Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Детекция бактерий рода Azospirillum с помощью бактериофагов, выделенных из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Детекция бактерий рода Azospirillum с помощью бактериофагов, выделенных из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75"

На правах рукописи

ооьи^о"—

Караваева Ольга Александровна

Детекция бактерий рода АгоъртИит с помощью бактериофагов, выделенных из АгоартИит ЪгаьИете штаммов Бр7 и 8К75

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнология) 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2012

ійнв ?ііі;-.

005048057

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научные руководители: доктор биологических наук, доцент

Гулий Ольга Ивановна доктор биологических наук, профессор Игнатов Олег Владимирович

Официальные оппоненты: Золотухин Сергей Николаевич

доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П. А. Столыпина профессор кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы

Ксенофонтова Оксана Юрьевна

кандидат биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» доцент кафедры микробиологии и физиологии растений

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН).

Защита состоится «25» декабря 2012 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ».

Автореферат диссертации разослан ноября 2012 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл. 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из актуальных проблем современной биотехнологии является разработка новых подходов для детекции бактерий с помощью бактериофагов (Schofield, Sharp, Westwater, 2012; Smartt et al., 2012; Wang, Ye, Ying, 2012). Этому вопросу посвящено сравнительно большое количество научных статей, однако, развитию методов детекции почвенных микроорганизмов, уделяется недостаточное внимание, хотя роль этих микроорганизмов весьма значительна как для развития фундаментальных исследований, так и для современной сельскохозяйственной биотехнологии.

Важную роль в процессах азотфиксации играют грамотрицательные рост-стимулирующие бактерии рода Azospirillum. Впервые эти бактерии были выделены в Нидерландах более 80-ти лет назад (Beijerinck, 1925), однако в сферу интенсивного изучения попали после опубликования работы «Ассоциативный симбиоз у тропических трав...» (Dôbereiner, Day, 1976), став одним из наиболее интенсивно исследуемых ассоциативных партнеров растений (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000; Bashan, Holguin, de-Bashan, 2004). Среди азоспиршш наибольшее внимание исследователей привлекает вид Azospirillum brasilense как модельный объект при изучении ассоциативных и эндофитных ризосимбиозов. образуемых бактериями и высшими растениями (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000; Bashan, Holguin, de-Bashan, 2004; Мулюкин и др., 2009). Эти ризобактерии могут способствовать развитию растений как непосредственно (азотфиксация, гормональный эффект, улучшение минерального и водного питания растений), так и опосредованно, путем подавления развития бактериальных патогенов. В последнее время азоспириллы рассматриваются как перспективный компонент консорциума ризобактерий для инокуляции в качестве компонентов бактериальных удобрений (Чернова, Бурыгин, 2008).

Прогресс в исследован™ азоспирилл в качестве экологически безопасных стимуляторов роста растений в значительной степени зависит от развития быстрых и надежных способов определения данных микроорганизмов в почве. Кроме того, значительный интерес при исследовании собственно феномена ассоциативной микрофлоры представляет изучение их сезонных колебаний, а также изменения их численности, вызванные антропогенными воздействиями. В целом, развитие подходов, позволяющих осуществлять мониторинг состава ризосферных бактерий, представляется одной из актуальных задач современной экологической микробиологии (Красов, 2009).

Бактериофаги представляют собой наиболее многочисленную, широко распространенную в биосфере и, предположительно, наиболее эволюционно древнюю группу вирусов (Фильчиков и др., 2009). Бактериофаги широко распространены в природе и выполняют важную роль в контроле численности микробных популяций, в автолизе стареющих клеток, в переносе бактериальных генов, выступая в качестве векторных «систем» (Шестаков, 2007), они представляют собой один из основных подвижных генетических

элементов. Несмотря на то, что история изучения и использования бактериофагов имеет много десятилетий, бактериофаги почвенных микроорганизмов изучены мало, хотя их роль в контроле численности бактерий и способствовании переносу генов весьма значительна (Воуег й а1., 2008).

Перспективным направлением дальнейших исследований по изучению ассоциативных и эндофитных ризосимбиозов, образуемых бактериями и высшими растениями, является выделение и изучение бактериофагов почвенных микроорганизмов, в том числе бактериофагов АгояртПит ЬгайИепзе, а также разработка новых методов индикации почвенных бактерий с помощью бактериофагов.

Цель работы - выделение и изучение бактериофагов из АгозртЫит ЬгазИеже штаммов Йр7 и 81175, и их применение для детекции бактерий рода АгозртИит с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.

Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:

1. Выделить бактериофаги из А. ЬгавНеюе штаммов 8р7 и 81175 и изучить их биологические свойства.

2. Исследовать изменения электрооптических параметров микробных суспензий различных штаммов А. ЬгазИете при их инфицировании бактериофагами из А. Ьга$Иете штаммов 8р7 и 81175.

3. Изучить возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для определения спектра литического действия бактериофагов на примере бактерий рода АгозртИит.

4. Использовать метод электроакустического анализа клеточных суспензий для детекции клеток АгоэртПит при их инфицировании специфическими бактериофагами.

5. Исследовать возможность применения миниантител, специфичных к липополисахариду и флагеллину А. brasilen.se 8р245, для детекции бактерий с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.

Научная новизна работы.

Из микробных клеток А. ЬгазИете штаммов Эр7 и 8Я75 с использованием индуцирующего фактора - низкой температуры выделены бактериофаги ФАЬ-8р7 и ФАЬ-8К75. У клеток А. Ъгавйете штаммов Эр7 и 81175 обнаружено явление лизогении. Представлена характеристика выделенных бактериофагов и определено их таксономическое положение, они относятся к семейству Ройгжтйае.

Впервые выделенные бактериофаги были использованы для детекции бактериальных клеток А. ЪгазИете штаммов Бр7 и 81175 с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий. На примере микробных клеток А. ЬгаяИете штаммов 8р7 и 8(175 показано, что с помощью измерения ориентационных спектров микробных суспензий возможно определение спектра литической активности и специфичности действия бактериофагов.

Впервые применены миниантитела для детекции бактерий A. brasilense Sp245 с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа клеточных суспензий. Установлено, что взаимодействие миниантител с бактериальными клетками A. brasilense Sp245 приводит к изменению электрооптических параметров микробной суспензии и изменению величины значения электрического импеданса.

Практическая значимость работы.

Выделение и изучение бактериофагов из клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 открывает перспективы для их использования при разработке высокочувствительных и ускоренных методов детекции гомологичных бактериофагам бактерий.

Материалы, представленные в диссертации, используются при чтении лекций по биотехнологии и микробиологии для студентов и аспирантов в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.И. Вавилова» и ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У микробных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 выявлено явление лизогении. Использование индуцирующего фактора — низкой температуры позволяет выделять бактериофаги из A. brasilense штаммов Sp7 и SR75.

2. Изменения электрооптических параметров микробных суспензий при их инфицировании специфическими бактериофагами позволяют определять литическую активность бактериофагов.

3. Изменения элекгрооптических и электроакустических свойств микробных суспензий азоспирилл при их инфицировании специфическими бактериофагами применимы для детекции клеток азоспирилл.

4. Методы электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий позволяют проводить детекцию бактерий с применением миниаитител.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на: 13-ой, 14-ой и 16-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009; 2010; 2012); 5-ой и 6-ой Всероссийских конференциях молодых ученных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010; 2012); 6-ой и 8-ой Молодежных школах-конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010; 2012); III Региональной научной конференции «Исследование молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2011); 6-ом Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); European Congress of clinical microbiology and infectious disease (London, 2012); IV Съезде биофизиков России. Симпозиуме IV «Новые

тенденции и методы в биофизике» (Нижний Новгород, 2012); Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012).

Работа выполнена в лаборатории физиологии микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) в соответствии с плановыми темами НИР «Исследование электрофизических свойств микробных клеток при их инфицировании бактериофагами» 2009-2012 гг. (№ гос. регистрации 01200904393, научный руководитель зав. лаб. д.б.н., профессор Игнатов О.В).

Работа поддержана грантами РФФИ №09-02-12442-офи_м, президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых - докторов наук МД-57.2008.4 (2008-2009 гг.), а также Госконтрактом с СФИРЭ им. В.А. Котельникова РАН, г. Саратов от 05 октября 2009 г. и Госконтраюгом с СФИРЭ им. В.А. Котельникова РАН, г. Саратов от 29 июня 2010 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 20 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей объекты, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников, состоящего из 215 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 173 страницах компьютерного текста, включающего 36 рисунков и 13 таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. В работе использовали микроорганизмы A. brasilense штаммов Sp7, Cd, Spl07, Sp245, Jm6B2, Br 14, KR77, S17, S27, SR55, SR65, SR75, A. amazonense Aml4, A. halopraeferans Au4, A. irakense штаммов KBC1, KA3, A. lipoferum штаммов Sp59b, RG20a, Escherichia coli штаммов B-878, XL-1, из коллекции культур Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) (Саратов). Микроорганизмы хранились при +4°С на чашках Петри с картофельным агаром (3%) и пересевались каждые 2 недели.

