm), IgG - кроличьи антитела против суммарных иммуноглобулинов человека (pRAH-Iss), Ig кролика - козьи антитела против суммарных Ig кролика (pGARI) Инкубировали 60 мин на шейкере при +20°С, после чего трижды отмывали PBSTw и добавляли субстратный буфер (0.01 % ортофениленднамин, 0.01% Н202, 40 мМ Na-цитрат, рН 4.7), который готовили непосредственно перед применением и вносили в количестве 100 мкл в каждую лунку. Через 15 минут после внесения субстратного буфера реакцию останавливали внесением 10% H2S04 объемом 30 мкл в лунку. А4д2 измеряли с помощью планшетного ридера (Multiscan). По показаниям прибора строили графические зависимости А492 (ось Y) от степени разведения субстрата, которой соответствовала определенная его концентрация (ось X)

2. Результаты исследования и их обсуждение

2.1. Схема эксперимента по получению изолированных доменов IgAl-специфичной протеазы с помощью рекомбннантных продуцентов на основе Е. coli. IgAl-протеаза N. meningitidis принадлежит к классу сериновых протеаз (клан химотрипсина) и имеет размер предшественника 180 кДа, в том числе зрелый фермент 105 кДа и С-концевой секреторный домен 75 кДа. Поскольку типичная молекулярная масса сериновых протеаз самого различного происхождения находится в диапазоне от 20 до 30 кДа, и лишь сложно регулируемые ферменты этого типа, например, плазмин, имеют больший размер, возникает вопрос о функциональной роли той части полипептидной цепи IgAl-протеазы, которая выходит за пределы необходимой для проявления каталитической активности.

При сопоставлении последовательности IgAl-протеазы менингококка с другими протеазами клана химотрипсина удалось установить отдаленное

сходство структуры N-концевой части молекулы фермента с последовательностью зрелого калликрепна 1 человека (236 а.о.) Выравнивание последовательностей калликрепна и IgAl-протеазы менингококка позволило выявить ключевой остаток каталитического центра сериновых протеаз - Serl95 по адресации химотрипсина. При этом вся последовательность калликрепна по профилю гидрофобности совпала с N-концевой частью зрелой IgAl-специфичной протеазы. Принимая во внимание тот факт, что ключевые остатки каталитического центра IgAl-протеазы (VLGDSGSPLF) сосредоточены вблизи N-конца зрелого пептида, членение аминокислотной последовательности IgAl-протеазы было проведено на фрагменты 29 и 85 кДа. Таким образом, в рамках экспериментальной проверки выдвинутой гипотезы о двухдоменноп организации IgAl-протеазы N meningitidis на первом этапе нашей работы были приблизительно определены границы аминокислотных последовательностей предполагаемых каталитического (КТД) и некаталитического субстрат-связывающего доменов (НСД).

Следующим этапом работы стало клонирование фрагментов генов IgAl-протеазы N. meningitidis, соответствующих установленным границам КТД и НСД. Поскольку в нашем распоряжении не имелось клонированного гена полноразмерной IgAl-протеазы менингококка, для получения обозначенных последовательностей использовали геномную ДНК штаммов N. meningitidis М9 и А208, изолированных на территории нашей страны во время эпидемических вспышек

Для ПЦР-амплификации целевых фрагментов были разработаны олигонуклеотидные праймеры на наиболее консервативные участки последовательностей IgAl-протеаз различных серогрупп, находящиеся вблизи предполагаемых границ доменов. Это условие диктовалось необходимостью учета полиморфизма генов IgAl-протеаз из различных источников, который мог осложнить проведение ПЦР при работе со штаммами, не подвергавшимися прежде генотипированию.

Следует отметить, что амплифицируемые фрагменты гена IgAl-протеазы, соответствующие КТД и НСД, перекрывались на 54 п.н. Таким образом, на N-конце НСД в качестве пептидного линкера оказывался небольшой фрагмент КТД (<18 а о.). Это решение было принято, поскольку примененный метод давал лишь оценочные представления о расположении С-конца КТД, а приобретение доменом компактной структуры кооперативно и, как правило, возможно лишь при наличии всех составляющих его а.о.

Участок гена IgAl-протеазы, соответствующий НСД длиной 2110 п.н., был получен в результате ПЦР на матрице геномной ДНК штамма N. meningitidis М9 (серогруппа А) с использованием праймеров IgA2dop (Ватт) 5' - GG GGA ТСС TAC GAT TAT TGG GCAGGC TA - 3' и IgA2rev (Sali) 5' - GAT GTC GAC TCG GCG GCG GTT CTC GGC ATA AGG AT - 3' Фрагмент гена, соответствующий КТД длиной 786 п.н , получали на базе геномной ДНК штамма N. meningitidis А208 (серогруппа А) с

использованием праймеров IgA2for (ВатНГ) 5' - ATT GGA ТСС TAC ТСА GAA GCG GCA TTG GTC AGA GA - 3' и IgA2dom {Salí) 5' - GAT GTC GAC TTA АТС GCG TTG ТТГ GAT TTC AT- 3'. ПЦР проводилась при следующих параметрах: 94°С -30", 58°С - 30", 72°С - 60", 30 циклов при концентрации геномной ДНК в смеси 0.01 мкг/мкл. Используя введенные в составе праймеров сайты рестриктаз ВатШ и Sail, оба продукта ПЦР вводили в экспрессионный вектор pQE-30 В случае фрагмента, соответствующего КТД, в сайт вектора ВатШ вводили дополнительно ген GFP, полученный в форме продукта ПЦР, и несущий на флангах сайты ВатШ и Bglll соответственно. В результате были получены экспрессионные конструкции PQG-A2C (КТД) и pQ-M2B (НСД), дизайн которых представлен на рис. 1.

а.

' Полноразмерная IgAl-протеаза

Serj244

КТД

ССД - 685 а.о.

б.

BamHI

2110 п.н.

6His

Sa:

PQ-M2B

__~~3amHI

AAAGAGGAGAAATTAACT ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC

Я Я

праймер IgA2dop

TAC GAT TAT TGG GCA GGC TAT CAA AAA AAC TCT TGG CAA GAA TGG AAT W A G Y О К

D В.

N ...

Q К N S W Q Полноразмерная IgAl-протеаза 847 а о

Ser244

КТД - 262 а о.

Р-

-ссд-СИ

ВатШ

Sali

GFP 750 п.н. 786 п н.

Т5 пр 6His

PQG-A2C

г.

GFP (BglII/DamliI) праймер lgA2for

gac gag ctg tac aag ада tcc tea gaa geg gca ttg gtc aga gac ggt gtc DELYKKSSEAALVRDGV

Рис. 1. Дизайн экспрессиопиых конструкций pQ-M2B (а) и pQG-A2C (в) для получения изолированных белков НСД и КТД соответственно. В пунктах б и г приведены фрагменты конструкций, соответствующие N-концевым участкам последовательностей IgA 1 -протеазы.

Путем введения pQ-M2B и pQG-A2C в штамм Е. coli NM522 были получены продуценты соответствующих белков. Следует отметить, что продукт конструкции pQG-A2C представлял собой химеру, где в качестве N-концевого компонента выступал зеленый флуоресцирующий белок (green fluorescent protein-GFP). Целью введения этого элемента являлось улучшение продукции белка клетками Е. coli на стадии трансляции Кроме того, оба рекомбинантных производных гена IgAl-протеазы - Q-M2B и QG-A2C -содержали на N-конце последовательность из б а.о. His.

Для препаративной наработки белков Q-M2B и QG-A2C осуществлялась стандартная ферментация в 24 колбах Эрленмейера (750 мл) по 30 мл среды LBS в каждой, в результате чего удавалось собрать 5 г влажной биомассы. Целевой продукт выделяли исключительно из нерастворимой клеточной фракции (телец включений). Изначально наличие целевого продукта в пробе визуализировали с помощью ДСН-ПААГ, где целевые белки мигрировали в соответствие с ожидаемой молекулярной массой: 85 кДа для Q-M2B и 54 кДа для QG-A2C. Стоит отметить, что выбор экспрессии в виде телец включения обеспечил высокую воспроизводимость выхода продукта и его стабильность при хранении в концентрированном состоянии. В готовом препарате телец включения доля целевого белка составляет 50-70% от массы общего. Для оценки выхода рекомбинантного продукта, содержание белка в полученных препаратах телец включения измеряли по модифицированному методу Лоури с бицинхониновым реагентом. Было определено, что максимально возможный выход за один цикл ферментации для белка QG-A2C составляет 30 мг (40 мг с 1 л культуры), для Q-M2B - 50 мг (70 мг с л культуры).

2.2. Получение и очистка рекомбинантных белков в активной форме. Для солюбилизации телец включения Q-M2B нами была применена оригинальная методика размыкания дисульфидных связей в окислительных условиях с помощью сульфитолиза, уравнение реакции которого приведено на рис. 2.

R-S-S-R bQi » R-S-SO", + R-S" \_[Ol_|

Puc. 2. Реакция сульфитолиза

Данный подход позволяет повысить степень извлечения белка, т.к. наряду с обработкой мочевиной происходит химическая реакция разрыва дисульфидных связей; образующийся при этом S-сульфонат обладает большей растворимостью и стабильностью по сравнению с полностью восстановленным белковым производным, так как не вступает в спонтанную реакцию с кислородом воздуха; в ходе ренатурации сульфонатные группы могут быть удалены за счет реакции с сульфгидрильным восстанавливающим агентом.

Сульфирование телец включения Q-M2B проводили как указано в Материалах и методах. В отличие от Q-M2B разрушение дисульфидных связей белка QG-A2C проводили традиционным способом, используя органические меркаптаны для восстановления дисульфидных связей.

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что обязательным условием очистки рекомбинантного белка, обеспечивающим высокий выход и воспроизводимость последующей ренатурации, является удаление примесей нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) с помощью хроматографической очистки в денатурирующих условиях, что обеспечивает высокий выход и воспроизводимость последующей ренатурации. В качестве сорбента в ходе хроматографии использовали анионообменную смолу DEAE Toyo Pearl (Toyo Soda Corporation), уравновешенную буфером Трис-НС1 (pH 8 8 или 8.2). Элюцию связавшегося белка Q-M2B (либо QG-A2C) восходящим градиентом NaCl проводили общим объемом буфера 200 мл, разбивая элюат на 20 фракций по 10 мл. В типичных экспериментах целевой продукт находился в нескольких фракциях и суммарный выход белка составлял 50-7-100 мг. Содержание целевого белка в отобранных препаратах определяли визуально с помощью ДСН-ПААГ. Фракции с наибольшим содержанием продукта (не менее 80%) объединяли и использовали в качестве исходного материала для отработки методики ренатурации.

