Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеазная активность клинических штаммов клебсиелл, связанная с инактивацией секреторного иммуноглобулина А

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Агапова, Ольга Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Klebsiella pneumoniae как возбудители внутрибольничной инфекции.

1.2. Факторы патогенности Klebsiella pneumoniae и их генетический контроль.

1.3. Ферменты патогенности и их роль в развитии инфекционного процесса.

1.3.1. IgA-протеазная активность различных видов бактерий.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Используемые штаммы, среды.

Микробиологические методы.

2.1. Определение IgA-протеазной ■ активности клинических изолятов Klebsiella pneumoniae.

2.2. Определение чувствительности к антибиотикам.

Генетические методы.

2.3. Конъюгативный перенос плазмид.

2.4. Анилиз штаммов на наличие плазмидной ДНК и условия проведения электрофореза в агарозном геле.

2.5. Выделение плазмидной ДНК.

Молекулярно-генетические методы.

2.6. Элиминация плазмид из штаммов K.pneumoniae.

2.7. Методика использования случайной амплификации полиморфной ДНК (RAPD-типирование) применительно к бактериям рода Klebsiella.

2.8. Полимеразная цепная реакция.

Методы изучения персистентных свойств штаммов с плазмидой SlgA-протеазной активности и без нее в модельных опытах in vivo и in vitro.

2.9. Внутрибрюшинное заражение белых мышей.

2.10. Культура клеток Нер-2.

2.11. Культура перитонеальных макрофагов морской свинки.

2.12. Определение патоморфологических изменений во внутренних органах при внутрибрюшинном заражении мышей.

Методы статистического анализа.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Коллекция клинических штаммов Klebsiella pneumoniae и их общая характеристика.

3.2. Частота встречаемости SIgA-протеазной активности среди клинических изолятов K.pneumoniae.

3.3. Выявление генов, контролирующих SIgA-протеазную активность, у штаммов Klebsiella pneumoniae.

3.4. Распространение SIgA-протеазной активности среди клинических штаммов различных видов бактерий.

3.5. Внутривидовая дифференциация с использованием RAPD-типирования

SIgA-протеолитических штаммов Klebsiella pneumoniae.

3.6. Маркеры антибиотикорезистентности госпитальных штаммов Klebsiella pneumoniae.

3.7. Природа генетического контроля SIgA-протеазной активности.

3.7.1. Передача плазмиды, несущей маркеры SIgA-протеазной активности в конъюгативном скрещивании.

3.8. Роль плазмиды (pSIgA) в развитии инфекционного процесса.

3.8.1. Изучение плазмиды (pSIgA), на модели культуры клеток Нер-2.

3.8.2. Изучение роли плазмиды (pSIgA), на модели перитонеальных макрофагов морской свинки.

3.8.3 Изучение роли плазмиды (pSIgA), в развитии инфекционного процесса при внутрибрюшинном заражении мышей генетически связанной парой S.typhimurium.

3.9. Модель генерализованной клебсиеллезной инфекции на белых мышах.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протеазная активность клинических штаммов клебсиелл, связанная с инактивацией секреторного иммуноглобулина А"

Актуальность проблемы.

В последние годы наблюдается изменение этиологической структуры инфекционной заболеваемости. Расширяется спектр острых и хронических заболеваний, вызываемых условно патогенными бактериями, среди которых одно из ведущих мест занимают капсульные энтеробактерии представители рода Klebsiella, в частности K.pneumoniae. Клебсиеллы выявляются при урологических, менингеальных, токсикосептических и кишечных инфекциях [24, 29, 30,76, 93,115,177].

Чаще всего K.pneumoniae выступают как возбудители внутрибольничной инфекции. Внутрибольничные инфекции, обусловленные K.pneumoniae, возникают в родовспомогательных учреждениях, реанимации, в отделениях для недоношенных и интенсивной терапии, в урологических и хирургических клиниках. [5, 32, 34, 45,46].

Вышесказанное в значительной мере происходит из-за нарушения экологического баланса между макроорганизмом и его микрофлорой, что обусловлено, в основном, следующими моментами: 1) распространением антибиотикоустойчивых штаммов вследствие недостаточно контролируемого использования антибиотиков; 2) токсическим воздействием факторов напряженной экологической обстановки; 3) развитием дисбиотических состояний; 4) увеличением числа лиц с врожденными или вторичными иммунодефицитами (хронические больные, новорожденные, недоношенные дети, онкологические больные, оперированные и др.) [12].

Клинические штаммы клебсиелл еще недостаточно изучены. Данные об их биологических и патогенных свойствах практически отсутствуют. Клебсиеллезные инфекции обычно не распознаются и проходят под другими диагнозами. Современная лабораторная диагностика базируется на

-4 традиционных способах обнаружения клебсиелл бактериологическим и серологическим методами. Маркирование изолируемых штаммов при недостаточном количестве диагностических препаратов и сывороток ведет к проблемам при расшифровке их этиологической значимости. Увеличение числа заболеваний клебсиеллезной этиологии, характеризующихся затяжным течением, хронизацией процесса, бактерионосительством и высокими показателями летальности, диктует необходимость разработки новых подходов в реализации диагностических задач в борьбе с этой патологией [10, 30, 33].

Так как представители рода Klebsiella относятся к группе условно патогенных бактерий, требуются доказательства этиологической роли клинических штаммов K.pneumoniae в развитии инфекционного процесса. Одним из доказательств является установление их патогенных свойств.

