Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата

Бульканова, Елена Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата"

На правах рукописи

Бульканова Елена Анатольевна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

БАКТЕРИОФАГОВ KLEBSIELLA, КОНСТРУИРОВАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ БИОПРЕПАРАТА

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2006

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарноЙ экспертизы ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич

кандидат ветеринарных наук, профессор Золотухин Сергей Николаевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Швиденко Инна Григорьевна

доктор ветеринарных наук, профессор Русалеев Владимир Сергеевич

Ведущая организация:

Ульяновский государственный университет

Защита диссертации состоится « 24 » ноября 2006 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410600, г. Саратов, Театральная пл., 1. Тел./факс (8452) 74-96-20.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335. Тел./факс (8452) 69-25-32.

Автореферат разослан 2006 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор биологических наук

Л.В. Карпунина.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время особое внимание уделяют диагностике мало изученных инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом. К их числу относятся клебсиеллезные инфекции. Представители рода Klebsiella широко распространены в природе, а подвид pneumoniae является нормальной микрофлорой респираторного тракта животных и человека. Однако среди этих микроорганизмов имеются патогенные варианты, способные вызывать у животных и людей самостоятельные заболевания. Клебсиеллы известны как возбудители пневмонии, заболеваний мочеполовой системы, острых кишечных инфекции, различных гнойно-септических осложнений, а также внутрибольничных инфекций, менингитов. Заболевания, вызываемые клебсиеллами, протекающие по типу острого сепсиса, предложено рассматривать как самостоятельную нозологическую единицу - клебсиеллез (Ковалева, Рейзис, 1993; Киселева, Красноголовец, 1996; Покровский, 1985; 1999). Известно так же, что K.pneumoniae играет этиологическую роль при маститах, пневмониях, септицемиях коров, свиней, лошадей, обезьян, инфекционной диареи молодняка животных (Воронин, Дервишов, Ставцева, 1989; Каврук, 1994; Кукава с соавт., 1998; Шахов, 2003; Золотухин, 2004; 2005).

Выделение и идентификация клебсиелл в основном проводится бактериологическим методом. Трудоемкость и длительность изучения биологических свойств бактерий не позволяет быстро идентифицировать бактерии рода Klebsiella. Существующие современные высокоспецифичные методы лабораторной диагностики (ИФА, РИА, ПЦР) из-за сложности методик, высокой стоимости оборудования и реактивов пока недоступны для большинства лабораторий. В связи с выше изложенным возникает необходимость изыскания эффективных и доступных для ветеринарных лабораторий методов индикации и идентификации бактерий рода Klebsiella.

Ряд исследователей (Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1988; Габрилович, 1981; 1983; Русалеев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990; 1992; Золотухин, 2005; Нагпадзе с соавт, 2005) приводят убедительные данные о положительных результатах индикации и идентификации возбудителей некоторых заболеваний с помощью

бактериофагов. Метод фагодиашостики является специфичным, не требующий больших затрат времени, материалов и доступен лабораториям всех уровней.

В арсенале ветеринарных лабораторий отсутствуют диагностические клебсиеллезные бактериофаги. Поэтому получение специфических бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Klebsiella, выделенных из объектов ветеринарного надзора, с целью диагностики, является актуальным.

Цель исследования. Разработка технологических параметров по индикации и идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов.

Задачи исследования:

1. Изучить распространение бактерий рода Klebsiella в хозяйствах неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных.

2. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий Klebsiella.

3. Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу, морфологию фаговых корпускул) выделенных бактериофагов.

4. Сконструировать на основе индикаторных бактериофагов новый биопрепарат - диапюстикум.

5. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагоидентификации и фагоиндикации бактерий рода Klebsiella.

6. Разработать схему идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью бактериофагов.

7. Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.

Научная новизна:

Выделены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении бактерий рода Klebsiella, изолированных из объектов ветеринарного надзора и патологического материала. Изучены основные б иол отческие свойства выделенных бактериофагов.

Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью. Впервые разработаны биотехнологические параметры для

фагоидентификации и фагоиндикации клебсиелл в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале.

Практическая значимость. Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, используемые для приготовления диагностического биопрепарата.

Два штамма бактериофагов депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и признаны перспективными для приготовления диагностического препарата.

Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю индикаторных бактериофагов Klebsiella К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА», одобренная Ученым советом Ульяновской ГСХА и утвержденная ректором академии 17.01.2006 года.

По материалам диссертационных исследований разработаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.06.2006 года.

Основные положения« выносимые на защиту:

1. Технологические параметры выделения бактериофагов бактерий рода Klebsiella.

2. Выделенные фаги имели высокую литическую активность, два бактериофага К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА обладали широким диапазоном лигической активности, специфичностью к бактериям рода Klebsiella.

3. Доказана эффективность сконструированного фагового биопрепарата.

4. Разработаны биотехнологические параметры изготовления диагностического фагового препарата.

5. Схема идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов.

6. Схема ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международных (Ульяновск, 2006); Всероссийских (Ульяновск, 2004; 2005); Межрегиональной (Самара, 2005) научно-практических конференциях.

Основные материалы диссертации заслушаны и одобрены на заседании Отделения ветеринарной медицины РАСХН (26.06.2006), на межкафедральном совещании сотрудников кафедр факультета ветеринарной медицины (15.03.2006).

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов К - 10 УГСХА, К -81 УГСХА и индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний:

- в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (от 30.01.06 г.);

- во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (от 21.02.06 г.);

- в условиях производства, проведенных на базе Чердаклинской районной лаборатории (от 10.12.05 г.).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии в соответствии с комплексным планом научной работы «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных» при творческом сотрудничестве с ВНИИВСГЭ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников (193 источника, в том числе 50 зарубежных авторов) и приложения. Работа изложена на 16Z страницах, иллюстрирована 18 рисунками, 29 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Штаммы. В работе были использованы 38 штаммов бактерий рода Klebsiella, из них 5 рсфсрснс-нпаммов, полученных из ГНЦ прикладной микробиологии г. Обсленск и Российского научно-исследовательского прогавочумного института «Микроб» г. Саратов, 10 штаммов из коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ), 11

музейных штаммов кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, 12 культур выделенные нами из патологического материала и объектов ветеринарного надзора, 123 штамма других родов семейства Enterobacteriaceae: Escherichia spp., Proteus spp., Morganella sppCitrobacter spp., Salmonella spp., Enterobacter spp., Providensia spp., Yersinia enterocolitica, а также родов семейств Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Pseudomonas spp.

21 изолят бактериофагов, выделенный нами из объектов окружающей среды.

Питательные среды и реактивы: мясо-пептонный бульон (НПО «Питательные среда», г. Махачкала); мясо-пептонный агар (0,3 %, 0,7 %, 1,5 %); среда Эндо (П1Ц прикладной микробиологии, г. Оболенск); среда Плоскирева («Биогехновация», г. Москва); среда Левина (НПО «Питательные среды», г. Махачкала); висмут-сульфит агар («Pronadisa», Madrid); среда Симонса (НИИ питательных сред, г, Махачкала); среда Клиглера (НИИ питательных сред, г. Махачкала); ацетатный агар (АО «Биомед» им. И.И. Мечникова Московская обл.); среды Гисса с индикатором BP (НПО «Питательные среды» г. Махачкала); реактив Ковача (Basle, Switzerland); физиологический раствор, pH 7,2 - 7,6; 0,04 % спиртовой раствор метилового ¡фасного; водный раствор КОН; раствор а-нафтола; трихлорметан ТУ 6-09^-263-76 (СКТБ «Технолог»); трихлорметан ТУ 6-09-4263-76 (СКТБ «Технолог»); 0,04% спиртовой раствор генпианвиолета.

Методы. Выделение и идентификацию бактерий рода Klebsiella проводили в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ и П 11 октября 1999 года.

Выделение и селекцию бактериофагов проводили по методам ЛИ. Адельсона (1962), С. Лурия, Д. Дарнела (1970), И.П. Ревенко (1978), ВЯ. Ганюшкина (1988), С.В. Ленева (1991), Габриловича (1992). Биологические свойства фагов изучали по методам М. Адамса (1961), Гольдфарба (1961), Тихоненко (1968), Габриловича (1973), Ганюшкина (1988), H.-W. Ackermann (1997). Индикацию бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора проводили с помощью реакции нарастания титра фага по методике описанной В.Д. Тимаковым, Д.М. Гольдфарбом (1961), В.Я. ГанЮшкиным (1988). Подготовку препаратов для электронной микроскопии

проводили соосаждением вирусных частиц в режиме низкоскоростного центрифугирования (Пономарев, Андреева, Артамонова, 2002).

Полученный в исследованиях цифровой материал обрабатывали с использованием стандартных программ статистического анализа для IBM PC, «STATISTIKA».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение бактерий рода Klebsiella из объектов ветеринарного надзора

Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий рода Klebsiella из объектов ветеринарного надзора и патологического материала. Клебсиеллы были выделены в 8 из 18 хозяйств Ульяновской, Самарской областей и республики Татарстан, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных. В результате проведенных исследований из патологического материала и объектов ветеринарного надзора, нами изолированно и идентифицированно 12 штаммов клебсиелл, из них 10 штаммов К. pneumoniae, и 2 штамма К oxytoca.

Поиск бактериофагов клебсиелл и селекция клонов фагов

Следующим этапом нашей работы стало исследование 28 (5 рефераю-штаммов, И музейных и 12 выделенных нами) штаммов бактерий рода Klebsiella на наличие в них про фага. В первой серии опытов выделение бактериофагов из бактерий проводили без воздействия индуцирующего фактора (Гольдфарб, 1961). В результате проведенных исследований штаммы Klebsiella не проявили лизогенных свойств.

Во второй серии опытов на исследуемые культуры воздействовали индуцирующим фактором (Лурия, Дарнелл, 1970), в качестве которого использовали ультрафиолетовое облучение и хлороформ. Суточную бульонную культуру обрабатывали ультрафиолетовыми лучами в течение 10, 15, 20, 30, 40, 60 минут с помощью прибора «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8, 18 % мощности которой приходится на область 254 нм. С такой же экспозицией воздействовали хлороформом на исследуемую культуру в соотношении 1 : 10. В наших опытах исследуемые штаммы Klebsiella в результате индукции не проявили лизогенных свойств.

Вторым этапом наших исследований стало выделение бактериофагов из объектов внешней среды (Гольдфарб, Тимаков, 1961).

Материалом служили следующие объекты: сточные воды свиноводческих и молочно-товарных ферм из разных хозяйств Ульяновской области, сточные воды Ульяновского мясокомбината. В результате проведенных исследований, нами был выделен и селекционирован 21 штамм бактериофагов Klebsiella,

Характеристика фагов бактерий рода Klebsiella

Морфологию негативных колоний изучали в разведении фагов 10"7 - 10*9 с индикаторной культурой на питательном агаре в посевах методом агаровых слоев (по Грация). Учет проводили через 18 - 24 часа инкубации в термостате при температуре 37 °С. Отмечали величину негативных колоний, форму, степень прозрачности, характер краев колоний, наличие и величина неполного лизиса. Образовавшиеся негативные колонии разделили на два типа (Бабков, 1973). К первому типу относятся круглые, прозрачные в центре негативные колонии диаметром от 2 мм и более с зоной неполного лизиса по периферии шириной 1-8 мм. Негативные колонии первого типа образуют фаги серии УГСХА: К - 4, К - 2, К - 60, К - 0x1, К - 33, К - 12, К - 24, К - 210, К - 210, К - 03, К - 032, К - 10, К - 8. Колонии второго типа круглые, прозрачные с ровными краями в диаметре до 2,5 мм с отсутствием зоны неполного лизиса. Колонии второго типа образуют фаги К - 41, К - 42, К - 11, К - 101, К - 14, К - 201, К - 281, К -44, К - 81.

Литическая активность бактериофага оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах. Активность по методу Аппелшана выражается максимальным разведением, в котором исньпуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки литической активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема (по Грация). Изученные нами фаги имели литическую активность от 10~3 до 10*8 (по Аппельману) и от 4 х 107 до 8 х 109 фаговых корпускул в 1 мл (по Грация). Результаты исследований представлены в таблице 1.

Спектра литической активности. Для изучения спектра литической активности использбвали метод нанесения капель бактериофагов на газон исследуемой культуры (Ганюшкин, 1988). В качестве исследуемых культур

использовали 28 (5 рефсренс-штаммов, 11 музейных и 12 выделенных нами) штаммов бактерий рода Klebsiella. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о разном диапазоне литической активности изолятов фагов, который колеблется от 14% до 75 %.

Два отобранных бактериофага исследовали дополнительно на 10 штаммах клебсиелл из коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ). В результате было установлено что, фаг К - 10 УГСХА лизировал 76 % штаммов бактерий рода Klebsiella, К - 81 УГСХА - 73 %, а в сумме фаги проявили литическое действие в отношении 97 % всех исследованных культур (табл. 2).

Фаги К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА с широким спектром литической активности были отобраны для конструирования диагностического биопрепарата.

Таблица 1

Литическая активность фагов бактерий рода Klebsiella

№ пп Название фага серии УГСХА Индикаторная культура Активность фагов

по Аппельману по Грация

1 К-281 К. pneumoniae № 8172 10° 1 х 10"

2 К - 210 К. pneumoniae № 1071 10"* 1,5 х 10"

3 К-41 К. pneumoniae № 4463 10*0 7 х 10у

4 К-42 К. pneumoniae № 4463 1<У* 5 x10е

5 К - 4 К. pneumoniae N2 4463 10"° 1 х 10v

6 К - 14 К. pneumoniae № 4463 10° 1,1 х 10"

7 К-24 К. pneumoniae № 4463 10° 1 х 10*

8 К-101 К. pneumoniae № 01 10"3 7х 10"

9 К-201 К. pneumoniae Ха 01 10" 2 х 10у

10 К - 2 К. pneumoniae № 265 10° 4х 10'

11 К - 12 К. pneumoniae № 265 ю-5 1 х 10*

12 К- 10 К. pneumoniae № 1017 10-* 2 х 10*

13 К-60 К. pneumoniae Кг 60 10° 2,5 х 10у

14 к- и AT. pneumoniae № 1 10'8 2,5 х 10*

15 К-0x1 К. oxytoca № 1/1 10° 8х 10"

16 К-33 К. oxytoca № 5 10"8 5 х 10*

17 К-44 К. pneumoniae № 4463 10"* 2 х 10у

18 К-03 К. pneumoniae № 03 10" 1 х 10*

19 К-032 К. pneumoniae № 03 10" 1x10s

20 К - 81 К. pneumoniae № 8172 10"° 4х 10*

21 К - 8 К. pneumoniae № 423 10" 1 х 10*

Таблица 2

Спектр логической активности фагов бактерий рода Klebsiella

Бактериофаги Кол-во исследованных штаммов культур Общее кол-во лизируемых штаммов культур Кол-во лизируемых штаммов культур % лизируемых штаммов культур

К-10 УГСХА 38 37 29 76

К-81 УГСХА 28 73

Общий % лизируемых штаммов культур 97

Специфичность фагов бактерий рода Klebsiella. Изучение специфичности бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА проводили по отношению к представителям других родов семейства Ertterobacteriaceae: Escherichia spp.t Proteus spp.t Morganella sppCitrobacter sppSalmortella spp., Enterobacter sppProviäensia spp.f Yersinia enterocolttica, а также родов семейств Staphylococcus spp., Streptococcus sppPseudomonas spp.

Установлено, что селекционированные фаги неактивны по отношению к представителям бактерий других родов и семейств.

Температурная устойчивость фагов бактерий рода Klebsiella. В результате изучения чувствительности бактериофагов к действию температуры, установили, что фаги К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА понижали свою физиологическую активность при температуре 67 °С и инактивировались при температуре 81 °С (К - 10 УГСХА) и 88 °С (К - 81 УГСХА) в течение 30 минут (табл. 3).

Таблица 3

Температурная устойчивость бактериофагов Klebsiella

Температура, °С Количество активных фаговых корпускул в 1 мл после действия температуры

К - 10 УГСХА К - 81 УГСХА

60-63 1x10" 2 х 10*

64-67 4,5 х 10й 1,8 х 10'

68-71 7,5 х 10" 1 х 10°

73-75 6,5 х 10J . 2,2 хЮ4

76-78 2,1 х 102 4,3 х 104

78-81 3x10' 4,8 х 104

82-84 - 2,1 х 104

85-88 ■ — 2х 10'

88-90 — _

Контроль фага 1,2x10" 3 х 10*

Устойчивость фагов бактерий рода К1еЬ$Ш1а н воздействию хлороформа. Чувствительность бактериофагов к хлороформу определяли в соотношении 1 : 10 при постоянном встряхивании в течение 10, 15, 20, 25, 30, 40 минут. Количество негативных колоний в 1 мл исследовали методом агаровых слоев (по Грация). Обработка бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА хлороформом выявила выраженную устойчивость их к воздействию данного агента в течение 40 минут (табл. 4).

Таблица 4

Устойчивость фагов бактерий рода Ktebsiella к воздействию хлороформа

№ пп Фаги Количество активных фаговых корпускул в 1 мл после воздействия хлороформа Контроль

10 мин 15 мин 20 мни 25 мин 30 мин 40 мин

1 К - 10 УГСХА 1 х 10" 1,5 х 10* 2,5 х 10* 2 х 10* 1 х 10* 1,5 х 10у 1,2 х 10*

2 К- 81 УГСХА Зх№ 3x10* 4 х 10" 2 х 10" 3 х 10" 3,2 х 10* 3 х 10*

Данный химический areirr использовали в исследованиях для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий.

Морфология фаговых корпускул. Для электронной микроскопии подготовку препаратов проводили соосажденнем вирусных частиц в режиме низкоскоростного центрифугирования по методике, предложенной А.П. Пономаревым, О.Г. Андреевой, Т.Н. Артамоновой (2002).

Исследования проводили на электронном микроскопе JEM-100B в лаборатории Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных, совместно с профессором А.П. Пономаревым. В результате проведенных исследований было установлено, что вирионы фагов К - 81- и К - 10 серии УГСХА имеют структуры, состоящие из симметричной головки в виде многогранника с отростком.

Вирусные частицы фага К - 10 УГСХА имеют следующие размеры высота головки 62 нм, диаметр головки: 50 нм и длина отростка - 105 нм. Отношение высоты головки к ее диаметру у фагов равно 1,24. Морфология бактериофага К - 10 УГСХА представлена на рисунке 1.

У фага К - 81 УГСХА корпускулы имеют головку высотой 60 нм, диаметр 55 нм, длина отростка —' 85 нм. Огаошение высоты головки к ее диаметру равно 1*09 нм. Морфология бактериофага К - 81 УГСХА представлена на рисунке 2.

В соответствии с морфологическими параметрами бактериофаг К - 10 УГСХА согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов (Murphy с соавт., 1995) относится к семейству Siphoviridae, по классификации A.C. Тихоненко к IV группе — «Фаги с длинным несокращающимся отростком», а фаг К - 81 УГСХА к семейству Afyoviridae и к V морфологической группе - «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению» (Тихоненко, 1968).

Для получения фагов с высокой логической активностью нами была установлена множественность инфекции, выраженная в соотношении между количеством фаговых корпускул и количеством микробных клеток индикаторной культуры. Для штамма фага К - 10 УГСХА множественность инфекции составила 2,17 корпускул фага на 1 бактериальную клетку, фага К - 81 УГСХА - 0,21 к 1. Оптимальная экспозиция пассажа при 37 °С составила 4 часа. Был осуществлен контроль бактериофагов: определение стерильности, литической активности, спектра лизиса, специфичности; степень нарастания титра фага.

Разработанные нами технологические параметры индикаторных фагов позволили получить специфический биопрепарат с литической активностью 10*. При исследовании литической активности полученного препарата в условиях хранения

Рис. 1. Электронная микрофотография морфология бактериофага К -10 УГСХА (увел, х 110 000)

Рис. 2. Электронная микрофотография морфология бактериофага К - 81 УГСХА (увел, х 110 000)

Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных фагов Klebsiella

при 2 — 4 °С с периодичностью 3-4 месяца в течение года было установлено, что фаги сохраняли свою активность за весь период наблюдения.

Разработка схемы ускоренной идентификацнибактернй рода Klebsiella

Учитывая строгую специфичность отобранных бактериофагов К-10иК-81 серии УГСХА, нами была разработана схема ускоренной идентификации бактерий рода Klebsiella. Исследования проводили в сравнении с традиционной схемой, представленной в «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями». В качестве материала для исследований использовали воду, комбикорм, мясо и фекалии, контаминированные бактериями рода Klebsiella в концентрациях 10s, 104, 10\ 102, 10 м.к. в 1 мл. Вьщеление и идентификацию чистых культур микроорганизмов проводили в соответствии с правилами, изложенными в выше упомянутых методических указаниях. Фагоидентификация основывалась па обнаружении прозрачной зоны лизиса бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА.

Проведенные исследования подтверждают возможность идентификации бактерий рода Klebsiella индикаторными фагами К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА, с уменьшением времени исследования с 96 до 48 часов, сократив при этом расход реактивов, питательных сред и лабораторной посуды.

Разработка оптимальных условий постановки РНФ

Решение следующей поставленной задачи заключалось в разработке оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага (РНФ) с различными субстратами.

Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение. Для постановки РНФ опытным путем установили показатели нарастания титра фагов, имеющие диагностическое значение. В наших исследованиях РНФ считали положительной, если увеличение титра фагов произошло в 5 и более раз. Данный критерий гарантировал достоверность результатов, поскольку он позволял исключить технические погрешности при титровании, при которых возможно выявление невысокой степени увеличения количества фага.

