Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная гетерогенность липополисахаридов бактерий рода Azospirillum серогруппы II

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурная гетерогенность липополисахаридов бактерий рода Azospirillum серогруппы II"

На правах рукописи

Сигида Елена Николаевна

СТРУКТУРНАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИЙ РОДА лго^штимм СЕРОГРУППЫII

03.01.04-биохимия 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МНМгт,

Си 14

Саратов - 2014

005549146

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научные Игнатов Владимир Владимирович

руководители: Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии

и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук,

лаборатория биохимии,

заведующий лабораторией

Федоненко Юлия Петровна

кандидат биологических наук, доцент

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, лаборатория биохимии, старший научный сотрудник

Официальные Щербаков Анатолий Анисимович

оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Саратовский государственный аграрный

университет им. НИ. Вавилова»,

кафедра микробиологии, вирусологии и химии,

профессор кафедры

Киреев Михаил Николаевич

кандидат медицинских наук

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лаборатория экспериментальной биотехнологии, старший научный сотрудник

Ведущая Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский организация: институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук, г. Владивосток

Защита состоится «21» мая 2014 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.002.146.1 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук по

адресу: 410049 Саратов, пр. Энтузиастов, 13. Тел. (8452) 970383

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ. Диссертация и автореферат размещены на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnvy-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан «?/» ЛСЛУ^-П- / 2014 г Ученый секретарь диссертационного совета (]

кандидат биологических наук H.H. Позднякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бактерии рода Azospirillum являются типичными представителями ризосферной микробиоты, способными формировать ассоциации с важнейшими хлебными и кормовыми злаковыми культурами и стимулировать их урожайность (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000).

Преобладающие гликополимеры клеточной поверхности азоспирилл -липополисахариды (ЛПС) и капсульные полисахариды (КПС) - вовлечены в процессы агрегации клеток и колонизации корней растений, принимая непосредственное участие в формировании растительно-микробных ассоциаций (Skvortsov and Ignatov, 1998; Burdman et al., 2000; Egorenkova et al., 2001). Изучение химической структуры гликополимеров необходимо для понимания молекулярных механизмов коммуникаций, происходящих в ризосфере между микроорганизмами и их макропартнерами. Это открывает возможности для управления этими процессами и повышения эффективности используемых в сельском хозяйстве технологий.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что азоспириллы продуцируют преимущественно S-формы ЛПС, содержащие О-специфические полисахариды (ОПС), экспонированные на внешней стороне наружной мембраны (Fedonenko et al., 2002, 2004, 2006, 2008; Chôma et al., 2008; Boyko et al., 2011, 2012).

На основании серологических перекрестных реакций с бактериями A. brasilense Sp245, Sp7 и A. lipoferum Sp59b, соответственно, были выделены три серогруппы азоспирилл (Коннова и др., 2008; Федоненко и др., 2011, Филипьечева, 2011). Сравнительное исследование структур повторяющихся звеньев ОПС этих бактерий позволило выявить химическую основу серологического родства между отнесенными к серогруппам I и III штаммами (Бойко и др., 2010; Федоненко и др., 2011), большинство из которых являются ассоциантами пшеницы. Сведения о структурах ОПС азоспирилл представителей серогруппы II, изолированных из ризосферы широкого круга злаков трех подсемейств - Pooideae, Panicoideae, Oryzoideae (Коннова и др., 2008; Филипьечева, 2011), - ограничены, в то время как данные серологического анализа свидетельствуют о неоднородности О-антигенных детерминант их ЛПС. Это обуславливает актуальность детализации и расширения существующей серо- и хемотаксономической схем бактерий рода Azospirillum. Серологическая специфичность КПС азоспирилл охарактеризована

лишь для нескольких штаммов. На основании идентичности антигенных свойств ЛПС и КПС было высказано предположение об отсутствии индивидуального капсульного антигена у штаммов А. brasilense Sp7 и Sp245 (Матора и Щеголев, 2002), при этом у бактерий А. lipoferum Sp59b выявлены как антигенные, так и структурные различия между ЛПС и КПС (Смолысина и др., 2010).

Анализ нуклеотидных последовательностей 90 МДа (р90, pRhico) и 115 МДа (р115) плазмид бактерий А. brasilense Sp7 выявил множественные открытые рамки считывания, предсказанные продукты экспрессии которых могут быть задействованы в биосинтезе и экспорте полисахаридов (Vanbleu et al., 2004; Lerner et al., 2009). В связи с этим представляет интерес сравнительное исследование ЛПС А. brasilense Sp7 и спонтанных производных этого штамма, плазмидные профили которых свидетельствовали об утере pl 15 и изменении структуры р90 (Петрова и др., 2005,2010).

Цель работы — структурный анализ липополисахаридов бактерий рода Azospirillum, отнесенных к серогруппе II. Для реализации цели в ходе исследования решали следующие задачи:

1. Провести скрининговые серологические исследования штаммов Azospirillum spp. для выявления перекрестных реакций с антителами к ЛПС бактерий - представителей серогруппы II.

2. Охарактеризовать химический состав ЛПС и структуру повторяющихся звеньев ОПС азоспирилл, отнесенных к серогруппе II.

3. Осуществить сравнительный анализ структуры ОПС А. brasilense Sp7 и его спонтанных производных с измененным плазмидным составом — А. brasilense Sp7.K2, Sp7.2 и Sp7.5.

4. Исследовать ЛПС из капсульного материала на примере бактерий А. irakense КВС1.

Научная новизна работы. Впервые для отнесенных к серогруппе II бактерий рода Azospirillum установлены структуры повторяющихся звеньев ОПС у штаммов А. brasilense Sp7, SR7, SR50, SR80, SR88, SR109, SRI 11, SRI 15 и A. lipoferum SR42 и КПС А. irakense КВС1. Выявлена химическая основа серологического родства между А. brasilense SR7 и S17, а также между А. brasilense Sp7, Jm6B2, SR50, SR80, SR88, SR109, SRI 11, SRI 15 и A. lipoferum SR42. Показано, что ОПС спонтанного производного А. brasilense Sp7.K2 отличается от ОПС родительского штамма

А. ЪгавИете 8р7 и его производных штаммов 8р7.2 и вр7.5 наличием рамнанового полисахарида.

Установлено, что антигенная специфичность мембранного и внеклеточного ЛПС А. пакете КВС1 обусловлена различиями макромолекулярной организации этих гликополимеров.

Получены новые данные о характере связывания жирных кислот в липидах А ЛПС исследуемых штаммов.

Научно-практическая значимость. Информация о структурах ОПС будет использована для серо- и хемотипирования азоспирилл. Сведения о составе и топологии углеводных компонентов бактериальной поверхности, определяющих успешность начальных этапов формирования растительно-микробных ассоциаций, могут быть использованы при отборе конкретных штаммов азоспирилл для создания биоудобрений.

Выделенные препараты ЛПС ряда штаммов А. ЬгазИете и А. Иа1оргае/егеп5 и полученные к ним поликлональные кроличьи Ат применяются при проведении плановых НИР сотрудниками лабораторий биохимии и иммунохимии ИБФРМ РАН, а также при выполнении учебного плана Учебно-научного центра физико-химической биологии Федерального государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» (СГУ) и ИБФРМ РАН.

Представленные в диссертации материалы включены в учебно-методическое пособие для студентов: «Практические занятия по физико-химическим методам исследования биополимеров» / Саратов: Изд-во «Новый ветер», 2013 г. 54 е., (в соавторстве с Г.Л. Бурыгиным, Л.Ю. Матора, С.Ю. Щеголевым), рекомендованное кафедрой органической и биоорганической химии Института химии СГУ и Ученым советом ИБФРМ РАН.

Работа проведена при частичной поддержке РФФИ (проекты 08-04-00669, 11-0400533, 13-04-01658) и Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение №8852 («Разработка методологии и приборного обеспечения электрооптического анализа вирусов и микроорганизмов»).