Полученные после хроматографии растворы рекомбинантных белков QG-A2C в восстановленной форме и Q-M2B в форме сульфонатного производного с концентрацией белка -2.5 мг/мл в буфере с содержанием мочевины 4 М использовали в качестве исходного материала для ренатурации В ходе подбора оптимального состава ренатурационного буфера каждую аликвоту раствора белка разбавляли в 2 раза одним из 15 предложенных буферов, содержащих свежеприготовленный ДТТ в количестве 2 мМ, который использовали в качестве восстановителя. Целью эксперимента являлся подбор условий, при которых потери белка за счет агрегации минимальны. Для оценки выхода растворимого белка

использовали метод Лоури и, дополнительно, электрофорез в ДСН-ПААГ. Исходя из полученных данных, была отобрана серия буферов - №1, №3, №9, №11, №13, №15. которые обеспечивали высокий выход водорастворимого белка. В качестве примера приведена электрофореграмма с белками, растворенными в буфере №9 (рис. 3).

{2-М2В

кДа

66.2 - (Ж-А2С

45 Ы |

25 18.4

1 2 3

Рис. 3. Электрофореграмма в 12.5% денатурирующем ПААГ, окрашенная Кумасси-Я250. На дорожки геля нанесены:

1. стандарт молекулярной массы;

2. ренатурированный ()-М2В;

3. ренатурированный £)С-А2С.

На основании анализа результатов ренатурации для дальнейшего исследования был выбран препарат (}С-А2С, полученный с помощью буфера №9.

2.3. Изучение протеолитнческой активности белка (2С-А2С в отношении человека. Получение белка (2С-А2С в ренатурированном

состоянии позволило перейти к экспериментам по изучению его протеолитнческой активности. Поскольку для оценки активности ^А1-протеазы до настоящего времени не разработано синтетических хромогенных производных пептидов, в качестве модели был выбран естественный субстрат — ^А1 человека. Предполагалось, что специфичность их расщепления рекомбинантным белком (^0-А2С может претерпеть большие или меньшие изменения по сравнению с полноразмерным ферментом. Исходя из этого, в ходе эксперимента по тестированию белка мы стремилась использовать методы, позволяющие не только визуализировать факт наличия у полученного продукта протеолитнческой активности, но и с максимальной точностью установить точки атаки субстрата, что позволило бы судить об

изменении его субстратной специфичности по сравнению с природным ферментом. В качестве субстрата использовали плазму больного миеломой, обогащенную IgAl. Ферментативную реакцию QG-A2C с IgAl человека проводили в объеме 300 мкл в буфере PBS (рН 7.4). Контролем служила культуральная жидкость штамма А208 N. meningitidis, содержание фермента в которой было неизвестно. Для более полного анализа работы рекомбинантного фермента продукты расщепления разделяли в ПААГ двумя способами: с восстановлением и без восстановления дисульфидных связей в субстрате.

Электрофорез в восстанавливающих условиях проводили с использованием в качестве восстановителя |3-меркаптоэтанола. После переноса белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану визуализировали продукты с помощью Вестерн-блоттинга согласно схеме, описанной в Материалах и методах. Итоги эксперимента представлены на рис. 4.

а-иепь IgAl Fc-фрагмент IgAl

кДа б«.:

\ • «ВД^

Рис. 4. Анализ продуктов расщепления IgAl белком QG-A2C. Разделение в 12.5% ПААГ в присутствии восстановителя. Мембрана окрашена вторичными антителами против а-цепей Ig человека, конъюгированными с пероксидазой. На дорожки геля нанесены: 1) маркер молекулярной массы; 2) нативный IgAl (в составе плазмы больного миеломой); 3) IgAl человека после расщепления QG-A2C; 4) IgAl человека после расщепления ферментами культуральной жидкости N. meningitidis А208.

На основании полученных данных можно заключить, что при расщеплении IgAl рекомбинантным ферментом и природной протеазой, наблюдается образование сходных фрагментов, предположительно соответствующих Fc-фрагменту IgAl человека с молекулярной массой около 30 кДа. Контроль интактных IgAl при окрашивании конъюгатом визуализируется полосой около 47 кДа, что соответствует ожидаемой массе

тяжелой цепи (а) с учетом гликозилирования. Эксперимент не выявил дополнительных точек расщепления а.-цепи 1»А несмотря на то, что время проведения реакции позволило достигнуть полного исчерпания субстрата. Конкуренция со стороны неспецифических белков плазмы человека не привела к подавлению активности рекомбинантного белка.

Для изучения структуры РаЬ-фрагментов, образующихся в ходе описанной протеолитической реакции белка <3-М2В с ^А1 человека была применена альтернативная схема визуализации продуктов: подготовку образцов перед разделением в ДСН-ПААГ проводили в невосстанавливающих условиях, а специфическое окрашивание перенесенных на мембрану фрагментов 1"А1 визуализировали с использованием вторичных антител против ХУк-цепей человека, конъюгированных с пероксидазой (рис. 5).

Двухвалентный Fab

' IgA

Одновалентный Fab

Полноразмерные I«A

45 35

Натнвная легкая ишь

1S.4 •—:

12 3 4

Рис. 5. Анализ продуктов расщепления IgAl белком QG-A2C. Разделение в 12.5% ПААГ в отсутствие восстановителя. Мембрана окрашена вторичными антителами против Х/к-цепей lg человека. На дорожки геля нанесены: 1) стандарт молекулярной массы; 2) субстрат, расщепленный QG-A2C; 3) субстрат, расщепленный ферментами в составе культуралъной жидкости N. meningitidis А208; 4) нашивные IgA1 (в составе плазмы больного миеломой).

На основании анализа результатов экспериментов, проведенных по двум различным схемам, можно высказать несколько предположений относительно взаимодействия КТД с IgAl человека:

1. Активность КТД уступает активности природного фермента, поскольку на рис. 5 можно видеть значительное количество нерасщепленных высокомолекулярных Ig, идущих в виде двух или более полос с различающейся молекулярной массой.

2. При обработке субстрата ферментом культуральной жидкости

менингококка единственным иммуноположительным продуктом оказывается полоса размером около 50 кДа, предположительно соответствующая моновалентному РаЬ-фрагменту (УН+СНа1-фрагмент а-цепи соединенный дисульфидной связью с легкой цепью в составе У[+Сь.доменов). Напротив, масса основного продукта расщепления (20-А2С около 105 кДа, что по размеру может соответствовать бивалентному РаЬ-фрагменту в составе двух УН+СНа1-фрагментов а-цепи соединенных между собой дисульфидной связью, каждый из которых несет связанную легкую цепь в составе доменов. Такой результат может быть достигнут при небольшом смещении сайта расщепления а-цепи в сторону С-конца молекулы иммуноглобулина, поскольку дисульфидная связь, соединяющая а-цепи находится в непосредственной близости к шарнирной области.

Таким образом, проведенные эксперименты показали наличие протеолитической активности у белка <30-А2С, что подтверждает гипотезу о локализации протеолитического домена в И-концевой части последовательности ^А1-протеазы менингококка. Результаты, приведенные на рис 5, можно объяснить, предположив, что для изолированного КТД сайт атаки ^А1 несколько смещен по сравнению с природным ферментом, хотя и остается в пределах главной шарнирной области ^А1 или в непосредственной близости от нее.

Предлагаемая модель расщепления 1«А1 белком СЮ-А2С представлена на рис. 6.

Рис. 6. Расположение сайтов расщепления в молекуле А1 природной 1цА1 -протеазой менингококка и белком ()С-А2С

Шарнирный регион

Сайт атаки в молекуле А1 природным ферментом из культуральной жидкости

менингококка, расположенный в шарнирном регионе. Расщепление приводит к образованию моновалентного РаЪ-фрагмента

Предполагаемый сайт атаки в молекуле А1 рекомбинантным (-А2С, расположенный к С-концу от дисульфидной связи, соединяющей а-цепи. Расщепление приводит к образованию бивалентного РаЬ-фрагмента

2.4. Изучение IgA-связывающей активности белка Q-M2B.

2.4.1. Оценка выхода ренатурации препарата Q-M2B методом тИФА. В отличие от ренатурированного белка QG-A2C, у белка Q-M2B не предполагалось наличие протеолитической активности в отношении IgAl человека, которую можно было бы сравнить с активностью полноразмерного природного фермента и сделать вывод о функционировании полученного препарата. С целью исключения некорректных результатов при проведении экспериментов по изучению предполагаемой способности Q-M2B к аффинному связыванию с IgA человека, было принято решение о тестировании выхода нативного продукта. При проведении процедуры ренатурации необходимо учитывать, что водорастворимая фракция полученного препарата не всегда представлена полностью нативным белком, обладающим биологической активностью. Это связано с возможностью аберрантного фолдинга, дающего неактивный, но растворимый и устойчивый продукт. В связи с этим для выбора образца с наибольшим выходом нативного Q-M2B был проведен тИФА, где активность белка определялась как способность к специфичному связыванию IgA человека Для проведения эксперимента использовали серию ранее выбранных ренатурированных препаратов Q-M2B. На рис. 7 представлены графические зависимости оптической плотности (ось Y) при длине волны 492 нм от концентрации IgA в точке титрования (ось X).

1 8 1 6 1 4

IgA, мг/мл

Рис. 7. Оценка эффективности ренатурации ()-М2В методом тИФА Показано связывание белка ()-М2В с А человека в зависимости от выхода нативного продукта при ренатурации в различных буферах.

Анализируя полученные данные можно сделать вывод, что наибольший выход нативного белка, специфично связывающего ^А

Буфера для ренатурации

человека, достигается при использовании буферов №9 и №15. Так как данные буфера оказались одинаково эффективны, было принято решение о дальнейшем использовании только буфера №9.