Условия культивирования микробных клеток: культуры бактерий выращивали в 250 мл колбах Эрленмейера на жидкой среде LB (Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989) - следующего состава (г/л): NaCl (Becton, Dickinson and Company, Франция) - 10,0, пептон (Becton, Dickinson and Company, Франция) -5,0, дрожжевой экстракт (DIFCO, США) - 5,0. Инкубирование клеток осуществляли на круговой качалке при интенсивности перемешивания 160 об/мин при температуре 30±1 °С в течение 18-20 ч.

Методы. В ходе выполнения работы применяли традиционные методы культивирования микроорганизмов на питательных средах (Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984). Выделение бактериофагов проводили методами, предложенными (Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984). Изучение биологических свойств полученных бактериофагов осуществляли методами, предложенными: (Адаме, 1961; Гольдфарб, 1961; Габрилович, 1968: Ганюшкин, 1988; Пожарникова, 2006; Григорьева, Кузин, Азизбекян, 2007; Васильев и др., 2011). Инфицирование клеток бактериофагом проводили согласно (Bunin et al., 2004b). Изучение электрооптических параметров суспензий клеток Л. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с использованием выделенных бактериофагов проводили согласно методике (Bunin et al., 2004b). Исследование электроакустических параметров суспензий клеток Л. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с применением выделенных бактериофагов осуществляли в соответствии с (Зайцев и др., 2011). Селекцию бактериофагов, несущих антитела к целым клеткам, проводили согласно (Charlton et al., 2000). Специфичность и чувствительность выделенных бактериофагов определяли методом дот-анализа (Дыкман, Богатырев, 1997). Титр сыворотки определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа по общепринятой методике (Beatty, Beatty, Vlahos, 1987). Исследование электрооптических параметров суспензии клеток A. brasilense Sp245 при взаимодействии с различным количеством миниантител (миниАт), специфичных к липополисахариду (ЛПС) и флагеллину клеток A. brasilense Sp245, проводили согласно методике (Гулий и др., 2010). Изучение электроакустичеких параметров суспензии клеток A. brasilense Sp245 при взаимодействии с разным количеством миниАт, специфичных к ЛПС клеток A. brasilense Sp245, по методу (Зайцев и др., 2011).

Кривые на рисунках строились по средним значениям, полученным в результате не менее 5 повторностей. Статистическую обработку результатов измерений проводили стандартным методом (Чарыков, 1984; Лакин, 1990). Для статистической обработки экспериментальных данных также использовали пакет прикладных программ Microsoft Excel 2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение бактериофагов из клеток бактерий Azospirilum brasilense штаммов Sp7 и SR75

Для выполнения исследований изучали возможность выделения бактериофагов из клеток Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75. Для этого предварительно исследовали штаммы на наличие в них профага. Результаты исследований свидетельствуют, что культуры A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 в опытах по выделению бактериофагов без воздействия на них индуцирующего фактора не проявили лизогенных свойств. Во второй серии опытов на культуры A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 воздействовали индуцирующим фактором -низкой температурой, как описано в работах (Лурия, Дарнелл, 1970; Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984). В результате были выделены бактериофаги из клеток

А. ЬгайЫпъе штаммов Бр7 - ФАЬ-Эр7 и 81175 - ФАЬ-8Я75 и изучены их биологические свойства. Таким образом, у исследованных культур А. ЬгоэИете штаммов 8р7 и 81175 показано явление лизогении.

Характеристика бактериофагов, выделенных из клеток бактерий А. ЬгюИеме вр7 и 81*75

Морфология негативных колоний

Для определения морфологии негативных колоний высевали исследуемые бактериофаги в разведении 10'7-10"9 на чашки Петри методом агаровых слоев по методу Грациа (Адаме, 1961; Мурадов и др., 1990; Григорьева, Кузин, Азизбекян, 2007). Для формирования газона на поверхности агара использовали клетки штаммов Бр7 и 81175, для каждого выделенного бактериофага, соответственно. Посевы культивировали в термостате при температуре 32°С. Изучение морфологии негативных колоний проводили через 24 часа. Было показано, что бактериофаг ФАЬ-8р7 на газоне индикаторного штамма Бр7 образует округлые, с ровным четким краем, прозрачные негативные колонии одного типа диаметром от 0,1 до 0,2 см. Бактериофаг ФАЬ-8Я75 на газоне индикаторного штамма 81175 образует прозрачные, овальные (вытянутые) негативные колонии, с ровньм нечетким краем, диаметром 0,3-0,5 см. Анализ выращенных культур после длительного культивирования (до 5 суток) показал, что пятна остаются прозрачными.

Литическая активность бактериофагов, выделенных из А. ЪгаъИепие Бр7 и 81175

Литическая активность бактериофагов оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры и выражается степенью максимального разведения, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки активности бактериофага является определение количества активных корпускул бактериофага в единице объема. Активность бактериофага ФАЬ-8р7 варьировала от 2x105 до 1,6x10 корпускул в 1 мл, а бактериофага ФАЬ-8Ы75 - от 3,5х105 до 7,8x10й корпускул в 1 мл.

Спектр литической активности бактериофагов, выделенных из А. ЪгавИете 8р7 и 81*75

К основным биологическим свойствам бактериофага, имеющим важное практическое и теоретическое значение, относится диапазон литической активности - спектр лизиса гомологичных бактериофагу бактерий по серологической группе. Определение спектра литической активности проводили методом нанесения капель бактериофага на газон изучаемой

культуры, как описано (Адаме, 1961; Ганюшкин, 1988). Изучение спектра литической активности бактериофагов ФАЬ-8р7 и ФАЬ-5Я75 определяли по отношению к 18 штаммам бактерий рода АгоярігШит: А. атагопете Ат14, А. ЪгшПеюе штаммов Зр7, СсЗ, БрШ, 8р245, М6В2, Вг14, КЯ77, Б17, Б27, 81155, 8Я65 Б¡175, А. Ііаіоргае/егапї Аи4, А. ігакеюе КВС1, КАЗ, А. Нро/егит штаммов 8р59Ь и 1Ш20а. Результат считали положительным, если на месте нанесения бактериофага на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов, и, соответственно, результат считали отрицательным при отсутствии лизиса. Результаты исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Сравнение данных по определению спектра литической активности бактериофагов ФАЬ-8р7 и ФАЬ-8Я75 на газоне индикаторных культур бактерий рода Агозрігіїїит и результатов, полученных с помощью метода электрооптического анализа микробных суспензий

Индикаторные штаммы Действие бактериофага

®Ab-Sp7 ®Ab-SR75

Метод «стекаю щая капля» Метод пгл У V анализа Метод «стекаю щая капля» Метод анализа

А. amazonense Аш14 + + + +

А. brasilense Sp7 + + - -

А. brasilense Cd + + - -

А. brasilense Spl07 + + - -

A. brasilense Sp245 - - - -

A. brasilense Jm6B2 - - + +

A. brasilense Brl4 + + + +

A. brasilense KR77 + + - -

A. brasilense S17 - - - -

A. brasilense S27 + + + +

A. brasilense SR55 + + + +

A. brasilense SR65 + + + +

A. brasilense SR75 - - + +

A. halopraeferans Au4 + + ■ - -

A. irakense KBC1 + + + +

A. irakense KA3 + + + +

A. lipoferum Sp59b - - - -

A. lipoferum RG20a - - + +

Примечание: «+»- наличие лизиса бактериальной культуры;

«-»- отсутствие лизиса бактериальной культуры.

Наряду с традиционными микробиологическими методами в последнее время активное внимание исследователей обращено на создание новых методов определения спектра литической активности бактериофагов, основанных на биосенсорных системах и регистрирующих взаимодействие инфекционных агентов с клетками-мишенями (Schmelcher, Loessner, 2008; Ripp, 2010). Была изучена возможность определения литической активности бактериофагов с помощью метода электрооптического (ЭО) анализа микробных суспензий на примере бактериофагов <5Ab-Sp7 и OAb-SR75. Методы ЭО анализа микробных суспензий основаны на регистрации изменения оптических свойств микробной суспензии под влиянием переменного электрического поля. При воздействии на бактериальные клетки антителами (Bunin et al., 2004а) и вирусами (Bunin et al., 2004b) происходит изменение ЭО параметров бактериальных суспензий. И наоборот, если вещество или частица присутствует в среде роста, но не взаимодействует с клетками, изменения величины ЭО параметров не происходит (Гулий, 2006; Гулий и др., 2008; Bunin et al., 2004а,b). Измеряя интенсивность рассеянного или прошедшего света, можно количественно охарактеризовать степень пространственной упорядоченности клеток и их электрофизические параметры (Ignatov, Guliy, Bunin, 2008). Спектр литического действия бактериофагов i>Ab-Sp7 и <I>Ab-SR75 проверяли по отношению к 18 штаммам бактерий рода Azospirillum: A. amazonense Aml4, A. brasilense нггаммов Sp7, Cd, Spl07, Sp245, Jm6B2, Brl4, KR77, SI7, S27, SR55, SR65, SR75, A. halopraeferans Au4, A. irakense KBC1, KA3, A. lipoferum штаммов Sp59b и RG20a. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Сравнительное исследование двух подходов определения спектра литического действия бактериофагов <I>Ab-Sp7 и <PAb-SR75 с помощью метода «стекающая капля» и метода ЭО анализа микробных суспензий показывает полное совпадение полученных результатов.