Личный вклад соискателя. Автор лично участвовал в планировании экспериментов, обсуждении полученных результатов, формулировании выводов и подготовке публикаций. Культивирование бактерий, выделение и очистка КПС, ЛПС и

ОПС, электрофорез, получение антител, серологические тесты, химические анализы, интерпретация спектров ЯМР проводились автором лично или при его непосредственном участии.

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам ИБФРМ РАН: своим научным руководителям д.б.н., профессору В.В. Игнатову и к.б.н., доценту Ю.П. Федоненко, а также д.б.н., профессору С.А. Коновой, вед. инж. E.H. Юдиной, вед. инж. Е.Е. Калашниковой (лаборатория биохимии), д.б.н., профессору Л.Ю. Матора, к.б.н., доценту Г.Л. Бурыгину (лаборатория иммунохимии), д.б.н., профессору Е.И. Кацы, к.б.н. Л.П. Петровой (лаборатория генетики микроорганизмов), к.х.н. O.E. Макарову и к.б.н. М.П. Чернышовой (лаборатория экологической биотехнологии), на разных этапах участвовавших в проведении исследований и обсуждении результатов. Автор благодарит сотрудников Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН д.х.н., профессора Ю.А. Книреля и д.х.н., профессора A.C. Шашкова за запись спектров ЯМР ОПС и помощь в их интерпретации.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Бактерии А. brasilense Sp7, SR7, SR50, SR80, SR88, SR109, SRI 11, SR115 А. lipoferum SR42 и А. halopraeferens Au4, отнесенные к серогруппе II, продуцируют структурно и иммунохимически гетерогенные ЛПС. Для ОПС А. brasilense Sp7, Sp7.K2, Sp7.2, Sp7.5, SR7, SRI 15 и A. halopraeferens Au4 характерно присутствие частично метилированных и ацетилированных моносахаридных остатков.

2. ЛПС и КПС бактерий типового штамма Л. irakense КВС1 содержат полисахариды с идентичными по первичной структуре полисахаридными повторяющимися звеньями. Серологическая гетерогенность этих гликополимеров может быть обусловлена различиями их макромолекулярной организации.

3. В составе ЛПС азоспирилл 3-гидрокситетрадекановая кислота является эфиросвязанной, а 3-гидроксигексадекановая — амидосвязанной.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 5 статей в отечественных и зарубежных научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.

Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, представлены на шести всероссийских и четырех международных конференциях.

Работа выполнена в соответствии с плановыми темами НИР «Биополимеры и низкомолекулярные соединения во взаимодействии растений и микроорганизмов» (2009-2012 гг. № госрегистрации 01200904391) и «Роль биомакромолекул и низкомолекулярных веществ в механизмах адаптации растительно-микробных ассоциаций в составе антропобиоценозов к условиям аридного климата» (2013—2015 гг. № госрегистрации 01201359049) лаборатории биохимии ИБФРМ РАН. Исследование полисахаридов с помощью спектроскопии ЯМР выполнено совместно с сотрудниками Института органической химии имени Н.Д. Зелинского РАН (г. Москва).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 239 источников, в том числе 58 источников на русском языке. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков и 12 таблиц.

Общепринятые сокращения и обозначения: Rhap - рамнопираноза, Fucp -фукопираноза, Galp - галактопираноза, Xylp - ксилопираноза, Мапр — маннопираноза, Glcp — глюкопираноза, GlcpNAc — 2-ацетамидо-2-дезокси-глюкопираноза, GalpNAc — 2-ацетамидо-2-дезоксигалактопираноза, ManpN(SHb) - 2-дезокси-2-[(8)-3-гидроксибута-ноиламино]маннопираноза, Gal/ — галактофураноза, Rhap2Me — 2-О-метил-рамнопираноза, Rha2Ac — 2-О-ацетилрамноза.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 Обзор литературы содержит сведения об ассоциативных ризосферных микроорганизмах, в том числе об азоспириллах как модельных объектах для изучения ассоциативного растительно-микробного взаимодействия. Приведена информация об особенностях морфологии и физиологии азоспирилл, в том числе о составе гликополимеров клеточной поверхности и их участии во взаимодействии с растениями. Обзор включает информацию о генетических аспектах биосинтеза ЛПС азоспирилл, актуальную к началу исследований схему хемо- и серотипирования этих бактерий на основании данных о строении ОПС.

Глава 2 Материалы и методы

Бактерии, предоставленные коллекцией микробных культур ИБФРМ РАН, культивировали в жидкой синтетической среде с малатом натрия до окончания экспоненциальной фазы роста. Капсульный полисахарид получали гель-фильтрацией на

колонке с Sepharose CL-4B капсульного материала, смытого с поверхности бактериальных клеток суспендированием в 0,15 M растворе NaCl в течение 5 сут при механическом перемешивании. ЛПС экстрагировали из высушенных бескапсульных клеток по модифицированной методике (Кулыпин и др., 1987) горячей водно-фенольной смесью. ОПС получали деградацией ЛПС в мягких кислотных условиях (2% АсОН, 4 ч, 100 °С) (Muller-Seitz et al., 1968). Электрофорез препаратов в ПААГ проводили по методу (Hitchcock and Brown, 1983) с визуализацией углеводных компонентов (Tsai and Frasch, 1982). Жирные кислоты (ЖК) в ЛПС анализировали ГЖХ в виде метиловых эфиров жирных кислот (Mayer et al., 1985). Результаты экспериментов статистически обрабатывали с использованием параметрического t-критерия Стьюдента (Лакин, 1980). Доверительный интервал определяли для 95%-ного уровня значимости. Расчеты проводили с помощью пакета программ MS Excel 2007.

В иммунохимических тестах были использованы полученные ранее (Коннова и др., 2008) поликлональные кроличьи Ат к О-антигенам бактерий, отнесенных к серогруппе II (A. brasilense Sp7, S17, SR55, A. irakense КВС1), серогруппе III (A. lipoferum Sp59b) и серогруппе I (A. brasilense Sp245), а также вновь полученные нами Ат к ЛПС A. brasilense Jm6B2, SR80 и A. halopraeferens Au4. Визуализацию взаимодействия Ат с антигенами в составе гликополимеров осуществляли с использованием методов встречной радиальной иммунодиффузии, иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа (ИФА).

При установлении строения ОПС применялось сочетание спектроскопии ЯМР и химических методов анализа, включающих определение моносахаридного состава и абсолютных конфигураций моносахаридов методом ГЖХ ацетатов полиолов (Sawardecker et al., 1965) и ацетилированных 2-октилгликозидов (Leontein et al., 1978), определение позиций замещения моносахаридов методом ГЖХ-МС частично метилированных ацетатов полиолов (Conrad, 1972).

Одномерную !Н- и 13С-ЯМР спектроскопию применяли для оценки степени регулярности ОПС, а в случае регулярных полимеров - для определения размера повторяющегося звена по числу сигналов аномерных атомов углерода и количества аминосахаров в повторяющемся звене по числу сигналов атомов углерода, связанных с азотом. Отнесение сигналов в одномерных спектрах проводилось с использованием двумерных экспериментов 'н'Н COSY, TOCSY, ROESY, 'Н,13С HSQC и НМВС. Размер

моносахаридных циклов и конфигурацию гликозидных связей определяли по величинам констант спин-спинового взаимодействия вицинальных протонов и характерным химических сдвигам 'Н и 13С. Положения замещения моносахаридных остатков подтверждали на основании а- и р-эффектов гликозилирования. Последовательность остатков в повторяющихся звеньях определяли по ядерным эффектам Оверхаузера в спектрах ROESY и данным 'Н,13С НМВС спектров, выявляющих корреляции между аномерными и неаномерными связевыми атомами соседних моносахаридных остатков.

