Липополисахарид менингококка серогруппы А

Бобылева, Галина Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Липополисахарид менингококка серогруппы А
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Липополисахарид менингококка серогруппы А"

; ^ <-\ Ь

Г0СК0Л1ИТЕТ РФ САНЭПИДНЛДЗОРЛ

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ имени Г. Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

БОБЫЛЕВА Галина Васильевна

ЛИПОПОЛИСАХАРИД МЕНИНГОКОККА СЕРОГРУППЫ А: ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ВОЗМОЖНАЯ ОБЛАСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

03.00.07 — Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского Госкомитета РФ санэпиднадзора.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ — доктор биологических наук В. И. КУВАКИНА.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Доктор медицинских наук, проф. Н. Н. КОСТЮКОВА, Доктор биологических наук, проф. В. Ф. РУНОВА.

Ведущее учреждение — Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Госкомитета РФ санэпиднадзора.

Защиту состоится «* 1992 г.

в "_ час. на заседании специализированного совета

Д.084.18.01 Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского Госкомитета РФ санэпиднадзора по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского.

Автореферат разослан ..•» 992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

3. Н. ЕРМОЛЕНКО

. 0Ш1АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на успехи в диагностике, профилактика и лечении менингококковой инфекции /МИ/, достигнутые за последние два десятилетия, эта проблема продолжает оставаться одной из важнейших е-инфекционной. патологии и привлекает пристальное внимание исследователей. Это связало-с тем, что генерализованные формы мошшгококковой инфекции- характеризуются особенно тяжелым течешем,. постилфавдоннкад осложнениями высокой летальностью <от 10 до, 40$), 'не-имеадай- тонденции к снижению (В.И.Покровский, А.А.Демина,1987{ Лиаегзеп,1983; Tlkbomiroy, ' 1987);. " . '

В настоящее время не вызывает сомнения, что развитие тяжелых патологических состояний организма: нар; -'.опия метаболизма, электролитного бсиианса, важнейших биохимических систем и поражения отдельных органов, вплоть до шока и гибели,, происходит от токсического действия лилоползюахарида /ШС/(ВЛ1.Покрсйский и соавт.,19761; Ю.Я.Венгеров и соавт.,1991;Аиаетзеп ', 1989). С учетом этого,- мнопю исследователи.полагают, что вопросы традиционной торапии медакгококковой инфекции.доданы бить пересмотрели в направлении создания, для этих полай лрепяратов ишуноглобу.яиг нов направленного антиэндотоксичаского дейстаия .(Т.КгШронова и соав.т., 1988; Gaffin e-t al.»I9Q5î Baufflgartiier et al,,1985} Zieg-ler,I9S8; De Karl a et al.,1903; Fonsgaarâ,1907,1989).

Д1С относится к числупротектившх антигенов мешшгококка, стимулирует образование бактаршсиднцх антител и участвует в формировании невосприимчивости к.*Щ» ДвтощщпрощтМ ЩС-рассматривается, как один из наиболее, пэрсякшх компонентов протийоме-нингококковой вакцины (А.А.Дальзиг и соавт.,1988,1969; Griffisa et al.,1934; ?rasch, 1987;.îoolrâaa et al.,x99I).

Глубокие исследования в облас-уи Ш^ нмйидиа связь с .НТО, определяют необходимость создам» надахкнх и достукпих кок.:вр-ческих диагностических тесТ-сисмм')ia- основе' ЛПО. 'Подобные препараты в надеей стране пока но производятся, - ' ■ \

Несомненно, что- исследования, направлению на, выявление специфических ШС-антитдл, я обеспечение этого направления надежними диагностияаскщ® препарата'® создадут необходимее поедпбсЕЛКи. для решения конкретных ' задач, связанных

с проблемой 1.Я.

Учтивая шмизлоканное, цель кастоятаА таботн заключалась в получении и характеристика ЛПС менингококка серогруппы А, конструировании на ого основе эрнтроцитариого диагностику!,а для выявления специфических антител и разработке подходов дат создания шнингококковых иммуноглобулинов направленного антхэвдо-токсического действия.

Для достижения поставлошой цата но обходило Сило решить следующие загачу:

- разработать метод получения високоо'ппцонного ЛПС менингококка сэрогруппи А, свободного от пригласи других антигенов микробной клетки;

- отработать'метода контроля и,цуиохк£иоской и химической чистота ЛПС;

- изучить физико-химические, кг,щунохЕдэтоские с биологические свойства ЛПС;

- разработать эрптроцитарнш диагностику« на основе ШС для определения спащхфпчоских антитол;

- оценить содержание ЛПС-антятел в сыворотках здоровше лиц л больних Ш1, а такжо изучить изменение их уровня в даиа-дшке заболевания;

- исследовать уровни антител к ШО в донорской плазма и плацентарных енворотках, пспсшьзуа\:ых в качоствэ сырья пр-д производстве гдиуно глобулинов, для роиения вопроса о возмояноста приготовления спощуТшеского антиэвдотокси-ческого вдуноглобулина;

- изучить протоктивную активность сывороток с высоким уровнем антител к ЛПС менингококка.

Положения, 'внност?-п?в на защиту:

I. Дяя конструирования диагностичеашх препаратов на основе ЛПС необходим! антигены, свободные от прш.шси капсульного груп поспецифичсского полосат рида. Предлагаемый для этих цела;; метод включает комбинацию препаративных процедур, состоящих из водно-фенольной экстракции микробных клэток по Востфалю, теркическо:': обработки раствора и ультрацентрифутарования его в присутствии

ПаЯ.

2. Разработана технология изготовления вдсокочувствительно-го, специфичного эрятроцмарного ЛПС~даагностикугл для выявления мзтшгококковых ЛПС-антител.

3, Для серотерапии КК.И предяоявно использовать комплексные игслуноглобулиновиа препараты, обогащенные 1еМ-фракцивЙ и приготовленные из сывороточного сырья о высоким исходным уровнем ме-ШШГОКОККСВЫХ ЛГС-ШЮТТОЛ.

Научная новизна табош

Разработан оригинальный метод очистки мешшгококкового ЛПС серогруппн А от принеси группоспецнфического ПС. Получено авторское свидетельство на "Способ получения длпополисахарида менингококка серогруппы Аи И 1537263 от 15 сентября 1989 г.

Получены доказательства толмунохишгееской гомогенности ЛПС и его выраженной видовой специфичности.

Получены дополнительные данные о содержании ЛПС-антител в сыворотках здоровых лиц и больных №1, а также дашше об изменении уровня ЛПС-алтител в динамике заболевания. •

Впервые проанализированы нг содержание специфических ЛПС-антител донорские и плацентарные сыворотки, используемые в производстве иммуноглобулинов, а также готовые коммерческие иммуноглобулины а экспериментальные серии коиигаксного имадноглобули-нового препарата (Ш1), разработанного в ШШМ тш.Г.Н.Габричевского. Показано, что 10% исследованных сывороток содержат высокие уровни ШС-антител(1:128-1:256).

Экспериментально обосновано на основе КШ, обогащенного фракцией иммуноглобулинов, конструирование монингококкового иммуноглобулина антиэндотоксического действия из сывороточного сырья с высоким исходным уровнем ЛПС-антител (от 1:128 и выше).

Практическая эта-тмость гяшслнеиноИ работа состоит в разработке на ос!!ове очищенного ЛПС менингококка серогруппы А эритро-щ! торт го го диагностикума для определения специфических антител, и а обосновании возможности получения препаратов иммуноглобулинов направленного антиэндотоксического действия дая серотерапии МИ.

■ Составлена науч'ко-техш:*?зс;сая документация на эрнтроцатар-'ЛЦС-диагаостикум {Изменение к Регламенту производства дааг-ностикумов менингокогесовых трупп А и' С эритроцитарных ждаспх, проекты ФС на. даагноепшукы эрйтроцитарнш мзщцггококкоепо грушоспевдфичесюш и видовой аптигенныо яидкиз для РА п ; .лс— труквди по пршонениэ дкатностакуиа мешшгококкового ездового лклоцолисахарвдного антигенного йщкого).

Дпробания работа п публикации. Г,'лтор;:алъг диссертации доложены на У111-ой паучло-практиче ской ко11фзрйиции молодых специалистов Ленинградского ордена Трудового Красного йпамонп научно-исследовательского института агидемасшоиш и ьшкрос&ологии им. Пастора (г.Ленинград, 1283), Ш-сй конференции молодых ученых института экспэрлмвнтальвий биологии АН Армянок.! ССР (Брайан, 1988), 1У-ой Вса соткой конференции по. шикнгококкозой инфекции п гнойным менингитам (г.Ковослбирск, 1520)

Диссертация апробировала на заседании секции Ученого Сойота "Иммунология--в кодшкнехая биотехнология" ШШШ кы.Г.Н.Габ-рпчевского 17 ивд 1992 г.

По тема 'дассоркщаа опубликовано 8 научных работ, в т.ч. одно авторской свдцзтельство.

Структура л обгРМ'шбот^. Работа написана по обычному плану п включает слэдущио разделы: "Бездонно", "Обзор литературы" (2 глазп), "Материала к метода", 4 Елавы собственных исследований, "¿-лгагаенЕв", пВшюдаи(7), "Список литературы" (всего 225 источников). Работа наложена ка /^страницах машинописи, ил-ластрирована 15 рисунками и 19 таблица:,ы.

МАТЕРИАЛЫ II1ШШ

тхуитн, В работе были исследованы ЛПС менингококка серогруппы Л (итамм А-208), полученные в период разработки метода их очистки до гс.иупохимичеегч гомогенного' состояния и в процессе наработки препаратов для использования в качество овк-ситша для эрлгроцатарных даагностикуков, а такие различные варианты ЛПС-диагностккумоз, изготовленных как при отработке условий их ярнготмашяш, так л в ходе даяьяейыих исследований по изучению уровня .Ш1С-антател в сыворотках различных контингентов людой (больных п здоровых) п препаратах крози.

Всего было получено 4о серий ЛПС' серогрулпн А(А-ЛйС). На основе очищенных А-ЛПС било лрпготоилаю II серий эрптроцитар-ного диагностикуиа. Кроме того, для проведения сровпитанного электрофоретического анализа ЛПС менингококка трех серогрушт били получены I соркя. ЛПС серогруппн В и 2 серии ЛПС серогруп-пы С, отга:цш«те по ма?оду Веогфалл. Бсэ препарата ЛПС были ис~ сяодовани по химическому составу, сорсыогичоскол активности и специфичности, "оксичносги дтя мытой, Проьедон иммунохимччвский анализ всох" серий А-ЛПО и определена степень их имцунохимичео-кой гомогенности. Вез эритроцигарныэ диагностикам;! были чгуче-ны по чувствптвльности, специфичности и стабильности.

Для изучения антига иного состава очгщенчцх ЛИС били получены лизаты Грассе (3 сер::и) и высокоочтаценннН калсульныИ специфический ПС монянгасокка сдрогрутшы А (А-ПС).

При исследовании серологической активности и специфичности ЛПС использовали иммунные мепшгекокковцо првяилитирувщиа и аг-глютшшруюсда сыворотки серсгрулп А, В, С, Д, X,*;3,>*-13Ь произведете Ставропольского !ШИВС и Ленинградского ШМВС. Гилер-имаунныо- кроличьи- сыворотки к менингококку серогруппн А получали по методу М.А.Сшрновой-Цутушевон и соавт.(1978). Гиперишлун-ныо кроличьи сыворотки к монинтекоккам сэрогрупп В и С и к непа-тогеыным найеспрлям Ме1заег1а ?1ауезсенз и ВгапЬагеНа оз^огааНа- , были ПОЛучеш! И ЛЬбСЗНО прОДОСТвВ-лены ншл А.И.Мишиной.

Уровень антитол к ,ППС менингококка определяли в сыворотках больных ГШИ (Т95 образцов), больных мешнгиташ другой этиологии (18 образцов), здовоьых лиц (208 образцов), а также е препаратах крови: нормальном иммуноглобулина производства МШП1ЭМ им. Г.Н. Габричовокого (10 серий), экспериментальных сериях ш-нингококкового иммуноглобулина (5 серий), экспериментальных сериях КИП (5 серий) .

Методы исследования. В работе были использованы следующие основные методы: ■ \

препаративные - скстракция ТХУ, смесью фенол-вода, ферментативное перёзарнврие, фракционирование этанолом, диализ, центрифугирование, "ультрадентрифугировялие и лиофилизашя;

::ро;.'лтогрсЛичеc:n:;i - на 1юлск:;з с сс£аразо;1

4В;

ягашчэскпо - спродгшзн^о еос;оса по г.:зтоду Chsu с% .{КЗЗ* болка по штоду lowry et «г, (IS5I), цукдэагошх гшслоу по y:c;q-Л.С.Сппрпна <IS58), 1Щ) ПО míоду Eroga et al.(1970);

биофпзпчо c:aia -й: ПААГ с £СН по Lss-aU (IS7G) с поелзду-ксЕл o;;piL3icainic;4 гадя сарзброл по ^отоду ct ni. (I£32);

к.:.зунотгачоскю - ^.¡йузиокная про1532тац:^х до Caouterloc;-(1953), ИБС? в ог£>роеоп голо по Р.Грабарэ и Д.Бу-ргзку (1£53), ЕЛЗЗ по üucnard (1259) II НЕЗ по tourcll <IBGS);

сзродогатагссш - Н1ГА и РШГА, в котордх a i^-jcteo гс::зсуп-сятанов петольо'рЕаяп доралззкэцрогачнио барзпьа слг. чсдосо^зскцо эряхроташ 0(1) группу, лагру^шшиз Л-ПО ¡un: Д-ДЮ;

блолсгйчсс:с;э - опродолошю толслчкссач: Л1С но штоду i-ссС е Kiicach " -(1333) я про201шшой сашшоста ciEúpaíc;: па ia^jx.

Сгаглск:ч-зс;;уа обра0о"л:у 0Kcaep;~.jut22C.Eax дгзкоа: нриьохда; ccf^anp;iiun;izn и coas?., 2С32; B.II.£ca3í:oo:i,

I55S).

СОДННГЛШЗ РЛЕ011!

Г>---" ;:^ГПТП .ЯПП ГЛГПТПУЛТГ-Г Д.

Дяг ицэдэиия .'НС па какробшсс кдосол »atfrsitiáAc

ста:.;.; ,СЗ бал цадмя ряд тоздщцонкк: штодоа эксяраяюп, а ;г.зш:о: ¿jazziia (1933), Paüorpasa п Топят. (1234) :; Ь}ст$адя(2£35), пазадледах получать npanapssu с разной сззаокьи Odessa п С;;эяо-п1чсс;;о£ йкеядостьэ. 11л осдоцокка дашпа зз^-язеглго аналлса :: еярздздзния топелчнозм, лродставлшшш: 2 тсбл.1, дал г-идслзилл £ЯС бал Eüöraa 1:0205 Ьзсяфадя, г.п. сл позЕйаы получать напболаа оч^цашшо г. 1:2со;:о.о::с.л:ха препарат.

Изучило сштшчлшого сэогаса ДДС с 1132 пешзадо, -irо

соз пргаараяа,. кззакда^о о? способа похучошш, содор^а®, по крайней г.ера, дга шшпчзкшх цолюнзкта. Б порзкрзеотхше роакдпях ШС и оч^юшого A-BQ с!::ло ycraiioasoiio, 120 огзши из кс.7ло:юнтов яв-дяэтея сяоздфгчаксзй ПС окпнгоЕокка группа А. Коллчоство примеси 5 то го антигена, одспешгоо в ИПГА с ПС^дитгостокумом и в ВИЭФ, составляло около 1$.

Харзиторнстатка препаратов пэ.'пиггококиопого ЛПС сорогрщтпи А, получогппге раайячтка иотодсми

Гйтод пздвлоияя Внход(^)" Содер~лт:о Токсичность4

фосфора баясп ПК в мг)

15уаропа 0,34 5,74 20,9 а,1 2,0

Райстрпка и. Гсша 3,20 5,41 1В,0 40,8 2,0

Езстфаля о послз-дугг™.» ультрхцон-тр^утарованис:! 1,00 3,70 2,7 2,8 0,35

х - дашшз по 2-3 серпа

Слздуо? огтптигь, что при анализа данных лпторатури, касав-глхе.п. иомучотт гэтшгс.-.огаопсс ЯГС с! а!., 1373,1280,

1933; 0t а1.,1233,1905,1987; Ия о* А1., 1388,1989), т не няпля сеэдэпгЛ по характеристике г'-^ушхггг'лосксй п антигенной чистота получотшх препатэттов, п теп члена, подтсер-^дгштлх отсу-?сте::о пр^зся гру1ш0спсцг:1'пчсзск0гс ПС. Такая характеристика, по нгпзе'гу гяонпа, крайпо кзобхода.'л, оеооошго яри использовании ЛПС дая сэролсютзскпх а гпуггохи-мэтоских исследований, поскольку Л-ПС, всяздсизао сильно шрагошого отргаутольного заряда ¡доле-кул, логко соцсгбгшзнрует эритроцита без какой-чяибо предварительно.! обработки ( ОогеоМ1оН о1. а1., 1С59) п сонсибшшзирук!;ая активность его в насколько десятков раз и пае, чем у ЛПС. При использовании для прпготоилопия диагностику:^ ЛПС, содеряацзго примось А-ПС да~о а незначительней копчостеэ, эрптрмщта сои-сибилизиройаяпсь сСс'игл алтлгонгг.а одновременно. В псслг)дус;.а.о: сыворотках при этом ааямялась, проздо везго, антитела к А-ПС, которые присутствовала а них в больо влсских титрах. Это обстоятельство ввдвнгело иг. порсьй план озэраоотау" способа очпетлп ЛПС, который гарантировал отсутсти'с А-ПС да^э и следосих количествах.

В основу иааого катода било пологоко различна в тср.\:оста-блльности ЛПС и Л-!1С, поскольку ШО относится к числу уормоста-

бильных ; ТпиЬег ,1959), а А-Ш - тер:.юлабяльных (В.И.КувакшцШоЗ) антигенов. Впредварительных экспериментах бшш определена условия, при которых ПО разрушался до шпкомолекулярних фрап;<ш-тов, а ЛПС сохранял свои свойства и биологическую активность. Одним из таких условий являлось тярпостатировшгае раствора ШС при 3?°С п течение 16 суток. Введение этой стадии в процесс очисткл позволило уквныипть содерглнае яримесц ПС л ДОС до 0,03%, однако полного осБобоздонкя от.нее но удавалось достигнуть га при последующе;.! мгагократном ультрацентрифутпроваши, ни при гель&лътредии. В специальных экспериментах было установлено, что ПС я ЛПС находятся в растворе в гада комплекса, причем связь иелду ш но является коваяодтяой и гло.дот быть разрушена при определенных концентрациях диосоцаирувдах агентов, например, 0,5 11 г,аС1. Сочетание теретчаскои обработха: с ультра-центрЩугцрованиец ЛГТ(3 в присутствии С, 5 !Д яаС1 обеспечизало полное освобождешю ого от приноси капсульного ПС.

11а рис Л представлена проилагасг-'ля нами схега получения ЛПС, которая включает экстшкцд» фоноле:.: по Вамфалл

(1965), ишеубировацио раствора ШС при 37°С в течение 1(3 суток с п о ело дущг.м ультоапентрифугированно!.; в присутствии 0,5 Ы г аС1, диализом и лаофилизшмп препарата. !.!огжо заметить, что ь:отод достаточно прост п технологичен, позволяет освобождаться от примеси белка и нуклеиновых кислот баз екдвчония в него таких трудос:.:глх и дорогостоящих процедур, как обработка форызитака: ДНКаз(... РНКазой, проназоИ, протоиназой К, лизоцином и др., кш: ото описало многими зарубежными авторадги (яепп1п£й съ ах.,1980; Заггсаа & Валсоск, 1293; а>са1 ^ а1.,И83; Ы.а в-4 е.1., 1383).

Важно отметить, что ЛПС ког быть получен не только из цельных микробных гае ток, но и из промежуточного балластного продукта производства мошшгококковоА гголисахаридаоЛ вакцины группы А, так называемого "ссадка-25".

С помоцью кд:луноэлзктрофореза было установлено, что ШС содпрлшт единственный антигенный коглионент и является шмуно-хилгачески гомогенным (рис. 2).

Pao.I. Схема получения .очищенного JfflO менингококка ceporpyraiu À

Рис.2. Кшун о эла ктрофоро з игдлунояшически гомогенного Д11С шшшгококка сорогрушш Л

I - очшцоннни ЛПС (20 иг/ия) а - cut ротка к шшшгококкаа сэрогруппы А

Характеристик ургдефюго Д-,ЩСТ

Химический анализ иолучошшх ЛПС показал, что они прэд-стапдяют собой шеокоочицешшо препарата: сук.аплоа содораапаа-примеои балка и нуклеиновых кислот но' прозшало 2% в перосчате на сухув массу препарата. Содержание фосфора в ЛПС составляло в среднем 3,7;?, КДО - около ICÍÍ, лкпида А - болоо 3QTÍ. Препарат были активны в тесто токсичности на ыиаах ( табл.2).

Високос содержание КДО и липвда А указывало па то, что видело нш/ наш ЛПС принадлежит к Е-типу и это полноетьв соответствует соврвшшшм придатавдотпм о шагеоской структура мошшго-кокковых ЛС (jemxinco et al., I9S0; Тдаi ct al,, ISS3; Cltob-cook ct al., igaG; Criffics ct al., 1283).

Дополнительное доказательство этолу было получено о пошзыэ Э5 в ПААГ с ДСП. По сравнения с ЛПС Escherichia ooli, относящиеся к Л]с з-тапа и содерзащгл болоз 40 различных коипононтов, ЛПС ке-шшгококков ccpoi^pynn А, В ц С давала характерные для в-типа споктрп и содарзала всаго лвдь 1-2 сс"огаш; ц 2-3 в^шоргшх компонента, располоЕэвншс в шшкогдолекулярноЗ области (рзс.З). йлектрофоретическт профили ЛПС соротруш А п В била лохози, что позволило предполагать наличке возаоаноЯ более вырааенной

Характеристика ишунохнинчоскн чистого ЛПС менингококка серогруппи А .

(сроднив данные по 10-сериям )

Я л

п/п Показатели X + ш

I. ñnсод (,» к весу сухах »слеток) 0,80 + 0,07

2. Фоо$ор {%) 3,75+0,02

3. КДО (%) 9,9 + 0,4

4. Липид А (*) • 33,5 + 2,8

5. Бэлок (%) 1,00 ± 0,07

б. llyi'jicvjioma кислот (fí 0,43 + 0,02

?. Кштсулышгг А-ПС (?) 0

8. Токсичность ( в мг) • 0,40 t 0.06

гомологии в их структуре.

Ориентировочная молекулярная масса А-ЛПС, оцененная расчетным способом по результатам химического анализа, составила 4,7 кД.

ЛПС обладал виратенной геиосонсибилизируидей и антителосвя-г зывающей активностью: ÜAK в Н1ГА составляла 52-125 шсг/мл, а МАК z Р'ШГА - 0,5-2,U «кг/мл.

Специфичность ЛПС изучала в И1ГА о монингоконковши сиворо-тками различных сорогрупп, сыворотками к накоторшд ьидаы нанато-гешгах нейссерий и к отдаленный по отиоаениш к менингококку с<ад териям. Из данных, представленных а табл.3, ввднЬ,. что пярпкрес-1ые, роагадаи с отдаланнимп вадаьш бактерий практически отс/тстио-ьавд, с н"иатогешшш1 яейссориямя били выражены для N. f lave а-

Hfj » -1

Kf ' ' I'M '

I ¡Vi

-Ci —

*4П

2 '

'*ÎC' э* S ЩР «JSP £02 РИШШВ

серогрупп Л, В с С h дГс C.coli 055:£Г

í 15 t.L-:r)

Обозначения: I - Шг

2 - IOC

ЩЕШ £ {0,5 в 2,0 ет) Е С

Спотфтагость «зшшгоногскового Л~ЛП0 ( по даяшзд ГПГЛ )

11г,»уПИ10 сиворопш К с11попотой Тптр Ш1ТЛТ9Л к ЛПС

П.сгп1гг51-Ш1з СОрОГрзТП

к 12 • 1:123-1:5120

3 а 1:64 -1:2048

с . 6 1:32 -1:2бб.