Таким образом, впервые показана возможность использования метода ЭО анализа микробных суспензий для определения литической активности бактериофагов. Полученные результаты в последующем могут быть использованы для развития нового метода определения специфичности действия бактериофагов в отношении микробных клеток.

Специфичность бактериофагов, выделенных из A. brasilense Sp7 и SR75

Необходимым условием для применения бактериофагов в микробиологических целях является отсутствие литического действия в отношении гетерологичных бактерий (специфичность). В качестве гетерологичных культур использовали бактерии родов Escherichia, Pseudomonas, Acinetobacter. Установлено, что изучаемые бактериофаги не вызывали лизис ни одной из испытуемых культур других видов бактерий. На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что бактериофаги <3>Ab-Sp7 и <DAb-SR75 не активны в отношении бактерий гетерологичных родов.

Температурная устойчивость бактериофагов, выделенных из А. Ьг^Пете штаммов вр7 и 81*75

Для изучения температурной устойчивости бактериофагов ФАЬ-Бр7 и ФАЬ-8Я75 подвергались воздействию высокой температуры от +50 до +90°С с шаговым интервалом в 10°С, при этом время воздействия составляло 30 мин (Адаме, 1961; Васильев и др., 2011). Устойчивость бактериофагов определяли посредством высева бактериальной культуры штаммов Бр7 и 51175, смешанной с суспензией соответствующего бактериофага ФАЬ-Бр7 или ФАЪ-8Я75, методом двухслойного агара. В результате было показано, что прогревание бактериофагов ФАЬ-Бр7 и ФАЬ-8Я75 до +60°С не оказало существенного влияния на активность бактериофагов (табл. 2). Дальнейшее повышение температуры приводило к незначительной потере активности бактериофагов.

Таблица 2 - Температурная устойчивость бактериофагов ФАЬ-8р7 и ФАЬ-81175

Активность бактериофага после

Температурный температурной обработки, количество

режим, °С активных корпускул в 1 мл

ФАЬ-Бр7 ФАЬ-8Я75

50 и,бхш'

60 7,3x108 8,7x10'

70 5,9х107 1,4x107

80 6,6x10" 7,6х 106

90 3,2хЮ5 бДхЮ6

Контроль активности бактериофага 1,7хЮ9 1ДхЮ8

Таким образом, можно сделать вывод, что изучаемые бактериофаги ФАЬ-8р7 и ФАЬ-8И75 являются термостабильными.

Устойчивость бактериофагов, выделенных из А. brasilen.se Бр7 и 81175, к воздействию хлороформа

На следующем этапе изучали влияние хлороформа на активность бактериофагов ФАЬ-Бр? и ФАЬ-8Я75. Для этого бактериофаги обрабатывали хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном перемешивании. При этом время воздействия хлороформа составляло 10, 20, 30 и 40 мин. После чего определяли активность фаголизата исследуемых бактериофагов методом агаровых слоев.

Изучаемые бактериофаги проявили высокую устойчивость к воздействию хлороформа, таким образом, возможно использование хлороформа для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий.

Устойчивость бактериофагов, выделенных из клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75, к воздействию разных значений pH

Для изучения влияния разных значений pH буферного раствора на активность бактериофагов <J>Ab-Sp7 и <t>Ab-SR75 использовали ТЕ буферный раствор (ЮмМ TrisHCl, 1мМ ЭДТА) со значениями pH: 5,5; 6,5; 8,5; 9,5, при этом время воздействия буферного раствора составляло 18-20 ч. Далее определяли активность исследуемого бактериофага методом Грациа.

Показано, что щелочная и кислая среда буферного раствора незначительно влияли на снижение активности изучаемых бактериофагов. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что бактериофаги <PAb-Sp7 и OAb-SR75 обладают высокой устойчивостью к щелочной и кислой среде буферного раствора.

Активность бактериофагов, выделенных из клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR7S, при хранении

Изучаемые бактериофаги хранили в ТЕ-буферном растворе (pH 7,5) при температуре -4°С и проверяли способность лизировать индикаторную культуру бактерий штаммов Sp7 и SR75 методом Грациа 1 раз в месяц на протяжении 11 месяцев. В результате проведенных исследований было показано, что бактериофаги OAb-Sp7 и OAb-SR75 сохраняют активность в течение 10 месяцев, при этом титр бактериофага <DAb-Sp7 за этот период снижался от 5,2х 108 до 6,5х 106 фаговых частиц/мл, а бактериофаг <DAb-SR75 - от 2,4* 108 до 7,ЗхЮ6 фаговых частиц/мл.

Морфология фаговых частиц бактериофагов, выделенных из клеток A. brasilense Sp7 и SR75, изученная с помощью электронной микроскопии

Для определения систематического положения выделенного бактериофага проводилось его электронно-микроскопическое исследование. Контрастирование осуществляли 1% уранилацетатом в течение 5 мин. Исследования проводили на просвечивающем электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss, Германия).

В результате проведенных исследований было установлено, что вирусные частицы бактериофага ФАЬ-Бр7 имеют изометрическую головку размером около 27 нм и хвостовой отросток размером около 16 нм. Вирусные частицы бактериофага <I>Ab-SR75 состоят из изометрической головки размером около 23 нм и хвостового отростка размером около 17 нм.

В соответствии с морфологическими параметрами, бактериофаги OAb-Sp7 и <DAb-SR75, согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Podoviridae (Ackermann, 2007), а по классификации A.C. Тихоненко - ко II' морфологической группе: «Фаги с аналогом отростка» (Тихоненко, 1968).

Использование бактериофагов для детекции микробных клеток ЛгоьртИит ЪгаъИете с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий

Изучалась возможность использования выделенных бактериофагов для детекции клеток азоспирилл с помощью метода ЭО анализа клеточных суспензий.

Первоначально проводилась оптимизация условий измерения ЭО параметров суспензии клеток А. ЪгавИете штаммов Бр7 и 81175, которая включала в себя напряженность электрического поля 17 В/см при времени приложения электрического поля 16 сек и проведение измерений на частотах 740, 1000, 1450, 2000 и 2800 кГц. Электропроводность воды во всех случаях составляла 1,6 цБ/т. В предварительных экспериментах было показано, что изменение величины ЭО сигнала происходит при внесении бактериофага из расчета 20 бактериофагов на 1 бактерию, поэтому мы использовали те же условия.

Далее изучали динамику изменений величины ЭО сигнала суспензии клеток А. ЬгаяПепзе Бр7 и А. Ьгазйепэе 8И75 при их инфицировании бактериофагами ФАЬ-8р7 и ФАЬ-8Б175. Для этого в суспензию клеток А. ЬгазПепзе 8р7 и А. ЬгазИепэе БЯ75 ПО8 клеток/мл) вносили соответствующий бактериофаг, затем проводили инкубацию при температуре 37°С в течение 1,5, ] 0, 20 и 30 минут. При инфицировании клеток А. ЬгазПете штаммов Бр7 (рис. 1 (А)) и БЯ75 (рис. 1 (Б)) соответствующими бактериофагами наблюдалось изменение величины ЭО сигнала уже через 1 мин от начала инфекции, что, вероятно, связано с адсорбцией бактериофага на поверхности клетки. Следует отметить, что изменения величины ЭО сигнала суспензий клеток А. ЬгазИете штаммов 8р7 и ЭЯ75 после 5, 10, 20 и 30 мин от начала инфекции клеток бактериофагом фиксировались в пределах 5%.

100 1000 10000 100 1000 10000 Цктога, «Гц Чктога. ьГи

Рис. 1. Динамика изменений ОС суспензии клеток А. ЬгазИете Бр7 (А) при добавлении бактериофага ФАЬ-8р7 и суспензии клеток А. brasilen.se 8К.75 (Б) при добавлении бактериофага ФАЬ-8Я75 из расчета 20 бактериофагов на 1 бактерию: (1) - контроль - суспензия клеток без добавления бакгериофагов; время от начала инфекции: (2) -1 мин; (3) - 5 мин; (4) -10 мин; (5) -20 мин; (6) - 30 мин

Одним из важных параметров при развитии нового метода детекции клеток является определение минимального количества детектируемых клеток. Поэтому проводили измерения при количестве клеток в ячейке 10 , 10 и 10 клеток/мл. Установлено, что предел детекции микробных клеток А. Ьгазйепэе штаммов Бр7 (рис. 2 (А)) и 5Я75 (рис. 2 (Б)) при их инфекции бактериофагами ФАЪ-8р7 и ФАЬ-8Я75 с помощью метода электрооптического анализа микробных суспензий составляет 104 клеток/мл.