Глава 3 результаты и их обсуждение состоит из четырех основных частей. В первой части на основании иммунохимических тестов, демонстрирующих серологические перекресты с представителями серогруппы II, проведена селекция бактериальных культур. Вторая часть работы содержит характеристику состава выделенных из бактериальной биомассы ЛПС, в том числе сведения о распределении маркерных 3-гидроксиалкановых кислот в липиде А. Третья часть посвящена анализу структуры ОПС отобранных штаммов серогруппы II и спонтанных мутантов A. brasilense Sp7.2, Sp7.5 и Sp7.K2. В четвертой части приведен сравнительный анализ строения и серологических свойств мембранного и внеклеточного ЛПС бактерий A. irakense КВС1.

3.1 Серологические исследования ЛПС

На основании наличия в ЛПС эпитопов, связывающих Ат к препаратам ЛПС представителей азоспирилл серогруппы II, бактерии A. halopraeferens Au4, A. brasilense SR7, SR50, SR88, SR109, SR111, SR115 и A. lipoferum SR42 были отнесены к данной серогруппе. Эти штаммы вместе с отнесенными ранее к серогруппе II A. brasilense Sp7 и SR80, для которых отсутствовали сведения о структуре ОПС, были использованы в дальнейших исследованиях.

Представленные в таблице 1 результаты прямого и перекрестного ИФА ЛПС исследуемых бактерий свидетельствовали о неоднородности их иммунохимических свойств, проявлявшейся в различной степени серологического родства с Ат к О-антигенам серогруппы И.

При исследовании методом ИФА бактерии A. brasilense S17 демонстрировали серологическое родство со всеми исследованными штаммами, а методом иммунодиффузии - только со штаммом A. brasilense SR7 (Рисунок 1А). Минорные отличия наблюдались в степени серологического родства при взаимодействии с Ат к

ЛПС А. brasilense Sp7, SR55, Jm6B2 и KBC1. У A. brasilense Sp7 в составе ЛПС присутствуют антигенные детерминанты, выявляемые Ат к ЛПС А. halopraeferens Au4. Бактерии А. brasilense SR50, SR88, SR109, SRI 11, SRI 15 и А. lipoferum SR42 серологически родственны с А. brasilense SR80. В ИФА наблюдалось взаимодействие на уровне гомологичного антигена, а в радиальной иммунодиффузии детектировались различия в количестве и локализации полос преципитации (Рисунок 1Б).

Таблица 1 - Результаты ИФА ЛПС бактерий рода Azospirillum

\ ЛПС Ат Штамм

■5t-<4 О, 1л ЛПБК Sp59b Au4 Sp7 SR42 SR50 SR80 SR88 SR109 SRI 11 SRI 15 _ SR7

ЛПС8р7 - - - +++ +* + + + - - +

ЛПСЗК8о - - + ++ ++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ +

ЛПС517 + - + +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++

ЛПС3К55 - - - ++ +++ ++ +++ ++ ++ +++ + -

ЛПСквС! - - - +++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ - -

ЛПСдтбВ2 - - + ++* + ++ +++* + - + +

ЛПСАи4 - - +++ ++ - + - + + - - +

ЛПБК5р59Ь - +++ - ++ + + ++ ++ + ++ ++ -

Sp245rw +++ - ++ - + ++ +++ ++ + - - ++

Примечания: — отсутствие взаимодействия (0492<0.3); "+" - слабое взаимодействие (0492 0.3-0.6); "++" — среднее взаимодействие (0492 0.6-1.0); "-Н-+" - сильное взаимодействие (0492>1.0); "*" - взаимодействие при 8-кратном увеличении концентрации антигена.

Некоторые из анализируемых штаммов демонстрировали перекрестные реакции с А. brasilense Эр245 и А. Иро/егит 8р59Ь, при этом интенсивность взаимодействия в различных комбинациях антиген/антитело существенно различалась. Этот факт вызывал особый интерес, поскольку бактерии А. Ьга5йете Эр7, вр245 и А. Иро/егит 8р59Ь относятся к разным серогруппам и характеризуются наличием индивидуальных антигенных детерминант (Реёопепко е? а/., 2004; Коннова и др., 2008).

А Б В

Рисунок 1 - Встречная радиальная иммунодиффузия ЛПС исследуемых штаммов бактерий рода АгозрШит с Ат к ЛПС А. Ъгшйете 817 (А) 81180 (Б) и к ЛПС 8р7 (В)

Для выявления химической основы серологической гетерогенности изучаемых штаммов азоспирилл требовалось детальное структурное исследование их О-антигенов.

Помимо штаммов дикого типа, в работе были использованы спонтанные производные типового штамма A. brasilense Sp7 - Sp7.2, Sp7.5 и Sp7.K2, охарактеризованные в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН. Их плазмида pRhico представляла собой дериват с молекулярной массой 94 МДа для штаммов Sp7.5 и Sp7.K2 и 131 МДа для штамма Sp7.2 (Петрова и др., 2005).

Серологические исследования мутантных штаммов свидетельствовали об утрате О-антигеном штамма Sp7.K2 одной из антигенных детерминант, выявляемой Ат к ЛПС Sp7 в гомологичном антигене (Рисунок 1В) и в штаммах Sp7.2 и Sp7.5. Ранее для этих бактерий было продемонстрировано снижение способности к формированию биопленок на гидрофобных и гидрофильных абиотических поверхностях (Петрова и др., 2010), что обуславливало интерес к исследованию их ЛПС.

3.2 Выделение и характеристика состава ЛПС

Препараты ЛПС, выделенные водно-фенольной экстракцией из бескапсульных бактериальных клеток, содержали все характерные для этого класса молекул компоненты: углеводы, КДО, фосфат и 3-гидроксиалкановые кислоты.

Электрофоретический анализ ЛПС в ПААГ с визуализацией углеводных компонентов (Рисунок 2) выявил преобладающие S-формы ЛПС с различным числом повторяющихся звеньев, а также лишенные ОПС R-формы.

I - ЛПС Sp7.2 2-ЛПС Sp7.5

3 - ЛПС Sp7.K2

4 - ЛПС Sp7

5 - ЛПС SR7

6 - ЛПС Аи4

7 - ЛПС SR42

8 - ЛПС SR50

9 - ЛПС SR80

10 - ЛПС SR88

II - ЛПС SR109

12 —ЛПС SR111

13 - ЛПС SR115

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рисунок 2 - ДСН-ПААГ электрофорез ЛПС исследуемых бактерий рода Azospirillum

В составе ЛПС исследуемых бактерий преобладали 3-гидрокситетрадекановая (3-ОН-С140), 3-гидроксигексадекановая (3-ОН-С160) и октадеценовая (С!8:!) кислоты (Рисунок ЗА). На их долю приходилось более 80% от суммы идентифицированных ЖК. В минорных количествах также были обнаружены гекеадекановая (С^о), гексадеценовая (С161) и нонадекановая (С19 0) кислоты.

В ЛПС большинства исследуемых штаммов характеристичные 3-гидроксиалкановые кислоты составляли 45-55% от суммы всех идентифицированных кислот, что соответствует их обычному содержанию в липидах А грамотрицательных бактерий (Красикова и др., 1989). В ЛПС А. ЬгазИете 8Я80 было обнаружено около 75% 3-гидроксикислот, что сопоставимо с полученными ранее результатами исследований ЛПС А. Про/егит 1Ю20а (Игнатов и др., 2009). В ЛПС всех исследуемых штаммов азоспирилл было выявлено высокое содержание непредельных ЖК, а в ЛПС А. ЬгазИепэе 81188 ненасыщенные негидроксилированные ЖК преобладали над 3 -гидроксикислотами.

nnCSR115 ЛПС SR109 ЛПС SR111 ЛПС SR88 ЛПС SR8Û ЛПС SR50 ЛПС SR42 ЛПС SRT ЛПС Sp7 ЛПС Аи4

■ ■ -Г -4—,

.ттушщ

i 1

IZ11 „„„„

ЛПС*SR115 ЛПС*SR111 ЛПС* SR109 ЛПС* SR88 nnC*SR80 ЛПС* SR50 nnC*SR42 nnC*SR7 ППС* Sp7 ЛПС* Au4

чпашз : ...........:...................'.............. Ш//ЖЖ -1-1—U—

»-.-j......J.........— ^ 3-OH-C14:0 ■ci« ^ C16:0

-, T 1 ! 1

1 1 1 !

