Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы патогенности Klebsiella pneumoniae и их роль в патогенезе острой кишечной инфекции у детей первого года жизни

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Факторы патогенности Klebsiella pneumoniae и их роль в патогенезе острой кишечной инфекции у детей первого года жизни"

РГ5 ОД

На правах рукописи

1 1 ноя ^

МАРТЫНЕНКО ЛЮДМИЛА ДМИТРИЕВНА

ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ К1оЬц1и11а рпиитшпаи И ИХ РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ ОСТРОЙ КИШЕЧНОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ

03.00.07 - микробиология

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону Государственном НИИ микробиологии и паразитологии Госсанэпиднадзора Российской Федерации

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Ю. В. Езепчук

доктор биологических наук, профессор А.Ф.Мороз

доктор медицинских наук, профессор Л. А. Ряпис

доктор медицинских наук, профессор Л.И.Краснопрошина

Научно-исследовательский институт педиатрии РАМН

Защита диссертации состоится "^у " 1996г.в

_час на заседании диссертационного совета д. 176.01.01. при

Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского по адресу: 125212,Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского.

Автореферат разослан 11 И " 1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Е. М. Горская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы заметно возросло социально-медицинское значение условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) и обусловленных ими острых кишечных инфекций (ОКИ), т.к. значительный удельный вес этих инфекций приходится на детей раннего возраста, особенно новорожденных. В этиологической структуре этих заболеваний доминирует К. pneumoniae, на её долю приходится от 11,2 до 54, 2% (Поликарпов H.A. и соавт., 1985; Белокрысенко С. С., 1990, 1993; Кашуба Э. А. и соавт., 1994).

Клебсиеллезы отличаются тяжелым течением, нередко с развитием генерализованных форм (Несветов к.М., 1974; Лебензон G.C. и соаит., 1986; Garcia G.М., 1985), не только у детей, ко и у взрослых (Фролов 8. М. и соавт., 1994).

Вместе с тем диагностика кишечных форм клебсиеллезной инфекции значительно сложнее, чем при другой локализации, т.к. факт выделения К.pneumoniae не может служить основанием для микробиологического диагноза, необходимо еще доказательство их этиологической значимости в каждом конкретном случае.

В этой связи исследователями используются различные подходы, в том числе и методический подход, основанный на определении патогенных свойств предполагаемого возбудителя (Бондаренко В.М. и соавт. ,1987; 1988; Поликарпов Н. А., 1987; Арутвнян Н. М., 1988; БаркусМ.М., 1990; Mesta А.М. et al.,1985; Gupta R. et al., 1990; Yokocfli et al.. 1995).

Несмотря на имеющийся значительный фактический материал, касающийся факторов патогенности, отсутствуют критерии оценки патогенности К.pneumoniae, подкрепленные данными о их роли в патогенезе кишечной инфекции, т.к. не разработан методический подход к изучению явления патогенности К. pneumoniae, основанный на механизмах взаимодействия микро- и макроорганизма и, как следствие, не разработаны диагностические препараты, направленные на тестирование факторов патогенности и выявление антител к ним.

Цель работы: Обосновать патогенетическую роль ведущих факторов патогенности и на их основе разработать критерии оценки этиологической значимости К. pneumoniae при острых кишечных инфекциях у детей первого года жизни.

Задачи исследования: 11

- изучить роль К. pneumoniae в этиологии острых кишечных инфекций у'детей первого года жизни;

- разработать критерии оценки этиологической значимости К. pneumoniae

при острых кишечных инфекциях;

- установить взаимосвязь совокупности факторов патогенности штаммов и отдельных клинических проявлений острого кишечного клебсиел/юза;

- выявить неспецифические клеточные и гуморальные факторы, участвующие в защите от инфекции у детей первого года жизни;

- экспериментально доказать роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе клебсиеллезной инфекции;

- установить роль ведущих факторов патогенности К. pneumoniae: фимбрий I и III типов, липополисахаридз и термолабильного энтеротоксина в патогенезе острой кишечной инфекции;

- экспериментально обосновать и разработать комплекс диагностических препаратов, основанных на тестировании факторов патогенности К. pneumoniae и выявлении антител к ним.

Научная jjouHaHju. Выявлен комплекс факторов и признаков патогенности К. pneumoniae и на его основе разработали критерии оценки для обосноваг.ия этиологической значимости штаммов при острых кишечных инфекциях у детей первого года жизни.

Впервые доказано, что шталшы К. pneumoniae способны к продукции ряда факторов патогенности С различной частотой и интенсивностью. Создана коллекция, включающая референс-штаммы и штаммы-продуценты факторов и признаков патогенности, подтвержденная 9 патентами и авторскими свидетельствами, 11 справками о депонировании в Государственной коллекции (Патент РФ N17B&965, 1777607; А. С. N504 3033, N504 3065, N504 3066, N504 1189, N94 01 8327, №4 030872. NS4 030870).

Впервые установлено наличие прямой корреляционной зависимости медду степенью адгезии, типом фимбрий и типом энтеротоксигенности. Бы-явлеио отсутствие корреляции между массивностью выделении и вирулентностью штаммов. Впервые установлено наличие избирательной гемолитической активности штаммов в отношении II(А) и IV (АВ) групп крови человека. преобгздание больных с этими не группами крови.

Впервые по данным электронной микроскопии дана характеристика поверхностных структур штаммов фекального происхождения, позволившая выявить типы фимбрий. Впервые экспериментально доказано участие фимбрий I и III типов и адгезивном процессе (Патент N¡777607, А. С. N5043066).

Установлено участие фимбриальных адгезинов в регуляции диарейного синдрома, опосредованно, через стимуляцию продукции термолабильного энтеротоксина.

Впервые выявлено и экспериментально доказало, что комплекс факторов патогенности штаммов определяет клинические К'рмы и проявления инфекции. Выраженность отдельных симптомов заболевания зависит от интен-

сивности продукции определяющих их факторов патогенности (Патент N1707615).

Установлено, что острая кишечная инфекция у детей первого года жизни характеризуется поражением всех отделов желудочно-кишечного тракта, с преимущественным вовлечением в патологический процесс толстого и тонкого кишечника. Острый период сопровождается антигенемией, обусловленной наиболее часто липополисахаридом и фимбриальным адгези-ном III типа в крови, термолабильным энтеротоксином и липополисахаридом в копрофильтрате.

Впервые экспериментально доказано, что исход инфекции зависит от исходного уровня сбалансированности системы АОЗ-ПОЛ и имеет решающее значение на первых этапах инфекции. Дефицит активных форм кислорода приводит к развитии генерализованных форм инфекции, а высокий уровень. - к избытку высокотоксичных продуктов перекисного окисления липидов, приводящих к быстрым летальным исходам.

Впервые экспериментально обоснован и разработан комплекс диагностических препаратов, иммуноферментных тест-систем и питательных сред для тестирования факторов патогенности К. pneumoniae и антител к ним (Патент N1814769, N1742322; А.С. N93-052668; N94030871).

Теоретическая значимость работы. Комплексный подход к изучению факторов патогенности К. pneumoniae позволил доказать, что патогенность является не видовым признаком К.pneumoniae, а лабильной характеристикой штамма, выполняющег^лножественную патогенетическую функцию. Факторы патогенности находятся во взаимодействии друг с другом.

У штаммов клебсиелл фекального происхождения впервые охарактеризованы типы фимбрий , продуцируемые ими адгезины, доказано их участие в адгезивном процессе, что позволяет рассматривать возможность развития направления по созданию антиадгезивных препаратов для лечения и профилактики клебсиеллезов.

Вскрыт ранее неизвестный один из механизмов регуляции диарейно-го синдрома. Фимбриальные адгезины I и III типов стимулируют продукцию термолабильного энтеротоксина, активирующего образование аденилатцик-лазы, которая» через усиление синтеза циклического аденозинмонофосфа-та, нарушает транспорт ионов и воды через мембраны клеток.

Установлено, что у детей первого года жизни, имеющих несовершенную защитно-адаптационную систему, основными механизмами защиты от инфекции являются локальная иммунная защита и неспецифические факторы -фагоцитоз и процессы свободнорадикального окисления. Доказано, что тяжесть течения и исход инфекции зависит от исходного состояния сбалансированности системы АОЗ-ПОЛ и имеет решающее значение на первых

этапах инфекции.

Практическая значимость работы. На основании результатов исследования разработаны и внедрены в работу практических лабораторий методы лабораторной диагностики острых кишечных инфекций у детей раннего возраста: - Диагностика, прогнозирование течения и лечение острых кишечных инфекций условно-патогенной и сметанной этиологии (Методические рекомендации. Утв. МЗ РСФСР 23.11.90г.).

- Определение адгезивных свойств грамотрицательных бактерий (Информационно-методическое письмо. Утв. ГКСЗН РФ 20.01.93г.).

- Определение факторов патогенности условно-патогенных энтеробактерий и оценка их этиологической значимости при острых кишечных инфекциях у детей раннего возраста (Методические рекомендации. Утв. ГКСЭН РФ 28.11.94г.).

На основании результатов исследования разработан комплекс диагностических препаратов, иммуноферментных тест-систем и питательных сред для тестирования факторов патогенности К.pneumoniae и антител к ним:

- Проект ВФС и ЭПР на тест-систему иммуноферментную для выявления антител к липополисахариду К. pneumoniae (Разрешение на проведение Государственных испытаний. Протокол ГФК РФ N1 от 05.04.95г.).

- Проект ВФС и ЭПР на тест-систему имыуноферментную для обнаружения термола&ильного энтеротоксина энтеробактерий (На рассмотрении в ГФК РФ,. N113 от 09.12.94г.).

- Проект ВФС и ЭПР на тест-систему иммунофериентнуп для выявления антител к термолабильному энтеротоксину энтеробактерий (Утв. Уч. советом РНИИМП, протокол N10 от 28.12.95 г. Рекомендована к рассмотрению в ГФК РФ).

- Проект ВФС и ЭПР на питательнус среду для определения термолабильного энтеротоксина энтеробактерий (На рассмотрении в ГФК РФ, N3 от 06.01.95г.).

- Проект ВФС и ЭПР на питательнуп среду для тестирования ДНК-азы энтеробактерий (На рассмотрении в ГФК РФ).

Данные, полученные в результате настоящих исследований, используются в учебном процессе: на ФУВ при Ростовском государственном медицинском университете на циклах "Бактериология" и "Иммунология", при чтении лекций по спецкурсу "Инфекционная иммунология" и "Тропические болезни с основами иммунодиагностики" для студентов 4 и 5 курсов био-лого-почвенногс факультета Ростовского государственного университета.

. Положения, выносимые на защиту:

1. Патогенность клебсиелл является не видовым признаком, а лабильной характеристикой штамма, выполняющего множественную патогенетическую функцию. Клебсиеллы способны к продукции ряда факторов патогенное™, с различной частотой и интенсивностью, каждый из которых выполняет определенные функции и находится во взаимодействии друг с другом (Патент N1788965, 1777607; АС N5043033. N5043065, N5041189, N94018327, N94030872; N94030870).

2. В патогенезе острой кишечной кпебсиеллезной инфекции определенную роль играют термолабильный энтеротоксин, фимбриальные адгезины I и III типов и липополисахарид,

- фимбрии I и III типов К.pneumoniae являются ответственными за адгезию. Их участие в адгезивном процессе реализуется через секретиру-. емые адгезины, обеспечивающие связывание микроорганизма с клетками макроорганизма (Патент N1777607, А. С. N5043066).

- Фимбриальные адгезины принимают участие в регуляции диарейного синдрома. Механизм регуляции опосредованный: адгезины стимулируют продукцию термолабильного знтеротоксина, активирующего образование адени-латциклазы, которая через усиление синтеза циклического аденозинмоно-фоефата нарушает работу (Na*-Kf) насоса.

- Липополисахарид является структурным фактором патогенности, активирующим процессы СР0, путем стимуляции образования АФК и подавлением активности ферментов антиоксидантной системы.

3. Совокупность определенных факторов патогенности определяет клинические формы и проявления инфекции. Выраженность отдельных симптомов заболевания зависит от интенсивности продукции определяющих их факторов патогенности (Патент N1707615).

4. Факторы патогенности К. pneumoniae индуцируют образование иммуноглобулинов и антител, секреторных и сывороточных.

5. У детей первого Ьода жизни основными механизмами, участвующими в защите от инфекции, являются локальная иммунная защита и неспецифические факторы: фагоцитоз и процессы СР0. Процессы СР0 в динамике заболевания характеризуются фазностью, антибатными и компенсаторными изменениями показателей, отражающих сбалансированность системы А03-П0Л. Тяжесть течения и исход инфекции зависят от исходного состояния сбалансированности системы А03-П0Л и имеют решающее значение на первых этапах инфекции.

Процессы СРО являются одним из пусковых механизмов в сложной системе взаимодействия микро- и макроорганизма.

6. Факторы патогенности К. pneumoniae могут быть использованы при

разработке препаратов для диагностики острых кишечных инфекций и направленного поиска средств лечения и профилактики (Патенты N18114768, N1742322, 17889656, 1777607; А. С. N93-052668, 5043066; Заявки на патент N94030871. пр. от 05.08794).

7. Б этиологической структуре острых кишечных инфекций детей первого года жизни доминируют условно-патогенные энтеробактерии, среди которых ведущими являются К. pneumoniae. Не все <чтаммы К. pneumoniae, выделенные из фекалий, являются истинными этиологическими агентами острых кишечных инфекций.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- VI Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитолога (Нижний Новгород, 1991); - Всероссийских конференциях и симпозиумах по проблемам: "Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний" (Звенигород, 1990); "Химия белка" (Тбилиси, 19Э0); "Бактериальные токсины" (Юрмала. 1989); "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1990, 1992, 1991);

- Пленумах: Всероссийского научного общества гастроэнтерологов (Рос-тов-иа-Дону, 1991, 1995); Проблемной комиссии научного Совета по микробиологии АМН СССР по программе "Плазмида" (Нальчик, 1990) и "Генетика и молекулярная биология бактерий" (Москва, 1991);

- Всесоюзных семинарах: "Клинико-лабораторные проблемы современной химиотерапии и профилактика инфекций" (1SS0); Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций" (1991);по современным методам диагностики соматических и инфекционных заболеваний (Ростов-на-Дону. 1991, Уфа, 1S92);

- Международных симпозиумах, конференциях и конгрессах: "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" (Рига, 1989); Лабораторные животные в медико-биологических и биотехнологических исследованиях" (Москва, 19Э2); lit) International Congress of immunoreabiIllation (Sochi, 1994); 7tli International congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division (Prague, 1994);

- Заседании Ростовского отделения микробиологического общества (1S96).

По материалам диссертации опубликовано 69 работ, из них в центральной печати - 38, центральной периодичиеккой - ,11, за рубежом - 4. получено 5 патентов и 8 положительных решений на выдачу патентов, 2 рацпредложения отраслевого значения, 12 справок на штаммы, депонированные в Государственной коллекции; издано 3 методических документа; подготовлена НТД (6ФС и ЭПР) на 5 диагностичских препарата.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 398 страницах машинописного текста, включая иллюстрации из 65-ти таблиц и 76-ти рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания используемых

материалов и методов, 7 глав собственных исследований, заключения и выводов, указателя литературы, включащего 493 работы, из них 185 зарубежных авторов.

Основные результаты, приведенные и диссертации, получены автором лично. Исследования по отдельным разделам проведены совместно с сотрудниками других учреждений. Электронно-микроскопические исследования выполнены на базе ЦНИЛ Ростовского медицинского университета (директор - д.м.н., профессор Вилков Г.А.) совместно с зав.отделом морфологии I Волковым р. И|. I Кирдеевым В. К1 и к. м. н. Куцевым С. И.

