Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы патогености Klebsiella pneumoniae и их роль в патогенезе острой кишечной инфекции у детей первого года жизни

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Введение Диссертация по биологии, на тему "Факторы патогености Klebsiella pneumoniae и их роль в патогенезе острой кишечной инфекции у детей первого года жизни"

т~\ л ¿»чпiг-ч ттт /трг\ I тг ггм т

Глава 1. иьс5ик лшЕгацпг'м

1.1 Клебсиеллез и факторы патогенности клебсиелл . 18

1.2 Механизмы антибактериальной защиты детей первого года жизни .41

ЛГ1Г«ГПГ>ГЧ ТТ ТТ ТГ~> Т ПГМТ^Г! i Т 11 Я (—1 ииьиТвЕмныь киСЛидивлНиЯ

Глава 2. Материалы и методы .50

2.1. Объекты и объем исследования.50

2. 2. Микробиологические методы.50

2.3. Определение факторов и признаков патогенности.56

2.4. Биологические методы исследования.61

2. 5. Методы изучения фимбрий.62

2. 6. Биохимические исследования.64

2.7. Молекулярно-биологические методы.69

2. 8. Иммунологические методы.70

2.9. Фагоцитарные реакции.71

2.10.Получение антигенов, антител и диагностических препаратов.74

2.11. Получение конъюгатов.83

ГЛАВА 3. Биологические свойства штаммов К. pneumoniae, выделенных от детей первого года жизни.89

3.1. Роль клебсиелл в этиологии ОКИ у детей раннего возраста.89

3.2. Характеристика биохимических свойств штаммов.S8

3.3. Капсулы и капсульные антигены штаммов.101

3.4. Состав высших жирных кислот липидов.104

3.5. Чувствительность к антибактериальным препаратам. 108

- б

3.6. Плазмидный спектр штаммов.116

ГЛАВА 4. Факторы и признаки патогенности К. pneumoniae .121

4.1. Адгезивные свойства, поверхностные структуры и факторы адгезии.121

4.2. Ферменты патогенности.137

4.3. Факторы патогенности с функцией поражения.141

4.5. Признаки патогенности.149

4.6. Массивность выделения.151

4.7. Вирулентность.153

4.8. Взаимосвязь факторов и признаков патогенности.156

ГЛАВА 5. Взаимосвязь патогенных свойств штаммов и клинических проявлений при остром кишечном клебсиеллезе,. 169

5.1. Клинические формы кишечного клебсиеллеза.169

5.1.1 Кишечный клебсиеллез при спорадической заболеваемости.170

5.1.2 Клебсиеллез при вспышке острой кишечной инфекции 176

5.2. Биолого-патогенетические свойства клебсиелл.180

5. 3. Дисбиотические показатели кишечника.182

ГЛАВА 6. Бактериальные антигены и иммуно-биохимические показатели при кишечной клебсиеллезной инфекции.186

6.1. Бактериальные антигены.186

6.2. Факторы неспецифической защиты.189

6.3. Локальная иммунная защита.196

6. 4. Гуморальный иммунитет.203

ГЛАВА 7. Экспериментальное изучение механизмов патогенеза острого кишечного клебсиеллеза.209

7.1, Экспериментальная модель для изучения механизмов патогенеза ОКИ у детей раннего возраста.209

7.2, Влияние биологических свойств штаммов и их факторов патогенности на динамику клинических проявлений и исход инфекции . 224

7,3. Динамика перекисного окисления липидов при острой кишечной клебсиеллезной инфекции. 230

ГЛАВА 8. Роль фимбрий I и III типов, липополисахарида и термолабильного энтеротоксина К. pneumoniae в патогенезе инфекции. 250

8.1. Механизм взаимодействия фимбрий и фимбриальных адгезинов I и III типов с клетками макроорганизма. 250

8.2. Роль липополисахарида в активации свободнорадикаль-ного окисления. 265

ГЛАВА 9. Экспериментальное обоснование разработки диагностических препаратов на основе факторов патогенности К. pneumoniae. 272

9.1. Разработка технологии получения антигенов. 272

9.1.1 Получение и характеристика ФА-I, ФА-Ш. 272

9.1.2 Разработка технологии получения ТЛЭТ. 287

9.1.3 Разработка технологии получения ЛПС. 296

9.2. Диагностические иммуноферментные тест-системы для тестирования факторов патогенности и антител к ним 303

9.3. Принципы разработки набора питательных сред для дифференциации патогенных и непатогенных энтеробак-терий, в том числе и К. pneumoniae. 308 r-\ I ? Г ТТТЛТ Т г-» Т t* ЯТ~\ л <*~v

АШШЧЬНИЬ . ¿10

ПТ ТГ\Г> ТГ» т ^

ШЬЮДЫ . JÖÜ

ГГП> t T/rnt *Т 1ГЧ/ЧТ ft 1Г-* !-\T—VT гл» !TT i t Jt it / />\ i /-V

Iltmi^kUMIL ¡-'ИП.ОМЬНДАЦШ. Ö4U rirriirmti rrt imrvrs i mt тм ^ Л

UllHUUft ЛИ 1 t/pA i У Hbl . ¿41

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ОКИ - острые кишечные инфекции

УПЗ - условно-патогенные энтеробактерии

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

ЛИС - липополисахарид

ТЛЗТ - термолабильный энтеротоксин

ТСЭТ - термостабильный энтеротоксин

ТЛ - термолабильность

ТС - термостабильность

СОД - супероксиддисмутаза

ГП - глутатионпероксидаза

ГТ - глутатионтрансфераза

ДНКаза - дезоксирибонуклеаза

ФА-I - фимбриальные адгезины I типа

ФА-III - фимбриальные адгезины III типа

АДГ - адгезивность

ЗНТ - энтеротоксигенность

К-Р - тест конго-рот

ФФ - фосфатаза

ГЕМ - гемолитическая активность

KT - каталазная активность

СРО - свободнорадикальное окисление

АФК - активные формы кислорода

АОА - антиокислительная активность

ДОС - антиоксидантная система

ДОЗ - антиоксидантная защита

ФАФ - функциональная активность фагоцитов

- о

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ОРЭ - осмотическая резистентность эритроцитов

МдА - малоновый диальдегид

СЛХЛ - спонтанная люминолзависимая хемилюминесценция

ЗЛХЛ - зимозанактивированная хемилюминесценция

РДДГ - реакция двойной диффузии в геле

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛВК - лизат бактериальных клеток

Н1 - надосадочная жидкость

ЖТБ - желче-тиосульфатный бульон

ЖЭКА - железо-эритритно-кровяной агар

П!А - полужидкий агар

КА - кровяной агар

ЦПХ-агар - плотная среда для синегнойной палочки

Кг - плотная среда для клебсиелл

П? - плотная среда для протеев

ВСА - висмут-сульфитный агар

MPC - модифицированный агар для лактобацилл

МИС - молочно-ингибиторная среда

МПА - мясопептонный агар

ЛДс0 - доза, вызывающая гибель 50% животных

КД - килодальтон

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы f?

- (

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последние годы заметно возросло социально-медицинское значение условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) и обусловленных ими острых кишечных инфекций (ОКИ), т.к. значительный удельный вес этих инфекций приходится на детей раннего возраста, особенно новорожденных. В этиологической структуре этих заболеваний доминируют условно-патогенные энтеробактерии (УПЗ); pp. Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter и другие (32, 72, 137, 148, 172), среди которых одно из ведущих мест занимает К. pneumoniae, на долю которой приходится от 11,2 до 54,2% (20,

Ч Л * Л Л ГЧ Л 4 f-\ Л Л Л ЛИЛ О О ЛЛЛ ЛЛ J ^

1, и'(С, ld/, Iü8, ¿lö, ¿М, ¿80, ШеС, öOij.

Клебсиеллезы отличаются тяжелым течением, нередко с развитием генерализованных форм (145, 181, 373), не только у детей, но и у взрослых (273).

Вместе с тем диагностика кишечных форм клебсиеллезной инфекции значительно сложнее, чем при другой локализации, т.к. факт выделения К. pneumoniae не может служить основанием для микробиологического диагноза, необходимо еще доказательство их этиологической значимости в каждом конкретном случае.

В этой связи исследователями используются различные подходы: метод количественного исследования фекалий, серотипирование выделенных культур, исследование парных сывороток с аутоштаммами и другие методы. В последние годы особую значимость приобретает методический подход, основанный на определении патогенных свойств предполагаемого возбудителя (9,17, 36, 38, 216, 381,426,491,493). Исследованиями ряда авторов показано, что большинство штаммов К.