-5*ш ¡111

! i i D >OH-Cie:D Ш C18:1

! 1 1 1

"T i ! !

W^-i-UJ™

А Б

Рисунок 3 - Процентное содержание ЖК в ЛПС (А) и О-дезацилилированных ЛПС* (Б)

Гидролиз ЛПС в мягких щелочных условиях позволил получить О-дезацилированные препараты (ЛПС*), которые отличались от исходных ЛПС возрастанием доли 3-OH-Ci6:o и снижением доли 3-OH-Ci4:o- Эти данные свидетельствуют о том, что З-ОН-С160 является N-связанной, а 3-ОН-С14:о -О-связанной. Информация о характере связей маркерных жирных кислот в ЛПС изучаемых штаммов A. brasilense согласуется с данными о структуре липида А A. lipoferum SpBrl7, для которого было установлено, что первичная 3-OH-Ci6:o кислота присоединена амидной связью, первичная З-ОН-Смо - эфирной связью, а гекеадекановая и октадеценовая кислоты являются вторичными (Chôma et al., 2008).

3.3 Структурные исследования ОПС азоспирилл, отнесенных к серогруппе II

Основной трудностью, возникшей в ходе этого исследования, являлось отсутствие регулярности строения ОПС изучаемых штаммов, обусловленное наличием нескольких типов повторяющихся звеньев и нестехиометрическим метилированием моносахаридных остатков. Применение распада по Смиту, основанного на селективном окислении моносахаридов, содержащих вицинальные гликольные группировки, позволяло подтвердить установленную структуру (например, в случае ОПС А. ЬгазИете ЯКЗО) либо упростить его исследование (как в случае ОПС А. ЬгазИете Бр7).

Спектр 13С-ЯМР ОПС А. ЬгазИете 8р7 содержал сигналы разной интенсивности, демонстрируя структурную гетерогенность этого биополимера. Анализ полисахарида (ПС), образовавшегося после распада по Смиту ОПС Бр7, позволил установить наличие в нем линейных трисахаридных повторяющихся звеньев двух типов, отличающихся лишь метилированием остатка Шш (обозначено курсивом):

-^•3)-а-Ь-И1ар(2Ме)-(1->3)-Р-0-Оа1р-(1-^3)-Р-В-ОШАср-(1->-

По соотношению интегральной интенсивности аномерных протонов КЬа и Ш1а2Ме в 'Н-ЯМР спектре было определено, что степень метилирования полисахарида составляет -65%. С учетом этих данных была установлена структура повторяющихся звеньев преобладающего в ОПС полисахарида, отличающегося от ПС наличием остатков терминальной Бис (Таблица 2), гликозилирующей СИсЫАс в положение 4. При рассмотрении минорной серии сигналов одномерных и двумерных 'Н- и 13С-ЯМР спектров в исходном ОПС А. ЬгазИете 8р7 (Рисунок 4) было выявлено присутствие полисахарида, близкого по структуре с ОПС А. ЬгазИете 1т6В2 (Воуко е/ а/., 2012). Наличие неотнесенных сигналов в спектрах ЯМР ОПС Л. ЬгазИете 8р7, может быть связано с наличием дополнительного полисахарида, предположительно, сопутствующего глюкана.

Недавно было установлено, что в составе Н-антигена бактерий А. ЬгазИете 8р7 присутствует гликан, состоящий из повторяющихся звеньев преобладающего полисахарида О-антигена, за исключением О-метилирования остатков КЬа (Ве1уакоу е1а1, 2012). Структурное сходство полисахаридов в составе соматического и жгутикового антигенов позволило объяснить обнаруженную ранее антигенную идентичность этих гликополимеров (Матора и др., 2008).

Таблица 2 - Структуры повторяющихся звеньев ОПС азоспиршш серогруппы II и спонтанных мутантов А. bra.silen.se 5р7, установленные в данной работе

Штамм Структуры повторяющихся звеньев ОПС

А. brasilen.se 8р7, 8р7.К2, 8р7.2, 8р7.5 -65% МеО-2-| а-Ы:иср(1->4)-| ->3)-а-ь-ИЬар-(1^3)-р-0-0а1р>-(1^3)-р-0-С1срКАс-(1-> а-0-КЬар(1->3) ->4)-а-Ь-Рис/?-(1->4)-р-о-Ху1р-( 1 ->

А. Ьга5Иепяе БЯ50, 8Я80, 81188, 811109, 811111, 15 А Иро/егит ЙК42 а-ь-Риср(1->2) ->3)-а-п-0ф-(1->3)-р-о-0а1р-(1->3)-р-О-0а1рКАс-(1-> а-о-Ш1ар(1-»3) -| ->4)-а-ь-Риср-( 1 ->-4)-р-о-Ху1р-( 1

А. brasilen.se ЭК7 Р-о-С1ср(1-^2)-| -»3)-а-Ь-Ю1ар-(1 ->3)-а-Ь-Ш1ар-( 1 ->2)-а-1.-Ш1ар-( 1 -> Р-0-С1срКАс(1->4)-| -»3)-а-п-Мапр]чГ(8НЬН 1 ->4)-а-Ь-М1ар2Ме-( 1 ->

Исследования с помощью спектроскопии ЯМР ОПС спонтанных мутантов А. ЬгаяИеш-е 8р7.2, Эр7.5 и Эр7.К2 выявили наличие в них повторяющихся звеньев ОПС родительского штамма 5р7. Кроме того, в спектрах ЯМР ОПС А. brasilen.se 8р7.К2 присутствовали дополнительные сигналы ЯЬа и С 1с, об увеличении доли которых в ОПС свидетельствовал также анализ моносахаридного состава. Мы предполагаем, что выявляемая иммунохимическими методами утрата одной из антигенных детерминант в ЛПС этих бактерий объясняется ее экранированием в результате синтеза широко распространенного в составе ОПС азоспирилл (Бойко и др., 2010; Федоненко и др., 2011) полисахарида рамнановой природы. Таким образом, установлено, что изменение структуры плазмиды рЯЫсо у штаммов А. brasilen.se 8р7.2, 8р7.5 и 8р7.К2 не отражается на продукции в составе ЛПС 8-форм, содержащих ОПС с повторяющимися звеньями родительского штамма.

(R> <G) (N)

->3)-a-L-Rhap-(1-i3)-j3-D-Galp-(1-^3)-)i-D-GloNp-(1~>

4

I

a-L-Fucp (F)

m (в) w

-»3)-a-L-RhaH1-»3)-p-D-G3lp-(1—3>li-D-GlcNp-(1^ 2 4

I t

OMs 1

a-L-Fucp (Fj

m

a-D-Rhap 1

-4)-o-L-Fucp41 -4)-p-D-Xvlp-(1 -<F) (X)

i/ \.....mJJ W

V5I V V 'v

зь

J f

J

i I

3»-

I Lf * -1 fe

......

......>-

Jr

ж

F5.F5

N2, N2 ®

N6, Л/6 »

/\ G6, G6 OMe

& / 0

X5

F5

' G4,G4

« R!

® a

R2

F\FfFln.F2

I _

R5 ®

62, G2

R2

R4

&R4

N3, N3 '

F4,

65. GS Ф* N5.W5

«—R2.R3 R3

ppm 56 58 60 62

X5

5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 ppm

4.8

-!-1-Г—'--1-»—5.......Г

4.4 4.2 4.0 3.8 3.6

.........Г '

3.4

66 68 70 72 | 74 -76 78 80 82 84 3.2 ppm

Рисунок 4 - Фрагменты *H, 13C HSQC спектра ОПС A. brasilense Sp7. Номера относятся к H, С парам в моносахарвдных остатках, обозначенных в соответствии с приведенными схемами

Структурные исследования ОПС бактерий А. brasilense SR50, SR80, SR88, SR109, SRI 11, SRI 15 и А. lipoferum SR42 выявили химическую основу серологического родства между этими штаммами, связанную с наличием повторяющихся звеньев двух типов (Таблица 2). Причиной серологических перекрестных реакций этой группы штаммов с А. brasilense Sp7 может являться присутствие как идентичных по структуре минорных ОПС, так и общих структурных фрагментов в составе преобладающих ОПС (остатки терминальной a-L-Fucp). В то же время терминальный остаток D-Rhap в минорном ОПС, возможно, отвечает за серологическую взаимосвязь с А. brasilense Sp245.