Морфологические исследования выполнены с совместно со старшим научным сотрудником кафедры патологической анатомии Ростовского медицинского университета к. м. н. Скориковой В. П.

Раздел клинических исследований выполнен совместно с зав. IL детским инфекционным отделением БСМЛ N1 им. Н.А.Семашко г. Ростова-на-Дону, ассистентом кафедры детских инфекционных болезней Ростовс-' кого медицинского университета к. м. н. ЛовердоМзао. кафедрой профессор Симованьян Э. Н.).

Серотипирование штаммов проводили на базе ЦНИИВС им. И. И. Мечникова. совместно с д.м.н. А. П. Батуро.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Работа выполнена в течение 1989 - 1994 гг. в лаборатории экспериментальной микробиологии Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии.

Обследовано 1685 детей, из них больных ОКИ - 1505, здоровых -180. Изучено 654 штамма К. pneumoniae и 264 - других видов условно-патогенных микроорганизмов. Исследовано 68 проб крови, 1240 - сывороток крови, 230 копрофильтров. Проанализировано 163 истории болезни. Подвергнуто иммунизации 76 кроликов, 60 крыс. При моделировании острой кишечной клебсиеллеэной инфекции использовано 260 кроликов подсосного возраста.

Подвергнуто заражению 15000 белых беспородных мышей и 68 мышей чистой линии. 320 мышей-сосунков.

Изучено 360 лизатов бактериальных клеток, 290 образцов надосадоч-ной жидкости, 26 серий токсинов, 28 серий различных видов антигенов, 16 серий диагностических тест-систем.

Микробиологические обследования детей проводили с использованием набора питательных сред и условий, максимально способствующих выделению известных патогенов: p.p. Shigella, Salmonella, Campylobacter.

Идентификацию выделенных культур проводили до вида по культураль-но-морфологическим, тинкториальным, биохимическим и серологическим признакам, согласно краткому определителю бактерий Берги, Руководству для врачей "Энтеробактерии" под ред. Покровского В.И. (1985) и Методическим рекомендациям МЗ РСФСР "Определение грамотрицательных потенциально-патогенных бактерий - возбудителей внутрибольничных инфекций" (3386). Ферментативные свойства клебсиелл изучали по 26-и тестам.

Серотипирование проводили по К-антиге^у в реакции на стекле при помощи набора моновалентных агглютинирующих клебсиеллезных капсульных сывороток, разработанных ЦНИИВС им. И. И. Мечникова.

Чувствительность к антибактериальным препаратам определили методом серийных разведений на плотной питательной среде (Наиааин С. М., Фомина Н.П., 1Ь88), с использованием штампа-репликатора для одномоментного исследования 50 культур. Изучено 27 антибактериальных препаратов в 3-х подавляющих рост концентрациях.

Вирулентность штаммов определяли по показателям Ю50 на модели белой мыши по методу Биргер М.0. с соавт. (1982). Тестирование термолабильного энтеротоксина (ТЛЭТ) проводили в тесте отека лапы белой мыши (Вартаньин Ю. П. с соавт. ,1978) и методой имкунофериентного анализа (ИФА), термостабильного энтеротоксина (ТСЭТ) - по методу Романенковой Н.И. с соавт. (1980).

Факторы патогенности ферментативной природы определяли с использованием бактериологических и биохимических методов. В качестве рефе-ренс-ыташов использовали авторскую коллекцию из 1£ штамиив К. рпешю-Ыае - продуцентов факторов патогенности. зарегистрированную в Государственной коллекции РГИСКа им. Л.А. Тарасовича.

Адгезивные свойства определяли на модели эритроцитов ш методу Брнлис В. И. и соаог. (1985) в собственной модификации. Изучение фимб-рий проводили с использованием метода электронной микроскопии, путем негативного контрастирования бактериальных клеток Г/Е-ным раствором уранилацетата.

Состояние функциональной активности фагоцитирующих клеток оценивали по показателям фагоцитарного индекса (ФИ), фен-оцитарного числа (ФЧ) и завершенности фагоцитоза (ЗФ) (Меньшиков В.Б. С соавт., 1987: Учитель Н. Я., 1978); активности ферментов: миелопероксидазы (Пинегин Б.В., 1938), суп£роксиддисмутазы (СОД) (МшЮгЬоигп С.Н. е1 а1., 1975; Дубинина ЕЕ. и соавт., 1983) и каталазы (Королек М. А. с соавт., 1963).

Для характерютики процессов свободнорадик зльного окисления (СРО) определяли уровень хемилюиинесценции (ХЛ). методом регистрации

светосуммы в течение 500 сек (Иестаков В. А. с соаит., 1979), спонтанной люыинолзависимой и индуцированной опсонизированным зимозаном (Романов С. П. с соаит., 1984); активность ферментов: СОД, каталазы, глу-татионтрансферазы (ГТ) и общую антиокислительную активность (Благоро-дов С.Г. с соавт., 1984); уровень малонового диальдегида (МДА) (Андреева Л. И. с соавт., 1988) и осмотической резистентности эритроцитов (Меньшиков В.В. с соавт., 1987).

Определение цАМФ проводили по методу Tovey К., et al. (1974) с использованием набора фирмы "Amersham".

Для оценки состояния общего и специфического иммунитета применяли методы определения секреторных и сывороточных иммуноглобулинов, по методу Манчини и в ИФА; циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) с тестированием класса компонента Ig и классоспецифических антител к бактериальным антигена).) и факторам патогенности методом ИФА.

Моделирование острой кишечной инфекции проводили на кроликах породы, шиншилла" подсосного возраста, весом 200 - 240 г путем введения через зонд в желудок живой взвеси суточной культуры в дозе 1,6 -2,ОхЮ10 м. т./кг массы тела животного (Патент РФ N1707615).

Источником получения антигенов служила биомасса, полученная методом глубинного культивирования штампов-продуцентов факторов патогенности, депонированных в Государственной коллекции РГИСКа им. Л. А. Тара-севича. Выделение липополисахарида проводили по методу Вестфаля-Люде-рица (1975) в модификации Кульшина В.А. с соавт. (1987), термолабильного знтеротоксина - по методу Clemens Y. D. et Finkelstein R. А. (1979), фимбриальных адгезинов по методу Old D. С. et al. (1985) в собственной модификации.

Очистку антигенов проводили на хроматографическом оборудовании фирмы LKB (Швеция).

Полученные результаты подвергались статистической обработке по общепринятым методам на мини-компьютере Hewlett Packard-65 (США) с программированием.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КЛЕБСИЕЛЛ. ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ.

Роль клебсиелл в этиологии ОКИ у детей раннего возраста. Ридом исследователей отмечен высокий удельный вес К. pneumoniae в этиологической структуре ОКИ, особенно среди детей раннего возраста (Еаркус М М.. 1990; Белокрысенко С. С. с соавт., 1990; 1993; Фролов В. М. с со-

авт., 1994: Кашуба 3.А. есоавт.. 1994). Однако остается неясным вопрос, все ли выделенные клебсиоллы являются истинными этиологическими

агентами.

Проведенное нами комплексное исследование показало, что частота выделения клебсиелл среди здоровых детей первого года жизни составляет 21,1 ±3, !/, среди больных ОКИ этого же возраста - 71,4tl, 2Z, из которых на долю этиологически значилшх приходится лишь 49.3il.2Z ; остальные 50, 5*2, 21 обусловливают дисбиотические сдвиги кишечника. Следует отметить, что в целом в этиологической структуре ОКИ на протяжении 8-летнего периода ведущими являются УПЭ, удельный вес которых от суммы ОКИ составляет 80, OÜ.O/*. Роль известных патогенов p. Shigella и р.Salmonella невелика (2,5±0,21 и 7,2±0,6/ соответственно). Среди УПЭ доминируют К. pneumoniae, при неуклонном росте их этиологической значимости , что согласуется с данными вышеуказанных исследователей и подтверждает общее представление о все возрастающей роли клебсиелл в инфекционной патологии детей раннего возраста.

Характеристика биологических свойств штаммов. Рост клебсиеллезов диктует необходимость решения многих методических вопросов, связанных с отсутствием объективных и надежных критериев, позволяющих дифференцировать истинные этиологически-- агенты от микроорганизмов, обусловливавших дисбиотические сдвиги. В этой связи ведутся поиски методических подходов, в том числе и основанные на биохимических и серологических признаках. Каш изучено 654 культуры по 26 биохимическим признакам, из ни/ 617 культур, выделенных от больных и 37 культур от здоровых детей. По основным биохимическим признакам все изученные штаммы имели однородную для p.Klebsiella характеристику биохимических свойств . Вариабельность отсечена по 5-ти признакам: расщеплению лактозы и дульцита, продукции индола, пути ферментации глюкозы и скорости гидролиза мочевины.

По совокупности вариабельности ведущих 4-х биохимических признаков все изученные штаммы сыли отнесены к 14 биохимическим вариантам. Однако отличий по частоте регистрации этих вариантов среди штаммов К. pneumoniae или биовара Ч. oxytoca, выделенных от больных и здоровых детей не установлено (t<l,95).

Анализ данных по изучению капсул у 654 штаммов, показал, что все штаммы имели капсулы, размер коирых варьировал ст "микро", едва различимой, до paüi. еров, значительно превышгиыцих диаметр тела самой бактериальной клетки. Необходимо отметить, что размеры капсул не связаны с источником выделении штаммов (U1.95). При серологической дифференциации 225 штамме в клебсиелл, К-антиген был идентифицирован лишь у 171

штамма (76,0*2,92), 47 штаммов были полиагглптинабельны и 7 не реагировали ни с одной из моноспецифических сывороток.

Анализ полученных данных показал широкое разнообразна К-антигена среди штаммов, выделенных от больных и здоровых детей. Из 86 известных сероварои обнаружено 66. среди которых с наибольшей частотой были выделены штаммы с антигенами: К21 (8, 8*1,8%), К16(5.3±1,5%). К2(4,8*1, i%). KH(4.0il.3%), К8(3,1*1,Ш и К11(2,2*0,9Х).

При изучении чувствительности к антибактериальным препаратам штаммов клебсиелл выявлена высокая активность в отношении аминоглико-зидов, цефалоспоринов, налидиксовой кислоты, триметоприма, фуразолидо-на, доксирубицина и броксивиналина, показатели чувствительности которых составили 76,1±1,7 - 98,2*0,22. Слабой активность» обладали препараты тетрациклинового ряда, рифампицин, хлорамфеникол, эритромицины, норсульфазол, чувствительность которых варьировала от 31,9*1,9% до 59.5*2,0%. Большинство штаммов имело множественную устойчивость к ан-' тибактериальным препаратам.

Существенных отличий в антибиотикограммах штаммов К.pneumoniae, выделенных от детей больных ОКИ и здоровых, установлено не было.

Изучение 246 штаммов клебсиелл с различными спектрами антибиоти-корезистентности, из которых 12 штаммов выделенных от здоровых детей,. 192 от больных ОКИ и 42 штамма, выделенных при 2-х вспышках острого кишечного клебсиеллеза среди детей, показало отсутствие плазмид в 8,9*1,8$ случаев, как среди штаммов, выделенных от больных, так и здоровых детей. В группе штаммов, несущих плазмиды, установлено, что их подавляющее большинство имело более одной плазмиды ( по три-пять-шесть плазмидных репликонов одновременно), ММ которых варьировала от 1,2 МД до 125 МД. Чаще всего в штаммах обнаруживали легкие и тяжелые плазмиды с ММ 1-2, 2,5-4, 5-10, 25-40 и 100-125 КЦ и значительно реже с ММ 80-90МД (11,2*2,1Ж) (t>2,0). При сопоставлении фенотипических признаков и антибиотикограми штаммов, имеющих одинаковый набор плазмид, наличие определенной взаимосвязи не установлено.

Таким образом, вьшеизученные показатели не могут являться основополагающими при этиологической расшифровке ОКИ.

ФАКТОРЫ-И ПРИЗНАКИ ПАТОГЕННОСТИ К.pneumoniae

Поиск факторов и признаков патогенности. установление частоты их распространения среди штаммов, выделенных от больных и здоровых детей, проводили с учетом биофункциональности искомых макромолекул. Меру патогенности штаммов оценивали по показателям вирулентности.

Адгезивные свойства, поверхностные структуры и факторы адгезии. Учитывая, что начало инфекционного процесса реализуется через одно из свойств микроорганизмов - адгезивность, были изучены адгезивные свойства 478 штаммов, выделенных от больных (453) и здоровых детей (25).

В группе больных детей преобладали штаммы со средней степенью адгезии (64,0±2,32, р<0,05), в группе здоровых детей отпечена тенденция преобладания высокоадгезивных штаммов (5Г,0±10,0, р)0,05). Было установлено, что частота выделения высокоадгезивных штаммов в группе здоровых детей была значительно вьше. чем больных (52, OilOX против 23.0±2,1/. при t=2.9). Отличий по частоте выделения среднеадгезивных и низкоадгезивных штампов в сопоставляемых группах не установлена (р>0.05).

Полученные нами результаты о подавляющем доминировании штаммов со средней и высокой степенью адгезии подтверждают общее представление о значении адгезии и развитии инфекционного процесса (Гизатулина С. С. с соаит., 19S5. 1S88; Svenson et al., 1985; Sansonetti. 1987). Однако выявленные нами данные и преобладании высокоадгезивных штаммов в группе здоровых детей не согласуются с результатами Бондаринко В.М. с со-аът.(1S87), Баркус М. М. (1990). устаноьиваих обратную закономерность. Вероятно, именно благодари способности к высокой степени адгезии, клебсииллы могли прикрепиться и колонизировать эпителий кишечника здоровых детей.

При электронномикроскоппческом изучении 252 штаиков (227 от больных и 25 от здоровых детей) наличие поверхностных структур Cuisj выявлено в 88,9±2,0Х, По морфологическим признакам, согласно классификации 01d D.С. et al. (1S35) и Gerlacii G. et al. (1S88), все ибнару:хенныи поверхностные структуры были идентифицированы как фим6р!.и I и III типов ( piio.I). Отличий по частите обнаружения Фимбрий или их типов среди штаммов, выделенных от здоровых детей и больных ОКИ. не установлено.

Большинство штампов, выделенных от больных к здоровых детей, имели III тип фимбрий (72,8 - 75,0Х). На долю штатив с I типом приходилось значительно меньшее число (11,1 - 12,52). Обращает на себя внимание факт обнаружения одновременно 2-х тиг.оь фимбрий I и III (8.3 -8,73t), а также итаммиа без фимбрий (10,9 - 12,52).

Результаты изучения адгезивных свойств 176 штаммов клебсиелл и зависимости от типов фимбрий показали, что адгезивными свойствами обладали ьсе изучьнные штаммы, в том числе и без фимбрий. Подавляющее большинство штаммов имело среднюю и высокую степень адгезии, на долю низкоадгезивных приходилось ьсеги 5.7i 1. Ы. Частота обнаружении штаммов со среднее и впеокой степенью адгезии среди шталишь с III типом

ФИМБРИИ - 111 ТИП d - 5-7 НМ £ - 1,5-1,8 МКМ

ФИМБРИИ

111 ТИП

1 ТИП

РИС. 1. ШТАММЫ КЛЕБСИЕЛЛ С РАЗЛИЧНЫМ ТИПОМ ФИМБРИЙ Л - 1 ТИП, В - 111 ТИП, С - 1, 111 тип (ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРСХ'КОПИЯ, КОНТРАСТИРОВАНИЕ УРАНИЛАПЕТАТОМ, Ч1ЕЛ11ЧЕНИЕ X 18000).

фимбрий была одинакова (t<l,95). Среди штаммов, несущих I тил фимбрий отмечена тенденция к средней степени адгезии, штаммов без фимбрий- к более высокой степени адгезии.

Учитывая общепризнанные представления о том, что у клебсиелл наличие маннозорезистентных гемагглютининов связано с фимбриями III типа, а маннозочувствительных - с фимбриями I типа, был проведен сопоставительный анализ типов фимбрий и гемагглютинации штаммов с 17-тьс видами эритроцитов: человека, животных и птиц. Полученные нами результаты показали, что реакция гемагглютинации не позволяют дифференцировать типы фимбрий. Полученные данные дают основание для двух предположений: 1 - о недостаточной информативности реакции гемагглютинации для дифференциации типа фимбрий у клебсиелл и 2 - отсутствие маркера из числа изученных нами видов эритроцитов, поэтому необходим поиск маркера.

Ферменты патогенности. Для сравнительной оценки частоты распространения ферментов патогенности среди штаммов различного происхождения, изучали способность бактерий к их продукции. С цель» выяснения характера эндо- и экзогенного распределения ферментов у штаммов, были исследованы живые культуры и их ультразвуковые дезинтеграты (таблица 1).

Таблица 1.

Частота распространения эндогенных и экзогенных ферментов патогенности среди К. pneumoniae

экзогенные эндогенные

Ферменты количество штаммов из них активных количество штаммов из них активных t

абс. а абс. Zi к

лецитиназа 450 68 15,11 1.8 216 39 18,1t 2.6 1,0

протеаза 450 53 11,8t 1.5 216 23 10.6» 2.1 <1,0

фосфатаза 450 183 40.61 2,3 216 121 5S.01 3.4 >2,0

ДНК-аза 450 112 24,8i 6,1 450 207 46,01 2.1 >2.0

каталаза 450 450 99,81 0.2 - - -

СОД 112 17 15.21 3,4 112 33 33,91 4.5 >2,0

нейрамини-даза 124 23 18,51 3.5 124 41 33.li 4,2 >2,0

Установлена, что ш.аммы К. рпеитотае спос«)бны продуцировать ряд известных ферментов, участвующих в проявлении патогенного потенциала, с различной частотой и интенсивностью. Частота варьировала в имроких

пределах, от 3,3*3,2 до 99.8iO.2Z и зависила от объекта исследования. Получены достоверные различия в более высокой частоте выявления внутриклеточных ДНК-а^ы. фосфатазы. каталазы, СОД и нейраминидазы, по сравнению с внеклеточными (t>2,0),что свидетельствует об их преимущественной эндогенности.

С наибольшей частотой обнаруживали ферменты антиоксидантной системы защиты, каталазу и СОД (99,8Ю, 2 и 33,9t4,5£), нейраминидазу (33.1±4.2%). несущую Функцию внедрения и ферменты, обеспечивающие адаптацию и защиту от макроорганизма - ДНК-азу и фосфатазу.

Сопоставление показателей частоты выявления ферментов, в зависимости от источника выделения штаммов, показало выраженное доминирование частоты обнаружения ферментов среди штаммов, изолированных от детей больных ОКИ (р<0,01). Установленная закономерность характерна для всех ферментов. Штаммы, выделенные от бальных детей, отличались более высоким уровнем каталазной активности по сравнению со штаммами, выделенными от здоровых детей. А штаммы, обусловившие вспьшки ОКИ среди новорожденных в Доме ребенка (19В7) и Роддоме N2 (1989). имели еще более высокий уровень продукции каталазы.

Полученные результаты позволяли подтвердить выводы ряда авторов о достоверных различиях в частоте обнаружения ферментов патогенности среди штаммов, выделенных от здоровых людей и больных ОКИ (Мнацаканов С.Т.. 1897; Поликарпов Н.А., 1987). соматических больных с дисбиозами кишечника и больных сепсисом (Поликароо Н.А. и соавт., 1985, 1986, 1987).

Из числа штаммов, стабильно продуцирующих ферменты патогенности были отобраны, адаптированы к питательный средам и условиям культивирования и впервые задепонированы в Государственной коллекции следующие штаммы: 1. Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae, используемый в качестве референс-шташа для определения каталазной активности микрорга-низиов при дифференциации патогенных и непатогенных микроорганизмов (положительное решение'на выдачу патента на изобретение N5043065/13 от 26.10.94); 2. Штамм бактерий К. pneumoniae - продуцент дезоксирибонук-леазы (пол. решение на выдачу патента на изобретение N50441189/13 от 07.10.94); 3. Штамм К. pneumoniae 254 - референс-штамм при определении фосфатазной активности микроорганизмов.

Факторы патогенности с функцией поражения. Принимая во внимание, что факторы патогенности, несущие токсическую функцию или оказывающие поражающее действие на клетки макроорганизма, являются определяющими в патогенезе инфекционного процесса, была поставлена задача изучения частоты и интенсивности продукции ТЛЭТ и ТСЗТ, гемолизинов штаммами

К. pneumoniae, выделенными из различных источников. Изучение 320 штаммов К. pneumoniae, выделенных от детей, 286 - от больных и 34 - от здоровых, показало, что в ЛБК штаммов, выделенных от здоровых детей, частота вынзления ТЛЭТ, по данным биопробы, составила 2,9*2,85ь, при индексе отека лапки 56 мг, по данным ИФА - 8,9*4,8%, при lgs-2,1, ТСЭТ обнаружить не удалось. Среди штаммов, изолированных от больных ОКИ, частота выявления ТЛЭТ и ТСЭТ была значительно выше (таблица 2). Установлены различия в частоте выявления признака энтеротоксигенности и его выраженности в зависимости от материала исследования. При исследовании ЛБК показатели энтеротоксигенности выше, чем при исследовании НИ, для ТЛЭТ разница статистически достоверна U - 2.9), для ТСЭТ -тенденция вышеуказанной закономерности. Полученные результаты свидетельствуют о преимущественном эндогенном характере энтеротоксигенности и соответствуют данным литературы о том, что накопление ТЛЭТ и ТСЭТ у УПЭ происходит преимущественно в периплазматическом пространство бактериальной клетки. Частота выявления признака ТЛЭТ зависила также и от метода ого тестирования. При сопоставлении данных биопробы и метода ИФА было установлено, что показатели, характеризующие частоту искомого признака, существенно выше при тестировании методом ИФА во всех сравниваемых группах ((, > 2.0). При этом максимально высокие показатели частоты выявления ТГЭТ отмечены при исследовании ЛБК методом ИФА (66,1*2,8Х), по данным которых на долю умереннотоксигенных штаммов приходилось 33,2*2,8 %. а высокотоксигенных - 14,7*2, IX.

Удельный вес штаммов, обладающих Tc-энтеротоксигенностью по данным биопробы составил 39.1*6,17. и не отличался от показателей ТЛ-эн-теротоксигенности в тесте отека лапы 139,6*2, 9, при t ■ 0,13). Было установлено, что 20.3*5. ОХ штаммов продуцирует одновременно оба энтеро-тонсина: ТЛЭТ и ТСЭТ.

Обращает внимание достаточно высокая степень корреляции между ТЛи ТС-энтеротоксигенностм) (г«0,65, nv- -0,095). Суммарно ТЛи ТС-энтерок-сигенной активностью обладало 70,3*5,1% штаммов, йз которых на долю слабоэнтеротоксигенных приходилось 20,3*5,0Х, высокоэнтеротоксигенмых - 28,1 *5,

Необходимо отметить, что из числа штаммов, не продуцировавших ТСЭТ в 51,3*8% случаев отмечена ТЛ-энтеротоксигенность. при этом на долю высокотоксигенных штаммов приходилось 25,6*6,9Ж. Среди штаммов, не обладающих ТЛ-энтеротоксигенностью, 38,7*8,7% продуцировали ТСЭТ, а доля высокотоксигенных штаммов составляла 25,8*7,8%.

Из числа штампов интенсивно и стабильно продуцирующих ТЛЭТ отобран, адаптирован к различным питательным средам и условиям

Таблица4 .

«Характеристика энтеротоксигенных свойств штаммов клебсиелл, выделенных от детей, больных ОКИ

Тип энте- ротокси- генности Метод тестирования Материал исследования

НЯ ЛКБ

п неэнтеро токсиген ные -*) энтеротоксигенные **) неэнтеро токсиген ные*) энтеротоксигенные **)

всего слабо умеренно высоко всего слабо умеренно высока

аОс. /*±ш абс. абс. Я±т або.Х± ш абс.Х*т абс.Х±гл абс. *+ш абс. 7.*ш абс. Г.+Я1 абс.

Термостабиль на! Термолабильный био -проба мыши-сосунки био-пробз (мыши) ИЗА 64 236 236 '56 87,5±0,4 224 78,3*2,4 152 53,1*2,9 3 12,5±4,3 62 21,7*2,4 134 46,9+2,3 0 54 13,9±2,3 35 12,2+1,9 0 8 2,8*0,9 76 2б,6±2,6 0 0 23 8,0*1,6 39 61,0*6,2 172 60,0+2,9 97 33,9*2,3 25 39,1*6,1 114 39,9+2,9 139 66,1*2,3 10 15,6*4,5 39 13,6+2,0 52 . 13,2*2,9 11 17,2*4,7 56 19,5+2,3 95 33,2*2,3 4 6,2+3,0 19 5,6+1,5 42 14,7*2,1

I I

*) неэнтеротоксигенные:

**) энтеротоксигенные: слабо:

умеренно:

высоко:

- титр ИЗА - менее 1:1(30

- индекс отека лапы - менее 50 мг

- индекс знтеросорбции - менее 0,09

- титр ИФА - 1:1Ш-1:4Ш

- индекс отека лапы от 50 до 75 мг

- индекс знтеросорбции до 0.1

- титр ила - 1:вио-1:аош

- индекс отека лапы от 75 до 100мг

- индекс энтеросорбипи от 0.1 до 0.2

- титр ИФА - 1:«4Ш и вь^е

- индекс отека лапы - более 100

- индекс знтеросорбции - более 0,2

культивирования штамм К. pneumoniae и зарегистрирован в Государственной коллекции под N 250.

Роль гемолизинов энтеробактерий, в том числе и клебсиелл, в возникновении кишечных инфекций до настоящего времени не выяснена. Вместе с тем. установлено, что штаммы, выделенные от больных, обладают способностью к продукции гемолизинов. В этой связи проведено изучение гемолитической активности 551 штамма клебсиелл, из них 516 от больных и 35 от здоровых детей и 236 из ЛБК (208 и 28 соответственно), с эритроцитами кролика, барана и че-ювека Rhf КО). II (А), III (В), IV(AB) -группы крови.

Сопоставление данных изучения культур и ЛБК показали более выраженную гемолитическую активность ЛБК. Статистически достоверные отличия выявлены для показателей суммарной гемолитической активности штаммов и в отношении эритроцитов IVСAB) и II(А) группы крови человека (t>2.0). для остальных сравниваемых групп - отмечена тенденция, что соответствует данным литературы о внутриклеточном доминировании гемолизинов энтеробактерий (Бондаренко В М., Голубев A.B., 1988). При исследовании ЛБК максимальные показатели приходятся на группу штаммов с умеренной активностью, при исследовании культур - со слабой степенью гемолитической активности (02,0). Следует отметить интересную особенность в явлении гемолитической активности штаммов, избирательность в отношении групп крови человека. Частота и степень активности культур и их лизатов достоверно вайе при исследовании с эритроцитами II и IV групп крови, что, вероятно,связано с А-антигеном АВО-системы крови.

Изучение гемолитической активности штаммов с эритроцитами кролика показало значительно меньшую частоту признака, 8.5:1,2 против 22, lil.8%. t>2,0, для культур и 13,1±1,2i, t>2.0. дли ЛБК. Еа^ более низкие показатели получены при исследовании штаммов с эритроцитами барана. (5,8±0,9Z и 8, Iii,8% соответственно, t >2,0). Еще меньшее число ытаммов обладало способностью одномоментно вызывать лизис эритроцитов кроликов и барана (2, Oiü, 6 - 2, li0.9Ä).

Признаки патогенности. В качестве признаков патогенности использовали показатель продукции ЗЦС и интенсивности дыхания в тесте с конго-рот. Установлено, что 28.4M,BZ штаммов, выделенных от больных, продуцировали ЭЦС, при этом на долю высокопродуктивных приходуюсь 15,6±1,5Х штаммов. Аналогичные показатели получены и в тесте С конго-рот. Частота этих же признаков среди штаммов, выделенных от здоровых детей была значительно ниже. 2,9i2, ВХ, для ЭЦС и 8,6*4.8Z для теста с конго-рот. Выявленные различия в частоте регистрации вышеуказанных признаков среди штампов, выделенных от больных и здоровых детей, ста-

тистически достоверны (1>2,0), поэтому позволили предположить возможность использования теста продукции ЭЦС и интенсивности дыхания микроорганизмов в качестпе маркеров для штаммов К. рпеитотае. Штамм К. рпеи-тотае, дающий стабильно интенсивную окраску в тесте с конго-рот, зарегистрирован в Государственной коллекции под N216, и на который получено положительное решение на выдачу патента (N5043033/13 (024588) от 24.11.94).

Массивность выделения. С целью выяснения значения массивности выделения клебсиелл в качестве критерия для обоснованности их этиологической значимости при ОКИ, были проанализированы показатели количественного содержания микроорганизмов в 1 г фекалий здоровых детей и больных ОКИ. Массивность выделения клебсиелл варьировала в широких пределах, от единичных колоний в нативном материале, до 23'10"я м. т. /1 г фекалий. У детей больных ОКИ клебсиеллы выделялись в значительных количествах, до разведения п'10"я. Основной массив выделенных культур ■ находился в диапазоне разведений от п'Ю"1 до 10~5, или 181,031-1Й5, 93.

У здоровых детей этого же возраста их количество не превышало 10"5, а основной массив приходился на разведения от п'Ю"1 до 10"4. Достоверные различия по частоте выделения клебсиелл установлены только для одного разведения - Ю"2; у здоровых детей высеваомость в этом разведении была выше, чем у больных ОКИ (I - 2.3).

Таким образом, количественные показатели так же не могут служить основополагающими при обосновании этиологической значимости К. рпешао-тае при ОКИ.

Вирулентность. Для сравнения частоты и степени выраженности патогенных свойств штаммов, выделенных от больных ОКИ (364 штамма) и здоровых детей (34 штамма), были определены показатели вирулентности по вычислению средних значений \8 Ь05о- Показатели вирулентности варьировали от 5,9±0,38 до 9,7110,27 при/95 % или 7,912,3'10я м. т. соответственно. Было установлено, что среди штаммов, выделенных от больных детей, диапазон величин Ь05() был значительно шире (9,1 ±0,27 -.5,910,38), по сравнению с группой здоровых детей (9,7 ПО, 27 -8,21Ю.21, при /95% р <0,01). Средние значения показателей вирулентности также имели существенные различия, для группы больных они составили ^ Ю50 7,9310,17 или 1И50 8,5И,4'107 м. т., а для группы здоровых Ш50 9.29±0,13 или Ш50 1,9И,310Я м. т. Оценка существенности различий, проведенная с помощью критерия знаков Ш50, позволили сделать заключение, что с вероятностью, превышающей/Э5% вирулентность штаммов в группе здоровых детей ниже чем в группе больных ОКИ.

На основании средних величин 1в Щ,0, были приняты следующие условные критерии при оценке степени вирулентности штаммов клебсиелл: авиру-шнтные - Ш50 > 9.2; слабовирулентные - ИЦо 8,2-9,2; умеренно-вирулентные - ЬО<,0 7,2-8,2; высокоиирулентные - Ь0$о < 7,2.

Взаимосвязь факторов и признаков патогенности. С целью установления взаимосвязи отдельных фактороз и признаков патогенности ме*ду собой и с показателями вирулентности штаммов, выделенных от больных и здоровых детей, был проведен корреляционный анализ выявленных факторов патогенности (таблица 3). Максимальное число взаимосвязей приходится на показатель вирулентности штаммов, при этом высокая степень корреляции отмечена для энтеротоксигенности и гемолитической активности. К числу факторов патогенности, имеющих значительное число взаимосвязей относятся адгизииность, энтеритоксигенность, гемолитическая, ДНК-аз-ная, каталазная активность, тест с конго-рот и наличие фимбрий.

Таблица 3.

ВЗАИМОСВЯЗЬ ФАКТОРОВ И ПРИЗНАКОВ ПАТОГЕННОСТИ ШТАММОВ КЛЕБСИЕЛЛ.

1 Вирулентность Н|Адгезииность Оимбрии

Зитеротоксигенность ДНК-аза Фосфатаза Каталаза Гемолизины СОД

Нейраиинидаза

зцс

Конго-рот Лецитиназа Протеаэа

Массивность

О - Отсутствие корреляции; И - низкая; У - умеренная; В - высокая

При сопоставлении показателей 1к 1ХЦ0 и КОЕ, корреляции между вирулентностью и массивностью выделения не установлено. Не было также выявлено и взаимосвязи между К-антигенами и факторами патогенности; между К-антигенами и размером капсул ; 18 КОЕ.

С целью установления частоты сочотанного носительства штаммами наиболее распространенных факторов и признаков патогенности, были подвергнуты анализу данные 450 штаммов, выделенных от больных и 35 - от здоровых детей. В группе штаммов, выделенных от больных детей в 88.4*1,7Л случаев отмечали наличие одновременно от 2-х до 5-ти факторов и признаков патогенности. Наиболее часто были следующие сочетания: АДГ^+ЭНТ; АДГ+ЗНТ+ДНК+К-Р; АДГ +ЭНТ +ГЕМ+К-Р; АДГ+ЭНТ+КТ+ДНК; АДГ+ГЕМ+КТ; АДГ+ГЕМ+ФФ+К-Р; АДГ°+ДНК+К-Р+ФФ; ЭНТ+ДНК+ФФ+СОД; ГЕМ+КТ+СОД+К-Р.

Следует отметить прямую корреляционную зависимость между вирулентностью. числом сочетаний факторов патогенности и их выраженностью,' чем больше набор факторов и интенсивнее их продукция, тем выше ^ ЬС%0 (при г°0,58; Пр-0,12 и выше).

Из группы штаммов, выделенных от здоровых детей, число сочетаний факторов патогенности лишь в одном случае составило три (АДГ+ФФТ+К-Р), 2,9*2,8%, в остальных - один, два (22,8*7.1%). Удельный вес штаммов, имеющих 2-3 фактора патогенности одновременно был значительно ниже, чем в группе штаммов, выделенных от больных детей (25,7*7,4% против 88,4*1,5%, при 1-8,1).

Результаты изучения степени адгезивного процесса, ТЛ- и ТС-энте-ротоксигенности штаммов, показали прямую зависимость этих признаков г-0.43, гаг -0,12 для ТС- и г -0,53, nv.-0.09 для ТЛ-энтеротоксигенности.

Еще более высокая степень корреляции выявлена между ТЛ-энтероток-сигенностыо и адгезивностыо у штаммов, имеющих III тип фимбрий (г » 0,75 и,.-0,08), что подтверждает значимость штаммов с III типом фимбрий в этиологии кишечного клебсиеллеза, а энтеротоксины являются определяющим фактором в патогенезе кишечной инфекции.

Таким образом,на основании выявленной взаимосвязи между вирулентностью штаммов, продукцией факторов патогенности и наличием признаков патогенности установлено, что к наиболее значимым факторам патогенности клебсиелл относятся: ТЛ-, ТС-энтеротоксигенность, высокая и средняя степень адгезии, наличие III типа фимбрий, гемолитической, ДНК-азной, фосфатазной,' СОД, высокой каталазной активности и интенсивность дыха-' ния в тесте с конго-рот. Критериями оценки этиологической значимости

- высокая степень адгезии.

клибсиелл являются обнаружение ТЛ-. ТС-энтеротоксигенности и (или 2-3-л вышеуказанных факторов или признаков патогенности.

Впервые создана коллекция штаммов клебсиелл-продуцентов факторов и признаков патогенности, подтвержденная 11 справками о депонировании в Государственной коллекции, 9 патентами и авторскими свидетельствами.

Полученные нами результаты дали основание полагать, что пагоген-ность клебсиелл является не видовым признаком, а лабильной характеристикой штаммов, выполняющей множественную патогенетическую функцию. Выявленные закономерности, присущие клебсиеллам. являются принципиально общими. Из этого можно сделать важный практический вывод о том, что для каждого вида УПЭ характерен свой набор факторов и признаков патогенности, котсрый может быть использован для их этиологического обоснования при ОКИ.

ВЗАИМОСВЯЗЬ ПАТОГЕННЫХ СВОЙСТВ ШТАММОВ И КЛИНИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ ПРИ ОСТРОМ КИШЕЧНОМ КЛЕБСИЕЛЛЕЗЕ

Большое разнообразие клинических форм и проявлений при заболеваниях условно-патогенной этиологии, характерно и для клебсиеллезов.

Клинические формы кишечного клебсиелльза. Анализ 163-х историй болезни детей первого года жизни, больных клебсиеллезом, находившихся на лечении в детских инфекционных отделениях показал следующий возрастной состав: до 1 месяца - 1.4U.0Z; от 1 до 3-х месяцев -21.3±3.5Х; от 3 до 6-ти месяцев - 26,5*3,9 и от 6 до 12-ти месяцев -50,7±4,2й. У большинства больных выявлен отягощенный преморбидный фон при доминировании II (А) (у 44,914.32)и IV(AB) (у 33,814. Ш групп крови.

По данным бактериологических исследований все 136 больных были разделены на 4 группы: 1 - моноинфекция (клебсиеллез); 2 - микстинфек-ция: клебсиеллезно-условно-патогенной этиологии (протеоз, эшерихиоз и др.): 3 - микстинфекция: клебсиеллезно-ротавирусной этнологии; 4 -микстинфекция, обусловленная шигеллами и сальмонеллами.

Установлено, что кишечный клебсиеллез, как при moho-, так и при микстинфекции в 73,5i3,8/ случаев начинался остро, с ухудшения состояния, повышения температуры до 38-39пС (50,0±4,3), появления рвоты и диаройного синдрома.

В 1-й груш е больных, с моноклебсиеллезной инфекцией, статистически достсверю доминировали энтериты и энтероколиты, больная часть из которых имелг признаки гемоколита. 25,5И1,12 от числа всех больных этой группы и 63,2111,12 от числа больных с явлениями колита.

Массивность выделения варьировала от единичных колоний в нативном

материале, до КОЕ/г lg 8,21 и чаще носила затяжной характер. Все штаммы были отнесены к группе вирулентных, lg LD50 5,6i0,385ь - 7,9*0,3' при _/95Х, lg. Факторами патогенности обладало 95,7i2,9% штаммов. Все штаммы обладали высокой и средней степенью адгезивного процесса, в 70,2*6,7Х случаев несли на своей поверхности III тип и 2.5*6,4% - I тип фимбрий.

У больных 2-й группы с микстинфекцией,диарея преимущественно носила характер энтероколита (t>4,0). Процент вирулентных штаммов составлял 77,8*6.2%, а средние показатели LD50 среди вирулентных штаммов были ниже: lg ИЦ0 8,63*0.27, против lg LD50 7,28*0,35 (р<0,05) в группе с моноинфекцией. Факторами патогенности обладало 95,6*3,1% штаммов.

В 3-й группе больных, клебсиеллезно-ротавирусной этиологии, преобладали энтериты и энтероколиты с выраженными признаками гемоколита над гастроэнтеритами и гастроэнтероколитами (t>4,0). По частоте выявления всех 4-х клинических форм,отличий с группой моноинфекции не наблюдали (t<1.2). Длительность, выраженность и частота диарейного синдрома была такой же. как и у больных первых двух групп. Массивность выделения была меньше и составила КОЕ/г lg 3,23 - lg 5,13, но более продолжительная, свыше 10-ти суток, по сравнению со второй группой (против lg 3,51- lg 8,24 и 8-и суток соответственно). На долю вирулентных штаммов приходилось 65.2± 2.9%. Средний показатель lg LD50 среди вирулентных штаммов составлял lg 8.51 i0.35. ./95561 g. Факторы и признаки патогенности были обнаружены у 60.9*30.2% штаммов, что и позволило рассматривать клебсиеллы в качестве ведущих этиологических агентов.

В 4-й группе больных детей наблюдали преимущественно гастроэнте-роколиты и энтероколиты, среди которых на долю гемоколитов приходилось 28,6*9.9% от числа всех больных этой группы и 30,0*10,2% от числа больных с явлениями колита.

Вирулентность выделенных штаммов была более умеренной, lg LD50 8,23*0,28/95% lg.

Таким образом, острая клебсиелпезная инфекция, как при моно-, так и при микстинфекциид характеризуется поражением всех отделов ККТ, с преимущественным вовлечением в патологический процесс тонкого и толстого отделов кишечника (61, 7±4.25Е), со склонностью к затяжному течению у 72,1±3,8% больных. Выраженность отдельных клинических проявлений зависала от комплекса факторов патогенности и интенсивности их продукции штаммами клебсиелл.

Биолого-патогенетические свойства клебсиелл. Исходя из данных о продукции отдельных, наиболее часто встречаемых факторов патогенности

штаммов клебсиелл, был проведен анализ индивидуальных клинических проявлений. В результате сопоставления показателей было установлено, что выраженность диарейного синдрома, обильный жидкий стул, более 10-ти раз и сутки и его длительность, более 7-ми суток, наблюдали в группе больных, у которых выделенные штаммы обладали высокой и средней степенью ТЛ-энтеротонсигенности, при высоких и средних показателях адгезии, наличии III типа фимбрий (г=0.83i0,21). У больных, от которых были выделены штаммы с I типом фимбрий, в 8,5 раза чаще наблюдали признаки острых респираторных заболеваний, в 17,6*6,5% случаев из которых отмечены осложнения в виде пневмоний. Среди больных с массивным выделением клебсиелл, КОЕ/г lg 5,35 и более, температура была несколько выше, 38,2"С - 39,3"С и более продолжительнее» до 7-9-ти суток, что, вероятнее всего, связано со значительным выходом ЛПС в процессе аутоли-знса бактериальных клеток.

Симптом частой рвоты чаще всего наблюдался в группе детей с выделенными от них штаммами, продуцирующими ЭЦС (r-0.58*0, 23). Отмечена, хотя и слабая, но корреляционная зависимость между больными со II(А) и IV(AB) группой крови и частотой выделенных штаммов, обладающих гемолитической активностью в отношении эритроцитов II(А) и IV(AB) группы крсви(г=0.41¿0.12 и 0,32*0,17 соответственно).

Данные изучения факторов патогенности клебсиелл, выделенных от больных острыми кишечными инфенкциими и клинических проявлений позволили сделать предположение о том, что многообразие клинических форм и проявлений зависит от совокупности факторов патогенности клебсиелл, играищ« определенную роль в развитии инфекции.

Дисбиотчческие показатели кишечника. При анализе качественно-количественного состава микрофлоры кишечника, наличие дисбиотических сдзигов было установлено у всех больных, из них дисбиоз I степени в 25,7*3,1% случаев, дисбиоз II степени в 60,3*6,21 и дисбиоз III степени в 13,9*2.9*.

В группах больных с ионоинфекцией и микстинфекцией. осложненной сальконеллезом и шигеллезом, частота дисбиозов III степени была максимально высокой (19,2 ± 5.7* и 23, В * 9,3*. 1-0,35) при t>2,0, а дисбиозов I степени минимально низкой (14.9 * 5,2Я и 4.5*4,3Z, t»l,5), при t>2,3. Установлено, что дисбиозы II и III степени в 3,5-4,2 раза чаще наблюдались при среднетяжелом и тяжелом течении заболевания.

Наиболее часто выявленные нарушения были обусловлены угнетением анаэробной микроолоры В. bif idurn и Laclobacíllus до КОЕ le 3,0 - lg 5,0 /г. снижение лак-озопозитивной Е.col i, а о 20,5*3, 57, полним ие отсутствием.

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ АНТИГЕНЫ И ИММУНО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ КИШЕЧНОЙ КЛЕБСИЕЛЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

Несмотря на интенсивные исследования, все еще невыясненными остаются пути реализации патогенного потенциала клебсиелл и какие клеточные и гуморальные факторы вовлекаются в защитные механизмы детского организма, имеющего несовершенную защитно-адаптационную систему.

Бактериальные антигены. При исследовании 34-х сывороток крови больных детой, в возрасте от 6 месяцев до 1 года, проведенном в остром периоде при среднетяжелых и тяжелых формах заболевания установлена высокая частота выявления ЛПС (50,0*8,6%) и ФА-Ш (52,9*8, 6Я). t>2,J, при t<2,0 между ними, и наименьшая - ТЛЗТ, t>2.0. Высокая частота обнаружения ЛПС в сыворотке крови, вероятно, отражает состояние эндотск-синемии при тяжелом и среднетяжелом течении патологического процесса. А сравнительно высокая частота выявления ФА-III типа связана с доминированием фимбрий III типа у клебсиелл. выделенных из фекалий детей.

Анализ результатов исследования нопрофилътратов 162 больных и 68 здоровых детей показал статистически достоверные отличия по частоте выявления ЛПС, ТЛЗТ. ФА-I и ФА-III, превышающих в группе больных в 7.8-22,8 раза (t>5,4). Обращает внимание высокая частота обнаружения ЛПС (80,7*3, IX). ТЛЗТ (66,0*3,1%) по сравнению с ФА-I и ФА-Ш типов (22.8*3,3% и 54,9*3,9%. соответственно, при t>2,2).

Таким образом, при острой кишечной клебсиеллезной инфекции отмечается антигенемия. обусловленная высокой частотой обнаружения в крови ЛПС и ФА-III <50,0*8,636 и 52,9*8,6% соответственно) и незначительной - ТЛЗТ (8.8*4,9Х). Отличительной особенностью копрофильтратов является высокая частота обнаружения ТЛЗТ и ЛПС (66.0*3,7% и 80,7*3,1 соответственно) .

Факторы неспецифической защиты. Система защиты макроорганизма от инфекции располагает достаточно широким наборам естественных или неспецифических факторов,_ среди которых особенно важное место занимают фагоцитарные реакции.

Состояние ФАФ оценивали по показателям ФА. ФЧ и ЗФ в нейтрофилах периферической крови по отношению к К.pneumoniae и Е.coli.

При сопоставлении индивидуальных показателей у больных детей было выявлено, что при кишечном клебсиеллезе в остром периоде происходит активация ФАФ. Однако, имелась разнонаправленность по третьему показателю - ЗФ (рис.2).

Выявлено, что в группе больных с низким уровнем ЗФ (11,7*0,2%). частота тяжелых форм была максимально высокой (69,2*12,6/), а а группе больных с уровнем ЗФ 16.2*0.31 преобладали среднетяжелые iopua инфек-

Рис.2. Показатели ФАФ у детей, больных клебсиеллезом (показатели здоровых детей приняты за 1002)

ции (62.5*17. IX). Таким образом, ФАФ периферической крови у детей первого года жизни, больных клебсиеллезом, снижена по основной своей Функции - завершенности, несмотря на повышение активности и поглотительной способности фагоцитов.

Принимая во внимание сведения о той. что исход фагоцитарной реакции в определенной мере зависит от активности ферментов антиоксидант-ной системы фагоцитирующих клеток, была изучена активность миелоперок-сидазы. СОД и каталазы в лейкоцитах крови, показавшая, что активность этих ферментов у бальных детей была достоверно ниже, чем у здоровых (Р<0,05).

Руководствуясь положением о тон. что ответственными за завершающую фазу фагоцитоза является АФК. были проведено комплексное изучение процессов СРО. в результате которого обнаружены изменения в соотноое-нии показателей системы П0Л-А03 в сыворотке крови детей и остром периоде кишечного клебсиеллеза.

Интенсивность ХЛ, характеризующая генерацию (АФК) у больных детей возрастала на 1882 , относительно контроля. Показатели общей АОА сыворотки крови были снижены на 55,4%. А уровень конечного продукта ПОЛ-ИДА» коррелировал с интенсивностью ХЛ, превышая контрольные показатели на 83,82. Осмотическая резистентность эритроцитов, отражающая стабильность бномембран, была понижена на 35,42. Наиболее резкие изменения изучаемых показателей наблюдали у детей с тяжелой формой инфекции. На основании полученных данных сделано заключение: при остром кишечном клебсиеллезе у детей первого года жизни происходит активация процессов СРЮ, сопровождающаяся повышением уровня АФК, угнетением общей АОА сыворотки крови, накоплением ИДА в сыворотке и повреждением мембран эритроцитои. Быявлены нарушения Функциональной активности фагоцитов в периферической крови: снижена активность ферментов антиокси-дантной защиты и, при общем повышении активности и поглотителаной способности фагоцитов, понижается завершенность фагоцитоза. Все изменения показателей СРО и ОАО носят индивидуальный характер.

Локальная иммунная защита. По современным представлениям кишечные секреты обладают эффективной системой местной защиты, направленной против этиологических агентов бактериальной природы и их метаболитов.

При сравнительном анализе показателей концентрации здоровых детей и больных было выявлено, что уровень 1еА«. варьировал в широких пределах, от 0,06 до 1,62 иг/т копрсфильтрата а группе больных и от 0,06 до 0,82 мг/ил. в группе здоровых детей. Средний уровень среди больных детей был выше по сравнению со здоровыми, 0,7310,11 мг/мл. против 0,2410,06 ш'/ил (Р<0,01), Полученные нами результаты склоняют к заключению, что развитие острой кишечной клебсиеллезной инфекции у детей первого года жизни сопровождается повышением уровня в коп-рофильтратах, что Свидетельствует о более выраженной активации локальной иммунной защиты и,- вероятно, является компенсаторной реакцией, направленной на ограничение поступления бактериальных антигенов в организм ребенка, больного кишечной формой клебсиеллеэний инфекции.

Исследования по изучению местного специфического иммунитета позволили установить следующее: при клебсиеллезной инфекции у детей первого года жизни вырабатываются антитела против антигенов клебсиелл, поверхностно-структурных (фимбриальных адгезинов и линополисахарида) и метаболитных (термолабильного энтеротоксина). среди которых доминируют 1кА-анти. Выявлена корреляционная зависимость между частотой регистрации антигенов и специфических антител в колрофильтрагах. Локальный синтез антител у детей первых трех месяцев жизни существенно ниже, чем у детей второго полугодия жизни.

1«САМ1ФЯ-1

1дМПпи Ч>Й-1

16-12)

1»НЙп11 лпс «з>

ДОАпМППС '(3-6)

1«НйпН «Рй-1 (3-6)

1«П ЙпИ ТЙ-1 (<3)

1«П йпН Тй-ш (6-12>

1дИАпМ ЛПС <6-12>

довпи тп «з>

1«пйп1{ квт <3-6»

1дП йп«( ТЙ-1 II <3-6>

1дКйпи ТПЗТ (6-12)

Рис.3. Показатели уровня сывороточных антител у детей первого года жизни, больных клебсиеллезом в острой периоде

(А - 1 суиие всрх бояьяых. Б - по возрасту)

Гуморальный иммунитет. Базируясь на сообщениях о том, что ОКИ, в том числе и у детей раннего возраста, сопровождаются иммунологическими изменениями, изучено состояние общего и специфического иммунитета у 50 д'гтей , включающего показатели: сывороточные иммуноглобулины (IgM, IBG. IeAl. специфические антитела (Ifi-анти) и циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). Приведенные данные (рис.3) отчетливо демонстрируют повышенное содержание суммарных IfcM, IgM-анти ко всем четырем антигенам и ЦИК.

Полученные данные дают основание полагать, что повышение уровня IrM и IgM-анти является результатом собственного синтеза, представляющего собой защитно-компенсаторную реакцию организма ребенка в ответ на поступление бактериальных антигенов. Показатели IgG, IgG-анти и связанных с ними ЦИК-ItfG, были на уровне контроля, a IgA. IgA-анти и ЦИК-IgA значительно ниже. У детей в возрасте до трех месяцев чаще обнаруживались IgG-анти к ЛПС и ФА-III, что,вероятно,связано с циркуляцией материнских антител. Подтверждением тому явилось обнаружение IgG-анти к ФА-1 и ЛПС у трех зцороиых детей.

У детей в возрасте от 3-х до 6-ти месяцев и от 6-ти до 12-ти месяцев существенно выше уровень IgM-анти (Р<0.05) ко всем антигенам К. pneumoniae. Высокий уровень IgM свидетельствовал об активности процесса у детей в возрасте 3-12-ти месяцев, а низкий уровень у детей первых 3-х месяцев, по-видимому, связан с незрелоегьи иммуннокомпе-тентных клеток.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ПАТОГЕНЕЗА ОСТРОГО КИШЕЧНОГО КЛЕБСИЕЛЛйЗА

Экспериментальная[ модель для изучения механизмов,патогенеза ОКИ у детей раннего возраста. Изучение патогенных свойств возбудителей, механизмов патогенеза острых кишечных инфекций у детей раннего возраста и оценка эффективности лекарственных препаратов требует экспериментальных исследований на биологических моделях, адекватных организму, имеющему несовершенную защитно-адаптационную систему. Нани создана экспериментальная модель, воспроизводящая осноиные клинические характеристики ОКИ у детей раннего возраста (патент N 1707615 от 02.11.89г. "Способ моделирования острой клебсиеллезной кишечной инфекции").

Динамическое наблюдение показало, что инкубационный период составлял 4-5 суток. Первые клинические проявления отмечены на 5-7-й день от момента заражения, достигая разгара на 8-11-й день и характеризовались появлением симптомов интоксикации, в виде повьтения температуры. Снижения аппетита, развития адинамии, на фоне которой возникала диа-

рея. Потеря массы тела составляла 25-3QX.

Развитие кишечной инфекции сопровождалось и определенными морфологическими изменениями, которые характеризовались сочетанием дистрофических, воспалительных и микроциркуляторных нарушений, сопровождающиеся функциональными нарушениями.

Сравнительная характеристика изменений в динамике инфекционного процесса выявила появление четко-выраженных морфологических изменений в тонком и толстом кишечнике уже на 2-е сутки с последующим нарастанием их на 4-е сутки и последующие сроки. На 7-е сутки, при сохраняющихся тяжелых морфологических изменениях, появлялись признаки репаратив-ных процессов и восстановления.

Морфологические изменения в паренхиматозных органах соответствовали тяжести таковых в желудочно-кишечном тракте. Однако наиболее выраженные изменения отмечены в печени и легких. Установлено, что к факторам, способствующим быстрому развитию инфекционного процесса и ускоренной гибели животных, относятся переохлаждение, голодание, избыток сахарозы, как источника питания возбудителя и малая масса тела животных.

Влияние биологических свойств штаммов и их факторов патогенности на динамику клинических проявлений и исход инфекции. Отмеченная нами зависимость выраженности отдельных клинических проявлений кпебсиеллез-ной инфекции у детей от совокупности факторов патогенности клебсиелл и интенсивности их продукции, требовала экспериментального подтверждения.

Сравнительное изучение двух групп штаммов, с умеренной степенью ТЛ-энтеротоксигенности, отличающихся только по типу фимбрий, показало следующее: клинические проявления клебсиеллезной инфекции, имеют некоторые отличия по диарейному синдрому, лихорадке, осложнениям и летальным исходам. Так, штаммы, имеющие I тип фимбрий вызывали острое кишечное заболевание, сопровождающееся пневмонией, с бактериологическим подтверждением и высокой летальностью (до 55,6±16,6%). В желудочно-кишечном тракте выявлена десквамация покровного эпителия с оголением поверхности ворсин на всем ее протяжении. Имело место токсическое поражение органов в виде зернистой дистрофии миокарда, белковой и жировой дистрофии печзни; в легких сливная, абсцедирущая пневмония.

Клинические симптомы клебсиеллезной инфекции, обусловленной штаммами с III типом фимбрий, отличались выраженностью и длительностью ди-apeiihoro синдрома. При патшого-анатомическом обследовании этой группы животных обнаружены четкие морфологические изменения в тонком и толстом кишечнике, характеризующиеся сочетанием воспалительных микроцирку-

ляторных дистрофических нарушений. Наряду с воспалительной реакцией отмечены процессы репарации. Морфологические изменения в паренхиматозных органах соответствовали тяжести тчкоиых в желудочно-кишечном тракте.

При статистическом анализе выявлена прямая корреляционная зависимость между I типом фимбрий и частотой осложнений, III типом фимбрий и выраженностью диарейного синдрома (р-0,02*0,01 и р=0.76±0,02 соответственно) .

Полученные нами данные дали основание предполагать участие фимбрий I и III типов в адгезивном процессе при дифференцированной троп-ности к определенному виду тканей, имеющих определенный тип рецепторов, I тип - к легким, III тип - к энтероцитам кишечника.

При заражении животных штаммами, продуцирующими ТЛЭТ и ТСЗТ, были выявлены отличия в выраженности клинических проявлений. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что имеется некоторая взаимосвязь между интенсивностью продукции энтеротоксинов и выраженностью диарейного синдрома, интенсивностью токсинопродукции и потерей массы тела, при показателе корреляции рангов р*0.8±0,07 и B5iQ.05 соответственно.

Клиническая картина животных, зараженных штампами, продуцирующими а- и ft- гемолизины, характеризовалась ранним (уже на 2-е сутки) появлением интоксикации, быстро приобретающей массовый характер. Развитие диарейного синдрома наблюдалось с 3-х суток после заражения у отдельных животных С последующим нарастанием количества заболевших к 5-6-му дни. При вскрытии павших животных наблюдали картину, характерную для токсического поражения органов в виде зернистой дистрофии миокарда, белковой и жировой дистрофии печени, ранее отмеченной в группе ¿квотных, зараженных штаммами с I тлгюм фимбрий. При этом необходимо отметить наличие инъецированности сосудов стенок тонкого и толстого кишечника с крупными геиоррагиями. Содержимое толстого кишечника желто-зеленого цвета, слизистое, зловонное с прожи/а<ами.

Таким образом, полученные результаты экспериментальных исследований подтвердили выявленную нами зависимость степени выраженности отдельных клинических проявлений и морфологических изменений во внутренних органах от биологических свойств возбудителя заболевания.

Динамика переписного окисления липидои при острой кишечной клеб-сиеллезной инфекции. Принимая во внимание полученные мам.и данные о том, что острый период клебсиеллезной кишечной инфекции у детей первого года жизни сопровождается активацией сьободнорадикалыюго окисления, изучены показатели, характеризующие процессы СРО в динамике забо-

Рис.4. Показатели уровня АФК и ФАФ у кроликов подсосного возраста до начала эксперимента

(круг - средине »окааатели »«тактиых imiotiux. ромб - показателя > грушах с разной иитеясмностьв XI: I груша XI - «о 500 ина/имк; II груша - 500-670 кип/км*! III группа - XI ciuie 670 «мп/им»)

мм йой лая

А С &

Рис. 5. Показатели A0A. ПОЛ и ФАФ у,кроликов подсосного возраста при остром кишечном клебсиеллезе.

Круг - грешке «сказатели «о мнфмцироланил (i I). А - исходный уровень XI до 500 иип/ика, В - XI 500-670 ими/мин, С - XI .более 670 nun/ынн (L - летальность; XI - хем и í юы и нес Цен ци я; НДА - ыало-aoíuk днальдеги!; ОРЭ - осиотическая резистентность зритроцито»; ДОЛ - автиокиглителнав акгилность; ФА - фагоцитариая актщность; ФЧ - фагоцитарное число; 31 - завершенность фагоцитоза.

левания на созданной нами модели. При анализе показателей, характеризующих процессы СРО и ФАФ у кроликов до начала эксперимента, выявлено, что эти процессы индивидуальны.

При сопоставлении исходных показателей ФАФ у животных с уровнем ХЛ (рис.4), было установлено, что для реализации эффективного фагоцитоза необходим определенный оптимальный уровень АФК, обеспечивающий бактерицидное действие. Избыток АФК, как и дофшит, вносили дисшорди-нацию во все стадии фагоцитарной реакции, но в большей степени и ее завершающую стадию.

При анализе клинических проявлений отчетливо просматривались отличия в сопоставляемых группах по тяжести точении заболевания. У животных I группы с неблагоприятным анамнезом и низким исходным уровнем ХЛ течение инфекционного процесса было тяжелым, с летальными исходами до 6о, 17. от очаговой пневмонии на 5-7-е сутки. У кроликов с высокими исходными показателями ХЛ, точение заболевания было средней тяжести, при 33,3/ летальных исходов. Наиболее благоприятное течение отмечено у кроликов с умеренными исходными показателями Ж Клинические симптомы развивались на 5-7-0 сутки без летальных исходов, что подтверждает данные, полученные нами на клиническом материале, о том, что чрезмерно повышенный урезонь АФК, как и пониженный, приводит к развитию осложненных форм заболевания.

Выявленная синхронность изменений показателей, отражающих уровень АФК и ФАФ периферической крови при килечном клебсиеллезе и фазность изменений ХЛ и процессе развития инфекции, свидетельствует о процессах активации СРО в организме ь целом. Вместе с тем вопрос о том. качие изменения происходят в клетках мишенях - энтероцитах и других, наиболее часто поражаемых органах, остался все еще не изученным.

С этой целые проведено изучение состояния амтиоксидачтной системы организма животных и перекисного окисления липидов в энтероцитах, легких, почках и сыворотке крови в динамике инфекции. Установлено, что развитие инфекции в группе подопытных животных сопровождалось активацией СРО. При анализе полученных результатов изучения изменений в системе П0Л-А03 в энтероцитах легких, почках и сыворотке крови отмочена синхронная однонаправленность изменений, показателей ПОЛ при антибат-ности показателей А0.4. Процессы ПОЛ носили Фазный характер, более выраженный в сыворотке крови и энтероцитах. Повышение уровня МДА имело два пика и сопровождались снижением активности АОА и наоборот , при этом совпадало со сроками повышения и понижения интенсивности ХЛ в крови.

Анализ клкнико-бактьрио4югических параллелей показал, что в про-

цессе развития клинических симптомов клебсиеллезной инфекции, выявлена определенная зависимость между тяжестью течения патологического процесса и активностью ПОЛ и АОА. Появление первых симптомов инфекции совпадало со вторым пиком активизации ПОЛ (3-й сутки) и значительным повреждением мембран эритроцитов. Острый период заболевания, особенно при осложненных формах, сопровождался прогрессирующим повышением уровня НДА в сыворотке крови, энтероцитах и поврежденных органах. Максимальная выраженность антибатных изменений уровня МДА и АОА отмечена накануне гибели животных, что, вероятно, связано с полным нарушением динамического равновесия в системе ПОЛ-АОЗ.

Таким образом, выявленная выраженная фазность процессов активации ПОЛ и угнетения АОА в динамике развития инфекции, зависимость тяжести течения и исхода заболевания от исходного уровня АФК, подтверждают роль процессов СРО в патогенезе кишечной инфекции клебсиеллезной этиологии. Принимая во внимание фазность этих процессов и установленную на клиническом и эксперименттльном материале, взаимосвязь между уровнем ХЛ, активностью ферментов антиоксидантной защиты и показателями ФАФ, представилось целесообразным уточнить изменения фагоцитарных реакций в динамике развития инфекции.

Моделирование процесса острой кишечной клебсиеллезной инфекции проводили на кроликах с умеренным исходным уровнем показателей ХЛ (500-670 иип/мин).

Результаты изучения ФАФ периферической крови нейтрофилов в динамике клебсиеллезной инфекции показали изменения разнонаправленного характера. Начало развития инфекционного процесса сопровождалось синхронным повышением активности всех 3-х показателей ФА, ФЧ и ЗФ с последующим их снижением к исходу первых суток и по срокам совпадало с аналогичными изменениями ПОЛ. Второй подъем активности ФА и ФЧ сопровождался дальнейшим понижением показателей завершенности фагоцитоза до 4,5-5,0%, сохранявшейся на низком уровне весь период наблюдения, с некоторой тенденцией повышения на 9-е сутки. Генерализация процесса по срокам совпадала с периодом пониженной завершенности фагоцитоза. Очевидно, такая синхронность изменений ФАФ связана с компенсаторными механизмами организма.

Суммируя результаты изучения функциональной активности периферических фагоцитирующих клеток, уровня АФК, продуктов ПОЛ, антиоксидантной задиты и показателей летальности в зависимости от исходного уровня АФК кежно прийти к заключению, что процессы СРО являются одним из элементов пускового механизма в сложной системе взаимодействия микроорга-низ.'-юв С клетками макроорганизма на уровне фагоцитов, от которых зави-

сит исход инфекции.

Следующим этапом уточнении роли СРО в патогенезе острого кишечного клебсиеллеза явилось изучение влияния модуляторов СРО на течение и исход инфекции. В качестве прооксидантои использовали левамиaw, дифе-нин, антиоксидантов - витамин Е и изоптин.

Исследования, проведенные на экспериментальной модели кроликов подсосного возраста показали, что антиоксиданты изоитин и витамин Е, введенные животным в средних терапевтических дозах через 1 час после заражения, ингибируя интенсивность СРО на первых этапах заболевания, способствовали ускоренному развитию клинических сии п опей, более тяжелому течению заболевании, сопровождающемуся массовой гибелью животных на 3-5-е и реже 7-е сутки.

Прооксиданты (левамизол и дифенин), в аналогичных дозах, стимулируя образование АФК в начале инфекционного процесса, когда необходим повышенный их уровень, обеспечивающий бактерицидное действии, усиливают завершенность фагоцитоза и тем самым оказывают благоприятное влияние на тяжесть течении и исход клебсиеллезной инфекции.

РОЛЬ ФИМБРИЙ I И III ТИПОВ, ЛИПСПОЛИСАХАРИДА И ТЕРМОЛАБРЛЬНОГО ЗНТЕРОТСКСИНА К. pneumoniae В ПАТОГЕНЕЗЕ ИНФЕКЦИЙ

Подводя итог приведении данным, имеются все основания рассматривать фимерии I и III типов, липиполисахарид и териолабильный энторо-токсин, как факторы патогенности , общие для всех этиологически значимых К. pneumoniae и играющие важную роль в патогенезе инфекции. В этой связи представляло несомненный интерес раскрытие некоторых механизмов взаимодействия этих факторов патогенности с макроорганизмом на уровне биохимических процессии.

Механиам изаиждийстеия___фимбрийJ4 фимбр(Ш!ьных адгезинов I и III

типовое wioTKaiiM макрооргамизма.. Согласно общему представлению о том, что для большинства энтеробактерий фактором адгезии являются поверхностный структуры,фиыбрии или пили, представлялось необходимым установить участие фимбрий в адгезивном процессе клебсиелл.

Опыты in vitro показали, что гомологичные антитела к фимбриям I и III типов, их адгезинам оказывают ингибирующие действие как на адгезивный процесс, так и на адгезивные свойства аггакмои. Снижение адгезивных свойств микроорганизмов зависит от количества введенной в инкубационную смесо антисыиоротки. при этом температурный режим не оказывает влияния на снижение адгезивных свойств штаммов, несущих на своей поверхности гомологичные типы фимбрий.

Ингибирующее действие антител к фимбриям I и III типов, а также

их адгизинов на микроорганизмы, несущие на своей поверхности гомологичные типы фимбрий, позволяют утверждать непосредственное участие фимбрий I и III типов в адгезивном процессе, а так_^же предполагать возможный притективный эффект антител.

С целью установления протективного действия специфических антител, были проведены исследования в опытах in vivo на модели белой мыши, путем внутрибршинного введения 0,5 мл цельных сывороток к фимбри-ям I и III типов, с последующим, с интервалом в 30 мин, введением взвеси живых культур. Результаты опытов in vivo показали, что гомологичные, по отношению к типу фимбрий, антитела обладают ярко-выраженным протективным действием. Гетерологичные антитела обеспечивают лишь частичную защиту, что,вероятно,связано с определенной степенью специфичности антител. Механизм ингибирующего действия гомологичных антител, вероятно, связан с блокированием соответствующих активных центров ад-гезинов, препятствующих прикреплению фимбрий к рецепторам клеток макроорганизма.

Необходимо отметить обратную корреляционную зависимость между степенью адгезии, по данным СПА и концентрацией специфических антител, г=0,82, при mr»0,0G для I типа фимбрий и г-0,88. при гаг=0,05 для III типа фимбрий. Имеющиеся колебания СПА при обработке другими сыворотками, к бактериальным антигенам: ТЛЭТ, холерогену, адъюванту Фрейнда, а также сывороткой человека, статистически не значимы (р>0,05).

Приведенные выше данные позволяют утверждать, что ингибирующее действие на адгезивный процесс и адгезивные свойства штаммов оказывают только сыворотки, содержащие гомологичные антитела к фимбриям I и III типов, а так'-же их адгезинам. Данное утверждение дает основание полагать, что фимбрии I и III типов участвуют в адгезивном процессе и что именно они являются антигенами адгезии у штаммов К. pneumoniae. Однако неполнота ингибирования адгезивного процесса и адгезивных свойств штаммов гомологичными антителами подтверждает высказанное нами ранее предположение о том, что в адгезивном процессе, кроме фимбрий, принимают участие, вероятно и другие компоненты бактериальной клетки.

Отмеченная рядом исследователей взаимосвязь энтеротоксигенных и адгезивных свойств энтеробактерий и установленная нами прямая корреляционная связь между степенью ТЛ-энтеротоксигенности и степенью адге-зивности, среди штаммов клебсиелл с III типом фимбрий, предполагает взаимное влияние этих факторов латогенности друг на друга. Однако сведений, подтверждающих данное предположение, в доступной нам литературе не обнаружено. С целью выявления возможного влияния ФА на экспрессию энтеротоксигенных свойств штаммов, были проведены эксперимен-

тальные исследования. Изучение влияния ФА-I и ФА-1П на продукцию ТЛЭТ проводили при культивировании штампов К. pneumoniae N729 и Е. ш11 N193 на «сидкой питательной среде - 37 гидролизате гидробионтов (Махачкала), без внесения дополнительных стимуляторов синтеза энтеротоксина. Анализ полученных результатов показал, что ФА-I и ФА-HI, не оказывая влияния на урожайность культуры, усиливают продукцию ТЛ37 но только К. pneumoniae, но и Е. coli, Установлена тесная взаимосвязь между дозой ФА и токсинопродукцией. Максимальный стимулирующий эффект был достигнут под действием ФА-Ш, в дозе 100-150 мкг/мл. при которой кратность усиления токсинолродукции составляла 1,92 раза для К. pneumoniae и 1,74 раза для Е. coli (р<0,01). Показатели максимального стимулирующего эффекта под действием ФА-I составляли 1,56 раза для К. pneumoniae и 1,42 раза для Е. coli (р<0,05). Результаты исследования ЛБК и тесте отека лапы согласовались с данными РДДГ с антисыоороткой к ТЛЭТ Е.coli и хо-лерогену. Роль ТЛЭТ и регуляции системы цАМФ в настоящее время ио оспаривается. Учитывая выявленное нами етииулнруещое действие OA на продукцию ТЛЭТ, представляло интерес выяснить возможное влияние и адгези-нов на систему цАМФ. Серией ontvrou на модели эритроцитов человека IV(AB) группы крови Rli', было установлено, что CA-I и ФА-Ш и дозах 5,0: 10; 25; 50 и 75 мкг не вызывают повышения /ровня цАМФ и не приводят к усилению действия ТЛЭТ.

В опытах in vivo на кроликах подсоснш-о возраста было показано, что внутривенное введение OA-1 и ФА-Ш в дозе 5-10 мг/кг массы тела, через 24 часа после заражения энтеротоксигеиным штаммом К. pneumoniae, оказывало ускоряющее действие на развитие диареи - на 3-й сутки. Появление дигрои и контрольном опыте (заражение без последующе!-о введения ФА) наблюдали лишь на 7-е сутки.

Выраженность диареи носила зависимый от дозы характер.

Суммируя полученные нами данные, можно полагать, что ФА принимают участие в регуляции диарейного синдрома-опосредованно. Механизм участия может быть представлен в виде следующей схемы (рис.6).

Таким образом, подведенные итоги результатов исследований по изучению механизмов взаимодействия фимбрий К. pneumoniae и ФА с клетками макроорганизма дают основания к следующему-заключению:

Фимбрии I и III типов К. pneumoniae принимаю? непосредственное участие в адгезивном процессе путем секреции ФА, обеспечивающих связывание с рецепторами клеток макрооргамиэма. Специфические антитела обладают протективным действием, выраженным по отношению к гомологичным и частичное по отношение к гетерологичным типам фиибрий. Специфические антитела, блокируя соответствующие активные центры адгеэинов, ингиби-

К :иточс1ая мембрана

\

№осгет кииешка

Шлччтчч&ттХГ Зттьактерми у

в«»* ■ ---—г—

стнмдоция синтеза ПЧох

,.............

......................

вазж

К.рглипотае

Рис. 6. Механизм регуляции диарейного синдрома фимбриальными адгезинами К. рпешпогпае.

руют процесс адгезии фимбрий к рецепторам кпетон макроорганизма.

ФА принимают участие в регуляции диарейного синдрома, оказывая стимулирующее действие на продукцию ПЭТ. который через активацию аде-нилатциклазы, усиливают образование циклического аденозинмонофосфата. Избыток последнего нарушает NA*-К*-равновесие клеток, приводящее к выходу жидкости из клетки и ее накоплению в просвете кишечника. ФА-1 усиливают продукцию ТЛЭТ энтеробактерий в 1,42-1.56 раза, ФА-III - в 1.74-1,92 раза.

Роль липополисахарида в активации свободнорадикального окисления. Учитывая, что ЛПС играет определенную патогенетическую роль, связанную с ого токсичностью, а также выявленные нами изменения процессов СРО в остром периоде заболевания у детей и в динамике развития экспериментальной инфекции, представлялось целесообразным уточнить характер изменений процессов СРО под действием ЛПС.

Исследования проводили в опытах in vivo на модели белой мыши, путем внутрибрюшинного введения препарата ЛПС, в дозе, соответствующей L0<5q (200 мкг/иыяь).

Динамика изменений изучаемых показателей указывала, что в ранние сроки после инъекции ЛПС, в лимфоцитах наблюдали увеличение уровня АФК, которое сопровождалось симбатным увеличением активности СОД и ан-тибатным изменением глутатионтрансфсразы. Симбатность изменений активности эгих антиоксидантных ферментов с генерацией АФК отмечена также через 48 часов. В более поздние сроки, к исходу 6-х суток все изучаемые показатели приближались к контрольному уровню.

Изучение возможности регуляции токсичности ЛПС препаратами анти-оксидантного действия проводили путем внутрибрюшинного введения последних в разные сроки, до и после введения ЛПС.

Анализ полученных результатов по изучению влияния антиоксидантов на показатели летальности белых кышей, отражающих токсическое действие ЛПС К. pneuiscniae, отчетливо показал, что перокеннорм, где действующим началом является СОД, витамин Е и витамин С, усиливает токсическое действие, наиболее выраженное в более ранние сроки, за 1 час до введения эндотоксина. Усиление токсичности может быть обусловлено подавлением Функциональной активности фагоцитов, обеспечивающих деструкцию ЛПС. Введение антиоксидантов через час, в момент максимального повышения АФК и связанного с ним активацией ПОЛ, обеспечивает поддержание этих процессов на физиологическом уровне.

Эффект действия изоптина отличается от остальных антиоксидантов. При этом просматривается та же закономерность зависимости процента летальности жииотных от сроков вредсния препарата. Через 1 час после

введения ЛПС изоптин оказывает полное нейтрализующее действие эндотоксина. Возможно механизм йнгибирующего действия изоптина опосредован Са-зависимым внутриклеточным процессом. Однако не исключено, что это антиоксидантное воздействие на организм животных более опосредованное, поэтому эффект антиоксидантной защиты более отдаленный, благодаря которому пик ее активности совпадает с пиком АФК и связанных с ним процессов ПОЛ. В пользу последнего свидетельствуют данные сроков введения препаратов, при которых наблюдали 100Х гибель животных. Так, для СОД это время составляло 1,5 часа до введения ЛПС, для витамина Е - 2 часа и витамина С - 1 час.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ РАЗРАБОТКИ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ К.pneumoniae

Несмотря на имеющиеся теоретические разработки по созданию диагностических препаратов для тестирования факторов патогенности энтеро-бактерий, в том числе и клебсиелл, отсутствуют технологии их изготовления. Отсутствие коммерческих препаратов не позволяет качественно проводить этиологическую расшифровку ОКИ, обусловленных УПЭ.

В этой связи разработка технологии получения диагностических препаратов на основе факторов патогенности, представляет теоретический интерес и практическую значимость.

Разработка технологии получения антигенов. Создание диагностических препаратов базируется на получении антигенов. В качестве последних нами были использованы факторы патогенности: ФА-I и ФА-III , ТЛЭТ, ЛПС К. pneumoniae.

На первом этапе разработки технологии было получение биомассы. В качестве штаммов продуцентов фимбрий I типа, фимбрий III типа, ЛПС и ТЛЗТ использовали штаммы, депонированные в Государственной коллекции (Патенты РФ N1777607, N1742322. N1788965; АС 5043066/13).

Разработанные нами критерии оценки этиологической значимости К.pneumoniae при ОКИ, на основе патогенетически обоснованных факторов патогенности и выявленные особенности специфического иммунного ответа на эти факторы, создавали предпосылки для разработки диагностических препаратов, которые можно было проводить по двум направлениям: созданию тест-систем на основе иммуноферментного анализа и конструированию питательных сред. Создание иммуноферментных тест-систем базировалось на разработке технологий получения факторов патогенности - как антигенных препаратов. В качестве последних нами были использованы установленные нами патогенетически значимые факторы патогенности: ФА-I и ФА-III, ТЛЭТ и ЛПС К. pneumoniae. Подобраны и адаптированы к различным питательным средам и условиям культивирования промышленные штаммы-про-

дуценты антигенов: фимбрий I и III типов, ЛПС и териолабильного энте-ротоксина (патенты РФ N1777607, N1742322, N1788965; АС N5043066/13).

Проведенные эксперименты по подбору питательных сред и условий культивирования показали, что наиболее перспективными питательными средами нвливтея гидролиэаты крови животных и гидробионтов. обеспечивающие максимальные урожайность культуры и выход целевого продукта на 1 единицу сырья при глубинном культивировании всех отобранных нами штаммов-продуцентов.

Следующим этапом работы явилась разработка технологичного способа выделения антигенов, с последующим получением чистых препаратов: ФА-I, ФА-III, ТЛЭТ. ЛПС.

В основу технологии получения ФА-1 и СА-ГП был положен метод Oíd О.С. et al. (1985) в кал'Ой модификации (Положительное решение на выдачу патента N93-052663 от 22.11.93). С целью понижении- чистоты препарата, бактериальные клетки вначале отмывали от камсульмых полисахаридов насыщенным раствором хлорида натрия, затес, отделили финбрми на механическом дезинтеграторе "Virtia" при установленном оптимальном режиме для каждого типа фимбрий.

Свободные фимбрии итделчди от клетик центрифугированием при Факторе разделения 5000-10000 р. (Вескгсал). Последующие этапы включали концентрировании фимбрий методом сульфатаммонийного осаждения, многоступенчатого диализа и ультразвуковой дезинтеграции, с последующей гель-фильтрации на 5epl»acryl £--200. Установлено, что ультразиукопые дезинтеграты Фимбрий (УЗДФ) обладают антигенными свойствами, УЗДО-I и УЗДФ-Ш содержат по 5 и 3 компонента. Наибольшей способностью к индукции антител обладали 1-я, 2-я фракции УЗД0-1 (ФА-I) и 1-я фракция УЗДФ-Ш (ФА-Ш).

Электрофаретический анализ ФА-I и ФА-Ш показал, что адгезины представляют собой пилежительно-заряженные белковые фракции, с ММ 13,5 кД - I типа и 25,0 кД - III типа, характеризующихся иысокой электрофо-ретической подвижностью.

Изучение спектра аминокислот препаратов CA, показало общность состава и их процентного содержания. Вариабельность выявлена по 6 аминокислотам , ФА-III отличался от ФА-I отеутстлийи аргинина и метионина, повышенным содержанием лизина и фенилаланина (л 1,8 - 2,3 раза). Солее низким содержанием лейцина и зспарагина (в 1,6 - 1,8 раза).

В ходе разработки технологии получения ТЛЭТ пикааано, что в качестве произойди шейных штаммов-продуцентов ТЛЭТ могут быть использованы E.coli и X. pneumoniae. Однако наибольший выход ТЛЭТ достигается при культивировании Б. coi i.

Введение и питательную среду лиииомнцина (75 мкг/мл) и каталазы (25 - 30 мкг) способствовало увеличению выхода целевого продукта. При-

Глубинное культивирование штаммов-продуцентов токсинов

Приготовление растворов реагентов для тест-систем

Выделение

и

очистка антигенов

Подбор дозы антигена, расфасовка

Иммунизация животных, получение гипериммунных сывороток

Выделение иммуноглобулинов

Подбор дозы антигена, расфасовка

Получение конъюгатов

Подбор рабочего разведения конъюгата, расфасовка

| Контроль |

Комплектация! тест-системыЯ

Лаборатории ЦГСЭН ЛПУ ИЗ и МП

Рис.7. Унифицированная схема производства диагностических тест-систем для тестирования факторов патогенности энте-робактерий и антител к ним.

сутствпо каталазы повышало микробное число, а линкомицина - усиливало продукцию ТЛЭТ.

Последующая технологии включала псаждение биомассы, ультразвуковую дезинтеграцию, выделение ТЛЗТ методом адсорбционной хромаюграфин на бногеле Bio-Rad 5Ат, модифицированном по методике Воронова С. Е. (1985) и гель-фильтрацией на Sepliacryl S-200.

Ммнунихимичесний анализ ТЛЗТ полазал, что змтеротоксины обладает неполной антигенной идентичностью между собой и холерогеном (Serva). Полученные нами данные по основным характеристика).! ТЛЭТ К. pneumoniae и Е.coli совпадают с описанными другими авторами (Степанова М. В.. 1936; Eutly V.J. el al., 1986; Haiilari A. etal., 1987), что позволило использовать термолабильный эптератоксин Е.coli и качестве антигена при получении диагностических препаратов.

Технология получения ЛПС включала культивировали!; штамма, выделение и очистку методом гель-фильтрации на Sephacry] S-200.

В результате экспериментальных исследований разработана унифицированная технология получения антигенных препаратов вкгичавщая культивирование штаммов-продуцентов факторов патогенности, выделения и очистки последних с использованием отечественного сырья и технологического оборудования.

Учитывая все возможности метода ИФА, бьша поставлена задача создания на его основе комплекса тест-систем дли тестирования факторов патогенности энтеробактерий и антител к ним.

Применение в клинической практике разработанных препаратов, не только повысило качество этиологической расшифровки ОКИ у детей раннего возраста , но и, благодаря возможности определения классоспецифи-ческих антител, оказало существенную помочь в правильной оценке фазы и тяжести инфекционного процесса.

Использование тест-систем в эпидемиологической практике при микробиологическом мониторинге за УПЭ а стационарах различного профиля, позволило прогнозировать осложнения и предупреждать случаи инутриболь-ничных инфекций. Возможность тестирования факторов патогенности не только в культурах, но и других биологических жидкостях, позволило оперативно вменять причины возникновении вспышек и группоных ОКИ среди детей до ныделения возбудителя. А определение иммунного ответа организма на факторы патогенности по классам антител, дало возможность дифференцированно подойти к вопросу источник инфекции-пострадавший.

Прин1)ипы разработки наб()ра_митательнь:х_сред _для „дифференциации

патогенных и нспатогенных_ энтеробактерий,___в том числе jt Кj'neomoniае.

Имеющиеся и литературе сообщения свидетельствует о оозмояности использования питательных сред, позволяющих дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы.

Серия экспериментальных исследований, проведенная нами, показала возможность создании набора питательных сред для выявления ряда факто-

ров и признаков патогенности энтеробактерий. В основу технологии была положена способность штаммов продуцировать биологически-активные вещества. которые диффундируя в питательную среду, содержащую соответствующие субстраты, изменяют цвет питательной среды или внешний вид колоний (таблица 4).

Таблица 4.

Питательные среды для дифференциации патогенных и непатогенных штаммов энтеробактерий

Наименование среды Назначение Принципы действия Уровень и этап внедрения

ТЛЭТ Выявление термолабильного энтеротоксина Накопление внутриклеточного ТЛ-эн-теротоксина Заявка на изобретение N94030871/13 приоритет от 05.08.94 Проект ВФС и ЗПР, ЭПС на рассмотрении в ГФК

ДНК-аза Выявление ДНК-азной активности Деполимеризация субстрата -ДНК,под действием фермента ДНК-азы Рац. предложение отраслевого значения N0-9109 от 29.04.88 Проект ВФС и ЭПР, ЭПС на рассмотрении в ГФК

ДФНА Выявление фосфатазной активности Расщепление субстрата натриевой соли дифосфата фенолфталеина Рац. предложение отраслевого значения N0-3512 от 27.10.90 Инструкция по изготовлению и контролю

Конго-рот Определение интенсивности дыхания Вирулентные шташы приобретают ярко-красную окраску Рац. предложение N15/90 от 28.05.90 Инструкция по изготовлению и контролю

Суммируя результаты сопоставления питательных сред с различными

основами, мы пришли к заключению, что для штаммов клебсиелл наиболее эффективными являются среды с углеводными основами, способствующие проявлению патогенных признаков.

Результаты апробации показали, что несмотря на многокомпонент-ность, среды просты в приготовлении, а способ исследования штаммов (посев бляшками) позволяет изучать одновременно 10-20 культур на одной чашке. Применение питательных сред, позволяющих дифференцировать патогенные и непатогенные штаммы, не требует специального оборудования и может быть использовано в лабораториях любого уровня.

Таким образом, результаты экспериментальных биотехнологических исследований показали возможность создания диагностических препаратов для тестирования факторов и признаков патогенности. Разработаны комплекс иммуноферментных тест-систем, включающий 6 препаратов и набор питательных сред из 4 препаратов.

Применение разработанных препаратов для определения факторов и

признаков патогенности на практике позволило повысить качество этиологической расшифровки до 94,012,5Z. что и целом способствовало своевременной и целенаправленной разработке лечебных и экстренных противоэпидемических мероприятий при вспышках ь групповых заболеваниях ОКИ среди детей.

ВЫВОДЫ

1. К. pneumoniae по частоте выделения и этиологической значимости при острых кишечных инфекциях у детей первого года жи^ни являются ведущими. Удельный вес этиологически значимых штаммов К.pneumoniae составляет 40,3±1,21, обусловливающих дисбиоаы кишечника

50, 712, 22.

2. К. pneumoniae способны к продукции ряда факторов патогенноети, выполняющих различные функции. Частота выявления и вирулентность штампов, выделяемых от больных достоверно выше, чем от здоровых детей. Существует прямая зависимость между вирулентностью и совокупностью факторов патогенности (г/0, 58, при ov^-i)-

3. Среди штаммов К.pneumoniae, выделенных из фекалий детей, доминируют штаммы С III типом фимбрий (73,012,87), доля штаммов с I типом фимбрий составляет 15,812,32, без фимбрий - 11.1 ¿2.0л. Штаммы с III типом фимбрий обладают сочетанпой высокой степенью адгезии и термолабильной энтеритоксигенностьв (г -0,75. гг,. 08). Экспериментально доказано участие фимбрий I и III типов в адгезивном процессе клебсиелл. Специфические антитела к фимбриии и фимбриальньм ад-гезинам ингибируют процесс адгезии. Получены в чистом виде фимбри-альные адгезины, представляющие собой белки с MM I тип - 18,5 КД и III чип - 25 КД. Определен состав аминокислот. Фимбриальные адгезины стимулируют продукцию термолабильного энтеротоксина К. pneumoniae и Е.coli. Адгезины III типа увеличивают продукцию в 1.74-1,92 раза. I типа - ч 1.42-1,56 раза.

4. Острая клебсиеллеаная моно- и микст-инфекции характеризуется поражением всех отделов желудочно-кишечного тракта, с преимущественным вовлечением в патологический Процесс тонкого и толстого отделов киаечника (61,7*4.22», со склонностью к затяжному течению у 72,113,82 Сольных и развитием дисбмотичоских сдвигов кишечника. Выраженность отдельных клинических проявлений инфекции зависит от совокупности факторов патогенности клебсиелл и интенсивности их продукции.

5. Экспериментально установлено, что липополисахарид К.pneumoniae стимулирует образование АФК в лимфоцитах животных в течение первых

24-х часов. Повышение уровня АФК сопровождается изменениями активности ферментов АОС: в течение первых 2-х часов происходит адекватное повышение, затем последующее снижение. Через 4В часов понижение уровня АФК сопровождается повышением активности ферментов. Полное восстановление указанных изменений наступает на 6-е сутки.

6. У детей первого года жизни в остром периоде кишечной клебсиеллез-ной инфекции установлена антигенемия, обусловленная преимущественно липополисахаридом (50,0*8,6%) и фимбриальныи адгезином III типа (52,9*8,6%), незначительно - термолабильным энтеротоксином (В, 8*4,9Х). В копрофильтратах достоверно высокая частота обнаружения терислабильного энтеротоксина (66,0*3,7%).

7. К. pneumoniae индуцирует специфический системный и местный гуморальный иммунитет на собственные факторы патогенности. Частота обнаружения антител и их уровень к липополисахариду и термолабильному энтеротоксину достоверно выше в копрофильтратах, в крови - к липополисахариду и термолабильному энтеротоксину. В остром периоде доминируют антитела класса "М".

8. У детей первого года жизни в остром периоде кишечной клебсиеллез-ной инфекции происходят нарушения функциональной активности фагоцитов периферической крови, связанные с достоверным снижением активности ферментов антиоксидантной защиты лейкоцитов (миелоперок-сидазы, супероксиддисмутазы и каталаэы) и, при общем повышении активности и поглотительной способности фагоцитов, происходит понижение завершенности фагоцитоза.

9. Острый период клебсиеллезной инфекции характеризуется активацией свободно-радикального кислорода: повышение АФК (до 188%), усиление ПОЛ, приводящее к увеличению уровня ИДА в сыворотке крови (на 83,8%) и понижение резистентности мембран эритроцитов (на 35,4%), при общем понижении антиокислительной активности сыворотки крови (на 55.4%).

10. Экспериментально установлено, что в динамике развития инфекции происходят фазные изменения функциональной активности фагоцитов: начало развития инфекционного процесса сопровождается синхронным повышением активности всех 3-х показателей: ФА., ФЧ. и ЗФ., с последующим их снижением к исходу первых суток. Второй подъем активности ФА и ФЧ сопровождается дальнейшим понижением ЗФ, снижаясь до 4,5-5%. Развитие генерализованных форм инфекции происходит при пониженном уровне.АФК и низком проценте завершенности фагоцитоза.

11. Экспериментально показано, что развитие острой кишечной клебсиеллезной инфекции сопровождается активацией процессов СРО, с выра-

женной фазностыо, резким повышением АФК и уровня ПОЛ в первые сутки после инфицирования и в остром периоде заболевании при антибат-ных изменениях показателей, отражающих АОС. Течение и исход инфекции зависят от исходного уровня сбалансированности системы ДОЗ-ПОЛ и имеет решающее значение на первых этапах инфекции. Антиоксиданты (витамин Е, изоптин), ингибируя интенсивность ПОЛ на первых этапах заболевания способствуют ускоренному развитию клинических симптомов, тяжелому течению, сопровождающемуся массовой гибелью животных на 3-5-е сутки. Прооксиданты (левамизол, дифенин) оказывают благоприятное действие на течение и исход инфекции.

12. На основе факторов патогенности К. рпошшгпао разработаны диагностические препараты: 1) иммуноферментные тест-системы, направленные на тестирование факторов патогенности и для выявления антител к ним; 2) питательные среды, позволяющие дифференцировать патогенные и непатогенные штаммы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В целях повышения качества этиологической расшифровки ОКИ у детей раннего возраста рекомендуется методический подход, основанный на определении факторов и признаков патогснности клебсиелл и других энтеробактерий.

2. В целях повышении качества иммунодиагностики клебсиеллезов у детей раннего возраста рекомендуется применение методов, направленных на обнаружение антигенов в копрофильтратах: термолабильного энте-ротоксина. фиибриалъных адгезинов; в крови: липомолисахарида, фимбриальных адгезинов и методов, направленных на выявление антител к этим антигенам в крови.

3. Путем внедрения комплекса диагностических препаратов, иммунофер-ментных тест-систем и питательных сред, необходимо обеспечить раннее и активное выявление клебсиеллезов у детей первое [-ода жизни.

4. Для оценки прогноза течения заболевании и рационального применения средств патогенетической терапии рекомендуется включить а комплекс лабораторных исследований тесть, позволяющие оценивать состояние неспецифг.ческих Факторов защиты: фагоцитарного звена иммунитета. сбалансированность системы АОЗ-ПОЛ.

5. Результаты настоящих исследований могут быть использованы в учебно-методических пособиях и практических рекомендациях при постдипломной подготовке врачей-бактерисшогов, иммунологов по вопросам бактериологической и иммунологической диагностики инфекционных заболеваний, педиатров и инфекционистов.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Частота выделения условно-патогенных микроорганизмов у детей, больных острыми кишечными заболеваниями /Каминская В.П., Конюхова Н.А., Калинина Т. 3. /. - // Проблемы медицинской и санитарной микробиологии города : Тезисы обл. конф. - Ростов-на-Дону, 1987,- С. 19.

2. Динамика накопления термолабильного энтеротоксина Е.coli на жидких питательных средах /Калинина Т. Э., Каминская В.П., Лобанов В.В., Рожков Е.В./.- // Сб. Бактериальные токсины.- Москва, 1987,-С. 89-92.

3. Циркуляция условно-патогенных микроорганизмов в родильных домах / Конюхова H.A. Каминская В.П. /.-// Гигиенические аспекты изучения биологического загрязнения объектов окружающей Среды: Матер. X Всесоюзн. конф. - М., 1988. - С. 128-129.

4. Определение иммуноглобулинов классов A.M.G. в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа /Шатокишвили Н.В./.-//Реабилитация иммунной системы: Тезисы докл. I Всес. симпозиума, 1908. - С. 158 -159.

5. Среда для определения ДНК-азы клебсиелл /Солдатова Л.В./. -//Лаб.дело,- 1989,- №8,- С. 61-62.

6. Определение адгезивных свойств клебсиелл и их оценка /Землянкина Л.П./.- //Лаб.дело. - 1989.- № 10.- С.68 г 70.

7. Энтеротоксигенная и гемолитическая активность К.pneumoniae //2-я Всесоюзн. конф. "Бактериальные токсины": Тез. докл. - Юрмала, Латвия, 1989. - С. 73.

8. Применение иммуноферментной тест-системы для определения термолабильного энтеротоксина Е.coli и антител к нему в расшифровке групповых ОКИ/Саухат С. Р., Рублев Б.Д., Цивин B.C./.- //Там же.-С. 74.

9. Стабилизация атигенныя свойств термолабильного энтеротоксина Е. coli / Благородов С.Г., Езепчук Ю.В., Рублев В.Д./.-//Там же. - С. 17.

10. ДНК-азная активность К. pneumoniae /Бусарева Г. Н. /. - Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование:Тез. докл.- Рига, 1989 - С. 17.

И. Симбриии биологические свойства штаммов К. pneumoniae /Землянкина Л. П., Бардахчьян 3. А. /. - Вестник всесоюзн. микробиол. общ-ва. Рост. отд., 1989.-Вып. 1 - С. 57-59.

12. Клинико-эпидемиологическая характеристика вспышки острой клебсиел-лезной инфекции у новорожденных /Симованьян 3.Н., ЛОвердо Р.Г.,

Крюкчиева И.Г., Лысов П.С./.- //Вопросы перинатальной диагностики и лечения. - Нальчик, 19В9. - с. 61-64.

13. Экзогенный липополисахарид: положительный сигнал для активации лимфоцитов и системы перекисного окисления липидов /Уваров В. Д., Поляков В.М., Шепелев А. П./.- //Свободно-радикальное окисление в эксперименте и клинике: Респ. сб. научн. тр. - Караганда, 1989.-С. 38-41.

14. Состав жирных кислот клеточной стенки К.pneumoniae /Гасанова Л.И., Бондаренко Е.М., Шепелев А.П. и др./. -//Всес.конф.Регуляция микробного метаболизма: Тез. докл. - Пущино, 1989.- С. 29.

15. Обоснование критериев патогенности К.pneumoniae //Всес. конф. Мпле-кулярные механизмы развития инфекционных заболеваний: Тез. докл. -Звенигород, 1990,- С. 63.

16. Изучение стабильности R-плазмид у энтеробактерий /Лысов П С., Лы-сова Л. К., Головина С. В. /.- //Экология человека. Механизмы интеграции биологических систем. Проблемы адаптации : Тез. докл. науч-но-практ.конф., г.Ростов-на-Дону, 1989.-С. 153 - 154.

17. Получение и очистка термолабильного энтеротоксина Е. col i //Всес. симпозиум Химия белков: Тез. докл. - Тбилиси, 1990.-С. 62.

18. Роль К. pneumoniae в развитии острой кишечной инфекции новорожденных /Симованьян Э.Н., Ловердо Р.Г., Лысов П.С./.- //Вопросы охраны материнства и детства. - 1990.- (86.- С. 15 - 17.

19. Факторы патогенности некоторых условно-патогенных бактерий, вызывающих диареи /Хмелевская Г. В., Девтероаа Л. В., Яговнин Э. А.. Шепелев А.П./.- //аурн. микробиол. .эпидемиол. и иммунобиол. - 1990. -N. - С.

20. Среда для определения ДНК-азы клебсиелл /Солдатова Л.В./. - //Изобретательство и рационализация в медицине- Москва, 1990.- С.40-41.

21. Перспектива разработки питательных сред для дифференциации патогенных клебсиелл и других энтеробактерий // Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии: Тез. докл. - Махачкала, 1990.- С.88-89.

22. Среда для определения фосфатазы клебсиелл /Зеилянкина Л. П..Благо-родов С. Г. /. - //там же, - С. 90.

23. Плазмидный состав и биологические свойства клинических штаммов К. pneumoniae /Ракин A.B., Рыкова В. В./.- //Бактериальные плазмиды: Тез. докл. - Нальчик. 1990 - С. 101-105.

24. Роль микробиологического контроля в выборе антибактериальной терапии при кишечной клебсиеллезной инфекции у детей раннего возраста /Владимирова Е.В., Ловердо Р.Г., Чертищева Е В./. - //Антибиотики и

химиотерапия.-1990. - Т. 35, № 9. - С. 45-46.

25. Применение метода иммуноферментного анализа для выяснения этиологии случая группового заболевания школьников острыми кишечными инфекциями /Саухат С.Р., Швагер М.М., Яценко В.Г. и др./.- //Острые кишечные инфекции. - Л, 1990,- Вып. 15. - С. 84.

26. Диагностика, прогнозирование течения и лечения острых кишечных инфекций условнблатогенной и смешанной этиологии /Кветная А.С., Носенко Л.М. и др./. - /Метод, реком., утвержд. МЗ РСФСР 23.11.90г. -Л., 1990.- 27 С.

27. Электронно-микроскопическое изучение фимбрий К. pneumoniae /Землян-кина Л.П./.- //Обл.науч.-техн. конф., посвящ. Дню радио:Тез. докл.-Ростов н/Д, 1991. - С. 49 - 50.

28. Особенности состава жирных кислот клеточной стенки клебсиелл /Шепелев А. П. /. - //X Всесоюзная конференцияvгазовой хроматографии: Тез. докл. - Казань, 1991.- С. 149.

29. Клиникэ-морфологические изменения ЖКТ при остром кишечном клебси-еллезе в эксперименте /Ловердо Р. Г., Скорикова В.П./. - //Мат. пленума Всерос. науч. общ-ва гастроэнтерологов. - Ростов-на-дону, 1991.-С. 212.

30. Спектр чувствительности к антибактериальным препаратам штаммов Klebciella spp, выделенных от детей, больных ОКИ и ГВЗ //Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций: Тез. докл. Все-союз. конф. - Москва, 1991. - С. 425 - 427.

31. Антибактериальная терапия клебсиеллезнои инфекции у детей раннего возраста /Ловердо Р. Г., Симованьян Э. Н. /. - // там же. - С. 390 -391.

32. Применение модуляторов свободнорадикального окисления как средства повышения эффективности химиотерапии ОКИ /Шепелев А. П. /. - //там «е.-С.730 - 731.

33. Роль условно-патогенных энтеробактерий в этиологии острых кишечных инфекций у детей раннего возраста /Алешукина А. В., Ловердо Р.Г., Бовтало Л. Ф.. Симованьян Э.Н./. - //VI Всерос. съезд микробиол., эпидемиол. и паразитол.: Тез. докл. - Нижний Новгород, 1991,- С. 57 -58.

34. Адгезивные свойства и фимбрии штамимов клебсиелл, выделенных от детей первого года жизни /Землянкина Л. П. /. - //там же. - С. 82 -83.

. 35.. Подходы к оценке этиологической значимости условно-патогенных энтеробактерий при острых кишечных инфекциях //там же. - С. 105 - 106.

36. Циркуляция условно-патогенных микроорганизмов в отделении патоло-

гии новорожденных детей стационара /Апейкина М.Д.. Владимирова Е.. Егорова И.П. и др./. - //там же, - С. 159 - 160.

37. Некоторые биологические свойства линополисахарида К.pneumoniae /Алешукина A.B./. - // ДМ 1991 МР» Р 3. - № 46. публ. 1417

ЗВ. Подбор питательных сред и условий культивирования для получения липополисахарида К. pneumoniae /Алешукина А. В., Корнилов В. 11. /. -//Изв. Сей. -Кавк. Науч. центра. Высш. шк. Ест. науки.-1991.-N4. -С. 119 - 122.

39. Фимбрии и биологические свойства штаммов клебсиелл. изолированных от детей первого года жизни, больных ОКИ /Зешшнкина Д. П., Батуро А.П., Рыкова В. В./. - //там же. - С. 122 - 125.

40. Поверхностные структуры и биологические свойства штаммив клебсиелл /Землнмкина Л. П. .Вилков Г. А., Батуро А. П./.- //Журн. микриби-ол., эпидемиол. и инмунобиол. - 1392. - Т. 54, №3,- С. 13 - 17.

41. Иммуноферментныс гест-системы в экспресс-диагностике инфекционных заболеваний /Шепелев А.П./.- //Разрабитка и производство препаратов медицинской био технологии: Тез. докл. - Махачкала, 1992. - С. 02 - 83.

42. Гидролиэаты казеина в масштабном получении бактериальных антигенов для диагностических целей /Шепелев А. П. /. - //гам же, - С. 120 - 122.

43. Унифицированный способ получения липогшлисахаридш граштрицат^ль-ных бактерий /Алешук;.на А В./. - //там же. - С. 123 - 124.

44. Способ получения антител к токсинам бактерий /Землннкина Л. П., Езепчук Ю. В./. - //Патент РФ №1314769, от 27.09.91 г.

45. Штамм бактерий Е.coli -продуцент териолабильного энтеротоксина /Езепчук ¡0. В., Алешукина A.B., Воронов С.Е. /. - //Патент РФ № 1742322 от 23.06.92 Бил 1623.

46. Штамм Klebcielia pneumoniae - продуцент лжюполииахарица /Алешукина А. В., Пономарева А. М. /. - Патент РФ № 1788965 от 15.01. 93 Бел №2

47. Способ моделирования острой клебсиеллезной инфекции /Ловердо Р Г., Землинкина Л.П., Шепелев А.П. и др./. - //Патент РФ № 1707615 от 23. 01.92 Бол №3

48. Штамм бактерий Klebcie)ia pneumoniae, используемый для получения фимбрий /Землянкина Л П., Вилков Г. А./. - //Патент Fi К 5777607 от 23.11.92 Бюл №43

49. Определение адгезивных свойств грамотрицательных бактерий /Зеилян-кина Л. П., Черкасский Б. Б., Минаев В. И. и др./. - //Информационно-методическое письмо - Утв. ГКСЗН РФ 20.01.93 -Ьс.

50. Острый кишечный клебсиеллез у детей раннего возраста /Ловердо Р.Г., Симоианьнн Э. Н./. - //Актуальные проблемы инфекционной патологии. ч.З. Иммунология и биотехнологии. - С.-Петербург, 1993. -С. 44.

51. Влияние антиоксидантов на токсичность ЛПС К. pneumoniae /Шепелев А. П. /.- //там же. - С. 48.

52. Клинино-микробиологическая характеристика кишечного клебсиеллеза у дитей раннего возраста /Симованьян Э.Н., Ловердо Р.Г., Плескачев А. Д. /.- //Современные аспекты терапевтической и хирургической помощи в гастроэнтерологии: Сб. научн. работ комплексной целевой программы "Гастроэнтерология". - Ростов-на-Дону, 1993. - С. 48 - 50.

53. Возможный способ повышения этиологической расшифровки ОКИ /Алешу-кина А. В., Бовтало Л. Ф., Ловердо Р. Г. /. - //там же. - С. 7 - 8.

54. Экспериментальная модель для изучения механизмов патогенеза острой кишечной инфекции у детей раннего возраста /Шепелев А.П./. -//Курн. Ланималогия. - 1993, - N1,- С. 75.

55. Cliemiluminescence of peripheral blood as index of immune status and graviti of infections process course /Shepelev A.P./.- //International Journal of immunorehabilitation : Abst. of the I inter, congr. on immunoreliabilitation.- 1994.- P. 320

56. lmmunoenzime test-system for detection of circulating immune complex is /Shepelev A.P./. - //International Journal of immunoreliabilitation :Abst. of the I inter, congr. on immunorehabilitation. -1994,- P. 225 - 226.'.'

57. Питательная среда для выявления энтеротоксигенных свойств штаммов Enterobacteriaceae /Темирханова 3.У., Балаклеец В. С., Девтерова Л. В. и др./. - //Принципы и практика борьбы с холерой в Республике Дагестан. Актуальные вопросы разработки микробиологических питательных сред: Тез. докл. Всерос. науч.-практ.конф. - Махачкала, 1994,- С. 81.

58. Перспективы использования бактериальных токсинов и метаболитов в производстве питаге/ъных сред целевого назначения //там же. - С.82.

59. The influence of vitamin E on the delopment and outcome of infections diseases //II International conference. Antioxidant vitamins ana Bata-Carotene in Disease Prevention. International Congress Center. Berlin. Oktober 10-12, 1994,- P.97.

60. Mechanism of defence of a microorganism Ггош phagocitosis /Shepe-iev A.P./.- //The International Congress of Bacteriology and Appe-lied Microbiology Division 7th international Congress of Mycology Division. Prague. Czech Republik, July 3-8, 1994.- P._172.

1. Определение факторов патогенности условно-патогенных энтеробактерий и оценка их этиологической значимости при острых кишечных инфекциях у детей раннего возраста /Шепелев А.П./.- //Метод, реко-менд,- Утв. ГКСЭН РФ 28.11.94 М.. 1994,- 38 С.

2. Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae, используемый для получения фимбрий КФА-П //A.C. 5043068/13 от 21.05.92г

3. Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae, используемый в качестве ре-ференс-штамма при определении интенсивности дыхания микроорганизмов /Ловердо Р.Г./. - //A.C. 5043033/13 от 21.05.92 г.

4. Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae, используемый в качестве ре-ференс-штамма для определения каталазной активности микроорганизмов при дифференциации патогенных и непатогенных микроорганизмов /Шепелев А. П./. - //A.C. 5043065/13 от 21.05.92 г

5. Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae - продуцент дезоксирибонукле-азы /Гиренкова Л.С./.- //A.C. 5041189/13 от 07.05.92 г

6. Способ получения фимбриального адгезина /Белецкая С.Г., Алешкин В. А./. - //A.C. 93-052668/13 от 22.11.93г

>7. Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae 232 - продуцент р-гемо^лизина /Шепелев А. П.,Гиренкова Л.С./. - //A.C. 94.018327 /13 от 19.05. 94г

8. Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae, используемый как рефе-ренс-штамм при определении гемолизинов энтеробактерий /Мазнева A.M./. - //A.C. 94030872/13

i9. Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae 231 - продуцент й-гемолизина /Шепелев А.П., Монакова Л.Ф./. - A.C. 94030870 /13 от 05.08.94.

Подписано к печати 08.10.96г. Заказ № 35-96 Тираж 100 экз. Типография АОЗТ " Л К Р', ул. Обороны, 49.