Факторы патогенности клинических штаммов K.pneumoniae, связанные со способностью колонизировать эпителий открытых полостей организма и противостоять его защитным механизмам, только начинают изучаться. В последние годы среди изучаемых факторов патогенности наибольшее внимание приобретают секретируемые факторы бактериальной природы, направленные на инактивацию защитных сил хозяина. Известно, что многие виды условно патогенных бактерий, рассматриваемые в качестве транзиторных представителей нормальной микрофлоры кишечника, способны к синтезу разнообразных протеолитических ферментов, которые нередко относят к факторам их потенциальной патогенности. В литературе имеются данные о частоте встречаемости штаммов клебсиелл, способных продуцировать лецитиназу, ДНК-зу , РНК-зу, фосфатазу, каталазу, роль которых в проявлении вирулентности бактерий требует детального исследования [37,38].

В настоящее время внимание исследователей обращено на факторы патогенности бактерий, принимающих участие на первых этапах развития инфекционного процесса. Сюда относят адгезивную и протеолитическую активность [13, 14, 16].

Адгезивная активность патогена рассматривается как пусковой момент развития инфекционного процесса, его способность закрепиться в месте прикрепления. Далее колонизация эпителия во многом зависит от способности патогена противостоять факторам иммунной защиты слизистых. Адгезивная активность клебсиелл достаточно хорошо изучена, что же касается ферментов патогенности, связанных с осуществлением возбудителем инактивации бактерицидных компонентов слизистых, то информация по обнаружению у клинических изолятов ферментов, расщепляющих иммуноглобулин, ДНК, РНК и другие компоненты эукариотических клеток практически отсутствует.

Как известно, адгезия бактерий к слизистым и последующая колонизация открытых полостей осуществляется за счет способности патогена подавлять защитные механизмы, обеспечивая себе возможность роста и развития. Одно из условий существования микроба на слизистых поверхностях хозяина является его способность к продукции ферментов, деградирующих секреторный иммуноглобулин A (SIgA) [125]. IgA-протеазы следует, по-видимому, рассматривать как фактор патогенности возбудителя [153]. В пользу этого положения свидетельствует способность бактериальных IgA-протеаз защищать микробные клетки от иммунной системы хозяина, так как секреторный иммуноглобулин А является одним из основных факторов местного иммунитета слизистых оболочек [174].

Наиболее полно роль и молекулярно-биологические свойства IgA-протеаз изучены у патогенных бактерий: Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus sanguis, S.pneumoniae [155]. Они обнаруживаются у условно патогенных бактерий рода Proteus, Klebsiella, Serratia, у E.coli, вызывающих инфекционные процессы на слизистых.

К сожалению, исследований по IgA-протеазной активности энтеробактерий проведено очень мало. С этих позиций мы сочли важным установить наличие данной активности у клинических изолятов K.pneumoniae и определить ее роль в развитии инфекционного процесса.

Цель и задачи исследования.

Цель работы - изучить способность клинических штаммов К.рпешпошае инактивировать секреторный иммуноглобулин (Б^А), исследовать природу генетического контроля этого явления и возможную роль в развитии инфекционного процесса.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Создать коллекцию клинических штаммов К.рпешпошае, выделенных в роддомах и детских стационарах некоторых городов России с учетом локализации патологического процесса.

2. Осуществить скрининг клинических штаммов клебсиелл, способных инактивировать и определить частоту встречаемости протеолитического фермента в зависимости от тропности клинического изолята.

3. Определить связь между Б^А-протеазной активностью и наличием у бактерий К.рпешпошае сложных плазмид.

4. Провести генотипирование Б^А-протеазных штаммов с помощью метода случайной амплификации полиморфной ДНК (КАРО-типирования).

5. С помощью ПЦР определить наличие консервативных нуклеотидных последовательностей 1§а-гена в структуре конъюгативных Я-плазмид и у бактерий различных таксономических групп, выделенных при гнойной воспалительной инфекции с различной локализацией патологического процесса.

6. На генетических связанных парах штаммов, отличающихся по наличию 8^А-протеазной активности, определить роль плазмиды, детерминирующей изучаемый признак, в развитии инфекционного процесса.

Научная новизна.

Установлено, что клинические штаммы K.pneumoniae в 58,6+4,7% случаев характеризуются способностью инактивировать SIgA.

Впервые показано, что гены, детерминирующие признак SIgA-протеазной активности входят в состав сложной R- плазмиды.

Продемонстрирована роль плазмиды, которая детерминирует SlgA-протеазную активность, в развитии персистентной клебсиеллезной инфекции.

Показана перспективность эпидемиологического маркирования различных клинических штаммов клебсиелл по профилю случайно-амплифицированной ДНК.

Отработаны методы (РАГА, ПЦР) для определения у клинических штаммов различных видов бактерий SIgA-протеазной активности.

Практическая значимость работы.

Целесообразность выявления SIgA-протеазной активности у клинических штаммов клебсиелл определяется способностью таких изолятов обуславливать формирование затяжного инфекционного процесса. Для тестирования SlgA-протеолитических госпитальных штаммов клебсиелл предложен быстрый метод скрининга большого числа изолятов в очаге клебсиеллезной инфекции и эпидемиологического маркирования изолятов с помощью полимеразной цепной реакцией и RAPD-типирования. 8

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Агапова, Ольга Валерьевна

ВЫВОДЫ.

1. При изучении 186 клинических штаммов К.рпеитошае Б^А-протеазная активность обнаружена у 109 (58,6%) изолятов. Среди штаммов, выделенных при респираторной инфекции и уроинфекции, частота встречаемости этого признака составила 84,2% и 94,4%, среди штаммов, изолированных от больных с пневмонией, токсикосептицемией и острой кишечной инфекцией - 40,6%, 60,0% и 22,7%.

2. Разработана ПЦР тест-система, позволяющая выявлять консервативные последовательности ДНК 1§а-гена как у штаммов К.рпеитошае, так и у бактерий других таксономических групп, изолированных при гнойно-воспалительных процессах.