Установление опгтшачьнаго времени, обеспечивающее наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями Для решения поставленной задачи проведены эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного

показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ, В качестве тест-объекта использовали МПБ, контаминированный бактериями рода Klebsiella. Оптимальное время экспозиции выбирали из следующих параметров:

- предварительное подращивание исследуемого материала в течение 5,16,24 часов при 3 7 °С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 °С;

- увеличение времени контакта исследуемого материала с фагом до 6, 10, 16 и 24 часов при температуре 37 °С.

Установлено, что с помощью исследуемых бактериофагов в РНФ при подращивании материала в течение 5 часов можно обнаружить клебспеллы в концентрации 103 м.кУмл. С увеличение времени подращивания материала до 16 часов чувствительность реакции повышается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.кУмл. На проведение исследования затрачивается 33 часа. Результаты исследований представлены в таблице 5,

Таблица 5

Чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала, контаминировашюго бактериями рода Klebsiella

№ Длительность Бактериофаг Время, затраченное на

пп подращивания исследуемого материала, проведение исследований, ч

ч К - 10 УГСХА К-81 УГСХА

1 5 10* 10' 22

2 16 10* 10* 33

3 24 W 10' 41

Во втором варианте опыта МПБ, контаминированный бактериями рода Klebsiella от 101 до 1 х 1Ö5 м.кУмл не подращивали, а сразу же вносили в пробирки. За 5 часов инкубации исследуемого материала с фагом К - 81 УГСХА обнаруживались бактерии Kpneumoniae № 8172 в концентрации 10* м.к./мл, при увеличение времени культивирования до 6 часов повышает чувствительность реакции с указанным фатом до 103 м.кУмл, а 10 часовая инкубация-до 102 м.кУмл (табл. 6).

Таблица 6

Чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с индикаторными бактериофагами

№ пп Длительность инкубирования исследуемого материала, ч Бактериофаг Время, затраченное на проведение исследований, ч

К - 10 УГСХА К - 81 УГСХА

1 5 10J 10* 17

2 6 10J 10J 18

3 10 10* 10' 22

4 16 10х 10' 33

5 24 1С ю2 41

На основании полученных данных можно сделать вывод, что наиболее оптимальным является режим РНФ при 6 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в количестве 103 микробных клеток в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 18 часов. Одновременное исследование бактериологическим методом позволяло обнаружить бактерии рода Klebsiella в концентрации 104 м.к./мл, при этом на исследование затрачивалось 96 часов: выделение возбудителя (48 часов), изучение биохимических свойств (48 часов).

Разработка схемы постановки РНФ для индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале

Данные исследования предполагали изучение возможности использования РНФ с индикаторными бактериофагами К-10иК-81 серии УГСХА .для обнаружения бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале (вода, комбикорм, фекалии и мясо). Одновременно исследования проводили бактериологическим методом.

По результатам проведенных исследований водопроводной воды, комбикорма и мяса установлено, что нарастание титра фагов более чем в 5 раз произошло при минимальной концентрации бактерий рода Klebsiella 10э м,к./мл.

При исследовании проб фекалий нарастание титра фагов более чем в 5 раз произошло при концентрации бактерии рода Klebsiella 104 м.к./г. При увеличении времени инкубации бактериофага с фекалиями до 10 часов обнаруживали клебсиеллы в концентрации 103 м.к./г за 22 часа.

При исследовании, воды, комбикорма, фекалий и мяса мы наблюдали видимое преимущество метода фагоиндикации - РНФ над бактериологическим методом исследования. Таким образом, диагностическая чувствительность РНФ позволяет обнаруживать бактерии рода Klebsiella в минимальной концентрации 103 - 104 м.кУмл за 18-22 часа.

Испытания в условиях производства. Оценивая эффективность реакции нарастания титра фага в условиях производства мы провели исследования по фагодиагностике кишечной инфекции телят, протекающей с участием бактерий рода Klebsiella. Телята принадлежали модочно-товарной ферме учебно-опытного хозяйства УГСХА Чердаклинского района Ульяновской области. Исследованию, подвергали 13 проб фекалий от больных диареей телят в возрасте от 2 - 15 суток.

В пробах фекалий телят методом фагоиндикации с помощью бактериофагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА бактерии рода Klebsiella были обнаружены в 38 % случаях (5 проб). Время исследования составило 22 часа. Бактериологическим методом данные бактерии были обнаружены в 15 % случаях (в 2 пробах) за 96 часов.

Результаты производственных испытаний указывают на более высокую чувствительность РНФ при обнаружении бактерий рода Klebsiella в сравнении с бактериологическим методом исследования с меньшей затратой времени, реактивов и посуды.

Изучение эффективности сконструированного фагового биопрепарата

В качестве усовершенствования предложенного метода нами изучалась возможность использования смеси из монофашв. Определение активности монофагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА и активности смеси данных фагов на индикаторных штаммах, показало равнозначные результаты (табл. 7). Интерференция, то есть взаимное усиление или подавление при взаимодействии фагов отсутствовала.

Таблица 7

Активность монофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА и их смеси

Фаги Индикаторная культура Количество корпускул в 1 мл (по Грация)

К-10 УГСХА К pneumoniae № 1017 2x10*

К-81 УГСХА К. pneumoniae № 8172 4х10ч

Смесь К - 10 УГСХА и К-81 УГСХА К pneumoniae № 1017 1,2 хЮ9

К pneumoniae J4s 8172 2,1 х 109

Результаты проведенных исследований подтверждают возможность использования монофагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА в смеси. Следовательно, полученный биопрепарат, состоящий из двух фагов, может использоваться для идентификации, а также в реакции нарастания титра фага для индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале. Предложены оптимальные технологические параметры постановки РНФ, позволяющие повысить эффективность обнаружения бактерий рода Klebsiella.

ВЫВОДЫ

1. Из объектов ветеринарного надзора и патологического материала Klebsiella spp. обнаружены в 8 из 18 хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных. Изолированно и идентифицированно 12 клебсиелл штаммов, из них 10 штаммов К. pneumoniae и 2 штамма К. oxytoca.

2. Из объектов внешней среды был выделен и селекционирован 21 изолят бактериофагов активных в отношении бактерий рода Klebsiella.

3. Выделенные фаги имели литическую активность от 10~J до 10"8 (по Аппельману) и от 4 х 107 до 8 х 10® фаговых корпускул в 1 мл (по Грация). Изученные фагй характеризовались разным диапазоном литической активности. Усганоатено что, два бактериофага отличались широким диапазоном логической активности: К - 10 УГСХА лизировал 76 % штаммов бактерий рода Klebsiella, К - 81 УГСХА - 73 %, а в сумме фаги лизировали 97 % всех исследованных культур. Установлено отсутствие активности селекционированных фагов к представителям бактерий других родов и семейств, то есть фаги специфичны к бактериям рода Klebsiella.

4. Показана устойчивость фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА к воздействию высокой температуры. Температурный диапазон составил 67 - 88 °С. Установлена устойчивость названных фагов к воздействию хлороформа в течение 40 минут.

5. В соответствии с морфологическими параметрами бактериофаг К - 10 УГСХА относится к семейству Siphoviridae, к IV группе по классификации A.C. Тнхоненко (1968), а фаг К - 81 УГСХА к семейству Myoviridae и к V морфологической группе.

6. Разработанные биотехнологические параметры изготовления и контроля клебсиеллезных бактериофагов позволяют получить специфический диагностический

препарат с высокой литической активностью, состоящий из двух штаммов фагов К-10 УГСХА и К-81 УГСХА.

7, Разработанная схема выделения и фагоидентификашш клебсиелл с помощью фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА, позволяет выделить и идентифицировать бактерии рода Klebsiella за 48 часов.

8. Разработанные технологические параметры ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале с помощью РНФ с использованием индикаторных бактериофагов (К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА), позволяют обнаружить бактерий рода Klebsiella в концентрации 103 - 104 м.кУмл (г) исследуемого субстрата за 18-22часа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены два штамма фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА активных по отношению к представителям бактерий рода Klebsiellat обладающие строгой специфичностью, широким спектром литической активности. Фаги депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации ветеринарных препаратов (справка о депонировании фага К - 10 УГСХА - Phagum Klebsiella 10 УГСХА-ДЕП от 21.02.2006, К-81 УГСХА - Phagum Klebsiella 81 УГСХА-ДНИ от 21.02.2006), признаны перспективными и используются для изготавления диагностических препаратов.

2. Индикацию и идентификацию бактерий рода Klebsiella, предлагаем проводить с помощью набора диагностических фагов согласно «Методическим рекомендациям по ускоренной индикации и идентификации энтеробакгерий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пишевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.06.2006 года.

3. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов рекомендуем проводить согласно «Временной инструкции по изготовлению и контролю индикаторных бактериофагов Klebsiella К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА», одобренной Ученым советом Ульяновской ГСХА и утвержденной ректором академии 17.01.2006 года.

Список работ« опубликованных по теме диссертации

1. Бульканова Е.А. Выделение, диагностика и идентификация бактерий рода Klebsiella it Матер. Всерос. научно-практ. конф. - Ульяновск, 2004. - Ч. 1. - С, 257 -262.

2. Бульканова Е.А., Золотухин С.Н., Митрохина Е.Н. Биологические свойства бактерий рода Klebsiella и их значение в патологии животных Н Вестник УГСХА, серия «Ветеринария». - 2004. - № 12, - С. 34 - 40.

3. Бульканова Е.А., Золотухин С.Н. Выделение бактериофагов рода Klebsiella из сточных вод//Вестник УГСХА, серия «Ветеринария». - 2004. - № 12.— С. 40-42.

4. Бульканова Е.А., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Выделение бактериофагов рода Klebsiella из объектов внешней среды // Сб. науч. тр. Межрегион, научно-практ. конф. молодых ученых Приволжского федерального округа. - Самара, 2005. - С. 189-191.

5. Бульканова ЕЛ., Мелехин А.С., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Литическая активность бактериофагов энтеробактерий рода Klebsiella выделенных из объектов внешней среды // Матер. Всерос. научно-практ. конф. - Ульяновск, 2005. - Ч. 5. -С. 155- 157.

6. Бульканова ЕЛ,, Мелехин А.С., Золотухин С.Н., Васильев Д.А, Биологические свойства бактериофагов Klebsiella выделенных из объектов внешней среды // Матер. Всерос. научно-практ. конф. - Ульяновск, 2005. -Ч. 5.-С. 155 - 157.

7. Бульканова Е.А., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Изучение устойчивости клебсиеллезных бактериофагов к воздействию температуры и хлороформа // Матер. Междунар. научно-практ. конф, - Ульяновск, 2006. -Ч. 1. - С. 333 - 336.

8. Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Каврук Л.С., Молофеева Н.И., Пульчеровская Л.П., Коритняк Б.М,, Бульканова Е.А., Феоктистова Н.А., Пожарникова Е.Н., Мелехин А.С., Барт Н.Г., Катмакова Н.П. Выделение и селекция клонов бактериофагов патогенных энтеробактерий // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: Матер. Междунар. научн. конф. - Ульяновск, 2006. - С. 227 - 231.

9. Золотухин С.Н., Мелехин А.С., Васильев Д.А., Каврук Л.С., Молофеева Н.И., Пульчеровская Л.П., Коритняк Б.М., Бульканова Е.А., Феоктистова Н.А., Пожарникова Е.Н. Чувствительность патогенных энтеробактерий, выделенных

при диареях молодняка животных к антибиотикам и специфическим бактериофагам // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: Матер. Междунар. научн. конф. - Ульяновск, 2006. -С. 233-236.

Ю.Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Мелехин A.C., Бульканова Е,А,, Феоктистова H.A., Пожарникова E.H. Бактериофаги малоизученных энтеробактериЙ и перспективы их применения в ветеринарии // Ветеринарная патология. - 2006. - № 3. - С. 80 -85.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бульканова, Елена Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика бактерий рода Klebsiella.

1.2. Патогенность.

1.3. Резервуар и распространение инфекции.

1.4. Устойчивость к физико-химическим факторам.

1.5. Лабораторная идентификация клебсиелл.

1.6. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике.

1.6.1. Взаимодействие бактериофагов с клеткой-хозяином.

1.6.2. Фагоидентификация бактерий и фаготипирование.

1.6.3. Реакция нарастания титра фага (РНФ).

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы исследований.

2.1.1. Материалы.

2.1.2. Методы.

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Выделение бактерий рода Klebsiella из объектов ветеринарного надзора и патологического материала.

2.2.2. Поиск бактериофагов клебсиелл и селекция клонов фагов.

2.2.3. Характеристика фагов бактерий рода Klebsiella.

2.3. Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных фагов клебсиелл.

2.4. Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий рода Klebsiella.

2.5. Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага.

2.5.1. Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение.

2.5.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями.

2.5.3. Разработка схемы постановки РНФ для индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора.

2.5.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями рода Klebsiella с помощью РНФ.

2.5.3.2. Исследование комбикорма, контаминированного бактериями рода Klebsiella с помощью РНФ.

2.5.3.3. Исследование проб фекалий, контаминированных бактериями рода Klebsiella с помощью РНФ.

2.5.3.4. Исследование мяса, контаминированного бактериями рода Klebsiella с помощью РНФ.

2.5.3.5. Исследование фекалий больных диареей телят на присутствие бактерий Klebsiella spp. с использованием РНФ.

2.6. Изучение эффективности сконструированного фагового биопрепарата.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата"

Актуальность работы. В настоящее время особое внимание уделяют диагностике мало изученных инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом. К их числу относятся клебсиеллезные инфекции. Представители рода Klebsiella широко распространены в природе, а подвид pneumoniae является нормальной микрофлорой респираторного тракта животных и человека. Однако среди этих микроорганизмов имеются патогенные варианты, способные вызывать у животных и людей самостоятельные заболевания. Клебсиеллы известны как возбудители пневмонии, заболеваний мочеполовой системы, острых кишечных инфекции, различных гнойно-септических осложнений, а также внутрибольничных инфекций, менингитов. Заболевания, вызываемые клебсиеллами, протекающие по типу острого сепсиса, предложено рассматривать как самостоятельную нозологическую единицу - клебсиеллез (Ковалева, Рейзис, 1993; Киселева, Красноголовец, 1996; Покровский, 1985; 1999). Известно так же, что К. pneumoniae играет этиологическую роль при маститах, пневмониях, сеп-тицемиях коров, свиней, лошадей, обезьян, инфекционной диареи молодняка животных (Воронин, Дервишов, Ставцева, 1989; Каврук, 1994; Кукава с соавт., 1998; Шахов, 2003; Золотухин, 2004; 2005).

Выделение и идентификация клебсиелл в основном проводится бактериологическим методом. Трудоемкость и длительность изучения биологических свойств бактерий не позволяет быстро идентифицировать бактерии рода Klebsiella. Существующие современные высокоспецифичные методы лабораторной диагностики (ИФА, РИА, ПЦР) из-за сложности методик, высокой стоимости оборудования и реактивов пока недоступны для большинства лабораторий. В связи с вышеизложенным возникает необходимость изыскания эффективных и доступных для ветеринарных лабораторий методов индикации и идентификации бактерий рода Klebsiella.

Ряд исследователей (Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1988; Габрилович, 1981; 1983; Русалеев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990; 1992; Золотухин, 2005; Натидзе с соавт., 2005) приводят убедительные данные о положительных результатах индикации и идентификации возбудителей некоторых заболеваний с помощью бактериофагов. Метод фагодиагностики является специфичным, не требующий больших затрат времени, материалов и доступен лабораториям всех уровней.

Выделением и изучением бактериофагов рода Klebsiella занимались исследователи разных научных школ (Przondo-Hessek, 1966; Slopek et. al., 1967; 1978; Габрилович с соавт., 1970; 1973; 1981; 1983; Gaston et. al., 1987; Pieroni et. al., 1994; Джапаридзе с соавт., 2005). Однако в арсенале ветеринарных лабораторий отсутствуют клебсиеллезные бактериофаги. Поэтому получение специфических бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Klebsiella, выделенных из объектов ветеринарного надзора, с целью диагностики, является актуальным.

Задачи исследования:

2. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий Klebsiella.

4. Сконструировать на основе индикаторных бактериофагов новый биопрепарат - диагностикум.

6. Разработать схему идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью бактериофагов.

Научная новизна:

Выделены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении бактерий рода Klebsiella, изолированных из объектов ветеринарного надзора и патологического материала. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов.

Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью. Впервые разработаны биотехнологические параметры для фагоидентификации и фагоиндикации клебсиелл в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале.

По материалам диссертационных исследований разработаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробак-терий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.06.2006 года.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технологические параметры выделения бактериофагов бактерий рода Klebsiella.

2. Выделенные фаги имели высокую литическую активность, два бактериофага К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА обладали широким диапазоном литической активности, специфичностью к бактериям рода Klebsiella.

3. Доказана эффективность сконструированного фагового биопрепарата.

4. Разработаны биотехнологические параметры изготовления диагностического фагового препарата.

5. Схема идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов.

6. Схема ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Региональные проблемы народного хозяйства» (8-9 апреля 2004 года, Ульяновская ГСХА, Ульяновск); Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых Приволжского федерального округа «Молодые ученые в решении региональных проблем АПК» (22 - 23 сентября 2004 года Самарская ГСХА, Самара); Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (26 - 28 апреля 2005 года, Ульяновская ГСХА, Ульяновск); Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (21 - 23 марта 2006 года, Ульяновская ГСХА, Ульяновск); Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (21 - 23 июня 2006 года, Ульяновск).

Основные материалы диссертации заслушаны и одобрены на заседании Отделения ветеринарной медицины РАСХН (26.06.2006 г.), на межкафедральном совещании сотрудников кафедр факультета фетеринарной медицины (15.03.2006 г.).

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов К - 10 УГС-ХА, К - 81 УГСХА и индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний:

- в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (от 30.01.2006 г.);

- во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (от 21.02.2006 г.);

- в условиях производства, проведенных на базе Чердаклинской районной лаборатории (10.12.2005 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников (193 источника, в том числе 50 зарубежных авторов) и приложения. Работа изложена на 162 страницах, иллюстрирована 18 рисунками, 29 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Бульканова, Елена Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. В объектах ветеринарного надзора и патологическом материале бактерии рода Klebsiella обнаружены в 8 из 18 хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных. Изолированно и идентифицированно 12 штаммов клебсиелл, из них 10 штаммов К pneumoniae и 2 штамма К. oxytoca.

3. Выделенные фаги имели литическую активность от 10~5 до 10'8 (по Ап

7 9 пельману) и от 4x10 до 8x10 фаговых корпускул в 1 мл (по Грация). Изученные фаги характеризовались разным диапазоном литической активности. Установлено, что два бактериофага отличались широким диапазоном литической активности: К - 10 УГСХА лизировал 76 % штаммов бактерий рода Klebsiella, К - 81 УГСХА - 73 %, а в сумме фаги лизировали 97 % всех исследованных культур. Установлено отсутствие активности селекционированных фагов к представителям бактерий других родов и семейств, то есть фаги специфичны к бактериям рода Klebsiella.

5. В соответствии с морфологическими параметрами бактериофаг К - 10 УГСХА относится к семейству Siphoviridae, к IV группе по классификации А.С. Тихоненко (1968), а фаг К - 81 УГСХА к семейству Myoviridae и к V морфологической группе.

6. Разработанные биотехнологические параметры изготовления и контроля клебсиеллезных бактериофагов позволяют получить специфический диагностический препарат с высокой литической активностью, состоящий из двух штаммов фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА.

7. Разработанная схема выделения и фагоидентификации клебсиелл с помощью фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА, позволяет выделить и идентифицировать бактерии рода Klebsiella за 48 часов.

8. Разработанные технологические параметры ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале с помощью РНФ с использованием индикаторных бактериофагов (К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА), позволяют обнаружить бактерий рода Klebsiella в концентрации 103-104 м.к./мл (г) исследуемого субстрата за 18 -22 часа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены два штамма фагов К -10 УГСХА и К - 81 УГСХА активных по отношению к представителям бактерий рода Klebsiella, обладающие строгой специфичностью, широким спектром литической активности. Фаги депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации ветеринарных препаратов (справка о депонировании фага К - 10 УГСХА - Phagum Klebsiella 10 УГСХА - ДЕП от 21.02.2006 № 263-5/19, К - 81 УГСХА - Phagum Klebsiella 81 УГСХА - ДЕП от 21.02.2006 № 263-6/19), признаны перспективными и используются для изготавления диагностических препаратов.

2. Индикацию и идентификацию бактерий рода Klebsiella, предлагаем проводить с помощью набора диагностических фагов согласно «Методическим рекомендациям по ускоренной индикации и идентификации энте-робактерий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.06.2006 года.

3. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов рекомендуем проводить согласно «Временной инструкции по изготовлению и контролю индикаторных бактериофагов Klebsiella К - 10 УГСХА и К -81 УГСХА», одобренной Ученым советом Ульяновской ГСХА и утвержденной ректором академии 17.01.2006 года.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы все большее значение в ветеринарной практике приобретают заболевания, вызванные бактериями рода Klebsiella. Известно, что К pneumoniae играет этиологическую роль при маститах, пневмониях, сеп-тицемиях коров, свиней, лошадей, обезьян, инфекционной диареи молодняка животных (Воронин с соавт., 1989; Каврук, 1994; Кукава с соавт., 1998; Шахов 2003; Золотухин с соавт., 2004; 2005).

Исследователи, занимающиеся лабораторной диагностикой, отмечают значительные трудности при обнаружении и идентификации клебсиелл бактериологическим методом. Идентификация бактерий рода Klebsiella бактериологическим методом, основана на изучении биохимических свойств данных микроорганизмов. Трудоемкость и длительность изучения ферментативных свойств не позволяет быстро и точно идентифицировать представителей рода Klebsiella.

Используя существующие схемы бактериологического выделения представителей рода Klebsiella, отмечали некоторые недостатки. Схема В.И. Покровского, O.K. Поздеева (1999) из-за трудоемкости и необходимости использования большого набора тестов, усложняла идентификацию. Недостаток использования методических рекомендаций по диагностике смешанной кишечной инфекции для выделения бактерий рода Klebsiella заключался в наборе тестов, который не позволяет дифференцировать выделенные культуры до вида, даже при большом сроке исследования (4 до 7 суток).

Для снижения трудоемкости бактериологического метода идентификацию бактерий проводили по следующим тестам: образование сероводорода (-), расщепление мочевины (+/-), определение подвижности (-), усвоение цитрата Симонса (+), реакция с метиленовым красным (-/+), Фогеса-Проскауэра (+/-). Указанные тесты позволяли нам дифференцировать клебсиеллы от других родов семейства Enterobacteriaceae. При получении соответствующих результатов продолжали изучение ферментативных свойств на средах с углеводами: глюкозой (+), лактозой (+), мальтозой (-), малонатом (+/-), ставили тесты на образование индола (-/+), утилизации ацетата (+/-) и ферментации сорбита (+).

В лабораторной практике некоторых заболеваний метод фагодиагностики показал высокую эффективность при индикации и идентификации возбудителей (Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1984; Русалеев, 1990; Кольпикова, Ба-кулов, Котляров, 1990, 1992; Натидзес соавт., 2005, Золотухин с соавт., 2005).

Исходя из выше перечисленного, целью наших исследований была разработка технологических параметров по индикации и идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов.

Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий рода Klebsiella из объектов ветеринарного надзора и патологического материала. Клебсиеллы были обнаружены в 8 из 18 хозяйств Ульяновской, Самарской областей и республики Татарстан, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных. В результате проведенных исследований из патологического материала и объектов ветеринарного надзора, нами изолированно и идентифицированно 12 штаммов клебсиелл, из них 10 штаммов К. pneumoniae и 2 штамма К. oxytoca.

Для достижения поставленной цели из сточных вод свиноводческих и мо-лочно-товарных ферм разных хозяйств Ульяновской области, сточных вод Ульяновского мясокомбината нами был выделен и селекционирован 21 штамм бактериофагов Klebsiella. У выделенных фагов были изучены основные биологические свойства: 1) морфология негативных колоний; 2) литическая активность; 3) спектр литической активности; 4) специфичность действия; 5) температурная устойчивость; 6) чувствительность к хлороформу; 7) морфология фаговых корпускул.

Изученные фаги с разной морфологией негативных колоний были разделены на два типа. К первому типу относятся круглые, прозрачные в центре негативные колонии диаметром от 2 мм и более с зоной неполного лизиса

1-8 мм. Колонии второго типа круглые, прозрачные с ровными краями в диаметре до 2,5 мм с отсутствием зоны неполного лизиса.

Литическую активность бактериофагов оценивали по методу Аппельману она составила от 10"5 до 10"8 и от 4 х 107 до 8 х 109 фаговых корпускул в 1 мл по методу Грациа. В результате изученния спектра литической активности в отношении 28 (5 референс-пггаммов, 11 музейных и 12 выделенных нами) штаммов бактерий рода Klebsiella фаги характеризовались разным диапазоном литической активности.

Для дальнейшего изучения отобрали два бактериофага с наибольшим диапазоном по отношению к изучаемым культурам - фаг К - 81 УГСХА, который лизировал 75 % и фаг К - 10 УГСХА - 71 % штаммов бактерий рода Klebsiella. Отобранные бактериофаги исследовали дополнительно на 10 штаммах клебсиелл из коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов. В результате было установлено что, фаг К -10 УГСХА лизировал 76 % штаммов бактерий рода Klebsiella, К - 81 УГСХА - 73 %, а в сумме фаги проявили литическое действие в отношении 97 % всех исследованных культур. В исследованиях на специфичность фаги оказались неактивны по отношению к представителям бактерий других родов семейства Enterobacteriaceae и семейств.

Селекционированные нами фаги К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА были термостабильны и не понижали свою физиологическую активность до 63 °С в течение 30 минут

Обработка бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА хлороформом, выявила выраженную устойчивость к воздействию данного агента в течение 40 минут. Полученные результаты учитывались при стерилизации фаголизата от бактерий.

По результатам изучения морфологии фаговых корпускул установили, что изученные фаги были различны по морфологическим параметрам. Бактериофаг К - 10 УГСХА согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов (Murphy с соавт., 1995) относится к семейству Siphoviridae, по классификации А.С. Тихоненко (1968) к IV группе - «Фаги с длинным несокращающимся отростком», а фаг К - 81 УГСХА к семейству Myoviridae и к V морфологической группе - «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению».

По литературным данным фаги, применяемые для индикации и идентификации должны соответствовать определенным биологическим свойствам, обладать широким диапазоном литического действия, высокой активностью и выраженной специфичностью, более высоким порогом термоинактивации, чем у бактерий (Тимаков, Гольдфарб, 1960; Ревенко, 1978). Результаты наших исследований соответствуют литературным данным. Бактериофаги К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА являются строго специфичными в отношении бактерий рода Klebsiella, с широким совместным диапазоном литического действия - 97 %, с высокой литической активностью от 2 х 109 до 4 х 109 фаговых корпускул в 1 мл, термостабильны и устойчивы к

Полученные результаты изученных биологических свойств двух фагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА позволили нам использовать их для изготавле-ния диагностических препаратов.

При разработке технологических параметров для получения индикаторных фагов Klebsiella с высокой литической активностью опытным путем установили множественность инфекции. Для штамма фага К - 10 УГСХА множественность инфекции составила 2,17 корпускул фага на 1 бактериальную клетку, фага К - 81 УГСХА - 0,21 к 1. Оптимальная экспозиция пассажа при 37 °С составила 4 часа. Был осуществлен контроль бактериофагов: определение стерильности, литической активности, спектра лизиса, специфичности; степень нарастания титра фага.

Метод фагоидентификации успешно применяется в ветеринарной и медицинской практике. С помощью специфических бактериофагов, многие исследователи идентифицировали большой процент патогенных культур в течение 48 часов (Островская, Папкова, 1951; Аврех, 1954; Кузнецова, 1956; Попхадзе,

1968; Цветков, 1941; Лихачев, 1948; Ганюшкин, 1984; Николаенко, Тутов, 1970; Капырина, Бакулов, 1972; Ревенко, 1978).

Предложенная нами схема выделения и ускоренной идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов К - 10 и К - 81 серии УГСХА, позволяла сократить сроки исследования в два раза (48 часов). В то время как бактериологический метод исследования занимал 96 часов.

Следующей важной задачей, которая была нами решена, была фагоин-дикация бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале без выделения чистой культуры.

Решение поставленной задачи заключалось в разработки оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага с различными субстратами:

- определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение. В наших исследованиях РНФ считали положительной, если увеличение титра фагов произошло в 5 и более раз. Данный критерий гарантировал достоверность результатов, поскольку он позволял исключить технические погрешности при титровании, при которых возможно выявление невысокой степени увеличения количества фага.

- установление оптимального времени, обеспечивающее наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями. Для решения поставленной задачи необходимо было провести эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культурой при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест-объекта использовали МПБ, контаминированный бактериями рода Klebsiella, оптимальное время экспозиции выбирали из следующих параметров: предварительное подращивание исследуемого материала в течение 5,16,24 часов при температуре 37 °С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 °С; увеличение времени контакта исследуемого материала с фагом до 6, 10,16 и 24 часов при температуре 37 °С.

Установлено, что с помощью исследуемых бактериофагов в РНФ при подращивании материала в течение 5 часов можно обнаружить клебсиеллы в концентрации 10 м.к./мл. С увеличение времени подращивания материала до 16 часов чувствительность реакции повышается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 10 м.к./мл.

За 5 часов инкубации исследуемого материала с фагом К - 81 УГСХА обнаруживались бактерии К pneumoniae № 8172 в концентрации 104 м.к./мл, при увеличение времени культивирования до 6 часов повышает чувствительность реак

3 2 ции с указанным фагом до 10 м.к./мл, а 10 часовая инкубация - до 10 м.к./мл. На основании полученных данных можно сделать вывод, что наиболее оптимальным является режим РНФ при 6 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в количестве 10 микробных клеток в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 18 часов. Одновременное исследование бактериологическим методом позволяло обнаружить бактерии рода Klebsiella в концентрации 104 м.к./мл, при этом на исследование затрачивалось 96 часов: выделение возбудителя (48 часов), изучение биохимических свойств (48 часов).

Полученные данные при исследовании воды, комбикорма и мяса подтверждают увеличение титра фагов более чем в 5 раз при минимальной концентрации бактерий рода Klebsiella 10 м.к./мл. При исследовании фекалий бактерии рода Klebsiella обнаруживались в концентрации 104 м.к./г, а с увеличением инкубации бактериофагов с материалом до 10 часов обнаруживали о данные бактерии в концентрации 10 м.к./г за 22 часа.

В результате проведенных исследований по обнаружению бактерий рода Klebsiella в контаминированных указанными микроорганизмами объектах ветеринарного надзора и патологическом материале, можно утверждать об успешном применении метода фашиндикации - РНФ, диагностическая чувствительность которого позволяет обнаруживать бактерии рода Klebsiella в минимальной концентрации 103 - 104м.к./мл за 18 - 22 часа.

Для оценки эффективности набора индикаторных бактериофагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА в условиях производства мы испытывали 13 проб фекалий больных телят, с помощью РНФ. Бактерии рода Klebsiella при этом были обнаружены в 38 %, а при исследовании бактериологическим методом - в 15 % случаях. Из этого следует, что РНФ является высокочувствительным методом, позволяющим обнаружить бактерии рода Klebsiella даже в случаях, когда выделение культуры в чистом виде практически невозможно из-за наличия большого количества посторонней микрофлоры.

В качестве усовершенствования предложенного метода нами изучалась возможность использования смеси из монофагов. Определив активность монофагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА, и активность смеси данных фагов на индикаторных штаммах культур К. pneumoniae № 1017 и К. pneumoniae № 8172 был получен аналогичный результат. Интерференция, то есть взаимное усиление или подавление при взаимодействии фагов отсутствовала.

На основании проведенных исследований, установлена возможность использования биопрепарата, состоящего из двух бактериофагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА. Следовательно, полученный биопрепарат, может использоваться для идентификации, а также в реакции нарастания титра фага для индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора. Предложены оптимальные технологические параметры постановки РНФ, позволяющие повысить эффективность обнаружения бактерий рода Klebsiella.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бульканова, Елена Анатольевна, Ульяновск

1. Абдусаматов М.А. Сравнительное изучение реакции нарастания титра фага и бактериологического метода при диагностике брюшного тифа у больных и рековалесцентов // ЖМЭИ. 1960. - № 1. - С. 23 - 27.

2. Аврех В.В. О применении бактериофагов в диагностике сальмонеллезов // ЖЭМИ. 1954. - № 7. - С. 93 - 96.

3. Адельсон Л.И., Гуторова В.Д., Ключарева Г.Г. Современное состояние проблемы теории бактериофага и его практическое применение // Тез. докл. юбилейной научной сессии Ленинградского сан.-гиг. мед. ун-та. -Л., 1958.-С. 123-131.

4. Алымова А.Ф., Гортинская В.В., Кузнецова А.П., Логинова Л.Л., Смирнова Е.А. Применение реакции нарастания титра фага в очагах брюшного тифа // Тр. Горьковского гос. мед. ин-та им. С.М. Кирова. 1964. - Т. 18.-С. 10-12.

5. Арский В.Г., Ахметов 3.3., Ясенский А.В. Применение реакции нарастания титра фага для диагностики хронической дизентерии // Здравоохранение Таджикистана. 1961. - № 2. - С. 5 - 11.

6. Архангельский И.И., Степанов Б.А. Фаготипирование патогенных стафилококков, выделенных из молока коров // Ветеринария. 1966. -№ 3. - С. 27.

7. Бабков В.В. Биологическая характеристика умеренных бактериофагов Е. coli 0124:В17 // Проблемы бактериофагии и биология кишечных бактерий: сб. кафедры микробиологии I Лен. мед. ин-та им. акад. И.П. Павлова Л., 1973.-53 с.

8. Байрак В.А. Тесты патогенности и фаготипы стафилококков, выделенных при мастите коров: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 1970.- 19 с.

9. Башмаков Г.А. Индикация дизентерийных бактерий на поверхности методом реакции нарастания титра фага // Военно-медицинский журнал. -1961.-№ 4.-С. 39-42.

10. Беркли Р., Бок Э., Буль Д., Бреннер Д., Васильева J1.B., Видель Ф., Грунт У., Гудселлоу М. Определитель бактерий Берджи // Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильяме. М.: Мир, 1997.-432 с.

11. Бондаренко В.М., Баркус М.М. Энтеротоксигенная способность штаммов рода Klebsiella и Enterobacter, выделенных при острых кишечных заболеваниях у детей // Журн. микробиол. 1986. - № 7. - С. 28 - 32.

12. Бондаренко В.М., Баккус М.М., Брилис В.И. Гемаглютинирующая и адгезивная способность штаммов клебсиелл и энтеробактер // Журн. микробиол. 1987. - № 7. - С. 3 - 6.

13. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина, 1999.-367 с.

14. Быкова З.А. Некоторые свойства чумных фагов // Тр. Армянской противочумной станции. 1964. - № 3. - С. 171-175.

15. Вилькомирская Т.С. О диагностическом значении реакции нарастания титра фага при дизентерии // ЖМЭИ. 1971. - № 1. - С. 136 - 138.

16. Воронин Е.С., Девришов Д.А., Ставцева Л.Я. // Вестник с.-х. науки. -1989.-№9.-С. 105-110.

17. Воронцова А.А. Применение метода реакции нарастания титра фага при эпидемиологическом и санитарном обследовании // Кишечные инфекции: тез. докл. на межинстит. конф. -М., 1961. С. 127 - 128.

18. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов // В кн.: Основы бактериофагии. Минск, 1973. - С. 5 - 24.

19. Габрилович И.М. Жугова Т.Ч. О взаимодействии фагов Klebsiella с чувствительными клетками // Вирусы микроорганизмов. Пущино: Науч. Центр биологических исследований АН СССР. - 1981. - С. 112-113.

20. Габрилович И.М., Азаматова А.Б., Хакешева Т.А. Об использовании бактериофагов для идентификации клебсиелл // Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике. М., 1983. С. - 139 - 140.

21. Газиев Г.М., Батуро А.П., Плетнев А.А. Определение факторов патогенности клебсиелл // Этиология острых кишечных заболеваний: сб. науч. трудов. -М., 1988. С. 86 - 90.

22. Ганюшкин В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят // Ветеринария. 1967. - № 3. - С. 69 - 71.

23. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги Salmonella choleraesuis, сравнительная характеристика и практическое применение: Автореф. дис. . докт. вет. наук. Ульяновск, 1984. - 84 с.

24. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. Ульяновск, 1988. - 45 с.

25. Ганюшкин В.Я. Обследование свиней на носительство сальмонелл и фагопрофилактика // Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск, 1990. -С. 20-28.

26. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М.: Медгиз, 1961. - 299 с.

27. Гольдфарб Д., Островская З.С. Индикация брюшнотифозной палочки в воде с помощью реакции нарастания титра фага // ЖМЭИ. 1957. -№ 5. - 17 с.

28. Гольдфарб Д.М., Кузнецова В.Н. Опыт применения реакции нарастания титра фага для диагностики дизентерии // ЖМЭИ. 1957. - № 8. -С. 90-94.

29. Гордина Р.В. Фаготипирование паратифозных бактерий и действие на них бактериофагов: Автореф. дис. . докт. биол. наук. -М., 1954. 52 с.

30. Горченина JI.B., Киселева Б.С. Среды для выделения клебсиелл // Журн. микробиол. 1985. - № 1.-С. 19-22.

31. Гуторова Л.Д. Фаготипирование бреславской палочки // ЖМЭИ. 1958. -№ 12.-С. 53 -55.

32. Давиденко Т.А., Зарицкий A.M. Фаготипирование S.typhimurium, выделенных в Киеве в 1966 1970 гг. // В кн.: Кишечные инфекции. - Киев, 1972.-С. 41-46.

33. Домарадский И.В., Мосолова О.Н., Денисенко Л.К. Методика быстрого обнаружения чумного микроба при помощи бактериофага. Иркутск, 1957.- 18 с.

34. Ершов Ф.И. Индикация дизентерийных бактерий с помощью РНФ // В кн.: Изменчивость микроорганизмов и иммунитет. М., 1959. -С. 188-191.

35. Земцова И.Н. Применение реакции нарастания титра специфического бактериофага для индикации спор сибиреязвенных бактерий в почве // В кн.: Вопросы микробиологии и лабораторной диагностики особо опасных инфекций. Саратов, 1965. - С. 171 - 175.

36. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных // Ульяновск. 2004. - С. 64 - 75.

37. Золотухин С.Н., Каврук JI.C., Васильев Д.А. Смешанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями // Ульяновск ГСХА. 2005. - С. 43 - 48.

38. Золотухин С.Н. Новые фармакологические средства в ветеринарии // Матер. 7 межгосуд. конф. С.-Пб., 1995. - С. 78 - 79.

39. Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Возбудители пищевых отравлений // Курс лекций по санитарной микробиологии. Учеб. пособ. 2002 -С. 151.

40. Зыкова JI.C. Факторы персистенции уропатогенов в диагностике, прогнозировании лечении пиелонефрита у детей: Автореф. дис. . докт. мед. наук. Оренбург, 1998. - 75 с.

41. Ивашура А.И. Патогенные бактерии в молоке здоровых и больных маститом коров и методы их индикации: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -М., 1967.-20 с.

42. Иллютович А.Ю., Петрова З.С., Голубева Е.Е., Четверкина Р.С. Применение РНФ для индикации дизентерийных бактерий флекснера в организме зараженных кроликов // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1958. -№ 6. - 78 с.

43. Калина Г.П. Среды узконаправленного действия для обнаружения и количественного учета клебсиелл // Журн. микробиол. 1980. - № 6. -С. 28-32.

44. Камбаратов П.И. Клиническая оценка РНФ как метода лабораторной диагностики острой дизентерии // ЖМЭИ. 1963. - № 4. - С. 29.

45. Капырина Н.А., Бакулов И.А. Идентификация возбудителя листериоза с помощью бактериофага // Профилактика и меры борьбы с лептоспиро-зом и листериозом с/х животных: матер, симпозиума. Новочеркасск, 1972.-С. 76-78.

46. Кац-Чернохвостова Л.Я. Проблема фаготипирования брюшнотифозных и паратифозных микробов и ее эпидемиологическое значение // ЖМЭИ. -1947.-№8.-С. 312-315.

47. Килессо В.А. Идентификация сальмонеллезных культур с помощью О-бактериофага // Тез. докл. конф. Таллин, научн.-иссл. ин-та эпидемиол., микробиол. и гигиены. Таллин, 1960. - С. 5 - 6.

48. Киселева Б.С. Род Klebsiella II Энтеробактерии: Руководство / Под ред.

49. B.И. Покровского. -М.: Медицина, 1985. С. 171 - 172.

50. Киселева Б.С. Гедзе Г.И., Солодова Т.Л. Результаты идентификации клебсиелл при различных заболеваниях новорожденных и детей раннего возраста // Жур. микробиол. 1982. - № 7. - С. 52 - 57.

51. Киселева Б.С. Капсульные антигены как основа для разработки диагностических и профилактических препаратов // Бактериальные антигены / Под ред. Семенова. М.: МНИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 1982. - С. 15 - 24; 30 - 39.

52. Киселева Б.С., Дусмухамедов Н.С., Голубева И.В. О выделении бактерий трибы Klebsiella при диарее у полярников // Жур. микробиол. 1978. -№ 12.-С. 49-52.

53. Ковалева Е.П., Рейзис А.Р. Инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами // Профилактика внутрибольничных инфекций / Под ред. Е.П. Ковалевой, Семиной: руководство для врачей. М., 1993.1. C. 56-69.

54. Козловский Ю.Е., Плугина И.В., Серебряков С.Н., Барановская О.П., Тихонова Н.Б. Анализ токсигенности штаммов энтеробактерий, изолированных в зверохозяйствах России // Доклады Российской академии с.-х. наук. 2002. - № 3 - С. 44 - 46.

55. Колпикова Т.И., Бакулов И. А., Котляров В.М. Перспективы практического применения листериозных бактериофагов // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: матер, научн. конф. ВНИИВиМ. Покров, 1992. - Ч. 11. - С. 211 - 212.

56. Колпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Фаготипирование листе-рий // Ветеринария. 1990. - № 6. - С. 31 - 32.

57. Коритняк Б.М. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Yesinia enterocolitica, разработка технологических параметров по их применению: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2005.-20 с.

58. Корнилова Г.В. РНФ при индикации дизентерийных бактерий в воде в сопоставлении с бактериологическим методом // Материалы 16 межоб-ластн. научно-практ. конф. лабор. работников Зап. Сибири. Томск, 1960.-С. 20-21.

59. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия — 2004. -Том 6. -№ 1.-С. 4-10.

60. Красноголовец В.Н., Киселева Б.С. Клебсиеллезные инфекции. М.: Медицина, 1996.-С.256.

61. Кременчук Г.А., Гицевич М.А., Бояршинова К.П. Применение реакции нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды // ЖМЭИ.- 1961.-№7.-С. 124.

62. Крылова М.Д. Применение бактериофагов для типирования бактерий // В кн.: Бактериофагия. М.: Медгиз, 1961. - С. 220 - 257.

63. Крылова М.Д. Фаготипы бактерий. М., 1963. - 97 с.

64. Крылова М.Д. Схема фаготипирования нетоксигенных дифтерийных бактерий типа gravis // ЖМЭИ. 1970. - № 12. - С. 16 - 22.

65. Крылова М.Д. Перспективы и возможности метода фаготипирования бактерий // Материалы юбилейного симпозиума, посвящен. 50-летию Тбилисского НИИВС. Тбилиси. - 1974. - С. 276 - 280.

66. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей.-М., 1991.-250 с.

67. Кузнецова В.Н., Хазанов М.И., Ремова Т.Н. Применение реакции нарастания титра фага для индикации дизентерийных бактерий в условиях внешней среды // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - С. 59.

68. Кукава Г.Г., Джикидзе Э.К., Стасилевич З.К., Крылова Р.И., Кебу Т.И. Биологическая характеристика клебсиелл, выделенных от обезьян в норме и при патологии // Bait. J. Lab. Anim. Sci. 1998. - № 4. - С. 231 - 237.

69. Лакин Г.Ф. Биометрия // Учеб. пособие для биологич. спец. вузов. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш. школа, 1980. - 293 с.

70. Лебедев В.И. Опыт применения РНФ в эпидемиологической практике // ЖМЭИ. 1963. - № 12. - С. 29.

71. Лебедев В.И. РНФ как ранний метод индикации дизентерии в детских учреждениях // Тр. науч. конф. аспирантов и ординаторов. М., 1964. -С. 105-107.

72. Ленев С.В., Дрогалина Н.А., Бугаев С.А. Бактериофаги для лечения и специфической профилактики сальмонеллеза птиц // Матер. Между нар. научн. конф. Ульяновск, 2006. - С. 417 - 420.

73. Ленев С.В. Способ выделения и свойства бактериофагов // Сб. науч. трудов Всеросс. науч. ин-та вет. препаратов. М., 1991. - С. 24.

74. Лешкович Н.Л., Ермилова В.П. О диапазоне и специфичности действия чумных фагов 1701, 1710 и их мутантов // В кн.: Проблемы особо опасных инфекций.-М., 1974.-С. 38-41.

75. Лихачев Н.В. Метод диагностики паратифа свиней при помощи бактериофага // Ветеринария. 1948. - № 7. - С. 32.

76. Лурия С., Дарнелл Д. Общая вирусология. М.: Мир, 1970. - 397 с.

77. Мазурин Н.Д., Розина-Япкина Ц.С. РНФ при диагностике дизентерии // ЖМЭИ. 1963. - № 1.-С. 113-115.

78. Мамонтова JI.M., Савилов Е.Д., Рахманин Ю.А. Условно-патогенные микроорганизмы и их распространение в водных экосистемах Сибири // Гигиена и санитария. 2005. - № 3 - С. 13-17.

79. Матвеева С.М. РНФ в диагностике брюшного тифа // Кишечные инфекции: тез. докл. межинстит. конф.-М., 1961.-С. 146-147.

80. Маслова Э.И. Ферменты патогенности бактерий рода клебсиелла-энтеробактер // Кишечные инфекции в Казахстане. Алма-Ата, 1980. -Т. 21.-С. 36-40.

81. Машков А.В. Видовая принадлежность L-форм, выделенных из крови при гломерулонефрите и хроническом пиелонефрите // Журн. микро-биол. 1978. -№ 1.-С. 35-36.

82. Мац Л.И. Вопросы санитарной бактериологии и вирусологии // М.: Медицина, 1965. 113 с.

83. Миляева Е.Н. Определение зараженности предметов бытовой обстановки дизентерийными микробами с помощью реакции нарастания титра бактериофага // ЖМЭИ. 1958. - № 12. - 34 с.

84. Молофеева Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Е. coli 0157 и их применение в диагностике: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2004. - 20 с.

85. Никитюк Н.М. Фаготипирование Styfimurium, выделенных на различных территориях СССР // ЖМЭИ. 1970. - № 1. - 53 с.

86. Нурызгалиев С.Н. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных гнойными инфекциями // Материалы 10 науч. сем. Алма-Атин. гос. мед. ин-та. Алма-Ата, 1978. - С. 55 - 57.

87. Островская Н.Н., Гольдфарб Д.М. К использованию метода нарастания титра фага'для выявления бруцелл во внешней среде // ЖМЭИ. 1961. -№5.-С. 145.

88. Островская З.С., Папкова Б.Н. Ускоренный метод диагностики брюшного тифа Vi-фагом//ЖМЭИ. 1951.-№2.-С. 37-40.

89. Павлова И.П. Изучение морфологии и биологических свойств фагов Вас. anthracis и Вас. cereus II ЖМЭИ. 1971. - № 7. - С. 147.

90. Петровская В.Г. Факторы патогенности энтеробактерий и их генетический контроль // Актуальные вопросы гигиены и краевой инфекционной патологии. Душанбе, 1981. - С. 194 - 200.

91. Петровская В.Г. Генетические основы вирулентности патогенных и условно-патогенных бактерий // Журн. микробиол. 1984. - № 7. -С. 77-85.

92. Петрушина Л.И. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных маститом коров ЖМЭИ. 1967. - № 5. - 128 с.

93. Поддубный Ф.Н. Изучение специфичности и чувствительности РНТФ при индикации дизентерийных бактерий в воде // ЖМЭИ. 1962. № 1. -С. 29-31.

94. Пожарникова Е. Н. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Enterobacter и конструирование на их основе биопрепарата Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2006. - 21 с.

95. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. М.: Медицина, 1999. - С. 389 - 393.

96. Покровский В.И. Проблемы внутрибольничных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1996. - № 2. - С. 4.

97. Покровский В.И., Дунаевский О.А. Современные принципы и методы диагностики инфекционных болезней // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001.-№ 4. - С. 5 - 7.

98. Покровский В.И. Энтеробактерии.-М.: Медицина, 1985.-С. 171 192.

99. Поликарпов Н.А., Шилов В.М., Красноголовец В.Н. и др. Биологические свойства патогенных энтеробактерий, выделенных из крови больных // Журн. микробиол. 1985. - № 10. - С. 15 - 19.

100. Пономарев А.П., Андреева О.Г., Артамонова Т.Н. Электронно-микроскопическое выявление вирусов животных в неконцентрированных вирусосодержащих суспензиях // Вестник РАСХН. 2002. - № 2. -С. 74 - 77.

101. Пономарев А.П., Мищенко В.А. Электронная микроскопия вирусов животных и некоторых условно-патогенных микроорганизмов //В.: Фолиант.-2005. 160 с.

102. Понявин Б.Я. Изучение реакции нарастания титра фага в условиях практической лаборатории // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - 135 с.

103. Попхадзе М.З. Использование бруцеллезного фага для диагностики бру-целл // ЖМЭИ. 1968. - № 2. - С. 119 - 124.

104. Пульчеровская Л.П. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике: Ав-тореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2004. - 21 с.

105. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. Киев: Урожай, 1978. - С. 88.

106. Ревенко И.П. К диагностике рожи свиней // Ветеринария. 1970. - № 6. -34 с.

107. Рубашкина Б.К., Казакова С.Ф. Применение метода нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды // ЖМЭИ. 1959. - № 6. -С. 110-112.

108. Русалеев B.C. Фагочувствительность аэробных спорообразующих бактерий // Ветеринария. 1990. - № 8. - С. 29.

109. Сельников О.П., Фролов А.Ф., Авдеева Л.В., Лукач И.Г. // Госпит. ин-фек. и лекарств, устойчивые микроорганизмы / ЦНИИ эпидемиол. М., 1992.-С. 46-47.

110. Сельников О.П., Персидский Ю.В., Барштейн Ю.А. Микробиологическая и патоморфологическая характеристика клебсиеллезной инфекции // Журн. микробиол. 1992. - Т. 54. - № 2. - С. 75 - 80.

111. Сергиенко Ф.Е. Новый метод бактерюлопчно1 д1агностики за допомо-гою бактерюфага // Мкробюл. журнал А.Н. УССР. 1936. - № 1. -С. 85-112.

112. Сиволодский Е.П., РовновН.В., Петров JI.H. Механизм специфической хромогенной реакции Klebsiella spp. на питательной среде с 5-аминосалициловой кислотой // Жур. микробиол. 1994 - № 3 -С. 489-494.

113. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б. // Определитель зоопато-генных микроорганизмов. Справочник. М.: Колос - 1995. - 320.

114. Стронговская Н.В. Сравнительное изучение РНФ для выявления носи-тельства дизентерийных бактерий: Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Симферополь, 1964. 17 с.

115. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Реакция нарастания титра фага (РНФ). -М., 1962.-32 с.

116. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага // ЖМЭИ. 1956. - № 10. - С. 3 - 7.

117. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.: Наука, 1968-170 с.

118. Трухина Г.М. Оценка методов выделения и циркуляции клебсиелл в объектах окружающей среды // Методы индикации биоценоза патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды. М., 1985. - С. 63 - 69.

119. Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов. Основы генетики и молекулярной биологии. М.: Мир, 1965. - С. 275 - 368.

120. Хоменко И.М., Конюхова Н.А. Энтеротоксигенная и адгезивная активность клебсиелл // Молекулятная структура бактериальных токсинов и генитический контроль их биосинтеза: Тез. Всесоюз. конф. М., 1985. -С. 128- 129.

121. Хоменко Н.А., Киселева Б.С. Изучение ацетатной среды как теста для дифференциации энтеробактерий // Жур. микробиол. 1973. - № 12. -С. 101-105.

122. Цветков К.И. Применение специфического бактериофага для диагностики паратифозного аборта кобыл // Ветеринария. 1941. - № 6. -С. 4-6.

123. Чиракадзе Л.Г. Чинашвили Т.Г. Типирование S. typhimurium при помощи селекционированных фагов // ЖМЭИ. 1974. - № 3. - С. 72 - 78.

124. Шантаренко И.В. Изучение РНФ как метода индикации бактерий дизентерии во внешней среде // Тез. докл. и выступл. на 5 Всес. научн. конф. по санитарн. микробиол. М. - 1962. - С. 89 - 93.

125. Шахов А.Г. Этиология и профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней телят и поросят // Ветеринарный консультант. 2003. -№ 1.-С.4-5.

126. Шипицын А.Г., Басова Н.Ю. Роль микробного фактора в возникновении респираторных болезней телят // Ветеринарный консультант. 2003. -№ 4. - С. 6.

127. Щеглова М.К. Некоторые свойства листериозного бактериофага // ЖМЭИ. 1962. -№ 1. - С. 99 - 102.

128. Ackermann H.-W., DuBow M.S., Gershman M. Taxonomic changes in tailed of enterobacteria // Archies of virology. 1997. - № 142. - P. 1381 - 1390.

129. Atreyee M., Nirmolendu R. Pevisent structure of the capsular polysaccharide of Klebsiella serotype 15 // Syst. and Appl. Microbiol. 1992. -V. 15, № 4. -P. 505-512.

130. Bagley S.T., Seidler R.J., Talbot H.W.J., Morrow J.E. Isolation of Klebsiellae from within living wood // Appl. Environ. Microbiol. 1978. - V. 36. - P. 178- 185.

131. Batshon B.A., Baer H., Shaffer M.F. Immunologic paralysis produced in mice by Klebsiella pneumoniae type 2 polysaccharide // J. Immunol. 1963. - V. 90.-P. 121-126.

132. Brown C., Seidler R.J. Potential pathogens in the environment: Klebsiella pneumoniae, a taxonomic and ecological enigma // Appl. Microbiol. 1973. -V. 25.-P. 900-904.

133. Donaldson Scott G., Azizi S.Q., R. dal Nogare Anthony Characteristics of aerobic gram-negative bacteria colonizing critically ill patients // Amer. Rev. Respir. Diseases.-1991.-V. 144, № l.-P. 202-207.

134. Duguid J.P. Old D.C. Adhesive properties of Enterobacteriaceae // Bacterial Adherence / ed. E.H. Beachey. London: Chapman and Hall, 1980. -P. 187-215.

135. Edberg S.C., Piscitelli V., Cartter M. Phenotypic characteristics of coliform and noncoliform bacteria from a public water supply compared with regionaland national clinical species // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 52. -P. 474-478.

136. Edwards P.R., Ewing W.N. Identification of Enterobacteriaceae II Burgess publ. Co., Minneeaprolis, 1972.

137. Ewing W.H., Edwards P.R., Ewings Identification of Enterobacteriaceae. 4 th ed. - New York; Amsterdam; Oxford; Elsevier. - 1986. - V. 536.

138. Gaston M.A., Ayling-Smith B.A., Pitt T.L. New bacteriophage tiping scheme for subdivision of the frequent capsular serotypes of Klebsiella spp. II J. clin. Microbiol.- 1987.-V. 117, №2.-P. 1228- 1232.

139. Gragia J., Yan G. Demonstration of types of tyfosus by means of preparation of type // Canad. publ. hith. J. 1938. - V. 29, № 9. - P. 448.

140. Graigie J., Felix A. Typing of typhoid bacilli with Vi bacteriophage, suggestions for its standardization // Lancet. 1947. - № 14. - P. 823.

141. Ivanof A., Serban D., Joneseu 0. Enterotoxigenic bacteria in infantile diarrheal disease // Arch. roum. Path. exp. Microbiol. 1983. - V. 42, № 2 - 3. -P. 147- 153.

142. Jhanjee A., Asnani PJ. Klebsiella pneumoniae enterotoxin // Acta Microbiol. Hung.-1982.-V. 29,№ l.-P. 1-7.

143. Jolivet-Gougeon A., Tamanai-Shacoori Z., Sauvager F., Cormier M. Production of Escherichia cob group I-like enterotoxin by Enterobacteriaceae isolated from environmental water // Microbios. 1997. - 90. - Mb 364. - 365. -P. 209-218.

144. Junzaburo M., Seiki S., Tokashi Y. и др. Биологическая активность и химический состав цитотоксина К. oxytoca II J. Gen. Microbiol. 1992. -№9.

145. Kahlich R., Palecek A., Korych B. Nalez enterobakterove toxikose v Ram-cidiagnostiky strevnich epidemii // Voj. Zdrav. Listy. 1982. - V. 51. -P. 260-263.

146. Katznelson H., Sutton M. Rapid phage plague count method for the detection of bacteria as applied to the demonstration of intern along borne bacterial infection of seed // J. Bact. 1951. - V. 61, № 1. - P. 689.

147. Kauffmann F. On the classificacion and nomenclature of family Enterobacte-riaceae // Intern. Bull. bact. Nomencl. a. Tacsonom., 1963. V. 13. -P. 187- 193.

148. Kauffmann F. On the serology of the Klebsiella group // Acta Pathol. Scand. -1949.-V. 26.-P. 381 -406.

149. Kaur K., Kaul M., Chhiber S. Enterotoxigemicity, klebocinogeny and antibiotic resistance pattern of food isolated of Klebsiella pneumoniae II Folia Microbiol. 1988. - V. 3, № 6. - P. 500 - 506.

150. Ketti I. A study of Escherichia coli from farm animals during // Acta. Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1981. - V. 28. - P. 393 - 398.

151. Lindberg R.B., Latta R.L. Phage tuping of Ps. aeruginosa chinical and epide-miologi considerations // J. Infect. Diseases. 1974. - V. 130, № 5. -P. 32-34.

152. Lee C.J., Jung D.S., Jung S.H., Baik J.H., Lee J.H., Cho Y.R., Go B.S., Lee S.W., Han S.Y., Lee D.H. Comparison of Liver Abscess between Diabetic Patients and Non-Diabetic Patients // J Hepatol. Korean. 2005. - V. 11, № 4. -P. 339-449.

153. Levintal C., Fisher A. Structural developmet of a bacteriae virus // Biochim. Biophys. Acta. 1952. - V. 9, № 4. - P. 419.

154. Martin W.J., Washington J.A. Enterobacteriaceae II Manual of clinical microbiology. 3rg ed. / Eds. E.H. Lennette et al. - Washington D.S.: ASM, 1980.-P. 195-209.

155. Matsen J.M., Spindler J.A., Blosser R.O. Characterization of Klebsiella isolates from natural receiving waters and comparison with human isolates // Appl. Microbiol. 1974. - V. 28. - P. 672 - 678.

156. Mukherjee Atreyee, Roy Nirmolendu Pevisend serotipe 15 // Syst. and Appl. Vicrobiol. 1992 - V. 15, № 4 - P. 505 - 512.173. 0rscov I., and 0rscov F. Serotyping of Klebsiella II Methods Microbiol. -1984.-V. 14.-P. 143- 164.

157. Pieroni P., Rennie R.P., Ziola В., Deneer H.G. The use of bacteriophages to differentiate serologically cross-reactive isolates of Klebsiella pneumoniae II J. Med. Microbiol. 1994. - V. 41, № 6. - P. 423 - 429.

158. Podschun R., Heineken P., Sonntag H.G. Haemogglutinins and adherence properties to HeLa and intenstine 407 cells of К pneumoniae and К oxytoca isolates // Zbl. Bakt. Hyg., 1 Abt. Orig. 1987. - Bd 255, № 4. -P. 585 -593.

159. Podschun R., Penner I., Ullmann U. Interaction of Klebsiella capsule type 7 with human polymorphonuclear leucocytes // Microb. Pathog. 1992. - V. 13.-P. 371 -379.

160. Podschun R., Ullmann U. Klebsiella spp. as Nosocomial Pathogens: Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity Factors // Clinical Microbiol, reviews.- 1998.-V. 11, №4.-P. 589-603.

161. Przondo-Hessek A. Bacteriophages of Klebsiella bacilli. Isolation properties and use in typing. Arch. Immunol. Ther. Exp. 1966. - V. 14. - P. 413 - 435.

162. Riser E., Noone P., Howard F.M. Epidemiological studi of Klebsiella infection in the special care baby rinit of London Hospital // J. clin. Path. 1980. -V. 33, №4.-P. 400-407.

163. Schindler P.R.G., Metz H. Coliform bacteria in drinking water from South Bavaria: identification by the API 20 E system and resistance patterns // Len-tralbl. Hug. Und Umweftmed. 1990. - V. 190, № 5 - 6. - P. 436.

164. Seidler R.J., Knittel M.D., Brown C. Potential pathogens in the environment: cultural reactions and nucleic acid studies on Klebsiella pneumoniae from clinical and environmental sources // Appl. Microbiol. 1975. - V. 29. -P. 819-825.

165. Simoons-Smit A.M., Verweij-van Vught A.M.JJ, Kanis I.Y.R., MacLaren D.M. Chemiluminescence of human leucocytes stimulated by clinical isolates of Klebsiella II J. Med. Microbiol. 1985. - V. 19. - P. 333 - 338.

166. Simoons-Smit A.M., Verweij-van Vught A.M.J.J., MacLaren D.M. The role of К antigens as virulence factors in Klebsiella II J. Med. Microbiol. 1986. -V.21.-P. 133 - 137.

167. Slopek S. Phage typing of Klebsiella 11 Methods Microbiol. 1978. - V. 11. -P. 193 -222.

168. Slopek S., Przondo-Hessek A., Milch H., Deak S. A working scheme for bacteriophage typing of Klebsiella bacilli. // Arch. Immunol. Ther. Exp. 1967. -V. 15, №4.-P. 589-599.

169. Slopek S. Phage typing of Klebsiella II Methods Microbiol. 1978. - V. 11. -P. 193-222.

170. Ullmann U. Pattern of microbial isolates in hospitalized patients // Zentbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. 1986. - P. 103 - 113.

171. Vernet V., Philippon A., Madoulet C., Vistelle R., Jaussand R., Chippaux C. // FEMS Vicrobiol. Lett 1995 -V. 130, № 1. - P. 51 - 57.

172. Weiss R. Klebsiella // Handbuch der bakteriellen Infectionen bei Tieren / Hrsg. Von H. Blobel, T. Schlisser.- Jena 1981. - P. 453 - 479.

173. Williams P., Lambert P.A., Brown M.R.W., Jones R.J. The role of the О and К antigens in determining the resistance of Klebsiella aerogenes to serum killing and phagocytosis // J. Gen. Microbiol. 1983. - V. 129. - P. 2181 - 2191.

174. Wong S.H., Cullimore D.R., Bruce D.L. Selective medium for the isolation and enumeration of Klebsiella spp. II Appl. Environm. Microbiol. 1985. - V. 49, №4.-P. 1022- 1024.

175. Yokochi Т., Nakashima I., Kato N. Effect of capsular polysaccharide of Klebsiella pneumoniae on the differentiation and functional capacity of macrophages cultured in vitro II Microbiol. Immunol. 1977. - V. 21. -P. 601-610.

176. Yokochi Т., Nakashima I., Kato N. Further studies on generation of macrophages in in vitro cultures of mouse spleen cells and its inhibition by the capsular polysaccharide of Klebsiella pneumoniae II Microbiol. Immunol. 1979. -V. 23.-P. 487-499.

Информация о работе

Бульканова, Елена Анатольевна
кандидата биологических наук
Ульяновск, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы