Микробиологические и технологические аспекты разработки комплексного препарата бактериофагов

Функер, Елена Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микробиологические и технологические аспекты разработки комплексного препарата бактериофагов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологические и технологические аспекты разработки комплексного препарата бактериофагов"

На правах рукописи

ФУНКНЕР Елена Внкторовна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗРАБОТКИ КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА БАКТЕРИОФАГОВ

03 00 07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь-2007

003071641

Работа выполнена на базе отделения бактериофагов и лаборатории бактериофагов филиала Федерального государственного унитарного предприятия «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития РФ «Пермское НПО «Биомед», Пермь

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Казьянин Александр Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кузяев Рафаэль Зиафутдинович кандидат медицинских наук Дарбеева Ольга Сергеевна

Ведущая организация: ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора, Санкт-Петербург

Защита состоится ^-/2007 г вчасов на заседании диссертационного

совета Д 004 019 01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу 614081, г Пермь, ул Голева, д 13 Факс (342)2446711

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http //www iegm ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан «

2007 г

Ученый секретарь диссертацисАното совета, /7 член-корреспондент РАН——

Ившина Ирина Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Инфекции, вызванные условно патогенными микроорганизмами, в том числе Escherichia coh, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp , Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Streptococcus spp в настоящее время представляют существенную проблему, как с клинических, так и с эпидемиологических позиций Традиционными препаратами этиотропной терапии гнойно-воспалительных заболеваний являются антибиотики Однако применение антибиотиков сопряжено не только с гибелью патогенных агентов, поддерживающих инфекционный процесс, но и с подавлением нормальной микрофлоры человека, ее адгезивных свойств (Трапезов и др, 1990, Кушнарева, 2000) Вопрос об успешной профилактике и терапии гнойно-септических инфекций приобретает чрезвычайную актуальность в условиях формирования полирезистентности микроорганизмов к антибиотикам (Навашин, 1997, Савицкая и др, 2001, Green, 2001, Ducki et al, 2002, Clarke, 2003) В связи с этим интенсифицируются исследования по совершенствованию и разработке альтернативных методов лечения, в частности фаготерапии Основными достоинствами препаратов бактериофагов являются высокая чувствительность патогенной микрофлоры к бактериофагам, сочетаемость со всеми видами традиционной антибактериальной терапии, отсутствие противопоказаний к фагопрофилактике и фаготерапии (Иванов, 2000, Лазарева, 2003, Sulakvelidze et al, 2001)

В сфере фагового производства актуальны задачи, связанные с конструированием новых препаратов и усовершенствованием технологического процесса, включая отбор и использование высокочувствительных штаммов-продуцентов, разработку питательных сред для культивирования бактериофагов, изготовление более широкой номенклатуры лекарственных форм В условиях полиэтиологичности многих заболеваний, вызванных условно патогенными микроорганизмами, наиболее целесообразно создание поливалентных комбинированных бактериофагов (Бухарин, 1999, Рафиев, Сатаров, 2001, Хайруллин, 2003) Распространенными формами выпуска препаратов бактериофагов являются жидкие лекарственные формы и таблетированные фаги кишечной группы В последние годы на фоне значительного увеличения объемов выпуска препаратов ведутся работы по созданию новых лекарственных форм (Георгадзе и др , 1997, Ананьев и др , 1999, Маркоишвили и др , 1999, Чубатова и др, 2000, Thacker, 2003, Sulakvelidse et al, 2004) Среди различных способов введения лекарств широкое распространение в медицинской практике получает ректальный способ, преимуществами которого являются попадание лекарственного вещества непосредственно в общий кровоток, увеличение скорости всасывания,

уменьшение частоты аллергезирующего действия, простота, безболезненность введения, а также удобство использования в детской практике (Козлова и др, 1992) Целесообразность выпуска лекарственных форм бактериофагов для ректального введения, в том числе суппозиториев, диктуется также необходимостью сохранения литической активности фагов, так как при пероральном приеме они в значительной степени инактивируются соляной кислотой желудочного сока

Цель настоящей работы - создание композиции, изучение биологических свойств и разработка лекарственных форм комплексного фагового препарата на основе отобранных из клинического материала условно патогенных микроорганизмов-продуцентов бактериофагов Основные задачи исследования

1 Детально исследовать морфо-физиологические свойства выделенных из клинического материала штаммов-продуцентов бактериофагов (£ coli. Kl pneumoniae, Pr vulgaris, Pr mirabilis, Ps aeruginosa. St aureus, Streptococcus spp ) и создать коллекцию из перспективных в производственном отношении микроорганизмов

2 Оптимизировать и унифицировать условия производственного процесса репродукции бактериофагов

3 Разработать способ получения комплексного фагового препарата и охарактеризовать его биологические свойства

4 Получить лекарственную форму комплексного фагового препарата для ректального введения (суппозитории), исследовать ее фармакодинамику и эффективность применения в клинической практике

Научная новизна. Проведено изучение морфологических, культуральных, биохимических свойств большой группы условно патогенных микроорганизмов, выделенных из клинического материала лечебных учреждений Пермского края Произведен отбор штаммов - потенциальных продуцентов бактериофагов Оптимизирован и унифицирован процесс репродукции бактериофагов на основе использования универсальной питательной среды (Патент RU 2247151 «Способ получения полибактериофага», приоритет от 06 05 2002) На основе высоковирулентных фагов (стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного, коли) сконструирован поливалентный комплексный 6-компонентный препарат Секстафаг с широким спектром и высоким уровнем антибактериальной активности Изучена фармакодинамика различных лекарственных форм Секстафага при пероральном и ректальном путях введения препарата

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о методических подходах к конструированию и изготовлению фаговых препаратов, включая постоянное обновление коллекции штаммов-продуцентов с изучением их свойств, репродукцию бактериофагов на универсальной питательной среде и особенности создания на их основе лекарственных форм

Практическая значимость работы определяется разработанными эффективными микробиологическими и технологическими приемами, позволяющими адаптировать процессы изготовления бактериофагов к условиям массового производства препаратов, а также созданием нового комплексного фагового препарата, расширяющего арсенал антибактериальных лекарственных средств Сформирована коллекция производственных микроорганизмов-продуцентов для изготовления моно - и комплексных препаратов бактериофагов Разработана универсальная казеиново-кислотная среда, позволяющая получать препараты бактериофагов со сниженным содержанием балластных веществ Предложен способ получения комплексного препарата, включающий раздельное культивирование отдельных компонентов с последующим объединением высокоактивных монофагов с заданными свойствами Получены лекарственные формы Секстафага жидкий препарат во флаконах и суппозитории ректальные на основе жидкого концентрата Созданная технология используется в производстве препарата Секстафаг жидкий (получено более 270 промышленных серий)

Результаты научной работы отражены в нормативной документации (регламент производства № 1105-01, фармакопейная статья предприятия 42-002823-22-02 на бактериофаг стрептококковый жидкий, регламент производства № 1103-01, ФСП 42-002827-05-02 на Секстафаг® (пиобактериофаг поливалентный) жидкий, экспериментально-производственный регламент, проект ФСП и проект инструкции по применению на Секстафаг® суппозитории ректальные (пиобактериофаг поливалентный)

Положения, выносимые на защиту

1 Использование коллекции региональных штаммов-продуцентов бактериофагов (Е coli, Kl pneumoniae, Pr vulgaris, Pr mirabilis, Ps aeruginosa, St aureus, Streptococcus spp ) и универсальной казеиново-кислотной питательной среды обеспечивает получение фаговых препаратов, обладающих высокой специфической активностью и низким содержанием балластных веществ

2 Предложенный способ раздельного культивирования монофагов (стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного, коли) с последующим объединением в единую лекарственную форму

с активностью не ниже 105 каждого компонента обеспечивает получение комплексного высоковирулентного препарата, обладающего выраженным этиотропным действием по отношению к условно патогенным микроорганизмам

3 Лекарственная форма препарата Секстафаг для ректального применения (суппозитории), полученная по разработанной технологии, оказывает терапевтический эффект в лечебной практике и обладает более длительной динамикой выведения, чем жидкий препарат

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Научно - практической конференции «Вакцинопрофилактика в XXI веке», Пермь, 2000, Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2001, Международной научной конференции «Перспективы развития естественных наук в высшей школе», Пермь, 2001, Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003, Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2004, Всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке разработка, производство и применение», Уфа, 2005, Научно-практической конференции «Современная вакцинопрофилактика проблемы и перспективы развития», Пермь, 2005, Научной конференции «Актуальные вопросы клинической медицины», Пермь, 2005, Научно-практической конференции «Трудные и нестандартные ситуации в хирургии Новые технологии в медицине», Ижевск, 2006, Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование», Пермь, 2006, Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий», Томск, 2006, Международной Российско-китайской научной конференции по фармакологии «Fundamental pharmacology and pharmacy-clinical practice», Пермь, 2006, Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ Полученные результаты защищены патентом на изобретение РФ

Связь работы с научными программами Диссертационная работа выполнена на базе отделения бактериофагов и лаборатории бактериофагов в

соответствии с планом НИР филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер госрегистрации 01 9 90 002643)

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 150 страницах, содержит 24 таблицы и 25 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 271 источник, из них 173 отечественных и 98 иностранных авторов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Формирование коллекции производственных и контрольных штаммов Е coli, Kl pneumoniae, Pr vulgaris, Pr mirabilis, Ps aeruginosa, St aureus. Streptococcus spp проводили на основе бактериологического анализа клинического материала, изученного в баклабораториях лечебных учреждений г Перми и Пермского края Дифференциальную диагностику выделенных штаммов микроорганизмов осуществляли по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам, результатам серотипирования (сыворотки диагностические эшерихиозные ОК поливалентные сухие для РА производства АО «Биомед» им И И Мечникова) и фаготипирования (международный набор, включающий 23 типа бактериофагов производства Англии) (Приказ № 535, Москва, 1985) Для хранения коллекционных штаммов использовали полужидкие и твердые среды (производства «Пермского НПО «Биомед») 0,5% агар Мартена (для Ps aeruginosa), 0,5% агар Мартена с 0,4% глюкозы (для Е coli), 1,5% агар Мартена с 0,4% глюкозы (для Kl pneumoniae, Pr vulgaus, Pr mirabilis, Staphylococcus spp, Stieptococcus spp) В исследованиях использовали селекционированные нами бактериофаги стафилококковый, стрептококковый, протейный, клебсиеллезный, синегнойный, коли, вошедшие в комбинированный препарат Секстафаг (пиобактериофаг), экспериментальные серии препарата Секстафаг суппозитории ректальные

Культивирование бактериофагов проводили в реакторах с применением казеиново-кислотной среды, мясо-пептонного бульона и бульона Мартена Концентрирование комплексного препарата осуществляли методом ультрафильтрации с помощью разделительных аппаратов на полых волокнах марки ВПУ-15 Для формования суппозиториев использовали гидрофобные (витепсолы, Себао) и поверхностно-активные вещества (МГД, Т-2) Свойства свечей изучали с использованием методов, изложенных в ФСП 42-002822-04-01 на клебсифаг суппозитории ректальные и в Государственной Фармакопее (ГФ XI, вып 2)

Чувствительность микроорганизмов к бактериофагам определяли путем диффузии фага в питательный агар и по методу Аппельмана (Адаме, 1961) Диапазон и степень литической активности бактериофагов определяли методом Аппельмана на питательном бульоне для культивирования микроорганизмов (ФС 42-0049-00) (Адаме, 1961), концентрацию фаговых частиц - методом А Gratia (Gratia, 1936) на двухслойном агаре (производства «Пермского НПО «Биомед») Контроль специфической активности препаратов бактериофагов проводили с помощью специально подобранных наборов контрольных штаммов Неспецифические свойства препаратов бактериофагов (pH, стерильность, токсичность) изучали регламентированными методами (ФСП 42-002823-23-02 на стафилококковый бактериофаг, ФСП 42-002823-22-02 на стрептококковый бактериофаг, ФСП 42-002824-08-02 на протейный бактериофаг, ФСП 42-002824-07-02 на коли бактериофаг, ФСП 42-002831-24-02 на клебсифаг жидкий, бактериофаг клебсиелл пневмонии, ФСП 42-002827-06-02 на бактериофаг псевдомонас аеругиноза (синегнойный), ГФ XI, вып 2) Антибиотикочувствительность микроорганизмов определяли диско-диффузионным методом на плотной питательной среде с использованием стандартного набора (пенициллин, ампициллин, оксацштлин, цефазолин, ванкомицин, ципрофлоксацин, эритромицин, фурадонин, гентамицин, амикацин, доксициклин, карбенициллин, цефотаксим, цефтазидим, налидиксовая кислота, офлоксацин, имипенем) производства НИЦФ, г Санкт-Петербург (Биргер, 1982, Сидоренко, 1999) Концентрацию микробных клеток определяли с помощью оптического стандарта мутности (ОСО 42-28-85 на 10 ед производства ГИСК им J1 А Тарасевича), а также турбидиметрическим методом в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 мм при длине волны 540 нм на фотоэлектроколориметре КФК-2 Физико-химические свойства препаратов, питательных сред (аминный азот, белковый и общий азоты, pH) изучали согласно методов, изложенных в ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические, иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов» Ацидорезистентность определяли путем инкубирования препарата Секстафаг в цитратно-фосфатном буфере (pH 2,8) при температуре (36 ± 1) °С в течение 1 ч с последующим определением специфической активности по Аппельману Стабильность компонентов Секстафага к термическому воздействию изучали при экспозиции препарата на водяной бане при температурах 45, 50, 55, 60, 65 °С в течение 30-60 мин

Динамику выведения бактериофагов изучали на здоровых людях и больных панкреонекрозом Клинический материал (мочу) обрабатывали хлороформом, а

при исследовании мочи здоровых людей использовали метод обогащения (Габрилович, 1968) Обработанные пробы наносили на газон тест - культуры микроорганизма и положительные пробы титровали по методу Аппельмана в разведениях Ю'-Ю3 Клиническую эффективность суппозиториев с Секстафагом оценивали в комплексном лечении 11 больных острым необструктивным пиелонефритом (основная группа) в сравнении с традиционной терапией 11 больных (группа сравнения) Изучали динамику изменения и нормализацию клинических и лабораторных показателей (температура тела, боли в поясничной области, бактериурия, лейкоцитурия, уровень лейкоцитов крови)

Анализ фракционного состава препаратов проводили методом жидкостной хроматографии низкого давления с использованием прибора «LKB» (Швеция) УФ-детекцию осуществляли в проточной кювете при длине волны 280 нм Электронная микроскопия компонентов препарата Секстафаг проводилась на базе Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (г Оболенск) под руководством к б н Жиленкова ЕЛ с использованием углеродных пленок-подложек, обработанных тлеющим разрядом в вакууме Перед нанесением на пленку фаговые образцы фиксировали 1% глютаровым альдегидом, приготовленным на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,0) Нанесенные на подложки препараты контрастировали 1 % водным раствором уранилацетата (Brenner, Hörne, 1959) Визуализацию образцов и их фотографирование проводили на электронном микроскопе «Hitachi Н-300» (Япония)

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методами вариационной статистики (Гланц, 1999) Статистическую значимость различий между группами оценивали с использованием i-критерия Стъюдента Различия считали статистически значимыми при р<0,05 Результаты в таблицах представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±ш)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Микробиологические аспекты разработки препаратов бактериофагов

За период с 1996 г по 2000 г при формировании коллекции продуцентов бактериофагов было проанализировано 7616 штаммов микроорганизмов, выделенных в баклабораториях г Перми и Пермского края, а также полученных из ГИСК им Л А Тарасевича (рис 1)

Escherichia coli 481 штамм

Streptococci!.

spp. 1516 штя.ччов

Klebsiella spp. ] 695 штяммоа

Staphylococcus

aureus 1610 UITHMMDB

Proteus spp. 1346 штиммов

Pseudom onas

aeruginosa 468 ш'Гйммон

Рис. 1. Видовой состав выделенных микроорганизмов.

Максимальное пополнение коллекции было проведено в течение 1999-2000 гг. при исследовании свойств выделенных микроорганизмов St. aureus (245 штаммов), Streptococcus spp. (374 штамма), Entewcoccus spp. (335 штаммов), Ps. aeruginosa (245 штаммов), E. coli (226 штаммов), Pr. vulgaris, Pr. mirabilis (573 штамма). Kl. pneumoniae (563 штамма). Бактериальные штаммы представленной таксономической принадлежности и обладающие типичными для каждого вида свойствами, оценивали по чувствительности к монобактернофагам (стафилококковому, стрептококковому, синегнойному, клебсиеллезном у, протейному, коли) (рис. 2),

I lili Iff i I 11 i I I i £

= I i I a 4 ¿ г

|днмснованне м и kptinpi зн и чмо в

¡o* a IÍ □ ш" а ю6

Разведение бактериофагом

□ >¡0°

Рис. 2. Распределение микроорганизмов но чувствительности к монобнктериофягам,

В дальнейшем микроорганизмы, чувствительные к бактериофагам в разведении не ниже 10 , пассировали с маточными бактериофагами под контролем

специфической активности. В коллекцию отбирали штаммы, лизируемые маточными бактериофагами в титре 10"ь и выше

При формировании коллекционного пула 5г. аигеш проводили фаготипирование штаммов с применением типового международного набора стафилококковых фагов. При изучении фагочу вствительноети 937 штаммов отмечено постоянное изменение чувствительности стафилококков к типовым и лечебным фагам. Выявлена высокая чувствительность к стафилококковому бактериофагу микроорганизмов, выделенных при гнойных инфекциях у взрослых (80 - 98%) и у детей (95 - 98%) (рис. 3). Вызывающие энтеральные заболевания штаммы 5/. аигеш .нитровались фагами значительно слабее И существенно отличгшись по фагоч у нствитсл ьностн в зависимости от места выделения штамма. 11ринимая во внимание данное обстоятельство, в коллекцию были отобраны штаммы стафилококков с разными фаготипами с учетом чувствительности к лечебному стафилококковому бактериофагу.

Рис, 3. Чувствительность Staphylococcus aureus к лечебному н типовым стафилококковым фагам.

Таким образом, проведенные исследования позволили сформировать коллекцию, которая в настоящее время включает около 600 производственных штаммов условно патогенных микроорганизмов. 11ополнекие и постоянное

обновление коллекции обеспечивают эффективность и адекватность получаемых препаратов бактериофагов современной этиологической структуре циркулирующих возбудителей

Получение комплексного фагового препарата

Процесс культивирования бактериофагов предполагает создание с помощью питательных сред благоприятных условий для размножения фаговых частиц Наиболее распространенными питательными средами в производстве бактериофагов являются дорогостоящие и недостаточно стандартные мясные среды Нами были проведены исследования по изучению возможности использования в качестве альтернативы более экономичных казеиновых сред Отличительными особенностями разработанного варианта казеиновой среды является то, что в качестве питательной основы использован кислотный гидролизат казеина со степенью расщепления 0,6-0,7, а также добавлен мультивитаминный комплекс Кроме того, оптимизирован способ получения гидролизата, включающий одновременное изоосаждение нерасщепленного казеина и обработку гидролизата углем

При сравнительном изучении характера роста микроорганизмов на мясной среде (бульон Мартена) и казеиново-кислотной среде выявлено, что разработанная среда обладает хорошими ростовыми свойствами и подходит для культивирования ряда условно патогенных бактерий (Е coli, Kl pneumoniae, Pr vulgaris, Pr mirabilis, Ps aeruginosa, Staphylococcus spp, Streptococcus spp )

Проведенные исследования явились предпосылкой для создания технологии получения комплексного препарата, включающей раздельное культивирование бактериофагов В стационарных условиях в реакторах в казеиново-кислотную среду одновременно засевали суточную микробную культуру из расчета (75±25) млн клеток на 1 мл среды и маточный бактериофаг в количестве 0,2% от объема засеваемой среды Культивирование вели при температуре (36±1)°С в течение (18±2) часов до полного лизиса культуры Полученный фаголизат подвергали сначала осветляющей, а затем стерилизующей фильтрации После этого стерильные фаголизаты (стафилококковый, стрептококковый, протейный, клебсиеллезный, синегнойный и коли) с титром по Аппельману не ниже 10~5 объединяли в равных объемах в 6-компонентный препарат Секстафаг Такая технология обеспечивает получение комплексного высоковирулентного препарата, обладающего значительной антибактериальной активностью по отношению к условно патогенным микроорганизмам

К достоинствам препарата следует отнести то, что полученный на казеиново-кислотной среде, он содержит балластных веществ в 5-6 раз меньше (по белковому азоту), чем фаголизаты с мясных питательных сред (бульон Мартена, мясо-пептонная среда) (табл 1)

Таблица 1

Азотистый состав питательных сред и препарата Секстафаг

Исследуемые питательные среды и препарат, полученный на этих средах Азот, мг/мл

Общий азот Белковый азот

Казеиново-кислотпая среда 1,960±0,010 0,040±0,004

Секстафаг, полученный на 1,670±0,100 0,030±0,00б

казеиново-кислотной среде

Бульон Мартена 2,830±0,080*** 0,240±0,010***

Секстафаг, полученный на бульоне 2,750±0,037"## 0,113±0,004**"

Мартена

Мясо-пептонный бульон 1,690±0,030*** 0,180±0,010***

Секстафаг, полученный на мясо- 1,310±0,02(Г 0,160±0,007"т

пептонном бульоне

Примечание *** - р<0,001 в сравнении с казеиново-кислотной средой, т - р<0,01, тч - р<0,001 в сравнении с препаратом Секстафаг, полученным на казеиново-кислотной среде

Таким образом, разработанная технология базируется на применении универсальной питательной среды для всех используемых в производстве комплексного препарата культур стафилококка, стрептококка, клебсиелл, синегнойной и кишечной палочек, протея, что обеспечивает стабильную репродукцию всех бактериофагов и позволяет получать препарат Секстафаг со сниженным содержанием балластных веществ

В ходе изучения свойств комплексного препарата установлено, что по устойчивости к физико-химическим факторам более стабильными являются клебсиеллезный, синегнойный, коли и протейный фаги, а лабильными -стафилококковый и стрептококковый, особенно это проявляется при высокотемпературных воздействиях (р<0,01) (рис 4)

is « 50 « ад 65

ЕЭ протейный О стрептококковый Всннегнойный

М клебсиеллезный Ш стафилококковый В коли

Рис. 4, Влияние температурного фактора на компоненты препарата Секстафаг.

С целью изучения сравнительной характеристики антибактериальной активности препарата Секстафаг и антибиотиков оценена чувствительность к ним микроорганизмов, выделенных из клинического материала в течение 2001 - 2002 гг.: St. aureus (627 штаммов), Str. pyogenes (183 штамма), Str. pneumoniae (104 штамма), Str. viridans (137 штаммов), E. coli (649 штаммов), Kl. spp. (165 штаммов), Pr. spp. (94 штамма), Ps. aeruginosa (91 штамм). По нашим данным у стафилококков степень чувствительности к препарату Секстафаг (76,7%) намного превосходила активность пенициллина (8,5%) и ампициллина (22,3%), находилась на уровне таких антибиотиков, как эритромицин (77,5 %) и оксациллин (78,8 %), а уступала только иипрофлоксацину (97,3 %), гентамицину (92,9 %) и цефазолину [89,5 %) (рис. 5).

■ eck амл окС tu ген инп эри !'Г

Рис. 5. Чувствительность Staphylococcus aureus к антибиотикам и препарату Секстафаг.

Примечание, пей - пенициллин, амп - ампициллин, оке - оксациллин; из -цефазолкн, ген - ген там н пин, цип - цилрофлоксацин, эри — эритромицин. ***. р < 0,00! ПО t— критерию Стьюдента относительно препарата Секстафаг.

Результаты оценки специфической лидирующей активности препарата Секстафаг по отношению к клиническим штаммам условно патогенных микроорганизмов свидетельствуют о создании высокоактивного препарата, не уступающего по эффективности многим современным антибиотикам.

Сравнительное изучение чувствительности микроорганизмов, полученных из баклабораторий лечебных учреждений г. Перми к препаратам Секстафаг жидкий и пиобактсриофаг поливалентный очищенный жидкий (производства Филиала ФГУП МЗ РФ «НПО «Микроген» в г, Уфа) показало, что спектр действия этих препаратов совпадает и практически не отличается (р>0,05) (рис. 6).

Рис. 6. Чувствительность микроорганизмов к препаратам Секстафаг н пиобактериофяг поливалентный очищенный жидкий.

При хроматографическом анализе комплексных препаратов бактериофагов разных производителей (Пермь, Уфа, Н.Новгород) выявлено, что содержание низкомолекулярных веществ в жидком Секстафаге в 2,5-3 раза меньше, чем и пиобактериофаге и интести-бактериофаге (рис. 7), Это свидетельствует о том, что в препарате Секстафаг присутствует меньше балластных веществ, чем в друг их комплексных препаратах, что связано с составом применяемой питательной среды.

Полученные серии препарата Секстафаг жидкий обладали высокой специфической активностью, были стерильны, не токсичны и стабильны в течение 2-х лет хранения при температуре от 2 до 8 "С. Обращают на себя внимание показатели специфической активности препарата. Титр компонентов Секстафага при определении по Г'рациа составил (2,0'106 - 6,0-107), что значительно выше, чем показатели титрования по Аппельману (10'51,6 - ]0"йос).

На газоне культур стафилококковый, стрептококковый, синегнойный и коли бактериофаги образуют негативные колонии размером 0,5-1,5 мм, протейный фаг - 0,1-0,2 мм и 1-2 мм, клебсиеллезный - колонии с ореолом, в центре прозрачная зона диаметром 2 мм.

Секстафаг

Ингестн-бактернофяг (г И Новгород)

'"фракции

Пнобяктернофаг (г Уфа)

i i

Стандарты 1 -голубой декстран (2000 кД), 2- тироглобуллин (669 кД), 3- каталаза (232 кД), 4- рибонуклеаза (13,7 кД)

20 40 60 вО 100 120 ^Рй™1"1

Рис 7 Хроматографический профиль комплексных препаратов бактериофагов на сефарозе 2 В.

Электронно-микроскопическое исследование составляющих компонентов препарата Секстафаг позволило визуально выявить и охарактеризовать морфологические особенности различных видов фагов Морфологически отдифференцировано 9 фагов, среди которых 3 вида относятся к стрептококковым фагам, 2 - к клебсиеллезным и по 1 виду - к синегнойному, протейному, стафилококковому и коли фагу (рис 8) Выявлены особенности строения вирионов и разный механизм адсорбции фага на клетке, что является важным аспектом при отборе бактериальных вирусов для лечебных целей Подтверждено, что все монофаги, входящие в Секстафаг, являются высоковирулентными

Необходимо отметить эффективность применения Секстафага в лечебной практике Комбинированный препарат - Секстафаг производства «Пермского НПО «Биомед» успешно использован в качестве средства фагопрофилактики инфекционно-воспапительных осложнений при кесаревом сечении Применение комбинированного бактериофага позволило снизить частоту инфекционно-воспалительных осложнений с 26,7 % до 18,7 % (Трушков, 2003) Эффективность терапии больных хроническим неспецифическим эндометршх)м составила 72-75 % (Меззи Хапед, 2003) Комплексное использование антибиотиков и бактериофагов при пиелонефрите у беременных явилось более эффективным и щадящим по сравнению с традиционной антибиотикотерапией

(Захарова, 2004). Оптимизация хирургической тактики, проведение антибактериальной терапии с учетом чувствительности изолированной микрофлоры к хи мл о прел аратам и использование в комплексной терапии Секстафага позволили снизить летальность у больных инфицированным панкреонекргаом с 27,8 %до 13,3% (Субботин, 2006).

Рис. 8, Электронно-микроскопический анализ препарата Секстафаг.

А - Бактериофаг Str. pyogenes № 1 {морфотип В1); Б - Бактериофаг Str. pyogenes № 2 (морфотип ВI ); В - Бактериофаг Sir. pyogenes № 3 (морфотип 83); Г - Бактериофаг St. aureus (морфотип Л)); Д - Бактериофаг Pr. vulgaris et mirabilis (морфотип Bl); К - Бактериофаг E. coli (морфотип А2); Ж - Бактериофаг Kl. pneumoniae № I (морфотип Cl); 3 - Бактериофаг Kl. pneumoniae № 2 (морфотип В î ); И - Бактериофаг Ps. aeruginosa (морфотип А1 ),

Разработка технологии и оценка качества ректальной лекарственной формы препарата Секстафаг

Анализируя потребительские свойства лекарственных форм с бактериофагами, мы остановили свой выбор на суппозиториях Работа по созданию суппозиториев с Секстафагом включала ряд последовательных этапов

В первой серии экспериментов отрабатывали технологию получения суппозиториев на модели одного бактериофага - клебсиеллезного В суппозиторную основу активное вещество вводили либо в сухом, либо в жидком виде Мы отдали предпочтение последнему варианту, поскольку активность жидких фагов сохраняется дольше, чем лиофилизированных Для предварительной подготовки биологически активного компонента был использован метод мембранной ультрафильтрации Достоинством этого метода является совмещение стадии очистки и концентрирования бактериофагов Проведенные исследования показали, что с помощью разделительных аппаратов на полых волокнах марки ВПУ-15 можно получить концентрированные клебсиеллезные бактериофаги с активностью в 100-150 раз выше исходной и очисткой по белковому и общему азотам в 78,0 и 63,4 раз соответственно

Такой подход позволил сохранить практически без потерь специфическую активность бактериофага и обеспечить высокую степень его очистки Полученные концентраты клебсиеллезного бактериофага были использованы при приготовлении 20 вариантов суппозиториев с применением ряда жировых основ (Себао, витепсолы марок Н-15, \V-35) и эмульгаторов (Т-2, МГД) в различных пропорциях Сравнение двух суппозиторных основ (Себао и витепсол) выявило значительные преимущества последнего по физическим свойствам Была определена оптимальная доза концентрированного бактериофага в суппозиторной массе - 20 % Установлено, что суппозитории, приготовленные на смеси витепсолов марок Н-15 и \V-35 обладали хорошими структурно - механическими свойствами, не оплавлялись в руках и практически полностью сохраняли специфическую активность в течение 1,5 лет при температуре хранения аг2до8°С

Приготовление суппозиториев с Секстафагом проводили по алгоритму, разработанному для клебсиеллезного бактериофага в свечах Для создания необходимой дозировки в лекарственной форме компоненты Секстафага так же, как и клебсиеллезный бактериофаг предварительно концентрировали Необходимо отметить, что специфическая активность концентрированных монофагов должна быть не ниже 10"7 При формовании свечей важную роль играет температурное воздействие на суппозиторную массу Учитывая это, было изучено влияние различных температур в течение 1 часа на концентрированный

Секстафаг и суппозиторную массу Установлено, что максимально допустимая температура процесса выливания не должна превышать 40 °С

По разработанной технологии изготовлены экспериментально-производственные серии Секстафага в суппозиториях, состав которых представлен в табл 2

Таблица 2

Состав суппозиториев с Секстафагом

Состав на один суппозиторий Масса свечи 1,2 г

Концентрированный стерильный Секстафаг 20%

Эмульгатор Т-2 5%

Витепсол Н-15 и \V-35 (1 1) 75%

На Секстафаг суппозитории ректальные оформлена необходимая нормативная документация (производственный регламент, проект ФСП) 3 экспериментально-производственные серии препарата вместе с документацией прошли контроль в ГИСК им Л А Тарасевича, получен положительный ответ Отмечено, что специфическая активность всех компонентов Секстафага в суппозиториях сохраняется в пределах нормы (не менее 10") в течение 1,5 лет хранения при температуре от 2 до 8°С (табл 3)