- О pneumoniae, выделенных от больных ОКИ и другими заболеваниями, обладают одновременно двумя и более факторами патогенности (9, 17, 38, 39, 214), а также высокой степенью устойчивости к антибактериальным препаратам (176, 179, 340, 383), в ряде случаев связанной с наличием R-плазмид (8, 17, 23).

Среди многообразия факторов патогенности выделяют адгезив-ность, энтеротоксигенность и факторы, связанные с мембраноповреж-дающим действием.

Адгезия, обеспечивающая начало инфекционного процесса при кишечных инфекциях, по мнению большинства исследователей связана с фимбриями (360, 362). Вместе с тем все еще остается неясным, какие структуры у К.pneumoniae участвуют в адгезивном процессе при ОКИ, т.к. исследованиями D.C.uid et.ai. (433), R. Podscnun et.ai. (439, 440) показано, что у штаммов, выделенных от больных урогенитальной локализации, преобладают фимбрии I типа. Отсутствуют сведения о структуре и биологических свойствах фимбриапьных адгезинов, а также их роли в патогенезе инфекции. До конца невыясненным остается вопрос о биологической активности липополисаха-рида, его роли как фактора патогенности. Противоречивы данные, касающиеся энтеротоксинов. Ряд авторов полагают, что патогенность К.pneumoniae в большей степени связана со способностью к продукции термолабильного энтеротоксина (9, 16, 17, 36, 321, 373, 398). Другие исследователи считают, что реализация патогенных свойств зависит от интенсивности продукции термостабильного энтеротоксина (330, 408). Представляют интерес и данные о новых для клебсиелл факторах патогенности - ферментах антиоксидантной защиты — супе-роксиддисмутазы, каталазы и пероксидаз, выполняющих функцию защиты от фагоцитоза (389, 427, 462).

Несмотря на имеющийся значительный фактический материал, касающийся факторов патогенности, отсутствуют критерии оценки патогенное™ К,pneumoniae, подкрепленные данными о их роли в патогенезе кишечной инфекции, т. к. не разработан методический подход к изучению явления патогенное™ К. pneumoniae, основанный на механизмах взаимодействия микро- и макроорганизма, и, как следствие, не разработаны диагностические препараты, направленные на тестирование факторов патогенное™ и выявление антител к ним.

Цель работы: Обосновать патогенетическую роль ведущих факторов патогенности и на их основе разработать критерии оценки этиологической значимости К. pneumoniae при острых кишечных инфекциях у детей первого года жизни.

Задачи исследования:

- изучить роль К.pneumoniae в этиологии острых кишечных инфекций у детей первого года жизни;

- разработать критерии оценки этиологической значимости К. pneumoniae при острых кишечных инфекциях;

- установить взаимосвязь совокупности факторов патогенности штаммов и отдельных клинических проявлений острого кишечного клеб-сиеллеза;

- выявить неспецифические клеточные и гуморальные факторы, участвующие в защите от инфекции у детей первого года жизни;

- экспериментально доказать роль процессов свободно-радикального окисления в патогенезе клебсиеллезной инфекции;

- установить роль ведущих факторов патогенности К. pneumoniae: фимбрий I и III типов, липогюлисахарида и термолабильного энте-ротоксина в патогенезе острой кишечной инфекции;

- экспериментально обосновать и разработать комплекс диагностаческих препаратов, основанный на тестировании факторов патоген-ности К.pneumoniae и выявлении антител к ним.

Научная новизна. Выявлен комплекс факторов и признаков пато-генности К. pneumoniae и на его основе разработаны критерии оценки для обоснования этиологической значимости штаммов при острых кишечных инфекциях у детей раннего возраста.

Впервые доказано, что штаммы К. pneumoniae способны к продукции ряда факторов патогенности с различной частотой и интенсивностью. Создана коллекция, включающая референс-штаммы и штаммы-продуценты факторов и признаков патогенности, подтвержденная 9 патентами и авторскими свидетельствами, 11 справками о депонировании в Государственной коллекции (Патент РФ N3788965, 1777607; t ГЧ ntr A i lltr Л J ЛЛЛ Г Ы г- J ЛЛЛЛ Ш Г A I Л * Г-i »-\ MA J ГУ. Л Г! Л ЛП

Л. С. 1MDU4 JUdeS, NDU4 ¿UOD, WOU4 <3UDO, 1\1Э0<1 11ЬУ, 1\]У4 UI dJ^!, П1У4

ЛЛГ"!Л И|Л i А л Г. M Л \ ucs N9^ иЗо/иь

Впервые установлено наличие прямой корреляционной зависимости между степенью адгезии, типом фимбрий и типом энтеротоксиген-ности. Выявлено отсутствие корреляции между массивностью выделения и вирулентностью штаммов. Впервые установлено наличие избирательной гемолитической активности штаммов в отношении 11(A) и IV (АВ) групп крови человека, преобладание больных с этими же группами крови.

Впервые по данным электронной микроскопии дана характеристика поверхностных структур штаммов фекального происхождения, позволившая выявить типы фимбрий. Впервые экспериментально доказано участие фимбрий I и III типов в адгезивном процессе (Патент

ЛТ J МММ ЛАП I rt ШГЛ i АЛЛ Л ^

N 1(((*0\J(, А. и.

Установлено участие фимбриальных адгезинов в регуляции диа-рейного синдрома, опосредованно, через стимуляцию продукции термолабильного энтеротоксина.

Впервые выявлено и экспериментально доказано, что комплекс факторов патогенности штаммов определяет клинические формы и проявления инфекции. Выраженность отдельных симптомов заболевания зависит от интенсивности продукции определяющих их факторов патогенности (Патент N1707615).

Установлено, что острая кишечная инфекция у детей первого года жизни характеризуется поражением всех отделов желудочно-кишечного тракта, с преимущественным вовлечением в патологический процесс толстого и тонкого кишечника. Острый период сопровождается антигенемией, обусловленной наиболее часто липополисахаридом и фимбриальным адгезином III типа в крови, термолабильным энтеро-токсином и липополисахаридом в копрофильтрате.

Впервые экспериментально доказано, что исход инфекции зависит от исходного уровня сбалансированности системы А03-П0Л и имеет решающее значение на первых этапах инфекции. Дефицит активных форм кислорода приводит к развитию генерализованных форм инфекции, а высокий уровень - к избытку высокотоксичных продуктов пе-рекисного окисления липидов, приводящих к быстрым летальным исходам.

Впервые экспериментально обоснован и разработан комплекс диагностических препаратов, иммуноферментных тест-систем и питательных сред для тестирования факторов патогенности К. pneumoniae и антител к ним (Патент N1814769, N1742322; А.С. N93-052668; Заявка на патент N94030871, пр. от 05.u8.94 г.).

Теоретическая значимость работы.

Комплексный подход к изучению факторов патогенности К. pneumoniae позволил доказать, что патогенность является не видовым признаком, а лабильной характеристикой штамма, выполняющего множественную патогенетическую функцию. Факторы.патогенности находятся во взаимодействии друг с другом.

У штаммов клебсиелл фекального происхождения впервые охарактеризованы типы фимбрий , продуцируемые ими адгезины, доказано их участие в адгезивном процессе, что позволяет рассматривать возможность развития направления по созданию антиадгезивных препаратов для лечения и профилактики клебсиеллезов.

Вскрыт ранее неизвестный один из механизмов регуляции диа-рейного синдрома. Фимбриальные адгезины I и III типов стимулируют продукцию термолабильного энтеротоксина, активирующего образование аденилатциклазы, которая, через усиление синтеза циклического аденозинмонофосфата, нарушает транспорт ионов и воды через мембраны клеток.

Установлено, что у детей первого года жизни, имеющих несовершенную защитно-адаптационную систему, основными механизмами защиты от инфекции являются локальная иммунная защита и неспецифические факторы - фагоцитоз и процессы свободнорадикального окисления. Доказано, что тяжесть течения и исход инфекции зависит от исходного состояния сбалансированности системы А03-П0Л и имеет решающее значение на первых этапах инфекции.

Практическая значимость работы. На основании результатов исследования разработаны и внедрены в работу практических лабораторий методы лабораторной диагностики острых кишечных инфекций у детей раннего возраста:

- Диагностика, прогнозирование течения и лечение острых кишечных инфекций условно-патогенной и смешанной этиологии (Методические рекомендации. Утв. МЗ РСФСР 23.11.90г.).

- Определение адгезивных свойств грамотрицательных бактерий (Информационно-методическое письмо. Утв. КГСЗН РФ 20. 01.93г.).

- Определение факторов патогенности условно-патогенных энтеробак-терий и оценка их этиологической значимости при острых кишечных инфекциях у детей раннего возраста (Методические рекомендации.

- 7 Т /" ТЛ Г"\ ? Г РЧД АЛ t Ч

Утв. М ÜJH 1ЛУ ¿0. 11. У4Г. ) .

На основании результатов исследования разработан комплекс диагностических препаратов, иммуноферментных тест-систем и питательных сред для тестирования факторов патогенности К. pneumoniae и антител к ним:

- Проект ВФС и ЗПР на тест-систему иммуноферментную для выявления антител к липополисахариду К. pneumoniae (Разрешение на проведение Государственных испытаний. Протокол ГФК Fi! от 05. 04. 95г. ).

- Проект ВФС и ЗПР на тест-систему иммуноферментную для обнаружения термолабильного энтеротоксина энтеробактерий (На рассмотреnxrf »t 1 < л /~ч /-"ч ^ 4 Ч нии в Гш, . 1мги от иу. 1<£. у4г. ;.

- Проект ВФС и ЗПР на тест-систему иммуноферментную для выявления антител к термолабильному энтеротоксину энтеробактерий (Утвержден на Ученом Совете РНИИМП, пр.N10 от 28.12.95г. Рекомендовано к рассмотрению в ГФК РФ.

- Проект ВФС и ЗПР на питательную среду для определения термолабильного энтеротоксина энтеробактерий (На рассмотрении в ГФК, N3 от 06.01.95г.).

- Проект ВФС и ЗПР на питательную среду для тестирования ДНК-азы энтеробактерий (на рассмотрении в ГФК).

Данные, полученные в результате настоящих исследований, используются в учебном процессе: на ФУВ при Ростовском государственном медицинском университете,на циклах "Бактериология" и "Иммунология": при чтении лекций по спецкурсу "Инфекционная иммунология" и "Тропические болезни с основами иммунодиагностики" для студентов 4 и 5 курсов биолого-почвенного фан;ультета Ростовского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. Патогенность клебсиелл является не видовым признаком, а лабильной характеристикой штамма, выполняющего множественную патогенетическую функцию. Клебсиеллы способны к продукции ряда факторов патогенности, с различной частотой и интенсивностью, каждый из которых выполняет определенные функции и находится во взаимодействии друг с другом (Патент N1788965, 1777607; А. С. N5043033, г Л» i /S rs Г~ ТПГ~/-\Л Л Л »1Л i /-V Л Л Л О И Т /"Л 4 !*1Л i

N5u4due>o, Nou4iidy, Nya ша32/, 1МУ4 ucsuзаявка на патент 030870).

2. В патогенезе острой кишечной клебсиеллезной инфекции определенную роль играют термолабильный энтеротоксин, фимбриальные адгезины I и III типов и липополисахарид.

- Фимбрии I и III типа К. pneumoniae являются ответственными за адгезию. Их участие в адгезивном процессе реализуется через секретируемые адгезины, обеспечивающие связывание микроорганизма с клетками макроорганизма (Патент N1777607, А.С. N5043066).

- Фимбриальные адгезины принимают участие в регуляции диа-рейного синдрома. Механизм регуляции опосредованный: адгезины стимулируют продукцию термолабильного энтеротоксина, активирующего образование аденилатциклазы, которая через усиление синтеза циклического аденозинмонофосфата нарушает работу (Na+-К+) насоса.

- Липополисахарид является структурным фактором патогеннос-ти, активирующим процессы СРО, путем стимуляции образования АФК и подавлением активности ферментов антиоксидантной системы.

3. Совокупность определенных факторов патогенности определяет клинические формы и проявления инфекции. Выраженность отдельных симптомов заболевания зависит от интенсивности продукции определяющих их факторов патогенности (Патент N1707615).

4. Факторы патогенности К.pneumoniae индуцируют образование иммуноглобулинов и антител, секреторных и сывороточных.

5. У детей первого года жизни основными механизмами, участвующими в защите от инфекции, являются локальная иммунная защита и неспецифические факторы: фагоцитоз и процессы СРО. Процессы СРО в динамике заболевания характеризуются фазностью, антибатными и компенсаторными изменениями показателей, отражающих сбалансированность системы АОЗ-ПОЛ. Тяжесть течения и исход инфекции зависят от исходного состояния сбалансированности системы АОЗ-ПОЛ и имеют решающее значение на первых этапах инфекции.

Процессы СРО являются одним из пусковых механизмов в сложной системе взаимодействия микро- и макроорганизма.

6. Факторы патогенности К.pneumoniae могут быть использованы при разработке препаратов для диагностики острых кишечных инфекций и направленного поиска средств лечения и профилактики Шатенг\Z »im* n I Ii J МАЛ * Г-7 i ЛЛЛЛ л млолл л г / Т*7 Л Г4* . А Г*- М/"4,^ Л£ГО,л,лО

ТЫ РФ: NlM'l ÖI14 ! Üö, 1 (^¿¿б, 1 18о0УОЭ, linwr, A.b. Гму^-UD^ÖOÖ, 5043066; Заявка на патент N94 030871, пр. от 05.08.94г.).

7. В этиологической структуре острых кишечных инфекций детей первого года жизни доминируют условно-патогенные энтеробактерии, среди которых ведущими являются К.pneumoniae. Не все штаммы К.pneumoniae, выделенные из фекалий, являются истинными этиологическими агентами острых кишечных инфекций.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: - VI Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991); л л - '10

- Всероссийских конференциях и симпозиумах по проблемам: "Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний" (Звенигород, 1990); "Химия белка" (Тбилиси, 1990); "Бактериальные токсины" (Юрмала, 1989); "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1990, 1992, 1994);

- Пленумах: Всероссийского научного общества гастроэнтерологов (Ростов-на-Дону, 1991, 1995); Проблемной комиссии научного Совета по микробиологии АМН СССР по программе "Плазмида" (Нальчик, 1990) и "Генетика и молекулярная биология бактерий" (Моек

J л л д \ ва, lyyij;

- Всесоюзных семинарах: "Клинико-лабораторные проблемы современной химиотерапии и профилактики инфекций" (1990); Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций" (1990); по современным методам диагностики соматических и инфекционных заболеваний (Ростов-на-Дону, 1991, Уфа, 1992);

- Международных симпозиумах, конференциях и конгрессах: "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" (Рига, 1989); Лабораторные животные в медико-биологических и биотехнологических исследованиях" (Москва, 1992); Itii International Congress of immunoreabiIitation (Sochi, 1994); 7th International congress of Bacteriology ana Applied Microbiology Division (Prague, iyy4j;

- Заседании Ростовского отделения микробиологического общества Л Л Л А \ иЭуол

По материалам диссертации опубликовано 69 работ, из них в центральной печати - 38, центральной периодической - 11, за рубежом - 4; получено 5 патентов и 8 положительных решений на выдачу патентов, 2 рацпредложения отраслевого значения, 12 справок на я r*j

-IIштаммы, депонированные в Государственной коллекции; издано 3 методических документа; подготовлена НТД (ВФС и ЭПР) на 5 диагностических препаратов.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 398 страницах машинописного текста, включая иллюстрации из 65-ти таблиц и 76-ти рисунков, списка литературы. Состоит из введения, обзора литературы, описания используемых материалов и методов, 7 глав собственных исследований, заключения и выводов, указателя литературы, включающего 493 работы, из них 185 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Мартыненко, Людмила Дмитриевна

выводы

1. К.pneumoniae по частоте выделения и этиологической значимости при острых кишечных инфекциях у детей первого года жизни являются ведущими. Удельный вес этиологически значимых штаммов К. pneumoniae составляет 49, 3±1,2%, обусловливающих дисбиозы кишечника - 50, 7±2, 2%.

2. К.pneumoniae способны к продукции ряда факторов патогенности, выполняющих различные функции. Частота выявления и вирулентность штаммов, выделяемых от больных достоверно выше, чем от здоровых детей. Существует прямая зависимость между вирулентностью и совокупностью факторов патогенности (г)0, 58, при mr< 1, 2).

3. Среди штаммов К.pneumoniae, выделенных из фекалий детей, доминируют штаммы с III типом фимбрий (73, 0±2, 8%), доля штаммов с I типом фимбрий составляет 15,812,3%, без фимбрий - 11,1±2,0%. Штаммы с III типом фимбрий обладают сочетанной высокой степенью адгезии и термолабильной энтеротоксиген-ностью (г,=0,75, mr=0,08).

Экспериментально доказано участие фимбрий I и III типов в адгезивном процессе клебсиелл. Специфические антитела к фимбриям и фимбриальным адгезинам ингибируют процесс адгезии.

Получены в чистом виде фимбриальные адгезины, представляющие собой белки с MM I тип - 18,5 Кд и III тип - 25 КД. Определен состав аминокислот.

Фимбриальные адгезины стимулируют продукцию термолабильного энтеротоксина К.pneumoniae и E.coii. Адгезины III типа увел m

- 3öt личивают продукцию в 1,74-1,92 раза, I типа - в 1,42-1,56 раза.

4. Острая клебсиеллезная моно- и микст-инфекция характеризуется поражением всех отделов желудочно-кишечного тракта, с преимущественным вовлечением в патологический процесс тонкого и толстого отделов кишечника (61, 7±4,2%), со склонностью к затяжному течению у 72,1±3,8% больных и развитием дисбиотических сдвигов кишечника. Выраженность отдельных клинических проявлений инфекции зависит от совокупности факторов патогенности клебсиелл и интенсивности их продукции.

5. Экспериментально установлено, что липополисахарид К. pneumoniae стимулирует образование АФК в лимфоцитах животных в течение первых 24-х часов. Повышение уровня АФК сопровождается изменениями активности ферментов ДОС: в течение первых 2-х часов происходит адекватное повышение, затем последующее снижение. Через 48 часов понижение уровня АФКсопровождается повышением активности ферментов. Полное восстановление указанных изменений наступает на 6-е сутки.

6. У детей первого года жизни в остром периоде кишечной клеб-сиеллезной инфекции установлена антигенемия, обусловленная преимущественно липополисахаридом (50, 0±8,6%) и фимбриаль-ным адгезином III типа (52,9±8,6%), незначительно - термолабильным энтеротоксином (8,8±4,9%). В копрофильтратах достоверно высокая частота обнаружения термолабильного энтероi г-? S токсина t.ö6, u-j, ск).

7. К.pneumoniae индуцирует специфический системный и местный гуморальный иммунитет на собственные факторы патогенности.

- ¿¿а

Частота обнаружения антител и их уровень к липополисахариду и термолабильному энтеротоксину достоверно выше в копро-фильтратах, в крови - к липополисахариду и термолабильному энтеротоксину. В остром периоде доминируют антитела класса

У детей первого года жизни в остром периоде кишечной клеб-сиеллезной инфекции происходят нарушения функциональной активности фагоцитов периферической крови, связанные с достоверным снижением активности ферментов антиоксидантной защиты лейкоцитов (миелопероксидазы, супероксиддисмутазы и ка-талазы) и, при общем повышении активности и поглотительной способности фагоцитов, происходит понижение завершенности фагоцитоза.

Острый период клебсиеллезной инфекции характеризуется активацией свободнорадикального' окисления: повышение АФК (до 188%), усиление ПОЛ, приводящее к увеличению уровня МДА в сыворотке крови (на 83, 8%) и понижение резистентности мембран эритроцитов (на 35,4%), при общем понижении антиокислительной активности сыворотки крови (на 55, 4%). Экспериментально установлено, что в динамике развития инфекции происходят фазные изменения функциональной активности фагоцитов: начало развития инфекционного процесса сопровождается синхронным повышением активности всех 3-х показателей: ФА., ФЧ. и ЗФ., с последующим их снижением к исходу первых суток. Второй подъем активности ФА и ФЧ сопровождается дальнейшим понижением ЗФ, снижаясь до 4, 5-5%. Развитие генерализованных форм инфекции происходит при пониженном уровне АФК и низком проценте завершенности фагоцитоза.

- 339

11. Экспериментально показано, что развитие острой кишечной клебсиеллезной инфекции сопровождается активацией процессов СРО, с выраженной фазностью, резким повышением АФК и уровня ПОЛ в первые сутки после инфицирования и в остром периоде заболевания при антибатных изменениях показателей, отражающих ДОЗ. Течение и исход инфекции зависят от исходного уровня сбалансированности системы АО3-ПОЛ и имеет решающее значение на первых этапах инфекции. Антиоксиданты (витамин E, изоптин), ингибируя интенсивность ПОЛ на первых этапах заболевания способствуют ускоренному развитию клинических симптомов, тяжелому течению, сопровождающемуся массовой гибелью животных на 3-5-е сутки. Прооксиданты (левамизол, ди-фенин) оказывают благоприятное действие на течение и исход инфекции.

12. На основе факторов патогенности К. pneumoniae разработаны диагностические препараты: 1) иммуноферментные тест-системы, направленные на тестирование факторов патогенное™ и для выявления антител к ним; 2) питательные среды, позволяющие дифференцировать патогенные и непатогенные штаммы.

- З^и