Помимо сигналов повторяющихся звеньев, являющихся общими для этой группы штаммов (Рисунок 5А), в спектрах 'Н-ЯМР (Рисунок 5Б) и 'Н,13С HSQC ОПС А. brasilense SRI 15 содержались сигналы терминальной глюкозы и нескольких остатков Rha, в том числе Rha2Ac, что согласовалось с данными анализов ГЖХ и ГЖХ-МС моносахаридного состава и метилирования.

SS so

4.1) Э.5

CR (NAC)

criGl

CIL (NAcJ

CH, (OAc)

Vi____(____L_........._„_/U 4-,

5/j s:o

Рисунок 5 - ^-ЯМР спектры ОПС бактерий^, brasilense SR109 (А) и SRI 15 (Б). Буквами обозначены моносахаридные остатки: А,С - Gal, В - GalNAc, D, Е - Fue, F - Xyl, G - Rha; H - Rha2QAc

Присутствие в ЛПС A. brasilense SR115 дополнительного полисахарида, приводит к изменению антигенных свойств этого гликополимера и экранированию одной из антигенных детерминант, выявляемых в иммунодиффузии AT/JinCSR80 в гомологичном антигене (Рисунок 1Б).

Исследование ОПС бактерий A. brasilense SR7, изолированных с корней ежи сборной в Саратовской области, позволило установить структуры двух типов повторяющихся звеньев в его составе (Таблица 2), имеющих такое строение, как в ОПС бактерий A. brasilense S17 (Fedonenko et al., 2008), выделенных с корней проса в Пакистане. Структурная близость ОПС является химической основой выявленного серологического родства между этими штаммами. Наличие Rha2Me в одном из повторяющихся звеньев, по всей видимости, обуславливает их перекрестную реакцию с A. brasilense Sp7.

Исследования структуры ОПС бактерий A. halopraeferens Au4 также продемонстрировали гетерогенность этого полимера В составе ОПС были выявлены нейтральные сахара: Rha2Me, Rha, Fue, Xyl и Glc в соотношении —1 : 2 : 3 : 3 : 2. В связи с наличием нескольких серий сигналов в спектрах ЯМР на данном этапе работы структуру ОПС этих бактерий установить не удалось. Гетерогенность ОПС может быть вызвана как нестехиометрическим метилированием Rha, так и нерегулярным строением полисахаридной цепи. Отличная от других представителей серогруппы II структура повторяющихся звеньев ОПС у бактерий этого штамма может быть связана с отличительной особенностью вида A. halopraeferens - обитанием в специфической экологической нише (солончаковых почвах).

Таким образом, было продемонстрировано присутствие нескольких типов повторяющихся звеньев в ОПС штаммов, отнесенных на основании прямых и перекрестных серологических реакций к серогруппе II. Наличие в ОПС этих бактерий структурно различных полисахаридных цепей наряду с их нестехиометрическим замещением О-метильными и О-ацетильными группами обуславливает возможность формирования нескольких иммунодоминанных участков (эпитопов) в составе ЛПС. Антисывортки, полученные к таким антигенам, могут специфически узнавать соответствующие эпитопы в ОПС, содержащих отдельные фрагменты этих участков, что объясняет обнаруженные отличия в структуре ОПС серологически родственных штаммов.

3.4 Структурный и серологический анализ KI 1С А. irakense КВС1

Известно, что калсульные полисахариды азоспирилл по своей природе являются внеклеточной формой ЛПС, ассоциированных с белковыми компонентами и по своим свойствам отличных от ЛПС внешней мембраны (Konnova et al., 1994). Сведения об антигенных свойствах капсульных полисахаридов азоспирилл весьма ограничены, а структура установлена лишь для КПС одного штамма. В связи с этим несомненный интерес представляет исследование КПС бактерий A. irakense КВС1 отнесенных к серогруппе II.

На основании данных о содержании углеводов, в том числе КДО, белка, а также насыщенных, ненасыщенных и 3-гидроксиалкановых кислот высокомолекулярный полимер, выделенный из капсульного материала бактерий A. irakense КВС1, был отнесен к внеклеточной форме ЛПС.

Использование Ат, полученных к ЛПС (Ат/ЛПС) и к целым клеткам, обработанным глутаровым альдегидом (Ат/ГК), выявило существенные различия в антигенной специфичности ЛПС и КПС этих бактерий (Рисунок 6). Локализация антигенных детерминант в углеводной составляющей КПС была подтверждена отсутствием различий в ИФА в интенсивности его взаимодействия с Ат/ГК до и после обработки протеиназой К. В связи с этим, для понимания причин антигенной гетерогенности мембранного и капсульного ЛПС из последнего был выделен и охарактеризован полисахарид.

■■ИйКттДИ1111

Ai III \] I 1С

Рисунок 6 - Иммунодиффузия мембранного и капсульного ЛПС A. irakense КВС1

с Ат/ЛПС и Ат/ГК

С использованием химических анализов и спектроскопии ЯМР было установлено, что полисахарид в составе КПС А. пакете КВС1 состоит из гексасахаридных повторяющихся звеньев следующей структуры:

->4)-а-ь-КЬар-( 1->3)-р- о-Оа1р-( 1 Таким образом, впервые было показано присутствие в составе КПС азоспирилл полисахаридных цепей, идентичных по структуре ОПС (Рес1опепко е/ а1., 2005). Этот

вывод разнится с полученными ранее данными для КПС штамма А. Иро/егит 8р59Ь (Смолькина и др., 2010), отличного от ЛПС по структуре и антигенным характеристикам.

Для локализации в ЛПС и КПС антигенных детерминант, специфичных к Ат/ЛПС и Ат/ГК, были проведены электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофорез продемонстрировал различную макромолекулярную организацию этих гликополимеров. В составе ЛПС превалировали 8-формы молекул, тогда как в составе КПС - К-формы (Рисунок 7А). Иммуноблоттинг показал, что Ат/ЛПС специфически узнавали 8-формы ЛПС (Рисунок 7Б) и компонент гликопротеиновой природы в составе КПС. Ат/ГК слабо взаимодействовали с ЛПС, но при этом интенсивно связывались с Я-формами КПС, специфичность к которым не исчезала после протеолиза (Рисунок 7В).

1 2 3 1 2 3 12 3

А Б В

Рисунок 7 - ДСН-ПААГ Электрофорез (А) и Весгерн-блот мембранного ЛПС (1), капсульного ЛПС (2) и капсульного ЛПС после обработки протеиназой К (3) с Ат/ЛПС (Б) и Ат/ГК (В)

В связи с этим, обнаружение зависимости антигенной специфичности внеклеточных ЛПС А. 1гакепве КВС1 не только от первичной структуры полисахаридных цепей, но и от соотношения 8- и Я-форм молекул в составе капсулы, дополняет существующее в настоящее время представление о топологии капсульных

углеводсодержащих биополимеров азоспирилл и ее влиянии на процесс образования специфических Ат.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование комплекса методов иммунохимии и структурного анализа позволило обнаружить присутствие в составе поверхностных антигенов азоспирилл, отнесенных к серогруппе II, сложноорганизованного ансамбля углеводсодержащих компонентов, гетерогенных как по структуре, так и по антигенным характеристикам. Учитывая способность этих бактерий сосуществовать с широким кругом растений-партнеров, можно предположить, что особенности строения мембранных компонентов определяют высокий адаптационный потенциал этих бактерий.

ВЫВОДЫ

1. На основании серологических исследований с использованием антител, специфичных к ЛПС бактерий А. brasilense Sp7, SR80, Jm6B2, S17, SR55, А. irakense КВС1 и A. halopraeferens Au4, серогруппа II была дополнена штаммами А. brasilense SR7, SR50, SR88, SR109, SRI 11, SRI 15, А. lipoferum SR42 и А. halopraeferens Au4.

2. Впервые установлены структуры повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов девяти исследованных штаммов азоспирилл серогруппы II и выявлена химическая основа серологического родства между ними, обусловленная наличием как идентичных повторяющихся звеньев, так и общих структурных фрагментов в их составе.

3. Установлено, что бактерии штамма А. brasilense Sp7 и его производные (Sp7.K2, Sp7.2 и Sp7.5) с измененным плазмидным составом продуцируют ОПС, содержащие идентичные повторяющиеся звенья. Для ОПС штамма А. brasilense Sp7.K2 продемонстрировано наличие дополнительного полисахарида рамнановой природы.

4. В гидрофобной части ЛПС исследуемых штаммов идентифицированы первичные О-связанная 3-гидрокситетрадекановая и N-связанная 3-гидроксигексадекановая кислоты и отмечено высокое содержание негидроксилированных ненасыщенных жирных кислот.

5. В результате исследования КПС А. irakense КВС1 впервые показано присутствие в составе КПС азоспирилл полисахаридных цепей, идентичных по структуре ОПС. Установлено, что серологическая гетерогенность ЛПС и КПС А. irakense КВС1 вызвана различиями в макромолекулярной организации этих гликополимеров.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

♦Статьи в зарубежных и российских изданиях, рекомендованных ВАК РФ для зашиты кандидатских и докторских диссертаций:

1. *Сигида, Е.Н. Особенности строения липидов А типового и мутангаых штаммов Azospirillum brasilense / Е.Н. Сигида, Ю.П. Федоненко, С.А. Коннова, В.В. Игнатов // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по микробиологии, вирусологии,иммунохимии.-2011. №4/1 (38).-С. 114-115.

2. *Сигида, Е.Н. Сравнительная характеристика липополисахаридов бактерий штамма Azospirillum brasilense Sp7 и его спонтанного мутанта Sp7.K2 / Е.Н. Сигида, Ю.П. Федоненко, О.Н. Смолькина, С.А. Коннова, В.В. Игнатов // Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2012. - Т. 12, Вып. 1. - С. 61-66.

3. *Sigida, E.N. Structure of repeating units of a polysaccharide(s) from the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense SR80 / E.N. Sigida, Yu.P. Fedonenko, E.L. Zdorovenko, S.A. Konnova, A.S. Shashkov, V.V. Ignatov, Y.A. Knirel//Carbohydr. Res. -2013. -V. 371. - P. 40-44.

4. *Fedonenko, Yu.P. Immunochemical characterization of the capsular polysaccharide from the Azospirillum irakense KBC1 / Yu.P. Fedonenko, G.L. Burygin, E.N. Sigida, I.A. Popova, A.K. Surkina, E.L. Zdorovenko, S.A. Konnova // Curr. Microbiol. - 2013. - V. 67. - P. 234-239.

5. *Sigida, E.N. Structural studies of the O-specific polysaccharide(s) from the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense type strain Sp7 / E.N. Sigida, Yu.P. Fedonenko, A.S. Shashkov, E.L. Zdorovenko, S.A. Konnova, V.V. Ignatov, Y.A. Rnirel // Carbohydr. Res. - 2013. - V. 380. - P. 7680.

6. Сигида, Е.Н. Особенности строения липидов А липополисахаридов производных штаммов Azospirillim brasilense Sp245 и Sp7 / Е.Н. Сигида, Ю.П. Федоненко, С.А. Коннова, В.В. Игнатов // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой / V Всерос. конф. мол. ученых: материалы докл., Саратов, Россия, 28 сент. - 1 окт. 2010 г. -Саратов: Издательский центр «Наука», 2010. - С. 121.

7. Сигида, Е.Н. Изменение структуры О-полисахаридов у спонтанных мутантов Azospirillum brasilense / Е.Н. Сигида, Ю.П. Федоненко, С.А. Коннова, В.В. Игнатов // Химия и биохимия углеводов / IV Всероссийская школа-конференция: материалы докл., Саратов, 14-16 сентября 2011,- Саратов: ООО «Ракурс», 2011. - С. 72-73.

8. Sigida, E.N. Structural analysis of the O-antigen of the lipopolysaccharides from Azospirillum brasilense Sp7.K2 / E.N. Sigida, Yu.P. Fedonenko, E.L. Zdorovenko, S.A. Konnova, A.S. Shashkov, V.V. Ignatov // 16th European carbohydrate symposium: Eurocarb 16, 3-7 My 2011. - Sorrento-Naples, Italy, 2011. - P. 530.

9. Сигида, Е.Н. Структурные исследования О-полисахарида ассоциативных ризобактерий Azospirillum brasilense неэндофитного штамма Sp7 / Е.Н. Сигида, Ю.П. Федоненко, С.А. Коннова, В.В. Игнатов // Перспективные направления физико-химической биологии и

биотехнологии: тезисы докладов и стендовых сообщений / XXIV Зимняя молодежная научная школа. Москва, 7-9 февраля 2012 г. - М.: Полиграфический участок ИБХ РАН, 2012. - С. 80.

10. Сигида, Е.Н. Особенности структуры О-специфического полисахарида почвенных бактерий Azospirillum halopraeferens Au4 / Е.Н. Сигида, Ю.П. Федоненко, В.В. Игнатов // Фундаментальная гликобиология /1 Всероссийская конференция. Казань, 20-24 июня 2012 г. -Казань: Печатный двор, 2012. - С. 55.

11. Федоненко, Ю.П. Структура О-специфических полисахаридов бактерий p. Azospirillum, относящихся к разным серогруппам / Ю.П. Федоненко, Е.Н. Сигида, О.Н. Смолькина, А.С. Бойко, С.А. Коннова, В.В. Игнатов // Фундаментальная гликобиология / I Всероссийская конференция. Казань, 20-24 июня 2012 г. - Казань: Печатный двор, 2012. - С. 65.

12. Sigida, E.N. Structures of O-polysaccharides from Azospirillum brasilense associated with C4 plants / E.N. Sigida, A.S. Boyko, Yu.P. Fedonenko, E.L. Zdorovenko, S.A. Konnova, V.V. Ignatov // Abstracts of the 5-th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, 2-6 September 2012. - Suzdal, Russia, 2012.-P. 05.

13. Fedonenko, Yu.P. Characterization of the capsular polysaccharide from Azospirillum irakense type strain KBC1 / Yu.P. Fedonenko, E.N. Sigida, A.K. Surkina, I.A. Popova, G.L. Burygin, E.L. Zdorovenko, S.A. Konnova, V.V. Ignatov // Abstracts of the 5-th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, 2-6 September 2012. - Suzdal, Russia, 2012. - P. P19.

14. Сигида, E.H. Структуры О-полисахаридов Azospirillum brasilense, ассоциированных с растениями с С4 фотосинтезом / Е.Н. Сигида, А.С. Бойко, Ю.П. Федоненко, Э.Л. Здоровенко, С.А. Коннова, В.В. Игнатов // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой / VI Всерос. конф. мол. ученых: материалы докл., Саратов, 24-28 сент. 2012 г. -Саратов: Научная книга, 2012. - С. 111.

15. Сигида, Е.Н. Выявление нового хемотипа рост-стимулирующих ризобактерий рода Azospirillum / Е.Н. Сигида, Ю.П. Федоненко, Г.Л. Бурыгин, Э.Л. Здоровенко, С.А. Коннова, В.В. Игнатов // Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии: тезисы докладов и стендовых сообщений / XXV Зимняя молодежная научная школа. Москва, 11-15 февраля 2013 г. - М.: Полиграфический участок ИБХ РАН, 2013. - С. 81.

16. Sigida, Е. Structural studies of the O-specific polysaccharides from the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense type strain Sp7 / E. Sigida, Yu. Fedonenko, A. Shashkov, E. Zdorovenko, S. Konnova, V. Ignatov, Knirel Y. И Abstracts of poster session 1, 17th European carbohydrate symposium: Eurocarb 17, 7-11 July 2013. - Tel-Aviv, Israel, 2013. - P. 55.

17. Sigida, E. Structural heterogeneity of the O-antigens from plant-growth-promoting rhizobacteria Azospirillum brasilense / E. Sigida, Yu. Fedonenko, E. Zdorovenko, S. Konnova, V. Ignatov // Program and abstracts of 2nd International Symposium on Life Sciences, 4-9 September 2013. -Vladivostok, Russia, 2013. - P. 20.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сигида, Елена Николаевна, Саратов

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ и МИКРООРГАНИЗМОВ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201458026 СИГИДА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

Структурная гетерогенность липополисахаридов бактерий рода АгозртИит

серогруппы II

03.01.04 - биохимия 03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук Игнатов Владимир Владимирович

кандидат биологических наук Федоненко Юлия Петровна

Саратов-2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................10

1.1 Ризосфера - уникальная среда обитания для микроорганизмов......................10

1.1.1 Корневые экссудаты растений как молекулярные сигналы в

ризосфере..........................................................................................................................................................12

1.2 Бактерии рода Аго$р1гШит в ассоциативных взаимодействиях с растениями..................................................................................................................................................................15

1.2.1 Морфологические и физиологические особенности азоспирилл... 16

1.2.2 Гликополимеры клеточной поверхности азоспирилл - состав и участие во взаимодействии с растениями..........................................................................22

1.3 Генетические аспекты синтеза липополисахаридов и экстраклеточных полисахаридов у азоспирилл......................................................................................................................30

1.4 Серотипирование и хемотипирование азоспирилл на основании антигенных свойств липополисахаридов, капсульных полисахаридов и

структур О-специфических полисахаридов..................................................................................33

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................41

2.1 Культуры бактерий, условия их выращивания и хранения....................................41

2.2 Приборы и материалы..............................................................................................................................42

2.3 Методы исследования..............................................................................................................................44

2.3.1 Выделение капсульных полисахаридов, экстракция липополисахаридов и получение О-специфических полисахаридов..........44

2.3.2 Хроматографические методы............................................................................................44

2.3.3 Электрофорез в полиакриламидном геле................................................................46

2.3.4 Спектроскопия ЯМР................................................................................................................47

2.3.5 Химические методы анализа..............................................................................................47

2.3.6 Серологические методы исследования....................................................................48

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ................50

3.1 Серологические исследования липополисахаридов азоспирилл......................50

3.2 Сравнительный анализ химического состава липополисахаридов..................54

3.3 Структурные исследования О-специфических полисахаридов азоспирилл, отнесенных к серогруппе II............................................ 59

3.3.1 Исследование структуры О-специфического полисахарида бактерий А. brasilense Sp7......................................................... 59

3.3.2 Структурные исследования липополисахаридов бактерий

А. brasilense Sp7.K2, Sp7.5 , Sp7.2.............................................. 67

3.3.3 Структурные и серологические исследования липополисахаридов бактерий А brasilense SR50, SR80, SR88, SRI 09,

SRI 11, SRI 15 и A. lipoferum SR42................................................ 73

3.3.4 Установление структуры повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов бактерий А. brasilense SR7............... 81

3.3.5 Особенности строения О-специфического полисахарида бактерий А. halopraeferens Au4................................................... 83

3.4 Структурный анализ капсульного полисахарида бактерий

А. irakense КВС1........................................................................... 87

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................... 91

ВЫВОДЫ................................................................................... 95

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.................. 96

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................................. 98

БЛАГОДАРНОСТИ...................................................................... 123

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Бактерии рода Azospirillum являются типичными представителями ризосферной микробиоты, способными формировать ассоциации с важнейшими хлебными и кормовыми злаковыми культурами и стимулировать их урожайность (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000).

Физиологическая активность повсеместно распространенных азоспирилл обусловлена продукцией разнообразных метаболитов: фитогормонов (Spaepen and Vanderleyden, 2011), аминокислот, сидерофоров, каротиноидов, а также углеводсодержащих полимеров - липополисахаридов (ЛПС) и капсульных полисахаридов (КПС), образующих гликоландшафт клеточной поверхности (Skvortsov and Ignatov, 1998). Мембранные и внеклеточные полисахариды вовлечены в процессы агрегации клеток и колонизации корней растений, принимая непосредственное участие в формировании растительно-микробных ассоциаций (Burdman et al., 2000; Egorenkova et al., 2001). Изучение химической структуры гликополимеров необходимо для понимания молекулярных механизмов коммуникаций, происходящих в ризосфере между микроорганизмами и их макропартнерами. Это открывает возможности для управления этими процессами и повышения эффективности используемых в сельском хозяйстве технологий.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что азоспириллы продуцируют преимущественно S-формы ЛПС, содержащие О-специфические полисахариды (ОПС), экспонированные на внешней стороне наружной мембраны (Fedonenko et al., 2002, 2004, 2006, 2008; Chôma et al., 2008; Boyko et al., 2011, 2012). Ввиду доступности ОПС для взаимодействия с иммунокомпетентными клетками их структура определяет специфичность образующихся антител (Ат) и составляет основу для серологической классификации бактерий (Матора и др., 1998; Weintraub, 2003). Сведения о структуре и антигенной специфичности КПС азоспирилл ограничены несколькими штаммами. На основании антигенной идентичности ЛПС и КПС было высказано предположение об отсутствии

индивидуального капсульного антигена (Аг) у штаммов А. ЬгазПете 8р7 и 8р245 (Матора и Щеголев, 2002), при этом у бактерий А. Иро/егит 8р59Ь выявлены как антигенные, так и структурные различия между ЛПС и КПС (Смолькина и др., 2010).

На основании серологических перекрестных реакций с бактериями А. Ьгаяйеше 8р245, Бр7 и А. Иро/егит 8р59Ь, соответственно, были выделены три серогруппы азоспирилл (Коннова и др., 2008; Федоненко и др., 2011, Филипьечева, 2011). Сравнительное исследование структур повторяющихся звеньев ОПС этих бактерий позволило выявить химическую основу серологического родства между отнесенными к серогруппам I и III штаммами (Бойко и др., 2010; Федоненко и др., 2011), большинство из которых являются ассоциантами пшеницы. Сведения о структурах ОПС азоспирилл представителей серогруппы II, изолированных из ризосферы широкого круга злаков трех подсемейств - Роо1с1еае, Рашсо1с1еае, Огуго1с1еае (Коннова и др., 2008; Филипьечева, 2011), - ограничены, в то время как данные серологического анализа свидетельствуют о неоднородности О-антигенных детерминант их ЛПС. Это обуславливает актуальность детализации и расширения существующей серо- и хемотаксономической схем бактерий рода АгояртПит.

Анализ нуклеотидных последовательностей 90 МДа (р90, рШнсо) и 115 МДа (р115) плазмид бактерий А. ЬгаяИете 8р7 выявил множественные открытые рамки считывания, предсказанные продукты экспрессии которых могут быть задействованы в биосинтезе и экспорте полисахаридов (УапЫеи а1., 2004; Ьегпег & ак, 2009). В связи с этим представляет интерес сравнительное исследование ЛПС А. ЪгааИете 8р7 и спонтанных производных этого штамма, плазмидные профили которых свидетельствовали об утере р115 и изменении структуры рЯЫсо (Петрова и др., 2005,2010).

Цель работы - структурный анализ липополисахаридов бактерий рода АгояртПит, отнесенных к серогруппе II. Для реализации цели в ходе исследования решали следующие задачи:

1. Провести скрииинговые серологические исследования штаммов Azospirillum spp. для выявления перекрестных реакций с антителами к ЛПС бактерий — представителей серогруппы II.

2. Охарактеризовать химический состав ЛПС и структуру повторяющихся звеньев ОПС азоспирилл, отнесенных к серогруппе II.

3. Осуществить сравнительный анализ структуры ОПС А. brasilense Sp7 и его спонтанных производных с измененным плазмидным составом - А. brasilense Sp7.K2, Sp7.2 и Sp7.5.

4. Исследовать ЛПС из капсульного материала на примере бактерий А. irakense КВС1.

Научная новизна работы. Впервые для отнесенных к серогруппе II бактерий рода Azospirillum установлены структуры повторяющихся звеньев ОПС у штаммов А. brasilense Sp7, SR7, SR50, SR80, SR88, SR109, SRI 11, SRI 15 и A. lipoferum SR42 и КПС А. irakense КВС1.

Выявлена химическая основа серологического родства между А. brasilense SR7 и S17, а также между А. brasilense Sp7, Jm6B2, SR50, SR80, SR88, SR109, SRI 11, SRI 15 и A. lipoferum SR42.

Показано, что спонтанные мутации, повлекшие изменения в р90 и утрату р115, не вызывают изменения структуры ОПС у штаммов А. brasilense Sp7.2 и Sp7.5, по сравнению с родительским штаммом. В составе ОПС штамма Sp7.K2 обнаружено присутствие дополнительного рамнанового полисахарида.

Установлено, что антигенная специфичность мембранного и внеклеточного ЛПС А. irakense КВС1 обусловлена различиями макромолекулярной организации этих гликополимеров.

Получены новые данные о характере связывания жирных кислот в липидах А ЛПС исследуемых штаммов.

Научно-практическая значимость. Информация о структурах ОПС будет использована для серо- и хемотипирования азоспирилл. Сведения о составе и топологии углеводных компонентов бактериальной поверхности, определяющих успешность начальных этапов формирования растительно-микробных

ассоциаций, могут быть использованы при отборе конкретных штаммов азоспирилл для создания биоудобрений.

Выделенные препараты ЛПС ряда штаммов А. ЪгаяИете и А. ксйоргае/егет и полученные к ним поликлональные кроличьи антитела применяются при проведении плановых НИР сотрудниками лабораторий биохимии и иммунохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН), а также при выполнении учебного плана Учебно-научного центра физико-химической биологии Федерального государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» (СГУ) и ИБФРМ РАН.

Представленные в диссертации материалы включены в учебно-методическое пособие для студентов: «Практические занятия по физико-химическим методам исследования биополимеров» / Саратов: Изд-во «Новый ветер», 2013 г. 54 е., (в соавторстве с Г.Л. Бурыгиным, Л.Ю. Матора, С.Ю. Щеголевым), рекомендованное кафедрой органической и биоорганической химии Института химии СГУ и Ученым советом ИБФРМ РАН.

Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, представлены на 5-й и 6-й Всероссийских школах-конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия растений и микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2010, 2012), 4-й Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, Россия, 2011), 16-м и 17-м Европейских углеводных симпозиумах «ЕигосагЬ» (Сорренто, Италия, 2011; Тель-Авив, Израиль, 2013), XXIV и XXV Зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2012, 2013), 5-й Балтийской конференции по микробным углеводам (Суздаль, Россия, 2012), 1-й Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Казань, Россия, 2012), 2-м Международном симпозиуме по наукам о жизни (Владивосток, Россия, 2013).

Личный вклад соискателя.

Автор лично участвовал в планировании экспериментов, обсуждении полученных результатов, формулировании выводов и подготовке публикаций. Культивирование бактерий, выделение и очистка ЛПС и ОПС, получение антител, серологические тесты, химические анализы, интерпретация ЯМР-спектров проводились автором лично или при его непосредственном участии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Бактерии А. brasilense Sp7, SR7, SR50, SR80, SR88, SR109, SRI 11, SRI 15 A. lipoferum SR42 и A. halopraeferens Au4, отнесенные к серогруппе II, продуцируют структурно и иммунохимически гетерогенные ЛПС. Для ОПС А. brasilense Sp7, SR7, SRI 15 и А. halopraeferens Au4 характерно присутствие частично метилированных и ацетилированных моносахаридных остатков.

2. ЛПС и КПС бактерий типового штамма А. irakense КВС1 содержат полисахариды с идентичными по первичной структуре полисахаридными повторяющимися звеньями. Серологическая гетерогенность этих гликополимеров может быть обусловлена различиями их макромолекулярной организации.

3. В составе ЛПС азоспирилл 3-гидрокситетрадекановая кислота является эфиросвязанной, а 3-гидроксигексадекановая - амидосвязанной.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 5 статей в отечественных и зарубежных научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.

Работа выполнена в соответствии с плановыми темами НИР «Биополимеры и низкомолекулярные соединения во взаимодействии растений и микроорганизмов» (2009-2012 гг. № госрегистрации 01200904391) и «Роль биомакромолекул и низкомолекулярных веществ в механизмах адаптации растительно-микробных ассоциаций в составе антропобиоценозов к условиям аридного климата» (2013-2015 гг. № госрегистрации 01201359049) лаборатории биохимии ИБФРМ РАН. Исследование полисахаридов с помощью спектроскопии ЯМР выполнено совместно с сотрудниками Института органической химии имени Н.Д. Зелинского РАН (г. Москва).

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований: в 2008-2010 гг. «О-специфические полисахариды ризобактерий рода АгояртПит: исследования структуры и влияния на нее растительных соединений фенольной природы» № 08-04-00669, в 2011-2013 гг. «Исследование строения и свойств липополисахаридов ризобактерий в связи с существованием в различных экологических нишах» № 11-04-00533, а также грантом Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение №8852 («Разработка методологии и приборного обеспечения электрооптического анализа вирусов и микроорганизмов (2012-2013 гг.)»).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 239 источников, в том числе 58 источников на русском языке. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков и 12 таблиц.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Ризосфера - уникальная среда обитания для микроорганизмов

Альтернативой синтетическим азотным удобрениям, производство и широкое использование которых может наносить серьезный урон окружающей среде, являются биоудобрения. Основой для них служат почвенные микроорганизмы, способные в процессе биологической фиксации утилизировать молекулярный азот из воздуха и преобразовывать его в различные доступные для растений соединения: соли аммония, нитриты, нитраты, а впоследствии в глутамин и др. (Lam et al., 1996; Franche et al., 2009). Впервые сельскохозяйственный препарат на основе биоудобрений был запатентован в США в конце XIX века, о чем позднее сообщалось в обзорной работе (Nobbe and Hiltner, 1896). К настоящему моменту для этих целей проведена селекция множества бактериальных штаммов. Однако широкое использование микробных инокулятов затруднено из-за варьирования и непостоянства результатов, полученных в лабораторных и полевых условиях. Причина этих расхождений кроется в недостаточной изученности комплекса взаимоотношений, возникающих между участниками данного процесса: растением, микроорганизмами и природной средой, в частности, почвой. Управление ключевыми стадиями биологической фиксации азота может осуществляться при детальном понимании этого явления, что подчеркивает актуальность исследований, связанных с его использованием для повышения урожайности важных в агрономическом отношении культур.

Наиболее специфичными и эффективными в отношении фиксации азота являются процессы с участием бобовых (семейства Fabaceae) и небобовых (семейства Cannabaceae) растений и грамотрицательных альфа-протеобактерий ризобий (Schultze and Kondorosi, 1998; Oldroyd and Downie, 2008; Desbrosses and Stougaard, 2011) и ассоциированных с актиноризными растениями

грамположительных актиномицетов Frankia spp. Азотфиксирующие цианобактерии (в основном Nostoc spp.) также колонизируют различные органы растений. Эти симбиотические взаимодействия выгодны обоим партнерам, а их образование протекает по строго диктуемым растением правилам. Данные отношения обусловлены вовлечением соответствующих генов растения и бактерий, ответственных за изменение метаболических путей и создание специализированных клеточных и тканевых структур — бактероида и клубенька, предоставляющих наиболее благоприятные условия для фиксации азота и его дальнейшей транспортировки (Reinh