Таблица 3

Оценка стабильности препарата Секстафаг суппозитории ректальные

S к Специфическая активность по Аппельману на штаммах

S 8-О Срок хранена (мес ) St aureus Streptococcus spp Pr vulgaris Pr mirabihs Kl pneumoniae Ps aeruginosa E colt

0 JQ-5 14,0 26 |Q 4 86,0,34 JQ-5 14,0 26 | Q-5 29 0 29 |Q-4 71,0 18 JQ-5 14,0 34

2,5 мес ,05ОО |Q 4 71,0,29 JQ-4 57,0 2 | Q-4 71,0,36 I Q-4 57,0 30 | Q-4 71,0 18

6 мес j Q-4 86,0 26 j Q-4 29,0 29 | Q-4 43,0 20 | Q-4 43,0 20 | Q-4 29,0 18 j Q 4 57,0 20

1 12 мес JQ-4 29,0 18 |р-4Д9,0,18 | Q-4 29,0 18 JQ-4.29,0,18 |Q-4 14,0 14 JQ-4 14,0 14

18 мес j Q-4 29,0 18 j Q-4 29,0 18 | Q-4 29,0 18 | Q-4 29,0 18 JQ-4 14,0 14 JQ-4 14,0,14

21 мес | Q-4 29,0 18 jQ 4 29,0 18 |Q 429,0 18 | Q-4 29 0 18 |Q-4 14,0 14 JQ-4 14,0 14

24 мес j Q-4 00,0 18 |Q 3 86,0 14 j Q-4 14,0 14 | Q-4 14,0 26 | Q-4 00,0 31 | Q-4 00,0 22

По остальным показателям (описание, микробиологическая чистота, средняя масса, время полной деформации, токсичность) суппозитории по истечении срока хранения соответствовали требованиям нормативной документации Таким образом, предложена и отработана технология изготовления суппозиториев с Секстафагом, в соответствии с которой концентрат бактериофагов вводится в суппозиторную основу в жидком виде, исключая стадию лиофилизации, что значительно удешевляет производственный процесс и обеспечивает длительное сохранение специфической активности фагов

Следующий раздел нашей работы включал изучение динамики выведения Секстафага при пероральном и ректальном путях введения у здоровых и больных людей Исследования показали, что при ректальном способе введения бактериофагов, так же как и при пероральном, происходит всасывание фагов в кровь, циркуляция в организме человека и выведение с мочой При этом наблюдается длительная циркуляция бактериофагов в организме человека и лучшее сохранение их литической активности Кроме того, положительными моментами ректального применения Секстафага являются отсутствие воздействия желудочного сока, насыщение венозной системы кишечника с дальнейшим поступлением препарата в общий кровоток, специфическое действие Секстафага на энтеробактерии толстой кишки

Изучена терапевтическая эффективность препарата Секстафаг суппозитории ректальные в комплексном лечении больных Работа проведена в 2005 г на базе урологического отделения ГКБ № 2 г Перми В исследование было включено 22 больных острым необструктивным пиелонефритом Пациенты были разделены на две группы больные основной группы получали комплексную терапию, включающую Секстафаг суппозитории ректальные 2 раза в день, современные антибиотики широкого спектра, дезинтоксикационную терапию, группа сравнения получала аналогичное лечение, но без суппозиториев

У больных основной группы при проведении комплексной терапии, включающей суппозитории с Секстафагом, гипертермия исчезала в среднем через 3,1 + 0,3 суток с момента начала лечения, в группе сравнения - через 5,0 + 0,4 суток Разница статистически достоверна (Р < 0,01) У 1 (9,1%) больного группы сравнения через 14 суток отмечалось сохранение субфебрильной температуры тела Лейкоцитоз крови снижался значительно быстрее у больных основной группы Через 14 суток терапии все больные имели нормальное содержание лейкоцитов крови, а среднее значение лейкоцитов составило 6,0x109/л, те показатель лейкоцитоза снизился на 57,7% В группе сравнения через 2 недели у 3 пациентов (27,3%) сохранялся гиперлейкоцитоз, среднее число лейкоцитов

периферической крови снизилось меньше, чем в основной группе Все 11 больных основной группы были выписаны на амбулаторное лечение с отсутствием лейкоцитурии и бактериурии При этом у 9 (81,8%) больных, у которых была выявлена бактериальная флора (преимущественно Е coli) со средним микробным числом 459,1x103, при контрольном посеве мочи не было обнаружено патогенной флоры В группе сравнения к 14 суткам у 36,4% больных сохранялась лейкоцитурия, у 18,2% в посеве мочи вновь высевались бактерии со средним микробным числом 121,7x103 (табл 4)

Таблица 4

Результаты лечения острого пиелонефрита

Показатели Основная группа Группа сравнения

до лечения через 14 сут до лечения через 14 сут

Наличие гипертермии, % больных 100 - 100 9,1

Наличие гиперлейкоцитоза крови, % больных 100 - 100 27,2

Степень лейкоцитоза крови, х 109/л 14,2+1,1 6,0+0,9* 14,1+0,8 8,8+0,8

Наличие лейкоцитурии, % больных 100 - 100 36,4

Наличие бактериурии, % больных 81,8 - 81,8 18,2

Среднее микробное число, х I О3 459,1 - 448,2 121,7

Примечание * - р<0,05 по t - критерию Стьюдента относительно группы сравнения

В результате проведенного исследования установлено, что применение Секстафага в новой лекарственной форме - суппозиториях в сочетании с антибактериальной терапией является эффективным методом лечения острого необструктивного пиелонефрита Применение данного препарата возможно до получения результатов бактериологического исследования мочи, что выгодно отличает комплексные бактериофаги от монофагов Таким образом, целесообразно в схему комплексной терапии острого пиелонефрита включать Секстафаг суппозитории ректальные

Материалы исследований фармакодинамики и клинической эффективности препарата Секстафаг суппозитории ректальные позволяют отметить его высокую антибактериальную активность в отношении условно патогенных микроорганизмов и являются предпосылкой для дальнейшего использования их в медицине

ВЫВОДЫ

1 Сформирована постоянно обновляющаяся коллекция производственных условно патогенных штаммов - продуцентов бактериофагов, выделенных из клинического материала, позволяющая получать высоковирулентные фаговые препараты

2 Разработан унифицированный способ репродукции бактериофагов с использованием универсальной казеиново-кислотной питательной среды, обеспечивающий получение препаратов бактериофагов с низким содержанием балластных веществ и высокой специфической активностью

3 Сконструирована фаговая композиция, состоящая из стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного и коли бактериофагов, оказывающая выраженное этиотропное действие на условно патогенные микроорганизмы

4 Предложен способ получения препарата Секстафаг, включающий раздельное культивирование монофагов с их последующим объединением в равных количествах, обеспечивающих специфическую активность в композиции не ниже 10"5 по каждому компоненту, и изготовлением лекарственных форм жидкий препарат во флаконах и суппозитории ректальные

5 Исследована фармакодинамика комплексного фагового препарата при использовании разработанных лекарственных форм и оценена эффективность суппозиториев в клинической практике

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Функнер Е В , Жданова С В , Ефимова Н П , Каменева М А Динамика выделения пентафага из организма здорового человека при пероральном и ректальном приемах//Матер научно-практ конф Западно-Уральского региона «Вакцинопрофилактика в XXI веке» - Пермь, 2000 - С 116-117

2 Функнер Е В , Мельникова Е В Оценка чувствительности клинических штаммов стрептококков к лечебному бактериофагу//Матер конф «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» - Томск, 2001 -С 90-91

3 Efimova N Р , Kameneva М А , Reshetmkov V I, Funkner Е V Evaluation of different ways of introduction of therapeutic phages//Abstr Evergreen International Phage Biology Meeting Canada, 2001 -P 20

4 Ефимова H П, Каменева M A, Функнер E В Бактериофаги -биологические антисептики//Труды Междунар науч конф «Перспективы развития естественных наук в высшей школе» - Пермь, 2001 - Т 5 -С 206-208

5 Ефимова Н П, Каменева М А, Функнер Е В Изучение фагочувствительности золотистых стафилококков, выделенных от

больных//Матер конф «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» - Пермь, 2003 - С 235-238

6 Ефимова Н П , Каменева М А , Грязнова Д В , Функнер Е В Разработка технологии изготовления суппозиториев с клебсифагом//Матер конф «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» - Пермь, 2003 -С 238-242

7 Функнер Е В Чувствительность клинических штаммов микроорганизмов к антибиотикам и бактериофагам//Матер конф «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» - Томск, 2004 - С 236-239

8 Ефимова М Г, Функнер Е В Оптимизация способа получения поливалентного бактериофага//Матер Всеросс науч конф с междун участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке разработка, производство и применение» - Уфа, 2005 - С 269-271

9 Функнер Е В, Ефимова М Г, Волкова Л В, Тюрева Т А Технологические особенности разработки суппозиториев с секстафагом//Матер Всеросс науч конф с междун участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке разработка, производство и применение» - Уфа, 2005 -С 272-274

10 Функнер Е В , Ефимова М Г , Давидов М И , Токарев М В , Муц М Н Первый опыт использования суппозиториев с секстафагом в лечении острого пиелонефрита//Матер научно-практ конф «Современная вакцинопрофилактика. проблемы и перспективы развития» - Пермь, 2005 -С 204-210

11 Токарев М В, Давидов М И, Функнер Е В Лечение острого пиелонефрита бактериофагами//Сб науч трудов «Актуальные вопросы клинической медицины» - Пермь, 2005 - С 154-159

12 Функнер Е В , Ефимова М Г Биологические и технологические аспекты разработки поливалентного фагового препарата//Пермский медицинский журнал -2005 -Т 22 -№4 - С 92-96

13 Урман МГ, Горовиц ЭС, Субботин АВ, Маслов ЮН, Одинцова О В , Функнер Е В Оптимизация антибактериальной терапии при инфицированном панкреонекрозе//Сб научно-практ статей «Трудные и нестандартные ситуации в хирургии Новые технологии в медицине» - Ижевск, 2006 - Вып 3 -С 309-312

14 Субботин А В , Функнер Е В , Урман М Г , Горовиц Э С , Маслов Ю Н , Одинцова О В Применение секстафага в комплексной антибактериальной терапии инфицированного панкреонекроза//Матер Междунар научно-практ конф «Здоровье и образование» -Пермь, 2006 - С 191-197

15 Функнер ЕВ, Ефимова МГ, Казьянин АВ, Субботин А В Оценка динамики выделения секстафага у больных панкреонекрозом//Матер Всеросс научно-практич конфер «Вакцинология 2006 Совершенствование

иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» - Москва, 2006 - С 99

16 Казьянин А В, Функнер Е В Создание производственной коллекции штаммов-продуцентов для получения комплексного фагового препарата//Матер Междун науч конфер «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» - Томск, 2006 - С 381-383

17 Kazjanm AV, Funkner EV, Efimova MG Studying stability of the preparation - sexstaphage suppositories per rectum//Matenals of the 2-nd Russian-Chinese international scientific conferences on pharmacology «Fundamental pharmacology and pharmacy-clinical practice» - Perm, 2006 - С 75-76

18 Ефимова НП, Ефимова МГ, Каменева МА, Функнер ЕВ Способ получения полибактериофага Патент на изобретение RU № 2247151 от 27 02 2005 Приоритет изобретения 06 05 2002 Зарегистрирован в Госреестре изобретений РФ 27 02 2005

ФУНКНЕР Елена Викторовна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗРАБОТКИ КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА БАКТЕРИОФАГОВ

Автореферат

Подписано в печать 27 04 2007 Формат 90x60/16 Уел печ л 1,4 Бумага ВХИ Набор компьютерный Тираж 100 экз Заказ №261 к/2007

Отпечатано в типографии ИД "Пресстайм" Адрес 614025, г Пермь, ул Героев Хасана, 105

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Функер, Елена Викторовна

Список основных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. БАКТЕРИОФАГИ: СВОЙСТВА, ПЕРСПЕКТИВЫ

ПРИМЕНЕНИЯ И ПРОИЗВОДСТВА.

1.1. Бактериофаги. Физико-химические и антигенные свойства.

1.2. Устойчивость фагов к факторам воздействия.

1.3. Основные стадии взаимодействия фага с бактерией.

1.4. Применение бактериофагов.

1.5. Технологические аспекты производства лечебно-профилактических препаратов бактериофагов.

1.6. Препараты бактериофагов. Лекарственные формы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. СОЗДАНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ КОЛЛЕКЦИИ

ШТАММОВ - ПРОДУЦЕНТОВ БАКТЕРИОФАГОВ.

3.1. Характеристика биохимических, тинкториальных, морфологических, культуральных свойств микроорганизмов.

3.2. Чувствительность штаммов микроорганизмов к бактериофагам.

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСНОГО ФАГОВОГО

ПРЕПАРАТА.

4.1. Разработка универсальной питательной среды.

4.2. Создание технологии получения комплексного препарата - секстафага.

4.3. Характеристика свойств секстафага.

4.3.1. Влияние физико-химических факторов и стабильность препарата.

4.3.2. Антибактериальная активность препарата.

4.3.3. Хроматографический профиль.

4.3.4. Электронно-микроскопическая характеристика секстафага.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА РЕКТАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ СЕКСТАФАГА.

5.1. Особенности получения суппозиториев с бактериофагами.

5.2. Изготовление суппозиториев с комплексным препаратом - секстафагом и свойства полученной лекарственной формы.

5.3. Изучение динамики выведения секстафага при пероральном и ректальном путях введения и применение суппозиториев в клинической практике.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микробиологические и технологические аспекты разработки комплексного препарата бактериофагов"

Актуальность проблемы

Инфекции, вызванные условно патогенными микроорганизмами, в том числе Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp.; Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., в настоящее время представляют существенную проблему, как с клинических, так и с эпидемиологических позиций. Традиционными препаратами этиотропной терапии гнойно-воспалительных заболеваний являются антибиотики. Однако применение антибиотиков сопряжено не только с гибелью патогенных агентов, поддерживающих инфекционный процесс, но и с подавлением нормальной микрофлоры человека, ее адгезивных свойств [81, 146]. Вопрос об успешной профилактике и терапии гнойно-септических инфекций приобретает чрезвычайную актуальность в условиях формирования полирезистентности микроорганизмов к антибиотикам [20, 48, 99, 196, 201, 207, 233, 256]. В связи с этим интенсифицируются исследования по совершенствованию и разработке альтернативных методов лечения, в том числе и фаготерапии. Основными достоинствами препаратов бактериофагов являются: высокая чувствительность к ним патогенной микрофлоры, сочетаемость со всеми видами традиционной антибактериальной терапии, отсутствие противопоказаний к применению [62, 82, 254].

В сфере фагового производства актуальны задачи, связанные с конструированием новых препаратов и усовершенствованием технологического процесса, включая отбор и использование высокочувствительных штаммов-продуцентов, разработку питательных сред для культивирования бактериофагов, изготовление более широкой номенклатуры лекарственных форм. В условиях полиэтиологичности многих заболеваний, вызванных условно патогенными микроорганизмами, наиболее целесообразно создание поливалентных комбинированных бактериофагов [22, 130, 159]. Распространенными формами выпуска препаратов бактериофагов являются жидкие лекарственные формы и таблетированные фаги кишечной группы. В последние годы на фоне значительного увеличения объемов выпуска препаратов ведутся работы по созданию новых лекарственных форм [6, 15, 33, 88, 108, 117, 118, 119, 224, 254]. Среди различных способов введения лекарств широкое распространение в медицинской практике получает ректальный способ, преимуществами которого являются: попадание лекарственного вещества непосредственно в общий кровоток, минуя желудок; увеличение скорости всасывания; уменьшение частоты аллергезирующего действия; простота, безболезненность введения, а также удобство использования в детской практике [69]. Целесообразность выпуска лекарственных форм бактериофагов для ректального введения, в том числе суппозиториев, диктуется также необходимостью сохранения литической активности фагов, так как при пероральном приеме они в значительной степени инактивируются соляной кислотой желудочного сока [63, 129].

Цель настоящего исследования - создание композиции, изучение биологических свойств и разработка лекарственных форм комплексного фагового препарата на основе отобранных из клинического материала условно патогенных микроорганизмов-продуцентов бактериофагов.

Основные задачи исследования:

1. Детально исследовать морфо-физиологические свойства выделенных из клинического материала штаммов-продуцентов бактериофагов (Е. coli, Kl. pneumoniae, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Ps. aeruginosa, St. aureus, Streptococcus spp.) и создать коллекцию из перспективных в производственном отношении микроорганизмов.

2. Оптимизировать и унифицировать условия производственного процесса репродукции бактериофагов.

3. Разработать способ получения комплексного фагового препарата и охарактеризовать его биологические свойства.

4. Получить лекарственную форму комплексного фагового препарата для ректального введения (суппозитории), исследовать ее фармакодинамику и эффективность применения в клинической практике.

Научная новизна

Проведено изучение морфологических, культуральных, биохимических свойств большой группы условно патогенных микроорганизмов, выделенных из клинического материала лечебных учреждений Пермского края. Произведен отбор штаммов - потенциальных продуцентов бактериофагов. Оптимизирован и унифицирован процесс репродукции бактериофагов на основе использования универсальной питательной среды (Патент RU 2247151 «Способ получения полибактериофага», приоритет от 06.05.2002). На основе высоковирулентных фагов (стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного, коли) сконструирован поливалентный комплексный 6-компонентный препарат Секстафаг с широким спектром и высоким уровнем антибактериальной активности. Изучена фармакодинамика различных лекарственных форм Секстафага при пероралыюм и ректальном путях введения препарата.

Практическая значимость работы определяется разработанными эффективными микробиологическими и технологическими приемами, позволяющими адаптировать процессы изготовления бактериофагов к условиям массового производства препаратов, а также созданием нового комплексного фагового препарата, расширяющего арсенал антибактериальных лекарственных средств. Сформирована коллекция производственных микроорганизмов-продуцентов для изготовления моно - и комплексных препаратов бактериофагов. Разработана универсальная казеиново-кислотная среда, позволяющая получать препараты бактериофагов со сниженным содержанием балластных веществ. Предложен способ получения комплексного препарата, включающий раздельное культивирование отдельных компонентов с последующим объединением высокоактивных монофагов с заданными свойствами. Получены лекарственные формы Секстафага: жидкий препарат во флаконах и суппозитории ректальные на основе жидкого концентрата. Созданная технология используется в производстве препарата Секстафаг жидкий (получено более 270 промышленных серий). Результаты научной работы отражены в НД:

1. Регламент производства на бактериофаг стрептококковый жидкий № 1105-01.

2. ФСП 42-002823-22-02 на бактериофаг стрептококковый жидкий.

3. Регламент производства № 1103-01 на Секстафаг® (пиобактериофаг поливалентный) жидкий.

4. ФСП 42-002827-05-02 на Секстафаг® (пиобактериофаг поливалентный) жидкий.

5. Экспериментально-производственный регламент производства на Секстафаг® суппозитории ректальные (пиобактериофаг поливалентный).

6. Проект ФСП и проект инструкции по применению на Секстафаг® суппозитории ректальные (пиобактериофаг поливалентный).

Положения, выносимые на защиту

1. Использование коллекции региональных штаммов-продуцентов бактериофагов (Е. coli, Kl. pneumoniae, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Ps. aeruginosa, St. aureus, Streptococcus spp.) и универсальной казеиново-кислотной питательной среды обеспечивает получение фаговых препаратов, обладающих высокой специфической активностью и низким содержанием балластных веществ.

2. Предложенный способ раздельного культивирования монофагов (стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного, коли) с последующим объединением в единую лекарственную форму с активностью не ниже 10'5 каждого компонента обеспечивает получение комплексного высоковирулентного препарата, обладающего выраженным этиотропным действием по отношению к условно патогенным микроорганизмам.

3. Лекарственная форма препарата Секстафаг для ректального применения (суппозитории), полученная по разработанной технологии, оказывает терапевтический эффект в лечебной практике и обладает более длительной динамикой выведения, чем жидкий препарат.

Апробация работы н публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Научно - практической конференции «Вакцинопрофилактика в XXI веке», Пермь, 2000; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2001; Международной научной конференции «Перспективы развития естественных наук в высшей школе», Пермь, 2001; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2004; Всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение», Уфа, 2005; Научно-практической конференции «Современная вакцинопрофилактика: проблемы и перспективы развития», Пермь, 2005; Научной конференции «Актуальные вопросы клинической медицины», Пермь, 2005; Научно-практической конференции «Трудные и нестандартные ситуации в хирургии. Новые технологии в медицине», Ижевск, 2006; Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование», Пермь, 2006; Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий», Томск, 2006; Международной Российско-китайской научной конференции по фармакологии «Fundamental pharmacology and pharmacy-clinical practice», Пермь, 2006; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006.

Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006.

Диссертация апробирована на заседании научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» и рекомендована к защите.

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ. Полученные результаты защищены патентом на изобретение РФ.

Связь работы с научными программами

Диссертационная работа выполнена на базе отделения бактериофагов и лаборатории бактериофагов в соответствии с планом НИР филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер госрегистрации 01.9.90 002643).

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 150 страницах, содержит 24 таблицы и 25 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 271 источник, из них 173 отечественных и 98 иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Функер, Елена Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Сформирована постоянно обновляющаяся коллекция производственных условно патогенных штаммов - продуцентов бактериофагов, выделенных из клинического материала, позволяющая получать высоковирулентные фаговые препараты.

2. Разработан унифицированный способ репродукции бактериофагов с использованием универсальной казеиново-кислотной питательной среды, обеспечивающий получение препаратов бактериофагов с низким содержанием балластных веществ и высокой специфической активностью.

3. Сконструирована фаговая композиция, состоящая из стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного и коли бактериофагов, оказывающая выраженное этиотропное действие на условно патогенные микроорганизмы.

4. Предложен способ получения препарата Секстафаг, включающий раздельное культивирование монофагов с их последующим объединением в равных количествах, обеспечивающих специфическую активность в композиции не ниже 10"5 по каждому компоненту, и изготовлением лекарственных форм: жидкий препарат во флаконах и суппозитории ректальные.

5. Исследована фармакодинамика комплексного фагового препарата при использовании разработанных лекарственных форм и оценена эффективность суппозиториев в клинической практике.

Заключение

В последние годы отмечается повсеместный рост лекарственной резистентности микроорганизмов к антибиотикам и большое число побочных реакций при их использовании. В связи с этим, потребность в антимикробных препаратах, действенных в отношении современных возбудителей и не угнетающих нормофлору человека, заставила клиницистов обратить свое внимание на бактериофаги, которые успешно применяли для лечения кишечных и гнойных инфекций еще до открытия антибиотиков. Лечебно-профилактические бактериофаги содержат высоковирулентные бактериофаги строго специфической направленности. Основными достоинствами препаратов бактериофагов являются высокая чувствительность патогенной микрофлоры к бактериофагам, сочетаемость со всеми видами традиционной антибактериальной терапии, отсутствие противопоказаний к фагопрофилактике и фаготерапии.

В условиях полиэтиологичности многих заболеваний, вызванных условно патогенными микроорганизмами наиболее перспективна разработка поливалентных комбинированных бактериофагов.

С целью создания комплексного фагового препарата - секстафага проводилась работа по отбору штаммов-продуцентов с формированием производственной коллекции, подбору оптимальной питательной среды для производства бактериофагов и разработке способа получения.

Формирование коллекции условно патогенных микроорганизмов проводилось на основе бактериологического анализа клинического материала. Дифференциальная диагностика выделенных штаммов микроорганизмов осуществлялась по их тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам.

За период с 1996 г. по 2000 г. для отбора высокочувствительных штаммов-продуцентов бактериофагов проанализировано 7616 штаммов микроорганизмов, выделенных в баклабораториях г. Перми и Пермского края, а также полученных из ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Максимальное пополнение коллекции проведено в 1999-2000 гг. при изучении свойств микроорганизмов St. aureus (245 штаммов), Streptococcus spp. (374 штамма), Enterococcus spp. (335 штаммов), Ps. aeruginosa (245 штаммов), E. coli (226 штаммов), Proteus spp. (573 штамма.), Klebsiella spp. (563 штамма). Штаммы микроорганизмов представленной таксономической принадлежности, обладающие типичными для каждого вида свойствами, оценивали по чувствительности к монобактериофагам (стафилококковому, стрептококковому, синегнойному, клебсиеллезному, протейному и коли). Лизируемость культур определяли по методу Аппельмана, а также при нанесении неразведенного фага на газон культуры на агаре. Наибольший диапазон литического действия отмечался у стафилококкового бактериофага. Чувствительность к данному бактериофагу клинических штаммов стафилококков составила 95%. По диапазону действия (количество лизируемых фагом культур в разведении 10 ) исследованные нами бактериофаги располагались в следующем порядке: стафилококковый - 78,2%, синегнойный - 71,7%, коли - 69,1%, клебсиеллезный - 64%, протейный - 54%, стрептококковый - 8,9% (для энтерококков) и 1,9% (для стрептококков), хотя чувствительность этих культур к стрептококковому фагу, разведенному в 10 раз весьма высокая и составляла 69,5%.

В связи с тем, что чувствительность стрептококков и энтерококков к стрептококковому фагу сильно отличалась, нами была изучена видовая принадлежность стрептококков и лизируемость их бактериофагом. Отмечена высокая чувствительность к стрептококковому бактериофагу Streptococcus pneumoniae- 84%, S. anginosus- 78%, S. agalactiae- 75%, S. pyogenes- 59%. Средний процент чувствительности для стрептококков составил 71%. Enterococcus faecalis , Е. faecium лизировались фагом в 22% случаев.

В дальнейшем микроорганизмы, чувствительные к бактериофагам в разведении не ниже 104 , пассировали с маточными бактериофагами под контролем специфической активности. В коллекцию отбирали штаммы, лизнруемые маточными бактериофагами в титре 10"6 и выше. Штаммы Escherichia coli отбирали с учетом различия серогрупп.

При формировании коллекционного пула St. aureus проводили фаготипирование штаммов с применением типового международного набора стафилококковых фагов. При изучении фагочувствительности 937 штаммов отмечено постоянное изменение чувствительности стафилококков к типовым и лечебным фагам. Выявлена высокая чувствительность к стафилококковому бактериофагу микроорганизмов, выделенных при гнойных инфекциях у взрослых (80 - 98%) и у детей (95 до 98%). Вызывающие энтеральные заболевания штаммы St. aureus лизировались фагами значительно слабее и существенно отличались по фагочувствительности в зависимости от места выделения штамма. Принимая во внимание данное обстоятельство, в коллекцию были отобраны штаммы стафилококков с разными фаготипами с учетом чувствительности к лечебному стафилококковому бактериофагу.

Проведенные исследования позволили сформировать производственную коллекцию, которая в настоящее время включает около 600 штаммов условно патогенных микроорганизмов. Пополнение и постоянное обновление коллекции обеспечивают адекватность препаратов бактериофагов современной этиологической структуре циркулирующих возбудителей.

Процесс культивирования бактериофагов предполагает создание с помощью питательных сред благоприятных условий для размножения фаговых частиц. Наиболее распространенными питательными средами в производстве бактериофагов являются дорогостоящие и недостаточно стандартные мясные среды. Нами были проведены исследования по изучению возможности использования в качестве альтернативы более экономичных казеиновых сред. Отличительными особенностями разработанного варианта казеиновой среды является то, что в качестве питательной основы использован кислотный гидролизат казеина со степенью расщепления 0,6-0,7, а также добавлен мультивитаминный комплекс. Кроме того, оптимизирован способ получения гидролизата, включающий одновременное изоосаждение нерасщепленного казеина и обработку гидролизата углем.

При сравнительном изучении характера роста микроорганизмов на мясной среде (бульон Мартена) и казеиново-кислотной среде выявлено, что разработанная среда обладает хорошими ростовыми свойствами и подходит для культивирования ряда условно патогенных бактерий (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Kl. pneumoniae, Pr. vulgaris et mirabilis, E. coli, Ps. aeruginosa).

Проведенные исследования явились предпосылкой для создания технологии получения комплексного препарата, включающей раздельное культивирование бактериофагов. В стационарных условиях в реакторах в казеиново-кислотную среду одновременно засевали суточную микробную культуру из расчета (75±25) млн. клеток на 1 мл среды и маточный бактериофаг в количестве 0,2 % от объема засеваемой среды. Культивирование вели при температуре (36±1) °С в течение (18±2) часов до полного лизиса культуры. Полученный фаголизат подвергали сначала осветляющей, а затем стерилизующей фильтрации. После этого стерильные фаголизаты (стафилококковый, стрептококковый, протейный, клебсиеллезный, синегнойный и коли) с титром по Аппельману не ниже 10"5 объединяли в равных объемах в 6-компонентный препарат - секстафаг. Такая технология обеспечивает получение комплексного высоковирулентного препарата, обладающего значительной антибактериальной активностью по отношению к условно патогенным микроорганизмам.

Таким образом, разработанная технология базируется на применении универсальной питательной среды для всех используемых в производстве комплексного препарата культур: стафилококка, стрептококка, клебсиелл, синегнойной и кишечной палочек, протея, что обеспечивает стабильную репродукцию всех бактериофагов и позволяет получать секстафаг со сниженным содержанием балластных веществ. Технология получения секстафага® (пиобактериофага) жидкого внедрена в производство, получено более 270 серий секстафага жидкого по 250,0 л.

Для сравнительной характеристики антибактериальной активности секстафага и антибиотиков оценена чувствительность к ним микроорганизмов, выделенных из клинического материала. Исследованию подверглись 2050 штаммов микроорганизмов: St. aureus (627 штаммов), S. pyogenes (183 штамма), S. pneumoniae (104 штамма), S. viridans (137 штаммов), Е. coli (649 штаммов), Kl. spp. (165 штаммов), Proteus spp. (94 штамма), Ps. aeruginosa (91 штамм), выделенные за период 2001 - 2002 гг. Так, у стафилококков степень чувствительности к секстафагу (76,7%) намного превосходила активность пенициллина (8,5%) и ампициллина (22,3%), находилась на уровне таких антибиотиков, как эритромицин (77,5 %) и оксациллин (78,8 %), а уступала только ципрофлоксацину (97,3 %), гентамицину (92,9 %) и цефазолину (89,5 %).

Результаты оценки специфической лизирующей активности секстафага по отношению к клиническим штаммам условно патогенных микроорганизмов свидетельствуют о создании высокоактивного препарата, не уступающего по эффективности многим современным антибиотикам.

Сравнительное изучение чувствительности микроорганизмов, полученных из баклабораторий лечебных учреждений г.Перми к секстафагу жидкому и пиобактериофагу поливалентному очищенному жидкому (производства

Филиала ФГУП МЗ РФ «НПО «Микроген» в г. Уфа) показало, что спектр действия этих препаратов совпадает и практически не отличается (р > 0,05).

При хроматографическом анализе комплексных препаратов бактериофагов разных производителей (Пермь, Уфа, Н.Новгород) выявлено, что содержание низкомолекулярных веществ в жидком секстафаге в 2,5-3 раза меньше, чем в пиобактериофаге и интести-бактериофаге (рис. 7). Это свидетельствует о том, что в секстафаге присутствует меньше балластных веществ, чем в других комплексных препаратах, что связано с составом применяемой питательной среды.

Полученные серии препарата - секстафаг жидкий обладали высокой специфической активностью, были стерильны, не токсичны и стабильны в течение 2-х лет хранения при температуре от 2 до 8 °С. Обращают на себя внимание показатели специфической активности препарата. Титр компонентов секстафага при определении по Грациа составил с ч

2,0 -10 - 6,0 • 10 ), что значительно выше, чем показатели титрования по Аппельману (10'5,86 - Ю"6,00). На газоне культур стафилококковый, стрептококковый, синегнойный и коли бактериофаги образуют негативные колонии размером 0,5-1,5 мм, протейный фаг - 0,1-0,2 мм и 1-2 мм, клебсиеллезный - колонии с ореолом, в центре прозрачная зона диаметром 2 мм.

Электронно-микроскопическое исследование составляющих компонентов секстафага позволило визуально выявить и охарактеризовать морфологические особенности различных видов фагов. Морфологически отдифференцировано 9 фагов, среди которых 3 вида относятся к стрептококковым фагам, 2 - к клебсиеллезным и по 1 виду - к синегнойному, протейному, стафилококковому и коли фагу. Выявлены особенности строения вирионов и разный механизм адсорбции фага на клетке, что является важным аспектом при отборе бактериальных вирусов для лечебных целей. Подтверждено, что все монофаги, входящие в секстафаг, являются высоковирулентными.

Необходимо отметить эффективность применения секстафага в лечебной практике. Комбинированный препарат - секстафаг производства «Пермского НПО «Биомед» успешно использован в качестве средства фагопрофилактики инфекционно-воспалительных осложнений при кесаревом сечении. Применение комбинированного бактериофага позволило снизить частоту инфекционно-воспалительных осложнений с 26,7 % до 18,7 % (Трушков А.Г., 2003). Эффективность терапии больных хроническим неспецифическим эндометритом составила 72-75 % (Меззи Халед Бен Абдала, 2003). Комплексное использование антибиотиков и бактериофагов при пиелонефрите у беременных явилось более эффективным и щадящим по сравнению с традиционной антибиотикотерапией (Захарова Ю.А., 2004). Оптимизация хирургической тактики, проведение антибактериальной терапии с учетом чувствительности изолированной микрофлоры к химиопрепаратам и использование в комплексной терапии секстафага позволили снизить летальность у больных инфицированным панкреонекрозом с 27,8 % до 13,3% (Субботин A.B., 2006).

Анализируя потребительские свойства лекарственных форм с бактериофагами, мы остановили свой выбор на суппозиториях. Работа по созданию суппозиториев с секстафагом включала ряд последовательных этапов. В первой серии экспериментов отрабатывали технологию получения суппозиториев на модели одного бактериофага - клебсиеллезного. В суппозиторную основу активное вещество вводили либо в сухом, либо в жидком виде. Мы отдали предпочтение последнему варианту, поскольку активность жидких фагов сохраняется дольше, чем лиофилизированных. Для предварительной подготовки биологически активного компонента был использован метод мембранной ультрафильтрации. Достоинством этого метода является совмещение стадии очистки и концентрирования бактериофагов. Проведенные исследования показали, что с помощью разделительных аппаратов на полых волокнах марки ВПУ-15 можно получить концентрированные клебсиеллезные бактериофаги с активностью в 100-150 раз выше исходной и очисткой по белковому и общему азотам в 78,0 и 63,4 раз соответственно.

Такой подход позволил сохранить практически без потерь специфическую активность бактериофага и обеспечить высокую степень его очистки. Полученные концентраты клебсиеллезного бактериофага были использованы при приготовлении 20 вариантов суппозиториев с применением ряда жировых основ (Себао, витепсолы марок Н-15, \V-35) и эмульгаторов (Т-2, МГД) в различных пропорциях. Сравнение двух суппозиторных основ (Себао и витепсол) выявило значительные преимущества последнего по физическим свойствам. Была определена оптимальная доза концентрированного бактериофага в суппозиторной массе - 20 %. Установлено, что суппозитории, приготовленные на смеси витепсолов марок Н-15 и \V-35 обладали хорошими структурно - механическими свойствами, не оплавлялись в руках и практически полностью сохраняли специфическую активность в течение 1,5 лет при температуре хранения от2до8°С.

Приготовление суппозиториев с секстафагом проводили по алгоритму, разработанному для клебсиеллезного бактериофага в свечах. Для создания необходимой дозировки в лекарственной форме компоненты секстафага так же, как и клебсиеллезный бактериофаг предварительно концентрировали. Необходимо отметить, что специфическая активность концентрированных монофагов должна быть не ниже 10". При формовании свечей важную роль играет температурное воздействие на суппозиторную массу. Учитывая это, было изучено влияние различных температур в течение 1 часа на концентрированный секстафаг и суппозиторную массу. Установлено, что максимально допустимая температура процесса выливания не должна превышать 40 °С.

По разработанной технологии изготовлены экспериментально-производственные серии секстафага в суппозиториях. На секстафаг суппозитории ректальные оформлена необходимая НД (производственный регламент, проект ФСП). 3 экспериментально-производственные серии препарата вместе с документацией прошли контроль в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, получен положительный ответ. Отмечено, что специфическая активность всех компонентов секстафага в суппозиториях сохраняется в пределах нормы (не менее 10"4) в течение 1,5 лет хранения при температуре от 2 до 8°С. По остальным показателям (описание, микробиологическая чистота, средняя масса, время полной деформации, токсичность) суппозитории по истечении срока хранения соответствовали требованиям нормативной документации.

Таким образом, предложена и отработана технология изготовления суппозиториев с секстафагом, в соответствии с которой концентрат бактериофагов вводится в суппозиторную основу в жидком виде, исключая стадию лиофилизации, что значительно удешевляет производственный процесс и обеспечивает длительное сохранение специфической активности фагов.

Следующий раздел нашей работы включал изучение динамики выведения секстафага при пероральном и ректальном путях введения у здоровых людей и больных панкреонекрозом. Исследования показали, что при ректальном способе введения бактериофагов, так же как и при пероральном, происходит всасывание фагов в кровь, циркуляция в организме человека и выведение с мочой. При этом наблюдается длительная циркуляция бактериофагов в организме человека и лучшее сохранение их литической активности. Кроме того, положительными моментами ректального применения секстафага являются: отсутствие воздействия желудочного сока; насыщение венозной системы кишечника с дальнейшим поступлением препарата в общий кровоток; специфическое действие секстафага на энтеробактерии толстой кишки.

Изучена терапевтическая эффективность препарата - секстафаг суппозитории ректальные в комплексном лечении больных. Работа проведена в 2005 г. во 2-м урологическом отделении ГКБ № 2 г.Перми. В исследование было включено 22 больных острым необструктивным пиелонефритом. Пациенты были разделены на две группы: больные основной группы получали комплексную терапию, включающую секстафаг суппозитории ректальные 2 раза в день, современные антибиотики широкого спектра, дезинтоксикационную терапию; группа сравнения получала аналогичное лечение, но без суппозиториев.

У больных основной группы при проведении комплексной терапии, включающей суппозитории с секстафагом, гипертермия исчезла в среднем через 3,1+ 0,3 суток с момента начала лечения, в группе сравнения - через 5,0 + 0,4 суток. Разница статистически достоверна (Р < 0,01). У 1 (9,1%) больного группы сравнения через 14 суток отмечалось сохранение субфебрильной температуры тела. Лейкоцитоз крови снижался значительно быстрее у больных основной группы. Через 14 суток терапии все больные имели нормальное содержание лейкоцитов крови, а среднее значение лейкоцитов составило 6,0x109/л, т.е. показатель лейкоцитоза снизился на 57,7%. В группе сравнения через 2 недели у 3 пациентов (27,3%) сохранялся гиперлейкоцитоз, среднее число лейкоцитов периферической крови снизилось меньше, чем в основной группе.

Все 11 больных основной группы были выписаны на амбулаторное лечение с отсутствием лейкоцитурии и бактериурии. При этом у 8 (81,8%) больных, у которых была выявлена бактериальная флора (преимущественно кишечная палочка) со средним микробным числом 459,1x103, при контрольном посеве мочи не было обнаружено патогенной флоры. В группе сравнения к 14 суткам у 36,4% больных сохранялась лейкоцитурия, у 18,2% в посеве мочи вновь высевались бактерии со средним микробным числом 121,7х103.

В результате проведённого исследования установлено, что применение секстафага в новой лекарственной форме - суппозиториях в сочетании с антибактериальной терапией является эффективным методом лечения острого необструктивного пиелонефрита. Применение данного препарата возможно до получения результатов бактериологического исследования мочи, что выгодно отличает комплексные бактериофаги от монофагов. Таким образом, целесообразно в схему комплексной терапии острого пиелонефрита включать секстафаг суппозитории ректальные.

Материалы исследований фармакодинамики и клинической эффективности препарата секстафаг суппозитории ректальные позволяют отметить высокую антибактериальную активность в отношении условно патогенных микроорганизмов и являются предпосылкой для дальнейшего использования их в медицине.

Таким образом, в результате проведенных исследований получен комплексный фаговый препарат - секстафаг, обладающий высокой антибактериальной активность по отношению к условно патогенным микроорганизмам. На основе концентрированного секстафага создана ректальная лекарственная форма препарата - секстафаг суппозитории ректальные. Изучение фармакодинамики разных лекарственных форм секстафага показало, что ректальный способ обеспечивает длительную циркуляцию бактериофагов в организме человека. В ходе клинических исследований установлено, что применение секстафага в новой лекарственной форме - суппозиториях в сочетании с антибактериальной терапией является эффективным методом лечения острого необструктивного пиелонефрита.

127

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Функер, Елена Викторовна, Пермь

1. Адаме М. Бактериофаги/ М. Адаме М, 1961.- 527 с.

2. Азлецкая А. Е. О путях выделения бактериофага из организма / А.Е. Азлецкая // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1950. - № 11. - С. 69-71.

3. Алферова Э.В. Биологические свойства бактериофага Enterobacter и разработка научных основ получения препарата бактериофагов: Автореф. дне. .канд. биол. наук / Э.В. Алферова Уфа, 1995. - 30 с.

4. Ананьев В.Н. Использование новой лекарственной формы в лечебном процессе / В.Н. Ананьев, Ю.Т. Новиков, Е.А. Фурина и др. // Межд. науч. конф. «Фармация в XXI веке: инновации и традиции»: Тез. докл. С-Пб.: СПХФА, 1999. - С. 45-46.

5. Ангджапаридзе Т.Г. Бактериофаг у здоровых людей / Т.Г. Ангджапаридзе // Труды Тбилисского научно-исследовательского института микробиологии, эпидемиологии инфекционных болезней. Тбилиси: Мед. газ., 1962. - С. 385-386.

6. Аркадьева З.А. Промышленная микробиология: Учеб. пособие для вузов по спец. «Микробиология» и «Биология» / З.А. Аркадьева, A.M. Безбородов, И.Н. Блохина и др.; Под ред Н.С. Егорова. М.: Высш. шк., 1989. - 688 с.

7. Арсентьева В.А. Внутривенное применение больших доз бактериофага в хирургии/

8. B.А. Арсентьева // Советская медицина. 1941. - № 9. - С. 18-20.

9. Асланов Б.И. Пути рационального использования синешойных бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике / Б.И. Асланов, Р.Х. Яфаев, Л.П. Зуева // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2003. - № 5. - С. 72-76.

10. Бабаева С. Н. Специфический паратифозный В бактериофаг / С.Н. Бабаева // Вопросы эпидемиологии, профилактики и клиники кишечных инфекций. М.: Наука, 1954. - С. 177-182.

11. Бабалова Г.Г. О профилактическом значении дизентерийного сухого бактериофага / Г.Г. Бабалова, К.Т. Кацитадзе, Л.А. Сакварелидзе и др. // ЖМЭИ. 1968. - № 2.1. C. 143-145.

12. Бактериофаготерапия урологических инфекций // Метод, рек. № 96/53. -М.: Минздравмедпром РФ, 1996. 7 с.

13. Белоусов Ю.Б. Клиническая фармакология и фармакотерапия / Ю.Б. Белоусов, B.C. Моисеев, В.К. Лепахин. М.: Универсум, 1993. - С. 280-293.

14. Боговазова Г.Г. Иммунобиологические свойства и терапевтическая эффективность препаратов бактериофагов клебсиелл / Г.Г. Боговазова, H.H. Ворошилова, В.М. Бондаренко и др. // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1992. -№3.- С. 30-33.

15. Боговазова Г.Г. Эффективность бактериофага Klebsiella pneumoniae при терапии экспериментальной клебсиеллезной инфекции / Г.Г. Боговазова, H.H. Ворошилова, В.М. Бондаренко // Журн. микробиол. -1991. № 4. - С. 5-8.

16. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно патогенных бактериях/ В.М. Бондаренко// Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1997.-№4.-С. 20-26.

17. Бродинова Н.С. Влияние биопрепаратов на состав микрофлоры при кишечных и урогенитальных инфекциях / Н.С. Бродинова, Л.Н. Мазанкова, О.В. Ерилова и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 1998. - № 9. - С.10.

18. Бухарин О. В. Персистенция патогенных бактерий/ О.В. Бухарин. М.: Медицина,1999.-367 с.

19. Вартапетов А. Я. Бактериофагия глубоких форм стрептодермий / АЛ. Вартапетов // Сб. тр. межинст. конфер. по проблеме бактериофагии, созванной в Тбилиси при институте вакцин и сывороток. Тбилиси, 1959. - С. 77-78.

20. Виноградова И.Н. Производственные питательные среды/ И.Н. Виноградова// Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. -М.: Медицина, 1964. т. 1. - С. 339-384.

21. Ворошилова H.H. Научные основы и разработка технологий производства препаратов бактериофагов Shigella и Klebsiella: Автореферат дне. .д-ра мед. наук / H.H. Ворошилова. Москва, 1992. - 53 с.

22. Габриэлян Н.И. Чувствительность нозокомиальной микрофлоры, циркулирующей в трансплантационной клинике, к лечебным бактериофагам / Н.И. Габриэлян, Е.М. Горская, Т.С. Спирина и др. // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2004.-№6.-С. 6-10.

23. Гаевская Н.Е. Характеристика умеренных фагов, выделенных из атоксигенных штаммов холерных вибрионов эльтор, изолированных от людей / Н.Е. Гаевская // Пробл. особо опас. инфекций. 2005. - № 2. - С. 40-43.

24. Гамалея Н.Ф. Бактериолизины ферменты, разрушающие бактерии / Н.Ф. Гамалея //Русский архив патологии, клинической медицины и бактериологии. - 1898. - № 6. -С. 607-613.

25. Георгадзе И.И. Получение и использование нового комбинированного биологического препарата «Интерфаг» / И.И. Георгадзе, Н.В. Топурия, Л.Г. Ткемаладзе//Мед. нов. Грузии. 1997. - № 10. - С. 12-16.

26. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. / С. Гланц. Москва: Практика, 1999.-459 с.

27. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. / Б. Глик, Дж. Пастернак.- М.: Мир, 2002. 589 с.

28. Голубева И.В. Энтеробактерии: (Руководство для врачей) / И.В. Голубева, В.А. Килесо, Б.С. Киселева и др. Под редакцией В.И. Покровского. М.: Медицина, 1985.-321 с.

29. Гольдфарб Д.М. Адсорбция фага на бактериальной клетке / Д.М. Гольдфарб // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1958. - № 5. - С. 64-69.

30. Государственная Фармакопея СССР. Вып. 2. — 11-е изд., доп. Москва: Медицина, 1990.-400 с.

31. Д Эрелль. Бактериофаг / Д Эрелль. Гос. Изд., 1926.- 222 с.

32. Давидов М.И. Первый опыт применения бактериофагов / М.И. Давидов,

33. B.Б. Веретенников // Пленум Российского общества урологов: Материалы. М., 2000.-С. 64-65.

34. Дарбеева О.С. Опыт использования адаптированных препаратов бактериофагов / О.С. Дарбеева, JI.M. Майская, Т.С. Перепанова // Биопрепараты.- 2002.- № 1.1. C. 13-17.

35. Дарбеева О.С. Современная ситуация в области производства и применения лечебно-профилактических бактериофагов// О.С. Дарбеева, JI.M. Майская,г

36. PJL Парфешок и др.// Вакцинолошя 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Матер. Всеросс. науч.- практич. конфер. Москва, 2006-С. 39.

37. Дарсавелидзе М. Разработка и создание нового лечебно-профилактического поливалентного препарата энтеробактериофага против кишечных инфекций/ М. Дарсавелидзе, Т. Чанишвили, Т. Габсиония и др. // Кутаис. мед. журнал. 1999. -№ 1-2. - С. 161-164.

38. Дарсавелидзе М.А. Характеристика донорспецифических РНК-содержащих бактериофагов Escherichia coli / М.А. Дарсавелидзе, Т.Г. Чанишвили // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - № 2. - С. 86-88.

39. Домникова Н.П. Частота выделения и антибиотикочувствительность грамотрицательной микрофлоры у пациентов с гемобластозами / Н.П. Домникова, Е.В. Брякотнина, В.Н. Ильина // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2004.-№3.-С. 3-6.

40. Ермаков Е.В. Об эффективности бактериофагов в лечении неспецифических заболеваний легких / Е.В. Ермаков, В.Г. Новожилов, В.А. Кирилова и др.// Сов. мед. -1984.-№2.-С. 37-39.

41. Ермольева З.В. Фаготерапия / З.В. Ермольева, О.И. Шевякова // Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. М.: Медицина, 1964. - т. 4. - С. 202-211.

42. Желудева И.В. Обоснование выбора бактериофагов для лечения воспалительных заболеваний пародонта / И.В. Желудева, E.JI. Жиленков, JI.H. Максимовская и др. // Пародонтолошя. 2002. - № 1-2. - С. 46-50.

43. Жиленков Е.Л. Совершенствование методов конструирования бактериофагов для лечения лор-патологии / Е.Л. Жиленков, Д.В. Попов, В.М. Попова и др. // Биопрепараты. 2002. - № 2. - С. 2-6.

44. Жуков-Вережников Н. Н. О сущности и значении бактериофагии. Сообщение 8-е. Новые доводы в пользу герменативной теории бактериофагии / H.H. Жуков-Вережников // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1947. - № 2. -С. 48-52.

45. Жуков-Вережников H.H. К вопросу о сущности и значении бактериофагии. Сообщение 5-е. Значение феномена д'Эрель для изучения биологии бактерий /, H.H. Жуков-Вережников // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1936. -т. 17,№4.-С. 571-580.

46. Заева С. П. Анаэробные бактериофаги/ С. П. Заева. М., 1945. - 89 с.

47. Заривчацкий М.Ф. Бактериофаги в комплексном лечении больных с пюйно-сепшческими заболеваниями в хирургии/ М.Ф. Заривчацкий, Л.П. Механошина, И.Н. Мугатаров//Terra medica. 1999. - С. 13-14.

48. Захарова Ю.А. Использование препаратов бактериофагов у беременных с пиелонефритом: Автореф. дискшщ. мед. наук/Ю А. Захарова-Пермь, 2004-20с.

49. Зуев В.А. Литическая активность бактериальных вирусов / В.А.Зуев. М., 1969. -184 с.

50. Зыкова Л. С. Факторы персистенции уропатогенов в диагностике, прогнозировании и лечении пиелонефрита у детей: Дис. .д-ра мед. наук / Л.С.Зыкова Оренбург, 1998.-394с.

51. Иванов A.B. Клиническое применение бактериофагов (практическое руководство) / A.B. Иванов. С-Пб.: Петрохимфарм, 2000.-41 с.

52. Казарновская С.С. Бактериофагия / С.С. Казарновская. Л.: Изд-во АН СССР, 1932.116 с.

53. Канорский И.Д. Течение раневого процесса на фоне фаготерапии хронического остеомиелита/ И.Д. Канорский, А.Г. Ханин, З.Ф. Василькова и др. // Хирургия. -1977.-№ 1.-С.61-65.

54. Карбахш М. Мембранные процессы в медицине и биотехнологии/ М. Карбахш, X. Перль// Журнал Всес. хим. общ. 1987. - Т.32. - № 6. - С. 669-673.

55. Квеситадзе И.Ф. Установление сроков появления в крови антител при разных методах дачи фага/ И.Ф. Квеситадзе, И.Ф. Михайлова // Журнал микробиол., эшщемиол. и иммунобиол. 1957. - №1. - С. 99-104.

56. Кисина В.И. Фаготерапия воспалительных урогенитальных заболеваний у женщин/ В.И. Кисина, Т.С. Перепанова, К.И. Забиров и др. // Вестник дерматологии и венерологии. 1996. - № 5. - С. 75.

57. Козлова Н.Г. Некоторые особенности создания лекарственных средств в форме суппозиториев / Н.Г. Козлова, Е.Е. Замараева, Л.И. Драник // Фармация. 1992. -№6.-С. 80-82.

58. Кокин Г.А. Фаготерапия и фагопрофилактика газовой гангрены / Г.А. Кокин // Военная медицина в Великую Отечественную войну. М., 1946. - Т. 3. - С. 56-63.

59. Кондратьева Т.С. Биофармацевтические исследования детских суппозиториев с фосфотиамином / Т.С. Кондратьева, Н.Г. Преферанская, Г.П. Матюшина, О.Н. Кондратьева//Фармация. 1990. -№ 5. - С. 14-17.f75,76,77,78,79,8081,82

Информация о работе

Функер, Елена Викторовна
кандидата биологических наук
Пермь, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Микробиологические и технологические аспекты разработки комплексного препарата бактериофагов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы