Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пути оптимизации и прогнозирования процессов управляемого культивирования Neisseria meningitidis серогруппы В

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Пути оптимизации и прогнозирования процессов управляемого культивирования Neisseria meningitidis серогруппы В"

о

, ,---РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК имени И. И. Мечникова

На правах рукописи

САРАЕВА Людмила Викторовна

ПУТИ ОПТИМИЗАЦИИ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПРОЦЕССОВ УПРАВЛЯЕМОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ Е

03.00.07-микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Мэсква, 1994

Работа выполнена в научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И. Л Мечникова РАМЕ

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ -

доктор биологических наук, профессор И. А. Баснакьян.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ -

академик Российской АМН, доктор медицинских наук,профессор А. А. Воробьев,

доктор биологических наук Е А. Мельникова.

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ, даюшэе отзыв о научно-практической значимости диссертации - Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится " 24" марта 1994г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 001.38.01 при научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН по адресу: 103064, Мэсква, переулок Мечникова, дом 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова.

Автореферат разослан " 20" Ф9ВРадя_ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Н. Г. Кудрявцева

- 1 -

Обшая характеристика работа Актуальность проблемы. В настоящее время в ряде стран Европы, Америки и Африки все большую роль в заболеваемости т-нингококковой инфекцией играет менингококк серогруппы В (Гаранин Б. А. ,1991; Чернышева Т. Ф. с соавт., 1991; Frasch С. Е. , 1987). Поэтому проблема профилактики и диагностики этого заболевания актуальна Соответственно необходимы постоянное ' совершенствование уяе-суврстадпащи и разработку *V:~'JT„ ратов для профилактики и диагностики менингококковой инфекции (Van der Ley P. et al. ,1992). Понятно, что для этого требуется достаточно большое количество биомассы, содержащей протективные антигены. Ее модно получить, с одной стороны, используя высокопродуктивные процессы культивирования микроорганизмов, подобранные эмпирически, а с другой - применяя высокопродуктивные процессы, найденные на основе математических (аналитических) моделей и/или графических построений (Васнакьян И. А. ,1972 ,1992),

Моделирование процесса культивирования микроорганизмов значительно облегчает задачу исследования, сокращая сроки освоения новых процессов и позволяя применять для этой цели методы прогнозирования (Запорожцев Л К, 1979; Кузнецова Т. Я с соавт., 1991-, Brat che 11 N. et al. 1990). Математическое описание роста микроорганизмов достаточно сложно,поскольку, как правило, рассматриваются процессы выращивания неселекциони-рованных штаммов в полноценных средах, содержащих природное сырье и в реакторах устаревших конструкций.

Любая аналитическая модель микробного роста имеет графическое выражение. которое облегчав-" задачу прогнозирования,

но не решает проблемы сложности аналитического подхода. Поз-тому целесообразно проверить возможность графического моделирования оптимизированных периодичес^х процессов культивирования микроорганизмов и на его основе прогнозировать более совершенные процессу, исключив необходимость составления уравнений, описывающих жизнедеятельность микроорганизмов.

Для этой цели наиболее подходят процессы культивирования медицинских микроорганизмов, специфика осуществления которых состоит в соблюдении жестких режимных требований к чистоте культуры, поддержанию штамма, сбалансированности питательной среды, стабильности условий выращивания и стандартности получаемых препаратов. К таким микроорганизмам можно отнести N. meningitidis серогруппы Е

Поэтому целью настоящей работы являются оптимизация, графическое моделирование и прогнозирование процессов управляемого культивирования N. meningitidis серогруппы В для уве-лиения их продуктивности по выходу биомассы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи :

1. разработать и осуществить продленный периодический процесс культивирования с подпиткой углеводным субстратом;

2. разработать и осуществить длительные управляемые процессы культивирования в синтетической питательной среде с увеличенным содержанием глюкозы 5,0 и 10,0 г/л /;

3. построить графические модели оптимизированных периодических процессов культивирования;

4. осуществить графическое прогнозирование непрерывно-проточных и непрерывно-синхронных процессов культивирования по графическим моделям;

5. проверить соответствие экспериментальных и прогнозируемых длительных управляемых процессов культивирования.

Научная новизна выполненной работы. Впервые на модели N. meningitidis серогруппы В штамма N 125 разработан продленный периодический с подпиткой глюкозой процесс культивирования в синтетической питательной среде и определены оптимальные условия для его осуществления. Также впервые для данного микроорганизма проведено длительное управляемое (сливно-доливное и непрерывно-проточное) культивирование в синтетической питательной среде с исходно высоким содержанием глюкоза

Установлено влияние высоких концентраций углеводного субстрата (5,0 г/л и 10,0 г/л) на метаболизм менингококков серогруппы В в условиях лимита растворенного в среде кислорода. Показано, что выход биомассы и основных менингококко-вых антигенов возрастает как при дробном добавлении глюкозы в среду культивирования, так и при исходном высоком ее содержании в среде.

Пэказана возможность и целесообразность графического мо-

I

делирования оптимизированных периодических процессов культивирования N. meningitidis серогруппы В штамма N 125. Разработан алгоритм графического прогнозирования непрерывно-син- .. хронных и непрерывно-проточных процессов культивирования менингококков серогруппы В. Выявлено соответствие экперимен-тальных данных прогнозируемым значениям, что подтверждает правомерность такого метода моделирования и прогнозирования на его основе.

- 4 -

Практическое значение выполненной работы: Показано, что разработанные процессы культивирования Neissirla meningitidis серогрулпы В являются более продуктивными по выходу'биомассы и основных антигенов, чем контрольный периодический процесс. Метод графического моделирования оптимизированного периодического процесса и прогнозирования на его основе длительных управляемых процессов культивирования также позволит повысить продуктивность работы эа счет экономии времени и средств на осуществление неадекватных поставленной цели процессов.

Биомасса N. meningitidis серогрулпы В, полученная в проанализированных процессах культивирования, была использована для разработки и внедрения в производство диагностикума ме-нингококкового группы В эритроцитарного, формалинизированно-го, жидкого. Это подтверждено "Актом внедрения мероприятия по плану новой техники предприятия НИИЭМ им. Габричевского : и Освоение и внедрение нового препарата - диагностикума ме-нингококкового группы В эритроцитарного, формалинизированного, жидкого" от 09. 02.1989г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизация процессов управляемого культивирования N. meningitidis серогрулпы В штамма N 125 путем осуществления высокопродуктивных по выходу биомассы и антигенов процессов: продленного периодического с подпиткой глюкозой, сливно-до-ливного и непрерывно-проточного в синтетической питательной среде с исходно высоким содержанием глюкозы.

2, Алгоритм графического моделирования оптимизированного пе-

- б -

риодического процесса культивирования N. meningitidis серо-групы В штамма N 125 и прогнозирования на его основе длительных управляемых процессов выращивания.

Апробация работы: Диссертация апробирована на научной конференции отдела условно-патогенных микроорганизмов НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН 04.11.1993г.

Публикации: По теме диссертации опубликовано семь печатных работ (список приведен в конце реферата).

Структура работы: Диссертация состоит из введения, трех глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения, состоящего из 26 таблиц на 68 страницах. Диссертация иллюстрирована 19 рисунками и 16 таблицами. В работе использовано 60 отечественных и 104 иностранных источника Содержание диссертации.

1. Материалы и методы.

Объекты исследований. В работе использовали штаммы Neisseria meningitidis серогруппы В N 126 и N 150,селекционированные в лаборатории моделирования процессов культивирования микроорганизмов НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН и депонированные в коллекцию культур патогенных бактерий ГИСК им. Л. А. Та-расевича..

Культивирование менингококка: Управляемое культивирование менингококка проводили в синтетической питательной среде ( Карабак В. И., 1985г.) и в той же среде, но с более высоким содержанием в ней глюкозы: 5,0 г/л и 10,0 г/л в ферментерах " Анкум - 2Ы " ( Пущино ) и "Marubishi " ( Япония ), которые обеспечивали выращивание микроорганизмов в чистой культуре и оснащены системами для стерильного отбора проб, подачи пита-

тельной среды, автоматического контроля и управления темпе-

соде ожанкем ратурой, рН.Урабтворенного в среде кислорода.

Проводили глубинное периодическое, непрерывно-синхронное (сливно-доливное) и непрерывно-проточное культивирование менингококков.

Оптическую плотность культуры определяли с помощью фото-электроколориметра - нефелометра 56М в кювете с рабочим расстоянием между гранями 1 см при длине волны А - 540 t 10 нм.

Методы биохимичеких анализов.

Количество белка определяли по методу Lovry О. Н. (1951), углеводов - Dubois U. (1956); аминного азота - Muting 0. « Kaizer Е. (1963); кетодезоксиоктоновых кислот (КДО) - Апа-ckerR.L (1966).

Серологический метод. Реакция торможения пассивной гемаг-глютинации (РТПГА) быча использована для определения содержания группоспецифического В-полисахарида (В-1С).

Определение расчетных показателей роста. Максимальную удельную скорость роста популяции определяли по формуле Иерусалимского Е Д. ( 1963 ), время генерации, продуктивность процессов по выходу биомассы рассчитывали по формулам Перт С. (1978).

Статистическую обработку результатов проводили по форму-приведенным в монографии Ашмарина И. П. и Воробьева А. А. (1962).

ОВЬЕМ РАБОТЫ.

Нами было осуществлено и проанализировано более 40 процессов культивирования Neisseria meningitidis серогруппы В в различных вариантах синтетической питательной среды; осуществлено более 300 биохимических определений основных анти-

генов менингококка и компонентов питательной среды, построено две графические модели оптимизированного периодического процесса культивирования, по 16 длительным управляемым процессам культивирования проверено соответствие полученных экспериментальных данных осуществленному графическому прогнозу.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Первым шагом в проведении исследований явилось изучение влияния различных концентраций глюкозы на рос? и развитие менингококков серогруппы В в синтетической питательной среде в ферментере при лимите кислорода Для этого было приготовлено 4 варианта среды, отличающиеся содержанием глюкозы -0,0 г/л; 1,6+0,3 г/л; 5,0±0,3 Г/Л; 10,0±0,3 г/л.

Результатами наших исследований показано повышение выхода биомассы в 2-3 раза при периодическом культивировании менингококка в среде с исходной концентрацией глюкозы 1,6+0,3 г/л в сравнении с выходом микробной массы при культивировании в синтетической питательной среде без глюкозы (табл.1). Максимальная удельная скорость роста при этом также повышалась вдвое.'

В ходе исследования нами получены результаты, показывающие возрастание в клетках количества В-ПС в 9-10 раз при культивировании в среде, содержащей 1,6+0,3 г/л глюкозы, по сравнению с аналогичным показателем при выращивании менингококка в среде без глюкозы (см. табл. 1). Дальнейшее повышение концентрации глюкозы в среде не приводило к значительному увеличению показателей роста Количество же В-ПС в клетках возрастало в 2 раза с увеличением содержания глюкозы в среде от 1,6+0,3 до 10,0+0,3 г/л. Эти результаты, свидетельствующие

Показатели роста биомассы и параметры процесса выращивания N. meningitidis серогрулпы В штаммов N 125, N150 в условиях периодического глубинного культивирования в ферментере при лимите кислорода в синтетической питательной среде с различной исходной концентрацией глюкозы .

Таблица N 1 . '

N штамма Исходная кон-.центрация глюкозы в среде Максимальная оптическая плотность биомассы Максимальная удельная скорость роста Минимальное время генерации рН культуры в конце процесса Содержание В-полисахарида в клетках

So, г/л Lg 100 Et ji max, ч-1 g min, ч РН мкг/ед Et

150 без глюкозы 1,05 + 0,05 0,22 + 0,02 3,15 . 7,4 + 0,1 1.0 ± 0,1

150 1.6 + 0,3 2,95 + 0,05 0,44 + 0,04 1,58 6,6 ± 0,1 9,25 + 0,05

125 1,6 + 0,3 2,10 + 0,05 0,35+ 0,03 2,00 1 6,5 ± 0,1 10,60 ± 0,05

125 3,0 ± 0,3 2,36 ± 0,05 0,32 ± 0,04 2,16 6,8 ± 0,1 —

125 10,0 + 0,3 2,23 + 0,05 0,35 ± 0,03 1,98 6,8 ± 0,1 21,7 ± 0,05

о положительном влиянии глюкозы на кинетику роста и синтез В-ПС, согласуются с литературными данными (Т^еБша, 1983г.). полученными для менингококков других серогрупп - А и С.

На основе полученных данных о положительном влиянии глюкозы на выход биомассы и синтез антигенов нами разработан и изучен продленный периодический с подпиткой глюкозой процесс культивирования менингококка серогруппы В в синтетической среде при лимите кислорода Оптимальными ' для роста менингококка значениями рН в данном процессе явились величины 6,9 -7,2; процент растворенного в среде кислорода 0-1. Оптимальные подпитывающие дозы глюкозы были: в начале процесса - 1,0 г/л, а затем с увеличением числа клеток - 1,5 г/л. Дробная подача глюкозы позволила повысить выход биомассы в 2 раза по сравнению с контрольным периодическим процессом. Анализ процесса с подпиткой менингококков серогруппы В выявил увеличение выхода белка в 4,6 раза по сравнению с контрольным периодическим процессом в синтетической среде без подпитки глюкозой.

Результаты,полученные нами на модели менингококков серогруппы В, еще раз доказывают возможность увеличения выхода биомассы и антигенов при осуществлении дробного добавления субстрата в процессе культивирования.

Разработанный продленный периодический процесс в синтетической среде е подпиткой глюкозой обладает недостатками, присущими любому периодическому процессу. Скорость роста микроорганизмом и многие свойства биомассы изменяются в ходе процесса. Однако, разработанный нами процесс показал принципиальную возможность не только выращивания менингококка в среде с высоким содержанием углеводного субстрата, но и по-

лучения в 2 раза большего выхода биомассы. Поэтому он послужил основой дальнейшего усовершенствования процессов культивирования, направленного на осуществление длительных упра-

I

вляеыых процессов в синтетической среде с высоким содержанием углеводного субстрата.

При разработке длительных управляемых процессов выращивания в интересующих нас средах мы придерживались принципа последовательности сиены условий культивирования. При осуществлении сливно-доливных процессов менингококк выращивали сначала в течение 48 чдсов в синтетической среде, содержащей глюкозу в концентрации 1,6+0,3 г/л;и затем еще 19 часов в питательной среде с большей концентрацией глюкозы (10,0+0,3 г/л). Т.к. нам известно, что глвкоэа менингококками потребляется преимущественно при лимите кислорода, то и это условие культивирования мы изменяли последовательно: первые 33 часа выращивание вели при избытке кислорода, а ватем снизили его до значений,близких к нулевым.

В результате показано, что выход биомассы менингококка в каждом цикле сливно-доливного процесса возрастает с повышением содержания глюкозы, в среде и снижением процентного содержания растворенного в среде кислорода. Это объясняется, тем, что в подобранных нами условиях культивирования менингококк меняет свой метаболизм, т. е. меняет ЙВои питательные потребности в еторону преимущественного потребления глюкозы, которая становится лимитирующим рост фактором. *

Аналогичная закономерность в отношении выхода биомассы наблюдается и в другом типе длительного управляемого культи-рования -непрерывно-проточном в трех вариантах синтетической питательной среды, различающихся по содержанию глюкозы, в

условиях лимита кислорода. Как видно из рис, 1, вначале культивирование осуществляли в среде с концентрацией глюкозы 1,0 ¿0.3 г/л и вели процесс 14.5 часов. Затем заменяли бутцлъ со средой, содержащей глюкозу в концентрацией 1,6±0,3г/л, на бутыль со средой, содержащей глюкозу в концентрации 5.010,3 г/л. В течение последующих 19 часов вели непрерывно-проточ^ цоэ культивирование в вышеназванных условиях. Выраядоание в. синтетической среде с 10,0±0,3 г/л глюкозы длилось от 33.5 часов до 50 часов (см. рис. 1). При атом скорость роста микроорганизмов, равная скорости разбавления/ по ходу процесса

* * 1

выращивания изменялась незначительно: от 0,18±0,05 ч в среде, содержащей глюкозу в концентрации 1.610,3 г/л,до 0,1б±0,06 ч. з среде с глюкозой в концентрации 10.0+0,3 г/л (табл.2). В данном процессе найлвдалось увеличение концентрации биошссы от 1,5810,06 ед. ЕЪ при непрерывно-проточном культивирования с обычным содержанием глюкозы до 2,17Ю,05 ед. ЕЬ при непрерывно-проточном выращивании в среде, содержащей 10,010,3 г/л глюкозы ( табл. 2). Нам представляется, что причины повыяю-яия выхода биомассы те дв, что и в случае сливно-додивного выращивания.

При сравнительном анализе накопления антигенов е осупззс-твленноы процессе культивирования менингококков серогруппы 9 на основании 'полученных данных', мояио говорить о тенденции ц: увеличению содержания В:Ш в белка в ■ цельной культуре щад повышении концентрации,глюкозы в среде.(см. табл. 2). Количество КДО в;дельной культуре таклэ • возрастало с увеличениям, содержания глшозы в среде от 30,2812,31 'до 61, 7618,02 Ш»/ т (см.табл.'2), ЭДи данные' сбглаеукяся с рс^уйьтатьии, щзду' «енньши Стукаловой Е & (ЮбЙг.) выкбда рчвд^г

Рис. i . Рост биомассы N. meningitidis серогруппы В штамма N 125 в условиях непрерывно-проточного культивирования в ферментере при лимите кислорода в синтетической питательной среде с различной исходной концентрацией глюкозы:

от 0 до 14,5 ч. роста - концентрация глюкозы в среде 1,6 г/л; от 14,5 до 33,5 ч. роста - концентрация глюкозы в среде 5,0 г/л; от 33,5 до 50 ч. роста - концентрация глюкозы в среде 10,0 г/л; По оси абсцисс : t - продолжительность культивирования (ч.); по оси ординат - концентрация биомассы з единицах экстинкции (Et). г - момент пуска потока среды, W- смена бутыли со средой, содержащей глюкозу в Солее высокой концентрации.

Таблица N 2.

Влияние глшозы на показатели роста, выход биомассы N. meningitidis серогруппы В штамма N 125, ее химический состав в условиях непрерывно-проточного культивирования в ферментере при лимите кислорода в синтетической питательной среде .

N П/П Исходная концентрация глхко-зы в среде Концентрация биомассы Удельная скорость роста -скорость разбавления Время генерации В- полисахарид в цельной культуре Белок в цельной культуре КДО в цельной культуре

So, г/л ед. Et JJ - D.4-1 g . ч мкг /мл мкг/мл мкг/мл

1 1,6 + 0,3 1,58 ± 0,06 0,18 i 0,05 3,87 56,7 238,8±20,0 30,28+2,31

2 5,0 ± 0,3 1,70 ± 0,03 0,17 ± 0,05 4,24 65,0 271,5±16,0 32,05±10,14

3 10,0 ± 0,3 2,17 ± 0,05 0,15 ± 0,06 4,70 ' 111,4 - 51,76±8,02

ного липополисахарида менингококков серогруппы Е

При использовании управляемого культивирования менингококков серогруппы В в синтетической среде с высоким содержанием глюкозы нами выявлены новые закономерности в потреблении углеводного и азотного субстратов. Как было установлено ранее ( Коленко В. М. 1990г.), при выращивании менингококков серогруппы В в синтетической питательной среде, содержащей глюкозу в концентрации 1,б±0,3 г/л, в условиях лимита кислорода углеводы потребляются на 90-100 %. Эта закономерность нами подтвердилась в тех же условиях культивирования, а при увеличении концентрации глюкозы в среде до 5,0+0,3 г/л ее потребление снижалось до 76%. Дальнейшее повышение содержания глюкозы в среде до 10,0+0,3 г/л приводило к тому, что ее потребление снижалось до 40%. При этом потребление менингококками органического азота увеличивалось незначительно.

Следующей задачей диссертационной работы было сравнение продуктивности разработанных процессов культивирования. Результатами исследований установлено, что при периодическом ■культивировании наблюдается увеличение продуктивности по выходу биомассы в процессах с подпиткой и при повышенном со' держании глюкозы в среде по сравнению с контрольным периодическим процессом в среде, содержащей глюкозу в концентрации 1.6+0,3 г/л. В длительных управляемых процессах также отмечается значимое повышение продуктивности при использовании высоких концентраций углеводного субстрата. Так, продуктивность по выходу биомассы за цикл слива-долива в среде с концентрацией глюкозы 10,0+0,3 г/л составило 1,07±0,12 млрд/мл-ч,

а в среде с концентрацией глюкозы 1,6+0,3 г/л - 0,68+ 0,29 млрд/мл ч.

- 15 -

Сравнение продуктивности по выходу В-ГО показало, что управляемые сливно-доливные и непрерывные процессы культивирования являются более высокопродуктивными по сравнению с периодическими при прочих равных условиях: содержании глюкозы в среде 10,0+0,3 г/л и растворенного в среде кислорода близком к нулевым. Так, продуктивность по выходу В-ГО периодического процесса составила 7,0 мкг/мл ч, сливно-доливного -11,8 мкг/мл ч, а непрерывно-проточного - 16,5 мкг/мл ч.

Эти результаты подтверждают, что' длительное управляемое культивирование в синтетической питательной среде, в том числе с исходно высоким содержанием глюкозы, является более прогрессивным по сравнению с продленным периодическим процессом. Однако, их осуществление требует много времени и материальных затрат. Поэтому более рациональным в данной ситуации было воспользоваться одним из методов моделирования й прогнозирования - графическим.

Построение графической модели оптимизированного периодического процесса культивирования мы проводили в соответствии с составленным нами алгоритмом, включающим следующие этапы:

1.проведение периодических процессов культивирования;

2. выбор оптимизированных процессов,т. е. процессов с короткой лаг-фазой, длительной экспоненциальной фазой, высокой удельной скоростью роста, высокой концентрацией биомассы;

3. систематизация сведений о росте биомассы по часам в выбранных процессах в виде таблиц;

4. расчет средних арифметических значений концентрации биомассы для каждого часа роста микроорганизмов;

5. построение графической модели оптимизированного периодического процесса по рассчитанным значениям.

- 16 -

Последовательное осуществление пяти описанных шагов (этапов) алгоритма моделирования приводит к построению графической модели оптимизированного периодического процесса культивирования исследуемых микроорганизмов. Для нашей графической модели значение концентрации биомассы для каждого часа роста определялось как среднее арифметическое по 9 типичным оптимизированным периодическим процессам. Поэтому графическая модель оптимизированного периодического процесса культивирования N. meningitidis серогруппы В представляет собой идеализированную кривую, отражающую зависимость накопления биомассы от времени культивирования от лаг-фазы до стационарной фазы роста. Как видно из рис. 2, нами было создано две графические модели для процессов культивирования, осуществляемых в питательных средах, содержащих различные источники органического азота (глутамат натрия и глутамино-вая кислота). Нам представлялось интересным выяснить - есть ли значимые различия в динамике роста микроорганизмов в зависимости от источника органического азота. Статистически значимой разницы между ними не выявлено. Поэтому в дальнейших исследованиях мы использовали модель, полученную для периодических процессов, осуществленных в синтетической питательной среде с глутаматом натрия (см. рис. 2а).

На основе построенной модели мы осуществили графическое прогнозирование непрерывно-проточных и непрерывно-синхронных процессов культивирования менингококков серогруппы Е При графическом прогнозировании непрерывно-синхронных процессов мы основывались на знании технологии сливно-доливного, а именно непрерывно-синхронного культивирования, которая сос-

Рис. 2 . Графические модели оптимизированного периодического процесса культивирования N. meningitidis серогруппы В штамма N 125 в ферментере в синтетической питательной среде; а - с глутаматом натрия; О - с глутаминовой кислотой. По осям абсцисс: t - продолжительность культивирования (ч), по осям ординат: Lg 100 Et - концентрация биомассы в логарифмах оптической плотности Л - лаг-фаза;

Э - экспоненциальная фаза; 3 - фаза замедления ско'рости роста.

таит в следуодем. В конце вкспоненциалькой фазы роста сливается половина имеющейся культуры и осуществляется долив до исходного офъема свежей питательной среды. Тем самым предполагается осуществление синхронизации деления культуры менингококков, что должно привести к удвоению концентрации биомассы со скоростью, равной серости ее роста в экспоненциальной фазе. Слив-долив осуществляют черев каждые два часа. т. е.через промежутки времени, соответствующие по продолжительности времени генерации менингококков.

Алгоритм графического прогнозирования непрерывно-синхронных процессов культивирования N. тэмп^икИз серогруппы В итамма N 126 на основе графической модели оптимизированного периодического процесса культивирования состоит в следующем (см. рис. 3);

1. нахождение на графической модели 'точки, соответствующей

концу экспоненциальной фазы роста; £.проведение иа найденной точки перпендикуляра на ось абсцисс; .

3. нахождение середины полученного отрезка прямой-, нроведещш двух линий, параллельных оси абсцисс черев; а) *;рчку модели, соответствующую концу экспоненциальной фазы роста; б) черев середину построенного перпендикуляра иа ос?» абсцисс;

Обозначение ца до луча иных параллельных, линиях отрезков, оо-ОтьетствУЗДос прамавут^сам времени, равным продолжительности генерация иоддадуемых бактерий прр их, , культивировании р '^даукааашгтьрс урдовия?; ; 6.-соединение найденных точек пунктирными линиями, парадлель-рь«и оой ординат;

Рис. 3 . Графическая модель оптимизированного периодического процесса культивирования N. menin?itidis серогруды В штамма N 125 в ферментере в синтетической питательной среде с глу-таматом натрия - сплошная линия от 0 до 6 ч. От 6 ч. й далее -сплошные и пунктирные линии - прогнозированный режим непрерывно-синхронного культивирования, х.о - экспериментальные значения концентрации биомассы по данным контрольных опытов. По оси абсцисс: t- продолжительность культивирования (ч.), по оси ординат: концентрация биомассы в единицах экстинкции (Et). .-'■■•■'■■' '

7. проведение через найденные точки сплошных линий, эквидистантных модельной кривой накопления биомассы в периодическом процессе.

Таким образом, алгоритм графического прогнозирования непрерывно-синхронных процессов выращивания включает 7 последовательных шагов, и их выполнение должно привести к построению прогнозированного графика данного типа процесса культивирования.

Насколько правомерно проведение прогнозирования таким способом, показала проверка соответствия имеющихся экспериментальных данных осуществленному графическому прогнозу. Она состояла в следующем: на прогнозированный график сливно-до-ливного процесса культивирования наносили экспериментальные значения оптической плотности по данным контрольных опытов. Из рис. 3 видно, что точки лежат вблизи прогнозируемых линий. Это свидетельствует о соответствии экспериментальных данных прогнозируемым. Тем самым подтверждается правомочность такого метода моделирования и прогнозирования на его основе.

Следующей задачей работы было проведение графического прогнозирования непрерывно-проточных процессов культивирования менингококков серогруппы Е Его осуществляли на основе фазы замедления скорости роста по модельной кривой.

Последовательность действий может быть объединена в алгоритм графического прогнозирования непрерывно-проточного культивирования по имеющейся графической модели оптимизированного периодического выращивания N. meningitidis серогруппы В. Они состояли в следующем:

1. обозначение на модельной кривой участка, соответствующего фаге замедления скорости роста микроорганизмов;

2. разделение найденного участка кривой на несколько равных участков (в нашем случае 5);

3. определение расчетным путем удельных скоростей роста биомассы в данной фазе для каждого участка кривой;

4. построение по полученным результатам расчета кривой, отражавшей зависимость концентрации биомассы микроорганизмов в фазе замедления скорости роста от удельной скорости роста, равной скорости разбавления, в установившемся режиме непрерывно-проточного культивирования.

Таким образом, алгоритм графического прогнозирования установившихся режимов непрерывно-проточных процессов культивирования исследуемого нами микроорганизма, включает 4 шага. Их последовательное исполнение позволит нам прогнозировать установившиеся режимы непрерывно-проточного выращивания менингококков серогруппы В штамма N126 при различных скоро-' стях разбавления.

Рассмотрим описанный алгоритм графического прогнозирования на конкретном примере, который выявит соответствие экспериментальных данных осуществленному графическому прогнозу.

Графический прогноз непрерывно-проточного культивирования выглядит как прямая линия, проведенная параллельно оси абсцисс из определяемой по модели точки в фазе замедления скорости роста. Как показано на рис. 4, экспериментальные значения, полученные в контрольных опытах, расположены вблизи прогнозируемой прямой.

Действительные значения исследуемой величины концентрации биомассы с вероятностью 997. находятся в интервале 2,137+ 0,029, т. е. от 2,108 до 2,166 (ЬдгЮО ЕЬ). Прогнозируемое значение концентрации биомассы (2,109 1^100 ЕУ находится в

1,2О г 1 6 в 10 12 V* ']28 30 32 35 38' кО к2 кк кб кв' 50 52 5к

Рис. к . Графическая модель оптимизированного периодического процесса культивирования N. тетпгШсИз серогруппы В пггамма N 125 в ферментере в синтетической питательной среде с глутаминовой кислотой -сплошная линия - от О до 6 г Прямая, параллельная оси абсцисс - прогнозированный режим непрерывно-проточного культивирования, х - экспериментальные значения концентрации биомассы по данным контрольного опыта от 19-22.06.91 г. ( в среде с глутаминовой кислотой, р02- 02, ¿1-0-0,138 ч-1 ). По оси абсцисс: t - продолжительность культивирования ( ч.), по оси ординат концентрация биомассы в логарифмах оптической плотности ( Цг 100 ЕЬ

пределах найденных доверительных интервалов. Это подтверждает соответствие экспериментальных данных прогнозируемым.

Таким образом,на основании проведенного исследования были сформулированы алгоритм графического моделирования оптимизированного периодического процесса культивирования N. meningitidis серогруппы В штамма N125 и алгоритмы графического прогнозирования непрерывно-синхронных и непрерывно-проточных процессов вырапвшания данных микроорганизмов по имеющейся модели.

Проверка соответствия экспериментальных данных прогнозируемым включала:

1. осуществление проверочных процессов выращивания данных микроорганизмов;

2.построение прогнозированного графика для того или иного избранного типа процесса выращивания и режима его осуществления;

3. нанесение экспериментальных данных на прогнозируемый график.

Вышеизложенный алгоритм графического моделирования и прогнозирования на его основе повышает продуктивность управляемых процессов культивирования за счет экономии времени и средств, т. к. позволяет в соответствии с поставленной целью заранее выбрать тип процесса культивирования, рассчитать концентрацию биомассы, длительность процесса, требуемое количество питательной среды и т. д.

Мы считаем, что использованные подходы и Алгоритмы моделирования и прогнозирования, разработанные в диссертационной работе, могут быть полезными при изучении длительных управляемых процессов культивирования других селекционированных

шташов бактерий при условии их выращивания в синтетических средах с использованием высокотехнологичного оборудования. Проверка этого предположения может послужить темой отдельного исследования.

Выводы:

1. Определены пути оптимизации процессов культивирования N. шшпг1и<И8 серогруппы В, которые направлены на повышение их продуктивности по выходу биомассы. Они заключаются в осуществлении новых для менингококка высокопродуктивных процессов:

а) продленного периодического с подпиткой глюкозой; О) длительных управляемых процессов с увеличенным содержанием глюкоеы в среде;

2. Составлены алгоритмы: 1) графического моделирования оптимизированного периодического процесса культивирования менингококков серогруппы В ; 2) прогнозирования длительных управляемых процессов культивирования на основе графической модели; 3) проверки соответствия экспериментальных данных осуществленному графическому прогнозу.

3. Построены две графические модели оптимизированного периодического процесса культивирования менингококка в синтетической питательной среде и на их основе осуществлен графический прогноз:

- непрерывно-синхронных процессов, воепроизводящих фазу акс-поненциального роста;

- непрерывно-проточных процессов, воспроизводящих фазу замедления скорости роста. ,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Стабилизация культур менингококков, выращиваемых в ферментере // Тезисы докл. Всесоювп. конф. "Ыенингококковая инфекция и гнойные менингиты", 24-25 сент. 1086 г., Архангельск,- с. 64-66 (соавт.: Е Ы. Боровкова, И. А. Баснакьян, Е Е Алексахина).

2. Приготовление гемосенситина менингококка группы В с использованием непрерывно-синхронного процесса культивирования вггамма-продуцента // В сб.: Вопросы физиологии,метаболизма и идентификации микроорганизмов / Ы. -1987.-е. 47-50 (соавт.Н.ЕКостикова, И.А.Баснакьян,JLЕБагирова, Т.А.Артемьева, a U. Боровкова).

3. Полисахарид - белковые комплексы, выделенные из равных штаммов N. meningitidis серогруппы В //ЮВИ-1988.-N2. -с. 2041 / соавт.: Л. Д Сивцева, & А. Мзльникова, КIL Звенигородская, Л. А. Левина.

4. Антигенная активность корпускулярной менингококковой се-рогруппы В вакцины при пероральной иммунизации животных // В сб. трудов VI Всероссийского съезда МЭП.-М. -1991.-т. 2.-с. 160-161 / соавт.: Е Е Алексахина, И. А. Баснакьян, В. М. Боровкова, Е Е Стукалова, Е И. Карабак.

5. Разработка и изучение периодического и многоциклического культивирования с подпиткой глюкозой Neisseria meningitidis серогруппы В // НМЭИ-1992. -N2. -с. 19-22 / соавт.: Е Е Алексахина. И. А. Баснакьян, Е Е Стукалова.

6. Антительный ответ животных на корпускулярный менингокок-ковый серогруппы В препарат при различных методах иммунизации // ЮЮИ-1992. -N7-8. -с. 30-34 / соавт.: Е Е Алексахина,

И. А. Басиакьян, ЕЕКоленко, Е Ы. Боровкова, Е Е Стукалова, Е И. Карабак.

7. Графическое моделирование для прогнозирования длительных управляемых процессов культивирования менингококка серо-группы В // ПСИ - 199Е -N6 -с. 6-8/ соавт. Баснакьян Е А., Алексахина Е Е , Артемьева Т. А., Карабак Е И.

Соискатель:

Л, Е Сарае ва