ЮООО 100

Рис. 2. Изменение величины ЭО сигнала суспензии клеток А. brasilense Sp7 (А) ппи их инЛекпии йактепиогЬагом ФАЬ-8п7 и А. brasilense SR75 ("Б) пои их

--,--- - - - X 1 А I А 4 ' * 4

инфекции бактериофагом ФАЬ-8Я75. Количество клеток в ячейке - 10 клеток/мл. (1) - контроль - суспензия клеток без добавления бактериофагов; (2) - суспензия клеток с добавлением бактериофагов

Важным этапов в развитии метода детекции клеток является получение аналитического сигнала при наличии мешающих факторов и, прежде всего, в присутствии посторонней микрофлоры. Поэтому нами проводились измерения ЭО параметров суспензии клеток А. brasilense штаммов Sp7 и SR75 при их инфекции бактериофагами ФАЬ-8р7 и ФАЬ-8Я75, соответственно, в присутствии клеток Е. coli штаммов В-878 и XL-1.

Для этого к смешанной суспензии А. brasilense Sp7, Е. coli В-878 и Е. coli XL-1 и смешанной суспензии А. brasilense SR75, Е. coli В-878 и Е. coli XL-1 (количество клеток в измерительной ячейке 104 клеток/мл, взятых в равном соотношении (1:1:1), вносили определенный бактериофаг. В качестве контроля использовалась смешанная суспензия А. brasilense Sp7, Е. coli В-878 и Е. coli XL-1 без внесения бактериофага. В результате было показано, что при инфекции клеток А. brasilense штамма Sp7 бактериофагом ФАЬ-Эр7 (рис. 3 (А)) и клеток штамма SR75 бактериофагом ®Ab-SR75 (рис. 3 (Б)) в присутствии клеток Е. coli В-878 и Е. coli XL-1, происходит значительное снижение величины ЭО сигнала.

Дополнительно проводились контрольные эксперименты по изучению неспецифического взаимодействия бактериофагов OAb-Sp7 и ®Ab-SR75 с клетками Е. coli штаммов В-878 и XL-1, при этом было показано, что изучаемые бактериофаги не инфицируют клетки Е. coli штаммов В-878 и XL-1.

гН-Ц

JOOO Частота, кГц

400 350

5

І 300 І

з 250

і200

1 150 £

Д 100

о

50 0

*****

1000 Частота, кГц

Рис. 3. (А) Изменение величины ЭО сигнала смешанной суспензии клеток Е. coli В-878 + Е. coli XL-1 + A. brasilense Sp7 при добавлении бактериофага OAb-Sp7; (Б) суспензий клеток Е. coli В-878 + Е. coli XL-1 + A. brasilense SR75, при добавлении бактериофага OAb-SR75. (1) - контроль - суспензия клеток без добавления бактериофагов; (2) - суспензия клеток с добавлением бактериофагов

Полученные результаты показывают возможность использования бактериофагов <I>Ab-Sp7 и <¡>Ab-SR75 для детекции микробных клеток с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий в присутствии посторонней микрофлоры.

Использование бактериофагов для детекции микробных клеток Azospirillum brasilense с помощью метода электроакустического анализа микробных суспензий

Принцип действия акустических методов анализа основан на регистрации биологических взаимодействий непосредственно в жидкой суспензии, контактирующей с поверхностью пьезоэлектрика. При добавлении соответствующих реагентов происходит изменение вязкости и проводимости суспензии, что приводит к сдвигу резонансной частоты, которая фиксируется датчиком (Bailato et al., 1986; Smythe, Tiersten, 1988; Khan, Ballato, 2000; Hu et al., 2004; Pinkham et al., 2005; Wark et al., 2007).

Для детекции микробных клеток был использован резонатор с поперечным возбуждающим электрическим полем, с простейшей геометрией электродов, нанесенных на пластину ниобата лития Х-среза, разработанный в лаборатории физической акустики Саратовского филиала Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова (г. Саратов). Для подавления нежелательных колебаний использовалось нанесение поглощающего покрытия на определенную область резонатора (Зайцев и др., 2011).

Целью данного этапа исследований являлось использование бактериофагов, выделенных из клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75, для

детекции микробных клеток азоспирилл с помощью электроакустического метода анализа микробных суспензий.

Первоначально проводилась оптимизация условий измерения электроакустических параметров. По результатам предварительных экспериментов были выбраны следующие частоты 6-7 МГц, при этом время анализа составляло -10 мин.

Далее изучали динамику взаимодействия бактериофагов ФАЬ-Бр7 и ФАЬ-8Я75 с клетками А. brasilen.se штаммов 8р7 и 8Ы75 с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий. Для этого к суспензии клеток А. brasilen.se штаммов 8р7 и 81*75 (108 клеток/мл) добавляли изучаемые бактериофаги, инкубацию проводили при температуре 37°С в течении 1,5, 10, 20 и 30 минут. В результате было установлено, что минимальное время, необходимое для взаимодействия бактериофагов ФАЬ-8р7 и ФАЬ-8Я75 с бактериальными клетками А. ЬгазИете для обоих штаммов составляет ~1 мин.

На следующем этапе исследований определяли минимальное количество детектируемых клеток с использованием бактериофагов ФАЬ-8р7 и ФАЬ-81175 при помощи электроакустического датчика. Были проведены измерения при количестве клеток в ячейке 106, 104, и 103 клеток/мл. Для суспензий клеток А. ЬгазИепве штамма 8р7 предел детекции составляет 104 клеток/мл (рис. 4 (А)) и для суспензии клеток штамма 8К75 - 103 клеток/мл (рис. 4 (Б)). Показано, что датчик позволяет четко разграничивать ситуации, когда происходит взаимодействие бактериальных клеток со специфическими бактериофагами от контрольных экспериментов, когда такое взаимодействие отсутствует.

Частота, МГц Ча<гтота,мг«

Рис. 4. Зависимость значений электрического импеданса суспензии клеток А. ЬгаяИете Эр 7 (А) при инфекции бактериофагом ФАЬ-8р7, количество клеток в ячейке - 104 клеток/мл и суспензии клеток А. Ьга$Нете 81175 (Б) при инфекции бактериофагом ФАЬ-8Я75, количество клеток в ячейке - 103 клеток/мл. (1) - контроль - суспензия клеток без добавления бактериофагов; (2) - суспензия клеток с добавлением бактериофагов

Важным моментом в развитии нового метода детекции клеток является получение аналитического сигнала в присутствии посторонней микрофлоры.

Проводили измерения частотных зависимостей импеданса для клеточных суспензий A. brasilense Sp7 и A. brasilense SR75 при взаимодействии с бактериофагами ФАЬ-8р7 и ©Ab-SR75 в присутствии клеток Е. coli XL-1. Для этого к смешанной суспензии клеток А. brasilense Sp7 и Е. coli XL-1 и, соответственно, А. brasilense SR75 и Е. coli XL-1 (в соотношении 1:1 в обоих случаях) добавляли исследуемый бактериофаг и регистрировали изменения частотных зависимостей импенданса.

В качестве контроля использовалась смешанная суспензия клеток А. brasilense Sp7 и Е. coli XL-1 и A. brasilense SR75 и Е. coli XL-1 без добавления бактериофагов. Как видно из полученных данных, при инфекции клеток А. brasilense Sp7 (рис. 5 (А)) и А. brasilense SR75 (рис. 5 (Б)) бактериофагами ®Ab-Sp7 и ®Ab-SR75 в присутствии посторонней микрофлоры (клеток Е. coli XL-1), происходит изменение значений электрического импеданса.

Дополнительно проводили эксперименты по регистрации изменений значений электрического импеданса клеток Е. coli XL-1 при добавлении бактериофагов, выделенных из клеток А. brasilense Sp7 и A. brasilense SR75. При этом было показано, что изменения электрического импеданса в обоих случаях не происходит. Следовательно, бактериофаги ®Ab-Sp7 и OAb-SR75 не инфицируют бактерии Е. coli XL-1.

6.4 6.6 Чистота, МГц

6,4 Часто

6,6

а, МГц

Рис. 5. (А) Изменение значений электрического импеданса смешанной суспензии клеток А. brasilense Sp7 + Е. coli XL-1 при взаимодействии с бактериофагом ФАЬ-Бр7; (Б) смешанной суспензии клеток А. brasilense SR75 + Е. coli XL-1 при взаимодействии с бактериофагом ®Ab-SR75. (1) - контроль -суспензия клеток без добавления бактериофагов; (2) - суспензия клеток с добавлением бактериофагов

Таким образом, впервые показана возможность использования бактериофагов ФАЬ-8р7 и <I>Ab-SR75 для детекции микробных клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий.