д I 1:16

X 3 1:16 -1:120

7 2 1:32 -1:12В

а 2 1:64 -1:128

1-335 I 1:64

II. Птгзсеспв 2 1:16 -1:32 .

1Т. соЛ4агЬзНо I 1:8

•О-штаготг Яа1гсяэ11а < 0-9,12,15) 4 1:2 -1:4

Зсг!—г5сМа со11 ГЛ-17 3 1:4

СЭДдоИа C7tir.il I 1:2

СМ^оИа Ло—.гг1 I • 1:4

Сог1азЬав*ег£1га (политиюгая) I 1:8

контроль (М'СС*) А 1:2

х - гтор'п.'з.'гал .пролитая сшзоротпа

ссаг, а о ттглгго?"''.."л:т каа-гдэллсь для гссх сзрогрупп, что углежога па глдсвуэ сзацгДлгаюсть ШС. Уропта ЛПС-очтптол бшш гласг,"лльппд1 з гс.".ологачио!1 систс:.:э, а э гатзрологсчшк варьировала а завзс^оста от серогрутти гашггококка. Наиболее высокими б;га титры апглтел в сыворотках групп!! В, что подержало насэ продлоло-ониэ о существования гокояогяи з ьтругту];<)

А- V* В-ДПС.

При диффузионной прецм.птлгли в геле с сыворотками серо-групи А, В и С ЛИС форшровал со всеш-сыворотками едшгетванну» гдянтмчйув полосу преципитации, что тикие свидательствавало о

видовой сплц^ичности ллс,

Высокоочвденний, тглуиохишчоски гомогенный ШС кенмиго-кокка сарогруппы А был использован в дальнейшем для конструи-рова:шя зритроцитарнпго диагностшеуиа.

3.Разработка технологам у.зготовлоотп вг'сок.очувстя',тыльного и спеютТ'.-.чнаго ;мтч)пц\!ТаглюРО лтауностакуш для выявления >лэ-нктчжоккотх ШС-антит^-л.

Эри'родатаршй ЛПС-диагиостикуы готовили с попадью общеизвестных методов, используя форшлишшровшшыа по Саши (1958) орнтроцаы и ск'пшфованшд! ЛПС. Для адтавздни ШО применяли обработку 0,02 Н иаОН при 3?°С в течешю ночи.

Оппиальмая концентрация ЛП^сенситана составляла 2ои мкг/аи.

Чувствительность и специфичность доагностшсука была изучена в результата титрования как кроличьих т'-мушшх ыошшгококко-вых сывороток различных серогрунп, так и человеческих снворотоц

ПОЛУЧОНШХ ОТ бОЛШИХ Ш,Ш, дОЛЫШХ 1.!0ШШГНТШ,Ш ДРУГОЙ ЗТИ0Л0-

Таблица 4

Уровень ышшнгокоиковнх. ДПС-ан'хител в сыворотках бо/ышх Гй/Л, ииншпчтши иной этиологии и здоровых шц

Контингент

Кол-во сывороток

Бодьшш IV"! 1

Больные м1<ш1н-гнтааа другой

ЬТИОЛПГИН Здоровье

195 18 26

% сывороток о титрами ¿1:32 1:64 1:128 1:253 1:512

'^ор.гошР'г ( 1 > в)

15 44

20 28 XI

25 22 4

26 6

1:128x1,2 (7.0 ±0,1)

1:43 ¿1,1 (5,5 ¿0,3)

1:32 х1,I (5,0 ¿0*1)

таи я здоровых лиц. "аяткальная концентрация аитатвл, выявляемая в И1ГА о ншшм даагпостикумом, составляла по белку 1,8 мвд/ил.

При титровании сывороток больных №1 отмапонн болоо высокие титры ЛЛС-антатол по сравнению с сыворотка.« здоровых лиц или больных менингитами .прут! этиологии- (табл.4). Это свидетельствовало о начпчли шргяюиного иммунного отвага на ЛПС-антигон при МИ. Наблюдалась динамика нарастшгая антител в ходо заболевания; Прирост антител бил отмэчон у больных 'Ш различных ссрогрутш, что подтверждало вацовуп специфичность ШС-диагностгосума. Сравнительное !1зучо!шо интенсивности иммунного ответа на ЛПС- я ПС-анаи-гоны больных Нй сорогрупп А, В и С показало, что а сыворотках больных Ш серогруш В п С титрн ЛПС-антател били достоверно выше (р<0,01), чей в сыворотках больных НИ серогруппы А» Дп ПС-антитол наблюдалась противополохггал картина п нпиболоо высоким • был отвот па А-ЛС (рис.4). Полученные результаты позволяют предположить, что при МИ шео? г-осто конкурзшшя антигенов и что группоспоцифический А-ПС, как болао сильный штагон, термозит синтез ЛПС-аититол.

4. Разработка полтопоп лля созданяд.ручуноглобуляноя анги-энпоточ^чяского.дсПстгня.

С помочь» Л1г!-дпаглосг:1Яу»,л были Определены уровни антител з донорских и плацентарных сыворотках, используемых для изготовления иммуноглобулинов (табл.5). Мояно заштить, что ксслодуомио сыворотка имели титра Л1С-антигел в интервале от 1:8 до 1:256, при отом на долэ образцов с тпгра'/д 1:128 п вглпо приходилось лишь около 1С$. Но шэкяо эти савороткп паяю рассматривать кок потенппалыгсо сырье для изготовления иммуноглобулинов направленного действия.

3 тостз занят« от детальна Л овдотс:ссе.м?л на мызах бьио показало, что вгодонш плазмы, содержащей ЛЮ-пптитолл а титра 1:120, почти вдвое увеличивало % йшшасмостп ялвоятх по сравнению с плазмой, титр ЛПС-антитал которой составлял 1:8-1:16. Это указывало на агггзэндотокилоскуп актатгость мошшгохошеовых ЛПС-анти-тол я порешэктавяоеть ш£ использования в дотокснкационноИ терапии №51»

Предварительная обработка сывороток мзркаптозтанолой приво-

6 .

4 -

2 '

Рис,4. Уровень антител к ЛПС и грушосневдфцчво-коцу ОС в сыворотках дольних РШИ различных серогрупп

Пи ос« оодииат - сродного оштричаскйв титров антител { в logg)

Л' А - сыворотки больных ШШ серогрухшы А

В В

С с

О- антитела к ПС антитела к ЛШ

аон ч «а р оггз ч о д и Ы íi ы

¿2 о о ч; м о S5 м ;4 и о л rJ

. на&чэовмспао о Е t: о

bp S g ч g ъ ч ц ? $ ч - ~ s s i

• ü s ocishíígh!ií3§pho

•í> ~ -я о ь Б» о и сл я a cd ~¡ f- <» н

_> а p o a с i o R с; к " a o

u rJ fc! S a o. ti o M с Э ч «-3 i ь

'Д 4 - о н ^ -J и =» cv с о s; « F

» о i» о tj о X ~ о 'i a Ь о h о

t . w si g i >-3 s a й ^ « i tl Ii

0 <-. ц л S a э H « о J о а

1 I £ V о - с i i сч i q, ö о -a а

г i * t 1 г- f i 5a ;

Коно«ашй продукт

го о

СП

. СП 1+ О О'Х-

1-1 « •

' о

чя о

ОТЗ Я Ч п О о

о Н аэ ►з о о и

^ и а л

ОДОСй

3 Т§=

оэ о

ЗЙ |1

ГО

са •« го ••

« со » -о

го о

1+ -х- 1+ -х-

О М ом

Исходное сырье

о к «

п я Вв

МО об

а и »а о

в> о о я |-3

я ш

к о

ев о го о

Г-5 ГО О ГО

Сл}

СЛ о}

?0 М О ю

СО О

сп с*э - о

со -х-м •т V

я ►о о

ОКЛ

от » •а р р ВЬд слр о

о •

(а м

со

го

-о3

1+ ъ а §

У &

Таша образом, в озгультать проведошшх ксслодоеонс; разработан шгод получения шсокоочвдвшюго шгАунохтсачейщ однородного uaicniTOKOiasoBOiKj ЛПС в на ьго осчоаэ сконструирован еритро-цитаряиЯ ДЕапюстакуи с ¿jpazsiaicii вадавоИ специфичности. Jfcar-ностикуи прадназначен для вшялания кашшгококковлх актлэндото::-сичаоких антител и f^oxgt бить испаяьяоаан как в каучинх исследованиях яря изучении разнообразна« вопросов патогенеза к ш,абиогенеза LSI, так и в практических целях, в частности, ьра отбора сшороточього с:рья с повшмпйа« сэдар^ашзи шнш1гокоха;о1ч!х ШС-шпптсл для получешя п-^уноглобулинов капрзьшшого cui-z-ацдотокопчоского действия. Показано, что иапбодае цорспохжтшг: препаратом такого яата явлштся КИП - кемшзкешй и:.:^утгог;:о5у.т,:-нокай препараг, содэр^а^Ш яо^иио енгитал lea-класса шиатеда IgU-ioxcca.

выводи

J. РазшЗотан способ получзшш Еисокоочщошного ь блологи-чоска активного Л1С шюшгококка грушш А путей сод-

но-^енольнпй акстракцш ьо Еостфал», ieptamcito.'i обработка к ультрацантрпфугпроваш'.я в раствора хлористого натрия с концентрацией 0,5 М е suae. Примененная ызтодака обоспечиьаот получение ишдунохчшгсесжи гомогенного препарата, свободного от прцвдеп груплоснец^нчоского пслисахарвд.

2. Показано, что препарата ЛПС по ссоа;.;у хишчискоцу составу и злектрофоротическрй годв1жностц в ПЛАТ о ДСЩ относятся к ' JfflOR-Tium. Сродняя сасса шдекул ШЗ состашязт около 4,7 кД.

3. Устаьэглеш внеокая гемосоясибшшзируюадая и онтитьлосвя-з:£квдал активность JJ1J: ШК в РИГА составляла 62-125 цкг/гл, а UAK в Г'1П1А - 0,5-2,0 гткг/ия, В структура ШС виладеш дотерии-нантц видовой специфичности, которое обуславливают порекрэстше ссрслогичосгчо реакции о цилушшии креллчы^ш сыворотками ко всей «зшгрушгау ынингошиш,

4. Р?.аработона технология кэготоияекяя и освозно производств» щиос по пучащие иенилгококкового эратроцатарчого ЛПС-дпагности-ку(ла. ¿".атосшсум характеризуется шеокой чувствительностью: ик'чмиштя кошентрашш рнтглч л, зияадяошя в ШГА, составит окс ло 1,8 ¡. Ki /m.

5« лрогодэпа срягаитсльнлл спйнга содержания "йшнгокслко— лиг Л1С-ситдтод з сц"с"отглх болышх к-;,ii, г.-.с:п:нглта'з1 иной этиологии а здоровых лиц. Установлено, что уропи л13-антатол а съою-лах болышх гс"1 статистически. значгко прстгааля таковна з сллсроткал ядоровчх лиц или больнда г.глспгглтг7'*! другой отно-лотлл. гзявлвпа динопзса нарастания „шс-энтатол з'процессе за-йологлния.

6. обнаружено, чго сяойо 10% доаорсхях и плацентарных си-иоротсл содэрглт цзеяпгог.о:с:овчз л1с-аит;'то."з в пов'ляешгих татрах (.1:120 д ::'::□). ¿пс-онтзтала относятся :с 1&з-:5лаосу п обладают сатнскдотс!глэст'1 сгязвносгш в зксяорглжпто па мотах.

7. стосотка с погл^згапь уротса 1.;зшшгохокковах ляс-пнгг/гол язяг^гя поргаекап'ппп для использования а качество слрья прп создала кг"4уяоглобу.-пновух прспаратоэ направленного

слалккптслст-'аслого дздслгаг. Одним из так:« препаратов колет

сЗоггглшЛ хс"-.тр->пп'-о:1 яктдвшшз г-луясглобуллнопй чр-тлгп".', ^чсг^бо^гпг-пл л г.м» г.п.Ггбрпч9Вского.

ст.:аа рдгот, по егз ^еекртлщк

X. лльоло.^саларда глзкпнгокошм группы а ¡г

::г:;пль-сг.':;;::о ого о ГПГА/ г.з.Гсйг.спа, п.л.Гс«"пя, 2.л.Кузпега-i-"!, т»п.гс"'1г:~о /А'~"тиспрсгг-палтаг'л дотекая каполшсс и ккавч-г".:: япГ.зксгЛ, сб.трудоз жхм гл л'.н.Гсбрзговспого.44., 195'/.-С.ЕСЫСЗ,

2» ;:""}л;о.югл'гс!с,;?л.1 сг.жпшоста .тгсюполисахярцдиого ког.:лопе-нта улытазиуксгсго рлгагёна ла- коюнгоягсскоа согогруппн В, г^тзсеипого л ллпоссгы /а.б.Пстров, н. л.варданян, т.в.Ювддогос-с::ая л др.//Разработка полил: бакторлальннх вамп'л. Об.трд-чоэ г1.11.11.к.зч1ткова.-г-'.,1с87.-с.2а-59.

3, д?л!слг л.л., Бобилова г.з. и'-.'.олгсг.одулируп'яо дог.ствг.о ~'пспс.т::са::яглдз "з1пссг1п г.гп1пз11;г£11я сорогрулпи л о слитпх »п //Тез.долл. iii лслтор.-лагли 'молодив у:?л:.л института з?.с-порлгпнтлл-глге:? блологлл /л Арзяхкгей сс?.~2ровая,1р£8.-с.50.

а. Лнглтола к л:яслолпсс::ар:!ду когшнгококхоь з'препаратах герогп /Г.3."сс''-.пт, и.в.Еорпсога, з.'л.Кувякина к др.///л:лу:.о-бполопппелло препарата. сз.трудов пзпем тгл.г.н.ГгИрнчопского.-

М,,1989.-0.25-26.

5. Протехтищая активность детоксицированного липополисаха-РВДа Heisaeria Keningitidip серэгруппы А В опытах ia vivo /

A.А.Дельвиг, Л.И.Красиопроашт, В.И.Кувакина и др.//Еурн.ш:кро-биол,, апидемиол. и кшунобиол.-1989.-^ 5.-0.69-73.

6. Бобылева F.B., Кувакина В.И. Способ получения липополи-сахарида кзникгококков серогрушш к //Авт.сввд. .'6 1537263 от 15 сентября ÍS89 г. .

7. Антитела к лцэтонолиеахариду менингококка и возьюаность их использования дм серотерапии /Г.-£.Бобылева, И.В.Борисова,

B.А.Алепшш* Л.'л.вилипдова //Тез.докл. 4 Всзсоюз.конф. по ые-нингокок'совой инфекции u гнойшш иекингитаы (Новосибирск,1990^т «1..I990.-T.2.-C.II3-II5.

6. Нротективноя .активность поликлональных и ионоклоналышх антител к липополисахариду i^bsaria oeningltidiB серогруппы А в опытах íb viro /А.А.Дельвиг, Л.И.Краснопрошина, Т.Юолга-рева и др./Дурн.микробиол., ападешюл. и шщунобиол.-1990.-№ 10.-С. 118-ГЮ.

2 i

caiíccx сстшЕнш!

ПС - полисахарид

ШС - липояалисахарпд

ЛОС - лмюодигосахарлд •

55 в ПЛАТ - электрофорез в полиакрилашдао*:! гола о ДСП о додоцалсульфато;.^ натрия

1135 - л^луцоодоктрофорЬз

ЕГОЗ - встречный илмунозлектрофорез

РИЭ5 - ракетпнЯ йлмунозлектрофорез

Л1ГА - реакция пассивной гемагглюттшация

РТГГГА - реакция торможения пассивной гемагглютинеции

ГМК в HITA - минимальная яктпзная концентрация антигена, еднекбилпзиругщая эритроциты в ГПГА

МУС в РИНГА- минимальная aктлтпп концентрация антигена,

торчозщая з HITA 2 гомагглитишрумдих единицы

сыворотки

Ш ' - г/хипиптакекковая шфэкция

Г?МИ - гоноралязов.гнны'9 формы мзншгококкопой инфекции

'>«'< Тип. .Мниадра,, рф 7„ir/íf

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бобылева, Галина Васильевна

ВВВДЕНИЕ.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИПОПОЛИ

САХАРВДОВ. . . .II

1.1. Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий.II

1.2. Методы ввделения и очистки ЛИС.14.

1.3Химическая структура ЛИС.

1.4. Биологические свойства ЛПС.

Глава 2. ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ЛПС

АНТИГЕН И РОЛЬ СЕРОТЕРАПИИ ПРИ СЕПТИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЯХ, ВЫЗВАННЫХ ГРАМОТРИЦА ТЕЛЬНЫМИ

БАКТЕРИЯМИ.

Часть 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Материалы исследования.

3.1.1. Штаммы.

3.1.2. Питательные среды.

3.1.3. Микробные клетки менингококков

3.1.4. Балластные осадки, полученные при производстве менингококковой полисахаридной вакцины группы А.

3.1.5. Антигены.

3.1.6. Кроличьи иммунные сыворотки

3.1.7. Сыворотки лвдей

3 .1.8. Препараты крови.

3.1.9. Лабораторные животные.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Культивирование менингококка

3.2.2. Методы препаративной биохимии . 48 3.2.3♦Физико-химические методы

3.2.4. Биофизические методы.

3.2.5. Иммун©химические методы.

3.2.6. Серологические методы

3.2.7. Биологические методы

3.3. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований.

Глава 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЬЩШШНИЯ ОЧИЩЕННОГО ДПС мшмнгшош ттш а

4.1. Сравнительная оценка традиционных методов ввделения менингококкового ЛИС и характеристика физико-химических свойств выделенных препаратов.

4.2. Использование отходов производства менингококков ой полисахаридной вакцины группы А для выделения ЛПС.

4.3. Антигенный анализ препаратов ЛПС менингококка группы А.

4.4. Разработка метода получения ЛИС, свободного от примеси группоспецифического ПС

Глава 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ й СЕРОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЕНИНГОКОККОВОГО ЛПС ГРУППЫ А

5.1. Анализ гомогенности ЛПС.

5.2. Электрофоретические свойства менингококкового ЛПС.

5.3. Характеристика серологических свойств и специфичности ЛПС.

- 4

Глава 6. РАЗРАБОТКА ЭРИТРОЩТАРНОГО ДИАШОСТШМА ДЛЯ ОПРЭДЕЛЕНИЯ СЛВДФИЧЕСКИХ АНТЙТВЯ К ЛШ МШНГОКОЙКА . . . . . . . . . . 10?

6.1. Подбор оптимальных условий приготовления ЛПС-диагнос тикума . Ю

6.2. Специфичноеть, чувствительность и воспроизводимость РПГА с формалияизированными эритроцитами, сенсибилизированными ЛПС

6.3» Стабильность эритроцитарного ЛПС-диагностикума . . . . . . . . . . . Ц

6.4. Определение уровня специфических ЛНСантител у больных ГФШ

Глава 7. РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ МШШГ0-КОЙКОВЫХ ДРОТЮОЛШОПОЛИСАХАРЙДНЫХ ШЩЩГ-Н0Г1СШШЙШ

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Липополисахарид менингококка серогруппы А"

Актуальность проблемы. Несмотря на успехи в диагностике, профилактике и лечении менингококковой инфекции, достигнутые за последние два десятилетия, эта проблема продолжает оставаться одной из важнейших в инфекционной патологии и привлекает пристальное внимание исследователей. Это связано о тем, что генерализованные формы менингококковой инфекции характеризуются особенно тяжелым течением заболевания, постинфекционными осложнениями и высокой летальностью (от 10 до 40/0, не имеющей тенденции к снижению (31, 39, 202).

В настоящее время не вызывает сомнения, что развитие тяжелых патологических состояний организма: нарушения метаболизма, электролитного баланса, важнейших биохимических систем и поражения отдельных органов вплоть до шока и гибели, происходит от токсического действия липополисахарида (9, 32, 40, 55, 140). G учетом этого многие исследователи полагают, что вопросы традиционной терапий Менингококковой инфекции должны быть пересмотрены в направлении создания для этих целей препаратов иммуноглобулинов направленного антиэндотоксического действия (28, 46, 65, 74, 75, 76, 77, 78, 84, 219).

Липополисахарид относится к числу протективных антигенов менингококка, стимулирует образование бактерицидных антител и участвует в формировании невосприимчивости к менингококковой инфекции. Детоксицированный липополисахарид рассматривается как один из наиболее вероятных кандидатов противоменингококко-вой вакцины (12, 13, 14, 79, 100, 169, 170).

Глубокие исследования в области менингококковой инфекции, имеющие связь с липополисахаридом, определяют необходимость создания надежных и доступных коммерческих эритроцитарных ди-агноетикумов на основе липополисахарида. Подобные препараты в нашей стране пока не производятся.

Несомненно, что исследования, направленные на выявление специфических антилипополисахарвдных антител, и обеспечение этого направления надежным диагностическим препаратом создадут необходимые предпосылки для решения конкретных задач, связанных о проблемой менингококковой инфекции.

Цель и задачи исследования.

Б связи с вышеизложенным целью работы являлось получение и характеристика ЛЕЮ менингококка группы А, конструирование на его основе эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител и разработка подходов для создания менинго-кокковых иммуноглобулинов направленного антиэндотоксического действия.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод получения высокоочищенного липополисахарида менингококка группы А, свободного от примеси других антигенов микробной клетки.

2. Отработать методы контроля иммунохимической и химической чистоты MG.

3. Изучить физико-химические, иммунохимические и биологические свойства 1ПС.

4. Разработать эритроцитарный диагностикум на основе ЛПС для определения специфических антител.

5. Оценить содержание JHIC-антител в сыворотках здоровых лиц и больных менингококковой инфекцией, а также изучить изменение их уровня в динамике заболевания.

6. Исследовать уровни антител к ЛПС в донорокой плазма и плацентарных сыворотках, используемых в качестве сырья при производстве иммуноглобулинов, для решения вопроса о возможности приготовления специфического антиэндотоксического иммуноглобулина.

7. Изучить протективную активность сывороток с высоким уровнем антител к ЛПС менингококка.

Положения, выносимые на защиту:

1. Для конструирования диагностических препаратов на основе ЛШ необходимы антигены, свободные от примеси капсульно-го группоспецифического полисахарида. Предлагаемый для этих целей метод включает комбинацию препаративных процедур, состоящих из водно-фенольяой экстракции микробных клеток по Вестфалю, термичеокой обработки раствора и ультрацентрифугирования его в присутствии ffafil.

2. Разработана технология изготовления высокочувствительного, специфичного эритроцитаряого ЛШ-диагноетикума для выявления менингококковых ЛПС-антител.

3. Для серотерапии Г#МИ предложено использовать комплексные иммуноглобулиновые препараты, обогащенные XgK-фракцией и приготовленные из сывороточного сырья с высоким исходным уровнем менингококковых ЛИС-антител.

Научная новизна.

Разработан оригинальный метод очистки менингококкового ЛПС серогруппы А от примеси группоспецифического полисахарида, Получено авторское свидетельство В 1537263 от 15 сентября 1989 г. на "Способ получения ЛПС менингококка группы А".

Получены доказательства иммунохимичеокой гомогенности ЛПС и его выраженной видовой специфичности.

Получены дополнительные данные о содержании ЛПС-антител в сыворотках здоровых лиц и больных менингококковой инфекцией, а также данные об изменении уровня ЛПС-антител в динамике заболевания.

Впервые проанализированы на содержание специфических ЛПС-антител донорские и плацентарные сыворотки, используемые в производстве иммуноглобулинов, а также готовые коммерческие иммуноглобулины и экспериментальные серии комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП), разработанного в ШИИЭМ им. Г.Н.Габричевского. Показано, что IQ% исследованных сывороток содержат высокие уровни ЛПС-антител (1:128 - 1:256).

Экспериментально обосновано на основе КИП, обогащенного igM -фракцией иммуноглобулинов, конструирование менингококко-вого иммуноглобулина антиэндотоксического действия из сывороточного сырья с высоким исходным уровнем ЛПС-антител (от 1:128 и выше).

Практическая значимость выполненной работы состоит в разработке на основе очищенного ЛПС менингококка группы А эритроцитарного диагноетикума для определения специфических антител, а также в обосновании возможности получения препаратов иммуноглобулинов направленного антиэндотоксического действия для серотерапии менингококковой инфекции.

Составлена научно-техническая докумштация на эритроци-тарный ЛИС-диагностикум (Изменение к ТУ-42.14 и Регламенту производства диагностикумов менингококковых групп А и С эритроцитарных жидких, проекты ФС на диагностикумы эритроци-тарные менингококковые группоспецифические и видовой антигенные жидкие для РА и Инструкции но применению диагности

- 10 кума менингококкового видового липополисахаридного антигенно^ го жидкого).

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе одно авторокое свидетельство.

Чисть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Бобылева, Галина Васильевна

ВЫВОДЫ.

1. Разработан опоооб получения выоокоочищённого и биологически активного MG менингококка группы А путем комбинации водно-фенольной экстракции по Вестфалю, термической обработки и ультрацентрифугирования в растворе хлористого натрия с концентрацией 0,5 М и выше. Примененная методика обеспечивает получение иммунохимически гомогенного препарата, свободного от примеси груипоспецифического полисахарида.

2. Показано, что препараты ЛПС по своему химическому составу и электрофоретической подвижности в ПААГ с ДСН относятся к ЛПС 1-типа. Средняя масса молекул ЛИС составляет около 4,7 кД.

3. Установлена высокая гемосенсибилизирующая и антитело-связывающая активность ЛПС; МАК в РПГА составляла 62-125 мкг/мл, а МАК в РТПГА - 0,5-2,0 мкг/мл. В структуре ЛПС выявлены детерминанты видовой специфичности, которые обуславливают перекрестные серологические реакции с иммунными кроличьими сыворотками ко всем серогруппам менингококка.

4. Разработана технология изготовления и освоено производственное получение менингококкового эритроцитарного ЛЩ-диагностикума. Диагностикум характеризуется высокой чувствительное тыэ: минимальная концентрация антител, выявляемая в РПГА, составила около 1,8 мкг/мл.

5. Проведена сравнительная оценка содержания менингококко-вых ЛПС-антител в сыворотках больных ГШЙ, менингитами иной этиологии и здоровых лиц. Установлено/что уровни ЛПС-антител в сыворотках больных ГФМИ статистичеоки значимо превышали таковые в сыворотках здоровых лиц или больных менингитами другой

-147этиологии. Выявлена динамика нараотания ЛПС-антител в процессе заболевания.

6. Обнаружено, что около 10$ донорских и плацентарных сывороток содержат менингококковые ЛПС-антитела в повышенных титрах (1:128 и выше). ЛПС-антитела относятся к igM-классу и обладают антиэндотоксической активностью в эксперименте на мышах.

7. Сыворотки с повышенным уровнем менингококковых ЛПС-антител являются перспективными для использования в качестве сырья при создании иммуноглобулиновых препаратов направленного антиэядотоксического действия. Одним из таких препаратов может быть обогащенный ^[-фракцией комплексный иммуноглобули-новый препарат, разработанный в ШИИЭМ им. Г.Н.Габричевского.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЩШ относятся к числу исключительно тяжело протекающих инфекций и характеризуются высокой летальностью, которая в начале века составляла 80-90$. Применение гипериммунных менинго-кокковых сывороток позволяло снижать летальность до 10-30$. Однако в те годы по ряду объективных причин этот метод лечения Щ не нашел широкого применения. В настоящее время в связи о использованием антибиотиков, сульфаниламидных препаратов и кортикостероидов летальность от Ш снизилась до 10-20$ (40). При этом следует иметь в виду, что такой уровень сохраняется неизменным на протяжении почти 50 лет и в отличие от других бактериальных инфекций не имеет тенденции к снижению.

Профилактика заболеваемости Ш осуществляется с помощью полисахаридных химических вакцин. За последние 20 лет разрабо-tshh и внедрены в производство менингококковые полисахаридные вакцины серогрупп A, G, г, W-I35 (36). К сожалению, аналогичная вакцина, приготовленная из В-ПС, оказалась не иммуно-генной для лвдей (216), в в настоящее время проводятся исследования по созданию эффективной менингококковой вакцины группы В на основе других протективных антигенов менингококка (19, 81, 145). Однако массовая иммунизация менингококковыми вакцинами целесообразна лишь в периоды эпидемического подъема заболеваемости и в организованных коллективах, где возникают очаги инфекции. В межэпидемический период применение вакцин экономически и эпидемиологически не оправдано. Между тем именно в этот период наблвдается увеличение летальности, по-видимому, из-за ослабления внимания медиков к МИ.

Хорошо известно, что рост числа антибиотике- и сульфаниламидорезистентных штаммов привел к значительному снижению эффективности лечения Ш этими препаратами (32, 40). Более того, применение антибиотиков для лечения больных с менингококдемией порой утяжеляет их состояние. Это происходит вследствие массовой гибели менингококка от действия антибиотиков и высвобождения в кровь больных больших количеств эндотоксина (41, 74, 189, 199).

Вышеперечисленные причины побуждают к поиску новых средств лечения Ж и других грамотрицательных инфекций. Одним из альтернативных решений проблемы является серотерапия на основе иммуноглобулинов направленного действия. Этому вопросу посвящены многочисленные публикации последних лет (28, 46, 75, 76, 77, 78, 65, 84, 219).

Общепризнано, что основным патогенетическим фактором при развитии грамотрицательных инфекций, в том числе и Щ, является ЛПС. Вызывая активацию системы комплемента, освобождение многочисленных медиаторов, действуя на макрофаги и клетки эпителия, ЛПС приводит к развитию тяжелых патологических состояний макроорганизма, вплоть до шока и гибели. Отсщда очевидно, что средства серотерапии должны быть направлены в первую очередь на инактивацию ЛПС. К таким средствам следует отнести прежде во его препараты плазмы крови или иммуноглобулинов, обогащенные антителами к ЛПС. Опубликованы данные об успешном применении специфических ан ти-ЛПС -иммун ог л о булинов в хирургической практике и при лечении сепсиса (46, 47, 75, 223). Подобные препараты для лечения ГШ! пока не разработаны,,

1з данных литературы известно, что уровень ЛПС в крови больных Г« может достигать значений в сотни и тысячи раз выше, чем йри оептицемйях, вызванных другими грамотрицатедьными инфекциями (55). Можно предположить по аналогии о другими грамотрица те льнами инфекциями, что введение иммуноглобулинов аятиэндотоксического действия, связывающих ШЮ менингококка и вызывающих его инактивацию, приведет к улучшению состояния больных ГйШ. В своей работе мы попытались обосновать основные подходы к созданию менингококковых антиэндотоксических иммунб-глобулиновых препаратов и, в первую очередь, оценить возможности использования донорских и плацентарных сывороток в качестве исходного еырья для получения таких препаратов. Согласно данным литературы около 3-1(3$ сывороток здоровых доноров имеют высокий уровень антител к ЛПС различных бактерий (33, 83, 84). Однако сведения о содержании в таких сыворотках антител к ДШ менингококка в литературе отсутствуют.

Для получений четкого представления о содержании ЛПС-ан-тител нами было исследовано более двухсот образцов плазмы крови безвозмездных доноров и плацентарных сывороток. На основании результатов титрования в РПГА указанного материала было показано, что сывороточные антитела к менингококковому ЛПС присутствуют практически у всех здоровых лиц, но, как правило, в низких титрах. Лишь у 10$ исследованных образцов уровень антител был достаточно высоким (1:128 и выше), чтобы рассматривать этот материал как перспективный для использования в серотерапии^ нативном видели в качестве исходного сырья при изготовлении иммуноглобулинов направленного действия.

Изучение аятиэндотоксической активности образцов плазмы крови с высоким исходным уровнем НС-антител в тесте защиты мышей от летальной эндотоксемии показало, что указанные образцы обладали выраженными протективннми свойствами. Процент гибели мышей при введении плазмы с высоким уровнем антител уменьшался вдвое до сравнению с плазмой, содержащей низкий уровень антител. Чтобы определить, сохраняется ли соответствующий уровень антител в готовых препаратах иммуноглобулинов, было проанализировано 10 серий коммерческого нормального иммуноглобулина, 5 серий специфического противоменингококкового иммуноглобулина, полученного из плазмы доноров, иммунизированных полисахаридной А-вакциной (37), и 5 серий экспериментального комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП), разработанного в МНИЙЭМ им. Г.Н.Габричевского (60. В отличие от коммерческих препаратов иммуноглобулинов, содержащих в основном только igg, в состав КИПа входило 15920$ iga ж 25-30$ igi; (6). Особенно важно присутствие с которыми, как известно, связывают защитный эффект при ряде грамотряцатеяьяых инфекций (эшерихиозы, садьмонеллезы и др.) (7). Б настоящее время энтеральные формы КИП успешно применяются для лечения острых кишечных инфекций (7). Ведется разработка КИИ для в/в введения.

Из всех испытанных нами препаратов антитела к Л1С менингококка в высоких титрах (1:128 - 1:256) были обнаружены только в КИПе. В коммерческих нормальных и специфических противо-мендагококковнх иммуноглобулинах титры антител были даже ниже, чем в исходном сывороточном сырье. Это свидетельствовало о потере ЛПС-антител при изготовлении коммерческого иммуноглобулина и, напротив, о концентрировании их в КИПе. Поскольку КИИ обогащен иммуноглобулинами класса М, можно было предположить, что менингококковые ЛПС-антитела принадлежат именно к этому классу. Титрование в РПГА образцов плазмы крови и КИП, предварительно обработанных меркаптоэтанолом, подтвердило наши предположения и указывало на перспективность использования КИП для серотерапии ЩЩ. Если такие препараты готовить из сывороток с высоким исходнйм уровнем ЛШ-антител, то это приведет к значительному увеличению их содержания в готовом препарате.

Необходимой предпосылкой для создания таких препаратов является наличие высокочувствительной и специфичной тест-системы для выявления НС-антител. Это и составляло основную цель наших исследований. В качестве диагностической тест-оис-темы нами был выбран эритроцитарный диагностикум на основе высокоочищенного ЛПС менингококка группы А.

Традиционные методы выделения ЛПС из микробных клеток позволяли получать препараты с различной степенью очистки и биологической активностью. Наиболее очищенные препараты с низким содержанием примеси белка и нуклеиновых кислот могли быть получены по методу Вестфаля в сочетании с ультрацентрифугиро-ваниам раствора ЛПС при 105000 g . Однако иммунохимический анализ с менингококковыми гипериммунными кроличьими сыворотками выявлял в таких ЛПС присутствие примеси капсульного ПС в количестве около J%,

В качестве методов количественной оценки содержания примеси А-ПС в ЛИС были использованы ВИЭ# и РТПГА с грунпоепеци-фическими менингококковыми кроличьими сыворотками. Были специально подобраны условия проведения этих реакций с учетом количества примеси А-ПС. Необходимость использования для этих целей йммунохймических методов вызывалась тем, что определение А-ПС химическими методами по содержанию фосфора оказалось невозможным из-за присутствия фосфора в составе самого ЛПС.

Следует отметить, что при анализе данных литературы, касающихся получения менингококковых ЛПС (II, 26, 27, 112, 113, 124, 203 , 205), мы не нашли каких-либо сведений по характернотике иммун©химической и антигенной чистоты полученных препаратов, в том числе данных, подтверждающих отсутствие в ЛПС примеси капеульного группоспецифического НС. Вместе с тем мы считали, что такая характеристика крайне необходима, особенно в том случае, если предполагается использование ЛПС для проведения иммунохимпческих и серологических исследований. Показано, что из-за сильно выраженного общего отрицательного заряда А-ПС, он легко сенсибилизирует эритроциты без какой-либо предварительной их обработки (95). В этом отношении сенсибилизирующая активность А-ПС приблизительно в 10 раз превышает активность ЛПС. Использование для приготовления диагностикума ЛПС, содержащего примесь А-ПС даже в небольшом количестве, было неприемлемо, так как в таком случае титрование сывороток привело бы к искажению результатов фактического содержания антител к ЛПС. Следовательно, необходимо было разработать такой способ очистки ЛПС, который бы гарантировал отсутствие в готовом препарате группоспецифического ПС даже в следовых количествах.

В основу разработанного нами метода было положено различие в термостабильности двух антигенов. Известно, что ЛШ относится к числу достаточно термостабильных антигенов и сохраняет серологическую и биологическую активность при нагревании его при Ю0°С в течение 3-х часов (198). А-ПС, напротив, весьма термолабилен и полностью разрушается до низкомолекулярных фрагментов в процессе нагревания при IQ0°C в течение 30 минут (18). Поэтому оказалось возможным подобрать такие условия, при которых происходило избирательное разрушение А-ПС при полном сохранении основных свойств ЛПС. Избирательная деградация A-1G достигалась нами в результате термостатирования водного раствора ЖС при 37°С в течение 16 суток. Однако и в этом случае эффективного разделения высокомолекулярного ЛПС и низкомолекулярного А-ПС не происходило ни в результате гельфильтрации на колонке с сефарозой 4В, ни при ультрацеятрифугировании.

В дальнейшем было показано, что ЛПС и А-Ш образуют комплекс, но связь между ними не является новалентной и может быть разрушена в присутствии определенных концентраций неорганических солей в раетворе. В соответствии с отработанными условиями заключительный этап очистки ЖС следовало проводить в присутствии laCi при концентрации раствора, равной 0,5 М или выше. На "Способ получения липоиолисахарида менингококка группы Ая получено авторское свидетельство Л 1537263 от 15 сентября 1989 г.

Указанным опособом ЖС мог быть получен как из сухих . микробных клеток, так и из иосадка-25и - балластного промежуточного продукта производства менингококковой полисахаридной вакцины группы А.

По разработанному методу было получено Ю серий ЖС. С помощью методов диффузионной преципитации в геле и ЙЭФ с гипериммунными кроличьими сыворотками было показано, что очищенные препараты содержали единственный антигенный компонент и бшш иммунохимически гомогенными.

Анализ очистки ЛПС проводили с помощью традиционных методов определения белка по Лоури и нуклеиновых кислот по Спирину. Суммарное содержание примеси балка и нуклеиновых кислот было невелико и не превышало в пересчете на сухую массу препарата.

Химический состав ЖС практически полностью совпадал с данными, представленными другими авторами для ЖС менингококка группы А (112, 113). Содержание фоофора в ЛПС составляло в среднем .3,752, КДО - около J0, липида А - более ЗС$. Высокое содержание КДО и липида А в наших препаратах указывало на то, что ЛИС принадлежит к к -типу, и это полностью соответствовало современным представлениям о химической структуре менингококковых ШЮ (108).

Дополнительное доказательство этого было получено с помощью Э# в MAT о ДОН. В сравнительных экспериментах постановки ЭФ в ШАТ о ДСН ЛПС из е. coli оеротипа 055:Вб, относящегося к ЖС s -типа, и менингококковых ЛПС групп А, В, С было показано, что препарат из е. eoli давал более 40 полос различной интенсивности, расположенных по всей длине геля и указывающих на сильно выраженную гетерогенность молекулярных масс от очень малых (порядка 3-4 кД) до больших (порядка нескольких десятков тысяч дальтон) (204). В противоположность этому ЛПС менингококка давали характерный для д-типа спектр, где выявилось от 2 до 6 отдельных полос. При этом количество основных компонентов не превышало 2, кроме которых обнаруживалось еще 2-3 минорных. Все компоненты двигались со скоростью, близкой к скорости бромфенолового синего, что свидетельствовало об их низкой молекулярной маосе, и находились на близком расстоянии друг от друга, почти сливаясь, что указывало на очень незначительную разницу в их молекулярной массе и химической структуре. Полученные нами данные полностью соответствовали представлениям о молекулярной структуре менингококковых ЛПС (204). Элетрофоретические профили ЛПС серогрупп А и В были очень похожи как по набору полос, так и по их расположению. Иная картина наблвдалась при электрофорезе ЛПС группы С. Независимо от концентрации препарата, использованной для электрофореза, в ЛПС группы С выявлялась единственная полоса без каких-либо минорных компонентов. Эти данные указывали на то, что для ЛПС групп А и В существует более выраженное антигенное родство, тогда как для серогрупны С такое предположение маловероятно.

Ориентировочная молекулярная масса ЛИС, оцененная расчетным опособом по результатам химического анализа, составляла 4,7 кД. Эти данные были очень близки к результатам, полученным другими авторами с помощью ЭФ в ПААГ о ДСП (124, 205).

Для решения вопроса об использовании очищенного ЛИС в качестве основы при созданий менингококковой диагностической тест-системы необходимо было изучить его серологическую активность и специфичность, которые имеют ключевое значение в характеристике любого антигена, используемого для конструирования диагностических препаратов.

Согласно данным литературы специфичность менингококковых ЛИС неоднозначна. ЛИС может иметь в своей структуре различные антигенные детерминанты (123, 205). В зависимости от условий культивирования менингококка, метода выделения и степени очистки активность тех или других детерминант может в значительной степени варьировать. При этом, до мнению ряда авторов, наиболее сильно выражены детерминанты с иммунотиповой специфичностью и в меньшей степени - с видовой специфичностью (137, 205, 225). Наряду о этим в ЛПС менингококка выявлены детерминанты, общие с некоторыми видами рода Neisseria , такими как ж. gonorrhoeae И Ж* lactamica (123).

При исследовании серологической активности и специфичности были использованы сыворотки к менингококкам различных серогрупп, к некоторым другим видам нвйосерий, к бактериям семей

О IBS En-feerolaeteriaeeae И в. dxjMiieriae.B опытах постановки РПГА с эритроцитами, сенсибилизированными ЛШС, в гомологичной системе титры гемагглютинации для разных серий сывороток находились в интервале от 1:128 до 1:5120. В гетероло-гичных системах титры значительно варьировали в пределах от 1:16 до 1:2048 в зависимости от серогруппы менингококка, взятого для иммунизации. Максимальные титры наблвдались в сыворотках к менингококку группы В.

Возвращаясь к данным, полученным при электрофореза ЛПС групп А и В, можно предположить, что высокие уровни антител к ЛШ в сыворотках группы В, обусловлены, по-видимому, большей гомологией в структуре молекул А- и В-ЛПС по сравнению о другими серогруппами.

При сравнении результатов титрования кроличьих сывороток к менингококкам и к непатогенным нейссериям, полученным по единой схеме иммунизации, было установлено, что слабые перекрестные реакции наблкщались в случае ц. fiavescens (1:20 -1:40) и практически отсутствовали для в, cattarbalis. Выраженных перекрестных реакций с сыворотками к представителям семейства энтеробактерий и грамположительным бактериям дифтерии не обнаружено.

При иммунохимических исследованиях с помощью диффузионной преципитации в геле по Ухтерлоне с гипериммунными кроличьими сыворотками к менингококкам серогрупп А, В и С ШС формировал с каждой из указанных сывороток единственную адентичную полосу преципитаций. Эти результаты позволили заключить, что очищенный ЛШ представляет собой антиген, содержащий детерминанты видовой специфичности. I сожалению, отсутствие эталонных сывороток с йммунотишовой специфичностью, которые в настоящее время получены лишь в зарубежных лабораториях, не позволили нам охарактеризовать иммунотиповую принадлежность подученного нами ЛПС.

Следующим этапом нашей работы было изготовление эритроци-тарного диагностикума на основе высокоочищенного и иммунохими-чески гомогенного ЛПС для выявления специфических менингококковых антиэндотоксичеоких антител. Диагностикум готовили с помощью общеизвестных методов (17), используя формалинизирован-ные по Фили эритроциты и активированный ЛПС. Было апробировано 2 способа активаций ЛПС: щелочная и кипячением. Как показали исследования, и в том и в другом случае получали ЛПС с приблизительно одинаковой гемосенсибилизирующей активностью. Однако при выборе окончательного варианта диагностикума предпочтение было отдано щелочной активации ЛПС, как более технологичной.

Эритроцитарный ЛПС-диагностикум был сравнительно отаби-лен и сохранял свою активность в течение;З^х лет хранения в условиях бытового холодильника.

Чувствительность и специфичность разработанного диагностикума была изучена в результате титрования как кроличьих ги~ периммунных менингококковых сывороток различных серогруш, так и человеческих сывороток, полученных от больных Щ®, больных менингитами иной этиологии, а также здоровых лиц. Исследования выявили высокую чувс твительнос ть ЛПС-диагностикума. С его помощью можно было определить титры ЛПС-антител в интервале от Д2 до 1:5120 - 1:10240. Минимальная концентрация антител/выявляемая в РИГА с ЛПС-диагностикумом, составляла по белку 1,8 мкг/мл.

При титровании оывороток, полученных от больных Щ с установлвнной серогрулдовой принадлежностью возбудителя, отмечены более высокие титры IliC-аятител по сравнению с уровнем таковых в сыворотках здоровых лиц или больных менингитами неменингокок-ковой этиологии. Это свидетельствовало о наличии выраженного иммунного ответа на ЛПС-антиген при МИ. Наблвдалась динамика нарастания антител в ходе заболевания Ш.

Отмеченные закономерности, как и ранее полученные экспериментальные данные по титрованию кроличьих иммунных сывороток к различным серогруппам менингококка, подтверждают видовую специфичность ЛПС-антигена и изготовленного на его основе эрит-роцитарного диагноетикума.

Средние уровни ЛШ-антител при ГФЩ серогрупп Б и С были достоверно выше, чем при заболеваниях, обусловленных менингококком группы А (соответственно, 1:118 £ 1,2; 1:155 $ 1,3 а 1:60 х 1,2). Мы полагаем, что одним из возможных объяснений такого иммунологического ответа может быть конкуренция антигенов мезду оильнш антигеном - грунпосиецифическим А-ПС и слабым антигеном - ЛПС. Такое предположение базируется на более выраженной антигенной стимуляции и иммунологической активности у А-ПС по сравнению с группоепецифичеокими Ш других серогрупп менингококка (29, 95, 96, 97).

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан метод получения высокоочищенного иммунохимически однородного менингококкового ЛПС и на его основе сконструирован эритроцитарный ЛПС-диагностикум с четко выраженной видовой специфичностью. ЛШ-диагностикум предназначен для выявления ме-нингококковых антиэндотоксичвскйх антител и может быть использован как в научных исследованиях при изучении разнообразных

- 145 вопросов патогенеза и иммуногенеза менингококковой инфекции, так и в практических целях, в частности, при отборе сывороточного сырья с повышенным содержанием менингококковых ЛЩ-анти-тел для получения иммуноглобулинов направленного антиэндоток-сического действия. Показано, что наиболее перспективным препаратом такого типа являетея КИП - комплексный иммуноглобули-новый препарат, содержащий, помимо антител ig@-класса, антитела м-класса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бобылева, Галина Васильевна, Москва

1. Протективная активность плазмы доноров, иммунизированных гретой корпускулярной вакциной ИЗ Re -мутанта Salmonella minnesotp, / а.в.Аполлония, М.А.Крохина, В.ГЛиходед и др. //Журн. микробиол., эпидешол. и иммунобиол. 1985.1. Ш 6. С. II9-I2Q.

2. Эндотоксинсвязывающие системы крови / А.А.Аполлонин, М.Ю.Яковлев, А.А.Рудик, В.Г.Лиходед //Журн. микробиол., эпидешол. и иммунобиол. 1990. - $ II. - С. 100-106.

3. Ашшрин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях // Д.: Гос. изд-во мед. лит. -1962. 182 о.

4. Борисова И.В. Комплексные иммуноглобулиновые препараты // Биологические препараты для профилактики, терапии и диагностики инфекционных заболеваний: Сб. трудов ШЙИЭМ им.Г.Н.Габричевского. М., 1983. - С. ПЗ-ПЭ.

5. Комплексные иммуногдобулиновые препараты для перорального применения / И.В.Борисова, В.А.Алешкия, Н.В.Холчев и др. //

6. Иммунобиологические препараты: Сб. трудов ШИИЭМ ям.Г.Н.Габричевского. М., 1989. - С. 5-10.

7. Ьсесоюз. конф. (Новосибирск, 1990). М., 1990. - Т.2.- С. 1-2.

8. Грабар П., Буртэн П. Мммуноэлектрофоретический анализ. // М.: Ш1., 1963. 232 с.

9. Биологически активный комплекс компонентов клеточной стенки и.meningitidis /А.М.Грачева, А.А.Демина, Н.А.Семина, 0.В.Коновалова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуно-биол. 1978. - 16. - С. 138-139.

10. Дельвиг А.А., Бобылева Г.В. Иммуномодулирувдев действие липололисахарида Jeis&eria meningitidis серогруппы А в опытах на мышах./'// Тез. докл. Ш конф. молодых ученых Ин-та экспер. биологии АН Армянской ССР. Ереван, 1988. -С. 58. .

11. Протективная активность детоксицированного липополисахари-да И".meningitidis серогруппы А В опытах in vivo / А.А.Дельвиг, Л.Й.Краснопрошина, В.й.Кувакша и др. // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1989. - № 5. -С. 69-73.

12. Детерман Г. Гель-хроматография. // М.: Мир. 1970. -252 с.

13. Захарова И.Я., Носенко Л.М. Методы получения микробных полиоахаридов. / Киев, 1983. 263 с.

14. Каральник Б.Б. Эритроцитарные диагностикумы. М.: Медицина, 1976. - 164 о.

15. Кувакина В.И. Менингококковые полисахарвдные вакцины групп А и А+С: Дис. докт. биол. наук. М., 1989. -398 с.

16. Ввделение и характеристика специфического полисахарида менингококков группы В / В.И.Кувакина, А.П.Аллилуев, Н.И.Валериус и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и имму-нобиол. 1986. -19. - С. 3-7.

17. Усовершенствование технологии изготовления меяингококко-вых полисахаридных вакцин / В.И.Кувакина, й.В.Холчев, Ил.Гофман и др. // Иммунопрофилактика детских капельных и кишечных инфекций: Сб. трудов МНИЙЭМ им. Г.Н.Габричево-кого. М., 1987. - С. 79-88.

18. Кузин A.M., Тефен Н.В., Полякова О.Н. Методы получения полных антигенов из микробных клеток.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. I95I.-J6 9. - С. 15-20.

19. Левенсон В.И. Способ статистической обработки результатов титрования антител. / Современные аспекты иммунопрофилактики, эпидемиологии, диагностики и лечения брюшного тифа.

20. М., 1968-1969. T.XII. - С. 150-153.

21. Антитела к липополисахариду менингококка при разных формах менингококковой инфекции /.Ю.В.Мартынов, А.М.Грачева, Ю.Я.Венгеров и др. //Журн. микробиол., эпидемиол. и имму-нобиол. 1989. - № 5. - С. 55-60.

22. Матущенко А.А. Особенности течения эпидемического процесса при менингококковой инфекции ж город© и сельской местности: Автореф. дис. канд. мед. наук Л., 1979. - 18 с.

23. Эритроцитарные менингококковые диагностикумы серогрупп А и С. / А.И.Мишина, М.А.Смирнова-Мутушева, В.И.Кувашша и . др.// Специфическая диагностика. и профилактика. менингококковой инфекции: Сб. трудов Моск. ШИВС им. И.Ж.Мечникова. -М., 1977. С. 16-19.

24. Покровский В.И., Демина А.А. Менингококковая инфекция серогрушш В. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1987. № 5. - С. 36-40.

25. Покровский В.И., Фаворова JI.A., Костюкова Н.Н. Менингококковая инфекция, г- М.: Медицина, 1976. 275 с.

26. Протективная активность препаратов плазмы крови доноров с высоким титром естественных антител к Не -гликолипаду грамотрицательных бактерий / А.А.Рудик, Е.Й.Кропачева,

27. А.В.Аполлония и др. // Журн. микробиол.,, эпидемиол. и иммунобиол. 1988. -17.- С.60-63.

28. Методы получения кроличьих агглютинирующих и преципитирую-щих менингококковых сывороток / М.А.Смирнова-Мутушева,

29. А.И.Мишина, Л.И.Головина и др. // Специфическая диагностика и профилактика менингококковой инфекции: Сб. трудов Моск. НИИВС им. И.й.Мечникова. М., 1977. - С. 31-34.

30. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот //"Биохимия. 1958. -Вып. 23, Л 5. - С. 656-662.

31. Требования к менингококковой полисахарвдной вакцине (Дополнение 1980 г.) // Серия техн. докл. ВОЗ. 1983. - Л 658. -С. 174-184.

32. Экспериментальные исследования по получению специфических антименингококковых иммуноглобулиновых препаратов /

33. Л.М.Филиппова, Н.В.Холчев, И.В.Борисова и др. // Биологичеокиа препараты для профилактики, терапии и диагностики инфекционных заболеваний: Сб. трудов ШЙЙЭМ им. Г.Н.Габричевского. М., 1983. - С. IQ7-II2.

34. Яровая Л.М., Алешин В .А. Новые данные о химичеокой структуре липополисахаридов ж практические перспективы. // Журн. шкробиол., эпидашол. и ишунобиол. 1991. - № 3. - С. 73-78.

35. Anderses В*М. Disease ani. mortality caused by Neisserias memiiaigi-fei'cli®» Пае role: of endotoxim liberation as; a virulence factor.//J. Oslo City Hosp. 1983. - v.33.-p.37-68.

36. Andersen Б.М. Endotoxin release from, Neisseria meningitidis. //Scand. J. Infect. Bis. 1989. - Suppl.-N 64.-p.I-43.

37. Andersen B.M., Solberg 0. ТЬе endotoxin-liberating effect @£ antibiotic on meningococci im vitro.//Acta Pathol.Microbiol. Scand. (в),-1980.-v.88.-p.23I-23&.

38. Andersen. В.Ж*,. Solberg; 0. Endotoxin liberation associated with: growth, encapsulation and virulence of Neisseria me— ning itidi S:. //Scand. J. Inffeet;. DSL®. -1988 . -v .20 ,-N I. -p>.2I-iI.

39. Aplcella M.A. Immunological and biochemical studies of meningococcal C-poly saccharides Isolated by diethylaminoethyl chromatography. //Infect. Immun. -19 7'6. -v.I4.-N I .-p. 106-113.

40. SU Cfelllas Ж** ILoifoy R. Antl^ps^idomoMas; aearigin®sa ajotiivity of an Intravenious Igf pareparatiom in burned mice»//J.framna.— 23»~p.530-534 ►

42. Sodas K.&., Apieella'Ш.А» Selection and inmraaffi®;eh©mi©al analysis of 1 ipоpоlysaccharide mutants ®f leisseria gonor-r&ae ae » //Infe ct, Immun»-I988 .—v • 499^506;.

43. Eie use of ft^maMn-pre served er:fthro;cytes in enteral hemagglutination test./Jf.Feeley* 0»Sword, 5»lanclaxk^ EUPielett/,ft* Ште D.P. Hole of complement in eMatQini sboek.//Handbook

44. Glauert Q.M., Thornley M* Eke topography of bacterial cell

45. Ш+- Goldman. K.C., Lelve I» leterogenejcty of: antlgenie^side«chain iBBgtli fm liEspolysaccharide from IsGhffirl&hla eoli OIII and Salmonella typhimurium 1Я2.//Eur. J.Biochem.-I9B0.

46. Шф Gatschlich E.C. Proposal for specification for meningoxjoc-@al p@lysaccharide тао«4не,//та0» fech.»Rep:*Ser. BB/7%.12»

47. Human, immunity to: meningococcus. If.Immumogenicity of group A and group & meningococcal polysaccharides in human volumteers./l.C/.Gotschlich, J. Gold Schneider,, ffi.S.Artens-tei2ffi//j!.lxp).Med.«I96a.^w.I2;9.-K 6.-p.I36;7-I384.

48. Gotschllchi Е.СГ.,, ioldschneider J., Artensteln M.S. Human immunity to menissgoxsioceus. J.The effeet o£. immunization with.: meningococcal group С po lysaceiharide of the carrier state.//J.Exp.Med. —19.I29:.-jff 6.-p.I3B5-I395.

49. Greisman S.E.,, Johnston G.A. Failure of ant£sera to J5 and// E595 rough mutants to reduce endotoxic 1ethaiitу.//J*Jpx A Bi s .—1988.—v.I57»—p* 54?~б4» Ш

50. Griff is s J.M.L.>,; Bertram; 1.Л. A lipopolysaeeharide CLPS) antigen common to type II epidemic strains of neisseria memngi t id i s. //Abstr. Алл . ie e t. So ©. Mi crо b i о 19 -E2

51. Immune response ®£ infant® and ehildreit to disseminated i®*» feetioms witU neisseria me2iin'gitidis>./J.EIUb.&riffissSi B.L.Brandt, I.l.Brond et al.//J.Infeet.Bis.~I984.-v.I50.~- p>7I-79.

52. Mpopolysaccharide nomenolatmre past., present; and future./ P.J*, L.Leive, P.H.lakela et al.//J»BacterIol#—I9B€.-v»l66»«* pv&99~705.1091» Janda J., Work В» A colorlnretric estimation of Ilpopolysac-charides.//FEBS Left.~I97T.-v. I6.-N 4.-p.343-345.

53. Jaxrn B.„ Reski Ж., Jann X* Heterogeneity of lipopoly^aeeha-rides» Analiisis of polysaccharide chain lengths Bgr sodium dbdeeylsulfate-^olsracrylamMe gel eleetrophoresis.//lur.J. Bi®chem. -1975 v. 60.-p»239>*2:4i6:.

54. Structural studies om the hexose region of core in lipopoly— saccharides from Ehtero)bacteriaceae./P.4B, Jans son, A*A. Lind-berg, B.Xindberg, R.lollIn//Syir. J.Biochem*-I98I»-v.II5^p.571-577.

55. The R—type lipopolysaccharides of leisseria meningitidis./ H.J.Jennings, A.K.Bhattacharjee, L.Eenne et al*//Can.J. Bio chem.-1980 5®.-p.

56. She chemical, ©omposition and serological reactions of llpo— polysaccharides from serogroups А, В, X and Ж leisseria meningitidis./H.J.Jennings, G.B.Hawes,. G.A.Adams, C.P.Kenny// San.J.Biochem.-1973 •-«v.51.-1 I0»-p.I347KE352.

57. W Jennings H.J.:, Johnson E.G., Kenne L. The structure of Retype oligosaccharide core? obtained from some lipopolysaccharides of leisseria meningitidis.//Sarbohydr.Res»-I9$3*^»I£I#-

58. Murine Immune responses to Salmonella lipopolysaccharideregiom./Jlrillo' E., H.Ziyono, S.M.lIchalec et al.//In: Agar-wal M.K., Yoshida M.(eds). Immunopharmacology of Indotoxi—со sis .—Berlin, I984.-P. 93НШ •

59. Zar.ch Н», Gmeiner J., lixdorf K. Alteration of Immuniglobu-lln G su&class responses in mice- to lipopolysaccharide.// Inf e et. Immun . -1983. -v. 4.0. -p. 15 7-165 .

60. Kenne L., Lindberg B. Bacterial polysaccharides.//In: Aspi-nal G.0.(ed.). The Polysaccharides. Academic Press.-!ew-Tork-London.-I983.-p*3'97-403.

61. Monoclonal antibody identification, of shared lipopolysaeeha-ride epitopes of Neisseria meningitidis and E.lactamica/

62. Laurell G.B. Quantitative estimation of proteins; by electrophoresis in agarose gel containing antibodies»//Analyt.Bio-cheim»-I966 15»',4:5-52»

63. Lindberg A.A., Holme 1. Evaluation of seme extraction methods for preparation of bacterial lipopolysaccharides; for structural analysis //Acta Pathol.Microbiol.Scand.-19772:»-В80,1. N 5.-p.751-759:.

64. Protein measurement with Folin phenol reagent /O.H.Lowry,

65. H. J.Rosenbrough, A.L.Zarr, R.J.Rondall//J.Biol.C^em.-I96;I.-v.I93»-p.265-275.

66. Lipopolysaccharide of gram-negative bacteria /0.Luderitz,

67. A.Ireudenbergjf ©.G-alanos et al.//In: Razin S.S., Rotten S. (eds.) Current Topics in Membranes and Transport.-v.17.-1982•-p.79-151.

68. Lipid A: chemical structure and biological activity /O.Luderitz, C.Galanos, Y.lehmann et ai.//<T.Infect.Ms»~I973.«

69. Lugtenberg В., Yan Alphen L. Molecular architecture and functioning of outer membrane of Escherichia coli and other gram-negati ve bacteria //Biochim.Biophys.Acta.-198З.-v.737.~ p.51-115*

70. Immunization with rough mutants of Salmonella minnesota: protective activity of Ijp and IgG antibody to the b.595 (Re che-motype) mutant /W.R.McCabe,, A. J.DeMaria, H.Berberichj M.Johns/, J. Inf e ct.Dis.-I988 .-v. 158 .-p. 2:91-300.

71. IcSabe W.R., Ireger B.E., Johns; I. Type-spesific and cross-reactive antibodies; in gram-negative bacteremia //N.Eng.Med.-I972--V. 287.-P. 2:6l~26 7.

72. Hemodynamic patterns of meningococcal shock in children / J.-C.Mercier, F.Beaufils, J,-F.Hartmanny D.Azema//Crit. Care Med.—1988. -v.16.-p.2 7-33.

73. Mergenhagen S.E., Martin G.R., Schiffman E. Studies on an endotoxin of a group G Neisseria meningitidis//J.Immunol.-1963.-v.90.-p.312-317.

74. Moller &., Sjjoberg 0., Andersson J. Immunog&nity, tolerogenity and mit&genity of lipopolysaceharide //J.Infect.Dls.-Igy^.-v.128.-Suppl.-p.S2~56.

75. Morgan W.I.J. Studies in Immunochemistry. II. Isolation and properties of specific- antigenic substance from B.dysenteriae (Shiga) //Biochem.Jj.^I937.-^.3I.«p.2003^02I.

76. Morgan W.I.J., Partridge S.M. An examination of the O-anti-genic complex of Bact.typhosum //Br. J.Exp.Path.-1942.—v.23.-p.151-165.

77. Morrison D.C. Nonspecific interaction of bacterial lipopolysac charide s with membranes and membrane components //In: Berry L.J.(ed) Handbook of Endotoxin.-I985.^.33.-CIi.2.-p.37-5I

78. Morrison D.C., Byan J.X. Bacterial endotoxins and host immune responce //In: Dixon D.J., Kumbel H.J.(eds).Advances in immunology.-v.££.~3f.York.Academic; Press.-1979. .293b449>

79. Morrison B.C., Ulevitch. E.J. The effects of bacterial endotoxins on host mediation systems //Am.J.PathoI.-I977.-v. 93.-p.526-618.

80. Mfflilradt P.F., Golecki J.R. Asymmetrical distribution and artifactual reorientation of lipppolysaccloaxi.de in tbe outer membrane bilayer of Salmonella typhimurium //Eur.J.Bio chem.-19 T^-v . 5.1 v3A34352 •

81. Effect of heat and chemicals on erythroeyte-modifying antigenic, toxic and pyrogenie properties /E.Ueter, O.Westphal,, O.luderitz et aW/J'*lMrmio:k-I956*~v»76• 377«*3S6•

82. О• Eawotny A., lawoiny A. , Behling TI»M. The neglected problem of endotoxin heterogeneity //In: Agarwal M.U.(ed.) Bacterial Endotoxin and Host Response .-1980.-p. 3.—9»

83. Osborn M.J. Biosynthesis and assembly of lipopolysaccharide of outer membrane //In: Jnouye A.£ed.) Bacterial Outer Membranes: Biogenesis and I\mctiom*—1979»^ «15—34 •

84. Osborn M.J.,, Rothfield I.E. Biosynthesis of the: core region of lipopolysaccharide //In: Weinbaun G., ladis S., АД S.J.(eds.) MierabiaI.»Toxins.—1971»—v.4.-p.331^350

85. Patterson-Delafield J., Martinez R.J., Lehrer R.L. Microbicidal catlonic; proteins; in rabbit alveolar macrophages: a potential host defense mechanism //Infect.Immun.-1980.-* v.30 *-p.180-192.

86. Reed L.J., Muench H. A simple method for estimating endpoints^ Am. J. Hyg. -1938.—v. 27 .-p. 49Э-499.

87. Lipid A, the endotoxic ©enter of haerfeerial lipopoly saccharides. Relation of chemical structure to biological activity /E.T.RIetschel, H.Brade, L.Brade et al.//Prog.Clin.Biol. Res.-I987.-v.23I.-p.25-44.

88. Rietschel E.T., Galanos C. Lipid A antlserum-mediated protection against Hipopolysaccharide- and lipid A-induced fever and skin necrosis //Infect.Immun.-I977*,-i:v.I5.'irP.34-49.

89. Bacterial endotoxins: chemical structure, biological activity and role in septicaemia /Е.Т.Rietschel, U.Schade, M.Jensen е t al.//Scand.J.Infect.Bis.-1982.-v.31.-Suppl.).-p.8-21.

90. Analysis of primary structure of lipid A /E.T.Rietschel, Z.Sidorczyk, U.Zahringer et al.//In: Andersen L., TJnder F. Ceds.) Bacterial Lipopolysaccharides: Structure, Synthesis, Biological Activities.^1983.^.2:31.-p.195-218.

91. Rioux^DarricuIat F., Parant M., Chedid L. Prevention of endotoxin—induced abortion by treatment of mice with antisera //J.Infect. Dis.-1978.-v.I37.-p.7-13.

92. An epidemic due to sulphonamlde resistant group A meningococci in the Helsinki Area (Finland). Epidemiologicaland clinical observations /J.Salmi, O.Pettay, J.Simula et al.//Scand. J. Infect. Dis. -197®. 8;.-p. 249^-254.

93. Heterogeneity of molecular size and antigenic expression within lipopolysaccharides of individual strains of leisseria gonorrhoeae and leisseria meningitidis /H.Schneider, T.L.Hale, W.D.Zollinger et al.//Infect.Immun.-I984»-v> 45 .544—549.

94. Schellekens J.F.P., Yerhoef J. Pathogenesis of gram-negative bacterial infections //Update.—1988.-p.84^-89.

95. Scibienski R.J. Immunological properties of protein-lipo-polysacharide complexes. III.Role of carbohydrate in the LPS aduvant effect //Molec.Immun.-I98G.-v.I7.-p.EI-27.

96. Evaluation of a chromogenic method for endotoxin measurement/M.F.Scully, J.M. Newman,. S.E.Clark, V.Y.Kakkar // Tromb.Re s.-I980.-V.20.-p.263-270.

97. Siber G.R., Kania S.A., Warren M.S. Crass-reactivity of rabbit, antibodies to lipopolysaeeharides of Escherichia coli J5 and other' gram-negative bacteria //J.Inf eet.Bis.-1985 152. -p.954-964.

98. Sidorczyk 2., Zahringen U., Eietschel E.T. Chemical strucr-ture of the lipid A component of lipopolysacchari.de from Proteus murabilis Ke-mutant //Eur-. J.Bioeiiem.,-1983^-^.137.-N I»-p.I5-22.

99. Properties and activity of lipopolysaccharide-reeeptor from; human erythrocytes /G.F.Springer, J.C.Adue, A.Bezko-rovainy, B. Jirgensons- //Biochemistry.-I974.-V. 13.-р.1379^13Ш.

100. Strain S.M., Fesik S.W., Armitage J.M. Characterization of lipopolisaccharide from a heptoseless mutant of Escherichia eoli by carbon 13 nuclear magnetic resonance //J. Biochem.-1983.-v.258.-N 5.-p.2906-2910.

101. Antibiotic therapy, endotoxin consentratiom in cerebrospinal fluid and brain edema in experimental meningits In.! rabbits /M.G.Eauber, A.M.Shibl, C.J.Hackborn, J.I.Lar-riek //J. Infect,Dis.456-4^.

102. Protection against gram-negative bacteremia and endotoxemia with human monoclonal IgM antibodies /N.N.Teng, H.S.Kaplan, J.M.Hebert et al.//Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-I985.-v.82.-p.1790-1794.

103. Immunochemical studies of meningococcal M9®S lipopoly— saccharide /О.М. Tsai, L.F. Mocca, A.B. Earpas, C.E.Frasch// Fed. Proc.-I984.~v.43.-1 &.-p.I5©7-I572.

104. Faravdekar Y.S., Saslaw L.D. A sensitive method for the estimation of 2-deoxy sugars with use of malosomEaldehyde thiobarhituric; acid reaction //J. Biol. ©hem.-1953.-v.234*1. 1945-19 50.

105. Westphal 0., Jann K. Bacterial lipopolysaccharldes -extraction with phenol water and father application of the procedure // In: Whistler R.L. (ed.) Methods in carbohydrate chemistry»— 1965. -v . 5>. -p. 83-91 •

106. Immunologic response of man to group В meningococcal polysaccharides / F.A.Wyle, B.L.Artenstain, E.C^Brandt et al. //J. Inf ect.Dis. -1972i. -v. 126. -p. 514-521.

107. Yesmg b.S. Functional activity of monoclonal antibodies against lipopoly saccharide (LPS) antigens of grains-negative bacili //Clin.Res.-1984.-v.55.-p.l668-1673.

108. Ziegler E.J. Humor necrosis fastor in humans //И".Eng. J* led .-1988 .^r. 318 .-pi.I533-1535.

109. Treatment of Escherichia coli and Klebsiella bacteremia in agranulicytic animals withi antiserum to a UBP-gal epimerase-defieient mutant /1.J.Ziegler, H.Douglas,

110. J.E.Sherman // J.Immuno1.-19 73.-v.Ill.-p.433-438.

111. Prevention of lethal Pseudomonas bacteremia with epimera-se-deficient E.coli antiserum / E.J.Ziegler, J.A.McCutchan, H.Buglas, A.C.Braude //Trans.Assoc.Am. Physicians.—1975.-v.88.—p.IOI—108.

112. Treatment of gram-negative bacteremia and shock with human antiserum to a mutant Escherichia coli /B.J.Ziegler,

113. J.A.MeCutchan, J.Merer et al.//U.Ehgl<.J.Med.-I982.-v . 3.0 7 . -p . 1225—12 30.

114. Isolation and characterization of a native cell wall complex from Neisseria meningitidis /1.©.Zollinger, B.b.Eas-per, B.J.Veltri, M.g.Artenstein //Infect.Immun.-1972.-V.6.-U 5.-p.835-851.

Информация о работе

Бобылева, Галина Васильевна
кандидата биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.07

Диссертация

Липополисахарид менингококка серогруппы А - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно