Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение фенотипических и молекулярно-генетических характеристик штаммов Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae, выделенных из ликвора детей, больных гнойным бактериальным менингитом

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Определение фенотипических и молекулярно-генетических характеристик штаммов Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae, выделенных из ликвора детей, больных гнойным бактериальным менингитом"

На правах рукописи

УРБАН ЮЛИЯ НИКОЛАЕВНА

Определение фенотипических и молекулярно-генетических характеристик штаммов Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae, выделенных из ликвора детей, больных гнойным' -бактериальным менингитом

03.02.03- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2014

я ОКТ 2014

005553222

005553222

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Станислав Степанович

доктор биологических наук Воропаева Елена Александровна Официальные оппоненты:

Дмитренко Ольга Александровна доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенности. Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения РФ

Червннец Вячеслав .Михайлович доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация: Хабаровский филиал Федерального государственного бюджетного учреждения "Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук - Научно-исследовательский институт охраны материнства и детства

Защита состоится «¡.•/¿> /у^-^' _2014 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального бюджетного учреждения науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, Ыр//\у\у\у^аЬпсЬ.ги

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Борисова Ольга Юрьевна

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Гнойный бактериальный менингит (ГБМ), как форма инфекционной нейропа-тологии, занимает важное место в структуре заболеваний нервной системы и остается одной из причин летальности и инвалидизации больных. Ведущими возбудителями данного заболевания являются Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae тип b (Hib) (Сорокина M.H. и др., 2003; Королева И.С., 2004). Ежегодно в мире, по расчетным данным, регистрируется более 1,2 миллиона случаев бактериальных менингитов (WHO Vaccine Preventable Diseases Monitoring System, 2010)

Для идентификации N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae широко используются микробиологические методы: бактериологический, микроскопический, иммунохимический (реакция латекс-агглютинации). Хотя бактериологический метод и принято считать золотым стандартом для подтверждения случаев заболевания в условиях клиники, уровень положительных результатов этого исследования относительно низкий по причине несоблюдения оптимальных условий хранения и транспортировки материала, и/или проведения антибактериальной терапии до взятия клинического материала, а учет результатов реакции латекс-агглютинации носит субъективный характер и может быть сложным для интерпретации (Королева И.С. , 2004; Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae, 2011). Поэтому, в последние годы для диагностики основных возбудителей гнойного бактериального менингита широко применяются молекулярные методы, в частности, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который находит широкое применение благодаря своей высокой чувствительности, специфичности и большей производительности (Carvalho М. G. et all, 2007; Maroufi Y„ 2007; Mothershed E. A., 2004).

Определение серотипового и серогруппового пейзажа N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae играет важную роль при внедрении вакцин, необходимых для профилактики гнойных бактериальных менингитов (WHO Vaccine Preventable Diseases Monitoring System, 2010). Для полноценного эпидемиологического надзора за N. meningitidis, Н. influenzae и 5. pneumoniae необходимы данные, которые позволяют проанализировать популяцию возбудителей (Brehony С., 2007). Данные об эволюции и закономерностях распространения патогенных бактерий, полученные с помощью метода мультилокусного сиквенс-типирования (MJICT), наиболее информативны, так как позволяют находить генетическую связь между штаммами и оценивать степень филогенетического родства возбудителей, а также дают представление о их географическом распространении (Лукашов В.В., 2009; Brehony С., 2007; Seiender R. К., 1987).

Своевременная и адекватная антибиотикотерапия гнойного бактериального менингита позволяет снизить смертность и инвалидизацию пациентов (Королева И.С., 2007; Mortensen, J. Е., 2006). Однако, лечение данного заболевания может быть неэффективным вследствие пониженной чувствительности к антибактериальным препаратам (АБП) штаммов N. meningitidis, Н. influenzae и S. pneumoniae. Трудности в оценке антибиотикорезистентности культур обуславливают необходимость использования молекулярно-генетических методов для выявления маркеров, определяющих устойчивость к антибиотикам (ChibaN. et all, 2011).

В ряде стран, входящих в состав содружества независимых государств (СНГ), для идентификации S.pneumoniae, N.meningitidis, И.influenzae в лабораториях используются, в основном, бактериологические и иммунохимические методы, нет полноценной картины о распространении на этих территориях возбудителей гнойного бактериального менингита.

Актуальность работы заключается в необходимости всестороннего изучения циркулирующих штаммов N. meningitidis, S. pneumoniae и Н. influenzae, вызывающих гнойный бактериальный менингит у детей в странах СНГ.

Степень разработанности темы исследования

Гнойный бактериальный менингит по-прежнему остается серьезной проблемой здравоохранения, поэтому необходимо внедрение новых вакцин против возбудителей данного заболевания (WHO Vaccine Preventable Diseases Monitoring System, 2010). Для введения вакцинации проводится мониторинг циркулирующих штаммов. Исследование возбудителей на пост-вакцинальном этапе необходимо для выявления серогрупповых/серотиповых замен в структуре циркулирующих штаммов (Платонов А.Е., 2011). В современных условиях использование молекулярно-генетических методов, совместно с классическими бактериологическими методами, позволяет провести всесторонние наблюдения за возбудителями, определить детерминанты, отвечающие за устойчивость к антибактериальным препаратам, расшифровать природу их устойчивости (Платонов А.Е., 2011). В России мониторингом циркулирующих возбудителей гнойного бактериального менингита с использованием как классических бактериологических, так и современных молекулярно-генетических методов занимается ряд исследователей (Козлов P.C., 2010; Королева И.С., 2013; Мирнов К.О., 2011; Платонов А.Е , 2011; Савинова Т.А., 2011; Сидоренко С.И. 2014). Однако работ, посвященных изучению возбудителей гнойного бактериального менингита в странах СНГ нет. Остается невыясненным состав доминирующих штаммов, их ан-тибиотикорезистентность и филогенетические отношения. Данные исследования являются актуальными для Российской Федерации, в связи с ее географическим расположением и активной миграцией населения из стран СНГ.

Цель исследования

Провести микробиологический и молекулярно-генетический скрининг образцов СМЖ и штаммов из ликвора, полученных от детей, больных гнойным бактериальным менингитом, для оценки фенотипических, молекулярно-генетических и филогенетических свойств S. pneumoniae, N. meningitidis и Н.influenzae.

Задачи исследования:

1. Провести мониторинг циркуляции N. meningitidis, S. pneumoniae и Н. influenzae в странах СНГ. Определить их серогрупповую и серотиповую принадлежность.

2. Оценить уровень фенотипической антибиотикочувствительности штаммов N. meningitidis, S. pneumoniae и Н. influenzae. Выявить наличие изменений в генах pbpla, pbp2x и pbp2b, обуславливающих снижение чувствительности к пенициллину, и наличие генов mefA и егтВ, ответственных за устойчивость к макролидам, у штаммов S. pneumoniae.

3. Определить доминирующие сиквенс-типы и клональные комплексы штаммов 5. pneumoniae, N. meningitidis и Н. influenzae, циркулирующих в странах СНГ, провести анализ филогенетического родства с построением дендрограмм.

4. Установить степень филогенетического родства между штаммами S. pneumoniae, выделенными из СМЖ и со слизистой носоглотки.

5. Разработать алгоритм идентификации возбудителей гнойного бактериального менингита.

Научная новизна

Впервые охарактеризована популяционная структура штаммов S. pneumoniae, N. meningitidis и Н. influenzae, вызывающих гнойный бактериальный менингит у детей в странах СНГ с помощью метода мультилокусного сиквенс-типирования (MJICT). Выявлено, что штаммы S.pneumoniae относились к сиквенс-типам СТ 239, 246, 2436, 473, а также СТ 230 и СТ 1176, в которые вошли штаммы, устойчивые к пенициллину, N.meningitidis - к клональному комплексу ST-11 complex/ET-37 complex и Н. influenzae - к клональному комплексу А1/А2.

Проведено молекулярно-генетическое исследование детерминант антибиоти-корезистентности S. pneumoniae и показано, что устойчивость к пенициллину у 5. pneumoniae связана с изменениями в генах, кодирующих чувствительность к пенициллину, а устойчивость к эритромицину обусловлена приобретением соответствующих островков патогенности (генов резистентности к антибиотикам).

Впервые идентифицированы два новых си к ве нс-ти па Л', meningitidis СТ-10735 и СТ- 10736, которые размещены в международной базе Neisseria PubMLST под идентификационными номерами 28790 (http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?page=prorileInfo&db=pubmlst neisseria seqdef& scheme id=l&profile id=10735) и 28791 (http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl7page =profilelnfo&db=pubmlst neisseria seqdef&scheme id=l&profile id=1073. что способствует повышению эффективности эпидемиологического надзора за менингококко-вой инфекцией.

Разработанный алгоритм идентификации возбудителей гнойного бактериального менингита позволяет сделать заключение о клинической значимости возбудителя в инфекционном процессе и оптимизировать лечебно-профилактические мероприятия.

Теоретическая и практическая значимость работы

Предложенный алгоритм идентификации инвазивных и неинвазивных штаммов с применением классических бактериологических и молекулярно-генетических методов позволит оценить патогенетическую значимость различных возбудителей гнойного бактериального менингита в инфекционном процессе.

Сведения о составе и распределении серогруппового/серотипового пейзажа N.meningitidis, S.pneumoniae и Н. influenzae в странах СНГ дают возможность обосновать введение в национальный календарь прививок вакцин против данных возбудителей.

Данные о наличии антибиотикорезистентности у штаммов S.pneumoniae и N.meningitidis могут быть использованы для оптимизации антибиотикотерапии гнойных бактериальных менингитов в странах СНГ.

Создан банк ДНК N.meningitidis, S.pneumoniae, Н.influenzae для дальнейших исследований, определения генетической структуры (сиквенс-типы) и определения антибиотикорезистентности, связанной с генетическими изменениями циркулирующих патогенов.

Результаты исследований и разработок внедрены в научно-исследовательскую работу лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (Акт внедрения от 24 июля 2014 г.)

Оптимизированные молекулярно-генетические методы типирования основных возбудителей гнойного бактериального менингита используются в Региональном ре-ференс-центре по инвазивным бактериальным заболеваниям, управляемым вакцинацией (PPJI по ИБЗ), Европейского Регионального Бюро Всемирной Организации Здравоохранения (ЕРБ ВОЗ) при проведении мониторинга за основными возбудителями гнойных бактериальных менингитов в странах СНГ. Результаты проведенных исследований размещены в базе данных ВОЗ и включены в ежегодно издаваемые бюллетени по наблюдению за возбудителями гнойных бактериальных менингитов в Европейском регионе ВОЗ.

Методология и методы и исследования

Методология данной работы спланирована согласно поставленной цели. Основными объектами исследования стали фенотипические, молекулярно-генетические и филогенетические свойства циркулирующих штаммов, вызывающих ГБМ. Научная литература, посвященная проблеме основных свойств S.pneumoniae, N .meningitidis и H.influenzae, была проанализирована формально-логическими методами исследования. Предметом исследования явились штаммы S.pneumoniae, N.meningitidis и H.influenzae, выделенные из спинномозговой жидкости (СМЖ) детей больных ГБМ. В работе использованы бактериологические, иммунохимические и молекулярно-генетические методы исследования.

Материалы и методы исследований

Результаты диссертационной работы основаны на лабораторном исследовании 810 образцов СМЖ и 33 клинических штаммов, выделенных из СМЖ, взятой у детей в возрасте от 1 месяца до 59 месяцев и 29 дней, поступивших в дозорные госпиталя с подозрением на менингит. СМЖ и клинические штаммы поступали из следующих стран: Азербайджан, Армения, Грузия, Белоруссия, Узбекистан и Украина за период 2007-2013 г.г. Для сравнения с клиническими штаммами S.pneumoniae, выделенными из СМЖ детей в странах СНГ, были взяты 5 клинических штаммов из СМЖ и 9 клинических штаммов, выделенных со слизистой носоглотки у пациентов клинико-диагностического центра ФБУН МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора.

Бактериологические методы. Для видовой идентификации полученные штаммы засевали на кровяной и «шоколадный» агар (Oxoid, Великобритания), тер-мостатировали в течение 24-48 часов при 37°С в атмосфере с -5% С02 и идентифицировали с использованием микроскопических, бактериологических и биохимических методов ( «Лабораторные методы диагностики бактериальных менингитов, вызванных Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae. Пособие ВОЗ, 2-е издание», 2011г.).

Серологические методы. Для серологического типирования штаммов Н. influenzae, N .meningitidis применяли коммерческие тест системы Pastorex meningitidis Latex kit (Biorad, США), индивидуальные антисыворотки к N. meningitdis (BD, США/ Серотипирование штаммов S.pneumoniae проводили с помощью коммерческого набора Pneumotest Latex kit (SSI, Дания) и реакции набухания капсулы (проба Нейфельда) с использованием индивидуальных антисывороток (SSI, Дания). Постановку реакций и оценку результатов проводили в соответствии с инструкциями производителей.

Определение чувствительности культур S.pneumoniae, N.meningitidis и H.influenzae к антибиотикам проводили с помощью диско-диффузионного метода Кирби-Бауэра (ДДМ) и определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) с использованием тест-полосок «Е-test», содержащими антимикробные препараты («Oxoid», Великобритания): пенициллин, ампициллин, цефотаксим, ципро-флоксацин, хлорамфеникол, эритромицин, ванкомицин, триметро-

пим/сульфаметоксазол. Оценку чувствительности микроорганизмов осуществляли согласно МУК 4.2. 1890-04 и стандартам, рекомендуемым Институтом клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standarts Institute, CLSI, США). Для выявлявления продукции р-лактамаз у штаммов Н. influenzae использовали экспресс-тест с нитроцифином (Oxoid, Великобритания), результат оценивали согласно инструкции производителя.

Молекулярно-генетнческие методы исследования. Экстракцию ДНК из СМЖ осуществляли с помощью коммерческого набора для выделения ДНК QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen, США), согласно протоколу с частичной модификацией (Carvalho М. G.et all, 2007). Экстракцию хромосомальной ДНК из культур N.meningitidis и Н. Influenzae осуществляли методом кипячения, согласно общепринятому протоколу (Маниатис Т.,1984). Для экстракции хромосомальной ДНК из культур S.pneumoniae использовали дополнительный ферментативный лизис. Для приготовления ферментативного буфера в 50 мкл Трис буфера (рН 8,0) добавляли 10 мкл мутанолизина (3000 Ед/мл) (Sigma, США) и 8 мкл гиалуронидазы (30 мг/мл) (Sigma, США). 18-24 часовую культуру клеток 5. pneumoniae, выросшую на кровяном агаре, вносили в 0,85% раствор NaCl до получения суспензии, сопоставимой со стандартом 3,0 по МакФарланду, и инкубировали при 70°С в течение 15 минут. Затем, пробирки с суспензией центрифугировали при 12000 об/мин в течение 2 минут, после чего сливали супернатант, а осадок ресуспензировали в 50 мкл ферментативного буфера, пробирки с буфером инкубировали при 37°С в течение 30 минут, затем кипятили содержимое при 100°С 10 минут, пробирки с суспензией центрифугировали при 13000 об/мин в течение 3 минут (Carvalho М. G. et all, 2007).

Видовую детекцию N.meningitidis, Н. influenzae и S. pneumoniae осуществляли с помощью метода ПЦР РВ. Использовали последовательности праймеров и флуоресцентно меченные зонды, рекомендованные согласно руководству «Лабораторные методы диагностики бактериальных менингитов, вызванных Neisseria meningitidis. Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae. Пособие ВОЗ, 2-е издание» (2011г.). Амплификацию с детекцией в режиме реального времени проводили в ам-плификаторе ABI 7500 (Applied Biosystems, США). Для определения серотипа S.pneumoniae применяли метод мультиплексной ПЦР (мПЦР), согласно схемам и

протоколам, представленным на веб сайте CDC, Атланта, США (http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm).

Определение генетической чувствительности к пенициллину и генетической резистентности к макролидам штаммов S. pneumoniae проводили с помощью ПЦР РВ с использованием праймеров и флуоресцентно меченных зондов, рекомендованных Chiba N et all., 2011.

Мультилокусное сиквенс типирование. Последовательность праймеров для амплификации и секвенирования генов «домашнего хозяйства», протоколы амплификации и реакции секвенирования использовали согласно рекомендациям базы данных

S.pneumoniae MLST (http://spneumoniae.m1st.net/),_Н. influenzae_MLST

(http://haemophilus.mlst. net/), Neisseria PubMLST (http://pubmlst.org/neisseria/). Определение нуклеотидной последовательности фрагментов проводили модифицированным методом Сенгера на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора реагентов для секвенирования В ig Dye Terminator v3.I Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), согласно рекомендациям производителя. Исследования проводились на базе ЗАО «ПИННИ» («Постгеномные и нанотехнологические инновации», CJSC «PYNNY» Инновационного центра медицинских нанобиотехнологий ГУ НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, г. Москва).

Статистическая обработка, анализ данных и программное обеспечение.

Статистическую обработку полученных данных проводили, применяя стандартный пакет статистических программ Microsoft Excel 2007. Для сравнения качественных признаков между исследуемыми группами использовали критерий хи-квадрат (%2) (Винник А.Л., 1991; Гланц С., 1998). Результаты секвенирования, полученные в формате хроматограммы, обрабатывали в программе CromasLite, секвени-рованные последовательности сопоставляли с международной on-line базой MLST (http://pubmlst.org). Для определения клональности исследуемых штаммов использовали алгоритм eBURSTv3, интегрированный в MJ1CT вебсайт (http://eburst.mlst.net). С использованием программы «Vector NTI Suite v. 9» проводили склеивание полученных нуклеотидных последовательностей. Выравнивание последовательностей осуществляли с помощью сервиса BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE TYPE=BlastSearch&BLAST SPEC=blast2seq&LINK LOC=align2seq). Построение филогенетической дендрограммы осуществляли методом присоединённых соседей (Neigbor joining -NJ) с использованием программного обеспечения MEGA 5.0 (TamuraK., 2011).

Личное участие автора в получении результатов.

Личное участие соискателя в получении результатов, изложенных в диссертации, заключалось в выполнении молекулярно-генетических исследований (ПЦР РВ, мПЦР), в обработке и анализе данных секвенирования, проведении биоинформационного анализа полученных данных, теоретическом обобщение результатов, статистической обработка данных. Бактериологические исследования проводились совместно с сотрудниками лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора: ведущим научным сотрудником Егоровой Е.А., младшим научным сотрудником Оганесяном А.Н.

Положения, выносимые на защиту:

1. Для выявления и определения серогрупп и серотипов N. meningitidis, S. pneumoniae и Н. influenzae в спинномозговой жидкости целесообразно использовать молекулярно-генетические и бактериологические методы.

2. Среди циркулирующих штаммов N. meningitidis, Н. influenzae и S. pneumoniae в странах СНГ механизмы антибиотикорезистентности определялись видовыми особенностями возбудителей.

3. Исследуемые штаммы N. meningitidis, S. pneumoniae и Н. influenzae принадлежат к широко распространённым сиквенс-типам и клональных комплексам.

4. Филогенетический анализ позволил установить определённую связь между штаммами S. pneumoniae, выделенными из спинномозговой жидкости и со слизистой носоглотки.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

О достоверности полученных результатов работы свидетельствует достаточный объем выборки анализируемых образцов (810 образцов СМЖ и 47 клинических штаммов), использование сертифицированных бактериологических, иммунохимиче-ских и молекулярно-генетических методов, которые характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Комплексное бактериологическое, иммунохимиче-ское и молекулярно-генетическое исследование клинических штаммов позволило получить сопоставимые данные, что свидетельствует о достоверности полученных результатах.

Диссертация апробирована на заседании секции Учёного Совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (протокол № 2 от 22 мая 2014г.).

Результаты диссертационной работы представлены, доложены и обсуждены на The 29th Annual Meeting of the European society for pediatric infectious diseases, 7-11 June, 2011, Hague, Netherlands; The 4th Congress of Europen Microbiologist, June 26-30, 2011, Geneva, Switzerland; The 27th International Congress of Pediatrics 2013 (ICP), August 24-29, 2013, Melbourne, Australia; на VI ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 24-26 марта, 2014.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 - в рецензируемых изданиях, 6 - в сборниках материалов конференций.

Структура и объем и диссертации. Диссертация изложена на 117 странице печатного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, заключение, выводы, практические рекомендации, перспективы дальнейшей разработки темы. Диссертация иллюстрирована 16 рисунками и 23 таблицами. В библиографическом указателе приведен 188 источник, из них 47 -на русском и 141 - на иностранном языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Идентификация возбудителей гнойного бактериального менингита в спинномозговой жидкости и характеристика выделенных клинических штаммов

При выполнении работы было исследовано 810 образцов СМЖ с использованием метода ПЦР РВ. Выявлено 267 (32%) позитивных образцов, из которых 148 (55,4%) - N. meningitidis, 76 (28,4%) - S.pneumoniae и 43 (16,2%) - H.influenzae (рисунок 1 А). Таким образом, доминирующим возбудителем ГБМ в странах СНГ явился N. meningitidis. С использованием метода ПЦР РВ определены серогруппы/серотипы позитивных образцов. На Н. influenzae группы b приходилось 100% (п=43) всех положительных образцов. В 148 образцах, в которых выявлена ДНК N.meningitidis, наблюдалось следующее распределение: 66,2% (п=98) - N. meningitidis В; 22,2% (п=33) - N. meningitidis С; 6,1 % (п=9) - N. meningitidis W135; 4,8% (п=7) - N. meningitidis А и 0, 7% (п=1), N. meningitidis X (рисунок 1Б).

А Б

Рисунок 1. А - распределение возбудителей ГБМ, выявленных в СМЖ; Б-распределение серотипов N.meningitidis в СМЖ.

С использованием метода мПЦР определены серотипы 76 положительных образцов, содержащих ДНК S.pneumoniae. Наблюдалось следующее распределение S.pneumoniae-. серогруппа 6 (6А/В/С) - 30,3% (п=23), серотип 14 - 13,3% (п=10), серотип 23F - 9,3% (п=7), серотип 19F - 5,4% (п=4), серотип 1 - 2,7% (п=2) и по 1,3% (п=1) приходилось на каждый следующий серотип: 2, 3, 4, 7 A/F, 8, 9V/A, 11 A/D, 17F, 15В/С, 18 (18 А/В/С). У 26% (п=20) серотип определен не был и данные образцы обозначены как нетипируемые (NT) .

Таким образом, доминирующим генотипом среди выявленных менингококков был N.meningitidis группы В 66,2% (п=98) (р<0,001), который, в настоящее время, не входит в состав ни одной из применяющихся менингококковых вакцин. Второе место по встречаемости приходилось на группу С (р<0,01). Картина распределения этих двух серогрупп соответствует картине распределения серогрупп N.meningitidis в Европейском регионе (World Health Organization Control of epidemic meningococcal disease, 1998). На третьем месте по встречаемости была серогруппа W135 (р<0,05), кою

□ N. meningitidis В □ V. meningitidis С

□ V. meningitidis W135 ON. meningitidis А

□ TV. meningitidis X

□ Nmeningitidis В S.pneum oniae OH.inJltienzae

торая характерна для стран Азиатского региона и Ближнего Востока («Лабораторные методы диагностики бактериальных менингитов, вызванных Neisseria meningitidis. Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae. Пособие ВОЗ, 2-е издание», 2011г.), и встречаемость этой серогруппы в ряде стран СНГ можно объяснить повышенной миграцией людей из данных регионов. Среди выявленных пневмококков наблюдалось многообразное распределение серотипов и серогрупп, но наиболее распространённой среди типируемых пневмококков была серогруппа 6 (30,3%). Среди типируемых пневмококков выявлены как штаммы, входящие в состав 13-ти валентной пневмококковой вакцины (серотипы 1, 4, 14, 19F, 23F), так и серотипы, не входящие в состав данной вакцины (серотипы 2, 3, 8, 11A/D, 17F, 15В/С).

На последнем месте по встречаемости был Н. influenzae b, что можно объяснить, тем, что в наблюдаемых странах была введена вакцинация против данного возбудителя.

Из 810 образцов спинномозговой жидкости выделено 33 штамма с использованием «классического» бактериологического метода и метода ПЦР РВ (таблица 1).

Таблица!. Видовая принадлежность штаммов, выделенных из СМЖ.

Общее количество штаммов S. pneumoniae N.meningitidis Н. influenzae

Бактериологический метод Метод ПЦР РВ Бактериологический метод Метод ПЦР РВ Бактериологический метод Метод ПЦРРВ

п=33 13 13 9 9 11 11

Дальнейшие исследования с использованием методов латекс-агглютинации и ПЦР РВ для идентификации N.meningitidis и Н.influenzae и мультиплексной ПЦР для идентификации S.pneumoniae позволили определить серотипы исследуемых штаммов (таблица 2).

Совпадение результатов, полученных с помощью серологического метода и метода ПЦР РВ, для идентификации исследуемых штаммов N.meningitidis и Н.influenzae составило 100% , что свидетельствует о высокой специфичности применяемых праймеров и зондов и возможности применения метода ПЦР РВ для идентификации серотипов данных возбудителей наравне с серологическими методами. Для 5 штаммов S.pneumoniae методом мПЦР определена только серогруппа, разделение на серотип методом мультиплексной ПЦР не проводилось. Это было связано с тем, что серогруппы S.pneumoniae 6А/В, 18A/B/C/F, 7В/С/40 имеют высокую гомологию гена, кодирующего синтез капсулы, к которому разработаны только групповые праймеры. Следовательно, для изолятов этих серогрупп методом ПЦР возможно определить только групповую принадлежность, а идентификация отдельного сероти-па возможно методом набухания капсулы. Однако интерпретация результатов реакции, набухания капсулы является субъективной и требует высокой квалификации исследователя, кроме того, поликлональные антисыворотки имеют высокую стоимость, и не всегда доступны для лабораторий.

Таблица 2. Серотипы исследуемых штаммов.

Nn/n Штамм Определение серотипа Определение серотипа

методом латекс- методами ПЦР РВ и

агглютинации мПЦР

1 155 N.meningitidis W135 N.meningitidis W135

2 72 N.meningitidis IV135 N.meningitidis W135

3 490 N.meningitidis В N.meningitidis В

4 504 N.meningitidis В N .meningitidis В

5 507 N.meningitidis В N.meningitidis В

6 509 N. meningitidis С N.meningitidis С

7 1015 N.meningitidis В N.meningitidis В

8 1017/07 N .meningitidis В N.meningitidis В

9 1018 N .meningitidis В N.meningitidis В

10 072 S.pneumoniae 19F S.pneumoniae 19F

11 069 S.pneumoniae 19F S.pneumoniae 19F

12 140 S.pneumoniae 6A S.pneumoniae 6AJB

13 12.30 S.pneumoniae 18F S.pneumoniae 18A/B/C/F

14 12.31 S.pneumoniae 23F S.pneumoniae 23F

15 12.19 S.pneumoniae 4 S.pneumoniae 4

16 12.21 S.pneumoniae 6A S.pneumoniae 6A/B

17 12.23 S.pneumoniae 6A S.pneumoniae 6A/B

18 12.24 S.pneumoniae 7B S.pneumoniae 7B/C/40

19 12.26 S.pneumoniae 4 S.pneumoniae 4

20 12.27 S.pneumoniae 20 S.pneumoniae 20

21 12.28 S.pneumoniae 3 S.pneumoniae 3

22 12.29 S.pneumoniae 14 S.pneumoniae 14

23 8.15 H. influenzae b H. influenzae b

24 8.16 H. influenzae b H. influenzae b

25 8.18 H. influenzae b H. in fluenzae b

26 8.20 H. influenzae b H. influenzae b

27 8.21 H. influenzae b H. influenzae b

28 23887 H. influenzae b H. influenzae b

29 23882 H. influenzae b H. influenzae b

30 23884 H. influenzae b H. influenzae b

31 23885 H. influenzae b H. influenzae b

32 23886 H. influenzae b H. influenzae b

33 23883 H. influenzae b H. influenzae b

При сравнении бактериологического метода и метода Г1ЦР РВ, использовавшихся для идентификации штаммов возбудителей гнойного бактериального менингита в СМЖ, выявлено, что бактериологическим методом определили 11 штаммов Н. influenzae, 9 штаммов N.meningitidis и 13 штаммов S. pneumoniae, то время как в тех же образцах методом ПЦР РВ определили: ДНК Н. influenzae в 43 образцах, ДНК N. meningitidis в 148 образцах ДНК, в 76 образцах - S.pneumoniae (рисунок 2). Это связано с тем, что методом ПЦР РВ определялось присутствие специфичных генов болезнетворных бактерий и, поэтому, в СМЖ не требовалось присутствие жизнеспособных микроорганизмов. Таким образом, было показано, что метод ПЦР РВ является более чувствительным и позволяющим поставить более точный диагноз, чем бак-

!

термальный метод при выявления основных возбудителей гнойного бактериального менингита в СМЖ (р<0,001).

S.pneumoniae N.meningitidis Н.influenzae

□ бактериологический метод ШПЦРРВ

Рисунок 2. Выявление основных возбудителей ГБМ бактериологическим ме-

1 тодом и методом ПЦР РВ из СМЖ.

|

Анализ антибиотикочувствительности штаммов S.pneumoniae, N. meningitidis и Н.influenzae

В ходе исследования проведено тестирование 33 штамма возбудителей, выделенных из клинических образцов: 13 штаммов S.pneumoniae проверяли на устойчивость к 6 антибактериальным препаратам (АБП), 9 штаммов N. meningitidis - к 4 АБП и 11 штаммов Н.influenzae к 6 АБП.

Установлено, что 30,7% (п=4) исследуемых штаммов S.pneumoniae имели резистентность к пенициллину, 7,7% (п=1) штаммов пневмококков резистентны к эритромицину. К ванкомицину у 30,7% (п=4) штаммов S.pneumoniae была умеренная чувствительность, у 30,7% (п=4) была умеренная чувствительность к триметропиму/ } сульфаметоксазолу. Все исследуемые штаммы были чувствительны к цефотаксиму и I хлорамфениколу. Развитие у пневмококков резистентности к препаратам пеницил-( линового ряда в большинстве случаев связывают со снижением аффинности пени-I циллин связывающих белков (ПСБ) - PBPla, РВР2х и РВР2Ь, которые кодируются ] соответствующими генами: pbpla, pbp2x и pbp2b. Для обнаружения генов pbpla, \ pbplx и pbp2b применяли метод ПЦР РВ. Для определения генетической устойчиво-j сти к макролидам, с использованием метода ПЦР РВ, проводили детекцию генов | егтВ и те/А. Полученные результаты сравнивали с данными, полученными при помощи ДДМ и МИК (таблица 3). Методом ПЦР РВ обнаружено 38,4% (п=5) пнев-! мококков с гППУ и гПУ и 7,7% (п=1) пневмококков с гПУ. Генетическая промежу-I точная устойчивость к пенициллину у данных штаммов была обусловлена изменениями в генах pbpla, pbp2x, pbp2b. Штаммы с генетической устойчивостью к макролидам составили 7,7% (п=1) и у данного штамма обнаружены фрагменты генов егтВ и те/А, а также он являлся и гПУ. При сопоставлении данных, полученных методами ДДМ, МИК и ПЦР РВ, выявлено, что у пенициллин резистентных штаммов были изменения в генах, кодирующих ПСБ. У одн ого

штамма были изменения в гене pbp2x, но МИК составила 0,03 мкг/л, что свидетельствовало о фенотипической чувствительности к пенициллинам. Возможно, наличие изменений в этом гене не всегда определяет у пневмококков устойчивость к пени-

циллину. Один штамм, который являлся пенициллин устойчивым, был генетически устойчивым и к макролидам, что подтверждалось ДДМ и МИК.

Таблица 3. Сравнительная характеристика пенициллин резистентных и устойчивых к

Штаммы Серотип Чувствительность к пенициллину Чувствительность к макролидам

Генетическая чувствительность МИК/Д ДМ Генетическая резистентность МИК/ДДМ

72 19F гППУ* (не выявлены рЬр 1 а-рЪр2х) 1.0 р***** 0,015 Ч

69 19F гППУ (не выявлены рЬр1а-рЬр2х) 1.5 Р Ч 0.015 Ч

140 6А гППУ (не выявлены рЬр2х) 0.375 Р Ч 0.015 Ч

12.30 18F гПУ* (не выявлены рЬр1а-рЬр2х-рЬр2Ь) 1,5 Р Р (выявлены ermB+mefA) 8 Р

12.31 23F гПЧ* * 0,045 Ч Ч 0,23 Ч

12.19 4 гПЧ 0.045 Ч Ч 0.03 Ч

12.21 6А гПЧ 0.023 Ч Ч 0.045 Ч

12.23 6А гПЧ 0.023 Ч Ч 0.045 Ч

12.24 7В гППУ (не выявлены рЬр2х) 0.03 Ч Ч 0.12 Ч

12.26 4 гПЧ 0.015 Ч Ч 0.23 Ч

12.27 20 гПЧ 0.015 Ч Ч 0.015 Ч

12.28 19F гПЧ 0.06 Ч Ч 0.09 Ч

12.29 14 гПЧ 0.06 Ч Ч 0.23 Ч

Ul^ — I 1.1 IL ГI I L V. IV LI/I I ivntl Lll IJ 1.1 II I 1 VVJiyinriDULll), I I II.' - 1 LH^l M LVVIVUn I luv/ llV'Ilt IV) I I I LI/I 1 IL1 III

nTT*** *****

циллин устойчивость, гПЧ - генетическая пенициллин чувствительность, Ч - чувстви-

*****

тельные, Р - резистентные.

В результате исследования штаммов менингококков установлено, что 33,3% исследуемых штаммов устойчивы к пенициллину, а так же в ходе исследования обнаружен мультирезистентный штамм N.meningitidis к пенициллину, цефотаксиму, сульфаметоксазолу, ципрофлоксацину.

Среди исследуемых штаммов Н.influenzae 90,9% (п=10) были ß-лактомазо -негативные, 9,1% (п=1) положительные по ß - лактомазе, что подтвердилось ДДМ

и МИК с ампициллином. К ципрофлоксацину и цефотаксиму исследуемые штаммы Н.influenzae были чувствительны. К хлорамфениколу и триметоприму/сульфаме-токсозолу среди исследуемых штаммов Н.influenzae у 36,3% (п=4) наблюдалась промежуточная устойчивость.

Мультилокусное сиквенс типирование штаммов S.pneumoniae, N.meningitidis и Н.influenzae

Проведено секвенирование 7-ми генов «домашнего хозяйства» 11 штаммов S. pneumoniae, выделенных из СМЖ. Анализ сочетания всех семи генов «домашнего хозяйства» в международной базе MJ1CT S.pneumoniae (веб сайт http://spneumoniae.mlst.net/sql/ allelicprofilechoice.asp) показал, что 11 исследуемых штаммов относились к известным 7-ми сиквенс-типам (CT) (таблица 4).

Таблица 4. Определение серогрупп/серотипов, сиквенс типов и антибиотикочувстви-тельности изолятов 5. pneumoniae__

Штаммы Гены домашнего хозяйства CT гПЧ Серогруппа

агоЕ gdh gki recP spi xpt ddl

12.28 15 17 4 16 6 19 7 239 гПЧ 19F

12.26 16 13 4 5 6 10 18 246 гПЧ 4

12.19 16 13 4 5 6 10 18 246 гПЧ 4

12.29 1 5 4 5 5 4 8 2436 гПЧ 14

12.23 7 25 4 4 15 20 28 473 гПЧ 6А

12.21 7 25 4 4 15 20 28 473 гПЧ 6А

140 7 25 4 4 15 20 28 473 гППУ 6А

12.24 10 20 8 10 6 1 18 1176 гППУ 7В

12.27 15 8 8 18 15 1 31 235 гПЧ 20

69 12 19 2 17 6 22 14 230 гППУ 19F

72 12 19 2 17 6 22 14 230 гППУ 19F

Примечание: СТ- сиквенс тип, гПЧ - генетическая пенициллин чувствительность, гППУ- генетическая промежуточная пенициллин устойчивость, гПУ - генетическая пенициллин устойчивость.

Рисунок 3. N.1 дендрограмма попарных различий СТ для штаммов З.рпеитоп^ае.

Для выявления родственных связей между штаммами проведен филогенетический анализ по степени гомологии выявленных сиквенс-типов с построением денд-рограммы (рисунок 3) . Анализ филогенетического родства показал, что большинство

штаммов S. pneumoniae вошли в кластер I. В данный кластер были включены СТ 239, 246, 2436, 473, а также СТ 230 и СТ 1176, в которые вошли штаммы, имеющие изменения в ПСБ, и они находились на отдельных ветвях, но имели общие узлы с выше перечисленными сиквенс типами. СТ 235 имел отхождение от общего кластера, что подчеркивает его возможное более древнее эволюционное происхождение и возможное отличие от штаммов, входящих в кластер I.

Секвенирование 7-ми генов «домашнего хозяйства» 6 штаммов N.meningitidis показал, что 4 штамма относятся к известным сиквенс-типам, а у двух штаммов было новое сочетание аллелей, которое не соответствовало известным сиквенс типам, представленным в международной базе Neisseria PubMLS (.http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst _neisseria_seqdef&page=profiles). Данные новых сиквенс типов внесены в международную базу Neisseria PubMLST и им присвоены новые номера сиквенс типов 10735 и 10736 (таблица 5).

Таблица 5. Определение серогрупп/серотипов, сиквенс типов и клональных комплексов штаммов N.meningitidis._____

Штам Гены домашнего хозяйства СТ КК Серогруппа

мы abcZ adk aroE fum С gdh pdk С pgm

155 2 3 4 3 8 4 6 11 ST-11 complex/ET -37 complex N.meningitidi s W135

72 2 3 4 3 8 4 6 11 ST-11 complex/ET -37 complex N.meningitidi s W135

490 2 3 9 3 8 4 648 9596 ST-11 complex/ET -37 complex N.meningitidi sB

1015 12 31 6 243 3 5 8 248 10735 N.meningitidi sB

1017/0 7 9 33 9 7 447 249 24 378 10736 N.meningitidi sB

1018 2 3 4 256 8 4 378 3537 ST-11 complex/ET -37 complex N.meningitidi sB

Примечание: СТ-сиквенс тип, КК-клональный комплекс.

Установлено, что известные СТ относились к клональному комплексу (КК) ST-11 complex/ET-37 complex. Данный клональный комплекс характеризуется широким распространением в мире и является гиперэндемичным в странах Европы. Новые сиквенс типы 10735 и 10736 не имели клональной принадлежности. Филогенетический анализ сходства с построением дендЬограммы (рисунок 4) выявленных сиквенс типов показал, что большинство исследованных штаммов (п=5) включены в единый кластер I. В данный кластер включены штаммы, принадлежащие к клональному комплексу ST-11 complex/ET-37 complex, так же в него входил новый СТ10735, не имеющий клональной принадлежности, но который филогенетически близок к

штаммам, включенным в гиперинвазивный клональный комплекс (КК) ST-11 complex/ET-37 complex. СТ 10736, в который вошел штамм с мультирезистентностью к АМП, находился на отдельной ветви, что подчеркивает его возможное более древнее эволюционное происхождение и отличие от штаммов, входящих в кластер I.

ST-11

ST-11 compte(/ET-37 complex

ST-3537 J ST-9596 ST-10735 ST-1 0736

Рисунок 4. NJ дендрограмма попарных различий СТ для штаммов N.meningitidis

Секвенирование 7-ми генов «домашнего хозяйства» И штаммов Н.influenzae, выделенных из СМЖ, показал, что все исследуемые штаммы относились к известным 3-м сиквенс-типам СТ 92 - 46% (п=5), СТ 6 - 36%(п=4), СТ 95 - 18% (п=2).

Дополнительная кластеризация с использованием eBURST анализа позволила выявить, что все исследуемые СТ образуют единый клональный комплекс А1/А2 с СТ-6, как наиболее вероятного предшественника СТ-92 и СТ 95, возникшее в результате дивергенции. Данный клональный комплекс является широко распространённым во всем мире. Филогенетический анализ (рисунок 5), проведенный на основании полученных нуклеотидных последовательностей, демонстрирует согласованность с данными кластеризации и показывает тесное родство между выявленными СТ.

,ST-6

- ST-95

- ST-92

Рисунок 5. NJ дендрограмма попарных различий СТ для штаммов Н.influenzae.

Сравнительный анализ штаммов S. pneumoniae, выделенных из СМЖ и со слизистой носоглотки

Для сравнительной характеристики между штаммами S.pneumoniae. вызывающими инвазивные и неинвазивные формы заболевания, были дополнительно взяты 5 клинических штаммов, выделенных из СМЖ. и 9 штаммов, выделенных со слизистой носоглотки у детей до 5 лет. Идентификацию штаммов и определение антибио-тикочувствительности проводили с использованием применяемых в данной работе методов. Полученные результаты представлены в таблице 6. Среди исследуемых штаммов 5. pneumoniae у 33,3% (п=5) наблюдалась устойчивость к пенициллину, которая была связана с изменениями в генах pbpla, pbp2x, pbp2b. У 80% (п=4) пенициллин-резистентных штаммов выявлена устойчивость к эритромицину, которая подтверждена не только ДДМ и МИК, но и обнаружением фрагментов генов егтВ и mefA.

Таблица 6. Определение серотипов и антибиотикочувствительности штаммов 5. pneumoniae, выделенных из СМЖ и носоглотки.___

Штам мы Место выделения Серспип Чувствительность к пенициллину Чувствительность к макролидам

Генетическая чувствитель-носгь дцм/ мик Генетическая резистентность ддм/ мик

794/1 носоглотка 19F гПЧ 4/0,06 Ч ЧУ 0,015

55/1 носоглотка 6В гПЧ Ч/,03 Ч ЧУ 0,015

264 нооэглотка 17F гПЧ 4/0,06 Ч ч/ 0,06

48/4 ноооглотка 9N гПЧ 4/0,06 Ч ЧУ 0,015

7515 носоглотка 6В гПЧ 4/0,06 Ч ЧУ 0,06

20336 носоглотка 6Л гПУ (не выявлены pbpla-pbp2x-pbp2b) У/1,5 (выявлены егтВ YmefÄ) УУ8

19426 носоглотка 14 гПУ (ж.шш\аълрЬр1а-pbp2x-pbp2b) У/1,5 У/8 (выявлены ennB+mefA) УУ8

8997 носоглотка 19F гПЧ 4/0,06 Ч ЧУ 0,06

9804 носоглотка 19F гПУ (невыяштеныр/р/о-pbp2x-pbp2b) У/1,5 У (выявлены ennB+mefA) УУ8

10 СМЖ 17F гППУ (не выяатены pbpla-pbp2x) У/1,5 Ч ЧУ 0,23

1934 СМЖ 19F гПУ (невыявленыр/р/я-pbp2x-pbp2b) У/1 У/8 (выявлены enriB+mefA) УУ8

118 СМЖ 18С гПЧ 4/0,015 Ч ЧУ 0,045

143 СМЖ 9L гПЧ 4/0,06 Ч 4У 0,045

97 СМЖ 1 гПЧ 4/0,045 Ч 4/ 0,045

Примечание: Ч - чувствительный, У - устойчивый, гПЧ - генетическая пенициллин чувствительность, гПУ - генетическая пенициллин устойчивость.

Проведено секвенирование 7-ми генов «домашнего хозяйства» 14 исследуемых штаммов S. pneumoniae. Анализ сочетания семи генов «домашнего хозяйства», проведенный в международной базе MJ1CT S.pneumoniae (веб сайт http://spneumoniae.mlst.net/sql/ allelicprofile choice.asp). показал, что 14 исследуемых штамма относятся к 12 известным сиквенс типам (таблица 7). Для выявления родственных связей между штаммами S.pneumoniae, выделенными из СМЖ и носоглот-

ки, проведен филогенетический анализ по степени гомологии выявленных сиквенс-типов с построением дендрограммы (рисунок 6).

. I

Таблица 7. Определение сиквенс типов и антибиотикочувствительности штаммов S. pneumoniae

Штаммы Гены домашнего хозяйства CT гПЧ Серотип

агоЕ gdh gki recP spi xpt ddl

794/1 1 5 4 12 5 3 8 423 гПЧ 19F

55/1 2 13 9 1 6 19 14 490 гПЧ 6В

264 7 2 9 1 10 1 45 7196 гПЧ 17F

48/4 2 8 2 4 6 1 71 3104 гПЧ 9N

7515 7 6 1 2 6 15 14 146 гПЧ 6В

20336 7 25 4 4 15 20 28 473 гПУ 6А

19426 7 11 10 29 6 8 1 1227 гПУ 14

8997 1 5 4 12 5 3 8 423 гПЧ 19F

9804 4 16 19 13 6 20 1 320 гПУ 19F

10 7 12 53 4 6 28 18 4841 гППУ 17F

1934 4 16 19 13 6 20 1 320 гПУ 19F

118 10 16 54 1 15 20 31 3750 гПЧ 18С

143 2 5 2 4 6 1 1 517 гПЧ 9L

97 7 28 1 2 6 1 9 2779 гПЧ 1

Примечание: СТ- сиквенс тип, гПЧ - генетическая пенициллин чувствительность, гППУ- генетическая промежуточная пенициллин устойчивость, гПУ - генетическая пенициллин устойчивость.

sT-гзб и

Рисунок 6. NJ дендрограмма попарных различий СТ для штаммов S.pneumoniae, выделенных из СМЖ и носоглотки.

Филогенетический анализ сходства исследуемых СТ пневмококков показал их распределение на 3 кластера. Кластер I был наиболее многочисленный и включал часть СТ, в которые вошли штаммы с гПУ. Наиболее тесную филогенетическую связь имели СТ 320 и 230. В данные СТ включены штаммы серотипа 19F, выделенные из носоглотки и СМЖ, и для них определена мультирезистентность к пенициллине и эритромицину. Данные СТ имеют общие узлы сСТ4841, в который вошел штамм серотипа 17F, выделенный из СМЖ и являющийся гППУ, с СТ 1176 (серо-тип 7В), выделенным из СМЖ, и с СТ 2779 (серотип 1), выделенным из СМЖ и

являющимся гПЧ. В СТ 473 вощли штаммы, выделенные из СМЖ, и штамм, выделенный из носоглотки и который характеризовался мультирезистентностью. Все эти штаммы относились к серотипу 6А и имели тесную родственную связь с СТ 423, в который вошли гПЧ штаммы, выделенные из носоглотки и относящиеся к серотипу 19F. На отдельной ветви в данном кластере находились СТ 239 (серотип 19F) и 246 (серотип 4), выделенные из СМЖ. В кластер II вошли СТ 146 (серотип 6В), выделенный из носоглотки, СТ 235( серотип 20) и СТ 1227, в который вошел штамм се-ротипа 14, выделенный из носоглотки, и для данного штамма была характерна мультирезистентность к пенициллину и эритромицину. В кластер III вошли СТ 3750, включающий штамм серотипа 18С, выделенный из СМЖ, СТ 490, включающий штамм серотипа 6В, выделенный из носоглотки, СТ 7196, в который вошел штамм, выделенный из СМЖ, серотипа 17F, СТ 3104, включающий штамм из носоглотки серотипа 9N, и СТ 517 ( штамм серотипа 9L), выделенный из СМЖ. Таким образом, сиквенс типы исследуемых пневмококков имели тесное филогенетическое родство, несмотря на то, что они характеризовались генетическим разнообразием и гетерогенной структурой.

Алгоритм идентификации возбудителей гнойного бактериального менингита

Рисунок 7. Алгоритм идентификации возбудителей гнойного бактериального менингита. Примечания: мПЦР- мультиплексная полимеразная цепная реакция; ПЦР РВ- полимеразная цепная реакция в реальном времени; МЛСТ- мультилокусное сиквенс типирование; СТ-сиквенс тип; ДЦМ- диско-диффузионный метод; МИК - минимальная ингибирующая концентрация; АБП - антибактериальные препараты.

Предложен оптимизированный алгоритм идентификации возбудителей бактериального менингита (рисунок 7). Оптимизация предусматривает возможность идентификации с использованием только молекулярно-генетических методов или бактериологического и иммунохимического методов, а также их комбинации. Впервые в принятый алгоритм идентификации включена оценка антибиотикочувствительности с установлением изменений в генетических структурах возбудителей, а также проведение филогенетического анализа для оценки патогенетических особенностей возбудителей.

Выводы

1. За период 2007-2013 гг. в образцах СМЖ, полученных из стран СНГ, было выявлено 267 позитивных образцов, из них 148 образцов содержали ДНК N. meningitidis, 76 - ДНК S.pneumoniae, 43 -ДНК Н.influenzae. Среди менингококков доминирующей была серогруппа В, среди S. pneumoniae преобладала серогруппа б (6А/В), все выявленные образцы Н. influenzae были идентифицированы как серотип Ъ.

2. У 30,7% исследуемых штаммов S.pneumoniae имелась устойчивость к пенициллину, которая связана с изменениями в генах, кодирующих синтез пенициллин связывающих белков, обусловливающих чувствительность к пенициллину; 7,7% штаммов пневмококков были резистентны к эритромицину за счет присутствия генов егтВ и те/А. Среди исследуемых штаммов N. meningitides, 33,3% штаммов были резистентны к пенициллину. У 36,3% штаммов Н. influenzae наблюдалась промежуточная устойчивость к хлорамфениколу и триметоприму/сульфаметоксозолу.

3. Большинство исследуемых штаммов N. meningitidis включены в клональный комплекс ST-11 complex/ET-37 complex. Штаммы Н. influenzae распределялись на три сиквенс-типа 6, 92, 95, которые входили в клональный комплекс А1/А2. Генетическая структура популяции S. pneumoniae характеризовалась значительной гетерогенностью, все выявленные сиквенс-типы имели тесное филогенетическое родство.

4. Филогенетический анализ сходства выявленных сиквенс-типов штаммов S. pneumoniae, выделенных из СМЖ и со слизистой носоглотки, показал их тесную взаимосвязь, что свидетельствует о необходимости мониторинга штаммов, вызывающих как инвазивные, так и неинвазивные формы инфекции.

5. Для оценки патогенетической значимости возбудителей гнойного бактериального менингита разработан алгоритм идентификации инвазивных и неинвазивных штаммов с применением классических бактериологических и молекулярно-генетических методов.

Практические рекомендации

1. Для диагностики гнойного бактериального менингита, вызванного S.pneumoniae, N.meningitidis, H.influenzae, целесообразно параллельно с классическими бактериологическими методами использовать молекулярно - генетические методы, такие как ПЦР в реальном времени и мультиплексную ПЦР.

2. Для определения изменений в генах ПСБ -pbpla, pbp2x и pbp2b и определения генетических детерминант - егтВ и те/Л, ответственных за резистентность к макролидам, у штаммов S.pneumoniae целесообразно использовать метод ПЦР РВ в качестве скрининга и экспресс метода.

3. Коллекция штаммов S.pneumoniae, N.meningitidis, H.influenzae и созданный банк ДНК, выделенных из спинномозговой жидкости больных гнойным бактериальным менингитом в ряде стран СНГ, могут быть перспективными для проведения дальнейших исследований в области разработки вакцин и изучения биологических свойств данных возбудителей.

Перспективные направления дальнейшей разработки темы

Существует несколько актуальных направлений дальнейшей разработки темы. Во- первых, исследование ДНК, выделенных из спинномозговой жидкости детей, с применением молекулярно-генетических методов для определения сиквенс-типов, клональных комплексов и детерминант, ответственных за антибиотикорезистент-ность, позволит полноценно охарактеризовать циркулирующие популяции возбудителей гнойного бактериального менингита на территориях стран СНГ. Во-вторых, актуальным является применение усовершенствованного алгоритма для изучения штаммов возбудителей гнойного бактериального менингита, выделенных со слизистой носоглотки детей, что позволит определить роль в патогенезе штаммов, вызывающих неинвазивные формы инфекции, их влияние на замещение циркулирующих патогенных штаммов после проведения вакцинации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Урбан, Ю.Н. Верификация возбудителей бактериального гнойного менингита в спинномозговой жидкости у больных детей/ Ю.Н. Урбан, В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, Е.А. Воропаева, Т.Г. Глушкевич, В.н' Яновская, Е. Ахмадова, С. Салимова, Л.И. Мосина, А. Wasley, G. Carvalho // Человек и лекарство: сборник материалов XVIII Росс. Нац. конгресса- М, 2011. - С.489

2. Слободенюк, В.В. МЛСТ-анализ сиквенс-типов (CT) штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных менингитами и носителей / В.В. Слободенюк, В.А. Алёшкин, A.B. Караулов, Е.А. Воропаева, A.B. Алешкин, М.С. Афанасьев, Ю.Н. Урбан, Е.А. Егорова // XX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Сборн. материалов конгресса. М., 15-19 апреля 2013 г.- М., 2013, С. 18-19.

3. Алешкин, В.А. Молекулярно-генетическая и филогенетическая характеристика штаммов Streptococcus pneumoniae, изолированных от пациентов с менингитами и носителей/ В.А. Алешкин, A.B. Караулов, В.В. Слободенюк-, С.С. Афанасьев, Ю.Н. Урбан, Е.В. Воропаева, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, В.А. Метельская, A.B. Алешкин, О.Г. Гречишникова, АЛ. Байракова, Ю.В. Несвижский , Е.О. Рубальский // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2013.-№ 5.-С.-53-60.

4. Афанасьев, С.С. Мониторинг сиквенс-типов штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных менингитом и носителей/ С.С. Афанасьев, В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, A.B. Караулов, Е.А. Воропаева, A.B. Алешкин, М.С. Афанасьев, Ю.Н. Урбан, Е.А. Егорова// Аллергология и иммунология. -

2013. - Т. 14, №1. - С.40-41.

5. Урбан, Ю.Н. Выявление основных возбудителей бактериального гнойного менингита методом ПЦР в реальном времени / Ю.Н. Урбан, Е.А. Егорова, В.В. Слободенюк, С.С. Афанасьев// Инфекция и иммунитет. Материалы международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций». - Санкт-Петербург, 2013. - Т.З, №2 - С. 181.

6. Урбан, Ю.Н. Молекулярно-генетическая и филогенетическая характеристика штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных менингитом и носителей/ Ю.Н. Урбан, Е.А. Егорова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, М.С. Афанасьев, А.Н. Оганесян // Молекулярная диагностика- 2014. Сборник трудов VIII всероссийской научно-практической конференции с международным участием -М 2014 -Т.1-С.416.

7. Урбан, Ю.Н. Молекулярно-генетическая, фенотипическая и филогенетическая характеристики штаммов Streptococcus pneumoniae в оценке их эпидемиологической роли/ Ю.Н. Урбан, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, A.B. Караулов, Е.А. Егорова, М.С. АфанасьевЮ Н.С. Несвижский, A.B. Алешкин, А.Н. Оганесян, А.Д. Воропаева// Астраханский медицинский журнал -

2014.-Т.9,№1 -С. 83-92.

8. Afanasiev, S.S. Genotyping of the pathogens isolated from children vvith bacterial meningitidis / S.S. Afanasiev, V.V. Slobodenyuk, J.Urban, E.A. Voropaeva, V.A. Alyshkin, E.A. Egorova, V.A. Metelskaia, O.G. Grechishnicova, M.S. Afanasiev // 29th Annual Meeting of the European society for paediatric infectious diseases, 7-11 June 2011 / Hague. Netherlands/-2011. - P. 120

9. Slobodenuk, V.V. Multiplex genotyping of Streptococcus pneumoniae strains isolated from children with meningitis and pathology of respiratory tract/ V.V. Sloboden-yuk, E.A. Voropaeva, V.A. Alyshkin, S.S. Afanasiev, J.N. Urban, E.A. Egorova, A.V. Kar'aulov, O.G. Grechishnicova, M.S. Afanasiev// FEMS 4-th Congress of Europen Microbiologist,26-30 June 2011 / Geneva, Switzerland / - 2011. - P. 145.

10. Aleshkin, V.A. Molecular genetic and phylogenetic characteristic of Streptococcus pneumoniae strains isolated from patients with meningitis and carriers/ V.A. Aleshkin, V.V. Slobodenyuk, E.A. Voropaeva, S.S. Afanasiev, J.N. Urban, E.A. Egorova, A.V. Karaulov, O.G. Grechishnicova, M.S. Afanasiev // 27 the International Congress of pediatrics 2013(ICP).- 24-29 August 2013 / Melbourne, Australia. - 2013. - P. 476.

Список сокращений

АБП- антибактериальные препараты

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ГБМ -гнойный бактериальный менингит

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КК- клональный комплекс

МИК- минимальная ингибирующая концентрация

МЛСТ - мультилокусное сиквенс типирование

гПУП- генетически промежуточно пенициллин устойчивый

гПУ- генетически пенициллин устойчивый

гПЧ- генетически пенициллин чувствительный

мПЦР- мультиплексная полимеразная цепная реакция

ПЦР РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени

РРЛ-региональная референс лаборатория

СМЖ- спинно-мозговая жидкость

СТ- сиквенс тип

CLSI-(Clinical and Laboratory Standarts Institute) - Институт клинических и лабораторных стандартов

Hib- Н. influenza серотипа b

NT- нетипируемый пневмококк

Подписано в печать: Тираж: 100 экз. Заказ № 1211 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; \v\vw.reglet.ru