2.4.2. Изучение связывающей способности белка ()-М2В в отношении природного субстрата - человека. Как описывалось ранее, белок (2-М2В представляет собой продукт экспрессии фрагмента гена специфичной протеазы менингококка группы А, патогенного штамма М9. Использованный для экспрессии фрагмент гена ща подобран таким образом, чтобы исключить из его состава предполагаемый каталитический (протеолитический) домен, располагающийся в И-концевой части полноразмерной ^А1-специфичной протеазы. Предполагалось, что естественной функцией некаталитического домена в составе протеазы является распознавание субстрата с целью своевременного раскрытия каталитического центра и предотвращения его конкурентного ингибирования неспецифическими пептидами. Поскольку естественным субстратом ^А1-протеазы менингококка является А1 человека, то в задачу входила экспериментальная проверка способности белка (2-М2В связывать ^А с высокой аффинностью. В качестве субстратов для связывания с С2-М2В мы использовали плазмы больных миеломой, обогащенные ^А1 или с

известной их концентрацией (20 мг/мл). Эксперимент был проведен согласно описанному в Материалах и методах тИФА На рис. 8 приведены графические зависимости оптической плотности при длине волны 492 нм (ось У) от концентрации субстрата в точке титрования (ось X).

плазма, ососашенная 0А2 ■ плазма сйогащенная 1дА1

20 667 2 22 0 74 0 25 0 082 0 027 1дА1 (1дА2), их/мл

Рис. 8. Оценка связывания ()-М2В с А1 и А2 в составе препаратов плазмы. На активированные ренатурированным в буфере №9 ()-М2В 8-ми луночные ряды подложки были нанесены препараты плазмы больных миеломой с определенной концентрацией /¿'Л7 (либо А2) в каждой точке разведения.

Как видно из представленных зависимостей, полученный белок Q-M2B обладает достаточно высокой аффинностью к IgA человека, что позволяет говорить о подтверждении выдвинутой нами теории о функциональной роли С-концевого домена IgAl-протеазы менингококка Однако достаточно неожиданным является тот факт, что аффинность по отношению к IgA2 значительно выше, чем к природному субстрату протеазы менингококка -IgA 1. Полученный результат, тем не менее, не противоречит описанным в литературе экспериментам по исследованию активности полноразмерной протеазы в присутствие различных субстратов. Так есть данные, что IgAl-протезы ингибируются биологическими жидкостями, обогащенными IgA2 (Plaut, 1983). Таким образом, связывание IgA2 с ферментом, не приводящее к расщеплению субстрата, может рассматриваться в качестве природного механизма с определенной функцией. В частности можно предположить, что образование данных комплексов IgA2-npoTea3a ш vivo может играть определенную роль в развитие менингококковой инфекции.

2.4.3. Изучение связывающей способности в отношении различных иммуноглобулинов. Проявление высокой связывающей активности белка Q-М2В в отношении IgA человека не исключает его взаимодействия с другими лигандами. Для проверки данного предположения был проведен тИФА согласно обычной схеме, где в качестве субстратов были выбраны очищенные препараты IgA2, IgG, IgM человека и иммуноглобулины кролика с известными концентрациями. Также был проведен тест на устойчивость связывающей способности Q-M2B к конкуренции со стороны различных белков плазмы крови человека, поскольку естественной средой при взаимодействии природной протеазы с IgA является именно эта биологическая жидкость. Разведенную 1:1000 плазму применяли в качестве буфера для нанесения IgA2.

IgG ■■■«- IgM

—lgA2 —x— 1дА2+конкурент

—ж— кроличьи Ig

1 ö

20 667 2 22 0 74 025 0082 0 027

Ig, ит/мл

Рис. 9. Оценка связывания белка (2-М2В с различными иммуноглобулинами. В качестве субстратов использовали

очищенные препараты 1^А2,

М человека и кролика.

Кривая «1^А2+конкурент»

получена при раститровке А2 в буфере, представляющем собой разведенную 1:1000 плазму здорового донора.

Ожидалось, что при устойчивом образовании комплексов НСД-^А2 присутствие конкурента не повлияет на вид кривой титрования. Результаты

эксперимента, отражающие взаимодействие белка с различными представлены на рис. 9, где показаны графические зависимости оптической плотности при длине волны А492 (ось У) от концентрации субстрата в точке титрования (ось X).

Как видно из представленных зависимостей, сигнал при взаимодействии <3-М2В с ^М и ^ кролика можно расценивать как

фоновый по сравнению с сигналом от Идентичность кривых при

взаимодействии белка с ^А2, полученных в присутствии и в отсутствии конкурента, позволяет сделать вывод о том, что разнообразные белки плазмы крови не оказывают влияния на взаимодействие домена со специфическим лигандом.

2.4.4. Связывание с Б-^А человека. Как известно из литературы, протеза менингококка расщепляет не только сывороточные, но и секреторные Так как полученный нами НСД устойчиво связывается с

сывороточными ^А с достаточно высокой аффинностью, было принято решение о проверке подобного взаимодействия с секреторными иммуноглобулинами. В качестве источника были использованы

частично обогащенные препараты слюны четырех здоровых доноров (см. Методы). Состав белков этих препаратов анализировали с помощью ДСН-ПААГ (рис. 10). В качестве стандарта сравнения наносили очищенный коммерческий препарат секреторных 1°А.

ННННВР" '

Г- '■: < X <ИЙ

' ■* ■ -v. V* .

§ ; . gif ф* mgc

ъ ..... ■ Ч .-й''

% "

. •/ > -*•«<,'>.' "¡'Л

1 2 3 4. 5 6

Рис. 10. Электрофореграмма в 12.5% денатурирующем ПААГ, окрашенная Кумасси-Я250. На дорожки геля нанесены обогащенные S-lgA препараты слюны:

1. донора №1; 5. контрольный препарат

2. донора №2; (очищенные S-IgA);

3. донора №3; 6. донора №4.

4. стандарт молекулярной массы (116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4 кДа);

Концентрация общего белка во всех препаратах была унифицирована, после чего они использовались в качестве источника субстрата для связывания с (2-М2В при тИФА согласно стандартной схеме, описанной выше. Образование комплексов НСД - 5-1§А визуализировали с помощью специфичного антивидового конъюгата рОАНТаа. Результаты эксперимента представлены на рис 11, где показаны графические зависимости оптической плотности при длине волны А492 от концентрации субстрата в точке титрования

-Ч^Д0н0р№1 —«—донор №2 —¡4-донор №3

концентрация общего бежа, мг/мл

Рис. 11. Оценка связывания белка ()-М2В с Использованные для

связывания с 0.-М2В препараты слюны, обогащенные ^-/^Л выровнены общего белка по концентрации между собой и коммерческими которые применяли в качестве контроля.

Из представленных графических зависимостей видно, что специфический сигнал связывания с (^-М2В наблюдается для трех препаратов' доноры №1, 2, 3. Только Э-^А из слюны донора №4 оказались нереакционноспособными. С другой стороны, следует заметить, что характер кривых отличен от полученной прн реакции с чистыми ^А2 Причинами этого могут являться как наличие примесных веществ в препарате белков слюны, так и их более низкая естественная аффинность к НСД ^А1-протеазы по сравнению с сывороточными ^А.

3. Выводы

1. В соответствии с выдвинутой нами гипотезой о двухдоменной организации IgAl-специфичной протеазы N. meningitidis впервые получены рекомбинантные продуценты, позволяющие синтезировать в виде телец включения в Е. coli изолированные каталитический и некаталитический субстрат-связывающий домены.

2. Предложена методика очистки и ренатурации, позволившая получить функционально активные рекомбинантные производные IgAl-протеазы N.meningitidis.

3. Показано наличие протеолитической активности у каталитического домена IgAl-протеазы менингококка в отношении IgAl человека.

4. Показано высокоаффинное связывание некаталитического субстрат-связывающего домена IgAl-протеазы менингококка с сывороточными и секреторными IgA человека. Обнаружена способность домена распознавать IgA2 человека, причем с большей аффинностью, чем IgAl.

Список публикаций по теме диссертации

1. Казеева Т.Н.. Шевелев А.Б., Неизвестные функции иммуноглобулинов А, Биохимия, 2007, №5, стр. 485-494

2. Хоменков В.Г., Казеева Т.Н., Шевелев Б.И., Барграссер В.П, Скоблов M Ю., Шевелев А Б., Клонирование и экспрессия генов IgA-специфичных протеаз Neisseria meningitidis, Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2007, №1, стр 30-35

3. Khamiankou V., Kazeeva T., Shevelev A., Expression of IgA-specific endopeptidases from Neisseria meningitidis in E. coll. 17th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases ICC, Munich, Germany, 31 Mar -04 Apr 2007. Abstract number- 1733_916

4. Казеева Т.Н., Хоменков В Г., Керученько Я.С., Шевелев Б.И , Шевелев А Б., Доменная организация IgA-специфичной протеазы менингококка и подходы к разработке лекарства от инфекционного менингита, Юбилейные Научные Чтения, посвященные 110-летию со дня рождения проф. Н.А Преображенского, Тезисы докладов, Москва, 2006, стр 30.

5. Kazeeva Т N.. Khomenkov V.G., Kuznetsova T.V., Shevelev А.В., Study of IgA-specific endopeptidases from Neisseria meningitidis and their genes. International conference Biocatalysis - 2005' fundamentals and applications, St Petersburg - Kizhiy - Valaam, Book of abstract, 2005, St.Petersburg, p.90.

Типография МГУ 119991, ГСП-1, Ленинские горы, д 1,стр 15 Заказ № 2374 Тираж 100 экз

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Казеева, Тамара Николаевна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Иммуноглобулины А - молекулярная мишень IgAl-протеаз ^ микроорганизмов

2.1.1. Структурная организация IgA

Первичная структура тяжелых цепей IgA

Доменная организация тяжелых цепей IgA человека

2.1.2. Биосинтез и распределение IgA в организме человека и j g животных

2.1.3. Функционирование IgA в качестве распознающего 9? элемента системы>гуморального иммунитета

2.2. IgAl-специфичные протеазы патогенных микроорганизмов

2.2.1. Представленность IgAl-протеаз и их структурных ^q гомологов у патогенов различных групп и их вклад в вирулентность

Классические» IgA 1-протеазы 3 О

Функциональные аналоги IgAl-протеаз

Структурные гомологи IgAl-протеаз

2.2.2. Секреция и локализация IgAl-протеаз

2.2.3. Особенности первичной специфичности IgAl-протеаз

2.3. Специфические факторы патогенов как инструмент для исследования новых функций IgA

2.3.1. IgA-связывающие М-подобные белки стрептококков ло

А , О группы А

2.3.2. /3-антигеп S. agalactiae

2.3.3. IgA-связывающие белки стафилококков

2.3.4. Сайты связывания белков патогенов в молекуле IgA

Введение Диссертация по биологии, на тему "Доменная организация IgA1-специфичной протеазы Neisseria meningitidis"

Протеазы, расщепляющие иммуноглобулины А1 (IgAl) человека, представляют собой высокоспецифичные ферменты, действующие на строго определенные пептидные связи в шарнирном регионе субстрата. Продукция IgAl-протеаз характерна для таких удаленных в систематическом отношении бактериальных патогенов человека, как Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, S. sanguis, которые вызывают у человека ряд опасных заболеваний: менингит, синусит, отит, бронхит, пневмонию, венерические заболевания и др. Ряд косвенных данных позволяет рассматривать эти ферменты в качестве одного из факторов патогенности микроорганизмов [1]. Так показано, что все патогенные представители родов Neisseria и Haemophilus обладают способностью * синтезировать данные ферменты, тогда как непатогенные штаммы являются в основном носителями молчащих генов IgAl-протеаз [2, 3]. 1

Общепринятой является точка зрения, что роль IgAl-протеаз в развитии инфекции сводится к расщеплению секреторных IgAl, которые в больших количествах присутствуют на слизистых оболочках и обеспечивают первую линию защиты от бактериальных патогенов. Деградация антител IgAl-протеазами, таким образом, ослабляет иммунитет слизистых, что приводит к адгезии бактерий на стенках эпителия и колонизации ими слизистых. Однако активность IgAl-протеаз была экспериментально выявлена в таких биологических средах как кровь, цереброспинальная жидкость и др., взятых от пациентов с соответствующими заболеваниями, что не позволяет рассматривать расщепление секреторных антител в качестве единственной функции [3]. Тем не менее, до сих пор остается не понятным, каким образом подобное расщепление защитных молекул оказывает влияние на развитие инфекции.

Работа по исследованию IgAl-протеаз осложнена, в первую очередь, отсутствием эффективных подходов, позволяющих получать функционально активный фермент в необходимом количестве. В результате до настоящего времени не установлена пространственная структура ферментов данного типа. Выделение IgAl-протеаз из природных источников связано с рядом трудностей: работа с патогенными микроорганизмами, подбор сред сложного состава для их культивирования, низкий уровень продукции фермента. Таким образом, для изучения функций IgAl-протеаз в патогенезе, особенностей фермент-субстратных взаимодействий и разработки эффективных ингибиторов требуется создание рекомбинантных продуцентов, позволяющих получать достаточные количества фермента и его мутантных производных. Однако, эта техническая проблема до настоящего времени остается нерешенной.

Важной предпосылкой настоящей работы является впервые высказанная нами гипотеза о мультидоменной организации сериновых IgAl-протеаз (ЕС 3.4.21.72) по аналогии с другими известными протеазами с большой молекулярной массой: энтеропептидазой и бутулиническим токсином. В рамках данной работы впервые выдвинуто предположение о существовании у сериновой IgAl-протеазы из N. meningitidis как минимум двух доменов, выполняющих различные функции. N-концевая часть полипептидной цепи, включающая в себя типичный для сериновых протеиназ каталитический сайт (VLGDSGSPLF), отвечает за протеолитическую активность фермента, формируя каталитический домен (КТД). Другая же, большая С-концевая часть молекулы ответственна за специфичное распознавание и связывание субстрата в виде IgA человека -некаталитический субстрат-связывающий домен (НСД).

Эта гипотеза имеет теоретическую значимость, позволяя планировать эксперименты в области изучения ферментативной кинетики и субстратной специфичности IgAl-протеаз. Она важна и с точки зрения разработки ингибитора этих ферментов, который традиционно рассматривается в качестве перспективного агента для терапии менингококковой инфекции. Наконец, расчленение IgAl-протеазы на изолированные домены могло бы оказаться удобным средством для создания рекомбинантных продуцентов фермента в условиях, когда продукция полноразмерного фермента в существующих системах экспрессии затруднена.

В качестве цели работы рассматривалась экспериментальная проверка впервые выдвинутой нами гипотезы о двухдоменной организации сериновых IgAl-протеаз на примере фермента из N. meningitidis, что обусловливает наличие в их структуре двух «центров взаимодействия с субстратом: 1 каталитического и некаталитического субстрат-связывающего.

В экспериментальные задачи работы входило:

1. Определение границ предполагаемых КТД и НСД доменов путем сопоставления аминокислотных последовательностей различных сериновых протеиназ и IgAl-протеазы менингококка; клонирование выбранных фрагментов генов, соответствующих доменам, с помощью ПЦР и разработка < систем экспрессии рекомбинантных белков в Е. coli.

2. Разработка систем очистки и ренатурации полученных белков-доменов.

3. Изучение субстратной специфичности изолированного КТД и сопоставление показанной активности с активностью нативного фермента из ' культуральной жидкости менингококка.

4. Разработка критериев оценки выхода нативного продукта при ренатурации изолированного НСД.

5. Изучение специфичности и аффинности распознавания белков-лигандов изолированным НСД.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

IgAl-протеазы - группа ферментов, объединяемая общим типом субстратной специфичности: все они расщепляют определенные связи в шарнирном регионе иммуноглобулинов класса А1 человека. Уже в первых работах, посвященных обнаружению IgAl-протеаз у Haemophilus, Neisseria и Streptococcus, этим ферментам была приписана роль факторов патогенности. Действительно, все известные бактерии, продуцирующие IgAl-протеазы, вне зависимости от систематического положения способны к адгезии на слизистых оболочках дыхательных или мочеполовых путей [4]. Более того, высокий уровень продукции IgAl-протеаз является обязательным атрибутом патогенных представителей групп Haemophilus, Neisseria и Streptococcus, тогда как штаммы с низкой патогенностью проявляют низкий уровень активности фермента или даже совершенно лишены соответствующих структурных генов. [2, 3]. Это наблюдение хорошо соотносится с современными представлениями о роли IgA: в обзорах последних трех лет они рассматриваются лишь в качестве средства пассивной нейтрализации антигенов [5, б]. Таким образом, участие IgAl-протеаз в патогенезе традиционно сводят к инактивации специфических антител класса IgAl, блокирующих поверхностные адгезины бактерий. На этом основании IgA 1 -протеазы- иногда относят даже к числу бактериальных адгезинов.

Не оспаривая факта стимуляции адгезии патогенных бактерий за счет активности IgAl-протеаз, необходимо подчеркнуть, что это явление не дает удовлетворительного объяснения жесткой корреляции между энцнефалотропностью наиболее патогенных штаммов* менингококка и их высокой способностью к продукции IgAl-протеазы. Адгезивная функция IgA 1-протеазы представляется [наиболее важной для- непатогенных г комменсалитических штаммов, населяющих носоглотку и верхние дыхательные пути человека: ведь в отличие от родственных им патогенных штаммов, они способны выживать, лишь прикрепившись к поверхности 9 эпителия. Однако, именно эти штаммы нередко оказываются лишены способности к продукции IgAl-протеазы [7].

Кроме того, расщепление антител класса IgAl на Fab и Fc фрагменты не снижает их сродства к антигену и, следовательно, не может непосредственно подавлять антиадгезивного эффекта антител в отношении патогенов [8]. Эти два наблюдения послужили основанием для выдвижения гипотезы о наличии у IgAl-протеаз дополнительных функций в процессе патогенеза, не связанных с адгезивным действием и, вероятно, реализуемых во внутренней среде организма, а пе па поверхности слизистых оболочек.

Однако, разработка этого предположения столкнулась с фундаментальной проблемой: недостаточностью наших представлений о роли самих молекул субстрата IgAl-протеаз - IgA - в развитии защитных реакций человека. Как упоминалось выше, традиционно функционирование

IgA сводят лишь к первичному распознаванию антигена, находящегося в составе серозно-слизистых секретов. При этом исключается существование механизмов атаки вторичных эффекторных механизмов против распознанных мишеней, аргументируя это невозможностью доставки компонентов этих механизмов за пределы крови или тканевой жидкости. Эта точка зрения не кажется нам убедительной, поскольку в крови человека и животных содержится значительное количество IgA, среди которых могут находиться антитела ко многим важным антигенам. Отсутствие механизмов распознавания иммунных комплексов IgA автоматически сделало бы такие комплексы эффективным механизмом, защищающим патогены, которые могли бы в этом случае использовать их в качестве маски-конкурента против

IgG и IgM и рецепторов лимфоцитов.

Логика функционирования гипотетических эффекторных механизмов уничтожения иммунных комплексов IgA требует от них способности отличать иммунные комплексы IgA от свободных IgA. В противном случае эффекторные механизмы были бы лишены специфичности и несли бы угрозу для собственных структур организма. Решение указанной задачи, как и в случае IgG, может быть достигнуто за счет передачи сигнала от Fab- к Fc-супердомену за счет конформационных перестроек. В качестве инструментов для решения поставленных задач можно рассматривать данные структурных исследований о взаимодействии IgA с известными рецепторами CD89 и рецептором полимерных IgA.

Важным средством визуализации конформационных перестроек в IgA под действием связывания антигена могут выступить также специализированные IgA-связывающие белки патогенных бактерий. Сам факт существования этих белков, взаимодействующих преимущественно с Fc-еупердоменами IgA, является веским аргументом в пользу существования иммунных механизмов IgA-зависимого уничтожения мишеней.

С учетом актуальности перечисленных проблем, мы сочли необходимым начать обзор литературы главой, посвященной современным представлениям о структуре и функции IgA. Далее следуют главы, в которых представлены сведения о структуре и функционировании IgAl-протеаз и IgA-связывающих белков патогенных бактерий. Эти данные рассматриваются, в первую очередь, с точки зрения выявления неизвестных функций IgA в иммунитете. Вскрытие подобных механизмов и возможные последствия их отмены при расщеплении IgAl-протеазами несомненно позволит улучшить понимание роли этой группы ферментов в адаптации патогенных микроорганизмов и обеспечении их вирулентности.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Казеева, Тамара Николаевна

5. ВЫВОДЫ

2.4. Заключение

Вопрос о роли IgAl-протеаз патогенных бактерий в развитии инфекции до сих пор остается открытым. Общепринятой является точка зрения, что роль этих ферментов сводится к расщеплению S-IgA, которые в больших количествах присутствуют на слизистых оболочках и обеспечивают первую линию защиты от бактериальных патогенов. Деградация антител IgAl-протеазами, таким образом, ослабляет иммунитет слизистых, что приводит к адгезии бактерий на эпителии и колонизации ими слизистых [42]. Однако, на наш взгляд, эти ферменты нельзя рассматривать только как механизм, обеспечивающий нормальную колонизацию бактерий на эпителии хозяина, в Г частности, и потому, что активность IgAl-протеаз патогенов была экспериментально выявлена в таких биологических средах как кровь, цереброспинальная жидкость и др. от пациентов с заболеваниями, причиной которой являются обсуждаемые микроорганизмы [2]. Кроме того, исследованные IgAl-протеазы, как правило, эффективнее расщепляют сывороточные IgAl по сравнению с секреторными [3]. Наконец, наличие генов IgAl-протеаз и их высокий уровень экспрессии являются неотъемлемым признаком именно патогенных штаммов родов Neisseria и Streptococcus, проникающих во внутреннюю среду организма. Напротив, для непатогенных представителей этих родов, персистирующих на эпителии верхних дыхательных путей, IgAl-протеаза является распространенным, но не обязательным фактором адаптивности [172].

Таким образом, можно предполагать, что IgAl-протеазы могут выполнять важные функции во внутренней среде организма, не связанные непосредственно с деградацией антиадгезиивных секреторных антител. Можно допустить, что IgA l-протеазы обеспечивают защиту патогенов от гипотетических механизмов IgA-зависимой атаки антигенов или же принимают участие в ориентировке патогенов во внутренней среде организма, обеспечении их гистотропности (в частности, энцефалотропности) [173].

Неизвестные функции, предположительно выполняемые IgAl-протеазами во внутренней среде макроорганизма, в сочетании с большим г размером белков этого типа, могут предполагать наличие у них структурных элементов, обеспечивающих контакт с различными факторами и рецепторами как организма человека, так и самого патогена.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Штаммы Е. coli и N. meningitidis. Клинические материалы

Для клонирования, получения плазмидной ДНК и получения биомассы рекомбинантных продуцентов использовался штамм Е. coli NM522 (thi, supE, F'proАВ, laclq ZAM15).

Штаммы M9 и А208 N. meningitidis серогруппы А, вызвавшие эпидемические вспышки в 1979 и 1984 г, получены из коллекции Государственного института стандартизации и контроля им. Л.А. Тарасевича РАМН. Геномная ДНК и культуральные жидкости этих штаммов, обладающие активностью IgAl-протеазы, предоставлены Государственным научным центром промышленной микробиологии (г. Оболенск, Московская область). Г

Образцы плазмы крови больных миеломой, обогащенные моноклональными IgAl или IgA2, были предоставлены Е.Ю. Варламовой (Гематологический научный центр РАМН). Концентрация IgA в предоставленных препаратах составляла 20 мг/мл.

3.2. Методы генной инженерии

3.2.1. Среды для культивирования Е. coli и основные растворы

Бактериальные среды:

• Минимальная среда Адамса для поддержания штаммов Е. coli:

10 г/л минимальные соли М9 (Gibco); 1,5% бактоагар (Difco);

0,4% глюкоза (Уфавита); витамин В1 (тиамин) в конечной I концентрации 100 мкг/мл (Уфавита)

• бульон LB: 10 г/л пептон (Difco), 5 г/л дрожжевой экстракт (Difco), 10 г/л NaCl (Лаверна)

• агаризованная селективная среда LB: бульон LB, 15 г/л бактоагар (Difco), 100 мг/л ампициллин

• бульон 2YT: (10 г/л пептон (Difco), 10 г/л дрожжевой экстракт S

Difco), 5 г/л NaCl (Лаверна), 100 мг/л ампициллин Основные растворы:

• раствор «Р1»: 30 мМ трис-HCl, рН 8.0; ЮмМ ЭДТА; панкреатическая РНКаза А 10 мг/мл (Реанал)

• раствор «В»: 200 мМ NaOH; 1% ДСН

• раствор «С»: 3 М ацетат К, рН 4.8

• ТАЕ Г: 50 мМ трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА, рН 8.3

• ПЦР-буфер: 67 мМ Tris-HCl, рН 8.3; 17 мМ (NH^SO^ 0.001% Твин-20, 2.5 мМ MgCl2

3.2.2. Приготовление компетентных клеток Е. coli и трансформация плазмидной ДНК

Клетки Е. coli из одиночной колонии вносили в 3 мл бульона LB и выращивали при 30 °С в течение ночи. Ночную культуру разводили в 100 раз с помощью бульона LB и подращивали при 30 °С до достижения Абоо=0-6. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 1 мин при 4 °С. Осадок ресуспендировали в 500 мкл охлажденного во льду 0.07 М СаС12 и инкубировали в ледяной бане в течение 30 мин. Затем клетки осаждали центрифугированием при тех же условиях и осадок ресуспендировали в I

100 мкл 0.07 М СаСЬ. Для проведения трансформации к 100 мкл суспензии компетентных клеток Е. coli добавляли плазмидную ДНК в количестве 0.01

0.2 мкг либо 3-10 мкл смеси ДНК, полученной в результате реакции лигирования, и инкубировали 20-40 мин во льду. Затем прогревали при 42 °С в течение 1.5 мин, охлаждали 1-2 мин во льду, добавляли 500 мкл LB и инкубировали 45-60 мин при 37 °С. Клеточную суспензию высевали на чашки Петри, содержащие агаризованную селективную среду LB.

3.2.3. Выделение плазмидной ДНК (вариант минипреп)

Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli проводилось по следующему модифицированному протоколу щелочного лизиса по Бирнбойму и Долли:

1. Жидкую культуру Е. coli, несущую плазмиду, получали выращиванием в 3 мл бульона 2YT при 37°С в течение 16-18 часов при интенсивной аэрации.

2. Клетки из 3 мл культуры собирали в пробирку типа Eppendorf с помощью двух последовательных осаждений 1.5 мл аликвот центрифугированием на настольной центрифуге «Eppendorf» 5414 (Германия) в течение 20 сек при 8000 об/мин.

3. Клетки суспендировали в 100 мкл раствора «Р1».

4. Лизис клеток проводили при добавлении 200 мкл раствора «В».

5. После просветления лизата его нейтрализовывали добавлением 150 мкл раствора «С».

6. Осветление лизата проводили центрифугированием на настольной центрифуге в течение 10 мин при 8000 об/мин.

7. Нуклеиновые кислоты из грубого лизата осаждали добавлением 350 мкл полиэтиленгликоля 6000 (Loba Chemie - Austranal) до конечной концентрации 8-12%.

8. Супернатант отбрасывали, а осадок промывали 70% этанолом и высушивали при +37°С до исчезновения запаха этанола.

9. Осадок растворяли в 100 мкл воды при +65°С в течение 10 мин, примеси полисахаридов и РНК удаляли высаливанием, для чего к раствору ДНК добавляли 50 мкл насыщенного нейтрального раствора ацетата аммония и 50 мкл 12 М LiCl и инкубировали при +65°С в течение 15 мин. Выпавший осадок РНК, полисахаридов и денатурированного белка отделяли центрифугированием в течение 10 минут при 8000 об/мин.

10. Супернатант переносили в чистую пробирку типа Eppendorf. ДНК осаждали добавлением 200 мкл изопропанола с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 8000 об/мин.

11. Супернатант отбрасывали, а осадок промывали 70% этанолом и высушивали при +37°С до исчезновения запаха этанола.

12. Осадок растворяли в 50 мкл воды при +65°С в течение 15 мин.

Для получения препаратов плазмидной ДНК высокой степени чистоты использовали кит для выделения ДНК «Rapid Plasmid DNA Daily Mini-prep Kit» согласно инструкции производителя (V-gene).

3.2.4. Электрофорез ДНК

Электрофорез ДНК проводили в 0.8% агарозном геле (агароза производства «Chemapol»), приготовленном на буфере ТАЕ Iх. Окраску гелей осуществляли бромистым этидием в концентрации 0.4 мкг/мл. Гели просматривали при помощи трансиллюминатора «Vilbert-Lourmat» при длине волны 260 нм. Фотографирование проводилось с помощью видеосистемы Vitran (Россия).

Для определения размеров фрагментов более 500 п.н. в качестве молекулярно-весового стандарта использовался GeneRuler 1 kb DNA Ladder (MBI Fermentas, кат. №SM0311); от 100 до 500 п.н. - GeneRuler 100 b DNA

Ladder (MBI Fermentas, кат. №SM0241). t t

3.2.5. ПЦР и олигонуклеотидные праймеры i

ПЦР-амплификация производилась в 30 мкл ПЦР-буфера с Taq-полимеразой производства «Бионем», 0.3-1.0 ед. акт на мкл. Остальные реактивы добавляли до конечных концентраций: 200 мкМ dNTP (Сибэнзим), 0.3 пмоль/мкл соответствующих праймеров (табл. 2). В качестве матрицы для амплификации фрагментов генов IgAl-протеазы менингококка использовали геномную ДНК штаммов N. meningitidis А208 и М9 в количестве 0.01 мкг/мкл. Амплификацию гена GFP (ECFP1, Clontech, каталожный номер 6901-1), осуществляли на базе плазмидной ДНК pQE-GFP, несущей соответствующий ген, полученной ранее в нашей лаборатории.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Казеева, Тамара Николаевна, Москва

1. Mistry D, Stockley RA. IgAl protease. Int J Biochem Cell Biol. 2006; 3 8(8): 1244-1248.

2. Vitovski S, Read RC, Sayers JR. Invasive isolates of Neisseria meningitidis possess enhanced immunoglobulin A1 protease activity compared to colonizing strains. FASEB J. 1999; 13(2):331-337.

3. Vitovski S, Dunkin KT, Howard AJ, Sayers JR. Nontypeable Haemophilus influenzae in carriage and disease: a difference in IgAl protease activity levels. JAMA. 2002; 287(13): 1699-1705.

4. Plaut AG. The IgAl proteases of pathogenic bacteria. Annu Rev Microbiol. 1983; 37:603-622.

5. Woof JM, Mestecky J. Mucosal immunoglobulins. Immunol Rev. 2005; 206:64-82.

6. Woof JM, Kerr MA. The function of immunoglobulin A in immunity. J Pathol. 2006; 208(2): 270-282.

7. Jose J, Otto GW, Meyer TF. The integration site of the iga gene in commensal Neisseria sp. Mol Genet Genomics. 2003; 269(2): 197-204.