Использование фаговых миниантител к поверхностным антигенам

A. brasilense Sp245 для детекции клеток с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных

суспензий

Антитела, полученные с помощью технологии фагового дисплея, успешно используются для идентификации бактерий (Williams, Benedek, Tumbough, 2003; Paoli, Chen, Brewster, 2004; Nanduri et al., 2007). Изучалась возможность использования рекомбинаторных фаговых миниантител на антигены клеточной стенки типового штамма A. brasilense Sp245 для детекции клеток с помощью методов электрооптического и акустического анализа клеточных суспензий.

Использование фаговых миниантител к поверхностным антигенам A. brasilense Sp245 для детекции клеток с помощью метода электрооитического анализа клеточных суспензий

Проводили измерения ЭО параметров суспензии клеток ,4. brasilense Sp245 при взаимодействии с разным количеством фаговых миниантител, специфичных к ЛПС и к флагеллину. Было показано, что при взаимодействии клеток A. brasilense Sp245 с миниАт, специфичными к ЛПС, а также при взаимодействии с миниАт, специфичными к флагеллину, происходят значительные изменения величины ЭО сигнала клеточной суспензии, при этом при увеличении количества внесенных миниАт величина ЭО сигнала значительно не изменялась (рис. 6).

Взаимодействие клеток A. brasilense Sp245 с миниАт, специфичными к ЛПС и к флагеллину клеток A. brasilense Sp245 были подтверждены с помощью электронной микроскопии.

190 1000 10000

Частога, кГц

Рис. 6. Зависимость величины ЭО-сигнала суспензии клеток А. Ьгаяйепзе Бр245 от количества анти-ЛПС (А) и антифлагеллиновых миниАт (Б): (1) - контроль -клетки без добавления миниАт, клетки А. ЬгазИете^ Бр245 с добавлением разного количества миниАт: (2) - 2*103, (3) - 4*103, (4) - 6х103 фаговых частиц/клетку

Таким образом, в результате исследований получены анти-ЛПС миниАт и антифлагеллиновые миниАт, специфичные к клетками А. ЬгаьПете 8р245. Установлено, что анти-ЛПС миниАт обладают большей чувствительностью по сравнению с антифлагеллиновыми миниАт в отношении клеток А. brasilen.se Бр245. Впервые показана возможность использования миниАт для детекции микробных клеток с помощью метода ЭО анализа клеточных суспензий.

Использование миниантител к поверхностным антигенам А. ЬгаиИсше Бр245 для детекции клеток с помощью метода электроакустического анализа микробных суспензий

На данном этапе работы проводили исследование возможности регистрации биологических взаимодействий «бактериальные клетки -специфические миниантитела» с помощью электроакустического метода анализа.

Поскольку ранее нами было показано, что анти-ЛПС миниАт обладают большей чувствительностью по сравнению с миниАт на флагеллин, в данной серии экспериментов использовались анти-ЛПС миниАт. Проводили исследования по изучению возможности определения микробных клеток А. ЬгазИепзе 8р245 с помощью измерения резонансной частоты при более низких концентрациях клеток в ячейке. Для этого измерения проводились при количестве клеток в ячейке 10б; 104; 103, 102 клеток/мл. При этом в качестве контроля использовали дистиллированную воду. Показано, что для суспензий клеток в ячейке 106, 104, 103 клеток/мл внесение соответствующих анти-ЛПС миниАт также существенно меняет значення резонансной частоты и электрического импеданса.

Таким образом, впервые показана возможность использования электроакустического метода анализа клеточных суспензий для детекции микробных клеток при взаимодействии с миниАт. Представленные результаты показывают возможность создания биологического акустического датчика для количественного анализа микробных клеток с пределом детекции ~103 клеток/мл.

Результаты проведенных исследований подтвердили актуальность, большую значимость и дальнейшую перспективность разрабатываемых подходов для применения в микробиологической и биотехнологической промышленности.

ВЫВОДЫ

1. Из микробных клеток А. ЬгаьИете штаммов 8р7 и с

использованием индуцирующего фактора - низкой температуры выделены бактериофаги ФАЬ-8р7 и ФАЬ-5Я75. Литическая активность бактериофагов ФАЬ-8р7 и ФАЬ-81175 по методу Грациа составила 5,0><108 и 3,3x108, соответственно. Бактериофаги ФАЬ-8р7 и ФАЬ-8Я75 обладают высокой температурной устойчивостью до +80°С и устойчивостью к воздействию хлороформом в течение 40 минут, сохраняют высокую активность при

значении pH буферного раствора в пределах от 6,5 до 8,5 и сохраняют активность при хранении при температуре -4°С в течение 10 месяцев.

2. Установлено, что выделенные бактериофаги <I>Ab-Sp7 и OAb-SR75 в соответствии с морфологическими параметрами согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Podoviridae, а по классификации A.C. Тихоненко к II морфологической группе: «Фаги с аналогом отростка».

3. Впервые показана возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для определения литической активности бактериофагов. Показана возможность детекции микробных клеток азоспирилл при их инфекции специфическим бактериофагом с помощью метода электрооптического анализа микробных суспензий. Определен минимальный предел детекции клеток, который составляет 104 клеток/мл.

4. Впервые исследована возможность использования бактериофагов, выделенных из А. brasilense Sp7 и А. brasilense SR75, для детекции микробных клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий. Показана возможность создания биологического акустического датчика для количественного анализа микробных клеток при их инфекции специфическими бактериофагами с пределом детекции ~103 клеток.

5. Установлена возможность использования методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий для детекции клеток азоспирилл при их взаимодействии со специфическими бактериофагами в присутствии посторонней микрофлоры.

6. Впервые определена возможность использования миниантител для детекции микробных клеток с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа клеточных суспензий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты диссертационных исследований по детекции микроорганизмов с помощью бактериофагов предлагается использовать в учебной работе аспирантов и студентов при изучении предметов микробиология, вирусология и биотехнология в ВУЗах и научно-исследовательских институтах РФ.

2. Определение литической активности бактериофагов рекомендуем проводить согласно «Методическим рекомендациям по определению литической активности бактериофагов с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий» для студентов старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области микробиологии, рекомендованные ученым советом ИБФРМ РАН (протокол №9 от 25.09.2012 г.).

3. При проведении научных исследований детекцию бактерий рода Azospirillum рекомендуем проводить с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий с использованием выделенных бактериофагов Sp7 и SR75, в том числе в присутствии посторонней микрофлоры.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Электрофизические свойства Azospirillum brasilense после пассажа в растении-хозяине / О.И. Гулий, О.В. Игнатов, O.A. Караваева [и др.] // Экология. Природные ресурсы. Рациональное природопользование. Охрана окружающей среды. Бюллетень Московского общества испытателей природы.

2009. Т. 114, Вып. 3. С. 233-235.

2. Изменение электрофизических свойств клеток Azospirillum brasilense Sp7 при их связывании с агглютинином зародыша пшеницы / О.И. Гулий, O.A. Караваева, Л.П. Антонюк [и др.] // Биология - наука XXI века: тезисы 13-ой Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых 28 сентября - 2 октября 2009 г. Пущино, 2009. С. 197-198.

3. Гулий О.И., Караваева O.A., Игнатов О.В. Определение фагочувствителыюсти микробных клеток Е. coli с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий // Биология - наука XXI века: тезисы 14-ой Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых19 -23 апреля 2010 г. Пущино, 2010. С. 240.

4. Караваева O.A., Гулий О.И., Игнатов О.В. Определение устойчивости микробных клеток по отношению к бактериофагам с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: материалы V Всероссийской конф. молодых ученых 28 сентября - 1 октября 2010 г. Саратов,

2010. С. 164.

5. Гулий О.И., Караваева O.A., Игнатов О.В. Использование метода электрооптического анализа клеточных суспензий для определения фагочувствительности бактерий // Актуальные аспекты современной микробиологии: тезисы VI Молодежной школы-конф. с междунар. участием 25-27 октября 2010 г. М.: МАКС Пресс, 2010. С. 176-177.

6. Электрофизические свойства микробных клеток при индукции бактериофага / O.A. Караваева, О.И. Гулий, С.А. Павлий [и др.] // Вестник Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина. Серия: биология. 2010. № 920, Вып. 12. С. 118-123.

7. Караваева O.A. Выделение бактериофага из Azospirillum brasilense Sp7 // Исследование молодых ученых в биологии и экологии: сб. науч. тр. 18-21 апреля 2011 г. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2011. Вып. 9. С. 48-51.

8. Павлий С.А., Караваева O.A., Володин Д.Ю. Использование метода электрооптического анализа клеточных суспензий для определения фагоустойчивости микробных клеток // Исследование молодых ученых в биологии и экологии: сб. науч. тр. 18-21 апреля 2011 г. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2011. Вып. 9. С. 82-85.

9. Изучение взаимодействия бактериофага с клеточной поверхностью Azospirillum brasilense Sp7 / O.A. Караваева, О.И. Гулий, С.А. Павлий [и др.] // Симбиоз Россия 2011: материалы IV Всероссийского с междунар. участием конгресса студентов и аспирантов-биологов 23-27 мая 2011 г. Воронеж: Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2011. Т. 1. С. 69-70.

10. Использование метода электрооптического анализа микробных суспензий для определения специфичности бактериофага / O.A. Караваева, О.И. Гулий, С.А. Павлий [и др.] // Известия Саратовского университета. Серия: химия, биология, экология. 2011. Т. 11, Вып. 2. С. 94-98.

11. Изучение бактериофага Azospirillum brasilense Sp7 / O.A. Караваева, О.И. Гулий, С.А. Павлий [и др.] // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по микробиологии и биотехнологии. 2011. №4/1(38). С. 32.

12. Preparation of miniantibodies to Azospirillum brasilense Sp245 surface antigens and their use for bacterial detection / L.A. Dykman, S.A. Staroverov, O.I. Guliy, O.V. Ignatov, A.C. Fomin, I.V. Vidyasheva, O.A. Karavaeva [et al.] // Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 2012. Vol. 33 N2. P. 115-127.

13. Получение фаговых мини-антител и их использование для детекции микробных клеток с помощью электроакустического датчика / О.И. Гулий, Б.Д. Зайцев, И.Е. Кузнецова, A.M. Шихабудинов, O.A. Караваева [и др.] // Биофизика. 2012. Т. 57, Вып. 3. С. 460-467.

14. Phage mini-antibodies and their use for detection of microbial cells by using electro-acoustic sensor / O. Guliy, B. Zaitsev, I. Kuznetsova, A. Shikhabudinov, O. Karavaeva [et al.] // European Congress of clinical microbiology and infectious disease 31 march-3 april 2012. London, 2012. P. 1393.

15. Исследование взаимодействия микробных клеток с антителами при помощи резонатора с поперечным электрическим полем / О.И. Гулий, Б.Д. Зайцев, И.Е. Кузнецова, A.M. Шихабудинов, Л.Ю. Матора, С.С. Макарихина, O.A. Караваева [и др.] // Биология - наука XXI века: тезисы 16-ой Междунар. Путинской школы-конф. молодых ученых 16-21 апреля 2012 г. Пущино, 2012. С. 223.

16. Использование фаговых миниантигел для детекции микробных клеток Azospirillum brasilense Sp245 с помощью электроакустического датчика / О.И. Гулий, Б.Д. Зайцев, И.Е. Кузнецова, A.M. Шихабудинов, O.A. Караваева [и др.] // Биология - наука XXI века: материалы Междунар. конф. 24 мая 2012 г. Москва, 2012. С. 207.

17. Использование электроакутического датчика для детекции микробных клеток при их взаимодействии с миниантителами / О.И. Гулий, Б.Д. Зайцев, И.Е. Кузнецова, A.M. Шихабудинов, O.A. Караваева [и др.] // Новые тенденции и методы в биофизике: материалы докладов IV Съезда биофизиков России. Симпозиум IV 20-26 августа 2012 г. Нижний Новгород, 2012. С. 84.

18. Выделение бактериофагов из Azospirillum brasilense Sp7 и их применение для детекции азоспирилл / O.A. Караваева, О.И. Гулий, С.С. Макарихина [и др.] // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: материалы VI Всероссийской конф. молодых ученых 2428 сентября 2012 г. Саратов, 2012. С. 160.

19. Исследование бактериофага почвенных бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b / С.С. Макарихина, О.И. Гулий, O.A. Караваева [и др.] // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: материалы VI Всероссийской конф. молодых ученых 24-28 сентября 2012 г. Саратов, 2012. С. 37.

20. Получение мини-антител к поверхностным антигенам Azospirillum brasilense и их использование для детекции микробных клеток / О.И. Гулий, O.A. Караваева, С.С. Макарихина [и др.] // Актуальные аспекты современной микробиологии: тезисы VIII Молодежной школы-конф. 22 - 24 октября 2012 г. Москва, 2012. С. 120.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Подписано в печать 22.11.2012

Гарнитура Times. Печать Riso. _Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 0478_

Отпечатано с готового оригинал-макега в типографии ИП «Экспресс тиражирование» 410005, Саратов, Пугачёвская, 161, офис 320 в 27-26-93

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Караваева, Ольга Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Бактериофаги почвенных микроорганизмов.

Глава 2. Детекция микробных клеток с помощью бактериофагов и фаговых миниантител.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты, материалы и методы исследований.

3.1. Бактериальные штаммы и условия выращивания бактерий.

3.2. Выделение и характеристика бактериофагов.

3.2.1. Определение концентрации фаговых частиц.

3.2.2. Определение морфологии негативных колоний.

3.2.3. Определение диапазона литической активности и специфичности действия выделенных бактериофагов.

3.2.4. Определение устойчивости выделенных бактериофагов к воздействию высокой температуры.

3.2.5. Определение устойчивости выделенных бактериофагов к воздействию хлороформа.

3.2.6. Определение устойчивости выделенных бактериофагов к воздействию разных значений рН.

3.2.7. Определение изменения активности бактериофагов при хранении.

3.2.8. Изучение морфологии фаговых частиц с помощью электронной микроскопии.

3.3. Электрооптический анализ клеточных суспензий с применением выделенных бактериофагов.

3.3.1. Подготовка клеток к электрооптическому анализу.

3.3.2. Проведение электрооптического анализа клеточных суспензий.

3.4. Электроакустический анализ клеточных суспензий с использованием выделенных бактериофагов.

3.4.1. Подготовка клеток к электроакустическому анализу.

3.4.2. Проведение электроакустического анализа микробных суспензий.

3.5. Изучение взаимодействия миниантител с клетками бактерий

A. brasilense Sp245.

3.5.1. Аффинная селекция миниантител из фаговой библиотеки.

3.5.2. Дот-иммуноанализ.

3.5.3. Приготовление препарата по изучению взаимодействия клеток бактерий A. brasilense Sp245 с полученными миниантителами с помощью электронной микроскопии.

Глава 4. Результаты исследований и их обсуждение

4.1. Выделение и характеристика бактериофагов, выделенных из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75.

4.1.1. Выделение и характеристика бактериофага из Azospirillum brasilense Sp7.

4.1.2. Выделение и характеристика бактериофага из Azospirillum brasilense SR75.

4.2. Использование бактериофагов для детекции микробных клеток Azospirillum brasilense с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.

4.2.1. Использование бактериофага, выделенного из A. brasilense Sp7, для детекции клеток азоспирилл с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.

4.2.2. Использование бактериофага, выделенного из клеток

A. brasilense SR75, для детекции клеток с помощью электрооптического анализа клеточных суспензий.

4.2.3. Определение литической активности бактериофагов с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.

4.3. Использование бактериофагов для детекции микробных клеток Azospirillum brasilense с помощью метода электроакустического анализа микробных суспензий.

4.3.1. Использование бактериофага из А. brasilense Sp7 для детекции клеток с помощью метода электроакустического анализа.

4.3.2. Использование бактериофага из А. brasilense SR75 для детекции клеток с помощью метода электроакустического анализа.

4.4. Использование фаговых миниантител к поверхностным антигенам А. brasilense Sp245 для детекции клеток с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.

4.4.1. Использование фаговых миниантител к поверхностным антигенам А. brasilense Sp245 для детекции клеток с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий.

4.4.2. Использование миниантител к поверхностным антигенам А. brasilense Sp245 для детекции клеток с помощью метода электроакустического анализа микробных суспензий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Детекция бактерий рода Azospirillum с помощью бактериофагов, выделенных из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75"

Одной из актуальных проблем современной биотехнологии является разработка новых подходов для детекции бактерий с помощью бактериофагов (Pathogen detection., 2012; Schofield et al., 2012; Wang et al., 2012). Этому вопросу посвящено сравнительно большое количество научных статей, однако, развитию методов детекции почвенных микроорганизмов, уделяется недостаточное внимание, хотя роль этих микроорганизмов весьма значительна как для развития фундаментальных исследований, так и для современной сельскохозяйственной биотехнологии.

Важную роль в процессах азотфиксации играют грамотрицательные рост-стимулирующие бактерии рода Azospirillum. Впервые эти бактерии были выделены в Нидерландах более 80-ти лет назад (Beijerinck, 1925), однако, в сферу интенсивного изучения попали после опубликования работы «Ассоциативный симбиоз у тропических трав.» (Döbereiner, Day, 1976), став одним из наиболее интенсивно исследуемых ассоциативных партнеров растений (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000; Bashan et al., 2004). Среди азоспирилл наибольшее внимание исследователей привлекает вид Azospirillum brasilense как модельный объект при изучении ассоциативных и эндофитных ризосимбиозов, образуемых бактериями и высшими растениями (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000; Bashan et al., 2004; Молекулярные основы ., 2005; Baldani, Baldani, 2005; Разнообразие морфотипов ., 2009). Эти ризобактерии могут способствовать развитию растений как непосредственно (азотфиксация, гормональный эффект, улучшение минерального и водного питания растений), так и опосредованно, путем подавления развития бактериальных патогенов. В последнее время азоспириллы рассматриваются как перспективный компонент консорциума ризобактерий для инокуляции в качестве компонентов бактериальных удобрений (Чернова, Бурыгин, 2008).

Прогресс в исследовании азоспирилл в качестве экологически безопасных стимуляторов роста растений в значительной степени зависит от развития быстрых и надежных способов определения данных микроорганизмов в почве. Кроме того, значительный интерес при исследовании собственно феномена ассоциативной микрофлоры представляет изучение их сезонных колебаний, а также изменения их численности, вызванные антропогенными воздействиями. В целом, развитие подходов, позволяющих осуществлять мониторинг состава ризосферных бактерий, представляется одной из актуальных задач современной экологической микробиологии (Красов, 2009).

Бактериофаги представляют собой наиболее многочисленную, широко распространенную в биосфере и, предположительно, наиболее эволюционно древнюю группу вирусов (Пространственная реконструкция ., 2009). Бактериофаги широко распространены в природе и выполняют важную роль в контроле численности микробных популяций, в автолизе стареющих клеток, в переносе бактериальных генов, выступая в качестве векторных «систем» (Шестаков, 2007), они представляют собой один из основных подвижных генетических элементов. Несмотря на то, что история изучения и использования бактериофагов имеет много десятилетий, бактериофаги почвенных микроорганизмов изучены мало, хотя их роль в контроле численности бактерий и способствовании переносу генов весьма значительна (Bacteriophage prevalence ., 2008).

Перспективным направлением дальнейших исследований по изучению ассоциативных и эндофитных ризосимбиозов, образуемых бактериями и высшими растениями, является выделение и изучение бактериофагов почвенных микроорганизмов, в том числе бактериофагов Azospirillum brasilense, а также разработка новых методов индикации почвенных бактерий с помощью бактериофагов.

Цель работы - выделение и изучение бактериофагов из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75, и их применение для детекции бактерий рода Azospirillum с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.

Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:

1. Выделить бактериофаги из A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 и изучить их биологические свойства.

2. Исследовать изменения электрооптических параметров микробных суспензий различных штаммов A. brasilense при их инфицировании бактериофагами из A. brasilense штаммов Sp7 и SR75.

3. Изучить возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для определения спектра литического действия бактериофагов на примере бактерий рода Azospirillum.

4. Использовать метод электроакустического анализа клеточных суспензий для детекции клеток Azospirillum при их инфицировании специфическими бактериофагами.

5. Исследовать возможность применения миниантител, специфичных к липополисахариду и флагеллину A. brasilense Sp245, для детекции бактерий с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.

Научная новизна работы.

Из микробных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с использованием индуцирующего фактора - низкой температуры выделены бактериофаги <I>Ab-Sp7 и OAb-SR75. У клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 обнаружено явление лизогении. Представлена характеристика полученных бактериофагов и определено их таксономическое положение, они относятся к семейству Podoviridae.

Впервые выделенные бактериофаги были использованы для детекции бактериальных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий. На примере микробных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 показано, что с помощью измерения ориентационных спектров микробных суспензий возможно определение спектра литической активности и специфичности действия бактериофагов.

Впервые применены миниантитела для детекции бактерий А. ЬгазИете 8р245 с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа клеточных суспензий. Установлено, что взаимодействие миниантител с бактериальными клетками А. ЪгалПете 8р245 приводит к изменению электрооптических параметров микробной суспензии и изменению величины значения электрического импеданса.

Практическая значимость работы.

Выделение и изучение бактериофагов из клеток А. ЬгаяИете штаммов 8р7 и 8Я75 открывает перспективы для их использования при разработке высокочувствительных и ускоренных методов детекции гомологичных бактериофагам бактерий.

По результатам диссертации были изданы методические рекомендации по определению литической активности бактериофагов с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий для студентов старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области микробиологии, рекомендованные ученым советом ИБФРМ РАН (протокол № 9 от 25.09.2012 г.).

Материалы, представленные в диссертации, используются при чтении лекций по биотехнологии и микробиологии для студентов и аспирантов в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.И. Вавилова» и ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У микробных клеток А. ЪгазИете штаммов 8р7 и 8Я75 выявлено явление лизогении. Использование индуцирующего фактора - низкой температуры позволяет выделять бактериофаги из А. ЬгазИете штаммов 8р7 и 8Я75.

2. Изменения электрооптических параметров микробных суспензий при их инфицировании специфическими бактериофагами позволяют определять литическую активность бактериофагов.

3. Изменения электрооптических и электроакустических свойств микробных суспензий азоспирилл при их инфицировании специфическими бактериофагами применимы для детекции клеток азоспирилл.

4. Методы электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий позволяют проводить детекцию бактерий с применением миниантител.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на: 13-ой, 14-ой и 16-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009; 2010; 2012); 5-ой и 6-ой Всероссийских конференциях молодых ученных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010; 2012); 6-ой и 8-ой Молодежных школах-конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010; 2012); III Региональной научной конференции «Исследование молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2011); 6-ом Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); European Congress of clinical microbiology and infectious disease (London, 2012); IV Съезде биофизиков России. Симпозиуме IV «Новые тенденции и методы в биофизике» (Нижний Новгород, 2012); Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012).

Работа выполнена в лаборатории физиологии микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) в соответствии с плановыми темами НИР «Исследование электрофизических свойств микробных клеток при их инфицировании бактериофагами» 20092012 гг. (№ гос. регистрации 01200904393, научный руководитель зав. лаб. д.б.н., профессор Игнатов О.В).

Работа поддержана грантами РФФИ №09-02- 12442-офим, президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых - докторов наук МД-57.2008.4 (2008-2009 гг.), а также Госконтрактом с СФИРЭ им. В.А. Котельникова РАН, г. Саратов от 05 октября 2009 г. и Госконтрактом с СФИРЭ им. В.А. Котельникова РАН, г. Саратов от 29 июня 2010 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 6 статей, из них 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, и 14 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей объекты, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников, состоящего из 215 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 173 страницах компьютерного текста, включающего 36 рисунков и 13 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Караваева, Ольга Александровна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы наблюдается возрождение интереса к исследованию бактериофагов. Фундаментальные и системные сравнительные исследования геномики бактериофагов разных видов бактерий имеют решающее значение для понимания и оценки их роли в совместной эволюции (коэволюции) с бактериями-хозяевами, в частности, в понимании механизма их участия в горизонтальном обмене генетической информацией (Плетенева и др., 2009). Среди огромного количества микроорганизмов особый интерес представляет исследование почвенных микроорганизмов ассоциированным с растениями и стимулирующими их рост. Модельным объектом изучения ассоциативных и эндофитных ризосимбиозов, образуемых бактериями и высшими растениями являются представители рода Azospirillum - Azospirillum brasilense (Bashan et al., 2004; Разнообразие морфотипов ., 2009).

Для понимания механизмов взаимодействия бактерий и растений важно учитывать влияние, оказываемое бактериофагами на микроорганизмы. Хотя исследованию бактериофагов уделялось огромное внимание с момента их обнаружения, в основном, они рассматривались с точки зрения их использования в медицине для диагностики и лечения инфекционных заболеваний, в том числе и особо опасных инфекций и в биотехнологии для предотвращения фаговой инфекции при микробиологическом производстве. Изучению бактериофагов, выделенных из симбиотических бактерий, уделялось крайне мало внимания, хотя их биологическое значение с точки зрения поддержания популяции клеток и переноса генетического материала весьма существенно.

Несмотря на то, что бактерии A. brasilense достаточно хорошо изучены, информация об их бактериофагах в литературе встречается редко. Наиболее часто бактериофаги выделяют из объектов окружающей среды, и лишь одна публикация посвящена их выделению из клеток бактерий A. brasilense (Bacteriophage prevalence ., 2008).

Основная идея работы заключалась в выделении и изучении бактериофагов из микробных клеток А. ЬгаяИете штаммов 8р7 и 8Я75 и их применении для детекции бактерий рода АюяртПит с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий. Основные результаты проведенных экспериментальных исследований можно разделить на три основных, но взаимосвязанных направления.

Первое - результаты по выделению и изучению бактериофагов из микробных клеток А. ЪгаБйете штаммов 8р7 и 81175.

Второе - экспериментальные результаты использования бактериофагов, выделенных из клеток А. ЬгаяМете штаммов 8р7 и 8Я75 для детекции бактерий рода АгояртИит с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.

Третье - результаты получения миниантител, специфичных к липополисахариду и флагеллину А. ЪгазИете 8р245, и их применение для детекции бактерий с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.

В наших исследованиях из микробных клеток А. ЬгаяИете штаммов 8р7 и 81175 с использованием индуцирующего - фактора низкой температуры были выделены бактериофаги ФАЬ-8р7 и ФАЬ-8Я75 и изучены их биологические свойства. Основываясь на полученные данные, можно утверждать, что у клеток А. ЬгаБИете штаммов 8р7 и 8Я75 обнаружено явление лизогении.

При изучении морфологии негативных колоний показано, что бактериофаг ФАЬ-8р7 на газоне индикаторного штамма 8р7 способен образовывать округлые, с ровным четким краем, прозрачные негативные колонии одного типа, диаметром 0,1 - 0,2 см. Бактериофаг ФАЬ-8Я75 на газоне индикаторного штамма 8Я75 образует прозрачные, овальные (вытянутые) негативные колонии, с ровным нечетким краем, диаметром примерно 0,3-0,5 см. Анализ выращенных культур после длительного культивирования (до 5 суток) показал, что пятна остаются прозрачными для обоих используемых культур.

Литическую активность бактериофагов оценивали по способности вызывать лизис бактериальной культуры и выражали степенью максимального разведения, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Активность бактериофага OAb-Sp7 варьировала от 2x105 до 1,6x1010 корпускул в 1 мл, а бактериофага OAb-SR75 - от 3,5x105 до 7,8x1011 корпускул в 1 мл.

К основным биологическим свойствам бактериофага, имеющим важное практическое и теоретическое значение, относится диапазон литической активности - это спектр лизиса гомологичных бактериофагу бактерий по серологической группе. Показано, что бактериофаг OAb-Sp7 вызывает лизис гомологичных фагу бактерий по серологической группе A. brasilense штаммов Sp7, Cd, Spl07, Brl4, KR77, S27, SR55, SR65, A. amazonense Aml4, A. halopraeferans Au4, A. irakense KBC1 и КАЗ, но не проявлять активность в отношении клеток A. brasilense Sp245, Jm6B2, S17, SR75,A lipoferum Sp59b и RG20a. В то время как, бактериофаг OAb-SR75 способен инфицировать следующие штаммы бактерий: A. brasilense штаммов SR75, Jm6B2, SR55, SR65, Brl4, S27, A. amazonense Aml4, A. irakense штаммов КВС1 и КАЗ, A. lipoferum RG20a, и не способен взаимодействовать с клетками A. brasilense Sp7, Cd, Spl07, Sp245, KR77, SI7, а также A. halopraeferans Au4 и A. lipoferum Sp59b.

Необходимым условием для применения бактериофагов в микробиологических целях является отсутствие литического действия в отношении гетерологичных бактерий (специфичность). В качестве гетерологичных культур использовали бактерии родов Escherichia, Pseudomonas, Acinetobacter. Установлено, что бактериофаги <DAb-Sp7 и OAb-SR75 не активны в отношении бактерий испытанных гетерологичных родов.

При изучении воздействия инактивирующих факторов на активность выделенных бактериофагов было показано, что изучаемые бактериофаги является термостабильными, сохраняют высокую устойчивость к воздействию хлороформа и изменениям значений pH буферного раствора в пределах от 6,5 до 8,5, при этом сохраняют активность в течение 10 месяцев.

При исследовании морфологии фаговых частиц с помощью электронной микроскопии было установлено, что вирусные частицы OAb-Sp7 и OAb-SR75 имеют сходный план строения - изометрическую головку и хвостовой отросток небольшого размера. В соответствии с морфологическими параметрами, бактериофаги OAb-Sp7 и OAb-SR75, согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Podoviridae (Ackermann, 2007), а по классификации A.C. Тихоненко - ко II морфологической группе: «Фаги с аналогом отростка» (Тихоненко, 1968).

На следующем этапе нашей работы были разработаны подходы для детекции бактерий азоспирилл с помощью бактериофагов OAb-Sp7 и OAb-SR75 с использованием методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий.

В результате проведенных исследований изучены изменения электрооптических (ЭО) параметров суспензии клеток А. brasilense штаммов Sp7 и SR75 при их инфекции бактериофагами <X>Ab-Sp7 и OAb-SR75, в зависимости от количества клеток и времени взаимодействия с клетками. Установлено, что при инфекции клеток А. brasilense штаммов Sp7 и SR75 изучаемыми бактериофагами происходит значительное изменение величины ЭО сигнала уже через 1 мин от начала инфекции. Определен минимальный предел детекции клеток, который составляет 104 клеток/мл для обоих исследуемых штаммов. Показано, что в присутствии посторонних культур клеток Е. coli В-878 и Е. coli XL-1, также возможна детекция клеток с использованием бактериофагов OAb-Sp7 и OAb-SR75.

При выделении и описании новых бактериофагов определение диапазона их специфического связывания с бактериальными клетками является необходимым этапом исследования (Characterization of ., 2009). Была изучена возможность определения литической активности бактериофагов с помощью метода ЭО анализа микробных суспензий на примере бактериофагов OAb-Sp7 и <DAb-SR75. Изучение спектра литического действия проводилось с помощью метода ЭО анализа микробных суспензий по отношению к следующим видам и штаммам бактерий рода Azospirillum: A. amazonense Aml4, A. brasilense штаммы: Sp7, Cd, Spl07, Sp245, Jm6B2, Brl4, KR77, S17, S27, SR55, SR65, SR75, A. halopraeferans Au4, A. irakense штаммы: KBC1, KA3, A. lipoferum штаммы: Sp59b и RG20a. При этом было показано, что результаты, полученные с помощью метода ЭО анализа микробных суспензий полностью соответствовали данным, полученным с помощью традиционных микробиологических методик. Таким образом, впервые показана возможность использования метода ЭО анализа микробных суспензий для определения литической активности бактериофагов. Полученные результаты в последующем могут быть использованы для развития нового метода определения специфичности действия бактериофагов в отношении микробных клеток.

На следующем этапе работы проводились исследования по изучению возможности детекции микробных клеток азоспирилл с использованием бактериофагов, выделенных из клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75, с помощью метода электроакустического анализа микробных суспензий.

Была показана возможность использования бактериофагов <DAb-Sp7 и OAb-SR75 для детекции клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий. Полученные результаты показывают возможность создания биологического акустического датчика для количественного анализа микробных клеток с пределом детекции -10 клеток/мл и детекции бактерий в присутствии посторонней микрофлоры.

Таким образом, впервые показана возможность использования бактериофагов, выделенных из A. brasilense Sp7 и A. brasilense SR75, для детекции микробных клеток азоспирилл с помощью метода электроакустического анализа клеточных суспензий.

Таким образом, впервые выделенные бактериофаги были использованы для детекции бактериальных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 с помощью методов электрооптического и электроакустического анализа микробных суспензий. На примере микробных клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 было показано, что с помощью измерения ориентационных спектров микробных суспензий возможно определение спектра литической активности и специфичности действия бактериофагов.

Антитела, полученные с помощью технологии фагового дисплея, успешно используются для идентификации бактерий (Williams et al., 2003; Paoli et al., 2004; Phage as ., 2007). Целью данного направления являлось изучение возможность использования рекомбинаторных фаговых миниантител на антигены клеточной стенки типового штамма A. brasilense Sp245 для определения поверхностных антигенов клеточных структур и детекции клеток с помощью методов электрооптического и акустического анализа клеточных суспензий.

В результате исследований получены анти-ЛПС миниАт и антифлагеллиновые миниАт, специфичные к клетками A. brasilense Sp?r45. Установлено, что анти-ЛПС миниАт обладают большей чувствительностью в отношении клеток A. brasilense Sp245 по сравнению с антифлагеллиновыми миниАт. Впервые показана возможность использования миниАт для детекции микробных клеток азоспирилл с помощью метода ЭО анализа клеточных суспензий. Мы полагаем, что полученные результаты могут быть использованы для создания тест-системы детекции микробных клеток и, возможно, оценки экспонированности тех или иных антигенных детерминант в составе клеточной поверхности бактерий.

Изучалась возможность определения клеток азоспирилл с использованием рекомбинаторных фаговых миниАт на антигены клеточной стенки типового штамма A. brasilense Sp245 с помощью метода акустического анализа клеточных суспензий.

В результате проведенных исследований показано, что частотные зависимости импеданса резонатора, нагруженного суспензией клеток с анти-ЛПС миниАт, после взаимодействия с клетками, значительно отличаются от резонатора с контрольной суспензией клеток без добавления миниАт. Представленные результаты показывают возможность создания биологического акустического датчика для количественного анализа микробных клеток с пределом детекции ~10 клеток/мл. Впервые продемонстрирована возможность использования электроакустического метода анализа клеточных суспензий для детекции микробных клеток при взаимодействии с миниАт.

Результаты проведенных исследований подтвердили актуальность, большую значимость и дальнейшую перспективность разрабатываемых подходов для применения в микробиологической и биотехнологической промышленности.