3. Впервые у клинических штаммов К.рпеитошае обнаружена конъюгативная плазмида м.м. 100 МБ, контролирующая способность

-104

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Агапова, Ольга Валерьевна, Москва

1. Акимкин В.Г. Нозокомиальный сальмонеллез как самостоятельная нозологическая форма инфекционной патологии человека. // Журн. микробиол. 1998. №4. С. 106-110.

2. Акимкин В.Г., Беляков В.Д. Сальмонеллезная инфекция в крупном многопрофильном стационаре. // Журн. микробиол. 1996. №6. С. 32 36.

3. Аксенов М.Ю., Гаровников Ю.С., Левина Г.А. и др. Использование метода полимеразной цепной реакции для изучения процесса перехода клеток Salmonella typhimurium в некультивируемое состояние. // Журн. микробиол. 1994. №2. С 17-20.

4. Ахунов Э.Д., Бондаренко В.М., Туйгунов М.М. и др. Использование случайной амплификации полиморфной бактериальной ДНК для типирования бактерий рода Citrobacter. // Журн. микробиол. 1998. №4. С. 61 63.

5. Березина JI.A., Ценева Т.Я, Бойков С.Т. и др. Частота встречаемости и характеристика штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных при инфекциях новорожденных. //Журн. микробиол. 1995. №5. С. 18.

6. Белая Ю.А, Белая О.Ф. Вирулентность энтеробактерий и иммунитет. // Журн. микробиол. 1996. №4. С. 108 112.

7. Бойко А.В., Бойко О.В. Рибонуклеазная активность бактерий как фактор персистенции некоторых возбудителей сапронозных инфекций. // Журн. микробиол. 1997. №4. С. 71 73.

8. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса. // Журн. микробиол. 1999. №5. С.36 39.

9. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно патогенных бактериях. // Журн. микробиол. 1997. №4. С. 20 26.- 105

10. Бондаренко В.М., Боев Б.В. Применение компьютерных технологий при оперативном анализе вспышек внутрибольничных инфекций. // Журн. микробиол. 1999. №3. С. 20 26.

11. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры. // Вестник РАМН. 1997. №3. С. 7-10.

12. Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Потатуркина-Нестерова Н.И. Проблема патогенности клебсиелл. //Ульяновск. 1996. 132 с.

13. Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Яблочков A.JI. Антилизоцимный фактор Klebsiella pneumoniae: природа, биологические функции и генетический контроль. // Журн. микробиол. 1994 (приложение). С. 22 28.

14. Бондаренко В. М., Пархоменко JI. В., Ковальчук В. К. Секретируемые про-теолитические ферменты Proteus mirabilis. // Журн. микробиол. 1993. № 2. С. 41-47.

15. Бондаренко В.М., Яблочков А.Л., Романова Ю.М. Характеристика плаз-миды Klebsiella pneumoniae, несущей маркеры лекарственной устойчивости и антилизоцимной активности. //Журн. микробиол. 1988. №3. С. 28 32.

16. Бондаренко В.М., Wu Gang, Баркус М.М. Адгезивная активность клинических штаммов клебсиелл. // Журн. микробиол. 1986. №2.С. 104 109.

17. Бухарин О.В. Персистенция бактериальных патогенов как результат отношений в системе паразит-хозяин. //Журн. микробиол. 1997. №4. С. 3 -9.

18. Бухарин О.В. Медицинские аспекты персистенции бактерий. // Журн. микробиол. 1994. №4. С. 11 18.

19. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект). // Екатеринбург: УрО РАН. 1996.

20. Вишнякова Л.А., Резцова Ю.В. Сопоставление вирулентности для мышей и ферментативной активности штаммов Streptococcus pneumoniae. // Журн. микробиол. 1991. №5. С. 19-21.

21. Гинцбург А.Л. Генодиагностика инфекционных заболеваний. // Журн. микробиол. 1998. №3. С. 86 95.- 106

22. Гостева В.В., Бондаренко В.М., Корягина И.П., Клицунова Н.В. Адгезия Klebsiella pneumoniae на эпителиоидных клетках in vitro. // Журн. микро-биол. 1984. №3. С. 32-35.

23. Грабовецкий В.В., Игнатов К.Б., Чистякова Л.Г. и др. Выявление генов, контролирующих энтеротоксигенность, у штаммов Staphylococcus aureus с помощью полимеразной цепной реакции. //Журн. микробиол. 1995. № З.С. 75 -78.

24. Дмитриева Т.Б. Состояние здоровья населения Российской Федерации и задачи органов и учреждений здравоохранения.// Журн. микробиол. 1997 №6. С. 3 6.

25. Домарадский И.В. Вирулентность бактерий как функция адаптации. // Журн. микробиол. 1997. №4. С. 16 20.

26. Езепчук Ю.В. Патогенность как функции биомолекул. // Москва. «Медицина». 1985. 237 С.

27. Еремин С.Р., Зуева Л.П., Ланцов A.A. и др. Эпидемиологические особенности госпитальных гнойно-септических инфекций в отоларингологических отделениях. //Журн. микробиол. 1992. №3. С. 36.

28. Калнин К.В. Роль R-плазмид в формировании свойств госпитальных штаммов энтеробактерий. // Автореф.диссерт.канд.мед.наук., 1993.

29. Красноголовец В.Н., Киселева Б.С. Клебсиеллезные инфекции. // Москва «Медицина». 1996.

30. Лившиц МЛ., Брусина Е.Б. Госпитальные инфекции: проблемы и пути решения. // Журн. микробиол. 1992. №1. С. 22.

31. Макарова Г.А., Бошняков Р.Х., Петров П.К. и др. Применение полимеразной цепной реакции для идентификации Helicobacter pylori в клиническом материале. // Молекулярная генетика, вирусология и микробиология. 1994. №1. С. 10-20.