8. Mansa B, Kilian M. Retained antigen-binding activity of Fab alpha fragments of human monoclonal immunoglobulin A1 (IgAl) cleaved by IgAl protease. Infect Immun. 1986; 52(1):171-174.

9. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. М: Мир, 2000. - 592 с.

10. Mestecky J, Russell MW. IgA subclasses. Monogr Allergy. 1986; 19:277-301.

11. Kerr MA. The structure and function of human IgA. Biochem J. 1990; 271(2):285-296.

12. Biewenga J. Structure of IgA: facts and gaps in our data on disulfide bonds. Adv Exp Med Biol. 1995; 371 A: 575-579.

13. Sumiyama К, Saitou N, Ueda S. Adaptive evolution of the IgA hinge region in primates. Mol Biol Evol. 2002; 19(7): 1093-1099.

14. Chintalacharuvu KR, Raines M, Morrison SL. Divergence of human alpha-chain constant region gene sequences. A novel recombinant alpha 2 gene. J Immunol. 1994; 152(11):5299-5304.

15. Almogren A, Senior BW, Loomes LM, Kerr MA. Structural and functional consequences of cleavage of human secretory and human serum immunoglobulin A1 by proteinases from Proteus mirabilis and Neisseria meningitidis. Infect Immun. 2003; 71(6):3349-3356.

16. Chintalacharuvu KR, Yu LJ, Bhola N, Kobayashi K, Fernandez CZ, Morrison SL. Cysteine residues required for the attachment of the light chain in human IgA2.J Immunol. 2002; 169(9):5072-5077.

17. Bertrand FE 3rd, Billips LG, Gartland GL, Kubagawa H, Schroeder HW Jr. The J chain gene is transcribed during В and T lymphopoiesis in humans. J Immunol. 1996; 156(11): 4240-4244.

18. Atkin JD, Pleass RJ, Owens RJ, Woof JM. Mutagenesis of the human IgAl heavy chain tailpiece that prevents dimer assembly. J Immunol. 1996; 157( 1): 156-159.

19. Krugmann S, Pleass RJ, Atkin JD, Woof JM. Mutagenesis of J chain residues critical for IgA dimer assembly. Biochem Soc Trans. 1997; 25(2):323S.

20. Braathen R, Sorensen V, Brandtzaeg P, Sandlie I, Johansen FE. The carboxyl-terminal domains of IgA and IgM direct isotype-specific polymerization and interaction with the polymeric immunoglobulin receptor. J Biol Chem. 2002; 277(45):42755-42762.

21. Krugmann S, Pleass RJ, Atkin JD, Woof JM. Structural requirements for assembly of dimeric IgA probed by site-directed mutagenesis of J chain and a cysteine residue of the alpha-chain CH2 domain. J Immunol. 1997; 159(1):244-249.

22. Mestecky J, Russell MW, Jackson S, Brown ТА. The human IgAisystem: a reassessment. Clin Immunol Immunopathol. 1986; 40(1): 105-114.j 133i

23. Perrier C, Sprenger N, Corthesy B. Glycans on secretory component participate in innate protection against mucosal pathogens. J Biol Chem. 2006; 281(20): 14280-14287.

24. Strong RK. This little plgR went to the mucosa. Structure. 2004; 12(11): 1919-1920.

25. Chang Y, Lee TC, Li JC, Lai TL, Chua HH, Chen CL, Doong SL, Chou CK, Sheen TS, Tsai CH. Differential expression of osteoblast-specific factor 2 and polymeric immunoglobulin receptor genes in nasopharyngeal carcinoma. Head Neck. 2005; 27(10):873-882.

26. Johansen FE, Braathen R, Brandtzaeg P. The J chain is essential for polymeric Ig receptor-mediated epithelial transport of IgA. J Immunol. 2001; 167(9):5185-5192.

27. Kaetzel CS. The polymeric immunoglobulin receptor: bridging innate and adaptive immune responses at mucosal surfaces. Immunol Rev. 2005; 206:8399.

28. Lewis MJ, Pleass RJ, Batten MR, Atkin JD, Woof JM. Structural requirements for the interaction of human IgA with the human polymeric Ig receptor. J Immunol. 2005; 175(10):6694-6701.

29. Brandtzaeg P, Johansen FE. Confusion about the polymeric Ig receptor. Trends Immunol. 2001; 22(4):545-546.

30. Hamburger AE, West AP Jr, Bjorkman PJ. Crystal structure of a polymeric immunoglobulin binding fragment of the human polymeric immunoglobulin receptor. Structure. 2004; 12(11): 1925-1935.

31. Brandtzaeg P, Johansen FE. Mucosal В cells: phenotypic characteristics, transcriptional regulation, and homing properties. Immunol Rev. 2005; 206:32-63.

32. Mestecky J, Lue C, Russell MW. Selective transport of IgA. Cellular and molecular aspects. Gastroenterol Clin North Am. 1991; 20(3):441-471.

33. Mestecky J, Moldoveanu Z, Prince SJ, Kutteh WH, Kulhavy R, McGhee JR, Moro I, Crago SS. Immunological properties and differentiation potential of human colostral lymphocytes of В cell lineage. Adv Exp Med Biol. 1991 ;310:123-129.

34. McGhee JR, Fujihashi K, Lue C, Beagley KW, Mestecky J, Kiyono H. Role of IL-6 in human antigen-specific and polyclonal IgA responses. Adv Exp Med Biol. 1991; 310:113-121.

35. Gilbert JV, Plaut AG, Wright A. Analysis of the immunoglobulin A protease gene of Streptococcus sanguis. Infect Immun. 1991; 59(1):7-17.

36. Mulks MH, Plaut AG, Feldman HA, Frangione B. IgA proteases of two distinct specificities are released by Neisseria meningitidis. J Exp Med. 1980; 152(5): 1442-1447.

37. Plaut AG. Production and isolation of neissereal IgA proteases. Methods Enzymol. 1988;165:117-120.

38. Monteiro RC, Van De Winkel JG. IgA Fc receptors. Annu Rev Immunol. 2003; 21:177-204.

39. Morton НС, Brandtzaeg P. CD89: the human myeloid IgA Fc receptor. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2001; 49(3):217-229.

40. Yan H, Lamm ME, Bjorling E, Huang YT. Multiple functions of immunoglobulin A in mucosal defense against viruses: an in vitro measles virus model. J Virol. 2002; 76(21):10972-10979.

41. Asahi-Ozaki Y, Yoshikawa T, Iwakura Y, Suzuki Y, Tamura S, Kurata T, Sata T. Secretory IgA antibodies provide cross-protection against infection with different strains of influenza В virus. J Med Virol. 2004; 74(2):328-335.

42. Pal K, Kaetzel CS, Brundage K, Cunningham CA, Cuff CF. Regulation of polymeric immunoglobulin receptor expression by reovirus. J Gen Virol. 2005; 86(Pt 8):2347-2357.

43. Schneeman ТА, Bruno ME, Schjerven H, Johansen FE, Chady L, Kaetzel CS. Regulation of the polymeric Ig receptor by signaling through TLRs 3 and 4: linking innate and adaptive immune responses. J Immunol. 2005; 175(l):376-384.

44. Russell MW, Reinholdt J, Kilian M. Anti-inflammatory activity of human IgA antibodies and their Fab alpha fragments: inhibition of IgG-mediated complement activation. Eur J Immunol. 1989; 19(12):2243-2249.

45. Jarvis GA, Griffiss JM. Human IgAl initiates complement-mediated killing of Neisseria meningitidis. J Immunol. 1989; 143(5): 1703-1709.

46. Van Spriel AB, van de Winkel JG. CD89 (Fc alphaRI). J Biol Regul Homeost Agents. 2001; 15(2): 179-181.

47. Mazanec MB, Coudret CL, Fletcher DR. Intracellular neutralization ofinfluenza virus by immunoglobulin A anti-hemagglutinin monoclonal antibodies. J Virol. 1995; 69(2): 1339-1343.

48. Bomsel M, Heyman M, Hocini H, Lagaye S, Belec L, Dupont C, Desgranges C. Intracellular neutralization of HIV transcytosis across tight epithelial barriers by anti-HIV envelope protein dlgA or IgM. Immunity. 1998; 9(2):277-287.

49. Mazengera RL, KeiT MA. The specificity of the IgA receptor purified from human neutrophils. Biochem J. 1990;272(1): 159-165.

50. Morton HC, Pleass RJ, Woof JM, Brandtzaeg P. Characterization of the ligand binding site of the bovine IgA Fc receptor (bFc-alpha R). J Biol Chem. 2004; 279(52): 54018-54022.

51. Morton HC, Pleass RJ, Storset AK, Brandtzaeg P, Woof JM. Cloning and characterization of equine CD89 and identification of the CD89 gene in chimpanzees and rhesus macaques. Immunology. 2005; 115(l):74-84.

52. Morton HC, Pleass RJ, Storset AK, Dissen E, Williams JL, Brandtzaeg P, Woof JM. Cloning and characterization of an immunoglobulin A Fc receptor from cattle. Immunology. 2004; 111(2):204-211.

53. Pleass RJ, Dunlop JI, Woof JM. Multiple transcripts of human IgA Fc receptor CD89 in neutrophils, eosinophils and the monocyte-like cell line THP-1. Biochem Soc Trans. 1997; 25(2):327S.

54. Herr AB, Ballister ER, Bjorkman PJ. Insights into IgA-mediated immune responses from the crystal structures of human Fc-alphaRI and its complex with IgAl-Fc. Nature. 2003; 423(6940):614-620.

55. Pleass RJ, Dehal PK, Lewis MJ, Woof JM. Limited role of charge matching in the interaction of human immunoglobulin A with the immunoglobulin A Fc receptor (Fc alpha RI) CD89. Immunology. 2003; 109(3):331-335.

56. Pleass RJ, Dunlop JI, Anderson CM, Woof JM. Identification of residues in the CH2/CH3 domain interface of IgA essential for interaction with the human Fc-alpha receptor (Fc-alphaR) CD89. J Biol Chem. 1999; 274(33):23508-23514.

57. Mattu TS, Pleass RJ, Willis AC, Kilian M, Wormald MR, Lellouch AC, Rudd PM, Woof JM, Dwek RA. The glycosylation and structure of human serum

58. Al, Fab, and Fc regions and the role of N-glycosylation on Fc alpha receptor interactions. J Biol Chem. 1998; 273(4): 2260-2272.

59. Pleass RJ, Anderson CM, Dunlop JI, Woof JM. Probing the Fc alpha R binding site on IgA by mutagenesis of the IgA Fc region. Biochem Soc Trans. 1997; 25(2):328S.

60. Pleass RJ, Areschoug T, Lindahl G, Woof JM. Streptococcal IgA-binding proteins bind in the Calpha 2-Calpha 3 interdomain region and inhibit binding of IgA to human CD89. J Biol Chem. 2001; 276(11):8197-8204.

61. Podbielski A, Schnitzler N, Beyhs P, Boyle MD. M-related protein (Mrp) contributes to group A streptococcal resistance to phagocytosis by human granulocytes. Mol Microbiol. 1996; 19(3):429-441.

62. Boehm MK, Woof JM, Kerr MA, Perkins SJ. The Fab and Fc fragments of IgAl exhibit a different arrangement from that in IgG: a study by X-ray and neutron solution scattering and homology modelling. J Mol Biol. 1999; 286(5):1421-1447.i

63. Bachovchin WW, Plaut AG, Flentke GR, Lynch M, Kettner CA. Inhibition of IgAl proteinases from Neisseria gonorrhoeae and Hemophilus influenzae by peptide prolyl boronic acids. J Biol Chem. 1990;265(7):3738-3743.

64. Plaut AG, Bachovchin WW. IgA-specific prolyl endopeptidases: serine type. Methods Enzymol. 1994; 244:137-151.

65. Meyer TF, Halter R, Pohlner J. Mechanism of extracellular secretion of an IgA protease by gram-negative host cells. Adv Exp Med Biol. 1987; 216B.-1271-1281.

66. Gilbert JV, Plaut AG, Wright A. Analysis of the immunoglobulin A protease gene of Streptococcus sanguis. Infect Immun. 1991; 59(1):7-17.

67. Poulsen K, Reinholdt J, Jespersgaard С, Boye K, Brown ТА, Hauge M, Kilian M. A comprehensive genetic study of streptococcal immunoglobulin A1 proteases: evidence for recombination within and between species. Infect Immun. 1998; 66(1): 181-190.'

68. Lomholt JA, Kilian M. Immunoglobulin A1 protease activity in Gemella haemolysans. J Clin Microbiol. 2000; 38(7):2760-2762.

69. Muller HE. Lack of immunoglobulin A protease in Neisseria lactamica. Eur J Clin Microbiol. 1983; 2(2): 153-154.

70. Mulks MH, Moxon ER, Bricker J, Wright A, Plaut AG. Examination of Haemophilus pleuropneumoniae for immunoglobulin A protease activity. Infect Immun. 1984; 45(l):276-277.

71. Hogg SD, Whiley RA, De Soet JJ. Occurrence of lipoteichoic acid in oral streptococci. Int J Syst Bacteriol. 1997; 47(l):62-66.

72. Talcenouchi-Ohlcubo N, Mortensen LM, Drasbek KR, Kilian M, Poulsen K. Horizontal transfer of the immunoglobulin A1 protease gene (iga) from Streptococcus to Gemella haemolysans. Microbiology. 2006; 152(Pt 7): 21712180.

73. Reinholdt J, Tomana M, Mortensen SB, Kilian M. Molecular aspects of immunoglobulin A1 degradation by oral streptococci. Infect Immun. 1990; 58(5):1186-1 194.

74. Frandsen EV, Kjeldsen M, Kilian M. Inhibition of Prevotella and Capnocytophaga immunoglobulin A1 proteases by human serum. Clin Diagn Lab Immunol. 1997; 4(4):458-464.

75. Jansen HJ, Grenier D, Van der Hoeven JS. Characterization of immunoglobulin G-degrading proteases of Prevotella intermedia and Prevotella nigrescens. Oral Microbiol Immunol. 1995; 10(3): 138-145.

76. Benjelloun-Touimi Z, Sansonetti PJ, Parsot C. SepA, the major extracellular protein of Shigella flexneri: autonomous secretion and involvement in tissue invasion. Mol Microbiol. 1995; 17(1): 123-135.

77. Provence DL, Curtiss R 3rd. Isolation and characterization of a gene involved in hemagglutination by an avian pathogenic Escherichia coli strain. Infect Immun. 1994; 62(4): 1369-1380.

78. Henderson IR, Czeczulin J, Eslava C, Noriega F, Nataro JP. Characterization of pic, a secreted protease of Shigella flexneri and enteroaggregative Escherichia coli. Infect Immun. 1999; 67(11):5587-5596.

79. Johnson TJ, Wannemuehler YM, Nolan LK. Evolution of the iss gene in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 2008; 74(8):2360-2369.

80. Houdouin V, Bonacorsi S, Bidet P, Bingen E. Antimicrobial susceptibility of 136 Escherichia coli isolates from cases of neonatal meningitis and relationship with virulence. Clin Microbiol Infect. 2007; 13(12): 1207-1210.

81. Restieri C, Garriss G, Locas MC, Dozois CM. Autotransporter-encoding sequences are phylogenetically distributed among Escherichia coli clinical isolates and reference strains. Appl Environ Microbiol. 2007; 73(5): 1553-1562.

82. Navarro-Garcia F, Canizalez-Roman A, Vidal JE, Salazar MI. Intoxication of epithelial cells by plasmid-encoded toxin requires clathrin-mediated endocytosis. Microbiology. 2007; 153(Pt 9): 2828-2838.

83. Dutta PR, Cappello R, Navarro-Garcia F, Nataro JP. Functional comparison of serine protease autotransporters of enterobacteriaceae. Infect Immun, 2002; 70(12):7105-7113.

84. Stathopoulos C, Provence DL, Curtiss R 3rd. Characterization of the avian pathogenic Escherichia coli hemagglutinin Tsh, a member of the immunoglobulin A protease-type family of autotransporters. Infect Immun. 1999; 67(2):772-781.

85. Vitovski S, Sayers JR. Relaxed cleavage specificity of an immunoglobulin A1 protease from Neisseria meningitidis. Infect Immun. 2007; 75(6):2875-2885.

86. Renn JP, Clark PL. A conserved stable core structure in the passenger domain beta-helix of autotransporter virulence proteins. Biopolymers. 2008; 89(5):420-427.

87. Shin EK, Jung R, Hahn TW. Polymorphism of pertactin gene repeat regions in Bordetella bronchiseptica isolates from pigs.J Vet Med Sci. 2007; 69(7): 771-774.

88. Wells TJ, Tree JJ, Ulett GC, Schembri MA. Autotransporter proteins: novel targets at the bacterial cell surface. FEMS Microbiol Lett. 2007; 274(2): 163

89. Gangwer KA, Mushrush DJ, Stauff DL, Spiller B, McClain MS, Cover TL, Lacy DB.Proc Natl Acad Sci USA. Crystal structure of the Helicobacter pylori vacuolating toxin p55 domain. 2007; 104(41): 16293-16298.

90. Bender MH, Weiser JN. The atypical amino-terminal LPNTG-containing domain of the pneumococcal human IgAl-specific protease is required for proper enzyme localization and function. Mol Microbiol. 2006; 61(2):526-543.

91. Reinholdt J, Kilian M. Comparative analysis of immunoglobulin A1 protease activity among bacteria representing different genera, species, and strains. Infect Immun. 1997; 65(11):4452-4459.

92. Qiu J, Brackee GP, Plaut AG. Analysis of the specificity of bacterial immunoglobulin A (IgA) proteases by a comparative study of ape serum IgAs as substrates. Infect Immun. 1996; 64(3):933-937.

93. ICobayashi K, Fujiyama Y, Hagiwara K, Hodohara K, Hosoda S. IgA protease from Clostridium ramosum that cleaves IgAl and IgA2, A2m(l): the site of cleavage and digestion of secretory IgA. Adv Exp Med Biol. 1987; 216B:1289-1296.

94. Fujiyama Y, Kobayashi K, Senda S, Benno Y, Bamba T, Hosoda S. A novel IgA protease from Clostridium sp. capable of cleaving IgAl and IgA2 A2m(l) but not IgA2 A2m(2) allotype paraproteins. J Immunol. 1985; 134(1):573-576.

95. Spratt BG, Barrell BG. Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491. Nature. 2000; 404(6777):502-506.

96. Mulks MH, Simpson DA, Shoberg RJ. Restriction site polymorphism in genes encoding type 2 but not type 1 gonococcal IgAl proteases. Antonie Van Leeuwenhoek. 1987; 53(6):471-478.

97. Halter R, Pohlner J, Meyer TF. Mosaic-like organization of IgA protease genes in Neisseria gonorrhoeae generated by horizontal genetic exchange in vivo. EMBO J. 1989; 8(9):2737-2744.

98. Bricker J, Mulks M, Moxon ER, Plaut AG, Wright A. Physical and genetic analysis of DNA regions encoding the immunoglobulin A proteases of different specificities produced by Haemophilus influenzae. Infect Immun. 1985; 47(2):370-374.

99. Senior BW, Woof JM. Effect of mutations in the human immunoglobulin A1 (IgAl) hinge on its susceptibility to cleavage by diverse bacterial IgAl proteases. Infect Immun. 2005;73(3): 1515-1522.

100. Langley R, Wines B, Willoughby N, Basu I, Proft T, Fraser JD. The staphylococcal superantigen-like protein 7 binds IgA and complement C5 and inhibits IgA-Fc alpha RI binding and serum killing of bacteria. J Immunol. 2005;174(5): 2926-2933.

101. Kehoe MA. Group A streptococcal antigens and vaccine potential. Vaccine. 1991; 9(11):797-806.

102. Robinson JH, Kehoe MA. Group A streptococcal M proteins: virulence factors and protective antigens. Immunol Today. 1992; 13(9):362-367.

103. Dale JB. Multivalent group A streptococcal vaccine designed to optimize the immunogenicity of six tandem M protein fragments. Vaccine. 1999; 17(2): 193-200. ,

104. Batzloff MR, Pandey M, Olive C, Good MF. Advances in potential M-protein peptide-based vaccines for preventing rheumatic fever and rheumatic heart disease. Immunol Res. 2006; 35(3):233-248.

105. Carlsson F, Berggard K, Stalhammar-Carlemalm M, Lindahl G. Evasion of phagocytosis through cooperation between two ligand-binding regions in Streptococcus pyogenes M protein. J Exp Med. 2003; 198(7): 1057-1068.

106. Persson J, Beall B, Linse S, Lindahl G. Extreme sequence divergence but conserved ligand-binding specificity in Streptococcus pyogenes M protein. PLoS Pathog. 2006; 2(5): 47.

107. McArthur JD, Walker MJ. Domains of group A streptococcal M protein that confer resistance to phagocytosis, opsonization and protection: implications for vaccine development. Mol Microbiol. 2006; 59(1): 1-4.

108. Fischetti VA. Streptococcal M protein. Sci Am. 1991 Jun;264(6):58-65.

109. Jarva H, Jokiranta TS, Wurzner R, Meri S. Complement resistance mechanisms of streptococci. Mol Immunol. 2003; 40(2-4):95-107.

110. Sharma AK, Pangburn MK. Localization by site-directed mutagenesis of the site in human complement factor H that binds to Streptococcus pyogenes M protein. Infect Immun. 1997; 65(2):484-487.

111. Kotarsky H, Gustafsson M, Svensson HG, Zipfel PF, Truedsson L, Sjobring U. Group A streptococcal phagocytosis resistance is independent of complement factor H and factor H-like protein 1 binding. Mol Microbiol. 2001; 41(4):817-826.

112. Kihlberg BM, Collin M, ОЬёп A, Bjorck L. Protein H, an antiphagocytic surface protein in Streptococcus pyogenes. Infect Immun. 1999; 67(4): 1708-1714.

113. Johnsson E, Berggard K, Kotarsky H, Hellwage J, Zipfel PF, Sjobring U, Lindahl G. Role of the hypervariable region in streptococcal M proteins: binding of a human complement inhibitor. J Immunol. 1998; 161(9):4894-4901.

114. Sandin C, Carlsson F, Lindahl G. Binding of human plasma proteins to Streptococcus pyogenes M protein determines the location of opsonic and non-opsonic epitopes. Mol Microbiol. 2006; 59(l):20-30.

115. Andre I, Persson J, Blom AM, Nilsson H, Drakenberg T, Lindahl G, Linse S. Streptococcal M protein: structural studies of the hypervariable region, free and bound to human C4BP. Biochemistry. 2006; 45(14):4559-4568.

116. Jenkins HT, Mark L, Ball G, Persson J, Lindahl G, Uhrin D, Blom AM, Barlow PN. Human C4b-binding protein, structural basis for interaction with streptococcal M protein, a major bacterial virulence factor. J Biol Chem. 2006; 281(6):3690-3697.

117. Carlsson F, Sandin C, Lindahl G. Human fibrinogen bound to Streptococcus pyogenes M protein inhibits complement deposition via the classical pathway. Mol Microbiol. 2005; 56(l):28-39.

118. Wistedt AC, Ringdahl U, Muller-Esterl W, Sjobring U.Identification of a plasminogen-binding motif in РАМ, a bacterial surface protein. Mol Microbiol. 1995; 18(3):569-578.

119. Navarre WW, Schneewind O. Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope. Microbiol Mol Biol Rev. 1999; 63(1): 174-229.

120. Akerstrom B, Lindahl G, Bjorck L, Lindqvist A. Protein Arp and protein H from group A streptococci. Ig binding and dimerization are regulated by temperature. J Immunol. 1992; 148(10):3238-3243.

121. Husmann LK, Scott JR, Lindahl G, Stenberg L. Expression of the Arp protein, a member of the M protein family, is not sufficient to inhibit phagocytosis of Streptococcus pyogenes. Infect Immun. 1995; 63(l):345-348.

122. Lindahl G, Stenberg L. Binding of IgA and/or IgG is a common property among clinical isolates of group A streptococci. Epidemiol Infect. 1990; 105(l):87-93.

123. Lindahl G, Akerstrom B. Receptor for IgA in group A streptococci: cloning of the gene and characterization of the protein expressed in Escherichia coli. Mol Microbiol. 1989; 3(2):239-247.

124. Johnsson E, Andersson G, Lindahl G, Heden LO. Identification of the IgA-binding region in streptococcal protein Arp. J Immunol. 1994; 153(8):3557-3564.

125. Akerstrom B, Lindqvist A, Lindahl G. Binding properties of protein Arp, a bacterial IgA-receptor. Mol Immunol. 1991; 28(4-5):349-357.

126. Johnsson E, Areschoug T, Mestecky J, Lindahl G. An IgA-binding peptide derived from a streptococcal surface protein. Biol Chem. 1999;274(21): 14521-14524.

127. O'Toole PW, Stenberg L, Rissler M, Lindahl G. Two major classes in the M protein family in group A streptococci. Proc Natl Acad Sci USA. 1992;89(18):8661-8665.

128. Stenberg L, O'Toole PW, Mestecky J, Lindahl G. Molecular characterization of protein Sir, a streptococcal cell surface protein that binds both immunoglobulin A and immunoglobulin G. J Biol Chem. 1994;269(18):13458-13464.

129. Bessen DE. Localization of immunoglobulin A-binding sites within M or M-like proteins of group A streptococci. Infect Immun. 1994; 62(5): 1968-1974.

130. Sandin C, Linse S, Areschoug T, Woof JM, Reinholdt J, Lindahl G. Isolation and detection of human IgA using a streptococcal IgA-binding peptide. J Immunol. 2002; 169(3):1357-1364.

131. Grubb A, Mendez E, Fernandez-Luna JL, Lopez C, Mihaesco E, Vaerman JP. The molecular organization of the protein HC-IgA complex (HC-IgA). J Biol Chem. 1986; 261(30):14313-14320.

132. Vaerman JP, Hagiwara K, Kobayashi K, Rits M. Complexes of albumin and alpha 1-antitrypsin with Fc-fragment of IgA monomer are disulfide-bound to penultimate C-terminal cysteine in the С alpha 3-domain. Immunol Lett. 1987; 15(l):67-72.

133. Janoff EN, Fasching C, Orenstein JM, Rubins JB, Opstad NL, Dalmasso AP. Killing of Streptococcus pneumoniae by capsular polysaccharide-specific polymeric IgA, complement, and phagocytes. Clin Invest. 1999; 104(8):1139-1147.

134. Nohynek H. Diagnosis and prevention of pneumococcal disease. Adv Exp Med Biol. 2006; 582:137-150.

135. Lindahl G, Stalhammar-Carlemalm M, Areschoug T. Surface proteins of Streptococcus agalactiae and related proteins in other bacterial pathogens. Clin Microbiol Rev. 2005; 18(1): 102-127.

136. Kong F, Gowan S, Martin D, James G, Gilbert GL. Molecular profiles of group В streptococcal surface protein antigen genes: relationship to molecular serotypes. J Clin Microbiol. 2002; 40(2):620-626.

137. Nagano N, Nagano Y, Taguchi F. High expression of а С protein beta antigen gene among invasive strains from certain clonally related groups of type la and lb group В streptococci. Infect Immun. 2002; 70(8): 4643-4649.

138. Lachenauer CS, Baker CJ, Baron MJ, Kasper DL, Gravekamp C, Madoff LC. Quantitative determination of immunoglobulin G specific for group В streptococcal beta С protein in human maternal serum. J Infect Dis. 2002; 185(3):368-374.

139. Jerlstrom PG, Chhatwal GS, Timmis KN. The IgA-binding beta antigen of the с protein complex of Group В streptococci: sequence determination of its gene and detection of two binding regions. Mol Microbiol. 1991; 5(4):843-849.

140. Jerlstrom PG, Talay SR, Valentin-Weigand P, Timmis KN, Chhatwal GS. Identification of an immunoglobulin A binding motif located in the beta-antigen of the с protein complex of group В streptococci. Infect Immun. 1996; 64(7):2787-2793.

141. Nagano N, Nagano Y, Nakano R, Okamoto R, Inoue M. Genetic diversity of the С protein beta-antigen gene and its upstream regions within clonally related groups of type la and lb group В streptococci. Microbiology. 2006; 152(Pt 3):771-778.

142. Lowy FD. Staphylococcus aureus infections. N Engl J Med. 1998;339(8):520-532.

143. Dinges MM, Orwin PM, Schlievert PM. Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev. 2000; 13(l):16-34.

144. Woof JM. The human IgA-Fc alpha receptor interaction and its blockade by streptococcal IgA-binding proteins. Biochem Soc Trans. 2002; 30(4):491-494.

145. Kilian M, Reinholdt J, Lomholt H, Poulsen K, Frandsen EV. Biological significance of IgAl proteases in bacterial colonization and pathogenesis: critical evaluation of experimental evidence. APMIS. 1996; 104(5): 321-338.

146. Kazeeva TN, Shevelev AB. Unknown functions of immunoglobulins A. Biochemistry (Mosc). 2007; 72(5):485-494.

147. Патрушев Л.И.// Искусственные генетические системы. Генная и белковая инженерия./ М.: Наука, 2004. 526с.

148. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М.//Теория и практика иммуноферментного анализа./М.: Высш.шк., 1991. 288с.

149. Cowley DJ, Mackin RB. Expression, purification and characterization of recombinant human proinsulin. FEBS Lett. 1997; 402(2-3):124-130.

150. Cerletti N., McMaster G.IC., Cox D., Shmitz A., Mayback B. Process for refolding recombinantly produced TGF-{3-like proteins.// US Patent. 1997. No 5 650 494;

151. Bailey JL, Cole RD. Studies on the reaction of sulfite with proteins. Biol Chem. 1959; 234(7):1733-1739.

152. Chan WW. A method for the complete S sulfonation of cysteine residues in proteins. Biochemistry. 1968; 7(12):4247-4254.

153. Patrick JS, Lagu AL. Determination of recombinant human proinsulin fusion protein produced in Escherichia coli using oxidative sulfitolysis and two-dimensional HPLC. Anal Chem. 1992; 64(5):507-511.

154. Мальцев К.В., Вульфсон А.Н., Иванов В.Т. Метод получения проинсулина человека.// 1995. Пат. РФ № 2045535.

155. QuickFold™ Protein Refolding Kit, Athena Environmental Sciences, Inc. Baltimore, MD, 2005.

Информация о работе

Казеева, Тамара Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Доменная организация IgA1-специфичной протеазы Neisseria meningitidis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы