Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протективная активность синтетических пептидных фрагментов белков поверхностной мембраны менингококка серогруппы В и их конъюгатов при менингококковой инфекции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Протективная активность синтетических пептидных фрагментов белков поверхностной мембраны менингококка серогруппы В и их конъюгатов при менингококковой инфекции"

На правах рукописи

ООЗ166899

Чибискова Ольга Владимировна

ПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ БЕЛКОВ ПОВЕРХНОСТНОЙ МЕМБРАНЫ МЕНИНГОКОККА СЕРОГРУППЫ В И ИХ КОНЪЮГАТОВ ПРИ МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ

03 00 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

д 6 ^р да

003166899

Работа выполнена на кафедре микробиологии медицинского факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» и в лаборатории иммунохимии Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель

кандидат биологических наук

Котельникова Ольга Викторовна

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук старший научный сотрудник

Грубер Ирина Мироновна

доктор биологических наук профессор

Михайлова Августина Алексеевна

Ведущее учреждение: Федеральное государственное учреждение науки Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им Л А Тарасевича

Защита состоится <<30у> ОУ 2008г в часов на засе ,ании диссертационного совета Д 212 203 05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов», по адресу 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 8

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов», по адресу 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6

Автореферат разослан <Д/>> ОЬ 2008г Ученый секретарь диссертационного совета//^

кандидат биологических наук, доцент /у// Гигани Ольга Борисовна

Актуальность проблемы.

В связи с высокой летальностью и серьезными осложнениями менингококковая инфекция продолжает оставаться актуальной международной проблемой На долю менингитов серогрупп А, В и С приходится около 90% заболеваемости менингококковой инфекцией И если в развивающихся странах доминирует серогруппа А этой инфекции, то в европейских странах и регионе Северной Америки преобладает менингит, обусловленный серогруппой В В Российской Федерации заболеваемость генерализованными формами менингококковой инфекцией серогруппы В в последние годы составляет около 26% от всех случаев заболевания менингитом трех основных эпидемически значимых серогрупп А, В и С [Королева И С и др , 2006], причем наибольшее число заболевших составляют дети до 14 лет (более 70%) Профилактика заболеваемости менингококковой инфекцией в России в настоящее время осуществляется с помощью вакцин, основанных на капсульных полисахаридах менингококков серогрупп А, С, Y и W135 [Таточенко В К, Озерецковский H А , 2007] Высокая эффективность этих вакцин позволяет легко справляться с эпидподъемами инфекции этих серогрупп Разработка же эффективной вакцины против инфекции, вызываемой менингококками серогруппы В, остается настоящей проблемой В отличии от капсульных А и С полисахаридов, полисахарид серогруппы В оказался мало иммуногенным и, по мнению ряда авторов, не должен присутствовать в вакцине из-за серологического сродства с ганглиозидами головного мозга человека и гипотетической опасностью аутоиммунного процесса у плода в утробе матери в ответ на его введение [Gotschlich Е С et al ,1977, Zollinger W D , et al, 1991, Romero D J et al, 1994, Haynnngen J et al, 1995] Эти данные определили по» ск новых подходов для создания вакцин против этой серогруппы, и в первую очередь, изучение основных белков наружной мембраны (БНМ) менингококка

Начиная с 80-х гг XX века свойства основных БНМ менингококка активно изучали, и на их основе предлагали различные варианты противоменингококковых вакцин Первая В-вакцина на основе везикул белков внешней мембраны менингококка, была создана кубинскими исследователями и оказалась высокоэффективной (83%) при иммунизации подростков на Кубе [Sierra G V et al, 1991] В Бразилии, где доминировали штаммы других серотипов и серосубтипов, эффективность вакцины составила 74% [de Moraes J С , et al., 1992, Milagres L G , 1994] Эффективной для взрослых оказалась везикулярная В-вакцина норвежских исследователей [Bjune G , et al, 1991, Hoiby E A , 1991], но для детей младше двух лет она была менее эффективной, что заставило авторов продолжить исследования по ае усовершенствованию [Taperro J W et al, 1998] Голландскими исследователями разработана шестивалентная В-вакцина, которая основана на мутанте норвежского вакцинного штамма 44/76, состоящая на 90 % из белка Рог A [Peters С С A M , et al, 1996, Claassen 1, et al, 1996, Rouppe Van der Voort E , 1998] В некоторых

европейских странах, в частности, в Греции, представленные в гексавалентной вакцине белки Рог А обнаруживаются лишь у 8% штаммов серогруппы В, циркулирующих в настоящее время [Tzankaki G et al, 2006], что исключает ее применение там Менингококковая новозеландская вакцина (MeNZB), основана на норвежском штамме 44/76 (В 15 Р1 7,16), была разработана для остановки эпидемии в Новой Зеландии, вызванной штаммом В4Р1 7Ь,4, индуцировала выработку бактерицидных антител, главным образом, специфичных к Рог А [Findlow J , 2007, Sundbu S , 2007]

В реестре разрабатываемых вакцин [The Jordan Report, 2007] содержится описание более 10 вакцинных препаратов, содержащих различные компоненты наружной мембраны менингококка и прошедших разные фазы исследования Однако, до настоящего времени в практике здравоохранения не существует вакцины, характеризующейся высокой эффективное 1ью против различных штаммов менингококка серогруппы В Разнообразие вирулентных штаммов менингококков серогруппы В диктует необходимость включения в вакцину большого числа маркеров и содержания других компонентов микробной клетки для обеспечения ее поливалентности

В свете изложенного, в настоящий момент остается актуальной задача поиска новых антигенов N meningitidis для изучеьля их протективных и иммуногенных свойств, с целью разработки эффективного иммунопрофилактического препарата, защищающего, в первую очередь, от инфекции, вызываемой менингококком серогруппы В Этой проблеме и посвящена настоящая диссертация

Успехи иммунологии и молекулярной биологии последней четверти XX века привели к появлению новых стратегических подходов к созданию вакцин В том числе была разработана концепция, включающая использование в вакцинных препаратах синтетических пептидов, моделирующих фрагменты белков возбудителя Достоинствами подобных вакцин является безопасность при получении, отсутствие токсичности и побочных эффектов при вакцинации, а также возможность сфокусировать иммунный ответ на консервативных участках структуры возбудителя тех, которые не варьируют от штамма к штамму

Для конструирования менингококковой В-вакцины, нами было выбрано направление, основанное на включении в создаваемый препарат синтетических пептидных фраг ментов основных БНМ менингококков Установленная ныне аминокислотная последовательность этих белков позволяет синтезировать как В, так и Т-комплиментарные участки пептидов, которые, кроме того, являются консервативными участками указанных белков, а значит общими для всего вида нейссерий Актуальность такого подхода к к( нструированию нового поливалентного вакцинного противоменингококкового препратата несомненна

Цель исследования: Цель данного исследования заключалась в выборе синтетических пептидных фрагментов БНМ менингококка серогруппы В, оценке их протективных и иммуногенных свойств и создании на их основе препаратов для профилактики менингококковой ичфекции в опытах на животных

Задачи исследования:

1 Охарактеризовать протективную актиьность синтетических пептидных фрагментов БНМ РогА, ОраВ и №рА менингококка серогруппы В

2 Отобрать пептиды, относящиеся к консервативным участкам БНМ серогруппы В и обладающие иммуногенными и протективными свойствами в отношении менингококковой инфекции этой серогруппы

3 Оценить иммуногенные и протективные свойства выбранных пептидных фрагментов БНМ менингококка серогруппы В в отношении менингококков серогрупп А и С

4 Исследовать роль клеточного и гуморального факторов при постинфекционном и поствакцинальном имм^/нитете у мышей, иммунизированных синтетическими пептидами, в защите от менингококковой инфекции

5 Изучить иммуногенные и протективные свойства синтетических пептидов БНМ менингококка серогруппы В посте конъюгации их с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А

Научная новизна. Впервые в эксперименте га животных показана протективная активность синтетических пептидных фрагментов консервативных участков БНМ РогА, ОраВ и №рА менингококка серогруппы В в отношении менингококковой инфекции трех основных серогрупп А, В и С

Показано, что напряженность иммунитета, возникающая у мышей при иммунизации их синтетическими пептидами, сопоставима с таковой у мышей после заражения их живой вирулентной культурой менингококка

Выявлена ведущая роль клеточного звена в формировании иммунитета к менингококковой инфекции

Установлено, что синтетические пептиды основных БНМ менингококка серогруппы В после конъюгации их с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А сохраняют свою протективную активность при защите мышей от заражения живой вирулентной культурой менингококков серогрупп А и В

Практическая значимость. На основе синтетических пептидов консервативных участков БНМ менингококка серогруппы В, конъюгированных с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А, в перспективе,

может быть сконструирована поливалентная вакцина против менингококковой инфекции

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Синтетические пептидные фрагменты БНМ РогА, ОраВ и №рА менингококка серогруппы В обладают протективной активностью в отношении менингококка серогруппы В

2 Пептидные фрагменты консервативных участков БНМ менингококка серогруппы В проявляют протективные свойства в отношении менингококков серогрупп А и С

3 Ведущую роль в защите от менингококковой инфекции играет клеточное звено иммунитета

4 Синтетические пептиды БНМ менингогсокка серогруппы В, конъюгированные с капсульным полисахаридом серогруппы А, способны защищать мышей от менингококковой инфекции серогрупп А и В

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на - XI Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» (г Москва, 2004г.), - XVIII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (г Москва, 2006г), - XV Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии Достижения современной биологической химии и перспективы их применения» (г Геленджик, 2007г), - XI Всероссийской конференции «Дни иммунологии в С -Петербурге» (2007г) Апробация диссертации состоялась на заседании кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН (г Москва, 2007г )

Публикации. По теме диссертации опубликовар о 9 научных работы, из них 7 в журналах рекомендованных ВАК РФ и получен патент (Способ приготовления бивалентной вакцины для профилактики менигококковой инфекции № 2250113,2003)

Структура и объем диссертации. Материалы работы изложены на 105 страницах машинописного текста и состоят из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы, включающего 132 источника Диссертация иллюстрирована 9 рисунками и 28 таблицами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Лабораторные животные Исследования проведены на 1568 мышах -самки линии CBA/La, весом 16-18 г, полученных из питомников «Столбовая» и «Пущино»

Антигены.

-пептидные фрагменты БНМ РогА, ОраВ и NspA менингококка серогруппы В Пептиды были синтезированы в лаборатории Синтетических вакцин Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН Для синтеза были выбраны участки, являющиеся потенциальными В-эпитопами белков и содержащие теоретически рассчитанные Т-хелперные эпитопы [Вольпина О М , 2002] Синтезированные пептиды содержали последовательность, как экспонированных участков петель, так и части трансмембранных участков В настоящей работе использована аминокислотная последовательность белков РогА и NspA штамма 44/76, аминокислотная последовательность белка ОраВ штамма Z2491 Пептиды были получены твердофазным методом путем наращивания цепи с С-концевой аминокислоты в ручном варианте на n-алкок :ибензильном полимере [Udenfnend S et al ,1987]

-пептидные фрагменты БНМ РогА и ОраВ менингококка серогруппы В, конъюгированные с капсульным полисахаридом серогруппы А Для синтеза конъюгатов был выбран метод, заключающийся в генерировании альдегидных групп путем окисления свободных вицинальных гидроксильных групп полисахарида А с помощью периодата натрия [Jennings Н J , 1981 ]

Бактериальные культуры Лиофилизированные культуры N meningitidis серогруппы А - штамм 208, серогруппы В - штамм 44/76 (В 15 Р1 7,16), 15 (В 15 Р1 7), 2394 (В 2b Р1 2), 125 (В 2а Р1 2) и серогруппы С - штамм 3806 были получены из музея ГИСК им Л А Тарасевича

Иммунизация животных Мышей иммунизировали свободными пептидами подкожно в дозе 50 мкг на мышь однократно с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) или двукратно с интервалом 15 суток Повторную иммунизацию проводили с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) Раствор пептида и адъювант смешивали в соотношении 1 1 Контролем служили мыши, получившие инъекции адъюванта по той же схеме, что и иммунные мыши Конъюгированные пептиды вводили мышам без адъюванта, однократно или двукратно в дозах от 3-х до 100 мкг на мышь Контролем служили интактные животные, после введения им физиологического раствора хлорида натрия

Протективную активность препаратов оценивали у иммунизированных мышей после их заражения живой вирулентной культурой менингококков серогрупп А, В, и С спустя месяц поспе последней иммунизации Мышей

заражали менингококком в дозах 25 1 06, 2,5 106 и 0,25 10г' микробных клеток (м к) внутрибрюшинно в смеси с железным декстраном (Sigma,USA) из расчета 13 мг железа на мышь Показателем активности вводимых мышам препаратов служило снижение числа колониеобразующих единиц (КОЕ) в крови мышей опытной группы, через 4 часа после заражения их сублетальной дозой менингококка, по сравнению с числом КОЕ в контрольной группе (в пересчете на 100 КОЕ в контроле) Протективную активность оценивали по индексу эффективности иммунизации (ИЭ) (соотношение LD50 в опыте и в контроле, ИЭ >10 считали защитным) и величине LDs0 культуры Гибель мышей учитывали на 5-й день после заражения

Наличие бактериолизинов в крови иммунных мышей оценивали микрометодом в реакции иммунного бактериолиза (РИБ) [Growe В A et al ,1989] Контролем служило число КОЕ в лунках, с добавлением к микробной культуре сыворотки интактных мышей и комплемента Положительным ответом считали снижение числа КОЕ на 50% и более по сравнению с контролем

Специфические антитела в крови иммунных животных определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) в двух вариантах постановки при сорбции на планшет соответствующего пептида (ИФАп ) или целой микробной клетки (ИФАцк) [Grunow R et al ,1988] Наличие специфических антител к пептидам в крови опытных животных оценивали в различные сроки после иммунизации Оптическое поглощение при проведении ИФА измеряли на приборе Multiscan Plus MKII (Flow Laboratories, Великобритания) при длине волны 492 нм За титр противопептидных антител принимали значение разведения сыворотки, дающее поглощение более 0,1 ОЕ и превышающее фоновый уровень в два раза

Метод адаптивного переноса лимфоцитов В различные сроки после иммунизации пептидами или после заражения микробами («переболевшие» мыши) из селезенок, тимуса и лимфатических узлов мышей в градиенте плотности сахарозы, с концентрацией 20, 40 и 60%, выделяли лимфоциты Популяцию Т-лимфоцитов получали отрицательной селекцией в результате адсорбции макрофагов на пластике и удалением В-лимфоцитов (метод «пеннинга») [Дж Клаус, 1990] Полученную взвесь лимфоцитов вводили внутривенно интактным мышам-реципиентам и через 3 часа заражали N meningitidis Контролем служили реципиенты лимфоцитов интактных доноров или доноров, получивших адъювант Показателем протективности перенесенных лимфоцитов служило снижение числа КОЕ в крови мышей-реципиентов иммунных лимфоцитов по сравнению с аналогичным показателем в группе реципиентов интактных лимфоцитов

Метод пассивной защиты Интактным мышш .-реципиентам вводили внутривенно 0,2 мл сыворотки, полученной на 30 сутки после иммунизации мышей пептидами или мышей, «переболевших» менингококковой инфекцией

Заражение N meningitidis проводили через 3 часа после переноса сыворотки Протективные свойства сывороток оценивали по снижению числа КОЕ в крови реципиентов иммунных сывороток по сравнению с этим же показателем у реципиентов интактных сывороток

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием компьютерных программ Биостат, Probit Analysis и с помощью программного обеспечения MS Office Exel

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика пептидных фрагментов белков РогА, ОраВ и NspA наружной мембраны менингококка серогруппы В.

Для выявления активных участков БНМ РогА, ОраВ и NspA менингококка серогруппы В изучали протективную и иммуногенную активность синтетических пептидных фрагментов в зависимости от кратности иммунизации животных Мышей иммунизировали однократно или двукратно в дозе 50 мкг пептида на мышь Наличие специфических антител к этим пептидам оценивали в ИФАп на 30-е сутки после последней иммунизации, накануне заражения штаммом 44/76 N meningitidis серогруппы В

Определение иммуногенной и протективной активности пептидных фрагментов белка РогА. Анализ иммуногенной и протективной активности синтетических пептидов белка РогА показал (таб 1), что после однократной иммунизации протективными оказались 4 пептидных фрагментов 32-51, 178199, 273-292, 306-332 (ИЭ>10) Повторная иммунизация этих животных соответствующими пептидами позволила выявить еще три протективных антигена - 118-143, 233-252, 346-363 У 6 из 7 активных пептидов наблюдалась протективная активность после вторичной иммунизации Антитела были обнаружены только к четырем из 12 изученных пептидов - 32-51, 118-143, 223242, 306-332 Уровень антител к этим пептидам не зависел от числа иммунизации При иммунизации мышей некоторыми пептидами с выраженной протективной активностью (178-199, 233-242, 273-292, 346-363) - антитела выявлены не были Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии корреляции между протективной активностью и способностью к антителообразованию, регистрируемому в ИФАп

Таблица 1 Влияние числа иммунизации на активность пептида

Номер пептида ИЭ Титр антител

1 ммуни зация 2 ммуни зация 1 иммуни зация 2 ммуни зация

12-31 1,4 1,2 <1 10 <1 10

22-41 3,8 5,6 <1 10 <1 10

32-51 12,0 35,1 1 1280 1 1280

77-96 1,4 3,7 <1 10 <1 10

118-143 5,6 13,7 1 2560 1 2560

166-187 1,2 2,0 <1 10 <1 10

178-199 19,9 48,4 <1 10 <1 10

223-242 4,4 7,9 1 1280 I 1280

233-252 7,9 17,6 1 10 <1 10

273-292 28,1 29,9 1 10 <1 10

306-332 33,0 44,2 1 2560 1 5120

346-363 5,6 16,6 1 Ю <1 10

контроль 1,0 1,0 <1 10 <1 10

Наличие антител к 6 протективным пептидам оценивали в ИФАц к (таб 2)

При иммунизации мышей пептидными фрагментами 118-143, 273-292, 306-332, 346-363 были выявлены специфические а! титела к эпитопам на поверхности всех использованных в работе штаммов менингококка серогруппы В, что подтверждает консервативность этих пептидов

Таблица 2 Наличие общих эпитопов на поверхности менингококков серогруппы В с различной серотиповой и серосубтиповой принадлежностью

штамм фенотип Титр антител п ри иммун «ации пептидами

32-51 118143 178199 273292 306332 346363

44/76 В 15 Р 1 7,16 1 1280 1 160 1 640 1 320 1 640 1 320

15 В 15 Р 1 7 1 640 1 1280 <1 20 1 20 1 640 1 640

2394 В 2Ь Р 1 2 <1:20 1 640 <1 20 1 640 1 640 1 640

125 В 2а Р 1 2 <1 20 1-640 <1 20 1 160 1 160 1-320

При иммунизации мышей пептидами 32-51 и 178-199 не выявлены антитела к поверхностным эпитопам гетерологичных штаммов Эти фрагменты относятся к вариабельным участкам белка РогА и несут на себе серосубтиповые маркеры штамма 44/76, в связи с чем, использование этих пептидов при

конструирование вакцины для защиты от N meningitidis представлялось не целесообразным

На основании полученных данных для дальнейшей работы были выбраны 4 пептида (118-143, 273-292, 306-332, 346-363), обладающие протективной активностью и относящиеся к консервативным участкам белка Рог А

Иммунологическая активность выбранных пептидных фрагментов была охарактеризована после двукратной иммунизации мышей по четырем показателям ИЭ, РИБ, ИФАп и ИФАц к (табл 3)

Таблица 3 Характеристика пептидов при оценке различных показателей

Показатель Номер пептида

118-143 273-292 306-332 346-363

ИЭ 13,7 29,9 44,2 16,6

РИБ* 160 80 40 40

ИФАп * 2560 <10 25 50 <10

ИФАц к * 160 320 640 320

* - титры антител выражены величиной, обратной разведению сыворотки

Показано отсутствие прямой зависимости между протективной активностью пептидов и наличием специфических антител к ним Так, при высокой протективности пептидов 273-292 и 346-363 антитела к ним в ИФАп не выявлялись, но обнаруживались при постановке ИФАц к О случаях отсутствия корреляции между этими показателями сообщается и в литературе [Granoff DM et al ,1998,Mahon BP et al, 2000] По-видимому, антитела не являются единственным барьером на пути менингококковой инфекции, и защита от последней может быть реализована за счет клеточного звена иммунитета, в частности, за счет цитотоксических Т-лимфоцитов

Характеристика пептидных фрагментов белка ОраВ По данным ряда авторов [Дельвиг А А и др, 2000] опалесцирующие белки, в частности ОраВ, обладают наиболее выраженными протективными свойствами в отношении N meningitidis В связи с этим, была изучена способность пептидных фраг ментов таких белков индуцировать иммунный ответ при введении их мышам (таб 4)

При однократной иммунизации мышей пептидн1 ми фрагментами белка ОраВ только четыре (30-51, 64-83, 109-130, 128-150) из 11 пептидов обладали выраженной протективной активностью (ИЭ>10) При повторной иммунизации мышей пептидами 30-51, 109-130, 128-150 защита мышей от заражения штаммом 44/76 N meningitidis снижалась в 2, 3 и 6 раз соответственно Увеличение протективной активности после повторной иммунизации наблюдалось у мышей привитых пептидом 74-93 (от ИЭ =3,1 до ИЭ=15,6)

Таблица 4 Влияние числа иммунизаций на активность пептида

Номер пептид ИЭ Титр антител

1 иммуни зация 2 иммуни зация 1 иммуни зация 2 иммуни зация

6-24 0,75 1,4 - 1 20480

30-51 31,4 14,0 <1 10 <1 10

41-63 6,0 4,1 1 10240 1 20480

55-73 0,9 1,0 1 2560 1 2560

64-83 15,8 14,9 1 5120 1 5120

74-93 3,1 15,6 1 1280 1 10

109-130 28,0 9,6 1 1280 1 20480

120-139 0,6 2,0 <1 10 1 80

128-150 31,4 4,8 1 160 1 10240

163-181 0,3 0,8 - 1 1280

222-240 0,3 0,6 1 5120- I 10240

контроль 1,0 1,0 <1 10 <1 10

Примечание "-" -опыт не ставили

Как и в случае пептидных фрагментов белка РогА, протективная активность пептидов белка ОраВ не зависела от наличия и уровня антител к этим пептидам Так, пептиды 6-24, 41-63, 55-73, 163-181, 22-240 не обладали протективностью, в то время как титр антител к ним составлял 1 2560 и выше К пептидам 30-51 и 74-93, обладающим протективной активностью, антитела в ИФАп не выявлялись В некоторых случаях (пептиды 109-130 и ¡28-150) при увеличении титра антител после повторной иммунизацки протективность резко снижалась Пептиды 30-51 и 128-150 относятся к на йолее консервативным участкам белка ОраВ и, при однократной иммунизации, обладают наибольшей защитной активностью Это послужило основанием для их дальнейшего изучения

Характеристика пептидных фрагментов белка NspA. Показателем протективности пептидных фрагментов белка NspA служило снижение числа КОЕ в крови мышей после их заражения штаммом Н44/76 N meningitidis серогруппы В (табл 5) Наличие антител к пептидам, выявляли методом ИФАп

При однократной иммунизации мышей пептидами 6-21, 79-95 и 128-144 антитела не выявлялись Уровень бактериемии у этих мышей значимо не отличался от такового в контрольной группе Повторная иммунизация пептидами 79-95 и 128-144 не снижала числа КОЕ в крови мышей при заражении N meningitidis После повторной иммунизации этими пептидами в

крови животных обнаруживались антитела в титрах титр 1 2569, 1 80, 1 320 соответственно

Таблица 5 Активность пептидных фрагментов белка NspA

Номер пептида Титр антител Число КОЕ

1 иммуни зация 2 иммуни зация 1иммуни зация 2 иммуни зация

6-21 <1 10 1 2560 75±13 -

40-62 1 2560 1 2560 9±4* 10±5*

79-95 <1 10 1 80 61±Г. 77±6

128-144 <1 10 1 320 57±7 89±9

контроль <1 10 1 10 100±5 100±6

Примечание "-" - опыт не ставили

* - достоверность различий с контрольной группой (р<0 05)

У мышей, однократно иммунизированных пептидом 40-62, после заражения N meningitidis наблюдается снижение числа КОЕ в крови почти в 10 раз по сравнению с контролем После повторного введения пептида 40-62 титр антител к нему и уровень бактериемии не менялись В лсокий уровень защиты от менингококковой инфекции мышей, иммунизированных пептидом 40-62 белка NspA, позволил выбрать этот пептид для дальнейшей работы

Защита мышей от менингококков серогрупп А, В и С с помощью синтетических пептидов.

Все синтетические пептиды вызывали у иммунизированных ими мышей защиту от заражения вирулентными штаммами менингококков (табл 9) Однако напряженность иммунитета, индуцируемого исследованными пептидами в отношении менингококков серогрупп А, В и С различается Так, синтетические пептидные фрагменты 306-322 и 273-292 белка РогА вызывали сходную защиту от заражения менингококками серогрупп А, В и С Остальные пептиды обладали более выраженными протективными свойствами при заражении мышей штаммом 208 N meningitidis серогруппы А При заражении штаммом 0638 N meningitidis серогруппы С мышей, иммунизированных синтетическими пептидами, наиболее активным оказался пептидный фрагмент 306-332 (число КОЕ снизилось до 26±4 по сравнению с контрольными животными) При иммунизации животных пептидами 118-143 и 346-392 белка РогА и пептидом 40-62 белка NspA число КОЕ снизилось примерно вдвое по сравнению с контролем Пептид 30-51 практически не защищал мышей от заражения штаммом 0638 N meningitidis серогруппы С

Таблица.9. Протективные свойства пептидов в отношении менингококков

серогрупп А, В и С

Белок Пептид Число КОЕ после з менингококками се аражения зогруппы

В 44/76 А 208 С 0638

РогА 118-143 40±3* 5±4* 60±7*

273-292 65±9 51±3* -

306-322 32±4* 22±6* 26±4*

346-363 62±6* 7±5* 63±12*

ОраВ 30-51 53±6* !8±8* 87±9

128-150 65±7 9±5* -

NspA 40-62 46±7* 9±5* 55±5*

контроль 100±7 100±6 100±9

Примечание: "-" - опыт не ставили

* - достоверность различий с контрольной группой (р<0.05)

Снижение числа КОЕ у мышей, иммунизированных исследуемыми пептидами, оказалось наименее выраженным при заражении гомологичным штаммом 44/76 N. meningitidis серогруппы В, тогда как при заражении штаммом 208 N. meningitidis серогруппы А наблюдается существенное снижение циркулирующих в крови микробов. Поскольку вирулентность штаммов менингококков, используемых для заражения, различна, можно предположить, что мало вирулентные штаммы легче элиминируются из организма.

Протективные свойства смеси пептидов.

Результаты предыдущих опытов позволили предположить, что иммунизация животных смесью пептидов приведет к более высокой защите их от заражения N. meningitidis (рис1.).

150;....................................................................... -

К 30-51 128-150 306-332 346-363 40-62 смесь пептиды

Рис. ]. Протективные свойства смеси пептидов

Для иммунизации мышей были использованы пептидные фрагменты 3051 и 128-150 (ОраВ), 306-322 и 346-363 (РогА). 40-62 (NspA), а так же смесь этих пептидов Мышей иммунизировали однократно из расчета 50 мкг каждого пептида на мышь с добавлением ПАФ и заражали штаммом 2394 N meningitidis серогруппы В

Результаты показали, что число КОЕ в крови мышей, иммунизированных смесью пептидов значительно ниже (КОЕ=13), чем при иммунизации любым из них.

Представленные данные свидетельствуют о том, что в состав вакцины против менингококка серогруппы В целесообразно включить несколько, наиболее перспективных пептидных фрагментов БНМ менингококка, обеспечивающих максимальный протективный эффект при защите животных от менингококковой инфекции

Изучение роли клеточного и гуморального факторов в защите мышей от менингококковой инфекции

У мышей, иммунизированных синтетическими пептидами или живыми микробами менингококка, изучали участие лимфоцитов и специфических антител к пептидам в защите от заражения живой вирулентной культурой N meningitidis

Роль антител к синтетическим пептидам в защите от менингококковой инфекции. Для оценки роли антитез в защите мышей от N meningitidis при иммунизации их пептидами, интактным реципиентам вводили сыворотку от мышей-доноров, иммунизированных пептидами двукратно в дозе 50 мкг на мышь, с последующим заражением реципиентов штаммом 44/76 N meningitidis серогруппы В (табл 6)

Таблица 6 Характеристика антител к пептидным фрагментам поверхностных белков менингококка серогруппы В

Иммунизация донора Число КОЕ**

Белок Номер пептида Титр антител в

ИФАп РИБ

РогА 118-143 1 2560 1 320 59±6*

273-292 <1 10 1 40 68±4

306-332 I 2560 I 40 38±7*

346-363 <1 10 1 80 48±6*

ОраВ 30-51 <1 10 <1 10 100±4

NspA 40-62 1 2560 <1 10 100±5

контроль <1 10 <1 10 100±4

* - достоверность различий с контрольной группой (р<0 05)

**- число КОЕ в крови мышей -реципиентов при пассивной защите

Для иммунизации доноров были использованы пептиды, выбранные на основании их протективной активности в опытах прямой защиты мышей от заражения штаммом 44/76 N meningitidis серогруппы В

Методом ИФАп специфические антитела к пептидным фрагментам белка РогА выявляли только в сыворотках доноров, иммунизированных пептидами 118-143 и 336-332. Сыворотки доноров, иммунизированных всеми пептидами этого белка, обладали бактерицидной активностью в титрах от 1 40 до 1 320 Эти сыворотки защищали мышей-реципиентов от заражения N meningitidis число КОЕ в крови мышей-реципиентов снижалось на 32-62% по сравнению с контролем При иммунизации доноров пептидным фрагментом 30-51 белка ОраВ антитела не были выявлены ни в ИФАп, ни в РИБ, и сыворотки этих мышей не защищали реципиентов от заражения N meningitidis Титр антител к пептиду 40-62 белка NspA в крови иммунизированных доноров, определяемый в ИФАп, составлял 1 2560 Сыворотка этих мышей не содержала бактерицидных антител и не обеспечивала защиту от заражения N meningitidis

Результаты этого опыта согласуются с приведен [ыми выше данными по отсутствию протективной активности некоторых пептидов при наличии специфических антител в крови иммунных животных

Роль лимфоцитов в защите от менингококковой инфекции.

Подтверждение ведущей роли клеточного механизма защиты мышей от N meningitidis при иммунизации синтетическими пептидами было получено в опытах переноса лимфоцитов от иммунного донора кнтактным реципиентам (таб 7)

Таблица 7 Протективные свойства иммунных лимфоцитов

Иммунизация донора Число КОЕ при заражении штаммами**

Белок Номер пептида Н44/76 2394

РогА 118-143 29±9* -

306-332 14±6* 26±9*

346-363 - 49±4*

ОраВ 30-51 - 13±6*

128-150 15±5* 28±6*

NspA 40-61 54±6* 59±9*

Адъювант 100±7 100±9

Примечание "-" - опыт не ставили

*- достоверность различий с контрольной группой (р <0 05)

**- число КОЕ в крови мышей-реципиентов иммунных лимфоцитов

Лимфоциты выделяли на 30-е сутки после первой иммунизации пептидами и в дозе 20 106 клеток переносили мыша л-реципиентам Эффект защиты оценивали по уровню бактериемии у мышей-реципиентов после заражения N meningitidis с различной серосубтиповой принадлежностью (штамм 44/76 и штамм 2394)

Перенос лимфоцитов от доноров, иммунизированных пептидами, обеспечивал защиту мышей-реципиентов от заражения штаммами 44/76 и 2394 N meningitidis серогруппы В Наименее защищеннмми от N meningitidis оказались реципиенты лимфоцитов от доноров, иммунизированных пептидом 40-61 Число КОЕ в крови этих реципиентов снижалось почти на 50% При той же дозе переносимых лимфоцитов более высокую защиту обеспечивали клетки мышей, иммунизированных пептидами 118-143, 306-332, 30-51 и 128-150 Число КОЕ составляло от 13 до 29 Лимфоциты доноров, иммунизированных пептидами 306-332,128-150 и 40-61, обеспечивали одинаковый уровень защиты реципиентов от обоих штаммов N meningitidis Получе шые данные говорят об участии клеточных механизмов в защите животных при заражении штаммами 44/76 и 2394 менингококка серогруппы В

Роль Т-лимфоцнтов в процессе защиты организма от меиингококковой инфекции. Для оценки роли Т-лимфоцтов в защите от менингококковой инфекции мышей иммунизировали одно- или двукратно пептидными фрагментами 273-292 и 306-332 белка РогА или живыми микробами штаммом 44/76 N meningitidis серогруппы В («переболевшие» мыши) (таблица 8)

Таблица 8 Защита мышей Т-лимфоцитами от заражения N meningitidis

Иммунизация доноров Защита реципиентов

антиген кратность иммунизаций переносимые лимфоциты число КОЕ

273-292 1 Т 88±9

2 47±7*

306-332 1 50±5*

2 50±6*

микроб 1 62±6

2 58±4*

микроб 1 суммарные 17±6*

2 U 7±4*

контроль 1 U 100±4

2 а 100±7

* - достоверность различий с контрольной группой (р<0 05)

Через месяц после последней иммунизации из селезенок мышей, иммунизированных пептидами, выделяли популяцию Т-лимфоцитов, а от «переболевших» животных - популяцию Т-лимфоцитов и суммарные лимфоциты Лимфоциты переносили внутривенно интактным мышам-реципиентам с последующим заражением их штаммом 44/76 N meningitidis серогруппы В. Положительным контролем служили реципиенты суммарных лимфоцитов от «переболевших» животных, отрица-ельным - от доноров, получивших адъювант Суммарные лимфоциты переносили в дозе 20 1 06, а Т-лимфоциты - в дозе 7 106 клеток, пропорциональной содержанию их в суммарной взвеси

Перенос клеток от контрольных животных не обеспечивал защиты от заражения культурой N meningitidis Снижение числа КОЕ в крови реципиентов Т-лимфоцитов «переболевших» мышей, не зависело от числа иммунизаций донора и составляло соответственно 62±6 и 58±4 При переносе суммарных лимфоцитов от «переболевших» доноров число КОЕ снижалось от однократно иммунизированных доноров до 17±6, от двукратно - до 7±4 Уровень бактериемии у реципиентов Т-лимфоцитов мышей, иммунизированных пептидом 306-332, также не зависел от кратности иммунизации донора и составлял 50 КОЕ Перенос Т-лимфоцитов от доноров, двукратно иммунизированных пептидом 273-292, внзывал снижение числа КОЕ у мышей-реципиентов почти вдвое больше, чем перенос Т-лимфоцитов от мышей, однократно иммунизированных этим пептидом Протективная роль Т-лимфоцитов при иммунизации мышей синтетическими пептидами была сопоставима с этим показателем для «переболевших» млшей

Таким образом, полученные результаты показали непосредственное участие Т-лимфоцитов в процессе защиты иммунных животных от менингококковой инфекции

Сравнение иммунного статуса мышей после иммунизации пептидами и животных, «переболевших» менингококковой инфекцией.

Сравнение напряженности иммунитета у вакцинированных и «переболевших» мышей, оценивали в опытах прямого заражения (доноры) и при переносе лимфоцитов от этих животных интактным реципиентам Мышей-доноров однократно заражали штаммом 44/76 N men.ngitidis серогруппы В в сублетальной дозе 0,25 1 06 мк («переболевшие» мыши) или иммунизировали пептидом 306-332 белка Рог А в дозе 50 мкг Контролем служили мыши, получившие ПАФ Перенос лимфоцитов осуществляли через месяц после иммунизации доноров в дозе 20 1 06 клеток Реципиентов и доноров одновременно заражали штаммом 44/76 в дозах 25 1 06- 2,5 1 06- 0,25 1 06 м к через сутки после переноса лимфоцитов (таб 9)

Таблица 9 Сравнение протективных свойств лимфоцитов от мышей, иммунизированных пептидом 306-322 или «переболевших» N meningitidis

Группа Иммунизация донора Доза за ражения, 106 м к ИЭ

25 2,5 0,25

Доноры микробами 5/20* 14/20 20/20 45,2

пептидом 6/20 14/20 16/20 52,5

контроль 0/20 9/20 15/20 1,0

Реципиенты микробами 4/7 6/7 7/7 10,8

пептидом 4/10 6/10 10/10 5,0

контроль 2/7 3/7 5/7 1,0

*- число выживших /число зараженных мышей

У мышей-доноров, иммунизированных пептидом, ИЭ не отличался от этого показателя у «переболевших» животных и составлял соответственно - 52, 5 и 45,2 Перенос иммунных лимфоцитов от этих мышей интактным реципиентам обеспечивал выраженную защиту последних по сравнению с переносом лимфоцитов от мышей контрольной группы (ИЭ равнялся 5,0 и 10,8 соответственно) Более низкий ИЭ для реципиентов пг сравнению с донорами можно объяснить недостаточным количеством перенесенных иммунных лимфоцитов в организме реципиентов по сравнению с аналогичными клетками в организме донора Полученные результаты, свидетельствуют о способности пептида, относящегося к высоко консервативному участку белка РогА, обеспечивать защиту животных от заражения вирулентной культурой N meningitidis, сопоставимую с защитой, формирующейся у «переболевших» животных.

Протективная активность пептидов, конъюгированных с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А.

Поскольку пептидные фрагменты белков в свободном состоянии неиммуногенны, для проявления их активности в работе использовали адъювант Фрейнда, который не пригоден при вакцинации людей Для сохранения иммуногенности пептидов была проведена их конъюгация с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А, разрешенным к применению в качестве противоменингококковой вакцины Представляло интерес изучить иммуногенную и протективную активность полученных комплексных соединений

Мышей иммунизировали однократно внутривенно конъюгагами пептидов 118-143, 273-292, 306-332, 346-363, 128-150, из расчзта 50 мкг пептида на мышь В предварительных экспериментах доза 50 мкг была выбрана как оптимальная при изучении протективной активности пептидных фрагментов

□ серогруппа В 0 серогруппэ А

^ 100

Е

о

50

0

11S+A 273+А 30S+A 346+А

к

конъюгаты

Рис. 2. Протективная активность конъюгирова..ных пептидов.

На 30-е сутки после однократной иммунизации мышей заражали штаммом 44/76 N. meningitidis серогруппы В и штаммом 208 N. meningitidis серогруппы А (рис.2). Протективную активность препаратов оценивали по снижению числа КОЕ в крови иммунных животных. Контролем служили интактные мыши.

У всех животных, иммунизированных конъюп;рованными пептидами, число КОЕ снижалось более чем в два раза как при заражении менингококком серогрупп А, так и В. Исключение составлял конъюгат 273-292 пептида. При заражении N. meningitidis серогруппы В число КОЕ в крови мышей, иммунизированных этим конъюгатом равнялось 59.

Таким образом, в результате конъюгации синтетических пептидных фрагментов БНМ РогА и ОраВ серогруппы В с капгульным полисахаридом менингококка серогруппы А были получены препараты способные обеспечивать защиту мышей от заражения N. meningitidis и серогруппы В, и серогруппы А.

1. Показана протективная активность синтетических пептидных фрагментов БНМ РогА, ОраВ и NspA менингококка серогруппы В.

2. Отобраны пептидные фрагменты консервативных участков БНМ, обладающие протективными и иммуногенными свойствами в опытах защиты мышей от заражения менингококками серогрупп В.

3. Показано, что пептидные фрагменты консервативных участков БНМ менингококка серогруппы В проявляют протективные свойства в отношении менингококков серогрупп А и С.

4. Выявлено участие клеточного и гуморального факторов в защите животных от менингококковой инфекции.

5. Установлено, что синтетические пептидные фрагменты БНМ менингококка N. meningitidis серогруппы В при конъюгации с капсульным полисахаридом N. meningitidis серогруппы А, будучи введенным мышам в

Выводы

качестве прививочного препарата, способны защищать мышей от заражения менингококком серогрупп А и В

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Чибискова О В (в соавторстве с Несмеяновым В А , Котельниковой О В , Вольпиной О М, Феоктистовым К М , Жмаком М Н, Короевым Д О, Аллилуевым АП, Ивановым ВТ) //Способ пршотовления бивалентной вакцины для профилактики менигококковой инфекции / Патент № 2250113, 2003

2 Котельникова ОВ, Чибискова ОВ, Нешеянов В А, Аллилуев А П , Вольпина О М , Короев Д О , Жмак М Н , Титова М А , Иванов В Т //Протективные свойства синтетических пептидов наружной мембраны менингококков / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2005, № 5, С 553-556

3 Котельникова О В , Чибискова О В , Феоктистов К М , Королева И С, Несмеянов В А , Аллилуев А П , Короев Д О , Вольпина О М , Иванов В Т //Конструирование противоменингококковых вакцин на основе синтетических пептидов белков поверхностной мембраны менингококка серогруппы В / Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2005, № 6(25), С 2832

4 Котельникова О В , Чибискова О В , Феоктистов К М , Лахтина О Е , Несмеянов В А , Аллилуев А П , Королева И С, Короев Д О , Вольпина О М, Иванов В Т //Перспективы создания вакцннного препарата для профилактики менингококковой инфекции серогруппы В на основе синтетических пептидов / Биопрепараты, 2005, № 4(20), С 2-6

5 Аллилуев А П, Аваков А Э, Чибискова О В //Вакцинопрофилактика менингококковой инфекции /Биопрепараты, 2006, № 3, С 6-8

6 Чибискова О В , Котельникова О В , Несмеянов В А , Вольпина О М, Короев Д О , Филатова М П //Механизмы формирования защиты от менингококковой инфекции у мышей, иммунизированных синтетическими пептидами / Бюплетень экспериментальной биологии и медицины, 2007,№ 6, С 663-666

7 Аллилуев А П, Котельникова О В , Лахтина О Е , Чибискова О В , Несмеянов В А , Вольпина О М, Короев Д О, Филатова М П , Королева И С //Роль антител к пептидным фрагментам белков наружной мембраны менингококка в защите от менингококковой инфекции / Вестник Российского университета дружбы народов, 2007, Т 35, №2, С 24-30

8 Филатова М П, Котельникова О В , Чибискова О В , Несмеянов В А, Аллилуев А П, Короев Д О , Волкова Т Д, Вольпина О М, Иванов В Т //Новый подход к созданию синтетических вакцин путем конъюгации пептидов с полисахаридами на примере менингококковой вакцины / Материалы

международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии Дс стижения современной биологической химии и перспективы их применения», Геленджик, 2007, С 303304

9 Котельникова О В , Чибискова О В , Несмеянов В А , Аллилуев А П , Филатова М П, Короев Д О , Волкова Т Д, Вольпина О М , Иванов ВТ// Протективная активность синтетических пептидов и их конъюгатов в зашите от менингококковой инфекции / Материалы международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии Достижения современной биологической химии и перспективы их применения», Геленджик, 2007, С 300-301

Протективная активность синтетических пептидных фрагментов белков поверхностной мембраны менингококка серогруппы В и их конъюгатов при менингококковой инфекции

Чибискова Ольга Владимировна Профилактика менингококковой инфекции серогруппы В остается важной для здравоохранения Поскольку разработка необходимого профилактического препарата против этой серогруппы сопряжена с большими сложностями Перспективным является направление, основанное на использовании синтетических фрагментов белков поверхностной мембраны менингококка, обладающих протективными свойствами

В работе показано, что иммунизация мышей синтетическими пептидами белков РогА, ОраВ и NspA, введенных животным с адъювантом Фрейнда, обеспечивает защиту от заражения менингококками различных серогрупп Антитела к этим пептидам присутствуют в крови хак иммунизированных пептидами животных, так и у мышей, инфицированных штаммами различных серогрупп N meningitidis После конъюгации этих пептидов с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А удалось получить препараты, введение которых мышам обеспечивало защиту от заражения менингококком как серогруппы В, так и от серогруппы А

Для некоторых пептидных фрагментов показана ведущая роль Т-лимфоцитов в защите от менингококковой инфекции

Protective activity of synthetic peptide fragments of meningococcal seroserogroup В outer membrane proteins and polysaccharide-peptide conjugates against meningococcal infection

Chibiskova Olga Vladimirovna The prophylaxis of meningococcal serogroup В infection remains a vital issue for the health care system since the development of the vaccine against this meningococci serogroup poses a great difficulty A challenging approach to the meningitis В vaccine development is based on the use of synthetic peptide fragments of meningococcal serogroup В outer membrane proteins, capable of inducing protective immunity

The study shows that immunization of mice with different synthetic peptide fragments of РогА, ОраВ и NspA proteins, administered n with complete Freund's adjuvant (CFA), protects the animals against meningococcal infection of various serogroups Antibodies to these peptides are detected in the sera of mice immunized with the peptides, as well as in the sera of mice infected with strains of various N meningitides serogroups Coupling of these protective peptides with capsular polysaccharide of serogroup A meningococci has made it possible to develop drugs, which induce protection in mice against meningococcal infection of both A and В serogroups

It has been demonstrated that the leading role in protective activity of some peptide fragments against meningococcal infection belongs to T-lymphocytes

Подписано в печать 27 03 2008 Печать трафаретная

Заказ №215 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-50, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чибискова, Ольга Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Необходимость создания вакцины против инфекции, вызываемой менингококком серогруппы В.

1.2. Менингококковые вакцины серогруппы В на основе капсульного полисахарида.

1.3. Комплексные вакцины против менингококка серогруппы В.

1.4. Конъюгированные вакцины на основе антигенов поверхностной мембраны менингококка.

1.5. Вакцины на основе синтетических пептидов.

1.6. Белки наружной мембраны N. meningitidis серогруппы В как антигены для создания вакцинного препарата.

1.6.1. Белок 1 класса -РогА.

1.6.2. Белки 5 класса - Ора.

1.6.3. Железодефицитный белок NspA.

1.7. Роль клеточного и гуморального иммунитета в защите от менингококковой инфекции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протективная активность синтетических пептидных фрагментов белков поверхностной мембраны менингококка серогруппы В и их конъюгатов при менингококковой инфекции"

Актуальность проблемы.

В связи с высокой летальностью и серьезными осложнениями менингококковая инфекция продолжает оставаться актуальной международной проблемой. На долю менингитов серогрупп А, В и С приходится около 90% заболеваемости менингококковой инфекцией. И если в развивающихся странах доминирует серогруппа А этой инфекции, то в европейских странах и регионе Северной Америки преобладает менингит, обусловленный серогруппой В. В Российской Федерации заболеваемость генерализованными формами менингококковой инфекцией серогруппы В в последние годы составляет около 26% от всех случаев заболеваний менингитом трех основных эпидемически значимых серогрупп А, В и С

10], причем наибольшее число заболевших составляют дети до 14 лет (более 70%). Профилактика заболеваемости менингококковой инфекцией в России в настоящее время осуществляется с помощью вакцин, основанных на капсульных полисахаридах менингококков серогрупп А, С, У и АМ135

11]. Высокая эффективность этих вакцин позволяет легко справляться с эпидподъемами инфекции этих серогрупп. Разработка же эффективной вакцины против инфекции, вызываемой менингококками серогруппы В, остается настоящей проблемой. В отличии от капсульных А и С полисахаридов, полисахарид серогруппы В оказался низко иммуногенным и, по мнению ряда авторов, не должен присутствовать в вакцине из-за серологического сродства с ганглиозидами головного мозга человека и гипотетической опасностью аутоиммунного процесса у плода в утробе матери в ответ на его введение [4,7, 27,42,]. Эти данные определили поиск новых подходов для создания вакцин против этой серогруппы, и в первую очередь, изучение основных белков наружной мембраны (БНМ) менингококка.

Начиная с 80-х гг. XX века свойства основных БНМ менингококка активно изучали, и на их основе были предложены различные варианты противоменингококковых вакцин. Первая В-вакцина на основе везикул белков внешней мембраны менингококка, была создана кубинскими исследователями и оказалась высокоэффективной (83%) при иммунизации подростков на Кубе [31]. В Бразилии, где доминировали штаммы других серотипов и серосубтипов серогруппы В, эффективность вакцины составила 74% [35,87]. Эффективной для взрослых оказалась везикулярная В-вакцина норвежских исследователей [24], но для детей младше двух лет она была менее эффективной, что заставило авторов продолжить исследования по ее усовершенствованию. Голландскими исследователями разработана шестивалентная В-вакцина, которая основана на мутанте норвежского вакцинного штамма 44/76, состоящая на 90 % из белка Рог А [32,84,94]. В некоторых европейских странах, в частности, в Греции, представленные в гексавалентной вакцине белки Рог А обнаруживаются лишь у 8% штаммов серогруппы В, циркулирующих в настоящее время, что исключает ее применение в этой стране. Менингококковая новозеландская вакцина (Ме^В), основанная на технологии процесса производства норвежской вакцины, была разработана для остановки эпидемии в Новой Зеландии, вызванной штаммом В:4:Р1.7Ь,4, индуцировала выработку бактерицидных антител, главным образом, специфичных к Рог А [109].

В реестре разрабатываемых вакцин [103] содержится описание более 10 вакцинных препаратов, содержащих различные компоненты наружной мембраны менингококка и прошедших разные фазы исследования. Однако, до настоящего времени в практике здравоохранения не существует вакцины, характеризующейся высокой эффективностью против различных штаммов менингококка серогруппы В. Разнообразие вирулентных штаммов менингококка серогруппы В диктует необходимость включения в вакцину большого числа маркеров и содержания других компонентов микробной клетки для обеспечения ее поливалентности.

В свете изложенного, в настоящий момент остается актуальной задача поиска новых антигенов N. meningitidis для изучения их протективных и иммуногенных свойств, с целью разработки эффективного иммунопрофилактического препарата, защищающего, в первую очередь, от инфекции, вызываемой менингококком серогруппы В. Этой проблеме и посвящена настоящая диссертация.

Успехи иммунологии и молекулярной биологии последней четверти XX века привели к появлению новых стратегических подходов к созданию вакцин. В том числе была разработана концепция, включающая использование в вакцинных препаратах синтетических пептидов, моделирующих фрагменты белков возбудителя. Достоинствами подобных вакцин является безопасность при получении, отсутствие токсичности и побочных эффектов при вакцинации, а также возможность сфокусировать иммунный ответ на тех консервативных участках структуры возбудителя, которые не варьируют от штамма к штамму.

Для конструирования менингококковой В-вакцины, нами было выбрано направление, основанное на включении в создаваемый препарат синтетических пептидных фрагментов основных БНМ менингококков [6,7,8]. Установленная ныне аминокислотная последовательность этих белков позволяет синтезировать как В, так и Т- комплементарные участки пептидов, которые, кроме того, являются консервативными участками указанных белков, а значит общими для всего вида нейссерий. Актуальность такого подхода к конструированию нового поливалентного вакцинного противоменингококкового препарата несомненна.

Цель исследования: Цель данного исследования заключалась в выборе синтетических пептидных фрагментов БНМ менингококка серогруппы В, оценке их протективных и иммуногенных свойств и создании на их основе препаратов для профилактики менингококковой инфекции в опытах на животных.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать протективную активность синтетических пептидных фрагментов БНМ РогА, ОраВ и №рА менингококка серогруппы В.

2. Отобрать пептиды, относящиеся к консервативным участкам БНМ серогруппы В и обладающие иммуногенными и протективными свойствами в отношении менингококковой инфекции этой серогруппы.

3. Оценить иммуногенные и протективные свойства выбранных пептидных фрагментов БНМ менингококка серогруппы В в отношении менингококков серогрупп А и С.

4. Исследовать роль клеточного и гуморального факторов при постинфекционном и поствакцинальном иммунитете у мышей, иммунизированных синтетическими пептидами, в защите от менингококковой инфекции.

5. Изучить иммуногенные и протективные свойства синтетических пептидов БНМ менингококка серогруппы В после конъюгации их с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А.

Научная новизна. Впервые в эксперименте на животных показана протективная активность синтетических пептидных фрагментов консервативных участков БНМ РогА, ОраВ и №рА менингококка серогруппы В в отношении менингококковой инфекции трех основных серогрупп А, В и С.

Показано, что напряженность иммунитета, возникающая у мышей при иммунизации синтетическими пептидами, сопоставима с таковой у мышей после заражения их живой вирулентной культурой менингококка серогруппы В.

Выявлена ведущая роль клеточного звена в формировании иммунитета к менингококковой инфекции при иммунизации синтетическими пептидами.

Установлено, что свободные синтетические пептиды консервативных участков основных БНМ менингококка серогруппы В после конъюгации их с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А сохраняют свою протективную активность при защите мышей от заражения живой вирулентной культурой менингококка серогрупп А и В.

Практическая значимость. На основе синтетических пептидов консервативных участков БНМ менингококка серогруппы В, конъюгированных с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А, в перспективе, может быть сконструирована поливалентная вакцина против менингококковой инфекции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Синтетические пептидные фрагменты БНМ РогА, ОраВ и №рА менингококка серогруппы В обладают протективной активностью в отношении менингококка серогруппы В с различной серотиповой и серосубтиповой принадлежностью.

2. Синтетические пептидные фрагменты консервативных участков БНМ РогА, ОраВ и №рА обладают протективностью в отношении менингококков серогрупп А, В и С.

3. Ведущую роль в защите от менингококковой инфекции играет клеточное звено иммунитета, в частности Т-лимфоциты.

4. Защита мышей, иммунизированных пептидными фрагментами консервативных участков БНМ РогА, ОраВ и №рА сопоставима с защитой мышей после их контакта с живой вирулентной культурой менингококка.

5. Синтетические пептиды БНМ менингококка серогруппы В, конъюгированные с капсульным полисахаридом серогруппы А, способны защищать мышей от менингококковой инфекции серогрупп А и В.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: — XI Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» (г. Москва, 2004г.); - XVIII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (г. Москва, 2006г.); - XV Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Достижения современной биологической химии и перспективы их применения» (г. Геленджик, 2007г.); - XI Всероссийской конференции «Дни иммунологии в С.-Петербурге» (2007г.). Апробация диссертации состоялась на заседании кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН (г. Москва, 2007г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работы, из них 4 в журналах рекомендованных ВАК РФ и получен патент (Способ приготовления бивалентной вакцины для профилактики менингококковой инфекции, № 2250113, 2003).

Работа выполнялась в рамках МНТП «Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего», госконтракт №43.269.11.0103.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Чибискова, Ольга Владимировна

Выводы:

1 .Синтетические пептидные фрагменты консервативных участков БНМ РогА, ОраВ и №рА менингококка защищают мышей от заражения вирулентными штаммами менингококка серогруппы В с различной серотиповой и серосубтиповой принадлежностью.

2. Пептидные фрагменты консервативных участков БНМ менингококка серогруппы В обладают протективными свойствами в отношение менингококка серогрупп А и С.

3. Формирование защиты от менингококковой инфекции у мышей, иммунизированных синтетическими пептидами, обусловлено, в первую очередь, участием клеточного звена иммунитета, в частности иммунных Т-лимфоцитов.

4. Защита мышей от менингококковой инфекции, иммунизированных синтетическими пептидами, сопоставима с защитой мышей после введения им сублетальной дозы живой вирулентной культуры менингококка («переболевшие» животные).

5. Синтетические пептидные фрагменты консервативных участков БНМ менингококка, конъюгированные с капсульным полисахаридом, защищают иммунизированных мышей от заражения менингококком серогрупп А, В и С без применения адъюванта.

6. Пептидные фрагменты консервативных участков БНМ менингококка, конъюгированные с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А, могут рассматриваться в качестве кандидата поливакцины при менингококковой инфекции.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Чибискова О.В (в соавторстве с Несмеяновым В.А., Котельниковой О.В., Вольпиной О.М, Феоктистовым K.M., Жмаком М.Н., Короевым Д.О., Аллилуевым А.П., Ивановым В.Т.) / Способ приготовления бивалентной вакцины для профилактики менигококковой инфекции // Патент №2250113, 2003.

2. Котельникова О.В., Чибискова О.В., Несмеянов В.А., Аллилуев А.П., Вольпина О.М., Короев Д.О., Жмак М.Н., Титова М.А., Иванов В.Т. / Протективные свойства синтетических пептидов наружной мембраны менингококков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2005, № 5, С. 553-556.

3. Котельникова О.В., Чибискова О.В., Феоктистов K.M., Королева И.С,. Несмеянов В.А., Аллилуев А.П., Короев Д.О., Вольпина О.М., Иванов

B.Т. / Конструирование противоменингококковых вакцин на основе синтетических пептидов белков поверхностной мембраны менингококка серогруппы В // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2005, № 6(25), С. 28-32.

4. Котельникова О.В., Чибискова О.В., Феоктистов K.M., Лахтина O.E., Несмеянов В.А., Аллилуев А.П., Королева И.С,. Короев Д.О., Вольпина О.М., Иванов В.Т. / Перспективы создания вакцинного препарата для профилактики менингококковой инфекции серогруппы В на основе синтетических пептидов // Биопрепараты, 2005, № 4(20),

C. 2-6.

5. Аллилуев А.П., Аваков А.Э., Чибискова О.В. / Вакцинопрофилактика менингококковой инфекции // Биопрепараты, 2006, № 3, С. 6-8.

6. Чибискова О.В., Котельникова О.В., Несмеянов В.А., Вольпина О.М., Короев Д.О., Филатова М.П. / Механизмы формирования защиты от менингококковой инфекции у мышей, иммунизированных синтетическими пептидами // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007,№ 6, С. 663-666.

7. Аллилуев А.П., Котельникова О.В., Лахтина O.E., Чибискова О.В., Несмеянов В.А., Вольпина О.М., Короев Д.О., Филатова М.П., Королева И.С. / Роль антител к пептидным фрагментам белков наружной мембраны менингококка в защите от менингококковой инфекции // Вестник Российского университета дружбы народов, 2007, Т. 35, №2, С. 24-30.

8. Филатова М.П., Котельникова О.В., Чибискова О.В., Несмеянов В.А., Аллилуев А.П., Короев Д.О., Волкова Т.Д., Вольпина О.М., Иванов В.Т. / Новый подход к созданию синтетических вакцин путем конъюгации пептидов с полисахаридами на примере менингококковой вакцины// Материалы международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Достижения современной биологической химии и перспективы их применения», Геленджик, 2007, С. 303-304.

9. Котельникова О.В., Чибискова О.В., Несмеянов В.А., Аллилуев А.П., Филатова М.П., Короев Д.О., Волкова Т.Д., Вольпина О.М., Иванов В.Т. / Протективная активность синтетических пептидов и их конъюгатов в защите от менингококковой инфекции // Материалы международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Достижения современной биологической химии и перспективы их применения», Геленджик, 2007, С. 300-301.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вакцина против менингококка серогрупп В в различных вариантах разрабатывается фактически с 1969 г., т.е. почти 60 лет. И пока, нет оснований констатировать, что такая вакцина существует и может быть рекомендована для профилактики менингококковой инфекции этой серогруппы.

Проведенная работа по созданию препаратов против этой инфекции на основании синтетических пептидных фрагментов, аналогов консервативных участков основных белков наружной мембраны менингококка РогА, ОраВ и №рА открыла новые возможности для конструирования такой вакцины. Приведенные в работе результаты исследования синтезированных пептидов показали их способность защищать мышей от смертельного заражения всеми эпидемически опасными штаммами менингококка серогрупп А, В и С. Сублетальные дозы этих микробов интенсивно элиминируются у животных, вакцинированных синтетическими пептидами, представленными в работе. Причем в качестве иммуногена могут быть использованы как пептиды в чистом виде, так и их конъюгаты с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А.

Используемые в настоящее время вакцины, основанные на капсульных полисахаридах менингококка серогрупп А, С, У и иммуногенны, обладают выраженной протективной активностью, подтвержденной многолетними исследованиями, в отношении соответствующей серогруппы менингококка, апирогенны и безвредны для людей.

Использование в качестве вакцинного препарата конъюгированных синтетических пептидов позволяет отказаться от применения каких - либо адъювантов при вакцинации, что сильно упрощает процесс вакцинации и резко снижает антигенную нагрузку на организм вакцинируемого.

Элиминация менингококковых микробов из организма определяются в первую очередь клеточным компонентом создаваемого иммунитета. Роль антител в этом процессе не так однозначна. Отсутствие специфических антител к синтетическим пептидам, определяемых классическим методом ИФА не всегда свидетельствует об отсутствии активности к этому антигену. То же было описано в литературе ранее и в отношении других антигенов.

Отсутствие в настоящее время эффективных вакцин против менингококкового менингита серогруппы В в значительной мере отражает недостаток имеющихся экспериментальных данных о механизмах формирования иммунитета при этой инфекции. Для создания эффективной комплексной вакцины против менингококков различной этиологии требуется знание клеточных основ формирования защиты от данного возбудителя, так как именно они обеспечивают формирование иммунологической памяти. Использование синтетических пептидных фрагментов основных белков поверхностной мембраны менингококков с выраженной протективной активностью и относящихся к их консервативным участкам является перспективным направлением как в области создания вакцин нового поколения, так в области теоретической иммунологии при изучении механизмов защиты от этой инфекции. Имеющийся в наличие набор моделей позволяет всесторонне изучить формирование иммунитета на всех стадиях его развития при создании вакцинного препарата, защищающего от всего разнообразия циркулирующих штаммов менингококка.

Таким образом, с полным основанием можно констатировать, что выполнен первый важный этап конструирования принципиально новой менингококковой вакцины серогруппы В, обладающей, кроме того, качествами поливакцины. Созданы все предпосылки для доработки полученных препаратов в качестве кандидата вакцины по принятым во всем мире схемам.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чибискова, Ольга Владимировна, Москва

1. Волкова Т.Д., Вольпина О.М., Иванов В.Т., Рубин С.Г., Семашко И.В., Караванов А.С. / Изучение антигенной структуры вируса клещевого энцефалита с помощью синтетических пептидов // 1998 г.

2. Дельвиг А.А., Семёнов Б.Ф., Розенквист Э., Робинсон Д.Г. / Neisseria meningitidis: от антигенной структуры к новому поколению вакцин // М. Медицина. 2000.

3. Демина А.А. /Бактериальные менингиты: эпидемиологический надзор и прогноз // Вакцинация. 1999. - №2. - С.5.

4. Дж. Клаус. / Иммунологические методы // 1990.

5. Ирун P.KoxeHUS. Матитьяху Фридкин[1Ь] Стефани Конен-Вайсман|Т)Е]. / Конъюгат, вакцина, способы усиления иммуногенности, способы иммунизации // RU 95105991 А1, 27.02.1997.

6. Королева И.С., Булошицкий Г.В., Спирихина Л.В., Закроева И.М., Грачева A.M., Королева М.А. / Современные особенности менингококковой инфекции // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2006. №4(29). С. 16-20.

7. Манько В.М., Скворцов В.Ю и др. / Эксперементальное изучение иммуномоделирующего действия глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП). //Иммунология, 1988 г., № 6, С. 34-37.

8. Платонов А.Е., Королева И.С., Миронов К.И. / Эпидемиология менингококковой инфекции в России и мире на современном этапе //Вакцинация. 2004, №1(31), 6-7.

9. Ройт А. Основы иммунологии. 2000 г.

10. Стентон Гланц. Медико-биологическая статистика. 2003г.

11. Таточенко В.К., Озерецковский Н.А. /Иммонопрофилактика // 2007.

12. Терри-Молинерт Г., Демина А.А., Валькацер Н.М. / Эпидемиологическая характеристика инфекции на Кубе // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1992. - № 2. - С. 27-30.

13. Abdillahi H., Poolman J.T. Whole-cell ELISA for typing Neisseria meningitidis with monoclonal antibodies // FEMS Microbiol. Lett. -1987.-V. 48.-P. 367-371.

14. Achtman M., Neibert M., Crowe B.A., Strittmatter W. et.al. / Purification and characterization of eight class 5 outer membrane protein variants from a clone of Neisseria meningitidis serogroup A // J. Exp. Med. -1998.-V. 168.-P. 507-525.

15. Achtman M., Wall R.A., Bopp M., Kusecek B. et. al. / Variation in Class 5 protein expression by serogroup A meningococci during a meningitis epidemic // J. Infect. Dis. 1991. - V. 164. - P. 375-382.

16. Achtman M., (DE); Moreau M. (FR) / IgAl protease fragment as carrier peptides // US 7235242 2004-10-14

17. Aho E.L., Dempsey J.A., Hobbs M.M. et al./ Characterization of the opa (class 5) gene family of Neisseria meningitidis.// Mol. Microbiol., 1991, Vol. 5, P. 1429-1437.

18. Alexander, H.L., Rasmussen, A.W., Stojiljkovic I. / Identification of Neisseria meningitidis Genetic Loci Involved in the Modulation of Phase Variation Frequencies // Infection and Immunity-2004.-Vol. 72, No. 11-P. 6743 6747.

19. Bjune G., Hoiby E.A., Gronnesby J.K., Arnesen O. et al. / Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway // Lancet. 1991. - V. 338. - P. 1093-1096.

20. Cadieux N., Plante M.5 Rioux C.R., Hamel J. / Bactericidial and cross-protective activity of a monoclonal antibody directed against Neisseriameningitidis NspA outer membrane protein // Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 4955-4959.

21. Chen T., Gotschlich E.G. / CGMla antigen of neutrophils, a receptor of gonococcal opacity proteins //PNAS. 1996. - V.93. - P. 14851-14856.

22. Christodoulides M., Heckels J.E. / Immunization with a multiple antigen peptide containing defined B- and T-cell epitopes: production of bactericidal antibodies against group B Neisseria meningitidis II Microbiol-UK. 1994. - V. 140. P. - 2951-2960.

23. Claassen I., Meylis J., Van der Ley P., Peeters C.C.A.M. et al. / Production, characterization and control ofa Neisseria meningitides hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine // Vaccine. 1996. - V. 14. - P. 1001-1008.

24. Cohen IRUN R. (Israel) Fridkin M. (Israel) Konen-Waisman S. (Israel) / Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic peptide carriers and vaccines comprising them // CA, 2141454 1994-02-17.

25. Delvig A., Donders E.M.L.M., Achtman, Poolman J.T. et al. / T-cell response to outer membrane proteins of Neisseria meningitidis: Comparative study of the Opa, Opc, and PorA proteins // Infect, and Immun. 1996. - P. 298-304.

26. Dyet K. H., and D. R. Martin / Sequence variation in the porB gene from B:P1.4 meningococci causing New Zealand's epidemic // J. Clin. Microbiol.

27. Expanded Program on Immunization. Vaccines against meningococcal meningitis: Current status // EPI Newsletter. 1994. V.16. P.4-5.

28. Figarella-Branger D., Durbec P., Bianco N., Gambarelli D., Pellissier J.F., Rougon G. / Expression des moleculer d1 adhesion NCAM, LI et de 1' epitope HNK1 par les medulloblastomas // Rev. Neurol. -1992. V.148. P. 417-422.

29. Norwegian meningococcal outer membrane vesicle vaccine MenBvac // Infect. Immun. 2006. V. 74. P.4557-4565.

30. Frasch C.E., Tsai C.M., Mocca L.F. / Outer membrane proteins of Neisseria meningitides: structure and importance in meningococcal disease // Clin. Invest. Med. 1986. - V. 9. - P. 101-107.

31. Frasch C.E. / Vaccines for prevention of meningococcal disease // Clin. Microbiol. Rev.-1989.-V.2 Suppl.- P. 134-138.

32. Frasch C.E., Coetzee G.J., Zahradnik J.M., Feldman H A., Kornhof H.J. / Development and evaluation of group B serotype 2 protein vaccines: report of a group B Field trial // Medecine Tropicale. 1983. V.43. P. 177183.

33. Frasch C.E., Zollinger W.D., Poolman J.T. / Serotype antigens of Neisseria meningitides and a proposed scheme for designation of serotypes // Rev. Infect. Dis. 1985. - V. 7. - P. 504-510.

34. Geysen H.M., Meloen R.H., Barteling S.J. / Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V.81.-P. 3998-4002.

35. Gotschlich E. C., Goldschneider I., Artenstein M.S. / Human immunity to the meningococcus. IV. Immunogenicity of serogroup A and serogroup C meningococcal polysaccharides in human volunteers // J. Exp. Med. -1969.-V. 129.-P. 1367-1384.

36. Gotschlich E. C., Goldschneider I., Lepow M.L. / Raven Press. NewYork.-1977.

37. Gotschlich E. C., Liu T.-Y., Artenstein M.S. / Human immunity to the meningococcus. III. Preparation and immunochemical properties of the group A, group B, and group C meningococcal polysaccharides // J. Exp. Med.-1969.- V.129. ?P. 1349-1365.

38. Gotschlich E.G., Goldschneider I., Artenstein M.S. / Human immunity to the meningococcus IV. Immimogenicity of group A and group C meningococcal polysaccharides in human volunteers // J. Exp. Med. -1969.-V.129.-P. 1367-1384.

39. Granoff D.M. et al. / A modified eenzyme-linkked immunosorbent assay for measurement of antibody responses to meningococcal C polysaccharide that correlate with bactericidal responses. // Clin. diag. lab. Immunol., 1998. - V. 5. P. 479-485.

40. Greenwood B: Manson Lecture. / Meningococcal meningitis in Africa // Trans R Soc Trop Med Hyg 1999, 93(4):341-353.

41. Grunow R., Jaahn S., Porstmann T., Kiessig S.T., Steindl F., Mattanovich D., Gurtler L., Deinhardt F., Katinger H., von Baehr R. / The high efficiency, human B cell immortalizing heteromyeloma CB-F7 // J. Immunol. Methods. 1988. - V. 106. - P. 257-265.

42. Jarvis G.A., Vedros N.A. / Sialic acid of group B Neisseria meningitidis regulates alternative complement pathway activation // Infect. Immun. -1987.-V.-55.-P. 174-180.

43. Jeanteur D., Lakey J.H., Pattus F. / The bacterial porin superfamily: sequence alignment and structure prediction // Mol. Microbiol. 1991. -V. 5.-P. 2153-2164.

44. Jennings H.J., Gamian A., Ashton F.E. / N- propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique epitope on group B Neisseria meningitidis // J. Exp. Med. 1987. - V. 165, - P. 1207-1211.

45. Jennings H.J. (CA); Pon R. (CA); Lussier M. (CA); Michon F. (US) / Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines // US 5811102, 22.09.1998.

46. Jennings H.J. (CA); Michon F. (CA) / Meningococcal polysaccharide conjugate vaccine // US 5902586, 11.05.1999.

47. Jennings H.J. (CA); ); Pon R. (CA); Lussier M. (CA); Michon F. (US) / Antibodies to meningococcal polysaccharide conjugate vaccines // US 6350449 B 1,26.02.2002.

48. Lifely M.R., Rogers M.V., Esdaile J., Payne M., Tite J.P. / Murine cross-reactive T-cell epitopes of Neisseria meningitides outer membrane proteins // Vaccine. 1992.- V.10. P. 159-163.

49. Lynch E.C., Blake M.S., Gotschlich E.C., Mauro A. / Studies of porins spontaneously transferred from whole cells and reconstituted from purified proteins of Neisseria gonorrhoea and Neisseria meningitidis II Biophys. J. 1984.-V.45. P. 104-107.

50. Lystad A., Aasen S. / The epidemiology of meningococcal disease in Norway 1975-91 //NIPH Ann. 1991. V.14. P.57-66.

51. Malorny B., Morelli G., Kusecek B., Kolberg J., Achtman M. / Sequence diversity, predicted two-dimensional protein structure, and epitope mapping of neisserial Opa proteins // J.Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 1323-1330.

52. Marburg S. (United States) Tolman R.L. (United States) Emini E.A. (United States) / Peptide polysaccharide-protein conjugate vaccines // CA 2047031 1992-01-20

53. Martin D., Brodeur B. R., Hamel J., Couture F.,. Alwis U., Lian Z., Martin S., Andrews D., Ellis R.W. // J.Biotechnol. 2000. - V. 83. - P. 27-31.

54. Martin D., Cadieux N., Hamel J., Brodeur B.R. / Highly conserved Neisseria meningitidis surface, protein confers protection against experimental infection // J. Exp. Med. 1997. - V. 185. - P. 1173-1183.

55. Moe G.R., Tan S., Granoff D.M. / Differences in surface expression of NspA among Neisseria meningitides group B strains // Infect. Immun. 1999. V.67. P.5664-5675.

56. Moe G.R., Tan S., Granoff D.M. / Differences in surface expression of NspA among Neisseria meningitides group B strains // Infect. And Immun., 1999, P. 5664-5675.

57. Moreau M. (FR); Mistretta N. (FR) / Polysaccharide-peptide-conjugates //US 6472506 Bl, 29.10.2002

58. Naess L.M.,Oftung F., Aase A.,Wetzler L.M. et al. / Human T-cell responses after vaccination with the Norwegian group B meningococcal outer membrane vesicle vaccine // Infect. And Immun. 1998. V.66. P.959-965.

59. Oftung F., Naess L.M., Wetzler L.M.,Aase A., Hanenberg B. et al. / Antigen-specific responses in humans after intranasal immunization witha meningococcal serogroup B outer membrane vesicle vaccine // Infect. And Immun. 1999. V.67. P.921-927.

60. Peters C.C.A.M., Rumke H.C., Sundermann L.C., Rouppe van der Voort E. et al. / Fhase I clinical trial with a hexavalent PorA containing meningococcal outer membrane vesicle vaccine // Vaccine. 1996. - V. 14. -P.1009-1015.

61. Pillai S. (United States) Insel R. (United States) Bixler G. (United States) / Synthetic peptides representing a T-cell epitopi as a carrier molecule for conjugate vaccines // CA 1340958 2000-04-11.

62. Plante M., Cadieux N., Rioux C.R., Hamel J., Brodeur B.R., Martin D. / Antigenic and molecular conservation of the gonococcal NspA protein // Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 2855-2861.

63. Poolman J.T. / Clinical trials with outer membrane protein vaccines and PorA recombinant vaccine // Proceedings of the Tenth International Pathogenic Neisseria Conference. Eds. Zollinger W.D., Frasch C.E., Deal C.D. 1996. Baltimore, USA. P.l 17-122.

64. Poolman J.T., van der Ley P., Wiertz E.J.H.J., Hoogerhout P. / Second generation meningococcal OMP-LPS vaccines // NIPH Ann. 1991. -V.14. - P. 233-241.

65. Rieger F.M., Grumet M., Edelman G.M. / N-CAM at the vertebrate neuromuscular junction // J. Cell Biol. -1985. V.101. ?P. 285-293.

66. Romero J.D., Outschoorn I.M. / Current status of meningococcal group Bvaccine candidates: capsular or noncapsular? // Clin. Microbiol. Rev. -1994.- V.7. ?P. 559-575.

67. Rosenqvist E., Hoiby E.A., Wedege E., Kusecek B., Achtman M. / The 5C protein of Neisseria meningitidis is highly immunogenic in humans and stimulates bactericidal antibodies // J. Infect. Dis. 1993. V.167. P.1065-1073.

68. Rosenqvist, E., K. Bryn, K. Harbak, J. Hoist, E. A. Hiby, P. Kristiansen,

69. H. Lange, D. Martin, K. M?yner, K. Nord, L. M. N?ss, A. G. Skryten, I. Aaberge, A. Aase, and H. Nkleby // Abstr. 13th Int. Pathogenic Neisseria Conf. 2002. P. 64.

70. Rouppe Van der Voort E. / Meningococcal vaccines. A continuous crusade? // Vrije Universiteit, Amsterdam, the Netherlands. 1998. P.l-157.

71. Rudel T., Schmid A., Benz R., Kolb H.A., Lang F., Meyer T.F. / Modulation of Neisseria porin (PorB) by cytosolic ATP/GTP of target cells: parallels between pathogen accommodation and mitochondrial endosymbiosis // Cell. 1996. - V. 85. - P. 391-402.

72. Snape M.D., Pollard A.J. / Meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccines // Lancet. Infect. Dis. 2005. - P. 21-30.

73. Stevens V. C. (United States) / Vaccines and antigenic conjugates // CA 2145391 1994-04-14.

74. Tsirpouchtsidis A., Hurwitz R., Brinkmann V. / Neisserial immunoglobulin Al protease induces specific T-cell responses in humans // Infec. and Immun. Jan. 2002. - V. 70. - P. 335-344.

75. Udenfriend S., Meienhofer J. / The Peptides. Analysis, Synthesis, Biology // London. Academic Press. Inc. 1987. - V. 9. - P. 27-30.

76. Vieusseux G. / Memoire sur la maladie qui a regne a Geneve au printemps de 1805 (in French) // J. Med. Chir Pharm. 1806. - V. 11.163-182.

77. Virji M., Makepeace K., Ferguson D.J.P., Achtman M., Moxon E.R. / Meningococcal Opa and Opc proteins: their role in colonization and invasion of human epithelial and endothelial cells // Mol. Microbiol. -1993.-V. 10.-P. 499-510.

78. Volpina O.M., Yarov A.V., Zhmak M.N., Kuprianova M.A., Chepurkin A.V., Toloknov A.S., Ivanov V.T. // Vaccine. 1996. - V. 14. - P. 13751380.

79. Weichselbaum A: Ueber die Aetiologie der akuten meningitis cerebrospinalis / Fortschr Med. 1887. - V. 5. - C. 573-583.

80. Wiertz E.J.H.J., Delvig A.A., Donderss E.M.L.M., Brugghe H.F. et al. / T cell response to outer membrane proteins of Neisseria meningitides: comparative study of the Opa, Opc and PorA proteins // Infect, and Immun. 1996. - V. 64. - P. 298-304.

81. Wyle F.A., Artenstein M.S., Brandt B.L., Tramont E.C., Kasper D.L., Altieri P., Berman S.L., Lowenthal J.P. / Immunological response of man to g group B meningococcal polysaccharide vaccines // J. Infect. Dis. -1972.-V. 126.-P. 514-522.

82. Zollinger W.D., Moran E. / Meningococcal vaccines present and future // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 1991. - V. 85. Suppl. 1. - P. 37-43.

83. Zollinger W.D., Boslego J., Frasch C.E., Froholm L.O. Safety of vaccines containing meningococcal group B polysaccharide // Lancet. -1984.-P. 166.