32. Мусина Л.Т., Гладкова К.К., Семина Н.А. и др. Оценка внутривидового маркирования Klebsiella pneumoniae в эпидемиологическом анализе внутрибольничной вспышки. //Журн.микробиол. 1995. №6. С. 41.

33. Петровская В.Г., Бондаренко В.М. Роль хромосомы и ее взаимодействия с внехромосомными детерминантами в процессе генетического контроля па-тогенности бактерий. // Молекулярная генетика, вирусология и микробиология. 1994. №5. С. 3-8.

34. Петровская В.Г., Бондаренко В.М. Общие принципы генетического контроля патогенности бактерий // Журн. микробиол. 1994. №3. С. 106 110.

35. Поликарпов Н.А., Шилов В.М., Зубков М.Н., и др. Биологические свойства условно патогенных энтеробактерий, выделенных от здоровых людей и соматических больных с дисбактериозом кишечника. // Журн. микробиол. 1986. №2. С. 34-38.

36. Поликарпов Н.А., Шилов В.М., Красноголовец В.Н и др. Биологические свойства условно патогенных энтеробактерий, выделенных из крови больных. //Журн. микробиол. 1985. №10. С. 15 19.

37. Романова Ю.М. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий на модели Salmonella typhimurium: феномен и генетический контроль. // Ав-тореф.дисс.докт.мед.наук., Москва. 1997.

38. Романова Ю.М, Гинцбург А.Л. Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1999. №2. С. 22 29.

39. Руднев И.А., Бондаренко В.М. Тиолзависимые гемолизины как факторы патогенности клебсиелл. //Журн. микробиол. 1993. №6. С. 31.

40. Семина Н.А, Прямухина Н.С, Жилина Н.Я. Заболеваемость внутрибольничными инфекциями в Российской федерации. // Журн. микробиол. 1995. №2. С. 30-35.- 10843. Сурикова E.B. Факторы персистенции клебсиелл. // Авто-реф.дисс.канд.мед.наук, Оренбург. 1992.

41. Тимаков В. Д., Кудлай Д.Г., Петровская В.Г. Ферментативная активность бактерий в связи с их вирулентностью. // Журн. микробиол. 1968. №3, С. 3 -16.

42. Тиссо-Геррас Р., Сетр Ж.С., Мьел С. и др. Госпитальная инфекция в родильных домах. // Журн. микробиол. 1995. №4. С. 35 39.

43. Фролов В.М., Ющук Н.Д., Пересадин H.A. Клинико-иммунологические особенности и лечение кишечной инфекции клебсиеллезной этиологии. // Журн. микробиол. 1994. №4. С.22 25.

44. Чернохвостова Е. В. Местный иммунитет и микробные IgA-протеазы. // Журн. микробиол. 1987. № 6. С. 104 110.

45. Шакирова Р. Г., Герман Р. П., Чернохвостова Е. В. IgA-протеазная активность микробов рода Bordetella. // Журн. микробиол. 1985. №7. С. 10-13.

46. Arredondo-Garsia J.L., Delia D.R., Solozzano-Saltos F., et al. Neonatal septicaemia due to Klebsiella pneumoniae in newborn infants. // Rev. Latinoamer. Microbiol. 1992. Vol.34. No.l. P. 11 16.

47. Bachovchin W.W., Plaut A.G., Flentke G.R. Inhibition of IgAl proteases from Neisseria gonorrhoeae and Haemophilus influenzae by peptide prolyne boronic acids. // J. Biol. Chem. 1990. Vol.265. P. 3738 3743.

48. Birnboim H.C., Doly J. A rapid at alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmidDNA. //Nucleic. Acids. Res. 1979. Vol.7. P. 1529 1538.

49. Brown N. Opportunist pathogens in hospitals all change please. // Microbiol. Today. 1999. Vol. 26. P. 105 - 108.

50. Brunder W., Schmidt H., Karch H. EspP, a novel extracellular serine protease of enterohaemorrhagic E.coli 0157:H7 cleaves human coagulation factor V. // Mol. Microbiol. 1997. Vol.24. P. 767 778.

51. Bond J.S., Butler P.E. Intracellular proteases. // Annu. Rev. Biochem. 1987. Vol.56. P. 333 -364.

52. Bricker J., Mulks M.H., Moxon E.R. Physical and genetic analysis of DNA regions encoding the immunoglobulin A proteases of different specificities produced by Haemophilus influenzae. // Infect, and Immun. 1985. Vol.47. P. 370 -374.

53. Bricker J., Mulks M.H., Plaut A.G., et al. IgAl proteases of Haemophilus influenzae: cloning and characterization in Escherichia coli K-12. // Infect, and Immun. 1983. Vol.80. No.9. P. 2681 2685.

54. Chowhury M.A., Miyoshi S., Shinoda S. Vascular permeability enhancement by Vibrio mimicus protease and the mechanisms of action. // Microbiol. Immunol. 1991. Vol. 35. P. 1049- 1058.

55. Cole M.F., Hsu M.J. Natural transmission of Streptococcus sobrinus in rats: saliva and serum antibody responses to colonization. // Infect, and Immun. 1992. Vol. 60. P.778 783.

56. Cordero jL, Leona W.A., Davis K. Neonatal airway colonization with gramnegative bacilli: association with severity of bronchopulmonary dysplasia. // Pe-diatr. Infect. Dis. J. 1997. Vol.16. No.l. P. 18 23.

57. Cordero 1., Davis K., Morehead S., et al. Factors affecting microbial colonization of the trachea and septicaemia in mechanically ventilated neonates. // Res-pir. Care. 1993. Vol.38. P.1355 1363.

58. Czupryncki C.J. Virulence mechanisms of bacterial pathogens. // Ed. J. A. Roth. Washington. 1988. P. 141 160.

59. Dagan R., Shrikep O., Hozan J., et al. Prospective study to determine clinical relevance of detection of pneumococcae DNA in sera of children by PCR. // J. Clinical microbiol. 1998. Vol.36. No.3. P. 669 674.

60. Dale B., Dragon E.A. Polymerase chain reaction in infectious disease diagnosis. //Lab. Med. 1994. Vol.25. P. 637-641.

61. Darfeuille-Michaud A., Jallat C., Aubel D., et al. R-plasmid-encoded adhesive factor in Klebsiella pneumoniae strains responsible for human nosocomial infections. // Infect, and Immun. 1992. Vol.60. P. 44 55.

62. Derrier A., Fach P. Salmonella DNA persistence in natural seawaters using PCR analysis. // International J.Antimicrobial. 1997. Vol.8. No.2. P. 507 511.

63. Dery K.J., Chavideh R., Waters V., et al. Characterization of the replication and mobilization regions of the multiresistance Klebsiella pneumoniae plasmid pJHCMWl. //Plasmid. 1997. Vol.38. No.2. P. 97 107.

64. Domenico P., Straus D.C. Extracellular polysaccharide production by Klebsiella pneumoniae and its relation to virulence. // Canad. J.Microbiol. 1985. Vol.32. P. 472-478.

65. Duguid R., Senior B.W. The effect of fluoride on Streptococcus sanguis 7863 IgAl protease production and activity.// Archives of oral biology. 1997. Vol.42. No.10-11. P. 821 -827.

66. Eidt S., Schrappe M., Kruis W. Molecular biology in diagnosis and epidemiology of Helicobacter pylori: PCR for the detection and AP-PCR for characterization of patient isolates. // Zentralblatt fur Bacteriolog. 1997. Vol.285. No.3. P.368 379.

67. Eisen D., Russel E.G., Tumms et al. Random amplified polymorphic DNA and plasmid analyses used in investigation of an outbreak of multiresistant Klebsiella pneumoniae. // J. Clin. Microbiol. 1995.Vol.33. No.3. P. 713 717.- Ill

68. Feldman C., Smith C., Levy H., et al. Klebsiella pneumoniae bacteriaemia at an urban general hospital. // J. Infect. 1990. Vol.20. P. 21-31.

69. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Chang Y. Vibrio cholerae hemagglutinin protease, colonial variation, virulence, and detachment. // Infect, and Immun. 1992. Vol.60. P. 472 478.

70. Frandsen E.V., Reinholdt J., Kyeldsen M. Characterization of the Streptococcus pneumoniae immunoglobulin Al protease gene (iga) and translation product. // Infect, and Immun. 1996. Vol. 10. P. 3957 3966.

71. Frandsen E.V., Reinholdt J., Kyeldsen M. Differentiation of human capnocy-tophaga species by multilocus enzyme electrophoretic analysis and serotyping of immunoglobulin Al proteases. // Microbiology. 1996. Vol.10. No.2. P. 441 -448.

72. Franklin R.B., Taylor D.R., Mills A.L. Characterization of microbial communities using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). // J. Microbiol. Methods. 1999. Vol.35. P. 225 235.

73. Fujiyama Y., Iwaki K., Hodohara K., et al. The site of cleavage in human alpha chains of IgAl and IgA2: A2m(l) allotipe paraproteins by the clostridial IgA protease. // Mol. Immunol. 1986. Vol. 23. P. 147 150.

74. Garcia D.L., Jorre M., Romero-Vivas J., et al. Klebsiella bacteriaemia; an analysis of 100 episodes. //Rev. Infect. Dis. 1985. Vol.7. No.2. P. 143 150.

75. Gilbert J. V., Plaut A.G. Detection of IgA protease activity among multiple bacterial colonies. //J.Immunol.Methods. 1983. No.57. P.247-251.- 112

76. Gilbert J.V., Plaut A.G., Longmaid B., et al. Inhibition of microbial IgA proteases by human secretory IgA and serum. // Mol. Immunol. 1983. Vol.20. P. 1039 1049.

77. Gilbert J. V., Plaut A.G., Fishman Y. et al. Cloning of gene encoding streptococcal immunoglobulin A protease and its expression in Escherichia coli. // Infect. and Immun. 1988. Vol.56. No.8. P. 1961 1966.

78. Gilbert J.V., Plaut A.G., Wright A. Analysis of the immunoglobulin A protease gene of Streptococcus sanguis // Infect, and Immun. 1991. Vol.59. No.l. P.7 -17.

79. Gordon V.M., Leppla S.H. Proteolytic activation of bacterial toxins: role of bacterial and host cell proteases. // Infect, and Immun. 1994. Vol.62. No.2. P. 333 -340.

80. Grundy F.J., Plaut A., Wright A. Haemophilus influenzae immunoglobulin Al protease genes: cloning by plasmid integration-excision, comparative analyses, and localization of secretion determinants. // J.Bacteriol. 1987. Vol.169. No. 10. P. 4442 4450.

81. Hedges S.R., Mayo M.S., Kallman L. et. al. Evaluation of immunoglobulin Al (IgAl) protease and IgAl protease inhibitory activity in human female genital infection with Neisseria gonorrhoeae. // Infect, and Immun. 1998. Vol.66. P.5826 5832.

82. Halter R., Pohlner J., Meyer T.F. IgA protease of Neisseria gonorrhoea: isolation and characterization of the gene and its extracellular product. // EMBO J. 1984. Vol.7. P. 1595 1601.

83. Hase C.C., Finkelstein R.A. Bacterial extracellular zinc-containing metalloprote-ases. // Microbiol. Rev. 1993. Vol.57. P. 823 837.

84. Hauck C.R., Meyer T.F. The lysosomal/phagosomal membrane protein h-lamp-1 is a target of the IgAl protease of Neisseria gonorrhoea. // FEBS Lett. 1997. Vol.405. P. 86 90.

85. Henderson B., Poole S., Wilson M. Bacterial modulins: a novel class of virulence factors which cause host tissue pathology by inducing cytokine synthesis. // Microbiol. Rev. 1996. Vol.60. No.2. P. 316 341.

86. Higaki M., Chida T., Hideko T., et al. Cytotoxic components of Klebsiella oxytoca on Hep-2 cells. // J. Microbiol. Immunol. 1990. Vol.34. No.2. P. 147 -151.

87. Highsmith A.R., Jarvis W.R. Klebsiella pneumoniae: selected virulence factors that contribute to pathogenicity. // Infect. Control. 1985. Vol.6. P. 75-77.

88. Hueck C.J. Type III Protein Secretion Systems in bacterial Pathogens of animals and plans. // MMBR. 1998. Vol.62. No.2. P. 379 473.

89. Insel R.A., Allen P.Z., Berkowitz I.D. Types and frequency of Haemophilus influenzae IgAl proteases. // Semin. Infect. Dis. 1982. - Vol.4. - P. 225 - 231.

90. Jarvis W.R., Munn V.P., Highsmith A.K., et al. The epidemiology of nosocomial infections caused by K.pneumoniae. // Infect. Contr. 1985. Vol.6. No.2. P. 68-79.

91. Johannsen D.B., Johnston D.M., Koymen H.O. A Neisseria gonorrhoeae immunoglobulin Al protease mutant is infectious in the human challenge model of urethral infection. // Infect, and Immun. 1999. Vol.67. No.6. P. 3009 3013.

92. Josephson K.L., Gerba C.P., Pepper J.L. Polymerase chain reaction detection of nonviable bacterial pathogens. // Appl. Envir. Microbiol. 1994. Vol.60. P. 3292 -3299.

93. Kado C.I., Lui S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small Plasmides. // J. Bacteriol. 1981. Vol. 145. No.3. P. 1365 1373.

94. Kil K.S., Darouiche R.O., Hull R.A., et al. Identification of a Klebsiella pneumoniae strain associated with nosocomial urinary tract infection. // J. Clin. Microbiol. 1997. Vol.16. No.7. P. 2370 2393.

95. Kilian M. Degradation of immunoglobulins AI, A2, and G by suspected princi- 114 pal periodontal pathogens. // Infect, and Immun. 1981. Vol.34. P. 757 765.

96. Kilian M., Holmgren K. Ecology and nature of immunoglobulin Al protease-producing streptococci in the human oral cavity and pharynx. // Infect, and Immun. 1981. Vol.31. P. 868-873.

97. Kilian M., Mestecky. J., Russell M.W. Defense mechanisms involving Fc-dependent functions of immunoglobulin A and their subversion by bacterial immunoglobulin A proteases. // Microbial Rev. 1988. Vol.52. P. 296 303.

98. Kilian M., Mestecky J., Schrohenholer R.E. Pathogenic species of genus Haemophilus and Streptococcus pneumoniae produce immunoglobulin Al protease. // Infect, and Immun. 1979. Vol. 26 No.l. P. 143 149.

99. Kim J.Y., Lim C.M., Koh Y., et al. A case of superior vena cava syndrome caused by Klebsiella pneumoniae. // European respiratory journal, 1997. Vol.10. No.12. P. 2902-2904.

100. Kontani M., Kimura S., Nakagawa I., et.al. Adherence of Porphiromonas gingi-valis to matrix proteins via a fimbrial cryptic receptor exposed by its own argin-ine-specific protease. //Mol. Microbiol. 1997. Vol.24. P. 1179 1187.

101. Koomey J.M., Falkow S. Nucleotide sequence homology between the immunoglobulin Al protease genes of Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, and Haemophilus influenzae. // Infect, and Immun. 1984. Vol. 43. P. 101 107.

102. Kunin C.M. Resistance to antimicrobial drugs a worldwide calamity. // Ann. Intern. Med. 1993. Vol.118. P.557 - 561.

103. Labib R.S., Calvanico N.J., Tomasi T.B. Studies on extracellular proteases of Streptococcus sanguis: purification and characterization of a human IgAl specific protease. // Biochim. Biophys. Acta. 1978. Vol.526. P. 547 559.

104. Lan L. Ayala. P., Larson J., et al. The Neisseria type 2 IgAl protease cleaves LAMP1 and promotes survival of bacteria within epithelial cells. // Mol. Microbiol. 1997. Vol.24. No.5. P. 1083-1094.

105. Leon C., Alvarez-Lerma F. Nosocomial bacteriaemia in critical III patients: a multicenter study evaluating epidemiology and prognosis. // Clinic. Infect. Dis. 1997. Vol.24. P. 387 -395.-115

106. Leonard J.T., Grace M.B., Buzard G.S., et.al. Preparation of PCR products for DNA sequencing. // Biotechniques. 1998. Vol.24. No.2. P.314 318.

107. Leung W.K. Evaluation of 16S rRNA gene PCR with primers Hp.l and Hp.2 for detection of Helicobacter pylori. // J. Clinical microbiol., 1998. Vol.36. No.2. P.603 604.

108. Levy I., Leibovici L., Drucker M., et.al. A prospective study of gram-negative bacteriaemia in children. // Pediatr. Infect. Dis. J. 1996. Vol. 15. No.2. P. 117 -122.

109. Lind Brandberg L., Welinder O., Lagergard T., et.al. Evaluation of PCR for diagnosis of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis infection. // J. Clinical microbiol. 1998. Vol.36. No.3. P. 679 727.

110. Liu Y., Mee B.J., Mulgrave L. Identification of clinical isolates of indole positive Klebsiella spp., including K.planticola, and a genetic and molecular analysis of their ß-lactamases. // J. Clinical. Microbiol. 1997. Vol.16. No.7. P. 2370 2390.

111. Lomnolt H., Kilian M.L. Antigenic relationships among immunoglobulin Al proteases from Haemophilus, Neisseria, and Streptococcus species. // Infect, and Immun. 1994. Vol. 62. No.8. P. 3178 3183.

112. Loomes L.M., Senior B.W., Kerr M.A. A proteolytic enzyme secreted by Proteus mirabilis degrades immunoglobulins of the immunoglobulin Al (IgAl), IgA2, and IgG isotypes. // Infect, and Immun. 1990. Vol.58. P. 1979 1990.

113. Male C.J. Immunoglobulin Al protease production by Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae. // Infect, and Immun. 1979. Vol.26. P. 254 -261.

114. Mancuso, Standiford T.J., Marsholl T., et.al. Lipooxygenase reaction products modulate alveolar macrophage phagocytosis of Klebsiella pneumoniae. // Infect, and Immun. 1998. Vol.66. No.ll. P. 1354 1360.

115. Marcotte H., Lavoie M.C. Oral microbial ecology and the role of salivary immunoglobulin A. // MMBR. 1998. Vol.62. No.l. P.24 35.

116. Martino P., Livrelli V., Sirot D., et.al. A new fimbrial antigen harbored by CAZ-5/SHV-4-producing Klebsiella pneumoniae strains involved in nosocomial in-116fections. // Infect, and Immun. 1996. Vol.64. P. 2266 2273.

117. Mecsas J., Strauss J.E. Molecular mechanisms of bacterial Virulence: Type III Secretion and Pathogenicity Islands. // Emerging infectious Dis. 1998. Vol.2. No.4. P.271 -285.

118. Meyer K.S., Urban C. Eagen J.A., et.al. Nosocomial outbreak of Klebsiella infection resistant to late-generation cephalosporins. // Annals of internal medicine. 1993. Vol.119. No.5. P. 353 358.

119. Milazzo F. H., Delisle G.J. Immunoglobulin A proteases in gram-negative bacteria isolated from human urinary tract infections. // Infect, and Immun. 1984. Vol.43. No. 1. P. 11-13.

120. Montgomerie J.Z., Ota J.K. Klebsiella bacteremia. // Arch. Intern. Med. 1980. Vol.140. P. 525 -527.

121. Mulks M.H., Holder I.A. Bacterial enzymes and virulence. // CRC Press. Inc. Boca Raton. Fla. 1985. P. 81 104.

122. Mulks M.H and Plaut A.G. IgA protease production as a characteristic distinguishing pathogenic from harmless Neisseria. // N. Engl. J. Med. 1978. Vol.299. P. 973 976.

123. Mulks M.H., Shoberg R.J. Bacterial immunoglobulin Ai proteases. // Muller H. E. // Zbl. Bakt. J. Abt.Orig. 1971 Bd A217. P. 254 274.

124. Mulks M.H., Kornfeld S.J., Frangeione В., et al. Relationship between the specificity of IgA proteases and serotypes in Haemophilus influenzae. // J. Infect. Dis. 1982.Vol. 146. №2. P. 266 274.

125. Mulks M.H., Kornfeld S.J, and Plaut A.G. Specific proteolysis of human IgA by Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae. // J. Infect. Dis. 1980. Vol.141. №4. P. 450- 456.

126. Nawas Т., Hawvari A., Mendrix E., et.al. Phenotypic and genotypic characterization of nosocomial Staphylococcus aureus isolates from trauma patients. // J. Clinical microbiol., 1998. Vol.36. No.2. P. 414-421.

127. Pena C., Pujol M., Ricart A., et al Risk factors for faecal carriage of Klebsiella pneumoniae producing extended spectrum beta-lactamase ESBL KP in the intensive care unit. // J. Ariza, F. Gudiol. 1997. Vol.36. No.l. P. 34 40.

128. Pittet D., Tarara D., Wenzel R.P. Nosocomial bloodstream infections in critically ill patients. Excess length of stay, extra costs, and attributable mortality. // JAMA, 1994. Vol.271. P. 1598 1601.

129. Pittet D., Wenzel R.P. Nosocomial bloodstream infections. Secular trends in rates, mortality, and contribution to total hospital deaths. // Arch. Intern Med. 1995. Vol.155. P. 1177- 1184.

130. Plaut A.G. The IgAl proteases of pathogenic bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1983. Vol.37. P.603-622.

131. Plaut A.G., Gilbert J.V., Leger G., et al. IgAl protease cleaves heavy chains independently in dimeric human IgAl. // Mol. Immunol. 1985. Vol. 22. No.7. P. 821 826.

132. Plaut A. G., Gilbert J. V., Artenstein M.S., et al. Neisseria meningitidis: extracellular enzyme cleaves human immunoglobulin A. // Science. 1975. Vol.190. P. 1103 1105.

133. Pohlner J., Halter R., Beyreuther K., et al. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease. // Nature. 1987. Vol. 325. P. 458 -462.

134. Poulsen K., Brandt. J., Hjorth J.P., et al. Cloning sequencing of the immunoglobulin Al protease gene (iga) of Haemophilus influenzae serotype b. // Infect.-118and Immun. 1989. Vol.57. No.10. P. 3097 3105.

135. Poulsen K., Reinholdt.J., Boye. K., et al. A comprehensive genetic study of streptococcal immunoglobulin Al proteases: evidence for recombination within and between species. // Infect, and Immun. 1998. Vol.66. No.l. P. 181-190.

136. Quan C.P., Berneman A., Pires R., et al. Natural polyreactive secretory immunoglobulin A autoantibodies as a possible barrier to infection in humans. // Infect, and Immun. 1997. Vol.65. No.10. P. 3997 4043.

137. Rao V.K., Krasan G.P., Hendrixson D.R. // Molecular determinants of the pathogenesis of disease due to non-typable Haemophilus influenzae. // FEMS Microbiol. Rev. 1999. Vol.23. P. 99 129.

138. Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S. // Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. // MMBR. 1998. Vol.62. No.3. P. 597 635.

139. Reinholdt J. A method for titration of inhibiting antibodies to bacterial immunoglobulin Al proteases in human serum and secretions. // J. Immunol. Methods. 1996. Vol. 45. P. 1287- 1295.

140. Reinholdt J., Kilian M. Comparative analysis of immunoglobulin Al protease activity among bacteria representing different genera, species, and strains. // Infect. and Immun. 1997. Vol.65. No.ll. P. 4452-4459.

141. Reinholdt J., Tomana M., Mortensen S.B. Molecular aspects of immunoglobulin Al degradation by oral streptococci // Infect.and Immun. 1990. V.58. №5. P. 1186-1194.

142. Renegar K.B., Jackson G.D.F., Mestecky J. In vitro comparison of the biologic activities of monoclonal monomeric IgA, polymeric IgA, and secretory IgA. // J. Immunology. 1997. Vol.160. No.3. P. 1219 1224.

143. Rice L.B., Eckstein E.C., DeVente J. Ceftazidime-resistant Klebsiella pneumoniae isolates recovered at the Cleveland department of veterans affairs medical-119centre. // Clinic. Infect. Dis. 1996. Vol.23. P. 118 124.

144. Rosestraus M., Wang Z., Chang S.Y. An internal control for routine diagnostic PCR: design, properties, and effect on clinical performance. // J.Clinic, micro-biol. 1998. Vol.36. Vol.1. P. 191 197.

145. Sears C.L., Kaper J.B. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion. // Microbiol. Rev. 1996. Vol.60. No.l. P. 167 215.

146. Senior B.W., Loomes L.M., Kerr M.A. Microbial IgA proteases and virulence. // Rev. Med. Microbial. 1991. Vol.2. P. 200 207.

147. Smith D.J., King W.F., Gilbert J.V., et al. Structural integrity of infant salivary immunoglobulin A (IgA) in IgAi protease-rich environments. // Oral microbiology and immunology. 1998. Vol.13. No.2. P. 89 97.

148. Smith H. The revival of interest in mechanisms of bacterial pathogenicity. // Biol. Rev. 1995. Vol.70. P. 277 316.

149. Solar R.G., Ruiz-Echevarria M.J., Espinosa M., et al. Replication and control of circular bacterial plasmids. // MMBR. 1998. Vol.62. No.3. P. 434 464.

150. Stenberg L. ,Quis I., Lindohl G., Plaut F. G. Lack of interference between IgA-binding proteins and IgA proteases of human pathogenic bacteria. // J.Med. Microbiol. 1996. Vol. 44. P. 65-69.

151. Stenberg L., Mestecky J., Lindahl G. Molecular characterization of protein Sir, a streptococcal cell surface protein that binds both immunoglobulin A and immunoglobulin G. // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 13458 13464.

152. Svenningsen N.W., Bekassy A.N., Christensen P., et al. Nosocomial Klebsiella-120 pneumoniae infection: clinical and hygienic measures in a neonatal intensive care unit. // Scand. J. Infect. Dis. 1984. Vol.16. No.2. P. 29 35.

153. Tarkkaner A.M., Vircola R., Clegg S., et al. Binding of the type 3 fimbriae of Klebsiella pneumoniae to human endothelial and urinary bladder cells. // Infect, and Immun. 1997. Vol.65. No.4. P. 1546 1550.

154. Toltzis P., Blumer J.L. Antibiotic-resistant gram negative bacteria in the critical care setting. // Pediatr. Clin. North. Am. 1996. Vol.42. P. 687 702.

155. Tomasi T.B., Grey H.M. Structure and function of immunoglobulin A. // Prog. Allergy. 1972. Vol. 16. P. 81-213.

156. Tzouvelekis L.S., Tzelepi E., Gazouli M., et al. Sporadic emergence of Klebsiella pneumoniae strains resistant to cefepime and cefpirome in greek hospitals. // J.Clinic. Microbiol. 1998. Vol. 36. No.l. P. 266 268.

157. Underdown B.J., Schiff J.M. Immunoglobulin A: strategic defence initiative at the mucosal surface. // Ann. Rev. Immunol. 1986. No.4. P. 389-417.

158. VanBelkum A., Melchers W.J.G., Gseldijk C., et al. Relationship between adhesion to intestinal Caco-2 cells and multidrug resistance in Klebsiella pneumoniae clinical isolates. // J. Clinical microbiol. 1997. Vol.35. No.6. P. 1499 1517.

159. Vatopoulos A.C., Kalapothaki V., Legakis N.J. Risk factors for nosocomial infections caused by Gram negative bacilli. // J. Hospital infection. 1996. Vol.34. No.l. P. 11-22.

160. Weinstein R.A. Nosocomial Infection Update. // Emerging Infect Dis. 1998. Vol.4 No.3. P. 416-419.

161. Wikstrom M.B., Dahlen G., Kaijser B. et al. Degradation of Human immunoglobulins by proteases from Streptococcus pneumoniae obtained from various human sources. // Infect, and Immun. 1984. Vol. 44. №1. P. 33 37.

162. Yinnon A.M., Butnaru A., Raveh D., et al. Klebsiella bacteriaemia: community versus nosocomial infection. // Q J Med. 1996. Vol.89. P. 933 941.

163. Yokota K., Oguma K. IgA-protease produced by Streptococcus sanguis and antibody production against IgA-protease in patients with Behcet's disease. // Microbiology and Immunology. 1997. Vol.41. No.12. P. 925 933.